Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Феногенетическое исследование тканеспецифических белков у Drosophila melanogasfer

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Феногенетическое исследование тканеспецифических белков у Drosophila melanogasfer"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

на правах рукописи

КАРАКИН Евгений Иннокентьевич

УДК 575.11.

ФЕНОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ШНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ У ВгояорЫ1а пв1а1^а^ег

Генетика - 03.00.15.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск,1989

£¿¿/-/77 а ^ ^Г^С ^ №

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР,

Институт медицинской генетики АМН СССР, г. Москва

доктор биологических наук, профессор Б.В.Конюхов Институт общей генетики АН СССР, г. Москва

доктор биологических наук, профессор Н.П.Мертвецов Институт биоорганической химии СО АН СССР, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР, г. Москва

Зацкта диссертации состоится "_" _ 1989 г. на

__________ заседании специализированного совета по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте цитологии и генетики Сибирского Отделения АН СССР Д - 002.II.01. в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск - 90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН СССР

Автореферат разослан "_" _ 1989 г.

г.Новосибирск

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АМН СССР, доктор биологических наук, профессор В.И.Иванов

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование проблем генетического контроля индивидуального развития и анализ генных взаимодействий в этом процессе составляют содержание одного из важнейших разделов современной генетики эукариот. При этом выяснение характера, причин и механизмов дифференциальной генной экспрессии в ходе дифференцировки клеток остаются фундаментальными задачами молекулярной генетики развития ( Нейфах, I960; Тимофеев-Ресовский и Иванов, I9G6; Астауров, 1968; Wright, 1970; Конюхов, 1973; 1980; Davidson,Britten, 1973; Корочкин, 1977; Gehring,1989 и др. ). Их решение принципиально важно для выяснения частных вопросов генетического контроля тканевой специализации в развитии, метаболического обеспечения тканеспецифических функций, аномальных аспектов генетического контроля злокачественной трансформации клеток определенного типа и т.д.

Од шал из перспективных подходов к решению указанных проблем является исследование закономерностей экспрессии генов: формирования тканевой специфики белков в ходе дивергентной дифференцировки клеток, модификаций специфики синтеза при изменении физиологических функций ткани, в том числе на начальных этапах злокачественной трансформации клеток, и т.д. Такой подход позволяет выявлять динамику многоступенчатой дифференциальной экспрессии контролирующих генов в тканях, закономерности генетического контроля нормальных тканевых функций и их регуляцию, генетические механизмы злокачественной трансформации клеток посредством детального изучения белков и исследования изменений характера их синтеза в ходе указанных процессов. Этот путь открывает также возможность устанавливать- функциональное значение тканеспецифических белков, что является чрезвычайно важным в рамках проблем частной молекулярной биологии генов у высших животных ( Георгиев, 1987; Баев, 1988 ), в том числе генов хорошо изученных объектов, в частности, дрозофилы.

Характеристики многих тканеспецифических белков животных,

за некоторым исключением ( работы лабораторий Дк.Иберта, Б.В.Конюхова, О.Е.Вязова, Г.И.Абелева, В.Я.Феля, Б.Мура и др. ), оставались до 70^ - 8С£ годов малоисследованными; к началу данной работы тканеспецифические белки дрозофилы совсем не были изучены. Поэтому задача выявления и детального генетико-биохимического исследования тканеспецифических белков у дрозофилы, их возможных функций, изучение модифицирующих генетических факторов, участвующих в регуляции синтеза специфических белков, являлось актуальным, формирующим новое экспериментальное направление - феногенетику тканеспецифических признаков у дрозофилы. Развитие зтого направления важно . для генетики индивидуального развития животных, поскольку позволяет выявить функциональную специфику эволюционно консервативного тканевого метаболизма в ходе дифференцировки клеток разных типов, вскрыть механизмы ее регуляции в норме и при различных генетических и экспериментальных воздействиях.

Цели и задачи исследования. В рамках проблем феногенетики и частной молекулярной биологии генов тканеспецифических функций у дрозофилы, цель работы заключалась в изучении терминальных и близких к ним этапов дифференциации слюнных желез и нервной ткани у дрозофилы: в идентификации и детальном исследовании физико-химических характеристик и динамики тканеспецифических белков в слюнных железах и головном ганглии, в характеристике генов, контролирующих их синтез, а также в исследовании эффектов генов, модифицирующих фенотипическое проявление. Необходимо было выявить тканеспецифические белки и установить характер экспрессии соответствующих им генов тканеспецифических функций в нормальном онтогенезе, установить принципиальные закономерности формирования спектров специфических белков. Кроме того, необходимо было выяснить, что происходит с регуляцией синтеза специфических белков нервной ткани при злокачественной трансформации ^¿-нейробластов зд в11;ц и при их метастазировании под влиянием различных аллелей рецессивного онкогена как модифицируется экспрессия генов нейроспецифических функций у поведенческих -мутантов с известным первичным биохимическим дефектом и в специально селектированных линиях с нарушением интегративних физиологических процессов, каково функциональное значение специфических белков.

Конкретные задачи работы заключались в следующем:

1. исследовать общие характеристики белков дрозофилы, их динамику в онтогенезе, метаболические функции;

2. идентифицировать тканеспецифические белки слюнных желез и нервной ткани, исследовать их субьединичный состав, динамику в онтогенезе, возможное функциональное значение;

3. исследовать вопросы регуляции экспрессии генов тканеспеци-фических функций: модификацию экспрессии такими мутантными генами, эффект которых затрагивал бы синтез тканеспецифичес-ких белков;

4. изучить закономерности характера синтеза общих и специфических белков в нормальном развитии дрозофилы, закономерности участия специфических белков в интегративных генетико-физио-логических процессах;

5. выявить закономерности процесса злокачественной трансформации клеток нервной ткани при блокировании функций антионкогена igl.

Для решения этих задач был разработан ряд оригинальных методов и их шкровариантов, позволяющих эффективно исследовать антигенные свойства белков, их ферментативную активность, значения молекулярных масс индивидуальных полипептидов, их пептидные карты и ряд других характеристик.

Научная новизна результатов. На основании проведенных исследований динамики белков в онтогенезе вскрыты два периода наиболее значительной перестройки характера их синтеза - эмбриогенез и второй личиночный возраст; закономерность выявлена на массиве около 100 белков ( 18 ферментов ). В личиночных сланных железах, в нервной ткани личинок и имаго дрозофилы впервые выявлены и детально изучены тканеспецифические белки, установлена их динамика в онтогенезе. Впервые обнаружены три згс - подобные протеинкиназы и эндогенные субстраты различных протеинкиназ в личиночной и имагинальной нервной ткани дрозофилы в условиях фосфорилирования in vivo и in vitro в норке. Впервые выявлена связь повышенного уровня синтеза нейро-белков 12-20 кДа, а также фосфотирозинсодержащего полипептида 5 кДа со злокачественной трансформацией нервной ткани igi -мутантов ( коллекция М.Д.Голубовского, К.Б.Соколовой ). Показано, что гены нейроспецифических функций, несмотря-на нео- 3 -

плазию нервной ткани мутантов, продолжают координирование эк-спрессироваться в ходе трансформации и на первых стадиях ме-тастазирования; в экспериментальных метастазах впервые выявлено аномальное фосфорилирование ряда нейробелков.

У - мутантов дрозофилы с измененным индексом обучения ( коллекция Е.В.Савватеевой ) на фоне подавляющего сходства характера синтеза нейробелков , впервые обнаружена прямая корреляция высокого уровня цАМФ-зависимого фосформирования ней-робелка р20 с повышенной способностью мутантов ав*8^ к обучению при пермлссивной ( 22° ) температуре. При рестриктквных температурах ( 29° ), когда самцы данных мутантов теряют способность к обучению, уровень фосфорилирования р20 дифференциально резко падает. При исследовании нейрозффектов в высоко-1Шбредных линиях дрозофилы с низкой половой и двигательной активностью ( коллекция Л.З.Кайданоьа ) впервые показано, что прц существенном сходстве наборов нейроспецифических белков, пептидных карт их ограниченного протеолиза, уровня фосфорилирования, низкая активность дифференциально сцеплена с повышенным содержанием группы низкомолекулярных нейробелков пр!гаа - мотосексинов. Получены оригинальные данные о том, что результат отбора в низкоактивной линии в плюс-направлении выра-зается в нормализации уровня синтеза нейробелков этой группы, а также в инициации конститутивной модификации нейрополипеп-тида р87. Впервые показана консервативность этих нейробелков, установлена их важная роль в метаболическом обеспечении двигательной активности. Выявленные нарушения в регуляции уровня синтеза и посттрансляционной модификации нейробелков представляют существенный теоретический интерес в связи с разработкой конкретных механизмов селекционных процессов.

