Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование регуляции тканеспецифической экспрессии гена ests у дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование регуляции тканеспецифической экспрессии гена ests у дрозофилы"

РГ6 ОД

1 ^ НОЙ ^95

рдн

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ.РАЗВИТИЯ.

На правах рукописи

Дзитоева Светлана Григорьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ТКДН2СПЕЦИ4ИЧВСК0Й ЭКСПРЕССИИ Г2НА вз13 У ДРОЗОФИЛЫ.

03.00.15. геяеаиха

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена, а лаборатории нейрогенетики генетики развития Института биологии гена РАН

Научные руководители:

чл-корр РАН, д.м.н., проф. Л.И.Корочкин, ,кандидат биологических наук Сергеев П.В.

„Официальный.оппоненты: ..

доктор биологических наук А.И.Иванов, хэядада® биологичесзсях наук Т.П. Тихомирова

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН -

зя" . .1996 года в

защита состоится" .<.. * У.. .1996 года в ". "час. яа заседании специализированного учёного совета Д002.85.01 по по зазрите диссертаций яа соискание учёной степени доктора наук яри Институте биолог:« развития им. Н.К.Кольцова SAH{117334,Москва, ул.Вавилова., 26) 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека Института, биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН..

Автореферат разослан'

Учёный секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Е.М.Протопопова

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. Изучение регуляции экспрессии генов остаётся одной из слоздаейшизс задач современной молекулярной биологии. Исследования---' -последних лет показали,- что практически- . зса гена эукарист- имеют : довольно сложную структуру,, обусловллвазакуто особенности их временной и пространственной экспрессии. Регуляторная часть гена, которая ооеспечиваео его работу, а большинстве случаеэ находится э области, расположенной перед точкой начала сраксхригции и имеет размеры о» нескольких. ЗсЬ до нескольких сотен кЬ. Зта регуяягоряая часть мсгет зялючавг» в себя модуляторы транскрипции -салленоорьг и энхансеры, посл^йозатол^лости ДНК, с которыми сзязггаазса-ся транс-регуляаорнна белки. Можно говорить лява» об оогвдх эахонсмзряостях регуляции экспрессии.. поскольку разнообразие специфики генов предполагает множество механизмов настройки их точного действия.

Удобной модель» длл исследования рагуляг^ы экспрессии тканеспгшпфичасклх г-2нэз оказались гомологичные системы •З-эстеразних геноа О.Ч'1г11^з л О . гг.<э1аподазЬег. У различных видов 0гоэсрЫ1а выявлено семейство эстеразных генов, ■ потерне можно подразделить на тг.лноспэцифичесхие или зидсспецифлческие >; " лоизе-'-саартд'' гены {Корсчхин,1Э35). -Экспрессия' тканаспецяфггческих геяоз эсюразгг дезольно подробно г.1следозана в репродуктивной системе самцоз ОгогерЬхХа группы и'0гозорЬ11а

группы глеХаг.сдазЪег. Структурные гены эстеразы 3" (езДО) О.у±гШз и эстеразн 6 D.meXanogaster гомологгганм

на 50% по аминокислотному составу, продукты этих двух

генов откосятся к классу р-карбоксилэстераз (Корочкин,1977, Тамарина.1991) .

Как было показано для D. raelanogas tar, геи est6 экспрессируется г самявыносядем протоке и вместе с семенной жидкость», з которой_ присутствует, эфяр^ цис-вахцинилацетат, передается в половые .пути самки. EST-6 энзим. расщепляет данный эфир до аверсивного феромона. (Richmond,Senior,1981). Предполагают, что EST-S D.virilis выполняет ту '-е функцию (Korochkin.1980) . Однако,эти два гомологичных по функции и составу генных продукта отличаются' местом экспрессии : г отличие от изофермента est-6 ,который экспрессируется в семявыносящем протоке, est-S экспрессируется а сэмявынооящей луковице (KorochXin. 197*3) .

