Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика белков центральной нервной системы в линиях Drosophila melanogaster, селектированных на изменение уровня двигательной активности

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика белков центральной нервной системы в линиях Drosophila melanogaster, селектированных на изменение уровня двигательной активности"

На правах рукописи УДК: 575.11; 577.12; 595.772

ргб оа

1 о ш гю

X \ , I

Адоньева Наталья Васильевна

Характеристика белков центральной нервной системы

в линиях ОКОБОРНИЛ \lELANOGASTER, селектированных на изменение уровня двигательной активности.

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2000

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, лаб. молекулярно-генетических основ онкогенеза, г.Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Е.И. Каракин

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Л.А. Васильева

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор химических наук Г.А. Невинский

Институт биоорганинеской химии СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, г.Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится <СО СМгл&лА. 2000 года на утреннем заседании диссертационного совета по Защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в конференц-зале Института цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г.Новосибирск, 90, проспект акад. Лаврентьева, 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

'/Г/Я 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

£0ЩеА/; 0 Ео 1(ч. уз. 0

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Генетика количественных признаков является одной ' из важных областей общей генетики, вскрывающей элементы комплексного контроля многих фенотипических признаков и формирующей, в частности, основы теории селекции. Поэтому разработка проблем генетики количественных признаков является одной из актуальных задач современной генетики.

Изучение генетического контроля ряда форм поведения животных с привлечением таких удобных объектов, как дрозофила, представляет в этом отношении несомненный интерес, поскольку позволяет проводить исследование элементарных поведенческих признаков с использованием мутационного и селекционного подходов. Одним из таких подходов является изучение линий, селектированных на определённую форму поведения. Удобную для этих целей модель представляют линии, различающиеся по уровню двигательной активности (Два ).

При изучении регуляции половой активности самцов дрозофилы в классической селекционной схеме (Кайданов, 1979; 1997) были выделены линии с устойчивыми различиями по комплексу признаков, среди которых - пониженная ДвА самцов и самок в низкоактивной линии НА. Известен также ряд линий, селектированных на различную скорость эфирной наркотизации и харктеризующихся разным уровнем ДвА (Лопатина и др., 1977), и, кроме того, линии, селектированные именно по признаку ДвА (Лучникова, 1964) Можно было предположить, что в ходе селекции возникли структурные или регуляторные изменения генов, активных в нервной ткани и отвечающих за реализацию этой формы поведения. В этом плане представляет интерес выявление в таких линиях возможных нейральных эффектов, в частности, характеристика белков центральной нервной системы (ЦНС).

Удобство признака ДвА состоит в возможности быстрого получения контрастных линий, что позволяет исследовать динамику изменений на уровне белков ЦНС в ходе отбора.

Цел и и задачи исследования. Целью настоящей работы является характеристика белков ЦНС в линиях ОговорИИа те1апо^аБ<ег, различающихся по уровню двигательной активности. Предполагалось выявить белки нервной ткани, которые могли бы служить биохимическими маркерами генетической системы, контролирующей уровень двигательной активности Конкретные задачи работы сводились к следующим:

1. Выявление совокупностей общих и тканеспецифических белков в ЦНС дрозофилы в линии дикого типа.

2. Изучение экспрессии полипептидов нервной ткани в известных линиях Д те1апо£а$1ег различающихся по двигательной активности;

3. Проведение селекции на изменение уровня двигательной активности в линиях дрозофил из природных популяций, и параллельное изучение экспрессии белков нервной ткани в ходе отбора.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые детально □характеризованы полипептиды нервной ткани личинки и имаго Д. melanogaster, выявлены нейроспецифические белки, исследованы их физико-химические характеристики.

В ходе работы впервые установлено, что селекция дрозофил на разнонаправленное изменение уровня двигательной активности сопровождается изменениями в экспрессии белков ЦНС.

Впервые выявлено существование связи между экспрессией белков (р47, р69, р71, р75, р87, hsal и nplmm) нервной ткани и различным уровнем двигательной активности в линиях дрозофилы, селектированных по ДвА, и у мутанта inactive.

На основании полученных данных высказано предположение о том, что совокупность генов, отвечающих за уровень ДвА, включает локусы, кодирующие обнаруженные нами белки.

Проведённое исследование создает предпосылки для выяснения роли конкретных белков ЦНС в механизмах обеспечения двигательной активности. Кроме того, имеющиеся данные о наличии гомологии генов, экспрессирующихся в мозге человека и нервной системе дрозофилы, позволяют надеяться, что результаты подобных исследований внесут свой вклад в выяснение молекулярных механизмов детерминации ДвА и у высших животных, включая человека.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме «Медиаторы в генетической регуляции поведения», Новосибирск, 1986; Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы «Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине», Горький, 1987; Tenth European Drosophila Research Conferense, Barselone, Spain, 1987, VI Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов», Москва, 1987; Symposium «Integrative Action of Neuron: Molecular Basis», Yalta, 1988; Международном совещании «Онтогенетические и генетико-эволюционые аспекты нейроэндокринной регуляции стресса», Новосибирск, 1988; Всесоюзном совещании по биологии и генетике дрозофилы, Одесса, 1989; III Всесоюзной школе-семинаре по генетике и селекции животных, 1989; Всесоюзном симпозиуме «Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов», Пущино, 1990; Conference «Neurobiology of Drosophila» Cold Spring Harbor, New York, 1993; Cold Spring Harbor Meeting «Learning & Memory», New York, 1994; Международной конференции «Современные концепции эволюционной генетики», посвященной 80-летшоакад. Д.К. Беляева, Новосибирск, 1997; Conference "Learning & Memory", Cold Spring Harbor, NewYork, 1999; Eighth Meeting on «Neurobiology of Drosophila», Cold Spring Harbor, NewYork, 1999.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 17 работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы ( 2.Í2 работ), изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 2.5 рисунков и £~ та блиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии Drosophila melanopaster. используемые в работе. Высокоинбредная линия НА, селектированная на низкую половую активность самцов , а также родственные ей низкоакгивнаые (НА и ВА~) и высокоактивные (ВА и НА ) линии получены Л.З.Кайдановым и подробно охарактеризованы в его работах (Кайданов и др.,1994; 1996); линии К-6, К-1 (Лучникова, 1964); линии 25, 27, 145, 3, 70, 75, 480, 497, 438, 15, XI, Х2, 10, 13 (Лопатина и др., 1977) с различным уровнем ДвА, и мутанты

inactive (iav) (Dagan et. al., 1975) любезно предоставлены Н.Г. Камышевым из коллекции лаборатории сравнительной генетики поведения Института физиологии им. И.П.Павлова. Для скрининга полиморфных вариантов нейроспецифических полипептидов были использованы 70 линий D. melanogaster, выделенных из разных природных популяций. В качестве контрольной использовали лабораторную линию дикого типа Canton S (C-S). Линии Т, Б2, Б20, БЗ и БЗО с низкой ДвА были получены автором в результате проведённой селекции

Схема отбора. Исходным материалом для собственных селекционных экспериментов послужили изосамочьи линии, происходящие из трех природных популяций Drosophila melanogaster. узбекской (Т89) и двух белорусских (2Б86 и ЗБ86).

На основании оценок уровня ДвА у самок в потомстве самок-основательниц были отобраны семьи с наименьшими показателями этого признака. Дня подбора основателей следующего поколения определяли индивидуальную ДвА у самцов и самок из этих семей и выбирали особей с минимальными оценками ДвА Такую двухступенчатую оценку ДвА проводили в каждом поколении с целью повышения селекционного вклада самцов по признаку пониженной ДвА в следующее поколение

Методы оценки двигательной активности. Для оценки ДвА мы использовали следующий метод: число движущихся в момент наблюдения мух в группах по 10 особей подсчитывали спустя 30 мин после одновременного встряхивания специального стенда со всеми стаканчиками, в которые предварительно были рассажены самки 3-5-дневного возраста (Лучникова, 1964). Индекс ДвА вычисляли по 10 последовательным наблюдениям. Для оценки индивидуальной ДвА мух рассаживали по одной в тонкие стаканчики со средой, через 30 мин. после синхронного встряхивания отмечали, сколько раз в течение 10-ти беглых просмотров каждая особь находилась в движении. Это число использовали в качестве показателя индивидуальной ДвА.

Исследование белков нервной ткани: Комплекс «мозг-вентральный ганглий» с нервными волокнами выделяли из личинок третьего возраста при помощи препаровальных игл под бинокулярной лупой.

