Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая характеристика естественных антител к простагландину F2 α

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая характеристика естественных антител к простагландину F2 α"

На правах рукописи

РГ5 ОД

КИСЕЛЕВ Игорь Петрович ;] Н ГШ

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЕСТЕСТВЕННЫХ АНТИТЕЛ К ПРОСТАГЛАНДИНУ ¥2а

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2000

Работа выполнена в Институте биотехнологии Министерства промышленности, науки и технологий

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор М.А. Мягкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор Л.В. Козлов доктор медицинских наук, профессор A.B. Погожева

Диссертационного Совета Д001.45.02. Гематологического Научного Центра РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новозыковский пр., 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического Научного Центра РАМН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «_».

2000 года в «_» часов на заседании

Автореферат разослан «_».

2000 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук старший научный сотрудник

В.Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы интенсивное развитие получило новое научное направление в биохимии, касающееся изучения факторов гуморального иммунитета - естественных антител (EAT). Эти иммуноглобулины (lg) продуцируются нормальными В-клетками в отсутствии антигенной стимуляции.

Обобщенный анализ накопленных к настоящему времени экспериментальных данных в отношении EAT [Coutinho A. et al. 1995] дает представление об основных биохимических характеристиках и некоторых отличительных особенностях этих AT. Установлена принадлежность EAT к основным классам иммуноглобулинов - M, G, А. Репертуар таких антител продуцируется популяцией В-лимфоцитов незрелого фенотипа и кодируется зародышевой линией VH и VL - генов ограниченного числа семейств с незначительным числом мутаций, что обеспечивает их конститутивный синтез в физиологических условиях. Для этих AT, как правило, характерна полиреактивность и меньшая аффинность, по сравнению с антителами, индуцированными активной иммунизацией. EAT способны принимать участие в широком спектре физиологических реакций организма: от иммунного регулирования, обеспечения внутреннего гомеостаза, неспецифической барьерной роли против чужеродных патогенных антигенов до транспортной функции и модуляции действия биологически активных веществ.

Высокая биологическая активность эндогенных низкомолекулярных соединений группы простагландинов (ПГ), являющихся универсальными медиаторами различных физиологических процессов, послужила основанием для проведения исследований по выявлению и изучению EAT к этим соединениям. Можно ожидать, что связывание EAT с такими биорегуляторами будет оказывать влияние на физиологические реакции организма.

Направленный поиск AT к простагландинам А, В, F2a, Е2 и D2 по связыванию радиоактивно меченных ПГ с lg сыворотки здоровых доноров и больных СПИД не выявил различий в уровнях связывания по сравнению с фоном, что послужило основанием для вывода об отсутствии EAT к ni~[Knazek R.A., Raphael M., Costa J. 1986].

С другой стороны, были идругие попытки выявления EAT к простагландинам. Так, был разработан твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), при проведении которого в качестве антигена (АГ) использовали конъюгат бычьего сывороточного альбумина (БСА) с ковалентно присоединенными молекулами простагландина F2a (nrF2„) [Полевая О.Ю. и др. 1986]. Применение данного метода позволило обнаружить в сыворотках крови здоровых людей присутствие IgG к П1Т2а [Полевая О.Ю. и др. 1988]. Кроме того, было показано, что у пациентов, страдающих гипертонической болезнью (ГБ) и инфарктом миокарда (ИМ) уровень таких lg отличался от нормального и в некоторых случаях коррелировал с тяжестью патологического процесса и эффективностью проводимой терапии. В результате проведенных исследований было установлено наличие спонтанного синтеза естественных

антител к эндогенному низкомолекулярному соединению простагландину F2„. Присутствие таких АТ в сыворотках здоровых доноров свидельствовало о том, что продукция анти-ПГР2а-АТ является нормальным физиологическим процессом. В совокупности с известным фактом о вазоконстрикторном действии nrF2a, полученные данные позволяли сделать вывод, что естественные антитела к nrF2cl выступают как антагонисты этого медиатора и, нейтрализуя его патогенетическое действие, обеспечивают защитный эффект при ГБ и ИМ [Крупник В.Е. и др. 1987; Полевая О.Ю., Крупник В.Е. 1988].

Однако, в проведенных исследованиях связывание lg с конъюгированным антигеном не ингибировалось свободным nrF2a, что не позволило авторам изучить аффинность и специфичность выявляемых IgG к nrF2ll, исследовать связывающую способность F(ab')2 -фрагментов lg и получить ответ на важный вопрос об антительной природе анти-ПГР2„-1д.

Учитывая актуальность рассматриваемой научной проблемы как для теоретических аспектов биохимии и иммунологии, так и для практической медицины, в настоящей работе была предпринята попытка выявления и изучения естественных антител к низкомолекулярному эндогенному биорегулятору простагландину F2„, который является медиатором различных физиологических процессов, обладающим высокой биологической активностью.

Цепь и задачи исследования. Цель данной работы заключается в изучении биохимических свойств естественных антител к простагландину F2„ на основе использования различных вариантов твердофазного иммуноферментного анализа.

Задачи исследования, определенные в соответствии с поставленной целью:

- синтезировать конъюгированные антигены простагландина F2(I на белковом носителе, содержащие в своем составе различное количество ковапентно связанных остатков простагландина F2a, а также получить макромолекулярный сорбент для выделения антител к; простагландину F2„ из сыворотки крови;

- выделить с помощью аффинной хроматографии из сыворотки крови здоровых доноров и неиммунизированных животных иммуноглобулины, связывающие простагландин F2„;

- определить содержание в сыворотке крови и изотипический состав аффинно очищенных иммуноглобулинов к простагландину F2o, исследовать их основные биохимические свойства - специфичность, аффинность и участие F(ab')2- фрагментов в связывании с простагландином F2a;

- исследовать зависимость синтеза естественных антител к простагландину F2a при увеличении его концентрации в организме, используя модельные эксперименты на животных;

- провести сравнительный анализ уровней естественных антител к простагландину F2tl в норме и при различных заболеваниях человека, связанных с нарушением обмена этого биорегулятора, для оценки диагностической значимости такого тестирования.

Научная новизна работы. Из сыворотки крови практически здоровых людей 1 нормальных животных с помощью аффинной хроматографии выделены иммуноглобулины к шкомопекулярному эндогенному соединению простагпандину Р2о, установлен их «отипический состав и количественное содержание в сыворотке крови, исследованы биохимические характеристики иммуноглобулинов, связывающих простагландин Р2с1. Изучение свойств этих иммуноглобулинов позволило установить их принадлежность к ютинным антителам, специфично связывающим простагландин Р2а своим активным центром Р(аЬ')2-фрагментом, причем такое связывание характеризуется определенной константой ¡ффинности (от 1x104 до 6x106 М"1).

Обнаружено увеличение содержания антител к простагландину Р2а при инфаркте лиокарда, а также при интегументной и системной формах красной волчанки. Показана (елесообразность определения антител к простагландину Р2„ при указанных заболеваниях, йусповленная значительным увеличением выявления количества пациентов с нарушением уморального иммунитета.

Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе результаты по «явлению уровня антител к простагландину Р2а используются с 1991 г. в Нижегородском нучно-исследовательском кожно-венерологическом институте в целях дополнительного 1иагностического тестирования и мониторинга иммунного статуса больных красной юлчанкой. Определение содержания анти-ПГР?1(-антител применяется с 1992 г. в НИИ юкарственных средств (г. Купавна) при изучении влияния на организм человека препаратов, азрабатываемых для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена |ростагландина Р2о. Анализ динамики содержания антител к простагландину Р2а применяется : 1995 г. на кафедре кардиологии Пензенского института усовершенствования врачей для [ополнительной оценки эффективности проводимой терапии при инфаркте миокарда у лиц с сраженными нарушениями иммунореактивности организма.

Основные положения, выносимые на защиту.

В сыворотке крови здоровых людей и нормальных животных обнаружено наличие естественных антител к эндогенному низкомолекулярному биорегулятору простагландину Р2а с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа. !. Исследованы биохимические свойства аффинно очищенных естественных антител к простагландину определено их количественное содержание в сыворотке крови, изучена специфичность, рассчитана константа аффинности, установлена их связывающая способность с антигеном на субмолекулярном уровне.

Проведен сравнительный анализ содержания антител к простагландину Р2„ в сыворотке крови здоровых доноров и больных сердечно-сосудистыми и аутоиммунными заболеваниями. Показано, что увеличение уровня простагландина Р2а в организме вызывает активацию синтеза естественных антител к нему.

Апробация работы. Основные материалы и положения диссертационно! работы доложены и утверждены на межлабораторной конференции ВНИИ Биотехнологш (протокол №42 от 19 ноября 1990 года.).

Результаты исследований также были доложены на: Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицински: диагностакумов" (Москва, 1990 год);

Российском конгрессе "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 1999 год);

Международном конгрессе "Современные методы диагностики и лечения аллергии астмы и иммунодефицитов" (г. Тбилиси, 1999 год).

Международном конгрессе "Биокатализ 2000" (Москва, 2000 год). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, список которых приведен i конце реферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзор; литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения (! подглав), выводов и списка литературы (223 источника). Работа содержит 9 таблиц и 1 рисунков. Материалы изложены на 100 страницах машинописного текста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

В работе использованы следующие биохимические и химические реагенты:

- меченные пероксидазой хрена овечьи антитела против !gG, IgM, IgA человека, IgC кролика, тяжелых у-цепей IgG человека, легких (% и >.)-цепей IgG человека (Sigma) кроличьи пероксидазные антитела против IgG мыши (Cappal);

- препараты IgG, IgM, IgA человека, IgG кролика и IgG мыши (НПП Диагностика, г Москва);

- овечья антисыворотка против IgG, IgM, IgA человека, IgG кролика; IgG кролика про-™ IgG мыши (НИИЭМ, г. Нижний Новгород);

- кроличья антисыворотка против простагландина F2el (предоставлена к.б.н. Крупник В.Е ВНИИ Биотехнологии, г. Москва).

- конъюгированный антиген бычий свыороточный альбумин - барбамил (БСА-барбамил] содержащий 10 остатков барбамила на 1 молекулу БСА (предоставлен к.б.н Лушникоеой М.В. ВНИИ Биотехнологии, г. Москва).

- бычий сывороточный альбумин, ДНК спермы лосося, пепсин, простагландин F2u Твин20, ТритонХ-100, ортофенилендиамин, изобутилхлорформиат, диоксан диметилформамид (Sigma); триэтиламин (Merk); сцинтилляционная жидкость (Koch Light); меченый тритием простагландин F2„ (Upjohn); макропористо аминопропилированное стекло (НПП "Диагностика", г. Львов).

Основные материалы исследований: образцы биологической жидкости (сыворотка крови), полученные от 25 здоровых доноров, 23 больных инфарктом миокарда, 62 пациентов с интегументной фермой красной волчанки и 29 лиц, страдающих системной формой красной волчанки; образцы сывороток крови от 25 нормальных кроликов; сывороточные пулы мышей линии BDF-,(DBA/2xC57BL/S) от трех групп особей (по 15 взрослых самок) - мышам первой группы вводили инъекции простагландина F2„ в физ. растворе, особям второй группы пересаживали клетки карциномы легкого линии Lewis, третья группа животных получала инъекции физ. раствора.

Сыворотки крови доноров и больных инфарктом миокарда предоставлены II МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова г. Москва, больных красной волчанкой - Нижегородским кожно-венерологическим НИИ МЗ РФ, Кроличья сыворотка получена из ВНИИ Биотехнологии г. Москва. Пулы сывороток крови линейных мышей BDF^DBA^xCSyBL/S) предоставлены НИИ лекарственных средств г. Купавна.

Данная диссертационная работа выполнена при совместном участии сотрудников отдела иммунохимии ВНИИ Биотехнологии, - Полевой О.Ю., Крупник В.Е.; врачей-клиницисгов кафедры общей терапии II МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова, - Корочкина И.М., Вербицкой И.А., Нижегородского кожно-венерогического НИИ МЗ РФ, - Воскресенского А.Е., Главинской Т.А., Института ревматологии РАМН, - Станислав М.Л.; а также сотрудников отдела фармакокинетики НИИ Лекарственных средств (г. Купавна), - Кинзирского A.C., Вавиловой В.Г.

Для выявления естественных антител к простагландину F2„ применяли твердофазный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах Nunc 96F (Дания). Учет результатов ИФА осуществляли на спектрофотометре с вертикальным ходом луча Multiskan (Labsistems) при 492 нм. В качестве антигенов использовали конъюгаты nrF2a с белковым носителем бычьим сывороточным альбумином, содержащие различные количества гаптена, присоединенного к одной молекуле БСА. Степень замещения гаптена в синтезируемых конъюгатах определяли методом меченых атомов, используя сцинтилпяционный счетчик радиоактивности Tracor Europe при введении в реакцию меченого тритием простагландина F2a (Н3-ПГР2а). Аффинную хроматографию выполняли с помощью специально полученного сорбента на основе макропористого аминопропилированного стекла при использовании комплекта хроматографической системы фирмы Pharmacia. Оптическое поглощение белков регистрировали с помощью спектрофотометра фирмы Phillips при 280нм.

Обработку цифровых данных проводили методами вариационной статистики и корреляционного анализа. При расчетах использовали пакет прикладных программ "Stat" фирмы IBM (США), реализованный на персональном компьютере IBM PC/XT (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Синтез конъюгированных антигенов простагландина F,„ с бычьим сывороточным альбумином для проведения иммуноферментного анализа аффинно выделенных антител.

Для выявления и изучения естественных антител к простагландину F2a, аффин! выделенных из сыворотки крови, был выбран наиболее чувствительный и широ используемый в настоящее время метод - твердофазный ИФА. Особенностью выявлен! антител к низкомолекулярным соединениям является необходимость получения конъюгатоа с макромолекулярными носителями, обычно белками. С этой целью бьи синтезированы конъюгированные антигены простагландина F2„ с бычьим сывороточнь альбумином методом смешанных ангидридов [Jaffe В.М. et at, 1971]. Карбоксильную труп молекулы nrF2a в органической среде активировали изобутилхлорформиатом, что приводи, к образованию реакционоспособного смешанного ангидрида, который вводили в реакцию белком в водно-органической среде, в результате чего происходило ковалентн присоединение nrF2a к белку пептидной связью. При введении в реакцию ПГР2с1 и БСА молярных соотношениях 15:1 и 50:1 были получены конъюгированные антигены, содержащк соответственно, 10 и 40 остатков простагландина F2(I на одну молекулу белка: (ПГРг^ю-БСР (nrF2n)4o-BCA. Количество остатков nrF2a, присоединенных к белку, контролировали п использовании 3H-nrF2a

2. Получение сорбента для аффинной хроматографии.