Данное различно в ткаааспеаифичности генов est-fi и est-s послужило удобной моделью для исследования молекулярно-генетических факторов, которые влияют на экспрессия) в одной ткани и отсутствие в другой.

• 3 сгязи с зышеизлояенным,• каждое исследование, которое касается механизма регуляции генной активности, представляет большой интерес с «очки зрения пополнения и упорядочивания имеющихся з данной области знаний.

Пали и задачи исследования. Целью настоящей работа бало исследование регуляции зханесяецифическсй

экспрессии гана est S D.virilis.

Исходя из этого, конкретные задачи настоящего исследования заключались в следующем:

1. Создание молекулярно-генатических конструкций с кодирующей последовательностью гена eat S в составе вектора pCaSpeR и делеционнкми фрагментами 5'

г

регуляторной последовательности в составе вектора pCaSpeR-AUG- pgal.

2. ТТолучание линий э^аясгеннъ» vr/y. O.irelafícgaster, з геном которых интегрировали исследуемые последовательности -—в составе воктсров для " транс-Аормаиии.' ■ " -

3. Анализ траясгеннтс'кук ihmeianogas-ter" методами классической генетики и биохимическими методами.

Научная новизна и практическая ценность работы.

3 результате проведанной работы было получено насколько линий трансгенных мух D.raelanogaster. Анализ трансгенных мух. з геном которых интегрировали транспоэон. с кодирующей последовательность» гана азЬ S з составе вектора pCaSpeR , , показал зидосяецифичность и тханесяецифичностъ функционирования гена est S D.virilis. Данный ген эхепрессируется з грансгенной линия по донсрнсму типу, т. а. з самявьшосящей луковице Z.ntólanogaster.

Анализ трансгенных ус/ti, а геном которых интегрировали транспозояы с 5' дедецлоннкми последовательностями регуляторной области в составе вектора pCaSpeR-AUG-pgal показал,что з регуляции экспресии гена estS принимают участие посяедозагельяссти ДНК, легаций дистальнёе от 1 сайта инициации трансляции. Региональная специфичность экспрессии гена sst-S регулируется не только активирующими, но и тормозящими влияниями последовательностей регуляторной зоны данного геиа.

Апробация работы.

Результаты работа докладазались на конференции молодых учёных а Институте Зиологии Развития-а 1995 году-и на мехдабораторнсм семинаре а Институте Биологии Гена з 1Э96 году. По теме диссертации опубликовано 2 статьи.

Структура и объём диссертации.

Работа изложена яа .... страницах. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заводов и списка лияеразуры. содер-шт 3 таблицы и 8 ри~у.псоз.

:-!адзриал^ л метода

Создание молекуляряо-ганатичесхях хснстоукаил.

Геномный фрагмеят «st 3 - D. v^rilis • ,размером 1300 н.з. был субхяонирозан из раие<г яслучзкксй пла,змтах р'/ВЭ ,на ссясве длазмиди p2K3I-, по сайтам KccRI и. Я>а1 з зектор длл -грансфосмсиуда pCaSpeR, а состав которого ахсдит mini, гея white, служащий фенотипичаским маркёром при отборе трансформантоа. Этот . геномный фрагмент содержит относительно маленький регуляторный фрагмент est S гена ( около 400 я. п. > куда входят два п^эдполохитедьнкх TivcMOTotja . л^'стальный и Р2— , мезд-/ хотсркми аахбдятся ери стхритые рамки считывания, и коцлрукщая часть содержащая последовательность активного центра эстеразы S фермента. Куклеотидная последовательность и схематическая . карта згой конструкции представлены на рис.1.

/

Eco RI

?ис.1. Схематическая карта конструкции с геном est3 D.virilis

Esterase-S gene of D. virilis (Sergeev,

1993, Nucl.Ac.Res.

