Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование регуляции тканеспецифической экспрессии гена est S у дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дзитоева, Светлана Григорьевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК-

^.т тт гпт д гпгр ■птд.л "г) Т\ С? "р.у^Т

на правах.рукописи

"ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНА езСЗ У ДРОЗОФИЛЫ".

03.00.15 - генетика Диссертация на соискание учёной степени

Научные руководители: д.м.н. Корочкин Л.И. к.б.н. Сергеев П.В.

МОСКВА-19 96

ОГЛАВЛЕНИЕ !. В1ЦДЕНИЕ......................................................................

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................

2.1. йзоферменты эсхеразы у разных видов ОгозорЬйа.

22. а-Снецнфнческне эсте^азы..........................................

2.3. р- Сиецнфнчесжне зсгераж.........................................

.2.4. Р - элемент трансформационные вектора.................

3. МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ........................................

3.1. Оборудование................................................................

32. Реактивы а ферменты...................................................

3.3. Методы исследования..................................................

4. РЕЗУЛЬТАТЫ" И ОБСУЖДЕНИЕ............................

5. ВЫВОДЫ.......................................................................

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................

1. ВВЗЗДШШ

Изучение регуляции экспрессии генов остаётся одной из сложнейших задач современной молекулярной биологии» Исследования последних лет показали,, что практически все ¡пены эукариот имеют довольно сложную структуру, обуславливающие их правильную временную и тканеспецифическую экспрессию, а так же характер этом экспрессии» Регуляторная часть гена, которая обеспечивает его работу, в большинстве случаев находится б области, расположенной перед точкой начала транскрипции и имеет размеры от нескольких кЬ до нескольких сотен к:Ь» Эта регуляторная часть может включать в себя модуляторы транскрипции - сайленсеры и зннансеры, последовательности ДНК, с которыми связываются транс-регулаторные белки. Можно говорить лишь об общих закономерностях регуляции экспрессии, поскольку разнообразие специфики генов предполагает множество механизмов настройки их точного действия.

Удобной моделью для исследования регуляции экспрессии тканеспецифическнх генов оказались гомологичные системы р-

эстеразных пенов D.virilis и D.aelanogaster. У различных видов Droaophila выявлено семейство естеразных генов, которые можно подразделть на ткане спе цифиче сжие или видоспецифические и "house-keeping" пены ( Иващенко, 1985 ). Экспрессия тканеспецифических генов эстеразы довольно подробно исследована в репродуктивной системе самцов Drosophila группы vi Ellis и Drosophiia группы melanogaster., Структурные гены ©стеразы 5{езс5) D. vir.il.is и эстеразы 6(est6) D„melanogaster гомологичны на 50% по аминокислотному составу.Продукты этих двух генов относятся к классу р - к ар 6 о к. с и л "3 с т е р а з { Richmond, 1990, Тамармна, 1991 ). Как было показано для D.melanogaster, ген est6 экспре соируе тся в семя выносящем протоке и вместе с семенной жидкостью, в которой присутствует эфир цмс~ вакцинилацетат, передаётся в половые пути самки» EST-6 расщепляет данный эфир до аверсивного феромона { Richaiond, Senior, 1981 ) » Предполагают, что EST--S D»vie±li3 выполняет ту же функцию( Korochtein, 1980). Однако, эти два гомологичных по функции и составу генных продукта отличаются высоким уровнем тканеспецифичности.В отличие от ез£б, который экспрессируе тся в семявыносящем протоке,

езйЗ экснрессируется в семявьшосящей луковице { КогосЬк±п, 1976}.

Данное различие в тканеспецифичности ненов езъб и езсЗ послужило удобной моделью для исследования молекулярно-генетических факторов , которые влияют на экспрессию в одной тканзи и отсутствие в другой,

В связи с вышеизложенным, каждое исследование, которое касается механизма регуляции генной активности, представляет большой интерес в сфере упорядочивания имеющихся знаний и поиска новых решений данной проблемы.

Целью настоящей работы было исследование регуляции тканеспецифической экспрессии гена езг,3

Исходя из этого, конкретные задачи настоящего исследования состояли в следующем:

1.Создание молекулярно-генетических конструкций с кодирующей последовательностью гена езъЗ и делеционными фрагментами 5®регуляторной последовательности данного те река в составе векторов рСаБреК т рСайреа!.

2.Получение линий трансгенных мух D.melanogaзter, в геном которых интегрировали исследуемые последовательности ДНК в составе трансформационных векторов.

3«Анализ тренере иных мух О.теХаподааЬег методами классической и молекулярной генетики»

г . ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2,1. Мзофйрмйнты эстеразы у разж! видов ВговорЫХа.