Получение сорбента для выделения из сыворотки крови EAT к nrF2ot с помощ! аффинной хроматографии осуществляли, как и в случае синтеза конъюгированных антиген! методом смешанных ангидридов. В качестве носителя использовали макропорист аминопропилированное стекло. Ковалентное связывание nfF2a с носителем происходило счет карбоксильной группы nrF2a и аминогруппы носителя. Контроль за количественн! присоединением ПГР2„ к аминолропилированному стеклу проводили, как и при синте конъюгированных антигенов, путем введения в реакцию 3H-nrF2a

3. Применение аффинной хроматографи для выделения антител к простагландину F^„ из сыворотки крови.

Антитела к nrF2cl выделяли из индивидуальных сывороток крови здоровых людеу нормальных кроликов, а также из пулов сывороток крови мышей BDF-,(DBA/2xC57BIj используя в качестве сорбента макропористое аминопропилированное стекло с ковален1 присоединенным nPF2a. После проведения хроматографии концентрация белка использованных сыворотках доноров составляла 0,45-0,73 мг/мл.

4. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к простагландину

При изучении свойств аффинно выделенных 1д к простагландину прежде всего, необходимо было установить их изотопический состав и количественное содержание в :ыворотке крови. Затем предстояло определить специфичность, аффинность и участие Р(аЬ')2 - фрагментов этих 1д в связывании с простагландином

Для проведения намеченных исследований в ИФА предварительно подобрали зптимальные соотношения разведений пероксидззных антител, концентраций сорбируемых антигенов (синтезированные конъюгаты ПГР?а с БСА) и разведений тестируемых препаратов зффинно выделенных АТ к ПГР2я Использовали следующие рабочие разведения конъюгатов 1ероксидазных антител: к 1дС, 1дМ или 1дА человека - 1/1000, к 1дв кролика - 1/1000, к !дв лыши - 1/800. Концентрация антигенов (ПГР2о)10-БСА и (ПГР2а)40-БСА в растворе для сорбции вставляла от 2 до 0,2 мкг/мл. Образцы анти-ПГР2„-антител, аффинно выделенных из чндивидуальной сыворотки крови здоровых доноров или нормальных кроликов, тестировали в эазведении 1/2, а для препарата мышиных АТ применяли разведение 1/5.

4.1. Определение количественного содержания и изотипического состава антител к простагландину В препаратах аффинно выделенных антител к ПГР2„, полученных из семнадцати эазных сывороток крови практически здоровых доноров, с помощью сэндвич-ИФА определяли сонцентрации иммуноглобулинов Э, М и А классов. Проведенными исследованиями было установлено, что индивидуальный разброс содержания анти-ПГР2„-антител в используемых ;ыворотках крови находится в пределах значений: 1дв (1-12), 1дМ (0,07-0,54) и 1дА (0,08-0,61) «кг/мл. При этом средний уровень АТ к ПГР2„ составил - ДО (5), 1дМ (0,3) и 1дА (0,31) мкг/мл. Этношение этих величин соответствует изотопическому составу специфичных к ПГР2„ ;ывороточных 1д рассматриваемых классов: С:М:А=5:0,3:0,31=17:1:1. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 Содержание аффинно выделенных к простагландину Р2с, иммуноглобулинов в, М и

Классы |д Диапазон концентраций 1дкПГР21, определенный в семнадцати донорских сыворотках крови [мкг/мл1 Среднее содержание выделенных 1д к пгр,« в сыворотке крови доноров [мкг/мл] Изотопический состав выявленных 1дкПГР2с1

в 1-12 5 6:М:А=5:0,3:0,31=17:1:1

м 0,07-0,52 0,3

А 0,08-0,61 0,31

Всвязи с тем, что в исследованных препаратах сывороток крови человека основную долю EAT к nrF2ol составляют lgG-антитела, изучение содержания анти-ГИТа,-антител в пятнадцати элюатах, выделенных из нормальных кроличьих сывороток, проводили среди иммуноглобулинов G-кпасса. В сэндвич-ИФА, проведенном аналогично исследованию элюатов донорских сывороток, было установлено, что среднее содержание IgG к nrF2c, в нормальной кроличьей сыворотке составляет 4,8 мкг/мл.

Далее, прежде чем продолжать исследование иммунохимических свойств EAT к ШТ^ провели сравнительный анализ связывающей способности с П1Т2а между полученными препаратами антител и цельной сывороткой.

4.2. Локализация зпитопов антигена, взаимодействующих с аффинно выделенными иммуноглобулинами к простагландину F?„ Образцы цельных сывороток крови доноров и препараты аффинно очищенных иммуноглобулинов к nrF2<I, выделенных из указанных образцов, тестировали при различных разведениях в прямом ИФА на связывающую активность по отношению к остаткам гаптена, используя в качестве антигена (nrF2„)10-BCA. Белок-носитель (БСА) без ГИТ2о служил контролем неспецифической сорбции AT. В результате было обнаружено, что тестируемые образцы обладали связывающей способностью в ИФА с каждым антигеном. На рис.1 представлены кривые, отражающие взаимодействие (OD в ИФА) исследуемых препаратов с антигенами БСА и (nrF2a)io-BCA.

1,000 0,900 0.800 0,700 0,600 0.5СО 0,400 0.300 0,200 О.ЮО 0,000

(nrF2ot)1c-BCA

0,775 \

\ * 0,686

БСА

• * 0,445

0,188*Х

0,143 ;

>4, 0,112 °-1ЭТ 0,101 |

1.0С0

0,900

0,800

■0.700 1

0,600 0,500 0,400 О.ЗОО 0,200 0,100 0.000

-2,3 -2 6 -2,9 -3,2 -3.5 -3.8

(ПГР2а)ю-БСА

^0,477

Ч I

Bs^ 0,382 ;

\ ;

0,250 I

--♦-.. Ч °'157

Na 0,120 л пая

п?11 *----- 0,СЭ8„____

■ 0,190 0,160 --- O.OSO "

БСА 0.123 ■»-- -

__________°-09г о 079 -;

0,230

-0,3 -0.6 -0,9 -1,2 -1,5 -1,8 -2.1

Рис. 1. Связыание (OD в ИФА) донорской сыворотки (а) и препарата аффинно выделенных из неё EAT к nrF2a (б) с антигенами БСА и (П1Г2а)ю-БСА при различных разведениях тестируемых образцов. Концентрация сорбируемых антигенов-0,2 мкг/мл.

Как следует из характера кривых, аффинно очищенные lg реагируют с конъюгатом (nrF2u)icr-5CA в значительно большей степени, чем с БСА. Для цельной же сыворотки крови наблюдаются близкие уровни связывания с каждым из антигенов. Эти данные

00.

ш

щетельствуют о преимущественном взаимодействии аффинно выделенных ЕАТ гнно с остатками ПГР2а на белке-носителе.

При исследовании нормальных кроличьих сывороток и выделенных из них 1д к ПГР2а пи получены аналогичные результаты.

4.3. Определение связывающей способности аффинно выделенных к простагландину естественных антител.

Для количественной характеристики связывания простагландина Р2а с аффинно дленными к нему иммуноглобулинами использовали ингибиторный ИФА. На основании |ученных данных рассчитывали константу аффинности (Ка) таких 1д по методу А.МеЬэ е!

1984. Показателем средней Ка тестируемых АТ в данном методе является величина, ятная концентрации ингибитора (ПГР2„), которая необходима для 50%-ного торможения имодействия АТ с антигеном. В качестве АГ использовали (ПГР2„)ю-БСА. Этим способом лось определить Ка для 14 из 25 препаратов аффинно очищенных АТ, полученных из ¡оротки крови практически здоровых людей, что составило 57%. Константа аффинности ител, выделенных из нормальных кроличьих сывороток, была установлена в 15 случаях из (60%). Рассчетные значения Ка составили от 1x10" до 6,2x106 М"1 при тестировании паратов АТ, приготовленных из донорских сывороток крови, и от 1,1x104 до 4,8х106 I образцов кроличьих АТ.

4.4. Изучение специфичности естественных антител, аффинно очищенных к простагландину ?,„.

Специфичность аффинно выделенных ЕАТ к ПГР2о1 оценивали по способности личных низкомолекулярных веществ ингибировать связывание этих АТ с антигеном р2а)ю-БСА. В качестве ингибиторов использовали ПГР2«, а также соединения близкие и ичающиеся по химической структуре: простагландин Е2. 6-кето-простагландин Р1ц, етагландин Вг, динитрофенол и фосфатидилэтаноламин. На рис.2 представлены кривые можения взаимодействия аффинно очищенных к простагландину Р2с, естественных ител с конъюгатом (ПГР2„)кг-БСА указанными соединениями. Из сравнения приведенных вых можно заключить, что выделенные ЕАТ являются высокоспецифичными к ПГР2„. При ользовании ПГВ2, 6-кето-ПГР1о, фосфатидилзтаноламина и динитрофенола вовсе не |людается ингибирования. Весьма незначительное торможение реакции связывания стагландином Е2 (перекрестная реактивность с ПГР2„ составляет 0,17%), вероятно, можно .яснить сходством его химической структуры с простагландином Р2о.

Рис. 2. Ингибирование связывания аффинно очищенных EAT к nrF2a человека с антигеном (П1Г2а)ю-БСА, сорбированным в концентрации 1 мкг/мл, различными низкомолекулярныму соединениями, где С - концентрация этих соединений [мкг/мл], используемая для ингибирования.

4.5. Выявление связывающей способности субмолекулярных F(ab'); и Fc - фрагментов антител к простагландину F? „ выделенных с помощью аффинной хроматографии.

С целью локализации участков аффинно выделенных к ni~F2a антител взаимодействующих с простагландином F^, нативный и гидролизованный пепсином элюать AT, полученные из сывороток крови здоровых доноров, тестировали в прямом ИФА не способность связываться с антигеном (nfF2a)10-BCA. Расщепление пепсином нативных AT не F(ab')2 и Fc - фрагменты осуществляли, как описано Hudson L. et al., 1980. При выявлена уровня связывания AT с АГ использовали 2 типа овечьих антител, меченных пероксидазо^ хрена: AT против легких цепей IgG и AT против тяжелых цепей IgG. Разведения пероксидазных конъюгатов предварительно подбирали таким образом, чтобы каждый из ни> выявлял близкие уровни IgG (определяемые по значениям OD в ИФА). Эти разведения составили 1/300 и 1/4000, соответственно, для анти - хА и анти - у пероксидазных антител £ тестировании нативных препаратов EAT к nrF2a.

Как следует из данных таблицы 2, в выбранных условиях ИФА для препаратоЕ нативных AT обнаружены близкие значения уровня связывания с АГ (OD в ИФА). В то же время, для гидролизованных AT в ИФА регистрируется значение оптической плотное™ (СЮ=0,300) только для фракции, содержащей Р(аЬ')2-фрагменты, которые выявляютс; конъюгатом антител, меченных ферментом, против легких цепей IgG. Тогда как для второе

фракции гидролизата, содержащей Fc - фрагменты, выявляемые в ИФА конъюгатом антител против у-цепей IgG, измеряемое значение OD в ИФА составляет пишь величину 0,047, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия с АГ.

Таблица 2 Связывание (OD в ИФА) нативных и гадролизованных пепсином EAT к nrF2„ человека с антигеном (nrF2„),0-BCA, сорбированным на твёрдую фазу в концентрации 1 мкг/мл, при использовании двух типов пероксидазных конъюгатов.

Тип используемого пероксидазного конъюгата Уровень связывания (OD492)

Нативные EAT Гидролизованные пепсином EAT

Препарат овечьих пероксидазных антител против тяжёлых цепей !дв человека в разведении 1/4000 0,716 0,047

Препарат овечьих пероксидазных антител против лёгких цепей 1дО человека в разведении 1/300 0,723 0,300

Полученные данные свидетельствуют о том, что именно F(ab')2 - фрагменты, содержащие активный центр антител, ответственны за взаимодействие EAT с простагландином F2„. Следовательно, выделенные с помощью аффинной хроматографии lg к nrF2„ обладают антительной активностью, т.е. являются истинными антителами.

Таким образом, в первой части работы при использовании аффинной хроматографии нам удалось выделить из сыворотки крови практически здоровых людей и нормальных животных иммуноглобулины, специфично связывающие nrF2a. Данные же по изучению их иммунохимических свойств позволили сделать однозначный вывод о том, что в нормальной сыворотке людей и животных имеется невысокий уровень EAT к эндогенному низкомолекулярному биорегулятору простагландину F2a. Всвязи с этим, закономерно возникал вопрос о том, как изменение концентрации простагландина F2a в организме влияет на состав популяции анти-ПГР2„-антител.

Вторая часть диссертационной работы заключалась в исследовании активации синтеза AT к простагландину F2a при увеличении его концентрации в организме.

5. Изучение антител к простагландину г?„ при изменении его содержания в организме.

Активацию синтеза анти-ПГР2„-антител исследовали как в модельном эксперименте на животных (при увеличении концентрации l"irF2a в организме), так и при некоторых патологических состояниях человека, характеризующихся нарушением обмена этого биорегулятора и его повышенным содержанием в крови.

S.1. Индукция изменений в составе популяции антител к простагландину F?„ в модельной системе.

Влияние изменения концентрации nrF2„ в организме на популяцию AT к nrF2ct изучали в модельном эксперименте на линейных мышах BDF1(DBA/2xC57BL/6).