)

TGACTTCAAA GTAATTTTCA AATATATAAA TTGAGAAGAG GAGTTCTAAG TGAIACGGGG 60 AGATTTGAGC TCAGCTGATA ' TTTCtTTTAT. AAGCTCATTT GÇGTTÇACTT TTACGAAAGT. ■ 120

; CAGCGCGTGA TTCATAATTT TACAGTTGCT_AACAGCGGAA CAAÇTTAGAA ATGGGGAATC 180

ATCTATIAAA GACCCCAGAA ACXAAGCGCX GAACCCAACI XCCAAACTCX GIGGCCXCTA 240

TAAAACAAAT GGCAGAGTGT TAAATTTTGA AACTCAGTTI AACIGCCAAX GCCAAGGGGC 300

CAGCCATCGG AACTAAICGA ATAGCIGICX XCTTTXCXCA CGXGAACAAA ACTTAGACTC 360

AAGTGACCAT AAAAAGGGAG TTGGCIGTCI CCGTTTCGAA CAATICAAGX TTGAGCTCCG 420

TCCTGTGCAC ACCAIGACIC AAATÁCTGTT GCCGATCGCG TTGCTCTGTC TGITTGCAGC 480

ATCAACCCTC AGCAATCCCC TGCTCGTGGA GTTGCCAAAT GGAGAATTGC GGGGACGCGA 540

CAATGGATTC TATTACAGCT ACGAGTCAAT ACCXXATGAA GAACCCCCAA TCGATGATCT 600

GTGCTTGGAA GAACCTCGTC CCTATACCGA AAGATGGGAA AAIACCIIXG ACGCGACTCG 660

GCCCCCAGTT GACTGCCTGC AGTGGAGTCA ACTCAXTTCA CAGCCTAATA AGCTGACAGG 720

GAGCGAGGAC TGXCXAACCG XCAGCAXCTA CAAGCCAAAG AAICTGACTC GCATCTCTTT 780

. . TCCGGTGGTG GCGCATATAT TIGGCGGCGG CTGGTCATTT GGTGCTGCGA TCGATGACGG 840

AGXGAGGCCC TTCAGCAGCA GCGGCAAIGX GAIAGIGGTG AAGACAACCA CAGAGTGGGA ' 900

GCGCIXGGGT TTTATGAGCA CTGGTGATTC TGTGATTCCG GGCAACXXCG GACTAAAGGA 960

TCAGCGTCTG GCAAICAAAI GGAITAGGAA CAACAXTGCA CGCTTTGGCG GAGATCCACA 1020

TÄATATAATT CTTCTCGGTT TCAGTACAGG CGGCTCCTCG GXGCACTTGC AGCTTATGCA 1080

CAAGGAATAX GGACAGCTGG XGAAGGGGGC CAIAXCCAXX AGTGGCACTG CAACGGXXCC 1140

CIGGGCIGTA CAGGCCAAIG CACGTGAICI CGCATTCCGA TATGGCAAAC TCTTGGGTTG 1200

XAATAACCCX AAAAATTCAC GCGAGCTGAA AGAXIGCCIG AAAAAAACGG AIGCGGAAGA 1260

AITCGXCAGC ACCTTAAGGC ACCTTCAGGT GTTTGACTAT GTGCCTTTTG GICCGIITGG 1320

CCCAGXCGTA GAGTCCCCCG AAGTGGAAAG CCCCTTCCIC ACCGAGCIGC CCCTCGACAC 1360

CAXCAGAAGT GGAAACTTXG CICAAGIGCÖ XTGGIIGGCC AGCTACACAC CCGAGAATGG 1440

TAXCXATAAC GCGGCXCXTC TIXIAGCTAA GGACGCCAAX GGTÀAAGAGA GGAXXGAAGA 1500

GTTAAACACT CGCTGGAACC AACTGGCICC ATACXIXXXG GCIIACCCAX ACACATTGAA 1560

GAGGTCTGAA ATGAATGCIC AXTCTCAGAA ACXGAAAXAI CAAIAXCTAG GAXATAAGAA 1620

• CTTCAGCGTC GXAAACXÂTX ICGAXGXXCA GCGCXIGXTI ACAAACGAGT TGXACAAAAA 1680

AGGCAICGAA CTGTCATTAG ATTCACATCG CAAGCACGGA GCCAGCCCCG ICIAIGCGXA 1740

CGTCTACGAC AATCCCGCGG ATAAGTCGCX GGCACAATTC CTGGCCAAGA GATCTGAIAT 1800

ATCCTTGGGT AAGAXAATGC TAATGCTCGA AATTGTGCAG XAACTAATAI CAATGATCTA 1860

