Иммуноферментный анализ естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека

Петроченко, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуноферментный анализ естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментный анализ естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи Петроченко Светлана Николаевна

ИММУНОФЕРМЕНТНЫИ АНАЛИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ АНТИТЕЛ К БИОГЕННЫМ АМИНАМ И ОПИОИДНЫМ ПЕПТИДАМ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04.-БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

- 3 дек 2009

МОСКВА - 2009

003486895

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институте физиологически активных веществ РАН

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор Мягкова Марина Александровна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

Самуил ова Дания Шавкетовна Доктор биологических наук Виха Галина Васильевна

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии

Зашита состоится «_»_2009 года в «_» часов

на заседании Диссертационного Совета Д.001.042.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН по адресу:

125167, Москва, Новый Зыковский проезд, дом 4А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН

Автореферат разослан «_»_2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие интенсивно развивается новое научное направление биохимии, связанное с изучением функционирования гуморальной системы иммунитета. В этой области получены экспериментальные данные, имеющие важное, принципиальное значение. Прежде всего, необходимо отметить работы по выявлению в сыворотке крови здоровых людей естественных антител различной специфичности, направленных против эндогенных макромолекулярных антигенов - белков цитоскелета, ферментов, нуклеиновых кислот, компонентов межклеточного матрикса и других антигенов [Maneta-Peyret L. 1991; Arnaud Е. 1994; Iznaga Escobar N., Топ-es L.A. 1998; Misra N., Kaveri S.V. 2003; Kazatchkina M.D. 2005; Lacrois-Dismaress 2006].

Естественные антитела обнаружены и к низкомолекулярным эндогенным соединениям, пептидным гормонам, нейромедиаторам, которые в классическом понимании, сами по себе не являются антигенами. Механизм образования эндогенных конъюгированных антигенов низкомолекулярных соединений, способных индуцировать антитела, предложен в работах Ковалёва И.Е., Полевой О.Ю. 1985,2002г.

Выполнены исследования, показавшие, что физиологической нормой для этих иммуноглобулинов является относительное единообразие репертуаров конститутивно экспрессируемых естественных антител, которые сохраняются десятилетиями и мало зависят от возраста и пола здорового человека [Ayouba et al., 1997; Nobrega et al., 1997; Francoeur, 1998]. Индивидуальные различия по этим параметрам в норме весьма невелики. В то же время было установлено, что у лиц с теми или иными метаболическими нарушениями состава эндогенных биорегуляторов, сопровождающими течение различных заболеваний, происходят существенные долговременные и специфические количественные изменения в составе циркулирующих естественных антител. При этом содержание антител одной специфичности может повышаться, другой снижаться, третьей оставаться в пределах нормы. В зависимости от ситуации, выявляемые у пациентов изменения в продукции естественных антител могут быть адаптивными (компенсоторными), либо -дезадаптивными (паталогическими). Иммунная система отражает метаболические перестройки, происходящие в организме человека, а естественные антитела выполняют важную гомеостатическую функцию в организме. [Коренева Е.А., Шекоян В.А. 1988; March H., Pedersen B.K. 1995; Levy Soussan P., Avrameas S. 1996; Клюшник Т.П. 1997; Морозов С.Г. 1997].

Эти исследования открывают перспективу применения полученных данных не только в научных целях, но и как важного клинико-лабораторного критерия для оценки нарушения

функционирования иммунной системы организма при патологических состояниях.

Эндогенные биорегуляторы, относящиеся к классу опиоидных пептидов и биогенных аминов, играют важную роль в механизме развития заболеваний, связанных с изменением деятельности нервной системы человека (стрессы, болезни зависимости, депрессии, и т.д.) [Коренева Е.А., Шекоян В.А. 1988; Абрамов В.В. и др. 1998; Hawk K.D., Кагр S.D. 1998]. Патогенетическая роль этих соединений отражается в увеличении их содержания в крови, изменении метаболизма, запускающего механизм, модулирующий влияние нервной системы на общий иммунный статус. На этом фоне может происходить качественное и количественное изменение уровня специфических естественных антител к указанным эндогенным биорегуляторам, участвующим в патогенезе заболевания.

Актуальна задача разработки надёжных методов контроля за состоянием здоровья человека. Определение специфических иммунных изменений, сопровождающих развитие указанных патологических процессов, поможет выявить новые маркеры, отражающие как начальные стадии, так и последующее течение заболевания, для дифференцированной системы комплексной диагностики, лечения и реабилитации больных.

Цель исследования. Целью данного исследования является разработка методов определения естественных антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам на основе твердофазного иммуноферментного анализа, изучение их специфических биохимических свойств и сравнительное определение изменения их уровня в норме и при развитии патологических процессов.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы получения биохимических реагентов синтетических антигенов (ß-эндорфина, дерморфина, серотонина, дофамина, гистамина) на полимерном носителе - поли(4-нитрофенил) акрилате;

2. Разработать иммуноферментные методы определения антител к опиоидным пептидам (ß-эндорфину и дерморфину) в сыворотке крови человека, провести сравнительный анализ содержания антител у доноров и больных с различными патологиями;

3. Оптимизировать условия определения антител к биогенным аминам (серотонину, дофамину и гистамину) в сыворотке крови человека на основе использования в иммуноферментном анализе новых синтетических антигенов перечисленных соединений;

4. Синтезировать сорбенты для аффинной хроматографии, провести выделение антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам из сыворотки крови человека, исследовать биохимические свойства антител: аффинность и специфичность;

5. Провести сравнительный анализ содержания специфических антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам в сыворотке крови человека и установить

практическую значимость разработанных вариантов иммуноферментного анализа.

Научная новизна. Созданы новые способы получения конъюгатов опиоидных пептидов (Р-эндорфина и дерморфина) и биогенных аминов (дофамина, серотонина и гистамина) с использованием поли(4-нитрофенил) акрилата.

Разработаны оригинальные методы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения естественных антител к опиоидным пептидам ((}-эндорфину и дерморфину) в сыворотке крови человека. На основе их применения для исследования сыворотки крови доноров и больных обнаружены антитела к указанным нейромедиаторам. Установлено изменение уровня антител к р-эндорфину и дерморфину по сравнению с нормой, в случае возникновения в организме человека процессов, связанных с проявлением клиники патологического влечения к употреблению наркотических веществ, алкоголю, азартным играм.

Синтезированы новые сорбенты для аффинной хроматографии; из сыворотки крови человека выделены антитела к опиоидным пептидам (Р-эндорфину и дерморфину) и биогенным аминам (дофамину, серотонину и гистамину). Исследованы биохимические свойства аффинно очищенных антител. Измерена константа аффинности и специфичность. Установлена взаимосвязь между структурой дерморфина, его биологической активностью и специфичностью естественных антител.

Научно-практическая значимость работы. Показана возможность использования новых методов иммуноферментного анализа определения естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в практической медицине. Проведённое сравнительное определение содержания естественных антител к р-эндорфину, дерморфину, дофамину, серотонину и гистамину позволило выявить их достоверное увеличение к указанным выше соединениям при наркомании и снижение их уровня при нейродермите и поллинозе. Найдена взаимосвязь между уровнем естественных антител к исследованным биорегуляторам в сыворотке крови больных и течением заболевания зависимости (наркомания, алкоголизм, игромания). Установлено, что определение естественных антител к гистамину при нейродермите и поллинозе может использоваться для оценки эффективности проводимой терапии. Разработанные способы анализа используются с 2006 года в Московском научно-практическом центре наркологии, Госпитале ФСБ России, а также ряде наркологических клиник страны.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод иммуноферментного анализа естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека на основе полученных синтетических антигенов р-эндорфина, дерморфина, дофамина, серотонина и гистамина.

2. Исследование биохимических свойств естественных антител к опиоидным

пептидам и биогенным аминам, сравнительная оценка изменения их аффинности и специфичности в норме и при патологии.

3. Сравнительный анализ антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам в норме и при патологии. Определение практической значимости разработанных вариантов иммуноферментного анализа.

Апробация работы. Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены на межлабораторной конференции Института физиологически активных веществ РАН (протокол №1 от 25 июня 2009 года).

Результаты исследования были представлены на 4-ой Российской конференции "Нейроиммунопатология" 11-12 мая 2006 г., Москва; на третьей Международной Научно-практической конференции МЕДБИОТЕК "Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине" 4-5 декабря 2006 г., Москва; на Международной конференции «Игровая зависимость: мифы и реальность» 21-22 июня 2006 г., Москва; на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 16-20 апреля 2007 г., Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, подготовлены методические рекомендации, по двум заявкам имеется положительное решение о выдаче патента.

Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы (187 источников). Работа содержит 21 таблицу и 13 рисунков. Материалы изложены на 119 страницах машинописного текста.

Данная диссертационная работа выполнена под руководством доктора биологических наук, профессора Мягковой М.А.; при совместном участии врача-клинициста Городской клинической больницы г. Пенза Манжос М.В.; главного врача МНПЦ наркологии г. Москвы Сокольчик Е.И.; зам. главного врача МНПЦ наркологии Шипицина В.В.; сотрудников Учреждения Российской академии наук Института физиологически активных веществ РАН: Киселевой Р.Ю., Жоховой Н.И.

Материалы и методы исследования.

В работе использованы следующие биохимические и химические реагенты: Р-эндорфин; гистамин; серотонин («Sigma»); дерморфин и его аналоги (предоставлены к.х.н. Яровой Е.В., ИБХ РАН), конъюгаты овечьих антител против IgM, IgG и IgA человека ("Sigma»); поли(4-нитрофенил)акрилат и аминопропилированное стекло (предоставлены д.х.н., проф. Бовиным Н.В., ИБХ РАН).

Основными материалами исследований служили образцы сыворотки крови здоровых доноров и пациентов.

Московским научно-практическим центром наркологии г.Москвы предоставленны пробы сыворотки крови 18 больных опийной наркоманией, 20 больных гашишной наркоманией, 20 больных игроманией, 20 больных алкоголизмом в возрасте от 20 до 44 лет и продолжительностью заболевания от 1 года до 11 лет.

Образцы сыворотки крови для исследования 55 больных в возрасте от 19 до 54 лет и продолжительностью заболевания в среднем 7.9±1.2 лет с диагнозом поллиноз, получены в Клинической больнице № 4 г. Пенза. Образцы сыворотки крови для исследования 70 больных нейродермитом в возрасте от 18 до 34 лет со средней продолжительностью заболевания 7,0±1,5 лет получены в отделе иммунологии ГУ ЦНИКВИ Росздрава.

При проведении иммунохимических исследований в качестве контрольных образцов использовали сыворотки крови 25 здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет, полученные в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН.

Для проведения иммуноферментного анализа у обследуемых лиц осуществляли забор 5 мл венозной крови натощак, до начала и после окончания лечения. Пробирки с кровью помещали в термостат на 30 мин. при Т 37°С, затем пробирку с образовавшимся сгустком оставляли на 18 часов при Т 4°С. Образовавшуюся сыворотку центрифугировали при 3000 об/мин. Далее полученные образцы сывороток хранили при Т-20°С до момента тестирования.

Клиническая часть исследования выполнена по специально разработанной системе, включающей клинико-диагностическое и экспериментально-психологическое обследование пациентов. В ходе лечения больные получали необходимую медикоментозную терапию, направленную на нормализацию соматоневрологических нарушений метаболизма, коррекцию психопатологических расстройств.

Для проведения биохимических и иммунохимических исследований применяли следующие методы:

1. Иммуноферментный анализ выполняли на полистирольных планшетах фирмы «Nunc» (Дания). Учёт результатов иммуноферментного анализа осуществляли на спектрофотометре с вертикальным ходом луча фирмы «Thermo» (Финляндия) при длине волны 450 нм.

2. Аффинную хроматографию проводили с помощью специально полученного сорбента на основе макропористого аминопропилированного стекла. Регистрацию результатов хроматографии осуществляли на жидкостном хроматографе «Spektroflow 757».

3. Белок в растворах аффинно выделенных антител определяли методом Бредфорда. Оптическую плотность растворов белков регистрировали спектрофотометрически на приборе

Gelesys lOuv, фирмы « Thermo» (Финляндия).

4. В работе использовали комплекс статистических методов с применением пакета программ SPSS 8.0 для научных исследований. Результаты исследований оценивали с использованием средней арифметической величины (М), их стандартной ошибки (т), критерия Стьюдента-Уэлча (t), критерия Пирсона, коэффициента корреляции Кендалла. Для принятия гипотезы применяли уровень достоверности 95% (р=0,05).