Использовали животных трех групп (по 15 взрослых самок весом 20-25 г в каждой группе). Особи первой группы в течение 3-х недель получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции П1Т2а в физ. растворе в дозе 30 мкг/кг веса. Мышам второй группы подкожно прививали клетки карциномы легкого линии Lewis, при росте которой наблюдается гиперпродукция ПГТ2„ клетками пораженного легкого [Chiabrando Ch. et al., 1985]. Третья, контрольная группа, получала внутрибрюшинные инъекции физ. раствора по той же схеме, что и первая. Забор крови проводили из ретроорбитального синуса. Кровь у мышей 1-ой и 3-ей групп брали на 22-е сутки после начала инъекций, а у мышей 2-ой группы на 7-ой день после перевивки опухоли, т.к. в предварительном эксперименте были выявлены максимальные уровни IgG к П1Т2<Д именно в эти сроки. Чтобы учесть возможное неспецифическое увеличение содержания IgG к nrF2n в сыворотках крови животных этих групп при стрессовом состоянии, которое может быть вызвано регулярными инъекциями и взятием крови, использовали еще одну (четвертую) группу мышей. Ее составили 15 самок той же линии, не подвергавшихся никаким инъекциям.

Сыворотки крови мышей указанных групп тестировали в прямом ИФА на содержание IgG, специфичных к П1Т2(1, по уровням связывания (OD) с конъюгированным антигеном (nrF2a)i0-BCA. Для контроля неспецифического взаимодействия сывороточных IgG использовали БСА, а также конъюгированный антиген, содержащий 10 остатков барбамила на 1 молекулу БСА: (Барбамил)ю-БСА. В каждой группе определяли среднее значение OD и ошибку репрезентативности этого параметра, отличие между средними величинами оценивали по критерию Стьюдента. Результаты тестирования представлены в таблице 3.

Таблица 3. Связывание в ИФА 1дС сывороток крови мышей с различными антигенами.

Антигены Уровень связывания (ODag2) Для сывороток крови четырёх групп мышей

1 особи, получавшие инъекции nrF2a в физ. р-ре 2 мыши с пересаженными клетками опухоли 3 мыши, получавшие инъекции физ. р-ра 4 нормальные особи

(nrF2l)10- БСА 0,563+0,029 р<0,01 0,547+0,027 р<0,01 0,503±0,021 р>0,05 0,443+0,023

БСА 0,460+0,028 р<0,01 0,436+0,020 р<0,01 0,401±0,017 р>0,05 0,359±0,014

(Барбамил)10-БСА 0,548±0,025 р<0,01 0,522+0,015 р<0,01 0,477+0,011 р>0,05 0,451+0,017

Из данных таблицы следует, что инъекции ПГР?а или пересадка опухоли приводят к увеличению связывания сывороточных 1дв с каздым АГ. Это видно при сравнении полученных результатов со значениями 00 для четвертой группы животных. Тенденция к подобному увеличению связывания отмечается и у мышей, получавших инъекции физ. раствора, но не является статистически достоверной.

Наблюдаемое повышение значений ОР вряд ли можно интерпретировать как исключительно неспецифическое усиление продукции 1дС в ответ на процедуры инъекций и забора крови, поскольку дальнейшее изучение иммунохимических свойств сывороточных 1дС у животных 1, 2 и 3 групп выявило качественные различия между 1дС-антителами в этих группах.

Из пулов сывороток крови мышей первых трех групп в одинаковых условиях были аффинно выделены АТ к ПГРг*. В полученных элюатах сэндвич-вариантом ИФА определяли содержание анти-ПГР2а-антител среди иммуноглобулинов в-класса, поскольку в предыдущих исследованиях индивидуальных сывороток человека и кролика было выявлено, что ЕАТ к ПГР2а представлены, в основном, 1д6-антителами. В результате было установлено, что уровни 1дв, специфичных к ПГР2„ в исследуемых сывороточных пулах составили 2,0, 1,8 и 1,3 мкг/мл, соответственно, для животных 1, 2 и 3 групп.

Далее, с помощью ингибиторного ИФА, как описано в разделе 4.3., находили константу аффинности выделенных АТ к ПГР2я. Величины Кэ этих антител составили 3,3х106м~1, 5,2x10® Г\Г1 и 7,1х104 М"1 для мышей 1, 2 и 3 групп, соответственно.

Результаты определения концентрации и расчета Ка анти-ПГР2с,-1дС, аффинно очищенных из пулов сывороток крови мышей указанных групп, представлены в таблице 4.

Таблица 4. Содержание 1дв к ПГР2а и величины констант аффинности (Ка) таких АТ, выделенных из пулов сывороток крови различных групп мышей.____

Группы животных Уровни 1дв к ПГР2а [мкг/мл пула сывороток крови] Средние значения Ка [М-1]

1. Мыши, получавшие инъекции ПГР2а в физ. р-ре 2,0 3,3х106

2. Особи с перевитыми клетками карциномы лёгкого Льюис 1,8 5,2х106

3. Контрольная группа, особям которой вводили физ. р-р. 1,3 7,1x10"

Полученные данные позволяют заключить, что повышение в организме уровня ПГР2„ при его экзогенном введении или росте простагландин-секретирующей опухоли способно индуцировать увеличение средней аффинности популяции антител к ПГР2а.

Следующим этапом исследований явилось изучение ЕАТ к П1Т2а при патологических состояниях человека, для которых характерно нарушение обмена простагландина F2a.

Для выполнения этой задачи предварительно исследовали характер выявляемой в ИФА популяции специфичных к nrF2„ антител в зависимости от плотности эпитопов сорбируемого антигена.

5.2. Влияние плотности эпитопов антигена на выявление антител к простагландину F?„ твердофазным ИФА.

Известно, что при определении уровня антител в ИФА, показателем которого служит величина оптического поглощения (OD) тестируемого образца, конечный результат анализа зависит как от концентрации антител, способных связываться с иммобилизованным на твердую фазу антигеном, так и от аффинности этого связывания. С другой стороны, была обнаружена взаимосвязь между плотностью эпитопов антигена и эффективностью связывания с ним антител различной аффинности [Nimmo G.R. et al., 1984]. При этом было показано, что с антигеном, имеющим высокую плотность эпитопов, достаточно эффективно связываются как высоко-, так и низкоаффинные антитела, в то время как с АГ, обладающим низкой плотностью эпитопов, реагируют преимущественно высокоаффинные AT. Приведенные данные позволяли предположить, что антигены с разной степенью содержания присоединенного простагландина F2„ могут выявлять в ИФА популяции специфичных к nrF2l антител, различающиеся по своей средней аффинности.

Для изучения влияния плотности эпитопов антигена на выявление антител к nfF2a в качестве антигенов использовали конъюгаты nrF2ol-BCA, содержащие 10 и 40 молекул гаптена на 1 молекулу белка: (П1Г2„)ю-БСА и (ПГР2а)4о-БСА.

Прежде всего, исследовали взаимодействие с каждым конъюгатом антител кроличьей антисыворотки против nrF2a, определяя среднюю Ка таких AT в ингибиторном ИФА по методу A.Nieto et.al., 1984.

Антигены сорбировали в концентрации 0,04 мкг/мл. Образцы антисыворотки тестировали в разведениях 1/2000 и 1/4000. Для торможения реакции АТ-АГ в инкубационную смесь вносили свободный nrF2u, содержание которого составляло от 10 до 10"5 мкг/мл теститруемой пробы, при последовательном 10-кратном уменьшении исходной концентрации. По кривым ингибирования, представленным на рис.3, рассчитывали величины Ка.

Из полученных данных, представленных в таблице 5, следует, что значения Ка, определенные при использовании (ПГР2„)10-БСА выше, чем в случае применения (nrF2a)40-БСА.

Рис. 3. Ингибирование связывания (00 в ИФА) антител кроличьей анти-ПГР2а-антисыворотки с антигенами (ПГР2„)4о-БСА и (ПГР2а)ю-БСА, сорбированными в концентрации 0,04 мкг/мл, свободным простагландином при разведениях антисыворотки 1/2000 и 1/4000, где Са -отсутствие ингибитора в пробе.

Таблица N25. Константы аффинности (Ка) антител кроличьей антисыворотки к ПГР2а, измеренные в ингибиторном ИФА с использованием антигенов (ПГР2а)13-БСА и (ПГР2а)40-БСА, а также отношения этих констант, при тестируемых разведениях антисыворотки 1/2000 и 1/4000.

Разведение антисыворотки Ка [М-1] Отношение Ка (ПГР2„),о-БСА Ка (ПГР3„),0-БСА

при использовании (ШТ^о-БСА при использовании (ПГР2„)4о-БСА

1/2000 5x10' 1,6x10' 3,13

1/4000 6,3х10а 2x108 3,15

Средние значения из величин, определённых при используемых разведениях 5,7х108 1,8x10' 3,17

С целью подтверждения полученного результата, отношение значений Ка, определяемое при использовании указанных антигенов, находили также с помощью прямого ИФА, как описано .Ш.Веайу е1.а1, 1987. В этом методе измеряют 50%-ное связывание АТ с АГ (СЮ в ИФА) при кратных последовательных разведениях тестируемого образца для двух различных концентраций сорбируемого АГ и рассчитывают К3 на основании закона действующих масс по формуле: К, = (п-1)/2(л[АТ']-[АТ]), где п = [АГ^/[АГ], [АГ'] и [АГ] -различные концентрации сорбируемого антигена, [АТ'] и [АТ] - концентрации антител, дающие 50%-ное связывание при соответствующих концентрациях антигена. Поскольку точная концентрация специфичных к ПГР2а антител в антисыворотке неизвестна, определить сами значения Ка при использовании камедого из антигенов оказалось невозможно, однако, данный

метод позволяет определить отношение этих констант. При расчете этого отношения в указанную выше формулу вместо значений концентрации АТ вводили пропорциональные им величины - десятичные лагорифмы разведений антисыворотки, а 50%-ное связывание АТ с АГ определяли по кривым титрования, представленным на рис.4.

Рис. 4. Зависимость связывания анти-ПГРгг-антител сыворотки имунного кролика в прямом ИФА от разведения кроличьей антасыворотки к ПГР2а при использовании антигенов (ПГР2о,)10-БСА (а) и (ПГР2а)4о-БСА (б), сорбированных в концентрациях: I - 4 мкг/мл, II - 0,8 мкг/мл, III -0,16 мкг/мл, IV- 0,032 мкг/мл, V - 0,0064 мкг/мл.

Отношение Ка(ПГР2„)10-БСА/Ка(ПГР2с,)4о-БСА, измеренное для любой выбранной пары используемых концентраций каждого АГ при тестировании антисыворотки в интервале разведений от1/200 до 1/409600, применяя последовательное 2-кратное титрование исходного разведения, определялось значениями от 1,2 до 1,6.

В результате, двумя разными методами было установлено, что определяемая в ИФА средняя аффинность АТ к ПГР2а выше в случае применения АГ с низкой плотностью зпитопов, чем при использовании АГ с высокой плотностью эпитопов. Другими словами, АГ с меньшим содержанием молекул ПГР2а преимущественно выявляет популяцию более аффинных АТ, тогда как АТ меньшей аффинности эффективнее взаимодействуют с АГ, содержащим большее количество ПГР2«. Полученные данные согласуются с известными результатами исследования взаимодействия моноклональных АТ к динитрофенолу (ДНФ) с конъюгированными антигенами ДНФП-БСА и ДНФ40-БСА [№тгпо в.Я. е( а!., 1984]. Расхождения в величине отношения Ка(ПГР2о)10-БСА/Ка{ПГр2а)40-БСА, выявляемые в прямом и ингибиторном ИФА, являются несущественными, учитывая, что отличия измеряемых значений наблюдаются как внутри каждого метода, в зависимости от условий эксперимента, так и меаду различными методами определения аффинности АТ [Веайу и.Р. а1., 1987; Рпдие! В. е1 а1., 1985].

Далее, нами была предпринята попытка определить константу аффинности кроличьих ЕАТ к ПГР2„ при тестировании в ингибиторном ИФА связывающей способности сыворотки

крови нормального кролика с конъюгатами (ЛГР21Х),0-БСА и (ПГР2а)40-БСА. В проведенных экспериментах не выявлялось ингибирование взаимодействия сывороточных АТ с указанными антигенами свободным простагландином Р2[1, что соответствует литературным данным по аналогичным исследованиям. Об отсутствии торможения связывания атител с конъюгированныии АГ свободным ингибитором сообщалось ранее для антиацетилхолиновых АТ нормальной сыворотки [Боиап М.1_. е( а1., 1986] и для некоторых монокпональных ЕАТ к динитрофенолу [Тегпупск Т., Ачгатеаэ в., 19В6]. Вероятную причину этого явления авторы связывали с невысокой средней аффинностью сывороточной популяции естественных антител.

Ввиду того, что применение ингибиторного ИФА не позволило определить константу аффинности анти-ПГР2(1-антител нормальной кроличьей сыворотки крови при использовании антигенов (ПГР2а)10-БСА и (ГИТ2о)4сгБСА, воспользовались прямым ИФА для расчета отношения констант Ка(ПГр2о)ю-БСА/Ка(ПГР2[,)4о-БСА, аналогично тому, как это делали при тестировании антисыворотки иммунного кролика. Антигены (ПГР2а)ю-БСА и (ПГР2„)40-БСА сорбировали в концентрациях 0,6 мкг/мл, 0,3мкг/мл и 0,15 мкг/мл. Сыворотку крови нормального кролика в исходном разведении 1/50 последовательно титровали в 2 раза до разведения 1/6400 и полученные образцы тестировали в прямом ИФА на связывание с АГ. По кривым титрования, приведенным на рис.5, рассчитывали отношение констант аффинности Ка(ПГР2я)1о-БСА/Ка(ПГР2,)аэ-БСА, которое определялось значениями от 2,1 до 2,5 (в среднем 2,3).

или (nrF2a)4o-BCA (б), сорбированными в концентрациях 0,6 мкг/мл (I), 0,3 мкг/мл (II) и 0,15 мкг/мл (III), от разведения нормальной сыворотки кролика.

Наконец, расчитывали величины Ка для ЕАТ к П1Т2с1, аффинно выделенных из сыворотки крови здоровых доноров и нормальных кроликов, в реакции ингибирования связывания АТ с антигеном (ПГР2„)4о-БСА, и сравнивали с результатами определения Ка в случае применения (ПГР2„)10-БСА.

Средние значения Ка, найденные при использовании антигенов (ПГРг»)ю-БСА и (ПГР2а)ад-БСА, составили 3,1х106 М~1 и 1,2х105 М-1 для АТ донорской сыворотки, а для кроличьих антител 2,4x10е М"1 и 1х10б М"\ соответственно.