TTCTCAGGCA CCGGAAXGGG CGACGATTAC TAXCXCTTGA XGAACAATCC AATGCGTGAA 1920

..CCGCTGCGAG CTGACGAGAA AATCGTTTCA TGGAAGCTAG TCAAGATGGT GGAAGATXTC 1980

GCCGCGCACG_AGACCTTGGT. CTATGACGAC TGTGTGTTCC CAAACAACTT "GGGGAAAAAG - 2Q40

AAATTCCAGt- TGGTGGTCAT-AGGAGGTAAC-TATXGCAAGC AATTGGAAGT GGAATCGTTT - 2100-

GCCCGACACG GTGICCAAIA ATCTACCACC AAATCCAATT GTAATTTACT GAGCCGAICI 2160

CTATGAAACG ATCAAATCAA XAGTCGATGG TXGTAAATTX CTATAAAXGI AXAIGXGGGX 2220 AXGXAAICTT CTGCAAATAA ATCATGGCAT TAXXIAATAA CXCAA <— 2265 nt.

SCORE SEQUENCES OF XHE KNOWN REGtJLAXORY SITES :

-naccc-nacctcct-ncgcctt-ntaaat-ngaatca-

naaaaccaaaa-naaaacaaataa -ngtggaatctc-ntacctga-ntatctga -ntttatt -NNaccatgg

-nggttttt, naattttgg -natta, naattaaat, -ntttttata,

-nagaaca, riaggtca, nagea, ntget -nggttatgggcccag, -ntggtagcgcc -nAGCAGAGTGGCGCGCGTGCXGGGCCCATAA -nCCCAGAGGDCCGAGGCCXXGCXCTGCIACCA -gggcccat aacccagaggdcc -nGCAGXCGIGGCCGAGCGGXTAAGGCGTCTG -nACTAGAAATCAGATTCCCTCTGGGAGCGTA -nGGTTCGAAXCCXACCGACTGCG

Создание esiS далеаиояиых конструкций. Геномный фрагмент гена eet-S Dr.virilis - 3430нп +570нп от качала транскрипции был исясльзоааз для соэд.»аяя конструкции s векторе pCa5par-AUG-cgal,c' репортерным геном 0-

галактозидазы. Этот ■ фрагмент бил лереклонирован з пдазмиду ' pBluescript XI5K+/- из плазкидо pBR322, куда ранее была клонирована геномная копия гена est-S Dr.virilis . Из плазмилы pBiuascript субклонировали в вектор для трансформации. Одна конструкция содержала 4т. -л. п. фрагмент /-3430ня +570нп/ Hindlll - Clal (рис.2), другая содержала Фрагмент, размером ЗООнп / -30 +570/ (рис.3) , п , наконец , третья конструкция -ЗОСнп / +500/ (рис.-1) . э дне пзрвна конструкции зхздят оба

Г.Г,С;С ГС ~ - i Г j. -.^¿tCTCSJüiiüiil И

проксималыпсг. ме:яду ко-тсриг-ги имеются три открытые рамки считывания <?ис.2,3),з зреть» конструкцию включён фрагмент , не содержащий л^гсталь.чьиг промотор. В.

•3; области ст . промотора, до сайта Clal .имеются 5 универсальных ATG ходсна (рис.4).£сэ векторные конструкции наращивались б бактериях' З.-oii, выделялись стандартным г^злсини м-этодсм и чистились з градиенте CsCI. '

Р-зазисимая трансформация клеток зародышевого пути D.—.alanccaster.