У взрослых мух 7-9-суточного возраста, наркотизированных либо замороженных в жидком азоте, изолировали головы под стереомикроскопом, тщательно удаляя остатки пищевода. Белки экстрактов головы имаго изучали методами диссоциирующего электрофореза в полиакриламидном геле (ДСН ПААГ ЭФ), имммуноэлектродиффузии (ИЭД) и перекрёстного иммуноэлектрофореза (ПИЭФ) (Каракин,1981; 1985). С определёнными допущениями, в экстрактах головы присутствуют главным образом белки мозга, ЦНС. Поэтому далее нейробелками мы называем белки или полипептиды, выделенные из экстрактов головы. Кроличьи антисыворотки к экстрактам тканей и извлечённым из ПААГ белкам нервной ткани личинок и имаго получали по методу Дорфмана (Дорфман, 1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика белков ЦНС личинок и имаго в линии дикого типа. 1.1 Анализ общих и тканеспецифических белков.

Изучение нейробелков у дрозофилы дикого типа (Canton S) является необходимой основой для исследований потенциальных маркеров нейрофункций у

мух с изменёнными поведенческими характеристиками. Разработанные в лаборатории микроварианты методов анализа белков (Каракин, 1981; 1985) позволили провести исследование ряда физико-химических характеристик белков нервной ткани D. melanogaster.

Спектр полипептидов мозга личинки III возраста линии Canton S содержит не менее 60 фракций (рис. 16)

В водных экстрактах нервной ткани личинки с помощью ПИЭФ выявляется не менее 30 антигенных фракций (рисДв).

Экстракты головы имаго содержат около 55 полипептидных фракций (рис. 16). Не менее 20 пслипептидов являются общими для мозга личинки и головы имаго дрозофилы. Существование связанных с возрастом различий может объясняться важными морфо-функциональными изменениями нервной системы насекомого, происходящими в период метаморфоза (Hartenstein, Campos-Ortega, 1984)

6) полипетнлы экстрактов головы имаго (1) и мозга личинки (2)

а)спецнфические антигены головы нмаго (hsal - bu8)

1 2

ê) общие антигены мозга личинок

щ

fcsal

2) специфические антигены мозга личинок '(bsal-bsaS)

ч,

ал__

/35 ~

\

H

M

Рисунок 1. Общие и специфические белки нервной ткани личинки и имаго дрозофилы.

1.2 Тканеспецифическне белки мозга личинки.

Особый интерес представляют тканеспецифическне белки нервной ткани. Для их выявления применяли метод ПИЭФ с промежуточным гелем, содержащим в качестве гегерологичных, антитела к личинкам, лишённым нервной ткани, и последующее осаждение белков, прошедших такой "фильтр", антителами к личинкам, содержащим нервную ткань (рис. 1г).

Полученные данные позволяют заключить, что 5 водорастворимых белков (й^а*/-5) являются нейроспецифическими для личиночного комплекса "мозг-вентральный ганглий", что хорошо согласуется с числом общих и органоспецифических белков в нервной ткани позвоночных (Каракин, Свиридов, 1981).

3.3 Особенности характера экспрессии полипептидов р87, р75, р71, р69, р47.

Необходимо отметить, что для всех перечисленных белков были характерны количественные изменения. Эти фракции выявлялись и в контроле (как в Canton S, так и в исходных популяциях), но в линиях их относительное содержание (на ЭФ-граммах) изменялось в различной степени в сторону увеличения или уменьшения. Разный уровень экспрессии р87 в различных линиях продемонстрирован на денситограммах (рис.8).

Иммунохимические эксперименты (ИЭД) с использованием антител к исследуемым полипептидам показали, что р75, р71 и р69 экспрессируются только на стадии имаго, а р47 и р87 характерны как для имаго, так и для личинки. Все указанные белки выявляются не только в нервной ткани, но и в других исследованных тканях имаго и личинки.

3.4 Исследование экспрессии белков нервной ткани в известных линиях дрозофил с различным уровнем ДвА.

Чтобы определить степень распространённости выявленных изменений экспрессии белков среди линий, имеющих отклонения от нормальной ДвА, проанализировали полипептидные спектры голов имаго из линий с высокой и низкой ДвА из коллекции Камышева Н.Г., а также низкоактивных мутантов inactive (kiv) (рис. 9).

В ряде исследованных линий полипептидный спектр экстрактов головы мух отличался от контрольного (Canton S) изменениями в относительном содержании тех же белков (р87, р75, р71, р69 и р47), которые были отмечены в ходе проведённого нами отбора на понижение ДвА (рис.9, табл.2). Аналогичные результаты были продемонстрированы в работах других авторов, которые показали, что повышенный уровень фосфорилирования белка р87 сопровождается повышенной ДвА у двух температурочувствительных мутантов (Karakin et. al., 1987; Sawateeva & Kamyshev, 1981).

Полученные нами данные не позволяют говорить о наличии корреляции между уровнем ДвА и уровнем содержания каждого из перечисленных полипептидов. Повышенное содержание р87 и р69, пониженное - р75 и р71 наблюдаются как в линиях с низкой, так и в линиях с высокой ДвА, а содержание р47 снижено, по сравнению с нормой, в трёх низкоактивных и повышено в одной высокоактивной линии (табл. 2). Однако набор белков, в экспрессии которых обнаруживаются отклонения от нормы, повторяется в селектированных линиях различного происхождения, а также у низкоактивного мутанта inactive. Это дало нам основания для предположения, что связь между уровнем ДвА и изменениями в экспрессии данных полипептидов всё же существует.

Множественность выявленных полипептидов и количественный характер изменений уровня их экспрессии хорошо согласуются с представлениями о полигенном контроле нейрофизиологических признаков (Лобашёв, 1967).

Таким образом, можно предположить, что гены для белков р87, р75, р71, р69, р47, hsal и nplmm входят в состав комплекса нейрогенов, контролирующих (в том числе и на уровне ЦНС) ДвА у дрозофилы.

Изучение с самых ранних этапов отбора характера изменений ДвА и экспрессии белков нервной ткани у селектируемых мух показало, что, вероятно, существует некоторое множество генов, по которым может пойти отбор на низкий уровень ДвА.

Рисунок 9. Нейрополипептиды имаго В. текто^ах1ег из линий с высоким и низким (*) уровнем ДвА (коллекции Камышева Н.Г., Кайданова Л.З.)

Ж

"А ч Кб 25 15 70 /оу* (мол.)К|*: 480 27 | 438*; 497*

_ • 0 J| & Ç &

w^t» »«.«A

Тот факт, что в некоторых линиях модификация р87 сохраняется до конца селекции, а в некоторых "вымывается" из селектируемых линий через какое-то количество поколений, возможно, говорит о том, что путь к достижению низкого уровня ДвА может лежать через регуляцию экспрессии данного полипептида, но не является единственным, поскольку в семьях и линиях, не несущих модификацию р87, уровень ДвА также остается низким. Подтверждением этому может служить уменьшение в некоторых селектируемых линиях относительного содержания полипептидов р47, р71 и р75, а также повышение содержания р69. Видимо, в

разных изученных нами природных популяциях закрепились разные гены, обеспечивающие сходный уровень ДвА.

Поскольку почти все упомянутые полипептиды присутствуют у дрозофилы из контрольной линии Canton S, а изменения носят количественный характер, то факторы, контролирующие данные изменения экспрессии полипептидов у мух селектированных линий и мутантов iav являются, по-видимому, регуляторными.

Таблица 2. Изменения полипептидного спектра экстрактов голов имаго О melanogasteг из линий с отклонениями от нормальной ДвА._

Уровень ДвА Линии p87 P75 no p71 липет P69 -ИДЫ p47 hsal nplmm авторы линий

по-вы-шен-ный НА+ + Кайданов Л.З.

15 - + ++ Пономарен-коВ.З., Смирнова Г.П., Лопатина Н.Г.

25 - - +

27 -

Кб + Лучникова ЕМ.

по-вы-шен-нын при 29°С ts 15 5 Савватеева Е.В.

ts980 32p.

пони-жен-ный Kl - Лучникова Е.М.

145 - + Пономарен-ко В В. и др

ilTV + - + Ikeda К, Kaplan VV.

Б2 + - - Адоньева HB.

БЗ + - - +

Б20 + -

Б30 + -

T +

HA - + Кайданов Л.З.

" + "- содержание данной фракции выше нормы (Canton S)

" - " - содержание данной фракции ниже, чем в норме (Canton S)

" 32Р* " - повышенный при 29°С уровень фосфорилирования (Karakin et. al., 1987)

выводы

1. В результате исследования с помощью высоковоспроизводимых микрометодов ряда физико-химических характеристик белков ЦНС Drosophila melanogaster в известных и специально селектированных линиях с различным уровнем локомоторной активности идентифицирован комплекс нейробелков, связаннных с регуляцией двигательной активности.