Полученные данные по изучению аффинности АТ к ПГР2„ у исследованных объектов при использовании антигенов с различной плотностью эпитопов обобщены в таблице 6.

Таблица 6. Средние значения констант аффинности (Ка) анти-ПГР2а-антител, взаимодействующих с антигенами (ПГР2и)10-БСА и (ПГР2„)40-БСА, а также отношение этих Ка при тестировании в ИФА различных объектов исследования.__

Объекты исследования К, [М-1] Отношение К, (ШТ^-уБСА Ка (nrF2„)40-bCA

для (ПП^о-БСА для (П1Т2о1)40-БСА

Иммунная кроличья сыворотка крови к nrF2„ 5,7x10е 1,8x10® 3,17

Сыворотка крови нормальных кроликов - - 2,3

EAT к nrF2a, аффинно выделенные из сыворотки крови здоровых доноров 3,1х106 1,2x106 2,6

ЕАТкП1Т2а, аффинно выделенные из сыворотки крови нормальных кроликов 2,4x106 1x106 2,4

В итоге, для всех рассмотренных объектов различными методами была установлена важная общая закономерность: использование в ИФА антигена с низкой плотностью эпитопов выявляет популяцию более аффинных антител, по сравнению с популяцией АТ, выявляемой антигеном с высокой плотностью эпитопов.

5.3. Исследование активации синтеза естественных антител к простагландину F,.. при некоторых заболеваниях человека, характеризующихся повышенным содержанием простагландина в организме.

Первым объектом изучения данного вопроса была сыворотка крови пациентов, страдающих инфарктом миокарда (ИМ), которая, как известно, имеет повышенное содержание простагландинов, в том числе и П1Т2а [Lai J. et al., 1996; Takase B. et al., 1996; Serebruany V.L. et al., 1997]. Приведенные в предыдущем разделе данные послужили стимулом для проведения сравнительного анализа содержания анти-ПГР2а-антител в сыворотках крови доноров и больных ИМ при использовании в ИФА антигенов (ПГР2а)10-БСА и (nrF2j4(rBCA. Белок-носитель (БСА), не конъюгированный с молекулами П1Т2а, применяли в оценке неспецифической реакции антител.

Прежде всего, подбирали оптимальные концентрации для сорбции

указанных антигенов. С этой целью их сенсибилизировали на планшетах в диапазоне от 10 до 10"2 мкг/мл при последовательном двукратном разведении исходного содержания (10 мкг/мл). Затем в прямом ИФА определяли уровень связывания 1дв донорской сыворотки крови (разведение 1/800) с каждым АГ (рис.6).

OD«

Q9C0 QSD фШ Q630 ДЯ) (140 Q30)

03» (ДО

(№

■ ! Q7 Q4 Q1 -Q2 -ф -Q8 -Ц -1,4 -1,7 -2

С: 10 5 2,5 1,25 0,63 0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 0,01

Рис. 6. Зависимость связывания IgG донорской сыворотки (разведение 1/800) от концентрации сорбированных антигенов (ПГР2а)40-БСА (a), (ПГР2а)10-БСА (б) и БСА (в) в прямом ИФА, где С - использованные значения концентрации антигенов [мкг/мл].

Из кривых зависимости OD в ИФА для (ПГР2о)ю-БСА выбрали концентрацию 1 мкг/мл, а для (nrF^c-BCA - 0,2 мкг/мл, поскольку в данных условиях конъюгированные антигены выявляют близкие уровни IgG. Содержание БСА в растворе для сорбции составило 0,6 мкг/мл, так как в этом случае определяется среднее значение OD из величин, соответствующих использованию антигена при 1 и 0,2 мкг/мл.

Сыворотки крови 10-ти здоровых доноров и 23-х больных ИМ, используемые в разведении 1/800, тестировали в прямом ИФА на связывание с (ПГР2а)10-БСА, (ШТ^о-БСА и БСА, сорбированными в концентрациях 1, 0,2 и 0,6 мкг/мл, соответственно. Средний уровень IgG к nrF2„ по данным значений OD в ИФА (ODcp.) и среднеквадратичное отклонение (о) для доноров составили ODcp.=0,594, <т=0,145 при использовании (ПГР2а)ю-БСА, и 00ср.=0,616, ст=0,092 в случае применения (nrF^Uo-БСА. Для БСА величины указанных параметров, в сравнении с таковыми для конъюгированных антигенов, были невелики ODcp-0,250, о=0,040, что свидетельствует о незначительном уровне неспецифического связывания анти-ПГР2а-антитеп с белком-носителем.

Содержание сывороточных 1дС к ПГР2с, у больных считали повышенным, если значения 00 в ИФА, определенные для тестируемых образцов, на 2а превышали величину ООср. для доноров. При использовании (ПГР2„)ю-БСА, из 23-х сывороток крови больных были выявлены 4 (№№ 1-4) с увеличением уровня 1дв к ПГР2(1 (17%), в случае применения (ПГР2а)40-БСА обнаружили 8 таких сывороток (№№ 2-9), что составило 35% (рис.7).

1,300 1,200 1,100 1,000 0,800 0,800 0,700 0.Б00 0,500 0.400 0.300 0,200 0,100 0,000

0,891

0,763 0,758 Интервал , , 0,703 I ООср±2о • 0,645 с1636

для донорской сыворотки крови " сю^+гсг-о.ш СЮср.-2(Т-0,304

1.300 1.200 1,100 1,000 0,900 0,800 0,700 0.600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000

"1 "244.....-......

0,827 -

0,810 0,805 0,805

Интервал СЮср±2а 1

для донорской сыворотки крови | СЮср+2ст=0,800 !

СЮс„- 2сг=0,432 |

Рис. 7. Уровни анти-ПГР2а-1дО (ОО в ИФА) в сыворотках №№1-9 больных ИМ, определённые при использовании антигенов (ПГР2а)10-БСА (а) и (ПГР2„)40-БСА (б).

Таким образом, использование обоих антигенов в ИФА позволило определить повышение содержания 1дЭ к ПГР21, у 9 пациентов из 23 (39%). Неспецифическое взаимодействие АТ для отмеченных проб оставалось в пределах значений, определенных для доноров.

Наблюдаемое проявление связывания антител, специфичных к простагландину Р2а, по-видимому, определяется различным характером их активности у разных больных ИМ. С одной стороны, вероятно, может происходить возрастание средней аффинности популяции анти-ПГР2»-антител. В таких случаях АТ эффективно выявляются конъюгатом с низкой плотностью эпитопов - (ПГР2„)10-БСА, так как с ним преимущественно реагируют более аффинные антитела. С другой стороны, возможно повышение общего содержания АТ к ПГР2а, без увеличения связывающей способности, и даже при ее уменьшении. Для выявления подобных АТ результативным оказывается конъюгат (ПГР2а)40-БСА, всвязи с тем, что он хорошо связывает как высокоаффинные, так и низкоаффинные антитела.

В результате проведенного исследования выявлено увеличение содержания сывороточных 1дО к ПГР2с, у определенной часта пациентов с ишемической болезнью сердца. Показано, что использование антигенов с высокой и низкой плотностью эпитопов позволяет обнаруживать повышенные уровни этих АТ у большего числа пациентов, чем при тестировании на основе какого-либо одного АГ.

Другим объектом исследования выбрали сыворотку крови больных красной волчанкой (КВ). Характерной чертой патогенеза этого аутоиммунного заболевания является повышенное содержание аутоантител к ДНК. Увеличение титра таких АТ служит диагностическим признаком КВ. Кроме того, известно, что при данном заболевании наблюдается увеличение концентрации простагландинов различных групп, в частности nrF2a, в сыворотке крови [Reshetnayk Т.М. et al, 1997; Ames P.R. et al., 1999]. Всвязи с этим, мы сочли целесообразным провести определение уровня сывороточных АТ к ГИТ?,, у больных КВ.

В сыворотках крови 29-ти больных системной красной волчанкой (СКВ), 62 пациентов с интегументной красной волчанкой (ИКВ) и 10-ти здоровых доноров выявляли уровни IgG и IgM (OD в ИФА) к антигенам (nrF2„)ítl-BCA и ДНК спермы лосося. Для контроля неспецифической сорбции АТ использовали БСА. Образцы исследуемых сывороток крови тестировали в разведении 1/400, антигены сорбировали в концентрации 1 мкг/мл. Связывание lg с АГ проявляли препаратами пероксидазных АТ против IgG или IgM человека. В каждой группе анализируемых образцов определяли среднее значение OD в ИФА и стандартную ошибку этой величины, отличие между средними определяли по критерию Стьюдента. Полученные данные, представленные в таблице 7, свидетельствуют, что не наблюдается увеличения среднего уровня АТ исследуемых классов к БСА у пациентов с ИКВ или СКВ по сравнению с донорами.

Таблица 7. Содержание антител классов G и М к панели антигенов, включающей

БСА, ДНК спермы лосося и (ПГР2д)40-БСА у доноров и больных КВ.

Класс иммуноглобулинов Антигены Уровень lg (OD в ИФА)

Здоровые доноры Больные СКВ Больные ИКВ

IgG БСА 0,878±0,017 0,972±0,028 р<0,1 0,946+0,019 р<0,2

ДНК спермы лосося 0,853±0,027 0,941±0,024 р<0,05 0,923+0,019 р<0,2

(ПГР2а)40-БСА 1,061+0,037 1,174+0,025 р<0,02 1,137±0,023 р<0,2

IgM БСА 0,823+0,025 0,892+0,024 р<0,2 0,889±0,031 р<0,5

ДНК спермы лосося 0,643±0,015 0,731 ±0,025 р<0,05 0,735+0,016 р<0,05

(ПГР2а)„о-БСА 0,824±0,031 0,997+0,035 р<0,01 1,040+0,031 р<0,01

Повышенное содержание 1дМ и 1дв выявляется при использовании как ДНК, так и (ПГР?а)40-БСА среди больных обеих групп, однако увеличение 1дв при ИКВ не является статистически достоверным.

Далее, среди пациентов каждой группы определяли процент выявления повышенного содержания 1дв и 1дМ к каждому АГ в отдельности, а также при использовании обоих

антигенов (табл.8). При этом достоверное увеличение уровня 1д определяли как

превышение среднего значения для доноров не менее, чем на Зо.

Таблица 8. Частота выявления (%) повышенного содержания антител Э и М классов к ДНК или (П1Г2а)40-БСА, а также при использовании обоих антигенов у пациентов с ИКВ и СКВ.

Класс иммуноглобулинов Группы пациентов Процент больных с повышенным уровнем 1д к используемым антигенам

ДНК (ПГР2а)4£ГБСА ДНК и (ПГР2„)4о-БСА

1дМ СКВ 80 60 80

ИКВ 18 24 43

1дв СКВ 58 42 67

ИКВ 18 18 30

В результате, было обнаружено, что повышенные уровни 1дМ к (ПГР2о,)4о-БСА наблюдаются у большего числа больных ИКВ (24%), чем при выявлении увеличенного содержания 1дМ к ДНК в той же группе пациентов (18%). С другой стороны, при ИКВ выявляется такой же процент повышенного содержания 1дС к (ПГР2а)«гБСА (18%), что и при тестировании 1дв к ДНК (18%).

Для больных СКВ максимальная частота выявления повышенных уровней АТ отмечается при использовании ДНК: 1дМ к ДНК (80%) и 1дв к ДНК (58%); тогда как увеличение АТ к (ПГР21)40-БСА определяется в меньшем числе случаев: 1дМ к (ПГР2<Х)«-БСА (60%) и 1дв к (ПГР2„)4<гБСА (42%).

В то же время, применение и ДНК, и (ПГР2о,)40-БСА существенно увеличивает процент выявления больных ИКВ с повышенным содержанием |дМ (43%) и 1дв (30%), в сравнении с количеством тех же пациентов, у которых определялось повышение уровней 1дМ (18%) и 1дС (18%) при использовании только ДНК. Аналогичное тестирование у больных СКВ эффективно только при выявлении 1дС: увеличение 1дС к ДНК и (ПГР2а)40-БСА отмечалось у 67% этих пациентов, тогда как повышение 1дв к ДНК наблюдалось в 58% случаев. В противоположность этому, увеличенное содержание 1дМ к ДНК и (ПГР2о,)40-БСА, наблюдаемое у 80% больных СКВ, определялось в том же числе случаев, что выявлялось при повышении 1дМ к ДНК (80%).

В итоге, исследование содержания АТ к ПГР2а у больных КВ позволило установить факт специфического повышения как 1дО, так и 1дМ к простагландину Р2„ у пациентов с ИКВ и СКВ. Обнаужено, что выявление АТ к ПГР2а, наряду со стандартно используемым для диагностики КВ определением АТ к ДНК, существенно повышает процент выявления больных с измененным состоянием гуморального иммунитета, особенно при ИКВ.

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования выявления АТ к ПГР2а в качестве дополнительного диагностического теста в клинике указанного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы два вида конъюгированных антигенов простагландина Р2„ с пользованием бычьего сывороточного альбумина и содержащие в своем составе 10 и 40 татков простагландина Р2„, ковалентно связанных с белком. Получен сорбент для |деления естественных антител к простагландину Р2е1 на основе аминопропилированного 1кропористого стекла.

2. Выделены иммуноглобулины, составляющие популяцию естественных антител низкомолекулярному эндогенному биорегулятору простагландину Р2о„ из сыворотки крови оровых доноров и неиммунизированных кроликов с помощью аффинной хроматофафии. тановлено, что они реагируют с конъюгированным антигеном Р(аЬ')2-фрагментами за счет итопов, представленных гаптеном.

3. Найдено, что соотношение изотипов выделенных к простагландину Р2а антител М и А классов составляет 17:1:1. Концентрация основного представителя популяции

тител к простагландину - иммуноглобулина в в сыворотке крови здоровых людей ставляет 5 мкг/мл. Показана высокая специфичность к простагландину Р2„ аффинно ищенных антител. Рассчитаны значения их констант аффинности, варьирующие в пределах 1x10" до 6x106 М"\

4. Установлено в модельном эксперименте на линейных мышах, что увеличение в ганизме концентрации простагландина приводит к возрастанию аффинности популяции ецифичных к нему антител.