ма-года 65гз;гр'/атсл нл сгсиетзах Р-зламентов. Процадура трансформации ссгюаака на ма-гсдз. предложенном Спрадлином и Рубином (Spradling A.C., Rubin G.M. .Science,213,1982). Интеграция транспозона в геном реципиентной линии обеспечивается рекомбинантным Р-элементом, клонированным в виде плазмиды рл 25,7 wo (Karess, Rubin, Cell, 135, 1984 ). Он экспрессирует

риС8

estS regulatory / region - 4000 bp /

distal promoter—PI

Pcti -^3Qj>p AJGAJGAJG „ \ „pn,

P2«— proximal promoter

3 ORF (open-reading frames)

Рис.2. Схематическая карта конструкции с двумя промоторами: Р1- дистальным и Р2- проксимальным и большим (3430н.п.)5'прилегающим фрагментом регуляторной области гена В.у1гЛ1д.в.

pUC8

estS regulatory / л region - 600 bp /—* \

РолРт/оьд AJGATGAJG __ уУрп,

distal promoter-—► PI \

/ P2*— proximal promoter

3 ORF (open-reading frames)

Рис.3. Схематическая карт« конструкции с двумя промоторами: Р1- дистадышм и Р2- проксимальным и небольшим {30н.п.)5'прилегакс?ям фрагментом регуляторной области гена estS D.virilis.

риС8

е^ геди1а!огу _,

гед!оп - 500 Ьр /

/.

^'//Ю^АЮ АЮ А£ч „рп, ргохМ ргопю1ег_Р2 ДТО-^ ссхЮпз

Рис.4. Схематическая карта конструкции, содержащей только Р2- проксимальный промотор регуляторной области гена езЪБ V. УХгхИЭ .

транспозазу, однако сам не способен транспонироваться из-за делеции в правом инвертированном повторе.

ллакчипишиая < истнмтня

Метод основам на. . способности бактериальной гэлактозидазы расщеплять 5-брсмо-4-хлсро-3-илдолил-р-Д-г'алактсзида ;:с-Оа1) с образованием преципитата синего дзета.

Результаты и обсуждение.

Исслерззанкз механизмов регуляхрет активности тканеспеии^ических гадсз эег.ы-гз. существенно ялл лояимания молекул-ргрно-генеяичёскмх -Аспектов клею чнсп

ди^фсрекцирсзгси (К. Магхаг -, Н.игргрилд, Г ■

Си^оп, 138'6. Корочки!, 1977 ) . Для зтсй аали сагооко используются трансгенные :»геотяые, з генома которых содержится чужеродный г-эн со смежными' псследона'гчль-костяпс* ДНК разной длины {йггигрсог., 1Э5-1) .

Для лслучзкпл тра:-:сгз:пшх мух использовали з качестве реиипиеаззсй линии D.mйLiцiog'aster С£ (11 ы4""'11 ,у1/1с<!3'. Р-элемент зазис;с-г/а трансформацию проводили по методу Спрадлинга и РуОина (ЗргасНАад, ЯиЫп, 1532) . В каудадьну» область змбрионса аа ранних стадия;; развития (0-2ч. при 2З'С) с г.смошью микроиньекияй взодили смесь зоктсрнсй -лазмита :: , -.-¡апдпды-лсх-юплшха рл25.7-,-с з ссс-гнсвеяии 5:1 _ (аожанврация ДНК а растзоре С,о "'/-..Хл буфера 0,1мМ ХщВО!, саб, 3, 0,5мМ КС!) . Зьизтших после кикроиньекгдш мух скрещивали с мухами, линии у*'»; Су/Ь,-С/БЬ. Среди потомкоз от этого скрещивания отбирали особей с окрашенными глазами,которые имели встроенную в их геном векторную конструкцию, и индивидуально

1 2

скрещивали их снова с мухами линии y*w; Су/1; D/Sb. Линии трансгенных мух закладывали от потомков этого

скрещивания, имёкших окрашенные глаза. Из числа выбивших после микроинъекхугй мух, которъз-! ззодили конструкцию с ксдофухацей часть» гена ast5, Ф=ртмльяыми сказались .2,5 . . особой (21 самец и 16 самок). Эффективность■трансформации составила 44.Si от числа фертильных•особей. Esuio выведено ' о линий' с генетической локализацией во 2-ой и 3-ей хромосомах.