2. Впервые детально охарактеризованы белковые спектры нервной ткани личинки и имаго в линии дикого типа Canton S:

а) идентифицирован набор общих нейробелков, насчитывающий около 60 полипептидов (при фракционировании в диссоциирующих условиях) и не менее 30 водорастворимых белков (при детекции иммунохимическими методами);

б) идентифицирован набор тканеспецифических нейробелков состоящий из 5 водорастворимых белков на стадии личинки и 8 - на стадии имаго;

в) показано, что нейроспецифические полипептиды с мол. массой 13.5 кДа мозга личинки (bspl-t) и головы имаго (bspl-ii), а также полипептид 13,7 кДа головы имаго (hspl-¡2) составляют группу структурно сходных нейрополипептидов, bspJ;

г) определена молекулярная масса нейроспецифического белка hsal головы имаго (23,4 кДа) и его субъединичный состав.

3. В результате селекции мух, взятых из различных природных популяций, получены 5 линий с низкой ДвА. Исследована динамика изменений экспрессии нейробелков в этих линиях в процессе отбора.

4. Охарактеризованы нейробелковые спектры в 22 селектированных линиях с разной ДвА, полученных другими авторами.

5. Сравнительный анализ спектров нейробелков выявил в 13 из 27 линий различной селекции, а также у низкоактивного мутанта inactive характерные изменения в экспрессии ряда белков:

а) онтогенетически стабильную модификацию р87, исчезающую в норме к 5-суточному возрасту имаго;

б) повышение относительного содержания р69 и nplmm;

в) понижение относительного содержания р71, р75 и hsal\

г) разнонаправленное изменение относительного содержания р47;

6. Идентифицированный набор из 7 полипептидов (р87, р75, р71, р69, р47, nplmm и hsal), претерпевающих разнонаправленные количественные изменения при отборе на уровень двигательной активности, свидетельствует о сложном генетическом контроле двигательной активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Каракин Е.И., Прасолова (Адоньева) Н.В., Кайданов Л.З. Анализ общих и тканеспецифических белков нервной ткани у самцов длительно селектированных линий Drosophila melanogaster, различающихся по двигательной и половой активности // В сб.: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума «Медиаторы в генетической регуляции поведения», Новосибирск, 1986, с.25-26.

2. Karakin E.I., Prasolova (Adonyeva) N.V., Kaidanov L.Z., Sawateeva E.V. Neuroproteins and some of their phosphorylated forms are involved in the learning in «genial» temperature-sensitive agu3 mutant males and in the sexual activity of LA males of

Drosophila melanogaster selected for «importence». // Abstr.: Tenth European Drosophila research Conference, Barseione, Spain, p.69, 1987

3. Прасолова (Адонъева) HB, Каракин Е.И. Генетико-биохимический анализ некоторых нейроспецифических белков в онтогенезе Drosophila melanogaster // В сб.: Тезисы VI Всесоюзного симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов», Москва, с.39-40, 1987

4. Каракин Е.И., Лернер Т.Я., Прасолова (Адоньева) Н.В., Кайданов Л.З. Исследование динамики синтеза нейробелков в онтогенезе Drosophila melanogaster у линий, селектированных на низкую половую, двигательную активность; сравнение линий с редуцированной (НА), компенсированной (НА ) и нормальной (Canton S) нейроэндокринной системой // Тезисы Международного совещания «Онтогенетические и генетико-эволюционные аспекты нейроэндокринной регуляции стресса», Новосибирск, с.65-67, 1988

5. Каракин Е.И., Прасолова (Адоньева) Н.В., Кайданов Л.З. Небробелки р87 и nplmm Drosophila melanogaster дифференциально характеризуют самцов инбредных линий, различающихся по уровню половой и двигательной активности // Доклады Академии наук СССР, 1989. -Т. 3 ОТ. - Ы 5. - С. 1246 -124 9

6. Прасолова (Адоньева) Н.В., Каракин Ь.И. Селекция на низкую двигательную активность у Drosophila melanogaster изменяет регуляцию синтеза нейробелков // Известия СО АН, вып. 2, с.25, 1989

7. Адоньева Н.В., Каракин Е.И., Кайданов Л.З. Регуляция синтеза нейробелков у Drosophila melanogaster, селектированных на изменения в уровне двигательной активности // Материалы Международной конференции «Современные концепции эволюционной генетики», посвященной 80-летию акад. Д.К.Беляева, Новосибирск, Россия, с. 10-12, 1997

8. Мезенцева Г.А., Вардосанидзе К В., Непомнящих Г.И., Адоньева Н.В , Бочкарев М Н.. Непомнящих JIM., Сидоров С.В., Зарубенков О.А., Каракин Е.И. Иммуногистохимическое исследование внутриклеточной локализации MARCKS, главного субстрата протеинкиназы С, в опухолевых клетках желудка // Актуальные вопросы современной медицины. Н.: Изд. Новосибирского Медицинского Института. 1999.-С.212-213.

9 Adonyeva N.V., Kaidanov L.Z., Mitskevich А.А., Karakin E.I. Modulations of motor activity in Drosophila selected strains correlate with the regulations of the synthesis of neuroproteins/>-/7, p75 andp87 in centrai nervous system.// Abstr. Conference "Learning & Memory", Cold Spring Harbor, NewYork, April - May, 1999, p. 13.

10. Adonyeva N.V., Kaidanov L.Z., Karakin E.I., Motor activity in Drosophila melanogaster correlate with the regulations of the synthesis of neuroproteins p47, p75 and p87// Abstr. Eighth Meeting on «Neurobiology of Drosophila», Cold Spring Harbor, NewYork, October, 6-10, 1999, p. 18.

11. Каракин Е.И., Адоньева H.B., Савватеева-Попова E.B., Кайданов Л.З. Нейрогенетика дрозофилы и проблемы нейробиологии. //Вестник ВОГИС. -1999.-N9.-С.7-10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Адоньева, Наталья Васильевна

Введение

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы.

1. Морфология развивающейся нервной системы Р. те1апо^а81ег.

1.1. Нервная система личинки Рго$орЫ1а melanogaster.

1.2. Нервная система имаго Р.те1апо£а$1ег.

2. Специфические маркеры нервной ткани дрозофилы.

3. Нейрологические мутации и их роль в исследовании нейрохимических процессов и механизмов реализации нейрофункций.

3.1. Мутации, затрагивающие ранний нейрогенез.

3.2. Мутации, связаные со структурными дефектами мозга.

3.3. Мутации, затрагивающие зрение.

3.4. Ольфакторные мутации.

3.5. Мутации, затрагивающие память и способность к обучению.

4. Исследование системы обратимого фосфорилирования белков у дрозофилы.

5. Исследование аденилатциклазного и фосфодиэстеразного комплексов у дрозофилы.

6. Исследование линий, длительно селектируемых на изменение уровня половой активности самцов.

7. Генетический анализ двигательной активности Рго8орЫ1а те1атс^а.ч1ег.

7.1. Исследование генетической детерминации различных форм ДвА.

7.2. Мутации, затрагивающие двигательную активность.

7.2.1 ДвА и метаболизм цАМФ.

7.2.2. ДвА и метаболизм биогенных аминов.

7.2.3. ДвА и исследовательское поведение личинок и имаго.

7.2.4. ДвА у мутантов с морфологическими аномалиями в структурах мозга.

Глава 2. Материалы и методы

1. Линии Рго.ъорЫ1а mela.noga.ster. используемые в работе.

2. Схема отбора.

3. Методы оценки двигательной активности.

4. Приготовление экстрактов белков для электрофоретического и иммунохимического анализа.

5. Фосфорилирование и йодирование нейральных белков in vitro.

6. Электрофоретический анализ белков в ГТААГ.

7. Получение антисыворотки к экстрактам тканей.

8. Перекрестный иммуноэлектрофорез.

9. Иммунодиффузия. иммуноэлектродиффузия и радиальная иммунодиффузия.

Глава 3. Результаты

1. Характеристика белков ДНС личинок и имаго в линии дикого типа.

1.1. Сравнительный анализ общих и тканеспецифических белков.

1.2. Тканеспецифические белки мозга личинки.

1.3. Некоторые свойства нейроспецифических белков группы bspl

1.4. Нейроспецифические белки имаго дрозофилы.

1.5. Некоторые характеристики нейроспецифического белка имаго - hsa-1.

2. Изучение экспресии белков нервной ткани Р. melanogaster в иибредных линиях с изменённым уровнем двигательной и половой активности.

2.1. Сравнительный анализ экспрессии общих и специфических белков нервной ткани имаго в линиях НА. НА+. НА", В А и ВА~.

2.2. Особенности экспрессии нейробелков. выявленные в линиях НА и НА+: а) Понижение относительного содержания нейробелка hsal. б) Повышение содержания группы нейробелков nplmm. в) Изменение экспрессии белка р87.

2.3. «Модификация р87» у имаго разного возраста.

3. Изменение экспрессии белков ДНС в линиях Drosophila melanosaster, селектированных на понижение уровня двигательной активности.

3.1. Изменение уровня ДвА в ходе селекции.

3.2. Изменение экспрессии белков нервной ткани имаго при селекции на понижение ДвА.

3.3. Особенности характера экспрессии полипептидов р87. р75. р71. р69. р47.