В Приложении I к диссертации приведены разработанные на основе онкомодели дрозофилы данные о том, что на ранних этапах индуцированной М-метил-Н-нитро-Н-нитрозогуанидином злокачественной трансформации клеток слизистой желудка у крыс, а также в спонтанных аденокарциномах желудка у человека характер синтеза большинства полипептидов и их фосфопроизводных форм совпадает с таковым слизистой желудка в нормальном состоянии. Вместе с тем впервые обнаружено, что содержание полипептида р42 в опухолях крыс и р49 в опухолях желудка у человека суще- 4 -

ственно вше, а уровень фосфоршшрования р20 и р50 в опухолях крыс, а также р20, р40, р60 в опухолях желудка у человека существенно ниже, чем в окружающей опухоль нормальной слизистой, что свидетельствует о консервативном характере нарушений специфических функций клеток слизистой в модели и клинике при их трансформации.

Совокупность представленных выше новых результатов, имеющих принципиальное значение не только в феногенетике дрозофилы, позволяет сформулировать представления о следующих закономерностях:

а) периоды наиболее резкой перестройки характера синтеза белков в онтогенезе - эмбриогенез и второй личиночный возраст - являются критическими в развитии дрозофилы, совпадающими с периодами закладки и развития личиночных и имагинальных тканей; выявленная фундаментальная закономерность в развитии дрозофилы характерна, по-видимому, и для ряда других насекомых с полным превращением;

б) на основании I. прямой корреляции уровня фосфорилирова-ния нейробелка р20 со способностью к обучению у -мутантов, указывающей ^а его вовлечение в процесс, 2. выявленной взаимосвязи уровня синтеза и модификации консервативных нейробелков группы пр1дд и р87 в селектированных линиях дрозофил с нарушением и восстановлением половой и двигательной активности, сформулирована следующая частная концепция реализации нейрофункций: мутационный и селекционный процессы могут затрагивать регуляторные системы экспрессии нейрогенов, влияющие на характер синтеза и модификации нейробелков и сдвигающие функциональный гомеостаз нервной ткани в новое устойчивое или псевдоустойчивое состояние;

в) моногенно детерминированная -неоплазия оптических центров мозга у мутантов дрозофилы характеризуется высокой степенью выраженности признаков дифференцированного состояния ювенильной ( личиночной ) нервной ткани; на основании полученных данных предложена следуицая гипотеза: механизм данной злокачественной трансформации, способствующий инициации и фиксации состояния конститутивной пролиферации 3-81- -нейробластов, связан с нехваткой одних нейробелков и с тканеспецифическим нарушением регуляции синтеза и модификации других нейробелков.

Пра фиксации конститутивной пролиферации незрелых нейробластов блокируется их способность к терминальной дафференцировке, обусловленная lgJ-геном.

Пшктическое значение результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы, связанные с обнаружением "биохимических критических периодов" в развитии насекомых, могут использоваться в практике разработки "периодов наибольшей уязвимости" при создании биометодов борьбы с вредителями растений. Данные, полученные в исследованиях характеристик индуцированного и спонтанного гастрокарциногенеза в модели и клинике, народу с микрометодами используются в фундаментальных исследованиях, проводимых НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова МЗ СССР ( Ленинград ), и могут использоваться Институтом проблем •онкологии АН УССР им. Р.Е.Кавецкого ( Киев ), а также ВОНЦ АМН СССР ( Москва ). Результаты исследования моделей интегративных нейропроцессов, связанных с уровнем половой и двигательной активности, а также с модификацией индекса обучения, используются в фундаментальных исследованиях, проводимых в Институте физиологии АН СССР им. И.П.Павлова ( Ленинград ), Биологическом Институте Ленгосуниверситета ( Ленинград ), и могут быть использованы в Институте физиологии им. И.С.Бериташвили АН ГрузССР ( Тбилиси .), Институте психического здоровья АМН СССР ( Москва ). Биохимические характеристики различных ступеней неоплас-тзческой трансформации нервной ткани могут быть использованы в исследованиях по наследственны?.! опухолям нейроэктодермального происхождения, проводимым в Институте медицинской генетики АМН СССР ( Москва ), НИИ глазных болезней и тканевой терапии им. В.П.Филатова ( Одесса ).

Существенная часть теоретических данных, включая результаты исследования экспрессии генов тканеспецифических функций у дрозофилы, обобщения по нейрогенезу, нейроонкогенезу, нейрологиче-скем мутациям, используются в лекционных курсах Новосибирского, Ленинградского университетов. Разработки комплекса микрометодов для исследования белков и их функций, являющиеся важной частью диссертационной работы, используются в лабораториях учреждений Новосибирска, Ташкента, Москвы, Ленинграда.

Апробация работы.Материалы диссертации докладывались на: I, II,III,1У,У координационных,совещаниях по генетике и биологии

дрозофилы ( Ленинград,1973; Канев,1975; Харьков,1979; Минск, 1985; Львов,1987 ), Х1У Международном генетическом конгрессе ( Москва,1978 ), Международной школе ВОЗ по микрометодам ( Новосибирск, 1981 ), Международном симпозиуме "Организация и экспрессия тканеспецифических генов" ( Новосибирск,1982 ), Мезцу-народной конференции ФЕБО-16 ( Москва,1984 ), Всесоюзном симпозиуме "Медиаторы в генетической регуляции поведения" ( Новосибирск, 1986 ), 1У Всесоюзном сьезде онкологов ( Ленинград, 1986 1, УН Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" ( Москва,1987 ), У1 Всесоюзном симпозиуме по нитрозосоедзшениям ( Таллинн,1987 ), X Всесоюзной конференции "Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине" ( Горький,1987 ), Международном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии ( Таллинн,1988 ), Международном симпозиуме "Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы" ( Ялта,1988 ), У1 Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов" ( Петрозаводск,1988 ), Международном совещании "Онтогенетические и генетико-эволюционные аспекты нейроэндокрпн-ной регуляции стресса". ( Новосибирск, 1988 ), У1 Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзшологик ( Вильнюс, 1988 ), III, 1У, У Съездах ВОГиС им. Н.И.Вавилова ( Ленинград,1977; Кишинев, 1982; Москва,1987 ), ряде других конференций, совещаний, симпозиумов. Основные разделы диссертации были представлены на УН ( Оулу, Финляндия, 1981 ), IX ( Сегед, Венгрия,1985 ), X ( Барселона, Испания,1987 ) Европейских конференциях по биологии дрозофилы, на I Интернациональном конгрессе по диптероло-гии ( Будапешт, Венгрия,1986 ), Х1У Международном биохимическом конгрессе ( Прага, Чехословакия,1988 ).

Результаты исследований обсуждались на семинарах учреждений Москвы, Ленинграда, Иркутска, Новосибирска, Гатерслебена ( ГДР ), на тематических заседаниях ряда обществ.

Обьем диссертации. Диссертация состоит из 8 Глав: Введение и задачи исследования, описание собственно результатов ( Главы 2,4,6,8 ) и специализированные обзоры литературы к ним ( Главы 1,3,5,7 ), Заключение, Выводы, список цитированной литературы ( наименование ), Приложения I, II, содержащие результаты изучения гастрокарциногенеза у крыс и у человека, а также не- 7 -

которые разделы материалов и методов. Работа изложена на страницах текста, содержит Табл., рис. По теме диссертации опубликовано 60 работ; кроме того, дополнительные 14 работ содержат материал, выполненный по родственной проблематике на других объектах.

- Все- эксперименты, представленные в диссертации, выполнены самостоятельно при содействии Т.Я.Лернер, Н.В.Прасоловой, Г.В. АраскиноЙ, надежная помощь которых заслуживает глубокой благодарности. Ряд результатов получен к обсувден совместно с С.М. Сгэрадовым, Е.П.Копанцевым, Л.С.Корочккной, В.А.Кокозой, Д.Ю. Цэрбаковым, Л.И.Корочкиным, И.И.Кикнадзе, Л.З.Кайдановым, Е.В. Савватеевой, но в диссертации использован только собственный штериал.5 Искренне признателен И.И.Кикнадзе, поддержавшей развитие направления.

В Гл. I, 3, 5, 7 рассмотрены имеющиеся в литературе данные по шкрометодам анализа белков и их фрагментов; генетико-<5но-ХЕьаческие характеристики белков дрозофилы, контролируемых ал-лельными и неаллельными генами, а также членами мультигенных сзцейств, их динамика в онтогенезе; генетико-биохимические характеристики тканеспецифических белков, некоторые данные моле-кулярно-генетического и молекулярно-биологического анализа се-кейств тканеспецифических белков у дрозофилы; вопросы регуляции экспрессии генов в тканях, генных взаимодействий при формировании тканей, влияние мутаций, фокусы действия мутантных генов и юс эффекты, обоснована ценность моногенных моделей не-оплазии. Сформулированы экспериментальные задачи, решаемые в Гл. 2, 4, 6, 8.