Методом Козерн-гибридизации с мРНН. показали .наличие транскрипта в трансгенных мухах с данной модекулгтеяо-генетической конструкцией. В г.ачестзе положи ельного контроля брали доноркую лини» D.virilis. Транскрикт гена eatS D.vixilis бил о.-голо I..9 т.н.п., а у тр'нсгеннкх мух ir^iai:ogascor. несущих аалслну:о '.сопи» денного «^на, он :о-:еат размер около 1.2 г. п. н.

3 качества ленда использовали гаасмнми фрагмент e^ts D.virilis. размером 2.000 н.п. (рис.5 )

Рис. 5. Козерн-гпбридизацля мРНК трансформированных мух D .iffil anegas tor (i) и донорной линии D.virilis (2) с ДНХ-зондсм.

Было также показано, что белковый. продух« гена. езЪв обнаруживается в . семявыносящих луковицах

трансформированных линий 0.гсе1аподаз1ег, также как и у донсрной линии В.у±г111з (Корапгеуа,1995) .

Из- числа вьскивгзес_.посла ^^^симокций мух, которым вводили, конструкцию., с большей .прилегающая. .5'-областью /3430а.а/ гена estS,20 оказались^ фертильными /13 самок ^ 7 самцов/, из них 3 самца и 3 самки дали трансгенное' потомство. Ныло выведено 3 линий: по маркёрам Су, Ь, □ и ЭЬ судили о локализации сайтов встраивания/во 2-ю или 3-ю згоомосому.(Таб.1). ■ -

Тиб. 1. Локализация шкертов и полученных г[)ансгеш1Ы\ линиях

конструкция ■ количество полученнх -линии хромосомнаялокшцичиия

1Р % ...... 3

2Р ' 4 2

2Р 2 Л

КС 4 3

НС 1 г х'

ЪР - конструкция с Р2 - проксимальным промотором. 2Р - конструкцня с Р2 - проксимальным и Р1 - лнетальным. промоторами и небольшим { 30 н.п.) 5' прилегающим районом. НС - конструкция с Р2 - проксимальным и Р-1 - дистальным " промоторами «I большим ( 3430 н.п.) 5* прилегающим районом.

' /

^ Блот-анализом по Саузерну дополнительно показали

нали'ше :к!-зрта з геноме псяучадаак .т.'.к:гй мух (р:гс.в) .

.......

I

1 2 3 4 5

Рис.6. Сауэеря - гибридиэациия геномной ДНК трансформированных мух О .те1аг.одазЪаг (2,3,4,5) и В.ухгШя (1) с eзts геком

БС"^" , С —~ЛСКаЛПЗ а^ЦПО С

гибридизации 1г. а ¿ли па политэнных :грсмгсгмах слюнных яелёз с ДКК-зсндсм, яачаннзм "Л [3], {Тай.2) , (рис.7) .

Таб.2. Ь -¡¿(и пиф|цш;щш1 Ж! по.шичшьк хромосомах №{N'¡'1') меченный зонд«« пгктопых трлнсгашых линий О.шеЬпо^азиг.