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

I. Получение реагентов для разработки иммуноферментного анализа определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам.

Первый этап работы создания метода определения специфических антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови связан с получением биохимических реагентов. Именно их качественные характеристики, основанные на возможности

получения разнообразных по структуре антигенов, являются главными факторами при разработке твердофазного иммуноферментного анализа естественных антител (е-АТ) к биогенным аминам и опиоидным пептидам.

Для этой цели исследовали варианты синтеза конъюгатов низкомолекулярных веществ на полимерном носителе. Провели анализ структуры новых соединений, использованных в качестве антигенов при разработке иммуноферментного метода.

1.1. Синтез конъюгнрованпых антигенов биогенных аминов и опиоидных пептидов на полимерной матрице.

Конъюгированные антигены биогенных аминов и опиоидных пептидов синтезировали способом получения искусственных антигенов на полимерной матрице, путём конденсации исходных соединений, содержащих свободную аминогруппу, с поли(4-нитрофенил) акрилатом.

На рисунке 1 представлена схема синтеза конъюгированных антигенов к биогенным аминам и опиоидным пептидам: р -эндорфину, дерморфину, серотонину, гистамину, дофамину.

АНТИГЕН

О—С—NHR

где R: р -эндорфин, дерморфин, серотонин, гистамин, дофамин.

1'нсуиок' 1. Схема синтеза кипыи1'И|)оиинны\ антигенов на но.ш(4-нп|роф1-нил)ак'рн.татс.

Полимерная матрица содержала предварительно активированные карбоксильные группы и виде р-шпрофенилового зфпра. Это качество макромолекуляриого носителя позволяет и мягких условиях, бсч использования других конденсирующих агентов, получить синтетический антиген, сохраняя практически без изменения структуру исходною соединения. Хорошо известно, что использование для коиалепттюго связывания с носителем высокореакциопноспособных веществ приводит к деструкции ппзкомолску.тярпых соединений, что, в конечном итоге, сказывается па возможности создания метода но определению естественных антител. Получено три вида кошлогаюв, содержащих либо полностью замещённую гаптспом матрицу (100%): либо от 30% до 50% молекул лнганда. присоединённых к ней; либо 10-15% молекул лиганда. связанных с полимером.

При разработке 11ФЛ определения антител к биогенным аминам и ошюндным пептидам использовали указанные выше синтезированные коиъюгпроваппые антигены с различным замещением полимерной матрицы молекулами гаптепа. Ото связано с тем, что при определении антител к любому из исследуемых антигенов на начальном 'лапе, мы изучали влияние структуры искусственного антигена па полноту связывания в ИФЛ с гетерогенной популяцией иммуноглобулинов, присутствующих в сыворотке крови человека.

В результате обнаружено, что из всего разнообразии синтезированных коньки провлппих антигенов, комплексы с 10-15% замещением полимерной матрицы биогенных аминов п оннондных пептидов являются наиболее пригодными для определения всей популяции специфических иммуноглобулинов, которые, как известно, различаются по силе связывания с

Рисунок 2. Кривые гптроиашш сыворотки на коныогироианных антигенах с различным замещением гаш еном но.шмериин матрицы.

Крив!,ю ппрованпя выделены равным цветом ь зависимости ог пропета замещения гаптеном полимерной мафпии: П)-15'/( - красным. МКти'д-синий. ИХ}',* - зеленый.

2. Разработка метода иммуноферментного анализа определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека.

Следующий раздел посвящен разработке специфичного и чувствительного метода иммуноферментного анализа для определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови людей, установлению факта существования таких антител в норме у практически здоровых людей и поиску отличительных особенностей естественных антител к указанным антигенам у больных, изучению практической значимости определения уровня антител к данным биорегуляторам.

Характеристики разрабатываемого метода ИФА определения антител (чувствительность, специфичность, воспроизводимость) зависят от выбора условий проведения эксперимента. Поэтому мы проводили оптимизацию параметров постановки ИФА определения антител на каждой стадии анализа.

I. Во-первых, было исследовано влияние концентрации раствора антигена,

используемого для сорбции, на выявление антител.

II. Во-вторых, была проведена оптимизация условий специфического связывания иммуноглобулинов классов G (IgG) и М (IgM) из сыворотки крови человека.

III. В-третьих, были выбраны условия определения иммунных комплексов антиген-иммуноглобулины из сыворотки крови доноров и больных с помощью антивидовых антител специфичных к IgG и IgM.

Выбор оптимальных условий постановки ИФА был сделан на основании данных, полученных при использовании сыворотки крови здоровых людей, а в качестве группы сравнения - больные поллинозом, нейродермитом и больные с различными видами зависимости (наркотической, алкогольной и игроманией).

Посадку антигена на полистирольный планшет проводили из раствора в карбонатном буфере (pH 9.6) в течение 18 часов при температуре 4°С, начиная с концентрации 10 мкг/мл и далее, уменьшая каждый раз концентрацию антигена двукратно. Затем в лунки планшета вносили разведения сыворотки крови, начиная с 1/100 и проводя в дальнейшем двукратные разбавления. Для выбора условий ИФА на первом этапе использовали приём «шахматного» титрования растворов антигена и сыворотки крови.

По полученным данным исследовали зависимость оптической плотности (OD450), регистрируемой в ИФА, от концентрации сорбируемого на планшете антигена и разведения сыворотки крови, а также влияние концентраций сорбируемого антигена и разведений сыворотки на уровень выявления антител против биогенных аминов и опиоидных пептидов, относящихся к двум изотипам иммуноглобулинов человека - IgM и IgG.

Таблица 1. Условии проведении ПФЛ для определения антител к биогенным аминам и онноидным пептидам и анализируемых образцах сыворотки крови.

Исследуемый липнем, содержащий в качестве глггени: Изотип иммуноглобулинов Интервал разведения сыворотки Интервал концентрации сорбируемого антигена, ыкг/ш

- эндорфнн к\1 1/200- 1/800 0.5 - 2

1цС 1/100- 1/600 0.5 - 2

Дерморфин 1цМ 1/100- 1/400 1 -3

1«С 1/100- 1/200 0.5 - 2

Гистамин 1ВМ 1/100- 1/1200 0.05 - 2

м 1/100- 1/800 0.05 - 3

Ссротоиип 1»М 1/100- 1/800 0.5 - 3

кС 1/100- 1/400 0.5 - 2

Дофамин 1цМ 1/200- 1/600 0.5 - 1

1/100- 1/800 0,5 - 2

В таблице 1 приведены обобщённые данные, полученные при анализе результатов подбора условии выполнения ИФА для определения антител к исследуемым анигенам, на основании которых выбирали область линейной зависимости величины поглощения в ИФА, как от концентрации антигена, так и от разведения анализируемой сыворотки.

На основании выбранных условий ИФА проводили определение содержания антител н |«М класса в индивидуальных образцах сыворотки крови здоровых лиц и пациентов, с учётом достоверного изменения уровня антител. За величину порогового уровня, разделяющего сыворотки допоров и больных, имеющих повышенный либо пониженный уровень антител к исследуемым антигенам, принимали значение ООад, в ИФА, отличающееся от среднего значения О!)^,, в ИФА для группы доноров, на величину трёхкратного стандартного отклонения [Мипцер О.П. п другие 1982; N¿10 Т.Т., ЬепЬоГПШ. 1988].

2.1. Определение антител к биогенным аминам и ошюидным пептидам и сыворотке криви человека методом иммуиофсрмситиого анализа.

Разработанный ИФА определения е-АТ к биогенным аминам и опиоплным пептидам был апробирован с использованием сыворотки крови допоров и больных с различными видами зависимости (наркотической, алкогольной п пгромапией).

Результаты анализа показали, что уровень антител к исследуемым антигенам у больных достоверно отличается ог нормы, установленной в группе доноров (ереднедонорское значение в ИФА±Зо) (таблица 2).

Таблица 2. Количество больных (и '<) с измененным уровнем антител при различных заболевашшх зависимости.

Кон ыо! ирошммый Уровень Наркоманы Алкоголики И: романы

антиген. антител но (38 чел.) (20 чел.) (20 чел.)

содержащий в сравнению с 1ёМ ДО 1«М ДО ДО

качестве гаитсна: донорами

11овышенный 62 30 17 25 3 25

|1 - эндорфин Норма 35 30 2.3 15 25 25

Пониженный 3 40 70 60 72 50

11овышенный 59 35 6 5 20 35

Дерморфин Норма 21 30 4 5 15 30

1 Сниженный 30 35 90 90 65 35

Повышенный 43 35 20 15 30 32

Гистамим 11орма 28 25 30 25 40 33

I {сниженный 29 40 50 60 30 35

11овы1иен11ын 75 40 20 35 15 25

Серогонин Норма 15 30 11 30 20 50

I Сниженный 10 30 69 35 65 25

Повышенный 91 35 20 23 42 40

Дофамин Норма 5 25 8 17 23 20

Пониженный 4 40 72 50 35 40

Необходимо отметить, что у пациентов, входящих в группу больных происходит одновременное изменение уровня антител и 1йМ класса, что свидетельствует, о том, что иммунная система в ответ па изменение метаболизма ключевых биорегуляторов, сопровождающих развитие патологических процессов, участвует в поддержании гомеостаза, регулируя содержания е-АТ к биогенным аминам и опиондным пептидам.

Проведённая статистическая обработка полученных данных, позволила выявить некоторые закономерности. Так установили, что в целом по группе, в зависимости от характера изменения уровня антител к исследуемому антигену, больных можно условно подразделить на три категории: группа с пониженным, с повышенным и соответствующим норме содержанием антител.

Далее апробацию метода ИФА провели с использованием сыворотки крови доноров н

больных аллергическим поллшюзом н нейродермитом. В результате анализа содержания

шцнтел (уО и )«М класса к биогенным аминам н опиондным пептидам установили, что уровень

анти тел у больных отличается от среднего, соответствующего норме в группе допоров.

Таблица 3. Количество больных (и %) с измененным уровне»! антител ирн различных ц.|.|У|)гических заболсваиинх.

Конъютиро ванный Уровень 1 1ейродермит Аллергический

антиген, антител но (70чел.) поллиноз

содержащий в сравнению с (55чел.)

качестве гаптена: донорами 1яМ | ДО ЫМ | ДО

- 'ШДОрфиМ 1 кшьппепиый 37 28 35 19

11орма 28 17 25 26

1 [оиижепмый 33 65 40 55

Дерморфии I 101Ч,||]1С[1ИЫ|"| 42 25 37 27

11ор,ма IX 45 23 .О

11опн'/кепмып 40 30 4(1 40

1 иетамин ] кнн.ппеипый 85 12 83 31

I [орма 10 38 9 15

11омижепмый 5 50 8 54

Серотнпм 11оы»ппснмий 14 47 38 19

11орма 25 19 8 37

11опижемиый 61 34 54 44

Дофамин 11овмшсмиым 24 25 35 18

11орма 36 45 20 39

1[опиженпый 40 30 45 43

Таким образом. разработанный пошл! метол ПФЛ определения антител к биогенным

аминам и опиопдпым пептидам позволяет установить изменения содержания антител в кровотоке больных нрн патоло] пческнх состояниях, характеризующихся изменением метаболизма указанных биорегуляторов.

В плане дальнейшего развития исследования необходимо: I).Установить. как связаны изменения уровня антител с развитием заболевания. 2(.Определить, насколько чти изменения ЯПЛЯЮ1СЯ специфическими и отражают участие шдогенпого биорегулятора в паюгепезе.

Определение уровня антител 1^0 и 1иМ класса к бишенным аминам и опиоплным пептидам провели на более обширном клиническом материале - у больных с патолошямм нервной и иммунной системы (наркомания, аллергический полднпоз, нейродермит). I! патогенезе чтп.х заболеваний участвуют биорегуляторы как ониопдной системы, так и биотепные амины, почтому оценку изменения уровня естественных антител в указанных группах больных, по сравнению с нормой, проводили к биогенным аминам, к чпкефалинам, [V-чпдорфнпу, лермор||л!ну и структурным аналогам лих веществ. Результаты сравни тельного определения специфичности взаимодействия антител, присутствующих в сыворотке крови, с антигенными мишенями различной структуры представлены в таблице 4.