3.4. Исследование экспрессии белков нервной ткани в известных линиях дрозофил с различным уровнем ДвА.

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Характеристика белков ДНС личинок и имаго в линии дикого типа.

2. Изучение экспрессии белков нервной ткани Р. ше1апоеа81ег в инбредных линиях с изменённым уровнем двигательной и половой активности.

3. Изменение экспрессии белков ЦНС в линиях РгоэоукИа те1апоца$1ег^ селектированных на понижение уровня двигательной активности. 84 Выводы 90 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика белков центральной нервной системы в линиях Drosophila melanogaster, селектированных на изменение уровня двигательной активности"

Актуальность проблемы. Генетика количественных признаков является одной из важных областей общей генетики, вскрывающей элементы комплексного контроля многих фенотипических признаков и формирующей, в частности, основы теории селекции. Поэтому разработка проблем генетики количественных признаков является одной из актуальных задач современной генетики.

Изучение генетического контроля ряда форм поведения животных с привлечением таких удобных объектов, как дрозофила, представляет в этом отношении несомненный интерес, поскольку позволяет проводить исследование элементарных поведенческих признаков с использованием мутационного и селекционного подходов. Одним из таких подходов является изучение линий, селектированных на определённую форму поведения. Удобную для этих целей модель представляют линии, различающиеся по уровню двигательной активности (ДвА).

При изучении регуляции половой активности самцов дрозофилы в классической селекционной схеме (Кайданов, 1979; 1997) были выделены линии с устойчивыми различиями по комплексу признаков, среди которых - пониженная ДвА самцов и самок в низкоактивной линии НА. Известен также ряд линий, селектированных на различную скорость эфирной наркотизации и харктеризующихся разным уровнем ДвА (Лопатина и др., 1977), и, кроме того, линии, селектированные именно по признаку ДвА (Лучникова, 1964). Можно было предположить, что в ходе селекции возникли структурные или регуляторные изменения генов, активных в нервной ткани и отвечающих за реализацию этой формы поведения. В этом плане представляет интерес выявление в таких линиях возможных нейральных эффектов, в частности, характеристика белков центральной нервной системы (ЦНС).

Удобство признака ДвА состоит в возможности быстрого получения контрастных линий, что позволяет исследовать динамику изменений на уровне белков ЦНС в ходе отбора.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является характеристика белков ЦНС в линиях Ого$орШ1а melanogaster, различающихся по уровню двигательной активности. Предполагалось выявить белки нервной ткани, которые могли бы служить биохимическими маркерами генетической системы, контролирующей уровень двигательной активности

Конкретные задачи работы сводились к следующим: 1. Выявление совокупностей общих и тканеспецифических белков в ЦНС дрозофилы в линии дикого типа.

2. Изучение экспрессии полипептидов нервной ткани в известных линиях D. melanogaster различающихся по двигательной активности;

3. Проведение селекции на изменение уровня двигательной активности в линиях дрозофил из природных популяций, и параллельное изучение экспрессии белков нервной ткани в ходе отбора.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые детально охарактеризованы полипептиды нервной ткани личинки и имаго D. melanogaster, выявлены нейроспецифические белки, исследованы их физико-химические характеристики.

В ходе работы впервые установлено, что селекция дрозофил на разнонаправленное изменение уровня двигательной активности сопровождается изменениями в экспрессии белков ЦНС.

Впервые выявлено существование связи между экспрессией белков (р47, р69, р71, р75, р87, hsal и nplmm) нервной ткани и различным уровнем двигательной активности в линиях дрозофилы, селектированных по ДвА, и у мутанта inactive.

На основании полученных данных высказано предположение о том, что совокупность генов, отвечающих за уровень ДвА, включает локусы, кодирующие обнаруженные нами белки.

Проведённое исследование создаёт предпосылки для выяснения роли конкретных белков ЦНС в механизмах обеспечения двигательной активности. Кроме того, имеющиеся данные о наличии гомологии генов, экспрессирующихся в мозге человека и нервной системе дрозофилы, позволяют надеяться, что результаты подобных исследований внесут свой вклад в выяснение молекулярных механизмов детерминации ДвА и у высших животных, включая человека.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме «Медиаторы в генетической регуляции поведения», Новосибирск, 1986; Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы «Фундаментальные достижения нейрохимии -медицине», Горький, 1987; Tenth European Drosophila Research Conferense, Barselone, Spain, 1987; VI Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов», Москва, 1987; Symposium «Integrative Action of Neuron: Molecular Basis», Yalta, 1988; Международном совещании «Онтогенетические и генетико-эволюционые аспекты нейроэндокринной регуляции стресса», Новосибирск, 1988; Всесоюзном совещании по биологии и генетике дрозофилы, Одесса, 1989; III Всесоюзной школе-семинаре по генетике и селекции животных, 1989; Всесоюзном симпозиуме «Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов», Пущино, 1990; Conference «Neurobiology of Drosophila» 6

Cold Spring Harbor, New York, 1993; Cold Spring Harbor Meeting «Learning & Memory», New York, 1994; Международной конференции «Современные концепции эволюционной генетики», посвященной 80-летию акад. Д.К. Беляева, Новосибирск, 1997; Conference "Learning & Memory", Cold Spring Harbor, New York, 1999; Eighth Meeting on «Neurobiology of Drosophila», Cold Spring Harbor, New York, 1999.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 17 работ. Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (214 работ ), изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 5 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Адоньева, Наталья Васильевна

Выводы

1. В результате исследования с помощью высоковоспроизводимых микрометодов ряда физико-химических характеристик белков ЦНС Drosophila melanogaster в известных и специально селектированных линиях с различным уровнем локомоторной активности идентифицирован комплекс нейробелков, связаннных с регуляцией двигательной активности.

2. Впервые детально охарактеризованы белковые спектры нервной ткани личинки и имаго в линии дикого типа Canton S: а) идентифицирован набор общих нейробелков, насчитывающий около 60 полипептидов (при фракционировании в диссоциирующих условиях) и не менее 30 водорастворимых белков (при детекции иммунохимическими методами); б) идентифицирован набор тканеспецифических нейробелков состоящий из 5 водорастворимых белков на стадии личинки и 8 - на стадии имаго; в) показано, что нейроспецифические полипептиды с мол. массой 13.5 кДа мозга личинки (bspl-l) и головы имаго (bspl-ii), а также полипептид 13,7 кДа головы имаго (bspl-i2) составляют группу структурно сходных нейрополипептидов, bspl; г) определена молекулярная масса нейроспецифического белка hsal головы имаго (23,4 кДа) и его субъединичный состав.

3. В результате селекции мух, взятых из различных природных популяций, получены 5 линий с низкой ДвА. Исследована динамика изменений экспрессии нейробелков в этих линиях в процессе отбора.

4. Охарактеризованы нейробелковые спектры в 20 селектированных линиях с разной ДвА полученных другими авторами.

5. Сравнительный анализ спектров нейробелков выявил в 13 из 25 линий различной селекции, а также у низкоактивного мутанта inactive характерные изменения в экспрессии ряда белков: а) онтогенетически стабильную модификацию р87, исчезающую в норме к 5-суточному возрасту имаго; б) повышение относительного содержания р69 и nplmm; в) понижение относительного содержания р71, р75 и hsal\ г) разнонаправленное изменение относительного содержания р47;

6. Идентифицированный набор из 7 полипептидов (р87, р75, р71, р69, р47, nplmm и hsal), претерпевающих разнонаправленные количественные изменения при отборе на уровень двигательной активности, свидетельствует о сложном генетическом контроле двигательной активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Адоньева, Наталья Васильевна, Новосибирск

1. Бензер С. От гена к поведению.// в кн.: Актуальные проблемы генетики поведения. Ленинград: Наука, 1975, С.5-20

2. Васильева Л.А., Ратнер В.А., Забанов С.А., Юданин А.Я. Сравнительный анализ паттернов локализации мобильных генетических элементов в селекционно-генетических экспериментах на Drosophila melanogaster.ll Генетика. 1995. - Т.31, N7. - С.920-931.

3. Гвоздев В.А, Кайданов Л.З. Геномная изменчивость, обусловленная транспозициями мобильных элементов и приспособленность особей Drosophila melanogaster!I Журн. общ. биологии. 1986. - Т.20. - №48. - С.51-63

4. Девай П., Домбради В., Гиркович X. и др. Микрокомпартментализация цАМФ и фосфорилирование белков у дикого типа и у мутантов линий dunce Drosophila melanogaster с нарушенной памятью // Тезисы 16 конференции ФЕБО, 1984,

5. Дюжикова Н.А., Токмачёва Е.В., Лопатина Н.Г. Исследование структурно-функциональной организации хромосом при реакции на стресс.//Генетика. 1997. - Т.33, №8,-С. 1077-1082

6. Еропкин М.Ю. Роль протеолиза в процессинге и инактивации нейропептидов, его возможная связь с некоторыми функциями мозга.// Усп. Совр. Биол., 1983, Т.95, вып.1, -С.65- 84.

7. Кайданов Л.З. О принципах генетического анализа физиологических признаков.// в кн.: Актуальные проблемы генетики поведения. Ленинград: Наука, 1975, С. 111-119.

8. Кайданов Л.З. Анализ генетических последствий отбора и инбридинга у Drosophila melanogaster II Журн. общ. биол., 1979, Т.40, №6, - С.834-849.

9. Кайданов Л.З. Генетические последствия отбора по адаптивно важным признакам (в экспериментах с дрозофилой) // Автореф. докт. дисс. -Ленинград 1982 - 30с.

10. КайдановЛ.З. Направленность наследственной изменчивости при отборе по адаптивно важным признакам.//В кн.: Дарвинизм: история и современность. Л.: Наука, 1987, с. 128159.

11. Кайданов Л.З., Куксинская И.С., Мексина Н.С. Исследование генетики полового поведения Drosophila melanogaster. 1. Селекция и генетический анализ линий, различающихся по половой активности//Генетика. 1969. Т.5 №9. 116-123.

12. КайдановЛ.З., Лучникова Е.М. Принципы генетического анализа поведения // В кн. Физиологическая генетика и генетика поведения. Л.: Наука., 1981, с.21-77.

13. Кайданов Л.З., Галкин А.П., Иовлева О В., Сиделева О.Г. Направленные перемещения по геному мобильного элемента хобо в длительно селектируемой линии НА Drosophila melanogaster.ll Цитология и генетика. 1996. - Т.30, - С.23-30.

14. Кайданов Л.З., Мыльников C.B., Иовлева О.В., Галкин А.П. Направленный характер генетических изменений при длительном отборе линий Drosophila melanogaster по адаптивно важным признакам//Генетика. 1994. - Т.30, №8, - С.1085-1096

15. Камышев Н.Г., Камышева Е.А., Смирнова Г.П., Парфенюк И.В. Взаимообучение особей дрозофилы в групповой ситуации методом проб и ошибок.// Журн. общ. биол. 1994. -Т.55, №6 - С.737-747

16. Камышев Н.Г., Савватеева Е.В., Пономаренко В В. О нейрогормональных факторах регуляции генетических и цитогенетических процессов // В кн.: Физиологическая генетика и генетика поведения. Л: Наука., 1981, с. 182.

17. Каракин Е.И. Микровариант метода перектрестного иммуноэлектрофореза и его использование для анализа полового диморфизма у взрослых мух Drosophila melanogaster.ll Изв. СО АН СССР,- 1981,- сер. Биол. Наук, т.З, № 15,- с. 126-131.

18. Каракин Е.И. Исследование синтеза белков в злокачественных неоплазмах мозга мутантов 1(2)gl Р.melanogaster.ll Тезисы докладов 16в Конференции ФЕБО. Москва; 1984,- с. 304.

19. Каракин Е.И. Изменение активности генов секреторных белков слюнных желез Р.melanogaster в онтогенезе и их регуляция. // В кн.: Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции у Piptera 1985,- Н,- с. 71-80.

20. Каракин Е.И., Свиридов С.М. Феногенетика водорастворимых антигенов дрозофилы.-1981,- с.126-156., Н.

21. Каракин Е.И., Адоньева H B., Савватеева-Попова E.B, Кайданов JI.3. Нейрогенепгика дрозофилы и проблемы нейробиологии. //Вестник ВОГИС. 1999. - N9. - С.7-10.

22. Кикнадзе И.И., Колесников H.H., Каракин E.H., Кокоза В.А., Копанцев Е.П., Себелева Т.Е., Щербаков Д.Ю., Зайниев Г.А., Агапова O.A., Айманова КГ. Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции у Díptera // Новосибирск: Наука, 1985,- с. 78-79.

23. Лобашёв М.Е. Генетика, Л.: ЛГУ. - 1967. - с.600.

24. Лучникова Е.М. Двигательная активность насекомых как фактор поведенческой устойчивости к инсектицидам // Сб. Исследования по генетике, изд-во ЛГУ, 1964 - №2 -С.37

25. Лучникова Е.М. Характер генотипического определения уровня общей двигательной активности Drosophila melanogasterl'/ Генетика. 1966 - №5 - С.36-46

26. Микеладзе Д.Г. Циклические нуклеотиды, кальций и протеинкиназные реакции в нервной ткани // Тбилиси: Мецниереба,- 1983. с. 184.

27. Милошевич Н.Дж., Влияние генов dunce и amnesiac на сигнальное обучение у плодовых мушек Drosophila melanogaster. эксперименты с запахами. // Генетика. 1999. - Т.35. №2. - С.209-216.

28. Мыльников С В., Смирнова А Н., Блюздин Ю.А., Опарина Т.И. О связи продолжительности жизни, интенсивности перекисного окисления и жирнокислотного состава липидов у Drosophila melanogaster II Вестн. СПбУ. 1994. - Сер.З. - Вып. 1. - (3). -С. 100-104.

29. Панов Е.Н. Поведение животных и этологическая структура популяций// М.: Наука. -1983. -423с.

30. Пахомов А Н., Неумывакин Л.В., Кайданов Л.З., Пономаренко В.В. Исследование состава множественных молекулярных форм холинестераз у Drosophila melanogaster. 1. Межлинейные различия//Генетика. 1974. - Т. 10. №10. - С.68-72.

31. Переслени И.В. Изучение генетического контроля метаболизма циклических нуклеотидов в связи с их влиянием на поведение дрозофилы// Дис. канд. биол. наук Л.: Ин-т физиологии им. И.П. Павлова АН СССР, 1986, 144 с.

32. Полэ И.Р., Кайданов Л.З. Распределение мутаций, контролирующих низкую половую активность самцов по длине Х-хромосомы линии НА Drosophila melanogaster II Генетика. 1978,- Т.14, №11. - С.1913-1918.

33. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г., Розенблюм С.Р. Получение температурочувствительных мутаций, затрагивающих метаболизм циклического аденозин-3'5'-монофосфата у D. melanogaster II Докл АН СССР. 1978, - Т.240, - С. 1443-1445.

34. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г. Влияние на двигательную активность и обучение D. melanogaster мутаций, затрагивающих метаболизм циклического аденозин 3',5'-монофосфата. II Докл АН СССР. 1978,- Т.243. - С. 1564-1567.

35. Савватеева Е.В., Лабазова И.В., Пагина В В., Кайданов Л.З. Изучение метаболизма цАМФ в линиях Drosophila melanogaster, селектированных на различия по половой активности самцов.//Докл. Акад. наук СССР. 1981. - Т.256. - №3. - С.715-717

36. Савватеева Е.В., Переслени ИВ., Корочкин Л.И. Циклический АМФ и двигательная активность дрозофилы.// Доклады Академии наук СССР. 1985. - Т.281, №4. - С.966-970

37. Северин ЕС., Кочеткова М.Н. Роль фосфорилирования в регуляции клеточной активности // М.: Наука, 1985,- 288 с.

38. Фурман Д.П., Матушкин Ю.Г., Морозов П.С. Идентификация полигенов в системе ahaete-scute методами кластерного анализа//Генетика. 1998. - Т.34, №2. - С.226-234.

39. Шарагина Л.М., Савватеева Е.В., Атаманенко А.А. Изучение активности фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов у мутантных линий Drosophila melcmogaster.il Генетика. 1997,- Т.ЗЗ, №6. - С.784-787

40. Щербаков Д.Ю., Исследование структуры и посттрансляционной модификации тканеспецифических белков слюнных желёз в норме и у мутантов Drosophila melanogaster .// Автореф. канд. дисс. Н. - 1988 - 16с.

41. Aceves-Pina E., Booker R., Duerr J. Learning and memory in Drosophila II Abstr. of Cold Spring Harbor Symp. VXLVIII, 1983, - P 831-840.

42. Aceves-Pina E., Quinn W. Learning in normal and mutant Drosophila larvae // Science, 1979, - V.206, - №4414, - P.93-96.

43. Albert K., Nairn A., Greengard P. The 87 kDa protein, a major specific substrate for protein kinase C: purification from bovine brain and characterization.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1987, V.84 - P.7046-7050.

44. Albert K., Wu W., Nairn A., Greengard P. Inhibition by calmodulin of calcium/phospholipid-dependent protein phosphorylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, - V.31 - P.3622-3625.

45. Angus J. Genetic control of activity, preening, and the response to a shadow stimulus in Drosophila melanogaster II Behav. Genet. 1974. - V.4. - P.317-329.

46. Arking R. Tissue-, Age-, and Stage-Specific Patterns of Protein Synthesis during the Development of Drosophila melanogaster!I Dev. Biol. 1978 - V.63, - P. 118-127.

47. Arnesen S.J., Olivio R.f., The effects of serotonin and octopamine on behavioural arousal in the crayfish // Сотр. Biochem. and Phisiol. C. 1988. V.91. - P.259-263.

48. Bastock M. A gene mutation which changes a behaviour pattern // Evolution 1956. - V.10. -P.421-439.

49. Bassler U. Neural basis of elementary behaviour in stick insects // 1983;59. de Belle J.S., Sokolovski M.B. Heredity of rover/sitter: Alternative foraging strategies in Drosophila melanogaster larvae // Heredity. 1987. - V.59. - P.73-83.

50. Benzer S. Antigenic homologies between mammalian and Drosophila retine // Caltech. Biology Annual report., 1983, - P. 197-202.

51. Benzer S., Zipursky S., Venkattesch T. et.al. // Monoclonal antibody studies in the Drosophila and Human nervous systems // Abstr. XV Intern. Congr. of Genetics, 1983, - Plenary Symposia. NewDehli, - p.36-37.

52. Booker R., Quinn W. Conditioning of leg position in normal and mutant Drosophila II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, - V.78, - №6, - P.3940-3944.

53. Brostrom C., Huang Y.-Ch., Breckenridge B., Wolff D. Identification of a calcium-binding protein as a calcium-dependent regulator of brain adenylate cyclase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975, - V.72, - №1, - P.64-68.

54. Burnet B., Connolly K. Activity and sexual behaviour in Drosophila melanogasterll In: The Genetics of behaviour (ed. J.H.F. van Abeelen). Amsterdam: North-Holland publ. Co. - 1974. - P.201-258.

55. Burnet B., Burnet L., Connolly K., Wiliamson N. A genetic analysis of locomotor activity in Drosophila melanogaster ll Heredity. 1988. - V.61. - P. 111-119

56. Byers D., Davis R., Kiger J. Defect in the cAMP phosphodiesterase due to the dunce mutation of learning in Drosophila melanogaster II Nature. 1981, - V.289, -P.79-81.

57. Candy D. J. The regulation of locust flight muscle metabolism by octopamine and other compounds // Insect Biochem. 1979. - V.8 - P. 177-181.

58. Chakravarthy B., Morley P., Whitfield J. Ca2+-calmodulin and protein kinase Cs: a hypothetical synthesis of their conflicting convergences on shared substrate domains // Trends Neurosci. -1999, Vol.22-№1 P. 12-16.

59. Chandhari N., Hahn W. Genetic expression in the developing brain // Science. 1983. - V.220. -№4600.-P.924-928

60. Cheung W.Y. calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation // Science. 1980. - V.207. -P. 19-27.

61. Cleveland D., Fisher S., Kirscherer M. Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis.// J. Biol. Chem. 1977 - V.252. - P. 1102-1106.

62. Cobb M., Connolly K., Burnet B. The relationship between locomotor activity and courtship in the melanogaster species sub-group of Drosophila II Anim. Behav. 1987. - V.35. - P.705-713

63. Connolly K.J. Locomotor activity in Drosophila as a function of food deprivation // Nature. -1966a. V.8. -P.224

64. Connolly K.J. Locomotor activity in Drosophila. II. Selection for active and inactive strains // Anim. Behav. 1966b. - V.14. - P.444-449.

65. Connolly K.J. Locomotor activity in Drosophila. III. A distinction betveen activity and reactivity //Anim. Behav. 1967. - V. 15. - P. 149-152.

66. Connolly K.J. The social facilitation of preening behaviour in Drosophila melanogaster.il Anim. Behav. 1968. - V.16 - P.385-391

67. Connolly K.J, Tunnicliff G., and Rick J.T. The effects of gamma-hydroxybutyric acid on spontaneous locomotor activity and dopamine levels in Drosophila melanogaster II Comp. Biochem. Physiol. 1972. - V.40b. - P.321-326.

68. Costa M.R.C., Catterall W.A. Phosphorylation of the subunit of the sodium channel by protein kinase C // Cell, and Mol. Neurobiol. 1984. - V.4. - N3. - P.291-297.

69. Coyle J. T. (rev. by) Brain policy: how the new neuroscience changes our lives and politics.// Nature. 1999. - V.400. - №6742. - P.330.

70. Dagan D., Kaplan W.D., Ikeda K. Analysis of single gene sex linked behavioural mutants in Drosophila melanogaster II Adv. Behav. Biol. 1975. - V.15. -P.321-340.

71. Davis R., Kiger J. Dunce mutants of Drosophila melanogaster. mutants defective in the cyclic AMP phosphodiesterase enzyme system // J. Cell. Biol. 1981. - V.90 - P.101-107.

72. Dijken F.R. van and Sharloo W. Divergent selection on locomotor activity in Drosophila melanogaster. I, Selection response // Behav. Genet. 1979a. - V.9. - P.543-553.

73. Dijken F.R. van and Sharloo W. Divergent selection on locomotor activity in Drosophila melanogaster. II, Test for reproductive isolation betveen selected lines // Behav. Genet. 1979b. - V.9. -P.555-561.

74. Dijken F.R. van, Sambeek M.P.J.W. van and Sharloo W. Divergent selection on locomotor activity in Drosophila melanogaster. Ill, Genetic analysis // Behav. Genet. 1979. - V.9. -P.561-570.

75. Dijken F.R., van, Stolwijk H., Sharloo W. Locomotor activity in Drosophila melanogaster.il Neth. J. Zool. 1987. - V.35. - P.438-454

76. Dudai Y., Jan Y.-N., Byers D., Quinn W., Benzer S. Dunce, a mutant of Drosophila , deficient in learning // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976, - V.73, - №5, - P. 1684-1688.

77. Dudai Y. Behavioural plastisity in a Drosophila mutant dunceDB276 //J. Comp. Physiol. 1979. -V.130.-N3.-P.271-275.

78. Esposito J., Obijesky J., High resolution polyacrylamide gradient gel electrophoresis.// Prep. Biochem., 1976. - V.6. - P.431-442.

79. Evans P.D. Biogenic amuines in the insect nervous sustem // Adv. Insect. Physiol. 1980. V.15. - P.317-322.

80. Evans P.D. Octopamine. // in: Comprehensive insect physiology, biochemistry and pharmacology (Edited by Kerkut G.A. and Gilbert L.I.)- New York> Pergamon press, 1985. - V. 11. - P.499-530.

81. Evans P.D., O'Shea M. An octopaminergic neurone modulates neuromuscular transmission in the locust // Nature, 1978. V.270. - P.257-259.

82. Ewing A. Attempts to select for spontaneous activity in Drosophila .11 Anim. Behav. 1963. -V.ll. -P.369-378.

83. Ewing A. Genetics and activity in Drosophila melanogaster.il Experientia. 1967. - V.23. -P.330-332

84. Feany M.N., Quinn W.G. A neuropeptide gene defined by the Drosophila memory mutant amnesiac. II Science. 1995. - V.268. -P.869-871.

85. Ferrus A. Neurogenetics of Drosophila II Disc. ofNeurosciences 1992. - V.9, №1. - P. 11-55.

86. Fischbach K., Heisenberg M. Structural brain mutant of Drosophila melanogaster with reduced cell number in the medulla cortex and with normal optomotor yaw responce // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, - V.78, - №2, - P. 1105-1109.

87. Fisher S, Peptide mapping in gels.// In: Methods in enzymology. 1983. - V.100, -P.424-430

88. Foster J., Guttman J., Hall L., Rosen O. Drosophila cAMP-dependent protein kinase // J. Biol. Chem. 1984. -V.259, -№21,-P. 13049-13055.

89. Fried G., Nestler E.J., de Cailli P. et. al. Cellular and subcellular localization of protein I in the peripheral nervous system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, - V.77, - №8, - P.2717-2721.

90. Fullilove S., Jacobson A.Emryonic development-descriptive // In: The genetic and biology of Drosophila (Edited by Ashburner M. and Wright T.R.F.). London: Academic Press. - 1978. -V.2c. - P. 106-227.

91. Goldberg N., O'Dile R., Haddlex H. Cyclic AMP // Adv. Cycl. Nucl. Res. 1973. - V.3, -P. 155-224.

92. Hall, J.C. Pleiotropy of behavioural genes.In: Flexiiblity and Constraint in Behavioural Systems (Greenspan, R.J., Kyriacou, C P, eds.) John Wiley and Sons Ltd., 1994. - P. 15-27

93. Hartenstein V., Campos-Ortega J. Early neurogenesis in wild-type Drosophila melanogaster II Roux's Arch. Dev. Biol. 1984. - v. 193, - P.308-325.

94. Hathaway D R., Adelstein R.S., Klee C.B. Interaction of calmodulin with alyosin light chain kinase and cAMP-dependent protein kinase in bovine brain // J. Biol. Chem. 1981. - V.256, №15, - P.8183-8189.

95. Hay D.A. Genetical and maternal determinants of the activity and preening behaviour of Drosophila melanogaster II Heredity 1972. - V.28. - P.311-336.

96. Hay D.A. Effects of genetic variation and culture conditions on the social behaviour of Drosophila melanogaster.il Behav. Genet. 1973. - V.3. - P. 107-120

97. Hemmings H., Greengard P., Tung H.Y. et.al. Dar pp-32, a dopamine-regulated neuronal phosphoprotein, is a potent inhibitor of protein phosphatase-1 // Nature. 1984. - V.310. -N5977. - P.503-505.

98. Hertweck H. Anatomie und Variabilitat des Nervensystem und der Sinnesorganne von Drosophila melanogaster (Meigen) // Z. wiss. Zool. 1931. - V.139. -p.559-663.

99. Hidon O., Fukami J. Presynaptic modulation by octopamine at a single neuromuscular junction in the mealworm (Tenebrio molitor) I I J. Neurobiol. 1987. V.18. - P.315-326.

100. Hilifiker S., Schweizer F.E., Hung-Teh K., Czernik A.J., Greengard P., Augustine G.J. Two sites of action for synapsin domain E in regulating neurotransmitter release // Nature neuroscince 1998 May - V. 1 - № 1 -P.29.

101. Hinke W. Das relative postembryonal Wachstum der Hirntaile von Culex pipiens Driosophila Mutanten // Z. Morphol. Okol. Tiere. 1961. - V.50. - P.81-118.

102. Hotta Y., Benzer S., Abnormal electeroretinograms in visual mutants of Drosophila II Nature -1969. V.222. - P.354-356.

103. Hoyle G. Neuromuscular transmission in a primitive insect: Modulation by octopamine and catch-like tension // Comp. Biochem. Physiol. 1984. V.77C. - P.219-232.

104. Ikeda K., Kaplan W. Neurophysiological genetics in Drosophila melanogaster II Am. Zool. -1974. -V. 14. P. 1055- 1066.

105. Jacobs M.E. Influense of beta-alanine on mating and territorializm in Drosophila melanogaster.il Behav. Genet. 1978. - V.8. - P.487-502

106. Jorgensen O. Polypeptides of the synaptic membrane antigens Dl, D2 and D3. // Biochem. Biophys. Acta. 1979. - V.583. - P. 153-162.

107. Kamyshev N.G., Smirnova G.P., Sawsteeva E.V., Medredera A.V., and Ponomarenko V.V. The influence of serotonin and p-chlorphenilalanine on locomotor actiivty of Drosophila melanogaster II Pharmacol. Biochem. Behav. 1983. - V.18. -P.677-681.

108. Kankel D.R., Hall J.C. The structure and development of the nervous system // Dev. Biol. -1976.-V.48.-P.l-24.

109. Kelly L. The regulation of phosphiorilation in synaptosomal fractions from Drosophila heads: the role of cyclic adenosine monophosphate and calcium/calmodulin // Com. Biochem. Physiol. -1981.-V.69,-P.61-67.

110. Kennedy M.B., Greengard P. Two calcium/calmodullin-dependent protein kinases, which are highly concentrated in brain, phosphorylate protein I at distinct sites. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981 -V. 78 - N 2 - P.1293-1297.

111. Kim J.H., Huganir R.L. Organization and regulation of proteins at synapses // Current Opinion in Cell Biology 1999. - V.l 1 - P.248-254.

112. Klemm N. Histochemistry of putative transmitter substances in the insect brain // Progr. in Neurobiology. 1976. -V.l.- part 2. - P.99-170.

113. Kovac L., Peterajova E., Pogady J. Drosophila melanogaster, a new subject in research on behaviour and pharmacology.// Agressiologie. 1979 - V.20D. - P.239-244

114. Knust E., Vassin H., Dietrich U. et. al. Genetics of neurogenesis. // In: Abstrs. Ixth Eur. Dros. Res. Conf., 1985, Hungary, Szeged., p.63.

115. Kuriacou, C.P., Hall, J.C. Genetic and molecular analysis of Drosophila behaviour.// Adv. Genet. 1994. - V.31. - P. 139-186

116. Laemmli. U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. 1970 - V.227. - P.680-685

117. Laurell C.B. Quantitative etstimation of protein by electrophoresis in agarose gel containing antibodies.// Analyt. Biochem. 1966. - V.15, №1. - P.45-49

118. Lendahl U. A growing family of Notch ligands // BioEssays 1998. - V.20. - P. 103-107.

119. Levy L., Ganguly R., Ganguly M., Manning J. The selection, expression and organisation of a Set of Head-Specific Genes in Drosophila II Dev. Biol. 1982. - V.94. - P.451-462.

120. Levy L., Manning J. The expression of a Set of Head-Specific Genes in the development of Drosophila II Dev. Biol. 1982. - V.94. - P.465-476.

121. Liu L., Wolf R., Ernst R. & Heisenberg M. Context generalization in Drosophila visual learning requires the mushroom bodies.// Nature. 1999. - V.400. - №6746. - P.753-756

122. Livingstone M., Sziber P., Quinn W. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga Drosophila learning mutant // Cell. 1984. - V.40, - P. 599-607.

123. Lohmann S.M., DeCamilli P., Einig J., Walter V. High affinity binding of the regulatory subunit (Rn) of cAMP-dependent protein kinase to microtubule-asssociated and other cellular proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, V.81, №21, P.6723-6727.

124. Luchnicova E.M., Borissow G.W. genetical analysis of the differences in locomotion activity within some lines of Drosophila melanogaster II In: Abstr. of papers XH-th Intern. Congr. of Enthomol. 1968. - Moscow. - P. 153.

125. Malamud J.G., Mzisin A.P., Josephson R.K. The effects of octopamine on contraction kinetics and power output of a locust flight muscle // J. Сотр. Physiol. A. 1988. v. 162. - P.827-835.

126. Manning A. The efects of artificial selection for mating speed in Drosophila melanogaster И Anim. Behav. 1961. - V.9. - P.82-92.

127. Manning A. selection for mationg speed in Drosophila melanogaster based on the behaviour of the sex//Anim. Behav. 1963. - V.ll. - P.116-120.

128. Menzel R. & Giurfa M. Cognition by a mini brain.// Nature. 1999. - V.400. - №6746. -P.718-719.

129. Meechan M.J., Wilson R. Locomotor activity in the Tyr-1 mutant of Drosophila melanogaster 11 Behav. Genet. 1987. - V.17. - P.503-512.

130. Mercer A.R., Menzell R. The effects of biogenic amines on conditioned and unconditioned responses to olfactory stimuli in the honeybee, Apis melleria II J. Comp. Physiol. 1982. V. 145.- P.363-368.

131. Milde J.J., Ziegler R., Wallstein M. Adipokinetic hormone stimulates neurones in the insect central nervous system // J. Exp. Biol. 1995. V.198. - P. 1307-1311.

132. Miller A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster II In: «Biology of Drosophila » (M. Demerec, ed ). New York: Wiley and Sons. - 1950. - P.481-498.

133. Miller S., Kennedy M B. regulation of brain type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase by autophosphorylation: a Ca2+-triggered molecular swith // Cell. 1986. - V.44. - №6. - P.861-870.

134. Myat M.M., Chang S., Rodriguez-Boulan E., Aderem A. Identification of the basolateral targeting determinant of a peripheral membrane protein, MacMARCKS, in polarized cells // Curr. Biol. -1998 Jun 4 8(12) - P.677-683.

135. Nagle K.J., Bell W.J. Genetic control of the search tactic of Drosophila melanogaster. an ethometric analysis of rover/sitter traits in adult flies // Behav. Genetics. 1987 - V.17. - N4. -P.110.

136. Nairn A., Hemmings H., Greengard P., Protein kinases in the brain // In: Ann. Res. of Biochem. 1985, V.54, P.931-976. Paolo Alto, California.

137. Pak W., Grossfield J., White N. nonphototactic mutants in a study of vision of Drosophila // Nature 1969. - V.222.-P.351-354.

138. Pitman R.M. Transmitter substances in insects: a review // Comp. Gen. Pharm. 1971. - V.2. -P.347-371.

139. Poulson D.F. and Boell E.J. The development of cholinesterase activity in embryos of normal and genetically deficient strains of Drosophila melanogaster II Anat. Record. 1946a. - V.96. -P.508.

140. Poulson D.F. and Boell E.J. A comparative study of cholinesterase activity in normal and genetically deficient strains of Drosophila melanogaster IIBiol. Bull. 1946b. - V.91. - P.228.

141. Power M.E. The structure and development of the nervous system // In: «The Genetics and Biology of Drosophila » (Ashburner M. and Wright T.R.F., eds ). London: Plenum Press. -1980. - V.2d. -P.295-368.

142. Qui Y., Davis R.L., Genetic dissection of the learning / Memory gene dunce of Drosophila melanogaster .11 Genes Dev. 1993. - V.7 - P. 1447-1458.

143. Quinn W., Dudai Y. Memory phases in Drosophila //Nature. 1976. - V.262, - P.576-577.

144. Rakis P. Discriminating migrations.// Nature. 1999. - V.400. - №6742. - P.315-316.

145. Robinson P. Neuronal protein phosphorylation, unconventional biology // Cell. 1985. - V.42, №3, - P.703.

146. Robinson P., Liu J.-P., Wen Chen, Wenzel Th. Activation of protein kinase C in vitro and in intact cells or synaptosomas determined by acetic acid extraction of MARCKS. // Analit. Biochem., 1993, V.210, P. 172-178.

147. Sakai K., Narise T., Hiraizumi Y., Iyama S. Studies on competition in plants and animals. IX. Experimental studies on migration in Drosophila melanogaster.il Evolution. 1958. - V.12. -P.93-101

148. Sarkar D., Erlichman J., Rubin C.S. Identification of a calmodulin-binding protein that co-purifies with the regulatory subunit of brain protein kinase II. // J.Biol. Chem., 1984, V.259, № 15, P.9840-9846.

149. Sawateeva E.V., Kamyshev N.G. Behavioural effects of temperature sensitive mutations, affecting metabolism of cAMP in Drosophila melanogaster II Pharmac. Biochem. Behav., 1981, V. 14, P.603-611.

150. Sawateeva E.V., Peresleny G.V., Granushina V. et. al. Expression of adenylate cyclase and phosphodiesterase in development of temperature sensitive mutants with metabolism of cAMP in Drosophila melanogaster II Develop. Genet., 1985, V.5, P.157-172.

151. Schenk P.W., Snaar-Jagalska B E. Signal perception and transduction, the role of protein kinases // Biochimica et Biophysica Acta 1999. - V. 1449. - P. 1-24.

152. Shi Y., Sullivan S.K., Pitterle D M, Kennington E.A., Graff J.M., Blackshear P.J. Mechanisms of MARCKS gene activation during Xenopus development // J. Biol. Chem. 1997 Nov. 14 -V.272 - № 46 - P.29290-29300.

153. Siddigi O. Neurogenetic analysis of olfaction in Drosophila II In Abstr. XV Int. Congr. Genet., New Dehli, 1983, P.41-42.

154. Siddigi O. Neurogenesis of olfaction in Drosophila melanogaster II Trends Genet., 1987, V.3, № 5, P. 137-142.

155. Simpson P. Notch signalling in development: on equivalence groups and asymmetric developmental potential // Current Opinion in Genetics & Development 1997. - V. 7. - P.537-542.

156. Shrimpton A.E., , Robertson A. The isolation of polygenic factors controlling bristle score in Drosophila melanogaster. I. Allocation of third chromosome sections // Genetics. 1988, V.l 18. - P.447-443.

157. Snodgrass R E. Principles of Insect Morphology // McGraw-Hill, New York. 1935. - ljht. no: Biology of Drosophila (ed. Demerec M). - New York: Wiley and Sons. - 1950. - P.481-498.

158. Sokolowski M B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster. a chromosomal analysis // Behav. Genetics. 1980. - V.10. -N3. -P.291-302.

159. Sokolovski MB. Gnetics and ecology of Drosophila melanogaster larval foraging and pupation behaviour // J. Insect. Physiol. 1985. - V.31. - P.857-864.

160. Sokolovski M.B. Genes for Normal Behavioral Variation: Recent Clues from Flies and Worms // Neuron 1998, Vol. 21, P. 463-466.

161. Sokolovski MB. and de Belle J.S. Behaviour-genetic analysis of the foraging locus in Drosophila II Behav. Genet. 1990. - V.20. - N6. - P.747.

162. Strauss R., Heisenberg M. A higer control center of locomotor behaviour in the Drosophila brain//J. ofNeuroscience. 1993. - V.13. - № 5. - P.1852-1861.

163. Sutherland E.W., Rail T.W., Menon T. Adenyl Cyclase. Distribution, preparation and properties // J. Biol. Chem., 1962, V.237, № 4, P. 1220-1227.

164. Tanouye M., Ferrus A., Fujita Sh. Abnormal action potentials associated with the shaker complex locus of Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, V.78, № 10, P. 6548-6552.

165. Thelen M., Rosen A, Nairn A., Aderem A. MARCKS phosphorilation/ dephosphorilation and its functions. //Nature. 1991. - V.351. - P.320-322.

166. Theur Kauf Yallee R.B. Molecular characterisationof the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2 // J. Biochem. 1982. - V.257, - №6. - P.3284-3290.

167. Tomlinson A. The cellular dynamics of pattern formation of the eye of Drosophila II J. Embriol. Exp. Morphol., 1985, V. 89, P. 313-331.

168. Tully T., Boyton S., Brandes C. et. al. Genetic dissection of memory formation in Drosophila melanogaster. II Cold Spring Harbor symp. Quant. Biol. 1990. - V.55. - P.203-211.

169. Tully T., Preat T., Boyton S.C., Del Vecchio M. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila . II Cell. 1994. - V.79. - P.35-47.

170. Tunnicliff G., Rick J.T., Connoly K. Locomotor activity in Drosophila . V. A comparative biochemical study of selectively bred population // Comp. biochem. Physiol. 1969. - V.29. -P. 1239-1245.

171. Vesterberg O. Staining of protein zones after isoelectric focusing in polyacrilamide gels.// Biochem. Acta, 1971. - V.243. - P.345.

172. Vulliet PR., Langan T.A., Weiner N. Tyrosine hydroxylase: a sabstrate of cyclic AMP-dependent protein kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, V.77, № 1, P.92-96.

173. Walaas S.I., Aswad D.W., Greengard P. A dopamine and cyclic AMP-regulated phosphoprotein enriched in dopamine-innervates brain regions // Nature, 1983, V.301, № 5895, P. 69-71.106

174. Wang J, Renger JJ, Griffith LC, Greenspan RJ, Wu CF Concomitant alterations of physiological and developmental plasticity in Drosophila CaM kinase II-inhibited synapses.// Neuron 1994 Dec;13(6): 1373-1384.

175. White K. Defective neural development in Drosophila melanogaster embryos deficient for the tip of the X chromosome // Develop. Biol., 1980, V. 80, № 2, P. 332-334.

176. Wilson R, Burnet B., Eastwood L., and Connolly K. Behavioural pleiotropy of the yellow gene in Drosophila melanogaster II Genet. Res. 1976. - V.28. - P.75-88.

177. Wu W., Walaas S., Nairn A., Greengard P. Calcium/phospholipid regulates phosphorilation of a Mr «87k» substrate protein in brain synaptosomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, - V.79, - P.5249-5253.

178. Wu W., Wong K., Chen J.-H., Jiang Z.-H., Dupuis S., Wu J.Y. & Rao Y. Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit.// Nature. 1999. - V.400. -№6742.-P.331-336.

179. Yamanaka M., Kelly L. A calcium/calmodulin-dependent cyclic adenosinemonophosphate phosphodiesterase from Drosophila heads // Biochem. Biophys. Acta., 1981, V. 674, P. 277286.

180. Yin J.C.P., Wallach J.S., Del Vecchio M. et. al. Induction of a dominant negative CREB trasgene specifically blocks long-term memory in Drosophila. II Cell. 1994. - V.79. - P.49-58.

181. DeZazzo J., Tully T. Dissection of memory formation: From behavioural pharmacology to molecular genetics // Trends Neurosci. 1995. - V.18. - P.212-218.

182. Zhao D., Hollenberg M.D., Severson D.L. Mol. Cell. Biohcem. 1992. - V.l 18. -N2. -P.163-169.1. От автора:

183. Автор благодарит научного руководителя д.б.н. Евгения Иннокентьевича Каракина за помощь и поддержку при проведении представленной работы.

184. Особенно хочется поблагодарить д.б.н. Дагмару Павловну Фурман, д.б.н. Елену Сергеевну Беляеву за неоценимую помощь в работе по подготовке рукописи и огромную моральную поддержку.

185. Я искренне благодарна д.б.н. Любови Антоновне Васильевой за ценные замечания, высказанные при чтении рукописи данной работы.

186. Особую благодарность мне хотелось бы выразить д.б.н.кафедра генетики и селекции СПбГУ, внимание к моей работе и моральную поддержку.

187. Я очень признательна д.б.н. Н.Г. Камышеву (лаб. сравнительной генетики поведения Ин-та Физиологии им. И.П. Павлова, Санкт-Петербург) за предоставленные линии мух, различающиеся по уровню двигательной активности.

188. Я бесконечно благодарна моим близким, родителям, мужу, дочке Машеньке за неоценимую помощь и терпение, сочувствие и поддержку.

189. Леониду Зиновьевичу Кайданову Санкт-Петербург) за постоянное