линия ■ мести ппкалтаиии

■ 1Р : 3 63Г

2Р 2 5ГА-В

¡1С Э 62 Г

3 4-х линиях интеграция :1:-гс<2рга била обнаружена з 3-■ая хромосома, з 1-;-Л яглтххп - з ¿< хрсмсссме. Эффективность траяс^осмаца составила 55 оа' оо«зго -числа зыхиаших мух. Из числа выживших ;<тух. которым вводили конструкцию с небольшой 5 -областью тзна /ЗОн.п./ оказались

фэртильчыми 14 самок и 9 самцсз.. найдэно 3 кучка трансформантоз, Вошедалс о линий, з 4-х интеграция иясзрта зо 2хрс. з С-:: -а 3;ао. ОЦгхитисаи, трансформации около 13-;. числа застивших мух, которым

ззодили кснструкцлх: тглько с Р1-дистальным промотором, 20 оказались фершильными /10 самок и 10 самцов/ .найден один л/чол траь'сформалго£> - з самки, выведена одна линия с интеграцией инсерта в 3-ей хромосоме. Эффективность трансформаций! 5 *.

v

v'* " л'Ч

г- -

it -Ш^-Р: .Vi •

• t .

•x' ' <?

• *'

?яс.7. in situ гибридизация на политеннъас ^окосскзх слюннмх желёз личинок третьего возраста

трансформированных мух D. irelanoga3tcr с Н- меченным ДНК-зондом D.virilis.

Для определения региональной специфичности в активности тестируемых регуляторных зон гена езЪБ, взрослые мухи обоих полов после вылета были проанализированы на 0-галактозидазнум активность. По 2030 мух обоих полов были исследованы в трёх...независимых-.. экспериментах,. Целые мухи протыкались ; препаровальной иглой в области груди и брюшка и окрашивались в буфере_с 2в формальдегидов, 5мМ КС1,, 0, 1мМ Ма3РО< (рНб.8), 0.02%Тритон Х-100, 50мМ К, Рз<0?6) , 50мМ К 1°''/^ 5 - Ьгсгго - 4 сЫого - 3 - 1пйо1±1 Ь-О-Ь'л1ода1ас*:оругапоз1с1а (:-С-еа1) яря 3?,1С 12-24 ,ч.

Анализ мух методом К-0а1 показал, что у дрозофил линии Р1 (инсеря содержит Р2-проксимальный промотор), в соответствии с окрашиванием положительная Ъеакция наблюдается з разных их частях - пищевода, кишечника, местами в мышечной ткани, палъпах, хоботке, мальпигиевых сосудах, з то хэ чрамя сямяаыносящие луковицы

практически на окразиэахтся.

Неспецифичность ' экспрессии р-галактозидазы

свойственна и мухам линии 2Р, где наряду с дистальным промотором содеря»мся и проксимальный промотор с небольшим (ЗОн.п.)смежным фрагментом ДНК. Однако, уровень окрашивания здесь умэньхея по сраанению с предыдущей линией, однако, заметно слабое окрааивание семявыносЯярвс луковиц.

Наконец, а -третьей линии НС,гда инсерт содер.тит помимо двух промоторов, .большой (3,4'кЬ) 5 ' -фрагмент регулязортой зоны гена езЬЗ , семяаьшосяшие луковицы окралхиваются, хотя существенного усиления реакции, по сравнению с предыдущим случаем, не отмечается (рис. 8) , Однако, в заметной степени изменяется реакция других тканей -. их окраяиваемость резко снижена и варьирует о®

Рис.8. Экспрессия р-галахтозидаэы в ехали семявьшосящих луковиц трансформированных мух О.теХаподазЬег.

особи к особи, от слабой или следовой до полного отсутствия (Таб.3).

Глч.Л 'Экспрессии р-галактеииизи делеининнмх конструкций в грансфирмиронаннмх линиях П.текшиеаьгег. ..

:::'пструкиии •"¿¿•.ты

иншспол мышечная ткань пильпы

Ч'.1,1М'Ш1 -новы

«МЯЯЫНОСЯШИС иропти ссминымогншис .пкч.ищы

>Юип г: I'! .г': !____:'/,_/У._! [____/У..

О

о

и

. I--</.