Таблица 4. Данные ПФЛ ш.ищ.юши анттпс.1 1-дМ класса к онпондним пешпдам 1) Гнин еппмм аминам н сыиорогке кропи больных и доноров

11еследусмый ашиген Среднее имчеипе опгпчсскои плотности Л)\ в ИФЛ и среднем |к> Iр\ пне

Оо.п.ные 011111*11 к>й наркоманией lio.ii.nuc непродер- МИЮМ 1к>;п.!1ыс ааасрптсскич чохшиолом До| юры

Мс[-)мксф;е|пн 0.85.10.044 0.5710.033 0.401(1.023:': 0.(1710.026

|1 - чпдорфпп ().87К).0Ь8-; о.531().о:() 0.3910.0.16* 0.6210.023

Дсрморфин 0.У41().()32!! 0.5710.02.1 ()..Ш().(Ш* 0.6610.017

Н-Туг-Туг-Рго-5ег-ЫН2 0.61±0.021 0.53±0.027 0.47+0.047 0.64±0.015

[Аг^Ч-дерморфин 0.69+0.040 0.59±0.030 0.49+0.030 0.68±0.011

[0-А1а41-дерморфин 0.61+0.017 0.63±0.022 0.51+0.012 0.71+0.015

Н-Туг-ОА1а-РЬе—Оа!а-ОН 0.84+0.037 0.53±0.037 0.47+0.047 0.69±0.024

[Агя21-дерморфин 0.50Ю.047 0.56±0.049 0.42+0.039 0.66±0.020

Серотонин 0.88+0.015 0.39+0.032 0.33±0.032 0.58+0.013

Дофамин 0.58+0.049 0.61+0.027 0.38±0.042 0.72+0.027

Гистамин 0.97+0.052 0.37±0.042 0.34+0.054 0.64±0.041

*р<0,05

Показано, что уровень антител класса в среднем по группе не отличается от нормы и остаётся практически одинаковым у всех обследованных лиц, как в случае биогенных аминов, так и опиоидных пептидов. Для группы обследованных больных содержание антител ^М класса было наиболее информативным и позволяло обнаружить высокий процент пациентов с достоверным изменением уровня антител по сравнению с нормой.

В этой группе наблюдается специфическое увеличение уровня антител ^М класса, связывающих дерморфин, (З-эндорфин, энкефалин (р<0.05). Содержание антител к ряду аналогов дерморфина в целом по группе достоверно не отличалось от нормы.

Интересные результаты были получены при анализе содержания ^М антител специфичных к опиоидным пептидам для больных аллергическим поллинозом. В этой группе выявлено достоверное снижение нормального уровня е-АТ, связывающих все исследуемые эндогенные опиоидные пептиды. Более того, это снижение было высокоспецифичным именно для эндогенных нейропептидов, поскольку в среднем по группе не было обнаружено достоверных различий для антител ^М класса, связывающих синтетические аналоги дерморфина.

В группе больных нейродермитом отмечается тенденция к снижению содержания е-АТ к эндогенным опиоидным пептидам. Но достоверной разницы по сравнению с группой доноров не установлено.

Анализируя результаты, представленные в таблице 4, с точки зрения наибольшего отклонения от нормы у больных в содержании антител ^М класса для различных опиоидных пептидов, мы обнаружили, что такой эффект в наибольшей степени свойственен дерморфину (р<0.05). Известно, что дерморфин наиболее стабилен в организме среди известных опиоидных пептидов, что, вероятно, играет существенную роль в проявлении антигенных свойств.

Для больных опийной наркоманией можно наблюдать достоверное повышение содержания антител ^М класса к серотонину и гистамину (р<0,05). Полученный факт подтверждает известные данные об участии серотониннергической системы в развитии зависимости к наркотикам. Приём наркотика ведёт к повышенному выбросу серотонина, который в свою очередь оказывает влияние на синтез специфических иммуноглобулинов, способных, вероятно, выполнять компенсаторную функцию и регулировать

концентрацию данного соединения.

Для группы больных аллергическим поллинозом и нейродермитом характерно достоверное (р<0.05) понижение содержания антител ^М класса к серотонину и гистамину.

Из совокупности представленных данных о содержании е-АТ к биогенным аминам и опиоидным пептидам в норме и клинике заболеваний следует, что уровни этих антител изменяются при патологических процессах, связанных с нарушениями обмена их антигенных мишеней и, возможно, индуцированы этими нарушениями. Причём, изменения уровней е-АТ происходит таким образом, чтобы компенсировать патологические отклонения в метаболизме антигенов и, тем самым, нейтрализовать их патогенетическое действие (если антигены биологически активны). Это позволяет сделать предположение, что е-АТ выполняют в норме гомеостатическую или защитную функцию, поддерживая концентрации различных эндогенных соединений в пределах нормы.

Патологическая роль е-АТ, по-нашему мнению, может проявляться лишь при их чрезмерной продукции, связанной, возможно, с нарушением регуляции их синтеза, и может рассматриваться в этом случае, как симптом аутоиммунного расстройства; или, наоборот, при недостаточной их продукции, в результате специфического иммунодефицита (у больных нейродермитом и аллергическим поллинозом). В этом случае проявляется патологическая роль не е-АТ, а их антигенной мишени.

3. Выделение аффинной хроматографией естественных антител к биогенным аминам, опиоидным пептидам и исследование их свойств.

Выделение антител к (3-эндорфину, дерморфину, серотонину, гистамину, дофамину из сыворотки крови доноров и больных опийной наркоманией проводили аффинной хроматографией с помощью синтезированного иммуносорбента. Для его получения к суспензии аминопропилированного стекла, активированного предварительно полинитрофенилакрилатом, добавляли соответствующие количества (5-эндорфина, дерморфина, серотонина, гистамина, дофамина. После ковалентного связывания гаптенов с макропористым носителем определяли ёмкость полученных сорбентов и использовали их для аффинной хроматографии.

3.1. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к р -эндорфину, дерморфину, серотонину, дофамину и гистамину.

После проведения хроматографии из сыворотки крови доноров и больных были выделены антитела к (5-эндорфину, дерморфину, серотонину, дофамину и гистамину ^О и ^М класса. Причём у 60% доноров установлено наличие антител класса и только в единичных случаях (10%) одновременно присутствовали ^М и антитела. У 30% доноров в выделенной из сыворотки фракции не удалось идентифицировать в ИФА принадлежность к конкретному классу иммуноглобулинов (рисунок 3).

Процентное соотношение выделенных антител в сыворотке доноров

10«.

■ IrG ■ IftG+IftNI ■ класс иммуноглобулина не идентпфицнрован 1'нсуиок' 3. 11ронентное со» i ношение выделенных ан гн тел Ii i сынороз кн (опорой.

При исследовании нзотпннческого состава аптшед против опиондлых пептидов и биогенных аминов, выделенных in сыворотки крови больных ошшпои наркоманией, обнаружены значительные отличия по сравнению с донорами. Iii каждого образца хроматографнрованы антитела к |( 'шдорфипу. дерморфпну. серотошшу. дофамину и гистамину IgG и Iкласса. Однако, как видно из представленных на рисунке 4 данных, в среднем у 70-80'/ обследованных больных выделены антитела IgM класса, а у остальных-Ig.Yl и IgG класса (рисунок 4).

Гпемкнс 4. IboiiiiiiPiecK'iiii состав антител.

Таким образом, при развитии заболевания происходят качественные и количественные изменения состава апштел. В сыворо1ке крови больных, в основном, присутствуют антитела IgM класса.

Далее для всех анализируемых образцов антител против ß-'ждорфина, дерморфипа. ееротонина. гистамина. дофамина определи.ш константу аффинности (Kai. I'aciöi К"а проводили по метод) Anieloclal (I9S4 i.).

Таблица 5. Определение Ка дли антител, выделенных II) сыворотки крови доноров н больных.

Исследуемый антиген Диапазон Ка. М'1

Группа больных Группа доноров

1ёО 1ёС 1аМ

|)-'Л1дорфин ю"-ю' ю'-ш1" ю'-ю4 Ю'-Ю4

дерморфнн 10"-10"' Ш5-10" КГ4-К)' -

серотонин ю'-ю1" ю'-ю" К)'-К)4 Ю'-Ю4

гистамин 10'-10'' Ю'-Ю1" Ю4-1(Г ю'-ю4

дофамин ю'-ю"' с ю'-ю4 Ю'-Ю4

В результате было установлено, что у 30% доноров Ка составляет величину ш'-Ю4 М'1 для 1^0 н для 1«М антител в случае р-эндорфина. Ка для 1«С антител к дерморфину составляет величину Ш^-Ю" М'1. В оставшихся образцах сыворотки крови Ка рассчитать не удалось, что, вероятней всего, связано с наличием популяции низкоаффшшых антител к данным ан тигенам в крови здоровых доноров. Для антител к биогенным аминам Ка измерена в диапазоне МГ'-КГ1 для 1»М и 10 '-10"5 для

Как видно из данных определения Ка в группе больных наблюдается возрастание аффинности антител но всем исследуемым антигенам и лежит в диапазоне от ЮМО7 М"1 до 107-

Далее для всех исследуемых образцов аффинно очищенных антител была изучена специфичность связывания с некоторыми антигенами, имеющими либо сходные с пептидами н биогенными аминами структурные фрагменты, либо проявляющих похожую физиологическую активность. Специфичность рассчитывали как отношение молярных концентраций антигена, использованного для аффинной хроматографии антител, и исследуемого антигена-ингибитора, вызывающих в ИФЛ 50% торможение связывания антител с коныогированным антигеном (рисунок

Нспольгуемый ингибитор - В-эндорфин

Используемый ингибитор - дгрморфин

-В-ЭНДОрф1Ш

-дерморфнн -серотонин -дофамин

- П1СШ.ИШ

Рисунок- 5. Специфичность антител, выделенных т сыворотки крови больных.

Н результате установлено, что все выделенные из сыворотки крови антитела индивидуальны по своей специфичности и не дают перекрёстных реакций с исследованными ингибиторами, отличающимися по структуре от использованных для аффинной хроматографии.

Анализ результатов, связанных с исследованием биохимических свойств антител свидетельствует о тесной связи гуморального иммунитета с системой пептидных регуляторов, которые, как известно, играют важнейшую роль в патогенезе аллергических заболевании и заболевании зависимости. Как было установлено, по мере развития патологического состояния в организме у больного человека, происходит изменение уровня антител, возрастает их аффинность и способность избирательно связываться с антигенами, предохраняя организм от патогенного воздействия.

Далее для всех исследуемых образцов антител 1«М класса к дерморфину была изучена специфичность связывания с некоторыми эндогенными лнгапдами оппатных рецепторов, имеющими сходную с дерморфином физиологическую активность.

Выбор пептидных аналогов дерморфину проводили с учётом общей для всех соединений биологической опиоидной активности (Коршунова Г.А., Сумбатен Н.В. 1989: Ме1сЫот Р., N0511 Ь. 1996]. В связи с этим все исследуемые вещества можно условно разбить на три группы:

1. В первую вошли укороченные, модифицированные фрагменты дерморфипа- это Ы- концевой тетранептид и С-концевон аналог дерморфнна. Биологическая активность соединения (1) полностью сохраняется, а в случае соединения (11) - она отсутствует.

И. Вторую групп)' составили вещества, полученные либо точечной заменой аминокислотных остатков в дерморфнне, либо модификацией пептидного состава, путём

введения D-аминокислот. Такие соединения сохраняют лишь 2-3% опиоидной активности дерморфина.

III. Третья группа представлена аналогами дерморфина с изменениями в структуре пептида по второму аминокислотному остатку. Эти вещества сохраняют от 45 до 60% биологической активности.

В результате проведённого исследования установлена индивидуальность антител по своей специфичности. Наиболее значительным перекрестом с морфином обладают некоторые антитела из сыворотки крови больных опийной наркоманией (№ 6,7,9). Это, вероятно, связано с наличием общих детерминант у дерморфина и морфина, участвующих в связывании с ц-опиатным рецептором. Для больных нейродермитом только в сыворотке №4 обнаружено торможение морфином (12%).

При исследовании специфического взаимодействия с аналогами дерморфина было

установлено, что выделенная популяция антител наиболее полно связывается с N-концевым

тетрапептидом, как в случае больных нейродермитом, так и опийной наркоманией. Именно

этот фрагмент обладает биологической активностью. Незначительное связывание и с аналогами

дерморфина второй группы. У большинства обследованных лиц не наблюдается

специфического взаимодействия и с третьей группой аналогов дерморфина.