Актуальными задачами биологии развития являются вопросы,. которые касаются механизмов работы гена и контроля генотипом процессов биосинтеза, клеточной физиологии, метаболизма и морфогенеза.. Каким образом продукты биосинтеза влияют на активность генов? Все вопросы, которые встают перед биологией развития, очень тесно переплетаются с фундаментальной проблемой общей генетики - проблемой молекулярных механизмов регуляции активности генов, и в первую очередь тканеспецифических генов, от функционирования которых зависит всё многообразие клеточного и тканевого состава развивающегося многоклеточного организма (Корочкин Л.И. 3.986). Среди тканеспецмфическмх генов встречаются такие, которые

кодируют гдзоферменты. По характеру генетического контроля выделяются две группы изоферментов : 1) контролируемые серией множественных аллелей? 2) контролируемые неаллельными генами (Корочкии. 1984}. Обычно изоферменты отличаются по своей подвижности в электрическом поле и могут быть легко разделены с помощью электрофореза в полиакриламидном , агарозном , крахмальном гелях с последующей специфической гистохимической окраской соответствующих блоков (Wilkinson, 1968, Mauser, 1971). Корочкин и его соавторы описали систему генов , контролирующих экспрессию изоферментов эстеразы у D.virilis , межвидовые различия которых строго детерминируется как состоянии структурных генов, так и их генотипическим окружением { Корочкин, 1984 ). Ими таете было показано наличие а- и {3-эстераз.

Анализ спектра изоферментов эстеразы у 1? видов Urosophila , принадлежащих к разным подгруппам рода и находящихся на разных ступенях эволюционного древа, показал, что у видов , сохранивших наибольшее сходство с предполагаемыми предковыми формами (D.lebanonensis , подрод Pholadoris / D.bussakii , подрод Dorsilopha ) , этот

спектр мало изменяется в коле онтогенеза . Виды , занимающие боле высокое таксономическое положение , характеризуются специфическим "набором" эстераз на каждой стадии развития . При ©том , в подродах Pholadoris и Drosophila из трёх типов ß - специфических эстераз (стадиеспецифическая , так называемая куколочиая. ( Р ) эстераза м специфичная для имаго "главная" ß ■•■• зстераза ) обнаруживается только стадиеспецифическая Р - эстераза,. Специфический для гениталий вариант ß ~ эстеразы , так называемая медленная ( S ) эстераза, проявляется только в подроде Drosophila (Корочкин,1901,Korochkin,1973) .

Изоферменты с узкой субстратной специфичностью {ацетилхолинэстераза, Р -зстераза) у всех изученных видов слабо варьируют по электрофоретической подвижности и числу фракций . Изоферменты с широкой субстратной специфичностью { а - эстеразы ) обладают выраженной изменчивостью по числу фракций , активности ш эле ктрофоретиче ской

подвижности отдельных фракций. На основе этих данных было сделано заключение о малой вариабельности ферментов , принимающих участие в важных метаболических процессах{Корочкин,1981,Korochkin, 1974).

2.2. ш--(Гао1дефичес;кя№ зетеразы.

а ~ Специфические эстеразы являются продуктом типичных house - keeping генов и обнаруживаются практически во веек органах и на всех стадиях развития. Соотношение разных изоферментов и фракций а - ©стеразы в разных органах практически не отличается у разных видов Drosophila (Иващенко, 1985) . Были выявлены и локализованы во второй хромосоме три гена ,кодирующих р-эстеразы (Корочкин, 1982) .

2.3. Рг" Специфические эстеразы.

р - Эстеразный кластер. р - Специфические эстеразы биохимически были охарактеризованы у представителей группы virilia , repleta , melanogaster и obscura (Richmond,1980,1990,Тамарина,1991).

p - Эстераза является гомодимером от 100 до 140 кДа у большинства исследованных видов. У трёх видов она представлена как мономерной фракцией так и дммериой ,

весом 50-70 «Да. К числу ©тих трёх видов относится. В.те1ап.одазг,ег . У группы оЬзсига наблюдается димерная форма фермента , однако встречаются и мономерные варианты { Тамарина, 1991, КогосЬк1пг 1978, 1980 ) . С помощью биохимических и иммунологических исследований было сделано предположение , что мажорные р. - изозимы различного происхождения ортологичны друг другу.