+ +

■*■ - ирк'О пы|.игк<;н11ая ¡ксирссспя о.|;»ш> ;'.мр;г.;.ч'!:иа;| -.жсп'.чч'с:!;! Ч - с" с.мйи жешчч'гнн лч ое полного тсутега:.!! щ :;сион к осоои

Полученные данные позволяют предположить, что в регуляции экспрессии тканеспецифического гена estS

D.virilis участвуют как стимулирукяцие, так и тормозные механизмы. Пс-вияимсму, область ДНХ, лежащая дистальнее промотора ?2. активирует транскрипцию гена ..estS' в различных тканях.. Хссаенные данные • а- пользу , этого были получены ранее:были найдены лежадае э этой области точки инициации, "задействованные"в различных органах дрозофилы (Ениколопоа, 1Э89).Еай более дистально расположены последовательности ДНК, которые тормозят экспрессию гена eats в тканях я органах D. -ririlis, за исключением ~=мявыносяг;ей луковицы.

Гея sstS*, регулиругсгай " ахсйзность .фермента, актизтеует транскрипция с пр-омс-зорл Р1, хстссал да^еет иесто ла только .а с-лмязы:-!^w-fcvuc лукселцах-, но и 2 других органах. Б ахтнзацпи данной транскрипции участвуют последовательности ДНК upstream ?1 (рис.1). Зрсксимальяее этой зоны ДНК расположены послацоаателькости (рис. 1) , которые- тормозят экспрессия гена nst-S повсюду, кроме самявыносг-сгях -уг.сзид. образом. региональная

специфичность ;?кспр*зсс::и гана ostS регулируется не только аг.тизпругацнми, но я тормозными влияниями.

выводы

1. С понодсь» инсерции гена езЪЗ О. тШз в геном D.mвlanogaster выявлена строгая тканеспецифичность трансзфипционно-ахтизного гена для семявыносязцих луковиц.

2.Сравнительный анализ гистохимической локализации р-галактозидазной активности в /различных органах линий 1 и 3 трансформированных мух показал:а)' положительную окраску в ткани семязыносяших луковиц и её отсутствие в других органах линии 1, соаоркзаей инсерт с двумя промоторами: Р1-дистальнуй я Р2-проксимадьный -.1 большой (3430'н.п.) 3'крилагаксу'с! фрагмент; б) отсутствие окраски з ткани самявмаоеяЕэвс луковиц при положительном окрашивании тканей других органов дяаин 3, содержащий инсерт только с ?2-проксимальным промотором.

3.Региональная специфичность экспрессии гена еаЬЭ О.у1г1Ххз регулируется как ахтивирумшим,. так и тормозным влиянием^ • а экспрессия этого гена деэерминирована пссладсзагальяостыэ 2 у-гастка1, который' располагается дасаалънее первого сайта инициации транскрипции.

Список работ, опубликованных по дреме диссертации:

1. BasMcirov V., Panin V., Shostac H., Pavlova G., Kopantzeva M., Dzltoeva S., Golubeva M. , KorochJcin L. Analysis of the family of tissue specific esterase genes in tba experiments on transgenic Droaophila //Онтогенез. 1994. Т.25. В 4. С.53-54. "

2. Корочкин Л.И., П.Сергеев, В.Н.Башгиров, В.М.Панин, К.Мартинец, М.Копанцева, Н.Шостак, Г.Павлова, С. Дзитоава, М.Голубева. Тканеспецифическая экспрессия гена ests у трансгенных дрозофил. / /Доклады Академии Наук. 1995. 1.340. а 3. С. 433-436. 4

3. С.Г.Дэитоева, В.М.Панин, В.Н.Башкиров, М.В.Фридман, П.Сергеев, чл-кор.РАН Л.Й.Корочкин. Молакулярно-геиетические механизмы регуляции активности гена estS у трансгенных дрозофил. //доклады Академии Наук. В печати.

4. Dzitoeva S., Bashfcirov V., Panin v., Fridman M., KorochJcin L. The analysis of regulatory DNA in transgenic Drosophila. FEBS Letters. In press.