Таблица 6. Специфичность антител против дерморфина, выделенных из сыворотки крови больных нейродермитом, опийной наркоманией и доноров

№ Группы обследованных лиц % ИНГИБИРОВАНИЯ В ИФА

ДМ МФ Р-эд Leu ЭФ Met-ЭН I II III IV V VI VII VIII

1 Больные нейродермитом 100 0.1 - - 0.01 42 - 0.01 0.01 22 0.01 0.01 0.01

2 100 4.2 - - 0.1 18 - 0.1 0.3 10 0.7 - -

3 100 3.3 0.7 - 0.7 31 0.01 - - 0.1 0.1 - -

4 100 12.0 1.5 - 0.01 22 0.01 - 0.01 0.1 - - -

5 100 - 1.0 0.1 - 0.1 0.2 - 0.05 - - - -

6 100 - 0.2 0.4 - 17 - 0.1 - - 0.1 - -

7 100 - 1.1 - 0.3 0.9 0.1 - - 12 0.4 0.5 0.01

8 100 0.01 - 1.8 2.4 8 - - - 7 0.1 0.1 -

1 Больные опийной наркоманией 100 - 7.2 1.8 0.09 12 0.01 0.01 0.9 - - 0.01

2 100 - 2.4 3.3 0.01 10 - 0.2 - 2 0.1 0.1 -

3 100 0.1 0.05 2.0 - 0.1 0.1 - - 1.1 0.4 - -

4 100 0.05 4.3 0.1 - 0.7 - 0.1 0.4 0.1 - 1.2 -

5 100 0.01 - 5.3 0.7 . - 0.02 - 0.01 - 0.7 0.1

6 100 24.0 5.1 16.5 - 41 0.01 - - 4.4 0.1 0.4 5.2

7 100 81.0 2.6 - - 47 0.01 - - - 0.2 - 0.9

8 100 0.7 - - - 2 - - 0.1 0.1 0.01 - 0.7

9 100 42.0 - 0.8 0.01 19 - 0.3 - 0.8 - 0.1 0.01

10 100 0.8 1.8 0.1 0.01 28 0.1 0.05 0.01 0.4 - - 0.1

ДОНОРЫ 100 - - - 0.1 0.1 - 0 - 0.1 - - -

ДМ - дерморфин МФ - морфин ß—ЭД - ß-эндорфин Leu-ЭФ - Ьеи-энкефалин

III. [Arg ]-дерморфин

IV. D-Tyr-Dala-Phe-Dala-Tyr-Pro-Ser-OH

V. [Т>-А1а4]-дерморфин

VI. [0-0гп2]-дерморфин

Met-'M>- Мемикефадип Vil. |1)-Л|«:|-дер\1орфпп

I. 1 l-T)r-Dula-l'he-lJala-Ol 1 V111. | U-Lys'l-лерморфип

II. ll-Tyi-Tyr-l'io-Sei-NIl,

Анализируя ti занмодспствис антител с дерморфином с точки зрения сто аминокислотной последовательности. можно сделать шлиод. что наиболее существенный вклад и что взаимодействие вносит N-концевои тет рапептид, который обладает и биологической актпвное'1 ыо. Замена первого аминокислотной) остатка (Туг) молекулы дерморфина на (Arg1) ведёт к снижению связывании с антителами и потери биологической активности. Следует отметин., что наличие алифатического (D-Ala) во втором положении дерморфина, также существенно влияет на взаимодействие антител. Замена этого остатка на основные аминокислоты (Ату, Lyr, От) приводит к значительному снижению связывания антител с чтими соединениями, хотя биологическая активность при этом надает только наполовину.

Таким образом, полученные данные расширяют поле знаний о закономерностях специфического взаимодействия антител, образующихся в сыворотке крови больных, с дерморфнпом, ею аналогами различной структуры и эндогенными иейропептидамн.

4.С|)а1Ч1нте,т|.|1ый анализ изменении уровня антител к биогенным амннам и »пион IIH.IM пептидам и норме и при чашиеиаииих зависимости.

Проведено сравнительное выявление антител к эндогенным биорегуляторам: серотонии, дофамин и [i-чпдорфни в сыворотке крови больных опийной наркоманией, алкоголизмом, шромапией п допоров. г>ги медиаторы являются участниками основных биохимических Процессов, в регуляции которых принимает участие нервная и нммупиая системы. Им принадлежит ведущая роль в механизме формирования заболеваний зависимости. Результаты анализа представлены в таблице 7.

Таблица 7. Результаты ИФД определении ан тител к ссротоннну, ß-эидорфнну, дофамину н группе больных онпйион наркоманией, алкоголизмом.

Грчнна больных и доноров 'Значение OD4s, в НФА в среднем ио ipviiiie

Серотонии Р-эщорфин Дофамин

Ьо.тьпые наркоманией 1,153 ±0.027 0.У41 ± 0,016 1,052±0.0|9

1>одьпые алкоголизмом 0.43У ± 0.023 0.259 ± 0.005 0.329 ± 0.037

Доноры 0.670 ± 0.026 о = 0.037 0.5X8 ±0.021 п = 0.029 0.721± 0,029 о = 0,053

' р < 0.01 (к cpaitiiciiiiu с донорами)

Выявлены естественные антитела к дофамину и ссротоннну достоверно превышающих

норму у 91% и 87% больных наркоманией соответственно. В случае Р-эндорфина увеличение уровня е-АТ наблюдалось только у 62% пациентов этой группы. У оставшейся части больных наркоманией содержание е-АТ оставалось в пределах нормы. В группе больных алкоголизмом при определении естественных антител у 95% пациентов наблюдался специфический иммунодефицит, т.е. достоверное снижение уровня е-АТ по сравнению с нормой ко всем выбранным для исследования антигенам.

В дальнейшем, проводили определения естественных антител к исследуемым антигенам у больных наркоманией, алкоголизмом и игроманией в период их лечения и нахождения в стационаре.

Таблица 8. Данные ИФА определения антител к серотонину, (З-эндорфину, дофамину у больных наркоманией в ходе проведения терапии.

Исследуемый антиген Средние по группе значения ОД450 в ИФА

Больные наркоманией Доноры

Этапы забора крови в динамике лечения

1-й день 3-й день 7-й день 21-й день

Серотонин 1,15 ±0,027 1,10 ±0,031 0,95 ± 0,024 0,90+0,021 0,670 ± 0,026

Р-эндорфин 0,94± 0,016 0,99± 0,023 0,81± 0,025 0,64± 0,019 0,588 ±0,021

Дофамин 1,05± 0,019 1,01± 0,021 0,95± 0,022 0,90± 0,025 0,721 ±0,029

* р < 0,01 (в сравнении с донорами)

В ходе лечения больных наркоманией отмечена тенденция к нормализации содержания е-АТ только для р-эндорфина и лишь на 21-й день нахождения в стационаре. В случае серотонина и дофамина уровень антител оставался достоверно повышенным для этой категории больных в течение всего периода времени лечения.

Таблица 9. Данные ИФА определения антител к серотонину, р-эндорфину, дофамину у больных алкоголизмом в ходе проведения терапии.

Исследуемый антиген Средние по группе значения ОД450 в ИФА*

Больные алкоголизмом Доноры

Этапы забора крови в динамике лечения

1-й день 3-й день 7-й день 21-й день

Серотонин 0,44± 0,023 0,3 9± 0,025 0,51± 0,018 0,62± 0,019 0,670 ± 0,026

Р-эндорфин 0,26± 0,005 0,41± 0,029 0,45± 0,017 0,49± 0,027 0,588 ±0,021

Дофамин 0,33± 0,037 0,34± 0,019 0,49± 0,021 0,61± 0,019 0,721± 0,029

* р < 0,01 (в сравнении с донорами)

Анализируя полученные результаты, можно отметить, что в отличие от группы больных опийной наркоманией, у этой категории пациентов происходит увеличение уровня естественных антител к серотонину и дофамину от достоверно сниженного к их нормальному содержанию,

соответствующему донорам. Более чем у половины больных этой группы к концу лечения восстанавливалось содержание антител к Р-эндорфину. Причем, повышение уровня антител начинается уже после 7-ого дня лечения в стационаре.

Таблица 10. Данные ИФА определения антител к р-эндорфину, дофамину, серотонину у больных игроманией.

Исследуемый антиген Средние по группе значения СЮ450 в ИФА*

Больные иг| зоманией Доноры

Выше нормы Ниже нормы

СЮ450 ИФА Кол-во чел. 0045о ИФА Кол-во чел.

Р-эндорфин - - 0,321 ±0,027 16человек 0,588 ±0,021

Дофамин 1,180±0,061 8 человек - - 0,721± 0,029

Серотонин 0,927±0,094 8 человек - - 0,670 ±0,026

* р < 0,01 (в сравнении с донорами)

Существует мнение, что возникновение и прогрессирование болезни «игромания» имеет одинаковые с наркоманией патогенетические механизмы, хотя эта зависимость и не связана с прямым действием экзогенного токсического вещества на организм человека. Индивидуализация полученных результатов ИФА для каждого больного явилась первым подтверждением высказанного предположения. Было установлено, что из 20 обследованных пациентов-игроманов у 16 человек (72%) почти в 2 раза снижен уровень специфических естественных антител к Р-эндорфину. А у оставшихся 4-х человек обследованной групп значение оптической плотности соответствует норме. Для 8 пациентов отмечено достоверное увеличение содержания е-АТ к серотонину дофамину.

Для практической оценки полученных результатов и возможности их использования в качестве дополнительного диагностического критерия проведено сопоставление результатов ИФА определения естественных антител с уровнем реабилитационного потенциала (УРП). Этот параметр получен по экспериментально-психологическим исследованиям профессором Т.Н. Дудко в НИИ наркологии МЗ и СР РФ (таблица 11).

Таблица 11. Сравнительные результаты ИФА антител к Р-эндорфину, дофамину, серотонину и определения уровня реабилитационного потенциала в группе больных игроманией.

Больные игроманией (20 человек) Диапазон УРП Уровень е-АТ Серотонин Уровень е-АТ Р-эндорфин Уровень е-АТ Дофамин

Группа 1 (4человека) 146-135 Повышен Норма Повышен

Группа 2 (16 человек) 67-78 Норма Понижен Норма

При сопоставлении результатов установили, что высокий УРП в диапазоне 146 -135 обнаружен у больных с достоверно повышенным содержанием естественных антител к серотонину и дофамину, при этом уровнем антител к Р-эндорфину остается нормальным (группа 1). Средний УРП 67-78 соответствует пациентам, у которых обнаружен специфический иммунодефицит, т.е. у данных лиц достоверно снижено содержание естественных антител к р-эндорфину.

Как видно из полученных результатов, при развитии заболеваний зависимости происходит изменение в иммунной системе, проявляющиеся в увеличении синтеза иммуноглобулинов, связывающих нейромедиаторы опиоидной и биогенной природы у больных наркоманией и снижение этих показателей при алкоголизме и игромании. Полученные данные могут быть использованы для создания новых способов ранней диагностики заболевания и помочь клиницистам в выборе комплексного подхода в лечебно-профилактической работе.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы конъюгированные антигены р-эндорфина, дерморфина, гистамина, дофамина и серотонина с использованием поли(4-нитрофенил)акрилата. Установлено оптимальное замещение (10-15%) гаптеном высокомолекулярной матрицы.

2. Разработаны условия проведения твердофазного иммуноферментного метода определения антител к р-эндорфину, дерморфину, гистамину, дофамину и серотонину в сыворотке крови человека с использованием новых синтетических антигенов. Установлено изменение уровня антител у людей с различными патологиями по сравнению с нормой.

3. Оптимизированы условия для определения антител к биогенным аминам (серотонину, дофамину и гистамину) в сыворотке крови человека на основе использования в иммуноферментном анализе новых синтетических антигенов.

4. Выделены аффинной хроматографией антитела к р-эндорфину, дерморфину, гистамину, дофамину и серотонину из сыворотки крови человека на основе синтезированных сорбентов. Изучены иммунохимические свойства данных антител и установлено, что при развитии заболеваний происходит их качественное и количественное изменении: увеличивается константа аффинности, повышается уровень высокоспецифичных антител ^М класса.