Глава 2. РАЗРАБОТКА И МОДИФИКАЦИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ, ВОСПРОИЗВОДИМЫХ И ВЫСОКОРАЗРЕШАЩИХ ЭЛЕКТРОФО-РЕТИЧЕСКИХ, ИММУНОХИМИЧЕСКИХ, ФЕРМЕНТАТИВНЫХ МИКРОМЕТОДОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ ДРОЗОФИЛЫ Перекрестный иммуноэлектрофорез ( пиэф ), предложенный С.Ла-урелл ( 1965 ), был модифицирован в отношении буферной сис-

2 соавторы экспериментов указаны в сносках по ходу изложения '^эксперименты выполнены совместно с С.М.Свиридовым

теш для его проведения, позволяющей получать высоковоспроиз-водимые результаты в серийных экспериментах. С использованием трис-ЭДТА-боратного буфера рН 8.6 были разработаны воспроизводимые полумикро*- и микроварианты пиэф, позволившие ( за счет использования П-образной пластины для приготовления тонкослойных гелей минимальной площади ) поднять чувствительность анализа почти в 100 раз без уменьшения числа детектируемых пиков преципитации. Без надежного микроварианта пиэф детальное исследование тканевой специфичности синтеза белков и ее регуляции у дрозофилы было бы проблематично. Для успешной реализации возможностей микроварианта пиэф был разработан365 также удобный способ накопления, микрогомогенизации ( в объеме 2-3 мкл ) и центрифугирования образцов без переносов материала; способ реализован в специальной стеклянной микропробирке-гомогенизаторе и позволяет, в совокупности с выполнением ряда условий получения высоковоспроизводимых результатов в пиэф, выявлять в I мкг суммарного белкового экстракта ткани около 40 пиков преципитации.

, Для исследования индивидуальных полипептидов в тканевых экстрактах дрозофилы методами градиентного ДСН ПААГ ЭФ создана специальная конструкция для фракционирования микроколичеств белков, несущая ряд оригинальных элементнв для получения высоковоспроизводимых градиентов пористости гелей, гермеиизации, охлаждения и фиксации блоков и т.д. Разработанный микровариант градиентного ЭФ в ПААГ обеспечивает высокое разрешение 50-60 индивидуальных полипептидов в тканевых экстрактах при использовании также около I мкг суммарного белка. Для оценки степени чистоты изолированных органов дрозофилы предложено использовать иммуногистохимический тест "фермент-отрицательных маркеров", позволяющий по наличию или отсутствию специфических ферментов в выделенных тканях судить о загрязнениях с достаточно высокой достоверностью; двукратной промывки очищенных органов в свежей капле культуральной среды было достаточно для исключения загрязнений со стороны гемолимфы.

£ эксперименты выполнены совместно с Е.П.Копанцевым и Ю.А. Юр-ченко

^эксперименты выполнены совместно с Б.А.Кузиным

Для детекции протеинкиназной активности по фосфорилированию экзогенного, но гомологичного протеинкиназам иммуноглобулина (Со11е-Ы;,Ег1каоп, 1978 ), разработан оригинальный "твердофазный вариант иммунокомплекскиназной реакции" в агарозных гелях с использованием в качестве субстрата нормальных антипротеин-киназных иммуноглобулинов в составе иммунопреципитатов нормальных тканевых протеинкиназ дрозофилы с нормальными противоткане-

¡анием данного микрометода детекции протеинкиназ вгс-подоб-ного типа в комплексе мозг-вентральный ганглий личинок дрозофилы с использованием - ^ АТФ в качестве донора фосфата обнаружено три различных про-теинкиназы, для одной из которых - доказаны агс-подобные^ свойства: диссоциированный 3^Р-рзциоиммунокомплекс содержал тяжелые цепи .меченые по тирозин/треонину (рис. I ). Наряду с идентификацией более десятка других ферментов в составе иммунопреципитатов у дрозофилы ( Гл. 4 ), предложенный способ детекции протеинкиназ в нервной ткани нормальных личинок будет полезен при анализе экспрессии ряда протоонкогенов в различных тканях и у других животных.

Впервые был предложен также экспресс-метод изоляции белков, гомологичных секреторным белкам слюнных желез личинок дрозофилы, из целых личинок с использованием кислотной экстракции и этанольного осаждения образцов, обогащенных полипептидами р4 и рб секрета. Разработан оригинальный экспресс-вариант массовой изоляции голов имаго дрозофилы в атмосфере жидкого азота и их исследования в условиях ингибированного автопротеолиза, и ряд других необходимых методов. Разработанные оригинальные методы и их варианты позволили решить ряд важных экспериментальных вопросов.

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ ДРОЗОФИЛЫ В ЭМБРИОНАЛЬНО-ЛИЧИНОЧНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ При исследовании антигенного состава в суммарных экстрактах

- 10 -

выш антисыворотками. С использов

200 К

53 К

___20К

рис Л. Идентификация _вгс-подоб-ных протеинкиназ в личиночной нервной ткани дрозофилы

из D.neXanogaster 0 - 120 час развития выявлено более 90 индивидуальных антигенных фракций, 18 антигенов данного спектра функционально идентифицированы с помощью иммуногистохимичес-ких реакций как известные ферментыг( рис. 2 ). При этом обнаружено соответствие количества пиков преципитации, обладающих специфичной ферментативной активностью, числу известных неаллельннх локусов генома Р.oelanogaetar . контролирующих синтез соответствующих ферментов. Эти данные- основа для исследования функциональной динамики становления белков в ходе нормального развития дрозофилы.

Анализ .динамики антигенного состава эмбрионально-личиночных бал-

рис.2. Антигены-ферменты в Фатсиррвзнние периодн онто-

дрозофилы генеза на синхронизированном мате-

риале, их появления и исчезновения в целом организме показал ( рис. 3 ), что существуют два периода в эмбрионально-личиночном онтогенезе, наиболее активные в отношении существенной перестройки характера синтеза белков - эмбриогенез и период второго личиночного возраста.

Три их класса различаются по свойствам в различные периоды развития: I. белки, обнаруживающиеся на всех стадиях, в том

*часть экспериментов выполнена совместно с Л.И.Корочкиным

- II -

число появившихся антигенов

48

Ж

Время

120 часы

разлитая

число исчезнувших антигенов

рис.3. Динамика появления и исчезновения белков в ходе развития дрозофилы

числе с вариацией относительных концентраций; 2. белки, появляющиеся на определенных стадиях и обнаруживающиеся на последующих; 3. белки, обнаруживаемые только на определенных стадиях развития. Белки этих классов по свойствам хорошо согласуются с характеристиками основных групп белков, выявленных в развивающихся тканях позвоночных ( Конюхов, 1958; Вязов, 1962 ). Соотношение наборов и относительных концентраций обнаруженных белков на различных стадиях развития фиксированы и являются устойчивыми признаками нормально развивающихся особей. Следует отметить, что действие многих изученных летальных генов дрозофилы ( см. обзор Ховановой, 1978 ) характерно также для эмбриогенеза и второго личиночного возраста, где нами обнаружены резкие изменения характера синтеза белков: в эти же периоды происходит становление и развитие личиночных и имагинальных органов у дрозофилы ( iouison, 1938 ).

Среди множества мутантных генов с эффективной летальной фазой в эмбриогенезе и втором-третьем личиночном возрасте, исследование эффектов которых представляло существенный интерес в связи с обнаружением выраженной бифазности перестройки характера синтеза белков в нормальном онтогенезе, изучены эффекты гена l(2)gl (Golubovsky.Sokolova, 1973 ), представленного серией аллелей, различающихся по времени гибели гомозигот ( Соколова, 1980 ). Большинство аллелей коногенно детерминирует злокачественную трансформацию оптических центров имаго в личиночном комплексе мозг-вентральный ганглий у гомозигот ( Gateff & Schneideroan, 1974 ). Аллели являются в основном делециями протяженностью ДО 40 т.п.н. (Mechler е.а.,1985 ). lgl* -гены кодируют в норме белки р78 и pI27 (Jacob е.а., 1987 ).

Сравнительный анализ общих спектров личиночных белков у гомозигот по i(2)gl4 и Df(2L) lgi net аллелям показал выраженный плейотропный эффект, выявленный в суммарных белках: 39 антигенных фракций обнаружено у гомо- и 46 - у гетерозигот*; среди них выявлено 2 гомо- и 9 гетерозигот-слецифичных фракций; у II из 14 идентифицированных антигенов-ферментов не обнаружено нарушений в отношении уровня их активности. Вместе с тем, у

1 материал выделен совместно с Л.С.Корочкиной

- 12 -

гомозигот по гену 1(2)§14 обнаружена высокоактивная форма кислой фосфатазы, и напротив, уровень активности и относительное содержание щелочной фосфатазы значительно ниже, чем у гетеро-зигот. Функции других различающихся антигенов неизвестны. Нормальное соотношение белков ( ферментов ), характерное для жизнеспособных гетерозигот ( личинок дикого типа ), специфическим образом нарушено у данных мутантов, и является четкой характеристикой гомозигот по различным аллелям д^ц - гена.