5. Выявлено увеличение содержания специфичных антител к простагландину Р2а в яороке крови больных ишемической болезнью сердца, а также пациентов с интегументной :истемной формами красной волчанки. Показано, что использование в иммуноферментном ализе антигенов с различной плотностью посадки гаптена повышает процент выявления льных с нарушением иммунного статуса.

Список работ Киселева И.П., опубликованных по теме диссертации

Киселев И.П., Крупник В.Е., Полевая О.Ю. Иммуноферментный анализ естественных антител к низкомолекулярным биорегуляторам на основе конъюгированных антигенов // Тезисы Всесоюзной конференции «Современные направления создания медицинских диагностикумов»., Минмедпром СССР, НПО «Биотехнология».- Москва.-1990.-с.102.

Крупник В.Е., Киселев И.П., Полевая О.Ю., Окунева И.Н., Вербицкая И.А. Влияние плотности эпитопов антигена на выявление антител к простагландину с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ИИммунология,-1991,- №1.- с.58-61.

Мягкова М.А., Абраменко Т.8., Киселев И.П., Станислав М.Л., Кост О.А., Никольская И.И., Гарац Л.Н. Определение естественных иммуноглобулинов к ангиотензинпревращающему ферменту у больных системными заболеваниями соединительной ткани // Вестник МГУ, Серия Химия - 2000.- с. 110-115.

4. Полевая О.Ю., Крупник В.Е.,Киселев И.П., академик Зефиров Н.С. Естественные антитела к простагландину Р2а: обнаружение, характеристика и индукция синтеза // Доклады АН СССР,-1991,- Т.316, №4.- с.1010-1013.

5. Савченко Р.П., Киселев И.П. Исследование уровня естественных антител к простагландину F2a у пациентов с ишемической болезнью сердца методом твердофазного ИФА при использовании антигенов, имеющих разную плотность эпитопов // Клиническая лабораторная диагностика.-1999 - №9 - с.25-26.

6. Савченко Р.П., Киселев И.П. Оценка диагностической значимости определения антител к простагландину Ф2а у больных красной волчанкой // International journal on immunorehabilitation.-1999- №14,- c.60.

7. Myagkova M.A., Abramenko I.V., Kiselev I.P.,Stanislav M.L., Kost O.A., Nikolskaya 1.1., Garats L.N. The determination of natural immunoglobulins to angiotensin converting enzyme in human serum by ELISA// International coference Biocatalisis-2000: fundamentals and application, june 10-15 2000, Moscow, Russian Federation.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселев, Игорь Петрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эндогенные низкомолекулярные биорегуляторы группы простагландинов.

1.1.1. Общая характеристика простагландинов.

1.1.2. Основные этапы биосинтеза и метаболизма простагландинов.

1.1.3. Биологическая активность простагландинов.

1.2. Естественные антитела: природа их антигенных мишеней, иммунохимические свойства, происхождение и функциональная реактивность.

1.2.1. Естественные антитела к макромолекулярным соединениям.

1.2.2. Антиидиотипические естественные антитела.

1.2.3. Естественные антитела к низкомолекулярным соединениям.

1.2.4. Иммунохимические свойства естественных антител.

1.2.5. Происхождение естественных антител, их связь с индуцированными антителами и аутоантителами при патологических состояниях.

1.2.6. Физиологические функции естественных антител.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы исследований.

2.2. Методы исследований.

2.3. Синтез конъюгированных антигенов простагландина F2tt с бычьим сывороточным альбумином.

2.4. Синтез сорбента для аффинного выделения из сыворотки крови антител к простагландину F2a.

2.5. Применение аффинной хроматографи для выделения антител к простагландину F2« из сыворотки крови.

2.5.1. Выделение антител к простагландину F2a из индивидуальных сывороток крови здоровых доноров и нормальных кроликов с помощью аффинной хроматографии.

2.5.2. Аффинное выделение антител к простагландину F2« из пула сывороток крови линейных мышей.

2.6. Ферментативный гидролиз пепсином аффинно выделенных антител к простагландину F2a.

2.7. Методика проведения иммуноферментного анализа.

2.7.1. Типовая схема твердофазного ИФА.

2.7.2. Проведение ингибиторного ИФА и определение с его помощью аффинности и специфичности антител к простагландину F2a.

2.7.3. Сэндвич-вариант твердофазного ИФА.

2.8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение конъюгированных антигенов простагландина F2а с бычьим сывороточным альбумином.

3.2. Получение сорбента для аффинной хроматографии.

3.3. Выделение антител к простагландину V20. из сыворотки крови с помощью аффинной хроматографии.

3.4. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к простагландину F2a.

3.4.1. Определение оптимальных условий проведения иммуноферментного анализа аффинно выделенных антител к простагландину F2a.

3.4.2. Определение количественного содержания и изотипического состава аффинно выделенных антител к простагландину F2a.

3.4.3. Локализация эпитопов антигена, взаимодействующих с аффинно выделенными иммуноглобулинами к простагландину F2«.

3.4.4. Определение константы аффинности выделенных к простагландину F2« естественных антител в реакции связывания с гаптеном.

3.4.5. Изучение специфичности естественных антител, аффинно очищенных к простагландину F2tt.

3.4.6. Выявление связывающей способности субмолекулярных F(at/)2 и Fc - фрагментов антител к простагландину F2a, выделенных с помощью аффинной хроматографии.

3.5. Изучение антител к простагландину F2a при изменении его содержания в организме.

3.5.1. Индукция изменений в составе популяции антител к простагландину F2tt в модельной системе.

3.5.2. Влияние плотности эпитопов антигена на выявление антител к простагландину Бга твердофазным ИФА.

3.5.3. Исследование активации синтеза естественных антител к простагландину при некоторых заболеваниях человека, характеризующихся повышенным содержанием этого биорегулятора в организме.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимическая характеристика естественных антител к простагландину F2 α"

В последние годы интенсивное развитие получило новое научное направление в биохимии, касающееся изучения факторов гуморального иммунитета - естественных антител (EAT). Эти иммуноглобулины (Ig) продуцируются нормальными В-клетками в отсутствии антигенной стимуляции.

Изучение гуморального иммунитета традиционно основывалось на модели индуцированного иммунизацией антителообразования, тогда как вопрос о функционировании иммуноглобулинов и секретирующих их В-лимфоцитов в норме долгое время не привлекал особого внимания исследователей. Однако, к середине 80-х годов был накоплен обширный фактический материал, свидетельствующий о присутствии в нормальных биологических организмах иммуноглобулинов к большому количеству аутологичных тканевых антигенов, клеток и клеточных структур, высокомолекулярных соединений и ряду низкомолекулярных веществ. Полученные данные свидетельствовали о важной физиологической роли естественных антител в обеспечении нормальной жизнедеятельности организма.

Высокая биологическая активность эндогенных низкомолекулярных соединений группы простагландинов (ПГ), являющихся универсальными медиаторами различных физиологических процессов, послужила основанием для проведения исследований по выявлению и изучению EAT к этим соединениям. Можно ожидать, что связывание EAT с такими биорегуляторами будет оказывать влияние на физиологические реакции организма.

Учитывая актуальность рассматриваемой научной проблемы как для теоретических аспектов биохимии и иммунологии, так и для практической медицины, в настоящей работе была предпринята попытка выявления и изучения естественных антител к низкомолекулярному эндогенному биорегулятору простагландину F2a, который является медиатором различных физиологических процессов, обладающим высокой биологической активностью.

Цель данной работы заключается в изучении биохимических свойств естественных антител к простагландину F2a на основе использования различных вариантов твердофазного иммуноферментного анализа.

Задачи исследования, определенные в соответствии с поставленной целью: синтезировать конъюгированные антигены простагландина F2a на белковом носителе, содержащие в своем составе различное количество ковалентно связанных остатков простагландина F2a, а также получить макромолекулярный сорбент для вьщеления антител к простагландину F2a из сыворотки крови;

- выделить с помощью аффинной хроматографии из сыворотки крови здоровых доноров и неиммунизированных животных иммуноглобулины, связывающие простагландин F2a;

- определить содержание в сыворотке крови и изотипический состав аффинно очищенных иммуноглобулинов к простагландину F2a, исследовать их основные биохимические свойства - специфичность, аффинность и участие F(at/)2 - фрагментов в связывании с простагландином F2«;

- исследовать зависимость синтеза естественных антител к простагландину F2« при увеличении его концентрации в организме, используя модельные эксперименты на животных;

- провести сравнительный анализ уровней естественных антител к простагландину р2Ы в норме и при различных заболеваниях человека, связанных с нарушением обмена этого биорегулятора, для оценки диагностической значимости такого тестирования. Научная новизна работы. Из сыворотки крови практически здоровых людей и нормальных животных с помощью аффинной хроматографии выделены иммуноглобулины к низкомолекулярному эндогенному соединению простагландину F2a, установлен их изотипический состав и количественное содержание в сыворотке крови, исследованы биохимические характеристики иммуноглобулинов, связывающих простагландин F2a. Изучение свойств этих иммуноглобулинов позволило установить их принадлежность к истинным антителам, специфично связывающим простагландин F2a своим активным центром - Р(аЬ/)2-фрагментом, причем такое связывание характеризуется определенной константой аффинности (от 1x104 М" до 6x106 М"1).

Обнаружено увеличение содержания антител к простагландину F20-. при инфаркте миокарда, а также при интегументной и системной формах красной волчанки. Показана целесообразность определения антител к простагландину F2« при указанных заболеваниях, обусловленная значительным увеличением выявления количества пациентов с нарушением гуморального иммунитета.

Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе результаты по выявлению уровня антител к простагландину F2a используются с 1991 г. в Нижегородском научно-исследовательском кожно-венерологическом институте в целях дополнительного диагностического тестирования и мониторинга иммунного статуса больных красной волчанкой. Определение содержания анти-ПГр2а-антител применяется с 1992 г. в НИИлекарственных средств (г. Купавна) при изучении влияния на организм человека препаратов, разрабатываемых для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена простагландина F2a. Анализ динамики содержания антител к простагландину F20. применяется с 1995 г. на кафедре кардиологии Пензенского института усовершенствования врачей для дополнительной оценки эффективности проводимой терапии при инфаркте миокарда у лиц с выраженными нарушениями иммунореактивности организма.

Апробация работы. Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены на межлабораторной конференции ВНИИ Биотехнологии (протокол № 42 от 19 ноября 1990 года.).

Результаты исследований также были доложены на:

Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990 год);

Российском конгрессе "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 1999 год);

Международном конгрессе "Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов" (г. Тбилиси, 1999 год).

Международном конгрессе "Биокатализ 2000" (Москва, 2000 год).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В сыворотке крови здоровых людей и нормальных животных обнаружено наличие естественных антител к эндогенному низкомолекулярному биорегулятору простагландину F2« с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа.

2. Исследованы биохимические свойства аффинно очищенных естественных антител к простагландину F2«, определено их количественное содержание в сыворотке крови, изучена специфичность, рассчитана константа аффинности, установлена их связывающая способность с антигеном на субмолекулярном уровне.

3. Проведен сравнительный анализ содержания антител к простагландину Рг« в сыворотке крови здоровых доноров и больных сердечно-сосудистыми и аутоиммунными заболеваниями. Показано, что увеличение уровня простагландина F2« в организме вызывает активацию синтеза естественных антител к нему.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Киселев, Игорь Петрович

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы два вида конъюгированных антигенов простагландина F2a с использованием бычьего сывороточного альбумина и содержащие в своем составе 10 и 40 остатков простагландина F2a, ковалентно связанных с белком. Получен сорбент для выделения естественных антител к простагландину F2ct на основе аминопропилированного макропористого стекла.

2. Выделены иммуноглобулины, составляющие популяцию естественных антител к низкомолекулярному эндогенному биорегулятору простагландину F2a, из сыворотки крови здоровых доноров и неиммунизированных кроликов с помощью аффинной хроматографии. Установлено, что они реагируют с конъюгированным антигеном F(ab/)2-фрагментами за счет эпитопов, представленных гаптеном.

3. Найдено, что соотношение изотипов выделенных к простагландину F2« антител G, M и А классов составляет 17:1:1. Концентрация основного представителя популяции антител к простагландину F2a - иммуноглобулина G в сыворотке крови здоровых1 людей составляет 5 мкг/мл. Показана высокая специфичность к простагландину F2a .' аффинно очищенных антител. Рассчитаны значения их констант аффинности, варьирующие в пределах от 1x104 МГ1 до 6x106 М-1.

4. Установлено в модельном эксперименте на линейных мышах, что увеличение в организме концентрации простагландина F2a приводит к возрастанию аффинности популяции специфичных к нему антител.

5. Выявлено увеличение содержания специфичных антител к простагландину F2a в сывороке крови больных ишемической болезнью сердца, а также пациентов с интегументной и системной формами красной волчанки. Показано, что использование в иммуноферментном анализе антигенов с различной плотностью посадки гаптена повышает процент выявления больных с нарушением иммунного статуса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселев, Игорь Петрович, Москва

1. Балуда В.П., Сушкевич Г.Н., Лукоянова Т.И. Роль простагландинов, тромбоксанов и простациклина в регуляции процесса агрегации и реакции освобождения тромбоцитов в норме и при патологии.// Патол. физиол. и эксп. терапия,- 1980.- № 4,- с. 80-85.

2. Данилова Т.А. Гетерофильные антитела при патологических процессах человека.// Иммунология.- 1987,- №4.-с. 5-11.

3. Жуков-Вережников H.H., Ломакин М.С., Майский И.Н., и др. Антигены, общие для злокачественных опухолей человека и некоторых видов микроорганизмов.// Бюл. эксперим. биологии и медицины.- 1981.- № 9.- с. 331.

4. Корочкин И.М., Вербицкая И.А., Крупник В.Е. и др. Сравнительный анализ содержания аутоантител против простагландина Ф2а в норме и при сердечно-сосудистых заболеваниях. // Кардиология,- 1988.- № 4,- с. 41-44.

5. Крупник В.Е., Данилова Н.П., Полевая О.Ю. и др. Иммуноглобулины, специфически связывающие простагландин Фга У больных инфарктом миокарда и гипертонической болезнью.// Кардиология,- 1987.- № 8,- с. 89.