5. Установлена взаимосвязь между содержанием естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам и течением патологических процессов. Показана принципиальная возможность применения теста по определению антител к р-эндорфину, дофамину и серотонину для оценки эффективности лечения заболеваний зависимости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Мягкова М.А., Дудко Т.Н., Панченко Л.Ф., Петроченко С.Н., Морозова B.C., Бондаренко С.Н. «Определение естественных антител к эндогенным биорегуляторам у больных игроманией методом иммуноферментного анализа» // Наркология. 2006. - № 12. С. 39-42.

2. Манжос. М.В., Шкадов A.B., Никишин С.Н., Петроченко С.Н., Демерчян Ш.А., Абраменко Т.В., Мягкова МА. «Иммуноферментный метод определения специфических антител в слюне больных поллинозом» // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. - № 5. - С. 44-45.

3. Манжос. М.В., Шкадов A.B., Никишин С.Н., Петроченко С.Н., Демерчян Ш.А., Абраменко Т.В., Мягкова М.А. «Определение специфических антител в слюне больных полинозом методом иммуноферментного анализа» // Биотехнология. 2006. -№ 4. -С.93-95.

4. Петроченко С.Н., Мягкова МА., Морозова B.C., Шипицын В.В., Сокольчик Е.И., Брюн Е.А. «Иммуноферментный анализ естественных антител к эндогенным биорегуляторам для диагностики заболеваний зависимости» // Наркология. 2007. - № 10. С. 30-34.

5. Петроченко С.Н., Мягкова М.А., Демерчян Ш.А., Абраменко Т.В. «Сравнительное определение естественных антител к нейропептидам и биогенным аминам у больных наркоманией и игровой зависимостью» // 4-я Российская конференция "Нейроиммунопатология". 11-12 мая 2006 г. Москва. Тезисы доклада в сборнике Патогенез. 2006. - Т. 4. - № 1. - С. 62-63.

6. Мягкова МА., Петроченко С.Н., Шипицын В.В., Морозова B.C. «Сравнительное определение естественных антител к эндогенным биорегуляторам для диагностики заболеваний зависимости» // Третья Международная Научно-практическая конференция МЕДБИОТЕК "Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине" 4-5 декабря 2006 г. Москва.

7. Мягкова М.А., Дудко Т.Н., Панченко Л.Ф., Петроченко С.Н., Морозова B.C., Бондаренко С.Н., Теребилина H.H. «Сравнительное определение естественных антител к эндогенным биорегуляторам для диагностики игровой зависимости» // Международная конференция « Игровая зависимость: мифы и реальность» 21*22 июня 2006 г. Москва. Тезисы докладов. С. 89-92.

8. Мягкова М.А., Петроченко С.Н., Морозова B.C., Шипицын В.В., Беленькая Д.В., Копоров Д.С., Сокольчик Е.И., Брюн Е.А. «Определение естественных антител к эндогенным нейромедиаторам в норме и при патологии зависимости» // XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 16-20 апреля 2007 г. Москва, Тезисы докладов С. 502-503.

9. Жукова Т.В., Петроченко С.Н., Веревина М.Л., Калинина М.В., Пономарев E.H. «Установление диапазона фоновых значений эндогенных опиоидов в слюне практически здоровых лиц» // VIII межвузовская конференция с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» 15-16 мая 2009 г. Ростов-на-Дону.

10. Мягкова М.А., Бачурин С.О., Абраменко Т.В., Петроченко С.Н., Морозова B.C., Савицкая Ю.А. «Выявление скрытых форм наркомании с помощью иммуноферментного анализа» // Методические рекомендации № 23 «Выявление скрытых форм наркомании с помощью иммуноферментного анализа». - Москва. - 2006г.

11. Петроченко С.Н., Манжос М.В., Мягкова М.А. «Способ диагностики поллиноза «in vitro» в крови» // Заявка на патент № 2007109243 от 14.03.2007 г.

12. Петроченко С.Н., Манжос М.В., Мягкова М.А. «Способ диагностики поллиноза «in vitro» в слюне» // Заявка на патент № 2007109241 от 14.03.2007г.

Отпечатано в типографии ООО НВП «ИНЭК» Тираж 100 экз. заказ № 2858/9 г. Москва, Ленинградское шоссе, д. 18 тел. 8 (495) 786-22-31

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петроченко, Светлана Николаевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы. Естественные антитела к физиологически активным соединениям.

1.1. Общая характеристика естественных антител.

1.2. Иммунохимичсские свойства естественных антител.

1.3. Физиологическая роль естественных антител.

1.4. Естественные антитела к низкомолекулярным соединениям.

1.5. Взаимосвязь между естественными антителами и аутоантителами при патологии.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы исследований.

2.2. Методы исследований.

2.3. Получение синтетических антигенов к опноидным пептидам и биогенным аминам на полимерном носителе.

2.3.1. Получение конъюгата Р-эндорфина на основе полимерной матрицы.

2.3.2. Получение конъюгата дерморфпна на основе полимерной матрицы.

2.3.3. Получение конъюгата серотонина на основе полимерной матрицы.

2.3.4. Получение конъюгата гистамина на основе полимерной матрицы.

2.3.5. Получение конъюгата дофамина на основе полимерной матрицы.

2.4. Разработка иммуноферментного анализа для определения антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам.

2.4.1. Определение рабочего разведения анализируемой сыворотки и концентрации антигена, сорбируемого на планшете.

2.5. ИФА определения антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам в сыворотке крови человека.

2.5.1. ИФА определения антител к р-эндорфину в сыворотке крови человека.

2.5.2. ИФА определения антител к дерморфину и его аналогам в сыворотке крови человека.

2.5.3. ИФА определения антител к серотонину в сыворотке крови человека.

2.5.4. ИФА определения антител к гистамнну в сыворотке крови человека.

2.5.5. ИФА определения антител к дофамину в сыворотке крови человека.

2.6. Выделение антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам из сыворотки крови человека.

2.6.1 Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к дерморфину.

2.6.2. Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к р-эндорфину.

2.6.3. Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к гистамину.

2.6.4. Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к серотонину.

2.6.5. Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к дофамину.

2.6.6. Выделение антител к р-эндорфину аффинной хроматографией.

2.6.7. Выделение антител к дерморфину аффинной хроматографией.

2.6.8. Выделение антител к гистамину аффинной хроматографией.

2.6.9. Выделение антител к серотонину аффинной хроматографией.

2.6.10. Выделение антител к дофамину аффинной хроматографией.

2.7. Изучение иммунохимических свойств антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам.

2.7.1. Выбор условий проведения ингибиторного ИФА.

2.7:2. Ингибиторный ИФА для оценки специфичности и аффинности антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам.

2.7.3. Определение специфичности антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам.

2.7.4. Расчёт константы аффинности антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам.

3. Обсуждение результатов.

3.1. Получение реагентов для разработки иммуноферментного анализа определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам.

3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов к биогенным аминам и опиоидным пептидам на полимерной матрице.

3.2. Разработка метода иммуноферментного анализа определения антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека.

3.2.1. Определение антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека методом иммуноферментного анализа.

3.3. Выделение аффинной хроматографией естественных антител к биогенным аминам, опиоидным пептидам и исследование их свойств.

3.3.1. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к р — эндорфину, дерморфину, серотонину, дофамину и гистамину.

3.4. Исследование иммунохимических свойств антител к (3-эндорфину, дерморфину, выделенных из сыворотки крови доноров и больных наркоманией.

3.6. Сравнительное определение с помощью ИФА уровня естественных антител к биогенным аминам в сыворотке крови больных наркоманией и доноров.

3.7. Сравнительное определение с помощью ИФА уровня естественных антител против опиоидных пептидов в сыворотке крови больных наркоманией, нейродермитом и доноров.

3.8. Сравнительный анализ изменения уровня антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в норме и при заболеваниях зависимости.

3.9. Диагностическая значимость выявления антител к наркотикам, биогенным аминам, опиоидным пептидам у больных наркоманией.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноферментный анализ естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека"

Актуальность проблемы.

В последнее десятилетие интенсивно развивается новое научное направление биохимии, связанное с изучением функционирования гуморальной системы иммунитета. В этой области получены экспериментальные данные, имеющие важное, принципиальное значение. Прежде всего, необходимо отметить работы по выявлению в сыворотке крови здоровых людей естественных антител различной специфичности, направленных против эндо1енны\ макромолекулярных антигенов - белков цитоскелета, ферментов, нуклеиновых кислот, компонентов межклеточного матрикса и других антигенов [Maneta-Peyret L. 1991; Arnaud E. 1994; Iznaga Escobar N., Torres L.A. 1998; Misra N., Kaveri S.V. 2003; Kazatchkina M.D. 2005; Lacrois-Dismaress 2006].

Естественные антитела обнаружены и к низкомолскулярным эндогенным соединениям, пептидным гормонам, нейромедиаторам, которые в классическом понимании, сами по себе не являются антигенами. Механизм образования эндогенных конъюгированных антигенов низкомолскулярных соединений, способных индуцировать антитела, предложен в работах Ковалёва И.Е., Полевой О.Ю. 1985, 2002г.

Выполнены исследования, показавшие, что физиологической нормой для этих иммуноглобулинов является относительное единообразие репертуаров конститутивно экспрсссируемых естественных антител, которые сохраняются десятилетиями и мало зависят от возраста и пола здорового человека [Ayouba et al., 1997; Nobrega et al., 1997; Francoeur, 1988]. Индивидуальные различия по этим параметрам в норме весьма невелики. В то же время было установлено, что у лиц с теми или иными метаболическими нарушениями состава эндогенных биорегуляторов, сопровождающими течение различных заболеваний, происходят существенные долговременные и специфические количественные изменения в составе циркулирующих естественных антител. При этом содержание антител одной специфичности может повышаться, другой снижаться, третьей оставаться в пределах нормы. В зависимости от ситуации, выявляемые у пациентов изменения в продукции естественных антител могут быть адаптивными (компенсоторными), либо — дез адаптивными (паталогическнмн). Иммунная система отражает метаболические перестройки, происходящие в организме человека, а естественные антитела выполняют важную гомеостатическую функцию в организме. [Коренева Е.А., Шекоян В.А.

1988; March H., Pedersen B.K. 1995; Levy Soussan P., Avrameas S. 1996; Клюшиик Т.П. 1997; Морозов С.Г. 1997].

Эти исследования открывают перспективу применения полученных данных не только в научных целях, но и как важного клинико-лабораторного критерия для оценки нарушения функционирования иммунной системы организма при патологических состояниях.

На сегодняшний день наименее изученными являются процессы, касающиеся реакции гуморального звена иммунитета при наркомании, алкоголизме и всех состояний зависимости. В кровотоке практически всех здоровых люден обнаружены е-Ат к физиологически активным соединениям. Содержание таких антител изменяется при патологиях, обусловленных нарушением соответствующих биорегуляторов.

Цель исследования.

Целью данного исследования является разработка методов определения естественных антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам на основе твердофазного иммуноферментного анализа, изучение их специфических биохимических свойств и сравнительное определение изменения их уровня в норме и при развитии патологических процессов.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы получения биохимических реагентов синтетических антигенов (Р-эндорфина. дерморфина, серотонина, дофамина, гистамина) на полимерном носителе - поли(4-нитрофенил) акрилате;

2. Разработать нммуноферментные методы определения антител к опиоидным пептидам (Р-эндорфину и дерморфину) в сыворотке крови человека, провести сравнительный анализ содержания антител у доноров и больных с различными патологиями;

3. Оптимизировать условия определения антител к биогенным аминам (серотонину, дофамину и гистамину) в сыворотке крови человека на основе использования в нммуноферментном анализе новых синтетических антигенов перечисленных соединений;

5. Провести сравнительный анализ содержания специфических антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам в сыворотке крови человека и установить практическую значимость разработанных вариантов иммуноферментного анализа.

Научная новизна.

Созданы новые способы получения конъюгатов опиоидных пептидов (р-эндорфина и дерморфина) и биогенных аминов (дофамина, серотонина и гистамина) с использованием поли(4-ннтрофенил) акрилата.

Разработаны оригинальные методы твердофазного иммуноферментного анализа ИФА для определения естественных антител к опиоидным пептидам (Р-эндорфину и дерморфину) в сыворотке крови человека. На основе их применения для исследования сыворотки крови доноров и больных обнаружены антитела к указанным нейромедиаторам. Причём, установлено изменение уровня антител к Р-эндорфину и дерморфину по сравнению с нормой, в случае возникновения в организме человека процессов, связанных с проявлением клиники патологического влечения к употреблению наркотических веществ, алкоголю, азартным играм.