При исследовании различий в характере синтеза белков у нормальных самцов и самок имаго было обнаружено два специфических антигена у самок и один - у самцов, отражающие результат половой дифференциации у дрозофилы; по-видимому, отсутствие селекции по полу особей в изученном эмбрионально-личиночном периоде развития не является критическим при обсуждении динамики состава белков в онтогенезе.

Представленные выше новые результаты являются важным "инвентаризационным актом" исследования белков дрозофилы с использованием их антигенных свойств, электрофоретических и ферментативных характеристик в условиях ингибированного протеолиза. Возможность строгой синхронизации исследуемого материала в отношении стадий развития позволяет и более детальное исследование онтогенеза, хотя уже полученные результаты бифазности резких изменений характера синтеза белков представляют самостоятельный интерес и в рамках концепции критических периодов развития ( Медведев, 1939; Нейфах, 1960; Светлов, 1961 ), и в рамках частной генетики индивидуального развития не только дрозофилы, но насекомых с полным превращением, обогащая ее важным конкретным материалом. Явно выраженный "фосфатазный" эффект - аллелей у гомозигот, с альтернативным характером проявления активности ферментов кислой и щелочной фосфатаз, представляет также .существенный интерес при детальном изучении плейотропных эффектов 3-е! -гена. Полученные данные послужили основой для исследования вопросов тканевой специализации синтеза белков у дрозофилы и ее регуляции.

Глава 6. ФЕНОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОЩИХ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ В НОРМАЛЬНЫХ ТКАНЯХ ДРОЗОФИЛЫ

Результаты сравнительного исследования общего состава белков в различных органах Р.ие1апсдоз1;ег , извлеченных из синхронизи-

рованных личинок 118-119 час развития1, показали существенные различия в составе белков слюнных желез, жировых тел, гемолимфы, личиночного комплекса мозг-вентральный ганглий ( рис. 4 ), чистота изоляции которых была доказана с помощью теста "фермент-отрицат ельных" маркеров. Сравнение эле-ктрофоретической подвижности позволило обнаружить белки, выявляемые в одном и отсутствующие в остальных изученных органах ( рис. 4, стрелки ). Наибольший интерес представляло детальное исследование белков слюнных желез и нервной ткани дрозофилы.

С использованием микроварианта пиэф исследование динамики стадийспецифических характеристик общего состава белков в слюнных железах и в комплексе мозг-вентральный ганглий в период 72120 час развития показало высокую степень стабильности профиля белков в личиночной нервной ткани и выраженную динамику в слюнных железах, выявив различающиеся периоды становления дефинитивного паттерна белков в обеих тканях. Сравнение спектров белков личиночного мозга с таковым головы имаго показало не только их сходство, но существенные различия, отражающие терминальные этапы дифференциации имагинальной нервной ткани дрозофилы ( рис. 6, 8 ). Эти данные послужили основой для выявления тканеспецифичес-ких белков адекватными иммунохимическими микрометодами.

Для идентификации специфических белков в слюнных железах1, имагинальной нервной ткани36*, а также комплексе мозг-вентральный ганглий личинок использовали сочетание антисывороток к очищенным слюнным железам, очищенным секрету слюнных желез, нервной ткани личинок и имаго, а также универсальных антисывороток к

1 эксперименты выполнены совместно с Т.ЯЛернер н эксперименты выполнены совместно с Н.В.Прасоловой

г \ ол.щел. гем.

мир. т. Мальп сосуды -

мозг

т/с 1ч сл. шел. .. г

рис.4. Антигены личиночных тканей дрозофилы

к целому организму дрозофилы, с одной стороны, с ангисыворотками к личинкам, лишенным слюнных желез, и к личинкам, лишенным нервной ткани - с другой. Для детекции специфических белков использовали пиэф с промежуточным гелем, содержащим антитела к ге-терологичным тканям, а также стандартный пиэф с абсорбированными их же экстрактами антисыворотками.

В результате использования различных методов и антител обнаружено, что в составе белков слюнных желез выявляется не менее пяти антигенных фракций секреторных белков, две из которых удовлетворяют высокоспецифичному иммунохимическому критерию тканевой специфичности и синтезируются, по-видимому, только в слюнных железах ( рис. 5 ). При исследовании значений мол. масс секреторных белков слюнных желез обнаружено 8-9 индивидуальных полипептидов, имеющих эквиваленты в экстрактах из слюнных желез перед окукливанием личинок( рис. 5 ). Антитела к образцам очищенного секрета оказались способны преципитировать все тканеспецифические фракции слюнных желез, все гомологичные секреторные белки, а также две -три фракции в экстрактах из жировых тел и две фракции белков в экстрактах из комплекса мозг-вентральный ганглий ("кислые" фракции, рис. 5 ). Таким образом, в составе секреторных белков слюнных желез выявляются две фракции абсолютной специфичности, и другие - ограниченной специфичности. Нельзя исключить, что последние транспортируются в выявленные ткани-мишени; возможно также, что эти белки независимо синтезирзтотся в данных тканях и являются типичными антигенными фракциями узкой тканевой специфичности ( Михайлов, Барабанов, 1975 ).

В комплексе мозг-вентральный ганглий личинок дрозофилы аналогичными методами обнаружено не менее 5 антигенных фракций, специфичных для личиночной нервной ткани, 8 фракций специфичны для головы имаго ( рис. в ). При сравнении полипептидов мозга личинок, головы имаго с экстрактами гетерологичных тканей ( ор-

/V

рис.5. Специфические белки секрета личиночных слюнных желез

секрет-'

слюнные_ железы

3=2

ганизм без мозга ) обнаружено, что полипептвд с мол. массой 13.5 кДа дифференциально характеризует нервную ткань ( рис. 6, в ). Моноспецифические антитела к нему оказались способны

осаждать йодированные ^^г гомологичные полипептиды

антигены

личиночного

мозга

полипептиды экстрактов головы имаго

личиночного мозга, мозга имаго, а также более высокомолекулярный полипептвд головы имаго р13.8, составившие группу структурно сходных нейрополипептидов

Ьар-1

125:

рис.6. Специфические белки личиночной ( а ) и имагинальной (б) нервной ткани дрозофилы

полипептцды этой группы не реагируют с антителами к личинкам с удаленным комплексом мозг-вентральный ганглий, их ограниченный протеолиз в геле с помощью химотрипсина, папаша, протеазыУ8 стафиллококка показал выраженное структурное сходство пептидов. В пи-эф-тесте с использованием анти-р13.5 в экстрактах личиночного мозга обнаружено три электрофоретически различающиеся антигенные фракции. Анализ полиморфизма по значению мол. масс фракции р13.5 в экстрактах головы имаго не выявил генетически контролируемых "вариантов данного нейрополипептида ни в одной из изученных 50 ) природных популяций и лабораторных линий дрозофилы, свидетельствуя о "запрете" на модификацию его структуры.

Установлен также полипептидный состав нейроспецифического белка головы имаго ь»а-1 путем диссоциации специфического имму-нопреципитата йодированного белка ( рис. 6, б ) и его фракционирования в ДСН ПААГ ЭФ. Кроме главной полосы с значением мол. массы около 23 кДа, в гелях выявляется более легкая минорная фракция, возможно, являющаяся продуктом частичной деградации главной субьединицы 23 кДа нейроспецифического имагинального белка Ьвь-1. Специальные исследования позволят решить этот вопрос, а также вопрос о субьединичном составе других нейроспеци-фических белков у дрозофилы.

При анализе динамики тканеспегшфических белков слюнных желез и нервной ткани получены данные о ранней детектируемой микрометодами экспрессии генов нейроспецифических функций, начиная с 4-6 час постэмбрионального развития ( более ранний материал не исследовался ), и в слюнных железах - с третьего личиночного возраста. Полный спектр нейроспецифических белков, характеризующий терминальные этапы дифференциации нервной ткани дрозофилы, формируется на стадии зрелой мушки; вместе с тем, претерминальная дифференцировка нервной системы на личиночной стадии развития характеризуется становлением синтеза большей части нейроспецифических белков, начиная с самых ранних стадий постэмбрионального развития.

Представленные результаты позволили на базе исследования тканевых белков впервые адекватно идентифицировать специфические белки слюнных желез и нервной ткани, изучить ряд физико-химических характеристик некоторых индивидуальных белков, оценить закономерности динамики общих и специфических белков в нормальном онтогенезе дрозофилы. Показано, что обе ткани детерминированы к тканеспецифическому синтезу в различные периоды развития организма, характеризуя функциональную асинхронность в становлении их дефинитивного паттерна. В специальных исследованиях, выполненных в нашей группе В.А.Кокозой1 и Д.Ю.Щербаковым®, установлена генетическая локализация трех структурных генов, контролирующих некоторые секреторные белки слюнных желез, детализирован "эпитопный портрет" белков секрета, выявлен характер их структурного сходства и посттрансляционной модификации, в частности, гликозилирование и впервые установленное фосфорилирование секреторных белков у дрозофилы.