6. Крупник В.Е., Полевая О.Ю., Самсонов В.А. и др. Динамика содержания аутоантител против гистамина у больных нейродермитом. // Вестник дерматологии и венерологии. -1987.- № 11.- с.12-14.

7. Ломакин М.С., Майский И.Н., Ларин A.C., и др. Антигены, общие для micobacterium bovis (БЦЖ) и некоторых злокачественных и нормальных тканей лабораторных животных.// Бюл. эксперим. биологии и медицины.- 1977,- № 1.- с. 65.

8. Мягкова М.А., Трубачева Ж.Н., Панченко О.Н. Иммуноферментный анализ для выявления естественных антител к катехоламинам. // Клин. лаб. диагност,- 1997.- № 3,- с. 8-10.

9. Овчинников Ю.А. Простагландины и тромбоксаны.// в кн. Биоорганическая химия.- М.: Просвещение, 1987,- с. 752-758.

10. П.Осипов С.Г., Бабаян Г.В., Ермолин Г.А. и др. Иммунный ответ к миоглобину при физических нагрузках у юных спортсменов. // Лаб. дело.- 1986,- № 9.- с. 550-552.

11. Полевая О.Ю., Данилова Н.П., Крупник В.Е. и др. Твердофазный иммуноферментный метод выявления аутоантител к простаглан динам. // Синтез и исследование простагландинов: Тезисы докладов всесоюзного симпозиума,- Таллин, 1986,- с. 47.

12. Полевая О.Ю., Крупник В.Е. Выявление иммуноферментным методом свободноциркулирующих и связанных в иммунные комплексы аутоантител против простагландина F2a в сыворотках человека.// Иммунология,- 1988.- № 3.- с. 88-90.

13. Полевая О.Ю., Перфильева Е.А., Селезнева J1.A. и др. Конкурентный иммуно ферментный метод количественного определения простагландина F2a-// Иммунология,- 1988.- № 4,- с.76-79.

14. Салмон Дж.А., Хигс Г.А. Эйкозаноиды.// в кн. Руководство по иммунофармакологии. пер. с англ./ под ред. М.М.Дейла, Дж.К.Формена,- М: Медицина, 1988.- с. 113-124.

15. Ailus К., Palosuo Т. IgM class autoantibodies in human cord serum. // J. Reprod. Immunol.-1995,- 29(1).-p. 61-67.

16. Ames P.R., Alves J., Murat I. et al. Oxidative stress in systemic lupus erythematosus and allied conditions with vascular involvement. // Rheumatology Oxford.- 1999 38(6).- p.529-534.

17. Avrameas S., Dighiero G., Lymbery., Guilbert B. Studies on Natural Antibodies and Autoantibodies.// Ann. Immunol.(Inst. Pasteur).- 1983.-v.134,- p. 103-113.

18. Avrameas S., Guilbert В., Mahana W. et al. Recognition of Self and Non-Self Constituents by Polyspecific Autoreceptors. // Intern. Rev. Immunol.- 1988.- v.3.- p. 1-15.

19. Bartmann W. Prostaglandins.// Angewandte chemie.- 1975.- v. 14,- p. 337-344.

20. Batta S.K. Effect of prostaglandins on steroid biosynthesis.// J. Ster. Biochem.-1975.-v.6.- p. 1075-1080.

21. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurment of monoclonal antibody affinity by noncompetitive enzyme immunoassay.// J. Immunol. Methods.- 1987.- v. 100.- p. 173-179.

22. Bennett S., Fleshier B. PG'SA: gastrointestinal tract.// Gastroenterology.- 1970,- v.59.- p. 790801.

23. Bergstrom S., Carlson L.A. Inhibitory action of prostaglandin Ei on the mobilizationof free fatty acids and glycerol from human adipose tissue in vitro.// Acta Physiol. Scand.- 1965.-v.63,-p.195-196.

24. Bergstrom S., Carlson L.A., Weeks J.R. The prostaglandins: a family of biological activ lipids.// Pharmac. Rev.- 1968.- v.20.- N 7,- p. 1-48.

25. Bernhard A., Lauwerys R., Mahien P. et al. Anti-basement-membrane antibodies in the serum of healthy subjects.// New Engl. J. Med.- 1986,- v. 314, N 22,- p. 1456-1457.

26. Bertelli A., Caciagli F., Schinelli M.L. Prostaglandins and cyclic nucleotids in tissue inflammation reactions. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975,- p. 28.

27. Berti F., Folco G.C. et al. Prostaglandins and cyclic nucleotides in central nervous system. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975,- p. 34-35.

28. Bezzi P., Carmagnoto G., et al. Prostaglandins stimulate calcium-dependent glutamate release in astrosytes. //Nature (Gr. Brit.).- 1998,- v.391, N 6664,- p. 281-285.

29. Billah M.M., Lapentina E.G., Cuatrecasas P. Phospholipase A2 and phospholipase C activities of platelets: Differential subsrate specificity, Ca2+ requirement, pH dependence and cellular localization.//J. Biol. Chem.- 1980,- v.255.-p. 10227-10231.

30. Bockman R.S. Stage dependent reduction in T colony formation coincidence with monocyte synthesis of prostaglandins.// J. Clin Invest.- 1980.- v.66.- p. 533-538.

31. Boyden S.V. Natural Antibodies and the Immune Response. In: Advanses in Immunology, ed by F.J. Dixon, J.H. Hhumphre. Academic. Press, New York.- 1966.- 5.- p. 1-28.

32. Bucana C., Hanna M.J. Immunoelectronmicroscopic analysis of surface antigens common to Mycobacterium bovis (BCG) and tumor cells.// J. Nat. Cancer Inst.- 1974,- v.53.- p. 1313.

33. Bui T., Straus D. Effects of cyclopentenone prostaglandins and related compounds on insulinlike growth factor-I and Wafl gene expression. // Biochim. et biophys. acta. Gene Struct, and Express.- 1998.-v,1397,N l.-p. 31-42.

34. Calzi L., Battiato S., Santini F., et al. Autoantibodies to Thyroxin and Triiodthyronine in the Immunoglobulin G Fraction of Serum. // Clinical Chemistry.- 1988.- v.34, N 12,- p. 2561-2562.

35. Carlan M.C., Peres A., Nardi N.B. Frequency of B cells in normal mice which recognize self proteins. // Braz. J. Med. Biol. Res.-1997.- 30(2).- p. 225-230.

36. Casali P., Burastero S.E., Nakamura M., et al. Human Lymphocytes Making Rheumatoid Factor and Antibody to ssDNA Belong to Leu-1+ B-Cell Subset.// Science.- 1987,- v.236.- p. 77-81.

37. Caspary E.A., Gubbay S.S., Stern G.M. Circulating antibodies in polymyositis and other muscle-wasting disorders.// Lancet.- 1964,- v.2, N 1366- p. 941.

38. Cederholom B., Wieslander J., Bygren R., et al. Patients with IgA nephropathy have circulating anti-basement membrane antibodies reacting with structures common to collagen I, II and IV.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986,- v.83,N 16,- p. 6151-6155.

39. Cervenak J., Kiss K., Uher F. Partial characterization of two lymphocyte-specific natural autoantibodies isolated from newborn mice. // Acta Microbiol. Immunol. Hung.-1999.- 46(1).-53-62.

40. Champion S., Haye B., Jacquemin CI. Cholinergic control by endogenous prostaglandins of CAMP accumulation under stimulation in the thyroid. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975,-p. 28-29.

41. Chaudhard A., Anderson M.V., Eling T.E. Conjugation of 15-keto-prostaglandin by Gluthation-S-transferases.// Biochim. Biophys. Acta.- 1978,- 531(1).- p. 56-64.

42. Chen P.P., Albrandt K., Orida N.K. et al. Genetic Basis for the Cross-Reactive Idiotypes on the Light Chains of Human IgM anti-IgG Autoantibodies. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1986,-83(21).-p. 8318-8322.

43. Chiabrando Ch., Broggini M., Castagnoli M.N., et al. Prostsglandin and Thromboxane Synthesis by Lewis Lung Carcinoma during Grows.// Cancer Res. 1985.- v.45.- N 8.- p. 3605-3608.

44. Colnaghi M.J., Menard S., Togliabue E., et al. Heterogeneity of the natural humoral anti-tumor immune response in mice as shown by monoclonal antibodies.// J. Immunol.- 1982,- v. 128.- p. 2757.

45. Cosenza M. Detection of anti-idiotype reactive cells in the response to phosphorylcholine.// Europ. J. Immunol.- 1976.- v.6.- p. 114.

46. Coutinho A., Kazatchkine M.D., Avrameas S. Natural autoantibodies. // Curr. Opinion Immunol.-1995,- 7(6).- p. 812-818.

47. Coutinho. A. Simple developmental programs of gene expression and cellular composition of lymphoid organs at the origin of natural tolerance. // Res. Immunol.-1995. 146(4-5).- p. 321332.

48. Deachapunya C., O'Grady S.M. Regulation of chloride secretion across porcine endometrial epithelia cells by prostaglandin E2.// J. Physiol.- 1988,- v.508, N 1,- p. 31-47.

49. Delves P.J., Roitt I.M. Idiotypic determinants on human thyroglobulin autoantibodies derived from the serum of Hashimoto patients and EB virus transformed cell lines.// Clin. Exp. Immunol.- 1984,- v.57, N 1,- p. 33-40.

50. Diaw L., Magnac C., Pritsch O. et al. Structural and affinity studies of IgM polyreactive natural autoantibodies. //J. Immunol.-1997,- 158(2).-p. 968-976.

51. Dighiero C., Lymberi P., Masie J.C. et al. Murine Hybridomas Secreting Natural Monoclonal Antibodies Reacting With Self Antigens. // J. Immunol.- 1983,- 131(5).- p. 2267-2272.

52. Dighiero G., Lymberi P., Guilbert B. et al. Natural Autoantibodies Constitute a Substantial Part ofNormal Circulating Immunoglobulins.// Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1986.-v.475.- p. 134-144.

53. Dighiero G., Lymberi P., Holmberg D. et al. High frequency of natural autoantibodies in normal newborn mice.// J. Immunol.- 1985,- v.134, N 2.- p. 765-771.

54. Eisenberg R.A., Theofilopoulos A.N., Andrews B.C., et al. Natural Thymocytotoxic autoantibodies in autoimmune and normal mice.// J. Immunol.- 1979,- v.122, N 6.- p. 2272.

55. Eliat D., Hochberg M., Pumphrey J., et al. Monoclonal antibodies to DNA and RNA from NZB/NZW Fi mice: antigenic specificities and NH2 terminal amino acid sequences.// J. Immunol.- 1984.-v.133,N l.-p. 489-494.

56. Els W.J., Helman S.I. Dual role of prostaglandins (PGE2) in regulation of channel density and open probability of epithelial Na+ channels in frog skin (R. pipiens). // J. Membrane Biol.-1997,- v.155, N 1,- p. 75-87.

57. Euler von U.S. On the specific vasodilating and plain mascle stimulating substances from accesory genital gland in man and certain animals. (Prostaglandins and vesigland).// J. Physiol. (Lond.).- 1936,- v. 88.- p. 213-234.

58. Fain J.N. Stimulation by insulin and prostaglandin Ei of gluxose metabolism and inhibition of lipolytic action of theophylline on fat cells in the absence of K.// Endocrinology.- 1968.- v.83.-p. 548-554.

59. Farahat A.A., Shaker M. Biological activity of prostaglandins. 2. Distribution of ascorbic acid and glutathion in the internal organs of rats after treatment with PGF2«- In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975.- p. 78.

60. Fish F., Ziff M. The in vitro and in vivo induction of anti-double-stranded DNA antibodies in normal and autoimmune mice.// J. Immunol.- 1982.- v.127.- p. 409-414.

61. Fitzpatric F.A., Wynalda M.A. Albumin-Catalised Metabolism of Prostaglandin D2.// J. Biol. Chem.- 1983,-258(19).-p. 11713-11719.

62. Friedman J. Human Thrombin Autoantibodies.// Thrombosis Res.- 1978,- 13(4).- p. 681-688.

63. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., et al. Measurment of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complexes by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.// J. Immunol. Meth.- 1985,- v.77, N 2,- p. 305-319.

64. Fucikova T., Cermakova J., Mareckova H. et al. CD5-positive B lymphocytes and antinuclear antibodies. // Cas. Lek. Cesk.-1998.-137(2).- p. 55-58.

65. Gajdos A. Medicine et biochemie. Paris.-1971,- p. 1-73.

66. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A., et al. A unique natural human IgG antibody with anti-a-galactosyl specificity. // J. Exp. Med.- 1984,- v.160, N 5,- p. 1519-1531.

67. Glotz D., Zanetti M. Detection of a regulatory idiotype on a spontaneous neonatal self-reactive hybridoma antibody.// J. Immunol.-1986.-v.137, N 1,- p. 223-227.

68. Goldbaum F.A., Braden B.C., Poljak R.J. The molecular basis of antigen mimicry by antiidiotype antibodies. // Immunologist.- 1998,- v.6, N1.- p. 13-18.

69. Gonsales R., Charlemagne J., Mahana W., et al. Specificity of natural serum antibodies present in phylogenetically distinct fish species. // Immunology.- 1988,- v.63, N 1,- p. 31-36.

70. Gonsales R., Matsiota P., Torchy C. et al. Natural Anti-TNP Antibodies from Rainbow trout interfere with Viral Infection in Vitro. // Res. Immunol.- 1989,- v. 140, N 7,- p. 675-684.

71. Grabar P. "Self' and "not-self' in immunology.// Lancet.- 1974,- v.l, N 7870,- p. 1320-1322.

72. Grabar P. Autoantibodies and the physiological role of immunoglobulins.// Immunol. Today.-1983,-v.4,N 12,-p. 337-340.

73. Grabar P. Hypothesis. Auto-antibodies and Immunological Theories: Analytical Reviw.// Clin. Immunol. Immunopathol.- 1975,- 4(4).- p. 453-466.

74. Grabar P. Les Globulines du Serum Sanguin.// Liege.- 1947,- p. 25.

75. Granstrom E., Hamberg M., Hansson C., Kindahl H. Chemical Instability of 15-keto-13,14-dihydro-PGE2: the Reason for Low Assay Reliability. // Prostaglsndins.- 1980.- 19(6).- p. 933957.