Синтезированы новые сорбенты для аффинной хроматографии; из сыворотки крови человека выделены антитела к опиоидным пептидам ((3-эндорфину и дерморфину) и биогенным аминам (дофамину, серотонину и гистамину). Исследованы биохимические свойства аффинно очищенных антител. Измерена константа аффинности и специфичность. Установлена взаимосвязь между структурой дерморфина, его биологической активностью и специфичностью естественных антител.

Научно-практическал значимость работы.

Показана возможность использования новых методов иммуноферментного анализа определения естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в практической медицине. Проведённое сравнительное определение содержания естественных антител к Р-эндорфину, дерморфину, дофамину, серотонину и гистамину позволило выявить их достоверное увеличение к указанным выше соединениям при наркомании и снижение их уровня при нейродермите и поллияозе. Найдена взаимосвязь между уровнем естественных антител к исследованным биорегуляторам в сыворотке крови больных и течением заболевания зависимости (наркомания, алкоголизм, игромания). Установлено, что определение естественных антител к гистамину при нейродермите и поллинозе может использоваться для оценки эффективности проводимой терапии. Разработанные способы анализа используются с 2006 года в Московском научно-практическом центре наркологии, Госпитале ФСБ России, а также ряде наркологических клиник страны.

Основные положения, выносимые на защит}'.

1. Метод иммуноферментного аналнза естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека на основе полученных синтетических антигенов (3-эндорфина, дерморфина, дофамина, серотонина и гпстамина.

2. Исследование биохимических свойств естественных антител к опиоидным пептидам и биогенным аминам, сравнительная оценка изменения их аффинности и специфичности в норме и при патологии.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Петроченко, Светлана Николаевна

ВЫВОДЫ.

1. Синтезированы конъюгированные антигены р-эндорфина, дерморфина, гистамина, дофамина и серотонина с использованием поли(4-нитрофенил)акрилата. Получены конъюгаты, содержащие различный диапазон замещения гаптеном матрицы (100% молекул лиганда; 30-50% молекул лиганда; 10-15% молекул лиганда), связанных с полимером. Изучено влияние замещения гаптеном полимерной матрицы на результаты иммуноферментного анализа.

2. Разработаны условия проведения твердофазного иммуноферментного метода определения антител к р-эндорфину, дерморфину, гистамину, дофамину и серотонину в сыворотке крови человека с использованием новых синтетических антигенов. Изучено влияние структуры антигена на полноту выявления специфических антител. Установлено изменение уровня антител к указанным антигенам у людей с различными патологиями, по сравнению с нормой.

4. Выделены аффинной хроматографией антитела к р-эндорфину, дерморфину, гистамину, дофамину и серотонину из сыворотки крови человека на основе синтезированных сорбентов. Изучены иммунохимические свойства данных антител и установлено, что при развитии заболеваний происходит их качественное и количественное изменение: увеличивается константа аффинности, повышается уровень высокоспецифичных антител класса.

Заключение.

Данное исследование проведено на стыке иммунологии и медицины и для создания подходов комплексной системы экспертизы и диагностики, которая позволяет выбрать методы дифференцированного лечения и реабилитации больных, страдающих различными видами зависимости и аллергическими заболеваниями.

Рядом исследователей, специализирующихся в области наркологии, высказано предположение, что в основе патогенетических механизмов заболеваний зависимости лежат те же факторы, что и при развитии классических случаев зависимости от психоактивных веществ (наркотиков и алкоголя), хотя очень часто болезни зависимости и не связаны с прямым действием экзогенного токсического вещества на организм человека. На сегодняшний день установлено, что при развитии некоторых видов наркомании происходит специфическое изменение гуморального иммунитета, выражающееся в увеличении уровня антител, связывающих как экзогенный наркотик, так и эндогенные нейромедиаторы. В механизме формирования наркотической зависимости ведущая роль принадлежит таким низкомолекулярным нейромедиаторам, как опиоидные пептиды, катехоламины и серотонин. Постоянное введение наркотиков животным способствует увеличению дофамина, норадреналина и серотонина. Для больных с различными видами наркомании на первой стадии формирования зависимости в плазме обнаружено увеличение уровня как самих нейромедиаторов, так и их метаболитов. При хроническом употреблении наркотиков происходит падение активности структур мозга, и уменьшение концентрации биогенных аминов. Необходимый уровень нейромедиаторов поддерживается за счет увеличения дозы наркотических веществ. Эти процессы способствуют в дальнейшем формированию физической и психической зависимости.

Иммунная реакция находится в тесной взаимосвязи с нервной системой организма. Опиоидные пептиды мозга являются одними из основных гуморальных факторов, осуществляющих эту взаимосвязь. В свою очередь, эти и другие виды нейропептидов, вырабатываемые клетками иммунной системы, служат каналом обратной связи иммунной системы с нейроэндокринными органами. Таким образом, опиоидные пептиды являются передатчиками; осуществляющими как прямые, так и обратные связи между нервной и иммунной системой организма.

Антитела к опиоидным пептидам и биогенным аминам здоровых людей являются частью иммунорегуляторной системы, модулирующей функции центральной нервной системы. При нарушениях взаимодействия этих систем организма, имеющих место при первичных психогенных заболеваниях, такие антитела могут выполнять важную компенсаторную, адаптивную, иммунорегулируюгцую функцию. Антитела могут вырабатываться на свойственные организму низкомолекулярные и высокомолекулярные соединения. В нормальных условиях имеются низкие титры к этим веществам. При определенных патологических состояниях, сопровождающихся нарушением обмена и повышением уровня эндогенных веществ или их метаболитов, происходит индукция иммунологических механизмов. Такой иммунологический процесс, направленный на метаболизм и выведение собственных молекул, протекает постоянно и является обязательным дополнением к ферментативным процессам, протекающим в организме.

Создание новых методов выявления уровня естественных антител, которые могут являться теми природными маркерами, отражающими течение заболевания, и его начальные стадии, позволит впервые получить не использовавшийся ранее в медицинской практике диагностический тест.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петроченко, Светлана Николаевна, Москва

1. Барнет Ф. «Клеточная иммунология» // Москва «Мир» - 1971 -542 страницы.

2. Беляев М.П. «Справочник лабораторных и функциональных показателей здорового человека» // Москва «Медицина» - 1992 - 28 страниц.

3. Брэдуэлл JI. «Антитела: методы» // Москва «Мир» - 1989 — в 2-х томах - 298 страниц.

4. Власов В.В. «Эффективность диагностических исследований» // Москва -«Медицина» выпуск 1 - 1988 - 297 страниц.

5. Глинн Л., Стьюард М. «Образование антител» // Москва «Мир» - 1983 - 196 страниц.

6. Глинн Л., Стьюард М. «Структура и функции антител» // Москва «Мир» - 1983 -200 страниц.

7. Гомазков O.A. «Роль ферментных систем в регуляции «триггерной» функции физиологически активных пептидов» // Вопросы медицинской химии 1988 — №1 -С. 12-18.

8. Гомазков O.A. «Функциональная биохимия регуляторных пептидов» // Москва -«Наука» 1993 - 160 страниц.

9. Гомазков O.A. «Современные тенденции в исследовании физиологически активных пептидов» // Успехи современной биологии 1996 - №1 - Т.116 - С. 6068.

10. Данилова ТА. «Гетерофильные антитела при патологических процессах человека» // Иммунология 1987 - №4 - С. 5-11.

11. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. «Аффинная хроматография: методы» // Москва -«Мир» 1988 - 278 страниц.

12. Добродеева Л.К., Суслонова Г.А. «Аутоантитела у практически здоровых людей» // Иммунология 1990 - №2 - С. 52-55.

13. Зотиков Е.А. «Антигенные системы человека и гомеостаз» // Москва 1982.

14. Ильчевич Н.В., Зеленская Т.М., Стошич-Богданович Н. «Гематотестикулярный барьер и аутоиммунные реакции в онтогенезе» // Физиологический журнал 1984- №1 Т.ЗО - С. 91-96.

15. Ильчевич Н.В., Лисяный Н.И., Янчий Р.И. «Антитела и регуляция функций организма» // Киев «Наукова думка» - 1986 - 248 страниц.

16. Ковалёв И.Е. «Иммунитет как функция системы организма, инактивирующей чужеродные химические соединения» // Химико-фармацевтический журнал 1977 -№12-С. 3-14.

17. Ковалёв И.Е., Полевая О.Ю. «Антитела к физиологически активным соединениям» // Москва «Медицина» - 1981 — 127 страниц.

18. Ковалёв И.Е., Полевая О.Ю. «Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям» // Москва «Наука» - 1985 - 302 страницы.

19. Корнева Е.А., Шекоян В.А. «Регуляция защитных функций организма» // Ленинград «Наука» - 1982 - 139 страниц.

20. Кочетов Г.А. «Практическое руководство по энзимологии» // Москва — «Высшая школа» 1980.

21. Крупник В.Е., Полевая О.Ю., Самсонов В.А. и другие «Динамика содержания аутоантител против гистамина у больных нейродермитом» // Вестник дерматологии и венерологии 1987 - №11 - С.12-14.

22. Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков H.H. «Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма» // Москва — «Медицина» 1989 - 320 страниц.

23. Кульберг А .Я., Елистратова И. А., Тарханова И.А., Бартова Л.М., Черноусова Л.М. «Естественные антитела: строение и происхождение» // Иммунология 1986 — №2 -С. 14-19.

24. Ломакин М.С., Майский И.Н., Ларин A.C. и другие «Антигены, общие для micobacterium bovis (БЦЖ) и некоторых злокачественных и нормальных тканей дабороторных животных» // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины- 1977-№1 С.65.

25. Ломакин М.С., Бочко Г.М. «Медиаторы системы иммунологического надзора» // Иммунология 1987 - №3 - С. 17-22.

26. Минцер О.П., Угарова Б.Н., Власова В.В. «Методы обработки медицинской информации» // Киев «Вища школа» - 1982 — 250 страниц.

27. Мишер А., Фолендер М. «Иммунопатология в клинике и эксперименте и проблема аутоантител» // Москва «Медгиз» - 1963 — 356 страниц.

28. Мягкова М.А., Трубачева Ж.Н., Панченко О.Н. «Иммуноферментный анализ для выявления естественных антител к катехоламинам» // Клиническая лабораторная диагностика 1997 - №3 - С.8-12.

29. Мягкова М.А. «Естественные антитела» // Монография — Москва.-1997.

30. Нго Т.Т., Ленхофф Г. «Иммуноферментный анализ» // Москва — «Мир» 1988 -198 страниц.

31. Остерман JI.A. «Хроматография белков и нуклеиновых кислот» // Москва -«Наука» 1985 - 536 страниц.

32. Пол У. «Иммунология» // Москва «Мир» - в 3-х томах - 1989.

33. Полевая О.Ю., Данилова Н.П., Крупник В.Е. и другие «Твердофазный иммуноферментный метод выявления аутоантител к простагландинам» // Синтез и исследование простагландинов: Тезисы докладов всесоюзного симпозиума — Таллин 1986-С.47.

34. Полевая О.Ю., Крупник В.Е. «Выявление иммунофермептным методом свободноциркулирующих и связанных в иммунные комплексы аутоантител в сыворотках человека» // Иммунология 1988 - №3 - С.88-90.

35. Полевая О.Ю., Перфильева Е.А., Селезнева JI.A. и другие «Конкурентный иммуноферментный метод количественного определения простагландина F2a» // Иммунология 1988 - №4 - С.76-79.

36. Полетаев А.Б. «Регуляторные антитела» // Сборник «Моноклональные антитела в нейробиологии» Новосибирск - 1995 - С. 37-47.

37. Торосян А.Ц. «Аффинность антител» // Успехи современной биологии 1980tom89. № 3.-C. 419-432.

38. Ailus K., Palosuo T. «IgM class autoantibodies in human cord serum» // J. Reprod. Immunol 1995 - 29(1) - P.61-67.

39. Algiman M., Dietrich G., Nydegger LI., Boieldieu D., Sultan Y., Kazatchkine M.D. «Natural antibodies to factor. VIII antihemophilic factor in healthy individuals» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 3795.

40. Ames P.R., Alves J., Murat I. et al. «Oxidative stress in systemic lupus erythematosus and allied conditions with vascular involvement» // Rheumatology Oxford 1999 -38(6) - P.529-534.