В отличие от а - энзимов , некоторое чёткое эволюционное различие наблюдается при сравнении стадие- и тканераспределения мажорных р. -- специфичных энзимов у исследованных видов . Этот фермент обнаруживается в гемолимфе всех исследованных видов , а некоторые дополнительные места экспрессии филогенетически

ограничены . Это -- экспрессия в ре продуктивной системе самцов некоторых видов '0 „ те 1агюд аз ие г и экспрессия в глазах у О.рзеискюЬзсига (МогСоп, 1985} . Ез 6 у О.теХаподаз-сег экспрессируется в гемолимфе самцов и самок ж в репродуктивной системе самцов . Молекулярный анализ показывает , что ген ЕзГ,-~6 располагается в 5 * области от тандемно расположенной пары эстеразных последовательностей разделенных 200 н.п. ( РасЬтопс!, 1980, Успенский, 1988,

Ludvig, 1993 )« Аминокислотная последовательность белков, кодируемых этими двумя г-енми на 591 идентична.

Геномный фрагмент, длиной 12 т.к.п., содержащий три эстеразные последовательности , был выделен у D.pseudoofoscura , используя est 6 как зонд . Гомология по аминокислотному составу белков, кодируемых этими треда предполагаемыми генами составляет 65-80% , а идентичность с двумя генными продуктами D., melanogaster составляет 6170% » Центральный ген ортологичен гену est6 и кодирует мажорную ii-ветерану гемолимфы (Brady, 1990) »

С помощью классического генетического анализа у D. vi ri lis был выявлен кластер трёх {5-эстеразных генов, кодирующих: мажорный фермент гемолимфы, наиболее медленно мигрирующую форму, главным образом s к с пр е с с и рующуюся в репродуктивной системе самцов, и наиболее "быструю" фракцию, главным образом экспрессирухяцуюся в куколке ( Мващенко , 1985 , Корочкин,1981). Клон, размером 15т.н.п., содержащий два из трех этих генов, был выделен и клонирован (Yenifcolopov, 1993 ). Анализ нуклеотидной последовательности позволил предположить наличие двух эстеразных генов в этом клоне, разделенных спейсером

500н.п., в то время как анализ генома по Саузерну показывает наличие третьего гена вблизи от этого 15т.н.п. клона. Продукты этик двух клонированных генов на 50% идентичны продуктам гомологичных генов D. melanogaster и D „ obscura (Ениколопов, 1989). Как показали последние исследования, фрагмент с 5*конца клонированного участка кодирует фермент репродуктивной системы самцов, а с 3 * конца находится геи, кодирующий фермент гемолимфы (Ениколопов, 1989, Sergeev, 1993,) .

С помощью классического генетического анализа был обнаружен у D. mo;} avenais (группа repleta) кластер двух генов. Один кодирует ß--эстеразу гемолимфы, а другой - её медленно мигрирующий изозим поздней личиночной стадии с а-и р- специфичным полиморфизмом « У нескольких видов группы repleta проявляется медленно мигрирующая мзоформа ß-эстеразы в репродуктивной системе (Oakeshott, 1993) Используя est-6 D.melanogaster как зонд, East , Graham и ¥hilington (1990) клонировали 16 т.н.п. геномный фрагмент D.buzzatii, который содержит три эстеразоподобных гена. Анализ нуклеотидной последовательности двух генов показал большое сходство с другими, уже известными, эстеразными

генами - около 60% гомологии по аминокислотным последовательностях'!,. Аналогично многим эстеравам эстеразные изозимы В.Ьиааа1^!! активны в гемолимфе на поздней личиночной стадии и в репродуктивной системе самцов, что говорит о большом эволюционном сродстве эстеразных генных кластеров у ОгозорЬИа (ОакезЬоси, 1993) .

Медленная специфичная З-эстераза является органспецифичной у различных видов ВгозорЬИа группы vir.il.i3 и обнаруживается в клетках секреторного эпителия семявыносящих луковиц самцов» Этот изофермент представлен обычно одной фракцией, у некоторых наблюдается две фракции. Молекулярно-генетический анализ гена ез£5 показал, что он достаточно консервативен и схож с ее^б 0 „ гае Хап.ос; аз 1;е г (КогоеЬк±п, 1990, Ениколопов, 1989) „ Ген егзъЗ сотоит из.двух экзонов, разделенных коротким интроном в 59н.п. Белок состоит из 549 аминокислот /1626н„п/„ Геи полностью отсеквенирован { Сергеев, 1992, Зегдее\', 1993), обнаружен активный центр, сайты гликозилирования, два типичных элемента эукариотического ТАТА-бокса находятся й положении 64 и 41н.п. "ирзъгевю" от кодова АТС--инициации трансляции. Б ~ эстераза синтезируется автономно в

семя выносящих луковицах, что было показано путём трансплантаций имагинальных дисков от самцов личинок D.montana и D.littoralis в куколки D.virilis:

электрофоретическая подвижность 5-эстеразы,

синтезированной в семя выносящих луковицах, развившихся из имплантанта, соответствует донору { Ко г och ¡ein, 1976). Транскрипт гена estS, размером 1,9kb появляется в семявыносящих луковицах на третий день после вылета имаго (Ениколопов, 1989, Korochkrin, .1978 ) * С помощью иммуногистохимической окраски было показано, что синтез 5-эстеразы начинается одновременно во всех эпителиальных клетках органа и экскретируется в просвет железы. В то же самое время, в секреторных клетках дифференцируется эндоплазматиче ский ретикулум и митохондриальные структуры { Асонова, 1978 ). Эксперименты по трансплантации имагинальных дисков от личинок разного возраста окукливающимся реципиентам с последующим

электрофоретическим анализом спектра изоферментов эстеразы в семявъшосящих луковицах, сформировавшихся . из ткани трансплантанта, позволили прийти к заключению, что секреторные клетки детерминируются к синтезу

тканеспецифического изофермента эстеразы между 10 и :12ч после второй линьки (йващенко, 1985, Корочкин, 1987, Кузин, 1975 }.Сходные данные были получены при изучении времени детерминации к синтезу гомологичной эстеразы D.Hielanogaster Est-6, которая экспрессируется в семявыносящих протоках (Кузин,1975)» Было показано (Richmond, Senior,1981), что EST-6 вместе с семенной жидкостью, в которой содержится эфир цис-вакцинилацетат, синтезируемый в семявыносящей луковице (Buttervorth,1969), передаётся в половые пути самки. EST-6 энзим расщепляет данный эфир до аверсивного феромона

(Richmond,Senior,1981). Предполагают, что EST-S энзим D,,virill.з выполняет ту же функцию (Korochkin, 1980) .

У самцов дрозофилы,кроме (^-специфической эстеразы, обнаружен тканеспецифический маркёр (PEB-protein), который охарактеризован как главный белок семявыносящих луковиц (Ludwig, 1991) « В группе vir.il.is он идентичен р-специфической 5-эстеразе, которая экспрессируется в семявыносящих луковицах всех 12 видов D»virilia, а также у D.repleta. У Dposophila группы hydei тканеспецифичность в экспрессии 5~эстеразы утрачивается, и она обнаруживается в

различных органах как самцов, так и самок m на разных стадиях личиночного развития ( Иващенко, 1985 ) . Высокий уровень активности р~специфической эстеразы-б

обнаруживается в семя выносящих протоках самцов группы meXanogaster (Аронгатам, 1974, Korochkin, 1974, Richmond, 1980, Успенский, 1988)« Высокая концентрация РЁВ-белка обнаруживается в семявыносящих луковицах мух этих видов. Эстераза-6 (гомолог S-эстеразы) отсутствует в репродуктивной системе Drosophila группы yakuba,а главный, родственный РЕВ-белок, содержится в семявыносящих луковицах этих видов. D.yacuba и D.pseudoobscura характеризуются отсутствием специфической эстеразы в репродуктивной системе и наличием тканеспецифического РЕВрзе-белка (Lucivig, 1991, Korochkin, 1990). Исследование молекулярно-генетических механизмов, которые определяют межвидовые различия тканеспецифических белков, позволило выявить у D.melanogaster четыре независимо действующих ре гуляторных участка, приле гащих к гену est6. Они направляют экспрессию 1ас'Л у трансгекных мух: 1) в семявыносящих протоках, 2) в слюнных железах imago, 3)в респираторной системе, максиллярных пальпах, антеннах и

префронтальной области, 4) в семявыносящих луковицах и префронтальной области. У некоторых транс - формированных линий была также найдена близкая к началу транскрипции область, индуцировавшая синтез бактериальной галактозидазы в кардии и преджелудке (ЬисЬгхд, 1993 ) .

Остается нерешенным вопрос, почему тканеспецифический эстеразный ген активируется именно в данной ткани.Реруляторные элементы,искуственное внедрение которых обусловливало необычную регионализацию его функций, присутствуют во всех тканях, однако "сраба-тывает" только тот, который определяет появление изофермента в семя выносящих протоках у ОлаеХаподазсег (Корочкин, 1995).

2.4. Р-эленент трансформационные вектора

Р-элемент зависимая трансформация. ( Кагезз Я., 1984 ) даёт возможность отчасти дать ответ на этот вопрос, используя тот факт, что у разных видов 0созорЫ1а пространственная, специфичность экспрессии гомологичных генов различается. Использование Р-зависимых

трансформационных элементов как векторов для внедрения

спеiщфжческик сегментов ДНК в зародышевую линию Dro