Наиболее важным развитием проблемы является изучение конкретных метаболических функций белков слюнных желез а нервной ткани, а также вопросы регуляции экспрессии контролирующих ге-

* Кокоза В.А. Генетико-биохишческий анализ белков секрета слюнных желез личинок РгояорЬИа пв1апобаа1;сг . канд.д. ,Н. ,1983. ** Щербаков Д.Ю. Исследование структуры и посттрансляционной модификации тканеспецифических белков слюнных желез в норме и у мутантов РгоаорНИа E^elшlogaзtgr . канд.д. ,Н. ,1988.

нов. Изучение функций нейробелков может "обогащаться" выявлением их участия в поведенческих реакциях, что существенно отличает исследование нейробелков от таковых других тканей и использовано в представленных ниже экспериментах.

Глава 8. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ4ТКАНЕВЫХ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФУНКЦИИ У МУТАНТОВ ДРОЗОФИЛЫ При анализе степени выраженности плейотропных эффектов изученных аллелей 1в1 -локуса ( Глава 4 ) в личиночных тканях обнаружено, что гомозиготы имеют дополнительные фракции белков в спектре жировых тел и нехватку фракций в спектре гемолимфы по сравнению с тканями гетерозигот и дикого типа. Кроме того, результаты сравнительного анализа экстрактов слюнных желез показали, что полипептвды, близкие по значению мол. масс секреторным белкам нормальных слюнных желез гетерозигот и дикого типа, выявляются в спектрах слюнных желез гомозигот ( рис. 5, центральная дорожка ). Пиэф-тест экстрактов слюнных желез гомозигот по обоим исследованным аллелям 1е1 -локуса, а также по гену йог с эедизон-недостаточным эффектом ( с использованием антител к белкам нормального, секрета ) подтвердил это наблюдение: антитела оказались способны осаждать белки, гомологичные нормальным секреторным белкам, однако их относительное содержание редко превышало в среднем 10$ от такового в железах гетерозигот и дикого типа ( рис. 7 ). Таким образом, прямыми экспериментами впервые показано, что экди-зоновая недостаточность у изученных мутантов не блокирует цитоплазматический синтез секреторных белков у гомозигот, хотя уровень их содержания существенно снижен. Это свидетельствует о возможности экспрессии генов специфических функций слюнных желез, в частности, об их координированной "недоэкспрессии", у мутантов экдизон-недостаточного ряда.

Исследование эффектов мутантного гена З-е1 на характер синтеза белков в комплексе мозг-вентральный ганглий, где, по-видимому ( Gateff,197^ ), локализован первичный эффект 1е1 -гена, по- 18 -

ч \ )

. V , и

рис.7. Секреторные белки эвди-зон-недостаточных мутантов 3^1 (аллельрг , а ), аог(б)

казало, что общие спектры нейробелков незначительно модифицируются мутантными аллелями и тканеспецифические белки нормального личиночного мозга синтезируются у мутантов в полном наборе ( рис. 8 ). Спектры белков мозга гетерозигот оказались практически идентичны таковым мо-

А-.

• л

\

ТРаиспл.

еде

-

== ей Sd —

g(|f 1 Ш

зга личинок дикого типа. Вместе с тем, у гомо- и гетерозигот в антигенных спектрах экстрактов мозга выявляется дополнительная, специфическая для нервной ткани фракция 6, не выявляемая в спектре мозга нормальных личинок конца третьего возраста ( рис. 8, 6 ).

Сходный по характеру эффект обнаружен при сравнении полипептидов мозга у личинок дикого типа, гетеро-, гомозигот по исследуемым J-gl—аллелям и у трансплантатов мозга гомозигот в брюшко самок имаго, эффективно моделирующих экспериментальные метастазы ( рис. 8 ). Нарастание содержания группы нейробелков с мол. массами 1220 кДа в спектре гомозигот специфически характеризует эту

первичную неоплазму, возникающую под влиянием lgl-аллелей; тканеспецифические же белки продолжают синтезироваться и в экспериментальных метастазах ( рис. 8 ). Такой "обратный" эффект, когда нехватка двух белков, кодируемых 1е1+-локусом ( Jacob е. а. ,1987 ), приводит к "перепроизводству" группы других нейробелков в мозге мутантов на стадии первичной неоплазмы, свидетельствует о нарушении нормальной регуляции их синтеза при блокировании активности lgl+- аллелей. В специальных экспериментах нами было показано, что синтез тканеспецифических белков личиночного мозга не нарушается ( отсутствует фракция 6 ) у эвдизон-недостаточных мутантов серии dor .

рис. 8. Специфические белки нервной ткани и трансплантатов мозга гомозигот по различным 1&1-аллелям

Нейроспецифические антигенные фракции обнаружены также в

трансплантатах второго пассажа ln vivo . что свидетельствует об отсутствии заметной метаплазии в трансформированных нервных клетках Igl-мутантов. О "выраженной нормальности" lgl-ней-робластов свидетельствует также вполне адекватная их реакция на температурный шок, идентичная таковой гетерозигот и мозга личинок дикого типа: ткани дифференциально в отношении белков, но однотипно реагируют на шок усилением синтеза ^-ыетионин-содержащих стандартных белков теплового шока. С использованием теста на выявление вгс-подобных протеинкиназ ( см. Гл.2 ) в сравнительных экспериментах было обнаружено, что содержание протеинкиназы tp^lb -3 существенно возрастает только на стадии экспериментальных метастазов. В специальных исследованиях с антителами к синтезированному 12-членному пептиду - С-концевому фрагменту с-вгс р62 протеинкиназы дрозофилы ( Самуков и соавт., 1986 ) было также показано, что р62 не является протеинкиназой tpkib -3. хотя последняя, по-видимому, принадлежит к зге-семейству: она способна фосфорилировать тирозин тяжелых цепей igG, автофосфорилироваться также по тирозину, фосфосодержащие tp^ih -3 и ее субстрат устойчивы к процедуре деградации фосфо-серина в горячей I М щелочи ( Hunter and Sefton, 1980 ).

Ущрансм. ро

\згр

Туг

22р

»об

'Р5 •

е/е сд/е

рис.9. Сравнение lgl-фосфонейробелков

Сравнение in vitro фосформирования нейробелков в экстрактах мозга личинок Canton s . гетеро-, гомозигот по мутан-тным igl-аллелям, а также в экстрактах трансплантатов показало, что характер фосфорилирования нескольких из более чем 20 фосфонейробелков резко изменяется лишь на стадии экспериментальных метастазов ( рис. 9 ): неоплазма характеризуется усилением синт-еза фосфотирозин-содержащего полипептвда р5. Наличие "излома" на стадии метастазов может характеризовать опухолевую прогрессию, изучение которой является важной самостоятельной задачей. Представленные факты обнаружены на основе использования микрометодов.

Сравнение профилей нейробелков у нейрологических ;ts-мутантов с измененным индексом обучения , в связи с генотипической вариацией содержания цАМФ, показало, что общие спектры нейропо-липептидов, полученных при анализе экстрактов головы 7-9-дневных самцов, гемизиготных по известным генам agta . pd« и др. ( Sawataeva е.а., 1985), существенно сходны. Исследовали также характер цАМФ-зависимого фосфорилирования _ ts3 „ . <,

ОвЛь • и

нейробелков в условиях in vitro и показали, -

что среди 60 выявленных в градиентном ДСН ПААГ ЭФ нейробелков не менее 15 мембран-свя-занных и двух цитозольных белков способны акцептировать фосфат от [¡$-^2р] АТФ донора в присутствии мМ концентраций "холодной" АТФ ( рис. 10 ). Три из них содержат ^Р-фосфат и после инкубации в I М горячей щелочи. Среди остальных фосфобелков лишь 4 - р20, р32, р40, р50 - специфично фосфорилируются цАМФ-зависимо в условиях in vitro в присутствии мкМ экзогенного цАМФ. При сравнительном in vitro фосфорилировании нейробелков, проведенном через 40 мин после содержания самцов исследуемых линий при 29°, обнаружено некоторое повышение уровня фосфорилирования р20

tSD

у мутантов -и падение уровня фосфори- рисЛ0. фоСфобелки

лирования у мутантов ад_ в присутствии нервной ткани ta-

10 мкМ экзогенного цАЫФ; при 22° уровень мутантов дрозоЩлы фосфорилированил р20 у мутантов agta3 существенно выше, чем в контроле. Это прямо коррелирует со способностью самцов-носителей к обучению избегать запах, связанный с электрошоком ( Савватее-ва и соавт., 1978 ). Другие нейросубстраты протеинкиназы А в данных условиях цАМФ-зависимого фосфорилирования при обеих температурах модифицируются практически идентично, в том числе у самцов других линий данной коллекции. Показано также, что набор полииептидов, а также характер их фосфорилирования у дрозофилы существенно сходен с таковыми мозга взрослых мышей и крыс, что указывает на их структурно-функциональную консервативность.

Изучение эффектов селекции среди самцов дрозофилы, отобранных на различия в уровне половой и двигательной активности ( Кай- 21 -

29' 22'29°22'

данов, 1979 ), проводили на нейробелках экстрактов головы. В линиях НА с низкой адаптивной ценностью характер синтеза нейробелков у взрослых самцов оказался существенно сходен с таковым других линий, имеющих устойчивые различия по данным признакам ( ВА, ВА~, НА" ), в том числе у самцов линий НА+, возвратно селектированных на повышение приспособленности из линий НА, с нормализацией двигательной активности ( Кайда-нов, 1979 ). Анализ содержания 8 тканеспецифических нейро-

белков головы имаго у самцов данных линий, общих антигенных спектров, уровня in. vivo и in vitro фосфорилирования не выявил качественных различий. Субьединичный состав и пептидные кар' ты ограниченного протеолиза специфического ней-робелка Ьаа-1 в НА, где обнаружено его пониженное относительное содержание, оказались сходными с таковыми линий ВА и Canton s . Вместе с тем, в линиях НА и НА+ выявились четкие различия в концентрации и модификации других нейробелков: в НА ' оказалось повышено содержание группы низкомолекулярных нейробелков npliaia - мотосексинов, в то время как в линиях НА+ конститутивно модифицирован нейрополипептвд р87 ( рис. IIх); у других линий эта модификация исчезает к 5 сут имагинально-го онтогенеза. Уровень же содержания р87 в линиях, в том числе в НА+, измеренный с помощью моноспецифических поликлональных антител к р87, ока-рис.П. Има- зался идентичным. Эти нейральные признаки, несом-гинальные ненно, связаны с регуляцией уровня половой и дви-селектиро- гательной активности; кроме того, они являются кон-ванных ли- сервативными, поскольку при иммунизации кроликов очищенными нейрополипептидами группы nplmn и р87 обнаружено предшествующее гибели животных нарушение координации движений у иммунизированных самцов, в особенности выраженное при введении белков группы nplma

Суммируя представленные результаты, можно утверждать, что

глубоко благодарен В.А.Прасолову за высокопрофессиональную помощь в подготовке фотодокументов в процессе выполнения работы

\

модификация экспрессии генов тканеспецифических функций слюнных желез эвдизоновой недостаточностью igl- и dor - мутациями ясно показала автономность индукции синтеза секреторных белков, а также координирующую роль экдизон-зависимых событий в процессе секретообразования на терминальных его этапах; это согласуется с совокупностью известных экспериментальных данных. Разработанная нами пиэф-тест-система позволяет измерять содержание секреторных фракций слюнных желез у любых мутантов, исследование которых представляет интерес с точки зрения анализа процесса секретообразования. Изучение же функционального значения отдельных белков секрета требует проведения специальных исследований.

Полученные на различных нейрологических мутантах и самцах селектированных линий результаты позволили не только фенотипи-чески маркировать на уровне белков такие процессы, как моноген-но контролируемая злокачественная трансформация нервных клеток, обучение, двигательная активность, но также четко обозначить подход к выявлению функционального значения ряда нейробелков: диагностическому значению фосфонейробелка р5, связанного с не-оплазией нервной ткани lgl -мутантов; протеинкиназы arc -подобного типа -tpicih -3, диагностически связанной с метастазами lgl -нейробластов; участию фосфо- и дефосфоформ нейробелка р20 - субстрата цАИФ-зависимого фосфорилирования - в эффективном и неэффективном обучении ta -мутантов; участию нейробелков группы npinn и р87 в нейральном обеспечении, по крайней мере, двигательной активности. Полученные данные о консервативном характере белков делают эти факты более значимыми, в особенности с точки зрения исследования механизмов регуляции экспрессии генов, определяющих тканеспецифические признаки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблемы регуляции экспрессии генов, в том число генов тканеспецифических функций, являются центральными в современной генетике. На них замыкаются актуальные вопросы генетического контроля индивидуального развития, злокачественной трансформации клеток, метаболического обеспечения нейральных и других тканеспецифических функций и т.д. Их решение создает более глубокую основу для понимания механизмов взаимодействия генов. В связи с этим выявление регуляторных эффектов модифицирующих генов, регуляторных воздействий внутренней среды организма,

выявление взаимозависимости и автономности в экспрессии генов составляют достойные задачи экспериментальной генетики ( Аста-уров, 1929; Тимофеев-Ресовский, 1934; Нейфах, I960; Нонюхов, 1980; Иванов, 1987 и др. ).

Поскольку физиологические функции генов реализуются в основном посредством белков,то важнейшими их характеристиками становятся особенности специфики транзиторного и дефинитивного их паттерна в тканях. Выявление закономерностей формирования спектров белков, их модификаций мутантными генами с тканеспецифи-ческим эффектом в таких важных генетических процессах как дифференциация тканей, становление специфики их характеристик, реализация тканевых функций в процессах секреции, интегративных нейропроцессах, злокачественной трансформации клеток составили новый подход к исследованию вопросов экспрессии генов у дрозофилы. Созданное в связи с этим новое направление - феногенетика тканеспецифических признаков у дрозофилы - является перспективным, и мн°гие результаты, изложенные выше, содержат эффективные "точки роста" и дальнейшего развития.

При исследовании динамики изменений в уровне синтеза существенного массива - около сотни белков, идентифицированных по антигенным характеристикам, ферментативной активности, значениям мол. масс, характеру посттрансляционной модификации - обнаружены два периода выраженной перестройки характера синтеза белков - эмбриональный и период второго личиночного возраста. Первый совпадает с дифференциацией личиночных тканей, второй - с активацией развития имагинальных зачатков. Оба критических периода согласуются с фазами действия многих изученных летальных генов у дрозофилы (Ha.dorn.1965; Хованова, 1978 ), с результатами изменений характера включения метки в белки развивающегося организма дрозофилы ( Church, Robertson,1966 ), с периодами выявления наиболее гетерогенных классов поли А+ - РНК (Levy, McCarthy, 1976 ). Экспериментально обнаруженный нами относительно монотонный характер синтеза белков в I и III личиночных возрастах является надежным "внутренним" контролем к выявленной динамике. Оснований для выявления перестройки синтеза -числа замен белков в онтогенезе, закономерностей качественных изменений спектров - по-видимому, вполне достаточно для формулирования заключения о критических периодах в эмбриогенезе и

втором личиночном возрасте дрозофилы. По сравнению с плацентарными ( Светлов, 1956; 1961 ), у дрозофилы как представителя насекомых с полным превращением, имеющих куколочный период в развитии, может существовать дополнительный критический период, связанный с гистогенезом и началом дифференциации имагинальных структур.

Выявленные специфические различия, а также сходство в характере синтеза белков в различных тканях, конкретно характеризуют их специализацию на претерминальных и терминальных этапах дифференциации, а также отратсают степень "перекрываемости" генных комплексов, активных в разных тканях: специфическая компонента не превышает 20%. Сравнительное исследование специфики синтеза тканеспецифических белков слюнных желез и нервной ткани дрозофилы показало асинхронный'характер функциональных преобразований спектров: эмбриональный период важен для становления личиночных нейроспецифических белков, третий личиночный возраст -для секреторных белков личиночных слюнных желез.

Каковы закономерности закрепленных мутационными эффектами модификаций нормальных тканеспецифических характеристик синтеза белков, важные для реализации тканевых процессов?.

Полный ответ на этот вопрос вряд ли возможен. Согласно классическим феногенетическим концепциям ( Наесквг,1918; Найот, 1965 ), модифицировать тканевые процессы надежнее начать с дефинитивных стадий. В слюнных железах - это процесс экструзии секреторного материала в люмен желез перед окукливанием личинок, а также терминальные этапы дифференциации слюнных желез, характеризующиеся синтезом больших'количеств секреторных белков. В Гл. 8 впервые показано, что в слюнных железах ряда эвдизон-не-достаточных мутантов координирование недоэкспрессируется комплекс генов мультигенного секреторного семейства, а эвдизоновая недостаточность, по-видимому, является внутриорганизменным фактором регуляции специфических функций слюнных желез в отношении секрета. Для исследования же детерминант индукции синтеза секреторных белков, не затрагиваемых эвдизоновой недостаточностью, необходим анализ других мутантов, блокирующих более ранние этапы дифференциации слюнных желез.

Регуляция нейрофункций, очевидно, имеет более широкий диапазон генетических факторов, влияющих на реализацию признаков дефинитивной нервной ткани. Специальными мутациями можно узко мо- 25 -

дулировать такие элементы поведения как обучение, двигательная активность; известны также мутации, сфокусированные на терминальных и претерминальных этапах дифференциации нервной ткани ( формирование отделов вентрального ганглия, имагинальных зрительных центров и т.д. ). В частности, на линиях уникальной коллекции ^-мутантов с измененным индексом обучения ( Саввате-ева и соавт., 1978; 1985 ) оказалось возможным не только выявить "цАМФ-зависимого участника процесса обучения" - нейробелок р20 - но также маркировать конкретной физиологической функцией собственно белок ( Гл. 8 ). В присутствии экзогенного цАМФ в условиях мечения 1п уИ-го уровень специфичного включения ^Р в нейробелок р20 - субстрат цАМФ-зависимого фосфорилирования -у мутантов гена с^ прямо коррелировал с зависимой от температуры способностью самцов-носителей к обучению. Эти данные являются веским доказательством в пользу участия протеинкиназы А в реализации интегративных функций мозга.

Другим модифицируемым специфическим признаком, выявленным в связи с исследованием дефинитивного паттерна нейробелков в линиях с пониженным уровнем половой и двигательной активности ( линии НА, Кайданов, 1979 ), оказался координирование повышенный уровень группы низкомолекулярных нейропептидов - мотосексинов. Важно, что в линиях НА+, возвратно селектированных из НА в плюс-направлении, содержание мотосексинов нормализовалось, но обнаружилась конститутивная модификация нейрополипептида р87. Полученные данные об их консервативности позволяют предполагать их участие в метаболическом обеспечении двигательной активности не только у дрозофилы.

На основании выявленных фундаментальных закономерностей характера синтеза и модификации изученных нейробелков можно сформулировать частную регуляторную концепцию реализации нейро-функций: мутационный и селекционный процессы могут затрагивать регуляторнье системы экспрессии нейрогенов, влияющие на характер синтеза и посттрансляционной модификации белков и сдвигающие функциональный гомеостаз нервной ткани в новое устойчивое или псевдоустойчивое состояние.

Исследование эффектов мутаций в рецессивном^! -онкогене, прерывающем нормальную дифференциацию нейробластов оптических центров в мозге имаго ( Gateff,1969 ), показало, что "ювениль-

ный" набор нормальных нейроспецифических белков обнаруживается не только в первичных неоплазмах, но и в метастазах первых пассажей при культивировании in viva ( Гл. 8 ). Мозг гомозигот адекватно реагирует также на температурный шок. Дифференциальное усиление уровня синтеза группы нейробелков 12-20 кДа, фосфоти-розин-содержащего нейропептида 5 кДа, усиление уровня синтеза ягс-подобной открытой нами протеинкиназы tpicib -3 и аномальное фосфорилирование ряда нейробелков на стадии экспериментальных метастазов являются первыми идентифицированными эффектами блокирования функций 1£1+-антионкогена в трансформированной нервной ткани. Это стало возможным только на основе созданных ранее надежных микрометодов изучения белков дрозофилы, разработки условий детекции протеинкиназ и их субстратов. Можно полагать, что' lgl-нейробластома, имеющая полную гомологию с ретиноблас-ТОМОЙ человека (Robertson,1984; Weinberg,1988 ), возникает только по причине инактивации igi+-reHa, выполняющего, по-ввдн-мому, функцию ингибитора пролиферации претерминально дифференцированных нейробластов оптических центров, поскольку lgl-ней-робласты неспособны к автономному торможению пролиферации.

Представленные здесь уникальные экспериментальные результаты существенно дополняют полученные данные по молекулярному клонированию г&1+-аллелей и их экспрессии в белки р78 и р127 ( Jacob o.a., 87), весьма важны для изучения роли антионкогенов в онкопроцессах. Следует также отметить,- что исследование генетически контролируемых неоплазм позволило получить высоковос-лроизводимые результаты; это весьма выгодно отличает генетические онкомодели от спонтанных неоплазий. На основании полученных данных предложена гипотеза о том, что механизм lgl-тран-сформации, способствующий инициации и фиксации состояния конститутивной пролиферации igi-нейробластов, реализуется при наличии генетического дефекта, блокирующего прохождение ими терминальных этапов нормальной дифференцировки.

Представленные в диссертационном исследовании данные позволяют четко очертить характер и круг вопросов, дальнейшее исследование которых, в особенности в отношении взаимодействия генов и регуляции их экспрессии, будет необходимо для понимания сложных механизмов нейральной дифференциации, ее прерывания неопластической трансформацией нейробластов, для выяснения специфики конкретных путей реализации дефинитивных функций нервной ткани.

Экспериментально-теоретические подходы, разработанные при изучении характеристик 1£1-трансформации нервной ткани у мутантов дрозофилы, позволит приступить к исследованию синтеза и модификаций белков в спонтанных опухолях желудка у человека, а также к анализу экспериментальной модели гастрокарциногенеза - индуцированных с помощью МННГ ( Калиновский и соавт., 1981; 1985 ) опухолей пилорических отделов желудка у крыс ( Прилож. I к дисс. ). В обеих типах опухолей обнаружены вполне однотипные, с учетом специфики видов, нарушения регуляции уровня производства и фосфорилирования также немногочисленных из существенного массива идентифицированных белков. Высокий процент носителей трансформированной слизистой желудкаа у человека ставит задачи глубокого исследования физиологического значения обнаруженных эффектов в модели и в клинике. Важнейшей может стать задача выявления фенотипических эффектов отдельных генов, мутации в регуляции экспрессии и/или структуре которых могут приводить к трансформации.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы закономерности динамики и функции общих и специфических белков РгояорЬИе. nelanogast«r с использованием оригинальных вариантов микрометодов. 1.1. В раннем онтогенезе дрозофилы суммарно выявлено окало 100 индивидуальных антигенных фракции; среди них - 21 фермент, включая три впервые обнаруженные цАМФ-независнмые «гс-подобные протеинкиназы. 1.2. Две стадии резкой перестройки характера синтеза белков - эмбриогенез и второй личиночный возраст - являются критическими периодами в развитии дрозофилы, совпадающими с периодами закладки и развития личиночных и имагинальных тканей. Первый из них обнаруживается

у плацентарных; второй, по-видимому, имеет принципиальное значение для насекомых с полным превращением, имеющих выраженную стадию развития имагинальных дисков.

2. Изучены закономерности формирования состава общих и ткане-специфических белков в различных личиночных тканях дрозофилы, их физико-химические характеристики. 2.1. В личиночных слюнных железах высокоспецифичными методами выявлено 5 антигенных секреторных фракций: две из них являются строго тканеспецифическими фракциями слюнных желез. 2.2. В имагинальной нервной ткани выявлено 8 тканеспецифических белков, 5 из них обнаруживаются на личиночных стадиях развития. 2.3. Динамика становления комплекса тканеспецифических белков в слюнных железах и комплексе мозг-вентральный ганглий носит асинхронный характер.

- 28 -

3. Исследованы некоторые закономерности регуляции экспрессии генов тканеспецифлческих функций. 3.1. Эвдизоновая недостаточность у гомозигот по генам lgl., dor не блокирует инициации цн-топлазматического синтеза секреторных белков слюнных лелез, но подавляет наработку их количеств в 10 раз. 3.2. Модификация индекса обучения известными ta -мутациями с модуляцией уровня циклического АМФ не затрагивает тканевой специфики нейробелков, но изменяет уровень посттрансляционной модификации: фосфо/дефосфо-формы цАМФ-зависимо фосфорилируемого нейробелка р20 прямо коррелируют с повышенным/пониженным индексам! обучения у ^-аллелей гена з.З. Модификация уровня половой и двигательной активности специальной селекцией самцов дрозофилы нз затрагдва-ет качественных характеристик тканевой специфики нейробелкоз в линиях НА, НА+, но изменяет уровень их содержания и модификации; нейробелки р87 и группы nplrsn ( ««отссексины ) участвуют в детерминации двигательной активности. Физиологические функции данных яейробелков консервативны. Результаты принципиально гажны для выявления молекулярных коррелятов илтегратпвных функций :ло-зга.

4. Изучен процесс моногенно детерминированной злокачественной трансформации личиночной нервной ткани мутантов дрозофилы с участием рецессивного онкогена lgl -серии. 4.1. Синтез личиночных нейроспецифических и других нейробелков не блокируется ни в первичных неоплазмах, ни в экспериментальных метастазах. Уровень экспрессии членов с-arc -семейства генов в первичных неоплазмах не изменяется по сравнению с нормой; lgl -нейробласты адекватно реагируют на температурный шок. Повышение уровня синтеза нейробелкоз р12-20, фосфотирозинсодержащего нейробелка р5 характеризуют рак мозга lgl -мутантов; повышение уровня синтеза arc -подобной непралъной протеинккназы tpkih-З характеризует экспериментальные метастазы; в последних резко меняется характер фос-форшшрования нейробелков. 4.2. Злокачественная трансформация происходит на стадии претерминальной дифференциации lgl -нейро-бластов; делетирование lgl +- гена позволяет lgl -нейробластам существовать на стадии конститутивной пролиферации, совпадающей с состоянием инициации трансформации. Полученные оригинальные данные позволяют предложить для экспериментальной проверки гипотезу о том, что состояние претерминально дифференцированных

- 29 -

клеток с выраженной ювенильной тканевой спецификой может быть сопряжено с состоянием инициации злокачественного роста, развивающемся в lgl-нейробластах при наличии генетического дефекта, блокирующего прохождение терминальных этапов нормальной дифференцировки клеток.

Изложенные материалы представлены в 60 публикациях, в том числе в следующих основных работах по теме диссертации:

1. Каракин Е.И., Свиридов С.М., Лернер Т.Я. Иммунохимический анализ водорастворимых белков в ходе развития Brosophila meiano-gaster .// В сб.: Итоги научных работ. Новосибирск,-1974,-с.13-14.

2. Aronshtem A. jKaroJcin Е.,Korochkin L. ,Sviridov S. A simple netted of preparation of the antiserum against eaterase-6 of Dro-Bophila malanogagter.// Dr.Inf .Serv. ,- 1974,-v. 51,- p.135.

3. Каракин Е.И;, Свиридов С.М., Корочкин Л.И. Иммунохимический анализ антигенов Drosophila neianogaatcr .// Докл. АН СССР, -1975,- т.222, Jé 4,- с. 960-963.

4. Каракин Е.И., Свиридов С.М. К методике двумерного иммуноэле-ктрофореза.// Лабор. дело,- 1975,- Jê II, -с. 673-676.

5. Каракин Е.И., Лернер Т.Я., Кикнадзе И.И., Корочкин Л.И., Свиридов С.М. Антигены личиночных органов дрозофилы.// Цитология,-1977,- т.19, № I,- с. Ill—119.

6. Каракин Е.И., Лернер Т.Я., Кокоза В.А., Свиридов С.М..Антигены секрета слюнных желез личинок Droeophiia melanogaster .// Докл. АН СССР,- 1977,- т.233, № 4,- с. 698-700.

7. Каракин Е.И., Корочкина Л.С., Свиридов С.М. Иммунохимическое исследование летальной мутации i(2)gi Drosophila melanogaster . // Генетика,- 1977,- т.13, № 12,- с.2165 - 2172.

8. Каракин Е.И., Лернер Т.Н., Кокоза В.А., Кикнадзе И.И., Корочкина Л.С., Корочкин Л.И., Свиридов С.М. Иммунохимическое исследование водорастворимых белков Drasophila melanogaeter в процессе индивидуального развития.// Тезисы докладов III сьезда ВОГиС, Ленинград, т.II (I), 1977,- с. 91-92.

9. Karakln E,I., L.Korochkiiia,S.Sviridov. Ал immunochemical analysis of l(2)gl in D.melanogaeter.// Dr.Inf.Serv.,-1978,-v.53,-p.124-125.

10. Karakin E..V.Kokoza,L.Korochkin and S.Svirldov. A two-dimensional immunoelectrophoretic study of D.melanogaster development.// Dros.Inform.Serv.,- 1978,- v.53,- p.125.

11. Каракин Е.И., Лернер Т.Я., Кокоза В.А. Иммунохимическое ис-

- 30 -

следование водорастворимых белков Droaophila nelanogaater .// Тезисы докладов Х1У Международного генетического конгресса. Москва,1978.- Секц. заседания,ч.1,- с.582.

12. Кокоза В.А., Каракин Е.И., Свиридов С.М. Генетико-биохими-ческий анализ белков секрета слюнных желез личинок Droaophila nelanogaater.// Докл.АН СССР,- 1980,-т.252,№3,- с. 735-738.

13. Каракин Е.И..Свиридов С.М. Феногенетика водорастворимых антигенов дрозофилы.// В кн.: Биохимическая генетика дрозофилы.-1981,- с.126-156., Н.

14. Каракин Е.И., Лернер Т.Я. Антигены личиночных тканей дрозофилы в развитии.// Тезисы докладов У1 Всесоюзного совещания эмбриологов. Москва, 1981,- с.77.

15. Каракин Е.И., Копанцев Е.П., Юрченко Ю.А. Полумикровариант метода перекрестного иммуноэлектрофореза в совмещенном блоке тонкослойного геля.// Онтогенез,- 1981,- т.12,ЖЗ, с. 323-326.

16. Кокоза В.А., Каракин Е.И. Электрофоретический анализ белков секрета слюнных желез некоторых линий, выделенных из природных популяций Droaophila nelanogaater .// Генетика,- 1981,- Т.17,

№ 5,- с. 935-939.

17. Каракин Е.И. Микровариант метода перекрестного иммуноэлектрофореза и его использование для анализа полового диморфизма у взрослых глух Droaophila nelanogaater.// Изв. СО АН СССР,- 1981,-сер. биол. наук, т.З.й 15,- с. I26-I3I.

18. Kokoza V..Kazakova S.,Karakin E,I,. Genetic and biochemical

analyaia of the secretory proteina of Droaophila nalanogaater 4-h

larvae.// Abatr. 7— EDRC. Oulu,- 1981,- p.64. • "

19. Karakin E., lerner T. Immunochemical analyaia of the proteina of larval tiaauea i-i l(2)gl D.nelanogaater mutanta.// Abatr. 7^" EDRC. Oulu,- 1981,- p.61.

20. Каракин Е.И., Лернер Т.Я. Иммунохимический анализ белков личиночных тканей летальных мутантов l(2)gl D.nelanogaater.//Те-зисы докладов 1У съезда ВОГиС. Кишинев,1982,- ч.1,- с. 109.

21. Каракин Е.И., Лернер Т.Я., Копанцев Е.П., Кокоза В.А. Органные и органоспецифические белки личиночных слюнных желез и комплекса мозг-вентральный ганглий Droaophila nelanogaater: их синтез в ходе развития и модификации паттернов в летальных мутантах l(2)gl4j)f (2Ь) lgi net,dor.// Тезисы докладов Международного симп. "Организация и экспрессия генов тканеспецифических функций". Новосибирск, 1982,- с. 27.

22. Karakin E,I..Kopantsev E.P.,Кокова V.A.,Xerner T.Ya. A mic-rcraethod of crossed iEaunoGloctropheresis in a thin-layer sandwich-block of agarose gel.// Ins Application of Biochemocal Ui-crcmathodB for tha Investigation of Tropical Disease Pathogens. Geneva,-1982,- UNDP/WORLD ВАЖ/WHO,- p.145-150.

23. Karakin E.I. Antigenic characteristics of malignant invasive neuroblastoma in larval brain transplants of lethal 1(2)^1 D.rac-laaoKaatnr mutants.// Droe.Inform.Sorv.1982,- v.58,- p.87.

24.Karakin E.I., Lerncr T.Ya. Changes in the antigenic composition of the salivary gland and brain-ventral ganglion complex in developing D.nalanogaBter third inotar larvae.// Dros.Inform. Serv.,- 1982,- v. 58,- p.88-89.

25. Karakin E.I. f l.Ya.Lerner, V.A.Kokoza e.a. Antigens of the Larval Organs and Salivary Gland Secretion of Drosophila nelano-g&gter.// Biol.Zbt.,- 1983,- v.102,-p.187-199.

26. Каракин Е.И. Исследование синтеза белков в злокачественных неоплазмах мозга мутантов l(2)gl D.nelonogaster .// Тезисы докладов 16- Конференции ФЕБО. Москва, 1984,- с. 304.

27. Karakin E,I. Protein г,ark erg for specific functions of normal larval norve tissue of Drosophila nglano^a.qter and their behaviour in malignantly transformed brain of 1(2and Df(2L)lgInet mutants.// Abstr.9— EDRC. Szeged,-1985,- p.53.

28. Каракин Е.И. Изменение активности генов секреторных белков слюнных келез D.melanogaster в онтогенезе и их регуляция.// В кн.: Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции у Jiptera .- 1985,- Н.,- с. 71-60.

29. Karakin E.I. The malignant transformation of larval brain of l(2)gl D.melanoga3ter mutants proceeds with the participation

of tyrosine proteinkinaseis).// Abstr. I Intern.Congress of Dipte-rology. Budapest,- 1986,- p.97.

30. Karakin E.I. ,Prasolova N. V.,Kaidanov L.Z., Sawateeva E.V.

Neuroproteins and sone of their phosphorylated forms are involved

ts3

in the learning in "genial" ag mutant males and in the sexual activity of LA males of Drosophila melanogaster selected for "impotence".// Abstr. 10^ EDRC. Barcelone,- 1987,- p.69.

31. Каракин Е.И. Идентификация специфических белков в нервной ткани ЛИЧИНОК Drosophila nelanogaster // Докл. АН СССР,- 1987,- т. 295, J6 4,- с. 981-983.

' 32 " -7 -

.__f'" -----'