41. Andersson A., Forsgren S., Soderstrom A., Holmberg D. «Monoclonal natural antibodies prevent development, of diabetes in the nonobese diabetic NOD mouse» // J. Autoimmun. 1991. - V. 4 - P. 733.

42. Andris J.S., Copra J.D. «Variable region gene utilizationin human antibodies to exogeneous antigens» // In:. Zanetti, M., Capra, J.D. Eds. The Antibodies. Harwood Academic Publishers Amsterdam - 1996 -P.l.

43. Adih M.r Ragimbeau,/., Avrameas S., Ternynck T. «IgG autoantibody activity in normal mouse serum is controlled by IgM» // J. Immunol. 1990 - V. 145 - P. 3807.

44. Avrameas S., Dighiero G., Lymberi P., Guilbert B. «Studies on natural antibodies and autoantibodies» // Ann. Inst. Pasteur Immunol. 1983. - V. 134D. -P. 103.

45. Avrameas S. «Natural autoantibodies: from 'horror au-totoxicus' to 'gnothi seauton'» // Immunol Today-1991.-V. 12.-P. 154.

46. Avrameas S., Ternynck T. «Natural autoantibodies: the other side of the immune system» // Res. Immunol. 1995. - V. 146. - P. 235.

47. Ayouba A., Peltre G., Cautinho A. «Quantitative analysis of multiple V region interactions among normal human IgG» // Eur. J. Immunol. 1996. -V. 26,- P. 710.

48. Ayouba A., Ferreira C, Coutmho A. «Distinguishable patterns of connectivity in serum immunoglobulins from SLE patients and healthy individuals» // Scand. J. Immunol. -1997. V. 45. - P. 408.

49. Bakimer R.: Fishman P., Blank M., Sredni B„ Djaldetti M., Shoenfeld Y. «Induction of primary antiphospholipid syndrome in mice by immunization with a human monoclonal anticardiolipin antibody H-3» // J. Clin. Invest. 1992. - V. 89. - P. 1558.

50. Bayry J., Lacroix-Desmazes S., Kazatchkine M.D., Hermine O., Tough D.F., Kaveri S.V. «Modulation of dendritic cell maturation and function by B lymphocytes» // J Immunol.-2005. -V.7.- P. 15-20.

51. Besredka M «Les antihemolysines naturelles» // Ann. Inst. Pasteur. 1901 - V. 15. - P. 758.

52. Blocher IT. «Receptors, antibodies and diseases» // Clin. Chem. 1984. - V. 30(7). - P. 1137-1156.

53. Boyden S.V. «Natural Antibodies and the Immune Response» In: Advanses in Immunology, ed by F.J. Dixon, J.H. Hhumphre Academic. Press — New York - 1966 - 5 - P.1-28.

54. Burnet M. «'The Clonal Selection Theory of Acquired Immunity. Vanderbilt University Press»//Nashville 1959.

55. Calzi L., Battiato S., Santini F., et al. «Autoantibodies to Thyroxin and Triiodthyronine in the immunoglobulin G Fraction of Serum» // Clinical Chemistry 1988 - V.34 -№12 - P.2561-2562.

56. Carlan M.C., Peres A., Nardi N.B. «Frequency of B cells in normal mice which recognize self proteins» // Braz. J. Med. Biol. Res. 1997 - 30(2) - P.225-230.

57. Casali P., Burastero S.E., Nakamura M., et al. «Human Lymphocytes Making Rheumatoid Factor and Antibody to ssDNA Belong to Leu-1+ B-Cell Subset» // Science 1987 - V.236 - P.77-81.

58. Challenor V.F. «Angiotensin converting enzyme inhibitors in Raynaud's phenomenon» // Drugs 1994. - V. 48. - №6 - P. 864-867.

59. Chen P.P., Albrandt K., Orida N.K. et al. «Genetic Basis for the Cross-Reactive Idiotypes on the Light Chains of Human IgM anti-IgG Autoantibodies» // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986 - 83(21) - P.8318-8322.

60. Chen J.J., Kaveri S., Kohler II. «Cryptic T cell epitopes in polymorphic immunoglobulin regions: evidence for positive repertoire selection during fetal development» // Eur J. Immunol. 1992 - V. 22 - P. 3077.

61. Chow D., Bennet R. «Low natural antibody and low in vivo tumor resistance, in xidbearing B-cell deficient mice» // J. Immunol. 1989. - V. 142. - P. 3702.

62. Cohen I.R., Cooke A. «Natural autoantibodies might prevent autoimmune disease» // Immunol. 1986. - Today 7 - P. 363.

63. Colnaghi M.J., Menard S., Togliabue E., et al. «Heterogeneity of the natural humoral anti-tumor immune response in mice as shown by monoclonal antibodies» // J. Immunol. 1982 - V.128 - P.2757.

64. Coscnza M. «Detection of anti-idiotype reactive cells in the response to phosphorylcholine» // Europ. J. Immunol. 1976 - V.6 - P.l 14.

65. Coulmho A. «Beyond clonal selection and network» // Immunol. Rev. — 1989. — V. 110 -P. 63.

66. Coutinho A., Kazatchkine M.D., Avrameas S. «Natural autoantibodies» // Curr. Opinion Immunol. 1995 - 7(6) - P.812-818.

67. Coutinho. A. «Simple developmental programs of gene expression and cellular composition of lymphoid organs at the origin of natural tolerance» // Res. Immunol. -1995- 146(4-5)-P.321-332.

68. Diaw L., Magnac C., Pritsch O. et al. «Structural and affinity studies of IgM polyreactive natural autoantibodies» // J. Immunol 1997 - 158(2) - P.968-976.

69. Dietrich G., Piechaczyk M, Раи В., Kazatchkine M.D. «Evidence for a restricted idiotypic and epitopic specificity of anti-thyroglobulin autoantibodies in patients with autoimmune thyroiditis» // Eur. J. Immunol. 1991. - V. 21. -P. 811.

70. Dietrich G.r Algiman M.f Sultan ¥., Nydegger ILK, Kazatchkine M.D. «Origin of anti-idiotypic activity against anti-factor VIII autoanti bodies in pools of normal human immunoglobulin G IVIg» // Blood 1992. - V. 79. - P 2946.

71. Dighiero C., Lymberi P., Masie J.C. et al. «Murine Hybridomas Secreting Natural Monoclonal Antibodies Reacting With Self Antigens» // J. Immunol. 1983 - 131(5) -P.2267-2272.

72. Dighiero G., Lymberi P., Guilbert B. et al. «Natural Autoantibodies Constitute a Substantial Part of Normal Circulating Immunoglobulins» // Ann. N. Y. Acad. Sei. -1986 V.475 - P. 134-144.

73. Dighiero G., Lymberi P., Holmberg D. et al. «High frequency of natural autoantibodies in normal newborn mice» // J. Immunol. 1985 - V. 134 - №2 - P.765-771.

74. Dinarello C.A. «Is there a role for Interleukm-1 blokade in Intravenous Immunoglobulin therapy» // Immunol. Rev. 1994 - V. 139. - P. 173.

75. Dmarello C, Thompson R.C. «Blocking IL-1: interleukin 1 receptor antagonist in vivo and in vitro. Immunol» // Today 12. 1991. - P. 404.

76. Durandy A., Schiff C., Botmefoy J. Y. «Induction by anti-CD40 ligand and cytokines of IgG, IgA and IgE production by B cells from patients with X-linked IgM syndrome» // Eur. J. Immunol. 1993. - V. 23. - P. 2294.

77. Dwyer D.S., Bradley R.J., Urquhart C.K., Kearney J.F. «Naturally occurring anti-idiotypic antibodies in myasthenia gravis patients» // Nature. 1983. - V. 301. -P. 611.

78. Eisenberg R.A., Theofilopoulos A.N., Andrews B.C., et al. Natural Thymocytotoxic autoantibodies in autoimmune and normal mice // J. Immunol. — 1979. V.122, N 6. -P.2272.

79. Eliat D., Hochberg M., Pumphrey J., et al. Monoclonal antibodies to DNA and RNA from NZB/NZW Fl mice: antigenic specificities and NH2 terminal amino acid sequences // J. Immunol. 1984.-v.133, N 1. - P.489-494.

80. Els W.J., Helman S.I. Dual role of prostaglandins (PGE2) in regulation of channel density and open probability of epithelial Na+ channels in frog skin (R. pipiens). // J. Membrane Biol. 1997. - V. 155, N 1. - P.75-87.

81. Elson C.J., Naysmith J.D., Taylor KB. «B-cell tolerance and autoimmunity» // Int Rev. Exp. Pathol. 1979. - V. 19. - P. 137.

82. Elson C.J., Williams N.A. «Autoreactive T cells repertoire» // Immunol Today 1995 -V. 16.-P. 71.

83. Filion M.C., Bradley A J., Devine D.V., Decary F., Chartrand P. «Autoreactive T cells in healthy individuals show tolerance in vitro with characteristics similar to but distinct from clonal anergy» // Eur. J. Immunol. 1995. - V. 25 - P. 3123.

84. Finnegan A., White N.B., Hodes R.J. «Function of autoreactive T-cells in immune respoces» // Immunol. Rev. 1990. - V. 116. - P. 15-31.

85. Fischer E., Rieux V., Guillet J.G., Kazatchkine M.D. «The human immunodeficiency virus preventive vaccine research at the French National Agency for acquired immunodeficiency syndrome research» // Mem Inst Oswaldo Cruz.-2005,- V.2.- P. 7984.

86. Francoeur A.M. «Antibody fingerprinting: a novel method for identifying individual people and animals» // Biotechnology. 1988. - V. 6. - P. 822.

87. Gatili U., Clark M.R., Shohet S.B. «Excessive binding of natural anti-alpha-galactosyl immunoglobulin G to sickle erythrocytes may contribute to extra-vascular cell destruction» // J Ctin Invest 1986. - V. 77. - P. 27.

88. Gilles J.G., Saint-Remy J.M. «Healthy subjects produce both anti-factor VDI and specific anti-idiotypic antibodies» // J. Clin. Invest. 1994. - V. 94 - P. 1496.

89. Glowinski J., Iversen L. «Regional studies of catecholamines in the rat brain» // J. Neurochem 1966. - V. 13. - № 8. - P. 655-669.

90. Grabar P."Self' and "not-self' in immunology // Lancet. 1974. - V.l, N 7870. -p.1320-1322.

91. Grabar P. Autoantibodies and the physiological role of immunoglobulins // Immunol. Today. 1983. - V.4, N 12. - P.337-340.

92. Grabar P. Hypothesis. Auto-antibodies and Immunological Theories: Analytical Reviw // Clin. Immunol. Immunopathol. 1975. - 4(4). - P.453-466.

93. Grabar P. Les Globulines du Serum Sanguin // Liege. 1987. - P.25.

94. Grabar S., Moing V.L., Goujard C., Egger M., Leport C., Kazatchkine M.D., Weiss L.,

95. CostagliolaD. « Response to Highly Active Antiretroviral Therapy at 6 Months and Long-Term Disease Progression in HIV-1 Infection» // J Acquir Immune Defic. Syndr. 2005,- V.7.- P.284-292.

96. Greenberg A.H., Chow D.A., Wolosin L.B. «Natural antibodies: origin, genetics, specificity and role in host resistance to tumors» // Clin. Tnimunel. Allergy. 3. 1983. -P. 389.

97. Gttigou V.f Guilbert B., Moinier D. «Ig repertoire of human polyspeciflc antibodies and B-cell ontogeny» // J. Immunol. 1991. - V. 146. - P. 1368.

98. Guilhert B., Dighiero G., Avrameas S. «Naturally occuring antibodies against nine common antigens in normal human sera. I. Detection, isolation, and haracterization» // J. Immunol. 1982. - V. 128. - P. 2779.

99. Guilpain P., Chanseaud Y., Tamby M.C., Larroche C., Guillevin L., Kaveri S.V., Kazatchkine M.D., Mouthon L. «Immunomodulatory effects of intravenous immunoglobulins» // Presse Med.-2004.- V.10.- P.9-23.

100. Hahn B.H. «Characteristics of pathogenic subpopulations of antibodies to DNA» // Arthritis. Rheum. 1981. - V. 25. - P. 747.

101. Hahn-Zoric B., Carlsson J., Bjorkander A.D., Osterhaml M.E., Mellander L., Hanson L.A. «Presence of non-maternal antibodies in newborns of mothers with antibody deficiencies» // Pediatric. Res. 1992. - V. 32. - P. 150.