76. Guilbert B., Dighiero G., Avrameas S. Naturally Occuring Antibodies against Nine Common Antigens in Human Sera. I. Detection, Isolation, and Characterisation.// J. Immunol.- 1982.-128(6).-p. 2779-2787.

77. Guilbert B., Mahana W., Gilbert M. et al. Presence of Natural Autoantibodies in Hyperimmunized Mice.// Immunology.- 1985,- v.56, N 3.- p. 401-408.

78. Gyires K., Knoll J. Some data on writing syndrome induced by PGEi in mice. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975.- p. 15-16.

79. Hamberg M., Svensson J., Samuelsson B. Thromboxanes: a new group of biologically active compounds derives from prostaglandin endoperoxidase.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1975.-v.72.- p. 2994-2998.

80. Hammarstrom S. Biosynthesis and biological activity of prostaglandins and thromboxanes.// Arch. Biochem. Biophys.- 1982,- v.214.-p. 431-445.

81. Hanna M., Tennant R.W., Yunas I.M., et al. Autogenous immunity to endogenous RNA tumor virus antigens in mice with a low natural incidence of lymphoma.// Canser Res.- 1972,- v.32.-p. 2226.

82. Hardy R.R., Dongt J.L., Hayakawa K., et al. Frequent X light chain gene rearrangement and expression in a Ly-1 B lymphoma with a productive k chain allele.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986,- v.83, N 5,- p. 1438-1442.

83. Hardy R.R., Hayakawa K., Shimizu M. Rheumatoid Factor Secretion from Human Leul+ B-cells. // Science.- 1987,- 236(4797).- p. 81-83.

84. Harris E.N. Antiphospholipid antibodies. // Brit. J. Haematol.- 1990,- v.74.- p. 1-9.

85. Hayakawa K., Hardy K., Honda M., et al.Ly-1 B celle: Functionally distinct lymphocytes that secrete IgM autoantibodies.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1984,- v.84, N 8.- p. 2494-2498.

86. Hayakawa K., Hardy K.D., Parks D.K. et al. The "LY-1 " cells subpopulatuon in normal, immunodefective, and autoimmune mice.// J. Exp. Med.- 1983,- v.157.- p. 203-218.

87. Hayakawa K., Hardy R., Herzenberg L.A. Peritoneal Ly-1 B cells: genetic control increased lambda light chain expression.// Eur. J. Immunol.- 1986,- v. 16, N 4.- p. 450-456.

88. Hinter H., Romani N., Stanzl U., et al. Phagocytosis of Keratin Filament Aggregates Following Opsonization with IgG-anti-keratin Filament Autoantibodies.// J. Invest. Dermatol.- 1987,-v.88.-p. 176-182.

89. Hirata M., Kakizuka A., Aizawa M. et al. Molecular characterization of mouse prostaglandin D receptor and functional expression of the cloned gene. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1994.-v.91, N 23.- p. 11192-11196.

90. Holborow E.I., Weir D.M., Johnson G.D. A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei.// Brit. Med.- 1957.- v.2.- p. 732-734.

91. Holmberg D., Freitas A.A., Portnoi D. et al. Antibody Repertoires of Normal BALB/c Mice: B Lymphocyte Populations Defined by State of Activation.// Immunol. Rev.- 1986.-v.93.-p. 147-169.

92. Horton E.W. A comparison of the actions of prostaglandins F2« and E2 on smooth muscle.// Brit. J. Pharmacol. Chemother.- 1965,- v.24.- p. 470-475.

93. Horton E.W. Prostaglandins. New York.- 1972,- p. 1-181.

94. Hudson L., Hay F.C. Practical Immunol. Edinburgh: Blackwell Scientific Publ., 1980, p.359.

95. Itaya T., Moriuchi T., Kodama T., et al. Naturally occurring antibodies against fibrosarcoma and glioma cells in rats.// Gann. Japan. J. Cancer Res.- 1982.-v.73, N 3,- p. 454461.

96. Jackson S., Montgomery R.J., Mestecky J. et al. Normal Human Sera Contains Antibodies Directed at Fab of IgA. // J. Immunol.- 1987,- 138(7).- p. 2244-2248.

97. Jaffe B.M., Smith J.W., Newton W.T. et al. Radioimmunoassay for Prostaglandins. // Science.- 1971,- 171(3970).- p. 494-496.

98. Jerne N. Towards a network theory of the immune system.// Ann. Immunol.- 1974,- v. 125.-p. 373-389.

99. Kaneko T., Zor U., Field J.B. Thyroid-stimulating hormone and prostaglandin Ei stinulation of cyclic 3',5'-adenosine monophosphate in thyroid stices.// Science (N.Y.).- 1969.- v. 163.- p. 1062-1063.

100. Karray S., Lymbery P., Avrameas S. et al. Quantitative Evidence Against Inactivation of Self-reactive B-cell Clones.// Scand. J. Immunol.- 1986,- v.23.- p. 475-480.

101. Kay M.M.B., Sorensen K., Wong P., Bolbon P. Antigenecity, Storage, and Aging: Physiologic Autoantibodies to Cell Membrane and Serum Proteins and the Senescent Cell Antigens. // Mol. Cell. Biochem.- 1982,- 49(2).- p. 65-85.

102. Kefalides N., Pegg M., Ohno N., et al. Antibodies to basement membrane collagen and to laminin are present in sera from patients with poststreptococcal glomerulonephritis.// J. Exp. Med.- 1986,- v.163, N 3,- p. 588-602.

103. Keskemeti V., Kelemen K., Knoll J. Comparative effects of prostaglandins on the cardiac transmembrane potentials. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975.- p. 119.

104. Khansari N., Fudenberg H. Immune Elimination of Autologous Senescent Erythrocytes by Kupffer Cells in Vivo.// Cell. Immunol.- 1983,- v.80, N 2.- p. 426-430.

105. Kleinfield R., Hardy R.R., Tarlinto D., et al. Recombination between an expressed immunoglobulin heavy-chain gene and a germline variable gene segment in a Ly 1+ B cell lymphoma.//Nature.- 1986.-v.332.-p. 843-846.

106. Klein-Nulend J.S., Cornelis M., Birger E.H. Prostaglandin mediated modulation of transforming growth factor-ß metabolism in primary mouse osteoblastic cells in vitro. // J. Cell. Physiol.- 1996,- v.168, N 1,- p. 1-7.

107. Kluskens L., Kohler H. Regulation of immune response by autogenous antibody against receptor.// Proc. Nat. Acad. Sei. USA.- 1974,- v.71, N 12,- p. 5083.

108. Knut A., Lloyd K.O., Lipkin M., et al. Natural Antibodies in Human Sera Directed Against Blood-Group-Related Determinants Expressed on Colon Cancer Cells.// Internat. J. Cancer.-1983.- v.32, N 2.- p. 199-204.

109. Korochkin I.M., Verbitskaya I.A., Kroupnik V.E. et al. Detection of human natural autoantibodies, specific for noradrenaline in patients with cardiovascular diseases// In: 10th World Congress of Cardiology.- Washington, 1986.- p. 220.

110. Kwapinski G., Oliver H., Kwapinski E., et al. Microbial-Like Antigens in Human Leukemia.// Oncology.- 1978.- v.35, N 6,- p. 263-266.

111. Lacroix-Desmazes S., Kaveri S.V., Mouthon L. et al. Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. // J. Immunol. Methods.-1998,- 216(1-2).- p. 117-137.

112. Lai J., Jin H., Yang R. et al. Prostaglandin F2 alpha induces cardiac myocyte hypertrophy in vitro and cardiac growth in vivo. // Am. J. Physiol.-1996.- 271(6 Pt 2).- p. 2197-2208.

113. Levy M., Fridman W.H., Neauport-Santes C. In Vitro Generation of Cells Producing Antierythrocyte Autoantibodies in Normal Mice.// Cell. Immunol.- 1982,- v.71, N 2.- p. 241253.

114. Lippman W. Inhibition of gastric acid production on the rat by synthetic prostaglandins analogues.// Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1971.- v.180.- p. 332-335.

115. Lomakin M.S., Krivoshein Y.S. Some Immunobiological Peculiarities of the Growth and Metastasizing of Induced Tumor and their First Passages.// Neoplasma 1965.-v.12, N 5.- p. 495-506.

116. Mace G., Blanpied C., Emorine L.J. et al. Isolation and characterization of natural human IgG with a morphine-like activity. // Eur. J. Immunol.-1999,- 29(3).- p. 997-1003.

117. Maclouf J., Kindahl H., Granstrom E., Samuelsson B. Interaction of Prostaglandin H2 and Thromboxane A2 with Human Serum Albumin. // Eur. J. Biochem.- 1980,- 109(2).- p. 561-565.

118. Madaio M.P., Schattner A., Schattner M., et al. Lupus serum and normal human serum contain anti-DNA antibodies with the same idiotypic marker.// J. Immunol.- 1986.- v.137, N 8.-p.2535-2543.

119. Manser T., Gefter M. The molecular evolution of the immune response: idiotype-specific suppression indicates that B cells express germ-line-encoded V gene prior to antigenic stimulation.// Eur. J. Immunol.- 1986.- v.16, N 11,- p. 1439-1444.

120. Mao G.F., Jin J.G., Bastepe M., et al. Prostaglandin E2 Both Stimulates and Inhibits Adenyl Cyclase on Platelets: Comparison of Effects on Cloned EP4 and EP3 Prostaglandin Receptor Subtyps.// Prostaglandins.- 1996,- v.52.- p. 175-185.

121. Martin W.J., Martin S.E. Thymus reactive IgM autoantibodies in normal mouse sera.// Nature.- 1975,- v.254.- p. 716-718.

122. Matsiota P., Chamaret S., Montagnier L., Avrameas S. Detection of Natural Autoantibodies in the Serum of Anti-HIV-positive Individuals.// Ann. Immunol. (Inst. Pasteur).- 1987.- v.138.-p. 223-233.

123. Mattaj I.W., Habets W.J., Venrooij W.J. Monospecific antibodies reveal details of U2 sn RNP structure and interaction between U1 and U2 sn RNPs. // EMBO J.- 1986.- v.5, N 5,- p. 997-1002.

124. Menard S., Colnaghi M.I., Delia Porta G. Natural anti-tumor serum reactivity in BALB/c mice. I. Characterization and interference with tumor growth.// Internat. J. Cancer.- 1977.- v. 19, N 2,- p.267-274.

125. Mercolino T., Arnold L., Haughton G. Phosphatidyl choline is recognized by a series of Ly-1+ murine B cell lymphomas specific for erythrocyte membranes.// J. Exp. Med.- 1986.- v.163, N 1,-p. 155-165.

126. Mikawa K., Akamatsu H., Maekawa N., et al. Inhibitory effect of prostaglandin Ei on human neutrophil function. // Prostagland., Leukotrienes and Essent. Fatty Asids.- 1994.- v.51, N4,-p. 287-291.

127. Miller C.W., Casimir D.A., Ntambi J.M. The mechanism of inhibition of 3T3-L1 preadipocyte differentiation by prostaglandin F2«. // Endocrinology.- 1996.-v.137, N 12,- p. 5641-5650.

128. Minden P., Sharpton T., et al. Shared antigens between bacteria and Guinea pig linelO hepatocarcinoma cells.// Cancer. Res.- 1976,- v.36.- p. 1680.

129. Nagoshi H., Uehara Y., et al. Prostaglandin D2 inhibits inducible nitric oxide synthase expression in rat vascular smooth mascle cells. // Circ. Res.- 1998,- v.82, N 3,- p. 204-209.

130. Nakano J. Effects of prostaglandins Ei, Ai and F2a on the coronary and peripheral circulation.// Proc. Soc. exp. Biol. Med.- 1968.- v.128.- p. 39-42.

131. Naparstek Y., Andre-Schwartz J., Manser T., et al. A single germline Vr gene segment of normal A/J mice encodes autoantibodies characteristic of systemic lupus erythematosus.// J. Exp. Med.- 1986,- v.164, N 2,- p. 614-626.

132. Nardiello S., Pizella T., Rucso M., Galanti B. Sensitive ELISA for IgG and IgM AntiAlbumin Autoantibodies not Influenced by HBS Ag-Associated Polyalbumin Receptors. // J. Immunol. Meth.- 1985,- 76(1).-p. 121-127.

133. Narumiya S., Yukihiko S., Fumitaca U. Prostanoid Receptors: Structures, Properties, and Functions.// Physiol. Rev.- 1999,- v.79.- N 4,- p. 1193-1226.

134. Nicosia S., Patrono C. Eicosanoid biosynthesis and action: novel opportunities for pharmacological intervention.//FASEB J.- 1989.-v.3.- 1941-1948.

135. Nieto A., Gaya A., Jansa M., et al. Direct Measurment of Antibody Affinity Distribution by Hapten-Inhibition Enzyme Immunoassay.// Mol. Immunol.- 1984.- v.21.- № 6.- p.537-543.

136. Nimmo G.R., Lew A.M., Stanley A., et al. Influence of Affinity on the Performance of Different Antibody Assays.// J. Immunol. Methods.- 1984.- v.12, N 1,- p. 177-187.

137. Nishioka M., Watanabe,S., Kabayashi K., et al. Rabbit autoanyibodies to actin induced by immunization with heterologous actins; a possible mechanism of smooth musle antibody production.// Clin, and Exptl. Immunol.- 1983,- v.53.- p. 159-164.

138. Nouberg C. Weitere Beitrage zur Chemie der Geschwulste. YII. Mitteilung.// Biochem. Z.-1910,-b.26.-p. 344-350.

139. Ochiai T., Ahmed J., Scher K. Functional characterization of a naturally occurring antibody cytotoxic for a subpopulation of splenic T cells.// Transplantation.- 1976,- v.22, N 1.- p. 1-8.

140. Opmeer F.A., Adolfs M.J.P., Bonta I.L. Direct evidence for the presence of selective binding sites for (3H)prostaglandin E2 on rat peritoneal macrophages.// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1983,-v.114.-p. 155-161.

141. Ortega E., Kostovetzky M., Larralade C. Natural DNF-Binding Immunoglobulins and Antibody Multispecificity.// Mol. Immunol.- 1984,- 21(6).- p. 883-888.

142. Parker C.W. Modulation of lymphoid cell function and allergic responses. In: Advances in Cyclic Nucleotide Research, ed. by P. Hamet and H. Sands, Raven Press, New York.- 1980.- p. 181.

143. Peng T.C., Six K.M., Munson P.L. Effects of prostsglandin Ej on the hypothalamo-hypophyseal-adrenal cortical axis of rats.// Fed. Proc. Fedn. Am. Soc. exp. Biol.- 1969.- v.28,-p. 437.

144. Pengo V., Ruffati A., Baritussio A. et al. Serum of Normal Subjects Contain IgG with Antibody-Like Specificity for Phospholipids. // Folia Haematol.- 1984,- 111(5).- p. 681-685.

145. Perkins J. The effect of prostaglandin on the metabolism of cyclic AMP in cultured human astrocytoma cells. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975,- p. 36.

146. Pisetsky D., Caster S. The B-Cell Repertoire for Autoantibodies: Frequency of Precursors Cells for Anti-DNA Antibodies.// Cell. Immunol.- 1982,- v.72, N 2,- p.294-305.

147. Poddubiuk Z., Kleinrok Z. The comparison of the central action of some prostaglandins in rats. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975.- p. 14.

148. Poljak R.J. An idiotope-anti-idiotope complex and the structural basis of molecular mimicking. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1994,- v.91, N 5,- p. 1599-1600.

149. Poncet P., Matthes T., Billecoco A., et al. Immunochemical studies of polispesific natural autoantibodies: charge, lipid reactivity, Fab^ fragments activity and complement fixation.// Mol. Immunol.- 1988.- v.25.- N 10.- p. 981-989.

150. Poulsen E., Hjort T. Identification of auto-antigens of the human sperm membrane.// J. Clin, and Lab. Immunol.- 1981,- v.6, N 1,- p 69-74.

151. Ragimbeau J., Avrameas S. Singl LPS-reactive B Cells in the Unimmune Mouse Spleen Cell Population Secrete Natural Multispecific Autoantibodies.// Scand. J. Immunol.- 1987.-v.26.-p. 29-35.

152. Reichlin M. Autoantibodies to the Ro RNP particles. // Clin, and Exp. Immunol.- 1995.-v.99, N 1,- p. 7-9.

153. Reth M., Kelsoc G., Rajewsky K. Idiotypic regulation by isologous monoclonal anti-idiotope antibodies.//Nature.- 1981.- v.290,N 5803,- p. 257-259.

154. Ritterboure-Simmons S. Production of diglyceride from phosphatidyl-inositol in activated human platelets.// J. Clin. Invest.- 1979.- v.63.- p. 580-587.

155. Robbins J., Rail J.E., Rawson R.W. An Unusual Instance of Thyroxin-Binding by Human Gamma Globulin.// J. Clin. Endocrinol. Metabol.- 1956,- 16(5).- p. 573-579.

156. Robert A. Prostaglandins, gastric secretion and gastrointestinal diseases. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975.-p. 170-171.

157. Rosenfeld S.J., Gralnick H.R. Adhesive Interactions in Hemostasis.// Acta Haematol.-1997,-v.97.-p. 118-125.

158. Rosenthale M.E., Dervinis A., Strike D. Actions of prostaglandins on the respiratory tract of animals. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975,- p. 245.

159. Rosklin R.E., Bendtzen K., Greineder D. Mediators of immunity: Lymphokines and monokines.//Adv. Immunol.- 1980.-v.29.-p. 55-136.

160. Roth-Brandel U., Bygdeman M., Wiqvist N. Effects of intravenous administration of prostaglandin Ei and F2a on the contractility of the non-pregnant human uterus in vivo.// Acta Obstet. Gynecol. Scand.- 1970,- v.49.- Suppl. 5,- p. 19-25.

161. Rowley D.A., Fitch F.W., Stuart F.P. et al. Specific Supression of Immune Responses. Antibody directed against either antigen or receptor for antigen can suppress immunity specifically.//Science.- 1973,- v.181,N4105,- p. 1133-1141.

162. Ruf J., Carayon P., Lissitcky S. Various expression of unique anti-human thyroglobulin antibody repertoire in normal state and autoimmune disease.// Eur. J. Immunol.- 1985.- v.15, N3,- p. 268-272.

163. Salbash P.B., Specht E., Janssen-Timmen U., et al. Differential Low Density Lipoprotein Receptor-Dependent Formation of Eicosanoids in Human Blood-Derived Monocytes.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1992,- v.89.- p. 2439-2443.

164. Samuelsson B. Metabolic transformation of arachidonic acid.// Prostaglandins.- 1976.-v.ll.-p. 431-435.

165. Samuelsson B., Granstrom E., et al. Metabolism of prostaglandins.// Ann. N. Y. Acad. Sci.-1971,- V.180.- p. 138-163.

166. Sansonno D.E., DeTemaso P., Papanice M.A. et al. An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Autoantibodies to Albumin. // J. Immunol. Meth.- 1986.-90(1).- p. 131-136.

167. Sawada S., Talal N. Characteristics of in vitro production of antibodies to DNA in normal and autoimmune mice.// J. Immunol.- 1979,- v. 122, N 6.- p. 2309.

168. Scheid M.P., Goldstein G., Hammerling U., Byse E.A. Lymphocyte differentiation from precursor cells in vitro.// Ann. N. Y. Acad. Sei.- 1975,- v.249.- p. 531-540.

169. Scollay R.C., Butcher E. C., Weissman I. Thymus cell migration. Quantitative aspects of cellular traffic from the thymus to the periphery in mice.// Europ. J. Immunol.- 1980.- v. 10.- p. 210.

170. Sela B.A., Raz A., Geiger B. Antibodies to ganglioside Gmi induce mitogenic stimulation and cap formation in rat thymocytes.//Europ. J. Immunol.- 1978.-V.8, N 4.- p. 268-274.

171. Serban D., Kordorf-Adan C., Sun Y.-Z., et al. Murine polyspecific antibodies. I. Monoclonal and Serum Anti-DNA Antibodies Cross-reactive with 2,4,6-Trinitrophenyl Derivatives.// J. Immunol.- 1985,- v,135,N 5,- p.3122-3127.

172. Sergeeva M.G., Gonchar M.V., Mevkh A.T., Varfolomeyev S.D. Prostaglandin E2 biphasic control of lymphocyte proliferation: Inhibition by picomolar concentrations. // FEBS Lett.-1997,-v.418,N3.-p. 235-238.

173. Shearer W.T., Parker C.W. Antibody and complement modulation of tumor cell growth in vitro and in vivo.// Federat. Proc.- 1978,- v.37, N 10.- p. 2385-2389.

174. Shlomchik M., Nemazee D., Sato V., at al. Variable region sequences of murine IgM anti-IgG monoclonal autoantibodies (rheumatoid factors).// J. Exp. Med.- 1986.- v. 164, N 2,- p. 407-427.

175. Shlomchik M.J., Marshak-Rothstein A., Wolfowicz C.B., et al. The role clonal selection and somatic mutation in autoimmunity. // Nature.- 1987,- v.328, N 6133,- p. 805-811.

176. Siegl A.M., Smith J.B., Silver M.J. et al. Selective binding site for (3H)-prostacyclin on platelets.// J. Clin. Invest.- 1979,- v.63.- p. 215-220.

177. Sing V.K., Hoffman M.A. Detection of antibodies to thymic tissue in human serum.// Immunol. Letters.- 1984,- v.7, N 5,- p. 249.

178. Souan M.L., Geffard M., Lebrin-Grauder P., et al. Detection of anti-acetylcholine antibodies in myasthenic patients.//Neurosci. Lett.- 1986.- v.64(l).- p. 23-28.

179. Stankova I., Prokesova L., Trojan S. Autoantibodies to brain tissue in rat sera: Pap. Symp. "Role Nitric Oxide Contr. Cardiov. Syst." Slov. and Czech Physiol. Soc., Brateslava, Febr. 5-7, 1996.//Physiol. Res.- 1996,- v.45, N 6,-p. 27.

180. Stein L.D., Sigal N.H. Heterogeneity of the human phosphocholine-specific B cell repertoire.// J. Immunol.- 1984,- v. 132, N 3,- p. 1329.

181. Stenson W., Parker C.W. Prostaglandins. In: Immunopharmacology, ed by P. Sirois and M. Rola-Pleszczynski, Elsevier/North Holland, Amsterdam.- 1982.

182. Sullivan T.D. Diacylglycerol metabolism and the release of mediators from mast cells. In: Biochemistry of the acute Allergic Reactions, ed by E.L. Becker, A.S. Simon and K.F. Austen, Alan R. Liss, New York.-1981,- p. 229-238.

183. Sulzer B., van-Hemmen J.L. Adaptive control: a strategy to treat autoimmunity. // J. Theor. Biol.-1999.- 196(1).-p. 73-79.

184. Sunahara F.A., Talasnik J. Modulatory role of prostaglandin on the regulation of coronary circulation. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975,- p. 122.

185. Takase B., Maruyama T., Kurita A. et al. Arachidonic acid metabolites in acute myocardial infarction. // Angiology.-1996.- 47(7).- p. 649-661.

186. Tateson J.E., Moncada S., Vane J.R. Effects of prostacyclin (PGX) on cyclic AMP concentrations in human platelets.//Prostaglandins.- 1977.- v.13.- p. 389-397.

187. Ternynck T., Avrameas S. Murine Natural Monoclonal Autoantibodies: a Study of Their Polyspecificities and Their Affinities.// Immunol. Rev.- 1986.-v.94,- p. 99-112.

188. Tomer Ya., Shoenfeld Y. The significance of natural autoantibodies.// Immunol. Invest.-1988.- v.17.- № 5,- p.389-424.

189. Trimarchi T., Benvenga S., Fenzi G. et al. Immunoglobulins Binding of Thyroid Hormones in a Case of Waldenstrom's macroglobulinemia. // J. Clin. Endocrinol. Metabol.- 1982,- 54(5).-p. 1045-1051.

190. Underwood J.R., Pedersen J.S., Chalmens P.J. et al. Hibrids from Normal Germ-free Nude and Neonatal Mice Produced Monoclonal Autoantibodies to Eight Different Intracellular Structurs.// Clin. Exp. Immunol.- 1985,- v.60.- p. 417-426.

191. Usardi M.M., Berti F., Franceschini J. et al. PGF2 stimulates gastric acid secretion in the rat. In: International conference on prostaglandins. Florence.- 1975.- p. 164.

192. Vaki M., Kearney J.F. Functional Characterization of Monoclonal Auto-antiidiotype Antibodies Isolated from the Early B Cell Repertoire of BALB/c Mice.// Eur. J. Immunol.-1986,- v.16, N9,-p. 1151-1158.

193. Vaki M., Sauter H., Paige C., et al. In Vivo Supression of Perinatal Multicpecific B Cells Results in a Distortion of the Adult B Cell Repertoire.// Eur. J. Immunol.- 1986.- v. 16,- p. 1159-1165.

194. Vesin M.F., Harbon S. Effect of prostaglandins and arachidonic acid on rat myometrial and endometrial adenylate cyclase. In: Advances in prostaglandins and thromboxane research., ed by B.Samuelsson and R Paoletti. V.2. New York.- 1976.- p. 847-848.

195. Vetter A.E., O'Grady S.M. Mechanisms of electrolyte transport across the endometrium. I. Regulation by PGF2a and cAMP. // Amer. J. Physiol.- 1997,- v.270, N 2,1,- p. 663-672.

196. Wada K., Ueno S., Harzana T., et al. Radioimmunoassay for antibodies to human skeletal muscle myosin in serum from patiens with polimiositis.// Clin, and Expl Immunol.- 1983.-v.52, N 2,- p. 297-304.

197. Week J.R., Sekhar N.S., Dusharme D.W. Relative activity of prostaglandins Ei, Ai, E2 and A2 on lipolysis, platelet agregation smooth muscle and the cardiovascular system.// J. Pharm. Pharmac.- 1969,- v.21.-p 103-108.

198. Whitaker A.N., McFarlaine J.R., Rowe E.A. et al. Measurement of Autoantibodies against Fibrinogen and Fibrin Degradation Products by Enzyme-Linked Immunoassay. // Thromb. Haemostasis.- 1985,- 53(1).-p. 80-85.

199. Wiener E. A Possible Role for Antibodies Against Spectrin in the Interaction Between Erythroblasts and Macrophages in vitro.// Br. J. Exp. Path.- 1985,- v.66.- p. 17-25.

200. Wing M.G. The molecular basis for a polyspecific antibody. // Clin, and Exp. Immunol.-1995,- v.99, N3,- p. 313-315.100

201. Wolosin L.B., Grenberg A.H. Murine Natural Anti-Tumor Antibodies.//1. Rapid In Vivo Binding Of Natural Antibody By Tumor Cells In Syngenic Mice.// Internat. J. Cancer.- 1979.-v.23,N.- p. 519-529.

202. Xavier R.M., Yamauchi Y., Nakamura M., et al. Antinuclear antibodies in healthy aging people: A prospective study. // Mech. Ageing and Dev.- 1995,- v.78, N 2,- p. 145-154.

203. Yachic A., Konno A., Ohta K., et al. Delineation of producing ability of IgG and IgA subclasses by naive B cells in newborn infants and adult individuals. // Clin, and Exp. Immunol.- 1995,-v,102,N l.-p. 204-209.

204. Zamulaeva I.A., Lekakh I.V., Kiseleva V.l., et al. Natural hidden antibodies reacting with DNA or cardiolipin bind to thymocytes and evok their death. // FEBS Lett.- 1997.- v.413, N 2,-p. 231-235.

205. Zouali B., Eyguem A. Expression of Anti-idiotypic Clones against Auto-Anti-DNA Antibodies in Normal Individuals.// Cell. Immunol.- 1983.- v.76, N 1,- p. 137-147.

206. Zouali M., Migliorini P., Stollar B.D. Murine lupus anti-DNA antibodies cross-react with the hapten (4-hydroxy-5-iodo-3-nitrophenyl) acetyl, but immunization-induced anti-DNA antibodies do not.// Eur. J. Immunol.- 1987.- v. 17, N 4,- p. 509-513.