102. Hanson L.A., Telemo E. «Immunobiology and epidemiology of breast feeding in relation to prevention of inffections from a global perspective» // In: Eds. Mucosal. Immunol. Academic Press 1997.

103. Harrap S.B., Nicolaci J.A., Doyle A.E. «Persistent effects on blood pressure and renal hemodynamics following chronic angiotensin converting enzyme inhibition with perindopril» // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1986. - V. 13. - P. 753-765.

104. Heard I., Potard V., Foulot H., Chapron C., Costagliola D., Kazatchkine M.D. « High Rate of Recurrence of Cervical Intraepithelial Neoplasia After Surgery in HIV-Positive Women» // J Acquir Immune Defic. Syndr.- 2005.- V.4.- P.412-418.

105. Hintner H. Romani N., Stanzl U., Gntbauer G., Fritsch P., Lawley T.J. «Phagocytosis of keratin filament aggregates following opsonization with Ig anti- keratin filament autoantibodies» // J. Invest. Dermatol. 1987. - V. 88. - P. 176.

106. Holmberg D., Forsgren S., Ivars F., Coutinho A. «Reactions amongst IgM antibodies derived from normal, neonatal mice» // Eur. J. Immunol. 1984. - V. 14. -P. 435.

107. Holmberg D., Wennerstrom G., Andrade L., Coutinho A. «The high idiotypic connectivity of 'natural' newborn antibodies is not found in adult mitogen-reactive B cell repertoires» // Eur. J. Immunol. 1986. - V. 16. - P. 82.

108. Huetz F., Larsson-Sciard E.L., Pereira P., Portnoy D., Coutinho A. «T-cell dependence of the natural autoreactive B cell activation in the spleen of normal mice» // Eur. J. Immunol. 1988. - V. 18.-P. 1615.

109. Hurez V., Dietrich G., Kaveri S. V., Kazatchkine M.D. «Polyreactivity is a property of natural and disease associated human autoantibodies» // Scand. J. Immunol 1993 - V. 38 - P. 190.

110. Jerne N.K. «Towards network theory of the immune system» // Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 1974. - V. 125. - P. 373-389.

111. Isenberg D.A., Shoenfeld Y., MadaioM.P. «Anti-DNA antibody idiotypes in systemic lupus erythematosus» // Lancet. I — 1934. P. 417.

112. Iwai K, Shimoike H., Ohmichi N., Kinoshita M «Angiotensinogen gene and blood pressure in the Japanese population» // J. Hypertension. 1995. - V. 25 (4 Part 2) - P. 688-693.

113. Jerne N.K. «The generative grammar of immune system» // EMBO J. 1985. - V. 4. -P. 847.

114. Kanost D. «Anergic B cells constitutively present self antigen: enhanced immunoglobulin receptor-mediated presentation of antigenic determinants by B cells is hierarchical» // Eur. J. Immunol. 1994. - V. 24. - P. 1186.

115. Kay M.M.B., Goodman S., WntfieldC., Wong P., Zaki L, Rudolqff V. «The senescent cell antigen is immunologically related to band» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983 -V. 80.-P. 1631.

116. Kazatchkine M.D., Dietrich G., Hurez V. «V Region mediated selection of autoreactive repertoires by. intravenous immunoglobulin IVIg» // Immunol. Rev. — 1994. V. 139. -P. 79.

117. Kearney J., Vakil M. «Idiotype directed interactions during ontogeny play a major role in the establishment of the adult B cell repertoire» // Immunol. Rev. 1986. - V. 94. - P.

118. Kellerman S.A., McCormick D.J., Freeman S.L., Morris J.C., Conti-Fine B.M. «TSH receptor sequences recognized by CD4 q T cells in Graves disease patients and healthy controls» // J. Autoimmun. 1995. - V. 8. - P. 685.

119. Kitamwa D., Roes « Kuhn R., Rajewsky K. «A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin m chain gene» // Nature. -1991.-V. 350-P.423.

120. Klein-Nulend J.S., Cornelis M., Birger E.H. Prostaglandin mediated modulation Physiol. 1996. -V.168,N 1.-P.1-7.

121. Kluskens L., Kohler H. Regulation of immune response by autogenous antibody against receptor// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. - V.71, N 12. - P.5083.

122. Knut A., Lloyd K.O., Lipkin M., et al. Natural Antibodies in Human Sera Directed Against Blood-Group-Related Determinants Expressed on Colon Cancer Cells // Internat. J. Cancer. 1983. - V.32, N 2. - P. 199-204.

123. Lacroix-Desmazes S., Kaveri S. V., Mouthon L., Ayouba A., Malanchere K, Coutinho A., Kazatchkine M.D. «Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals» // Journal of Immunological Methods 1998. - V. 216. - P. 117-137.

124. Landsteiner K. «The nature and specificity of antibodies» // In: Eds The Specificity of Serological Reactions Harvard Univesity Press Cambridge MA - 1945 - P. 127.

125. Undstrom J., SheltonD., Fujii Y. «Myasthenia gravis» // Adv. Immunol. 1988. - V. 42

126. Lim W., WiemerG., Gohlke P., linger T., Scholkens B.A. «Contribution of kinins to thecardiovascular actions of angiotensin converting enzyme inhibitors» // Pharmacol. Rev. -1995. V. 47. - № 1. - P. 25-49.

127. Lundkvist / CoutinhoA, Varela F., HolmbergD. «Evidence for a functional idiotypicnetwork among natural antibodies in normal mice» // Proc. Natl. Acad. Sci.1. USA- 1989 -V. 86-P. 5074.

128. Lutz H., Bussolino F., Flepp R. «Naturally occuring anti-band 3 antibodies and complement together mediate phagocytosis of oxidatively stressed human eryhtrocytes» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 7368.

129. Lutz H.U., Stammler P., Jelezarova K, Nater M, Spath P.J. «High doses of immunoglobulin G attenuate immune aggregate-mediated complement activation by enhancing physiologic cleavage of C3b in C3bn-IgG complexes» // Blood. 1996. - V. 88-P. 184.

130. Lymheh P., Blancher A., Calvas P., Avmmeas S. «Natural autoantibodies in nude and normal outbred Swiss and inbred B ALB r c mice» // J. Autoimmim. 1989. - V. 2 - P. 283.

131. Malanchere E., Huetz F., Coutinho A. «Maternal IgG stimulates B lineage cell development in the progeny» // Eur. J. Immunol. 1997. - V. 27. - P. 788.

132. Marchalonis J. J., Kaymaz H., Dedeoglu F., Schlutter S.F., Yocum D.E., Edmundson A.B. «Human autoanti-bodtes reactive with synthetic autoantigens from T-cell receptor B chain» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 3325.

133. Marchaloms J.J., Kaymaz H., Schluter S.F., Yocum D.E. «Naturally occurring human autoantibodies to defined T-cell receptor and light chain peptides» // Adv. Exp. Med. Biol. 1994.-V. 347.-P. 135.

134. Martin R.r Jaraquemada D., Flerlage M. «Fine specificity and restriction of myelin basic protein specific cytotoxic T cell lines from multiple sclerosis patients and healthy controls» // J. Immunol. 1990. - V. 145 - P. 540.

135. MendeLsohn F.A.O., Allen A.M., Chai S.Y., McKinley M.J. «The brain angiotensinsystem: Insights from autoradiographic mapping of angiotensin receptors and converting enzyme» // Proc. Austr. Physiol, and Pharmacol. Soc. 1989. - V. 20. -№ 1. - P. 1-14.

136. MichaelJ.G. «Natural antibodies» // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1969 - V. 48 - P. 43.

137. Michel C, Gonzalez R., Bon/our K, Avrameas S. «A concurrent increasing of natural antibodies and enhancement of resistance of furonculosis in rainbow trout» // Ann. Rech. Vet. 1990.- V. 21. -P. 211.

138. Miletic V.D., Hester C.G., Frank MM «Regulation of complement activity by immunoglobulin» // J. Immunol. 1996. - V. 156. - P. 749.

139. Misra N., Bayry J., Lacroix-Desmazes S., Kazatchkine M.D., Kaveri S.V. «Cutting edge: hurnan CD4+CD25+ T cells restrain the maturation and antigen-presenting function of dendritic cells» // J Immunol.-2004.- V.4.- P.72-80.

140. Moiola L, Karachunski P., Protti MR, Howard J.F., Conti-Troncom B.M. «Epitopes of the b subunit of human muscle acetylcholine receptor by CD4 q T cells of myasthenia gravis patients and healthy subjects» // J. Clin. Invest. 1994. - V. 93. - P. 1020.

141. Navin 71, Krug K, Pearson R. «Effect of immunoglobulin M from normal human serum on Leishmania donovani promastigote agglutination, complement mediated killing and phagocytosis by human monocytes» // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 1343.

142. Nobrega A., Malanchere K, Hecker L., Haury M, Grandien A., CoutinhoA. «Diversity of antibody repertoire. Clonal frequencies of reactivities and patterns of complex clonal mixtures on immunoblots of natural antigens» // Eur. J. Immunol. -1997.

143. Poutsiaka D.D., Clark B.D., Vannier E., Dinaretto C.A. «Production of XL-receptor antagonist and IL-1B by peripheral blood mononuclear cells is differentially regulated» //Blood.- 1991. V. 78.-P. 1275.

144. Roux K.H., Tankersley D.L. «A view of the human idiotypic repertoire, electron microscopic and immunologic analyses of spontaneous idiotype-anti-idiotype dimers in pooled human IgG» // J. Immunol. 1990. - V. 144. - P. 1387.

145. Rudensky A.Y., Maze! SM, Turin V.L. «Presentation of endogenous immunoglobulin determinants to immunoglobulin recognizing T cell clones by the thymic cells» // Eur. J. Immunol. 1990. - V. 20. - P. 2235.

146. Ruiz de Soma V., Carreno M.P., Kaveri S.V. «Selective induction of interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-8 in human monocytes by normal poly specific. IgG intravenous immunoglobulin» // Eur. J. Immunol. 1995. - V. 25. - P. 1267.

147. Saenko V.A., Kabakov A.K, Poverermy AM. «Hidden high-avidity anti-DNA antibodies occur in normal human gammaglobulin preparations» // Immunol. Lett. -1992 P. 34.

148. Stewart J.M. «Immunoglobulins did not arise in evolution to fight infection» // Immunol. 1992 - Today. 13 - P 396.

149. Sultan Y., Rossi F., Kazatchkine M.D. «Recovery from anti-VIII: C antihemophilic factor autoimmune disease is dependent on generation of antiidiotypes against anti-VIII: C autoantibodies» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V 84. - P. 828.

150. Tankersley D.L., PrestonM.S., Finlayson J.S. «Immunoglobulin G dimer: an idiotype-antiidiotype complex» // Mol. Immunol. 1988. - V. 25. - P. 41.

151. Thornton B.P., Vetvicka V., Ross G.D. «Natural antibody and complement-mediated antigen processing and presentation by B lymphocytes» // J. Immunol. 1994. - V. 152. -P. 1727.

152. Tighe H., Chen P.P., Tucker R. «Function of B cells expressing a humanimmunoglobulin M rheumatoid factor autoantibody in transgenic mice» // J. Exp. Med. -1993.-V. 177. P. 109.

153. Varela F., Coutinho A. «Second generation immune networks» // Immunol. — 1991. -Today. 12.-P. 159.

154. Vassilev T., Bineva L, Dietrich G., Kaveri S.V., Kazatchkine MIA «Variable region-connected, dimeric fraction of intravenous immunoglobulin enriched in natural autoantibodies» // J. Autoimmun. 1995. - V. 8. - P. 405.

155. Wei L., Alhenc-Gelas F., Corvol P., Clauser E. «The two homologous domains of human angiotensin I-converting enzyme are both catalytically active» // J. Biol. Chem. -1991. V. 266. - № 14. - P. 9002-9008.

156. Wilson G.S., Miles A A. «The natural antibodies: their nature, origin and behaviour» // In: Wilson T.A. Ed. Principle of Bacteriology and Immunity. Edward Arnold -London-1964.-P. 1315.

157. Witz L, Yaakubowicz M., Gelernter L «Studies on the level of natural antibodies reactive with various tumor cells during urethane carcinogenesis in BALB/c mice» // Immunobiology. 1984. - V. 166. - P. 131.

Информация о работе

Петроченко, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Иммуноферментный анализ естественных антител к биогенным аминам и опиоидным пептидам в сыворотке крови человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы