Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмахантительной агрессии в мозг

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмахантительной агрессии в мозг"

Гч..

С?"

Гтг сН

" и,

0 На правах рукописи

¿■О ^ УДК 616.831.-005.4 - 036.11 -092-07

АНТОНОВА Ольга Митрофановна

«Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмах антительной агрессии в мозг»

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1997

Работа выполнена в Государственном Научном Центре Социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.П. Чехонин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор АА. Терентьев доктор медицинских наук, профессор И_Я. Конь

Ведущая органнлцня:

Государственный Научный Центр Наркологии МЗ РФ

41/— Защита состоится АП£>еЛ/! 1997 г.

в 7 / часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.02.01 при Институте

Питания РАМН по адресу-. 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Питания РАМН.

Автореферат разослан " /ф " ИА^ТА 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук В.М. Жминченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Исследование молекулярных механизмов функционирования клеток головного мозга, а также ингегративной деятельности мозга в целом является перспективным направлением современной нейробиологии. Хорошо известно (Edelman G., 1992. г.; Березин В.А., 1994 г.; Штарк М.Б., 1995 г.; Chekhoniiv V.P., 1995 г.), что специфические свойства клеток той или иной ткани определяются структурой и функциями характерных для нее белков. Особый интерес вызывают белки, определяющие особенности функций ткани мозга, т.е. нейроспецифические белки (Moore B.W., 1965 г.; Eng L.1971 г.; Bock Е., 1975 г.; Березин В.А., 1986 г.; Полетаев А.Б., 1987 г, Чехонин В.П., 1989 г.; Бурбаева Г.Ш., 1989 г., Warecka К., 1992 г.; Edelman G l994 г.). Эти белки вовлечены s метаболические пути, характерные только для нервной ткани, такие как генерация и синаптическая передача, молекулярные механизмы анализа, синтеза и хранения йнформаиии, а также процессов обучения и запоминания Кроме того, нейроспецифические белки участвуют в процессах, не являющихся специфичными для ткани мозга, и обеспечивают такие функции как транспортную, ферментативную, цнтосхелетную, модуляторную и т.д Есть основания считать, что НСБ определяют особенности метаболизма ткани мозга его интенсивность, направление, локализацию.

Нейроспецифический белок, известный как 14-3-2 или нейроспецифическая ено-лаза, обнаруженная преимущественно в нейронах (Heran Е.А., 1981 г.), является одним из ненроспецифических белков, функция которого в настоящий момент установлена.

Несмотря на то, что в результате исследования NSE за период более чем в 20 лет накоплен обширный экспериментальный материал, следует признать, что целый ряд как прикладных, так и фундаментальных аспектов в проблеме NSE остаются открытыми. Например, не изучены особенности метаболизма NSE в норме и патологии, вопросы антителообразования к NSE и возможной агрессии антител а мозг. Не решен окончательно вопрос о возможности использования NSE и анти-ЫБЕ-антител в качестве маркера прорыва гематоэнцефалического барьера при нервных и психических заболеваниях, нейроинфекциях, травмах и опухолях головного мозга. Относительно слабо исследованы аспекты эктопического синтеза NSE и возможности этого феномена в целях ранней диагностики опухолевых процессов. Научный и практический интерес вызывает возможность использования специфических анти-К8Е-антител в качестве вектора для транспортировки в нейроны специальных маркеров или лекарственных препаратов (Carney D.N., 1982 г.; Marangos P.J.. 1982 г., Jankovich В., 199 Г, Dauberschimdt R.1991 г.; Barone F C., 1993 г.; Bonhomme V.. 1993 г; Stieber Р., 1993 г.)

з

Целью настоящего исследования явилась разработка высокочувствительного метода определения МБЕ и шгш-NБЕ-актигел г биологических жидкостях больных нервно-психическими заболеваниями в патогенезе которых имеет место нарушение функции ГЭБ, а также исследование роли акти-КБЕ-аятигел в формировании обшей аутоангнгелыюй агрессии в мозг.

З&ллчи исследования:

1) Разработать способ получеши ^Е, позволяющий получать препарат Н5Е высокой степени гомогенности, необходимой лях создания иммунохимических диагнос-тикумов.

2) Разработать и апробировать в »лкнико-лабораторной практике иммунофер-мектные тест-системы для определения и анги-Ы5Е-ангнто! в биологических жидкостях.

3) Провести иммунофермектный скрининг Ы5Е и анги-Ы5Е-антител в биологических жидкостях больных различными нервно-психическими и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функции гематоэнцефалического барьера.

4) Исследовать феномен прорыва меченых 1251 анти-КБЕ-антител через гемато-энцефалический барьер в направлении кровь-мозг, а также вероятность проникновения антител к нейроспецифическим белкам в мозг при экспериментальном нарушении резистентности гематоэнцефалического барьера.

Научная новизна. Разработан способ получения ЫБЕ высокой степени гомогенности из постмортальной ткани мозга человека. На основе этого препарата получены моноспецифические анти-^Е-антисыворотки и гомогенные препараты • анти-Ь'5Е-антигел.

Разработаны высокочувствительные иммуноферментные тест-системы для определения ЫБЕ и анти-^Е-антител в биологических жидкостях.

Проведена апробация данных тест-систем на клиническом материале и выработаны рекомендации по их применению при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции гематоэнцефалического барьера

Установлен феномен прорыва N'51: и анти-КБЕ-антител через гематоэнцефали-ческий барьер в направлении мозг-кровь при нервно-психических заболеваниях, травмах и опухолях, головного мозга

*

Экспериментально установлена возможность проникновения антител к №Е через оврежденный гематоэнцефалический барьер в направлении кровь-мозг, избирательном акоплении антител в ткани мозга, сопровождающихся повреждающим воздействием а клеточные структуры мозга.

Практическая ценность. Иммуноферментные тесг-сисгемы для анализа ЫБЕ 1 антн-^Е-антител могут быть использованы в комплексной диагностике и контроле а эффективностью проводимой терапии заболеваний, в патогенезе которых имеет (есто нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера.

Иммуиофермектная тест-система для анализа ШЕ может быть рекомендована для ¡иагностики, дифференциальной диагностики и контроля за проводимой терапии мел-:оклеточного раха легкого.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на дежлабораторных конференциях ГНЦССП им. В.П Сербского (1994-1997 гг.), на 5 яеждународном симпозиуме по направленному транспорту пептидов, белков и генов Лейден, 1995 г.), 20 международном конгрессе по нейропсихофармакологии (Мельбурн, 1996 г.)

Публикация. Материалы диссертации отражены в семи опубликованных «учных работах.

Структура диссертация.

Диссертация изложена на_машинописных страницах и состоит из введения, 6

-лав, в которых приводятся данные обзора литературы,, результаты собственных исследований и обсуждение полученных результатов, а так же выводов и библиографического указателя.

Диссертация иллюстрирована 14 рисунками, 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы в методы исследованкя. Объектами исследования были органы, гкани и биологические жидкости человека и крыс. Ткань мозга человека, необходимую зля приготовления экстракта и дальнейшей очистки препарата №Е, получали из моргов при Московских городских клинических больницах № 7 и Ь'ч 23.

Образцы сыворотки крови и слинно-мозговой жидкости доноров и больных получали со станций переливания крови, из клиник ММА им. ИМ. Сеченова, РГМУ им. Н И.Пироговз, МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, НИИ онкологии им. ILA. Герцена, НИИ эпидемиологии и инфекционных болезней МЗ РФ, кафедр неврологии Астраханского и Кемеровского медицинских институтов, а также ряда лечебных учреждений г. Москвы..

Для получения антасыво роток, кроликов породы Шиншила (массой 3-4 кг) иммунизировали очищенными препаратами NSE высокой степени гомогенности. Блшшнг проводили из краевой вены уха в количестве 50-60 мл. Полученную ангисыворотку консервировали азидои натрия (0.02 %) и хранили при температуре + 4-8 "С

Преципитирующая способность ajmi-NSE-ангнсывороток изучалась с помощью иммунодиффузнонного анализа, иммуноалектрофореза и перекрестного иммуно-элекгрофореза по Laureil С.В.(1965 г.)

На следующем этапе разрабатывалась тест-система к NSE по методу Н И Храм-ковой и Г.И. Абелева (1961 г.). Полученная стандартная тест-система была верифицирована с кроличьей антисывороткой к NSE (фирма "ICN").

Выделение специфических анти-№Е-антител проводили методом иммуноаф-финной хроматографии (Weir D., 1978) на иммуноадсорбенте с иммобилизованной NSE. Количественный анализ NSE и анти-NSE антител в биологических жидкостях осуществляли при помощи "сендвич"-варианта иммуноферментного анализа (Voller А., 1976 г.).

Для выделения NSE из ткани мозга человека последовательно применяли такие методы, как солевое фракционирование, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, гидрофобную хроматографию и изохроматофокусирование.

При исследовании физико-химических свойств и химической характеристики применяли методы аналитического хроматофокусирования (Sluyterman L.A.A., 1978) и диск-электрофореза в Г1ААГ с SDS (Laemli U.K., 1970). Белок определяли по методу Lowry ОН. (1951 г.), аминокислотный анализ NSE.проводили на аминокислотном анализаторе "Dunum DS - 500" (США).

С целью изучения механизмов аутоагрессии антител в мозг нами проводился экспериментальный прорыв гематоэнцефалического барьера у крыс: с одной стороны, при помощи судорожных пароксизмов, вызванных путем парентерального введения галоперидола (Deley G., Deniker P., 1961); второе направление - прорыв гематоэнцефалического барьера путем экспериментальной ишемизации головного мозга (Чехонин В П.и соавт. 1989 г.).

Статистическая •гооайотка по.тученных результатов проводилась методом вариационной статистики с вычислением среднеарифметической величины, средней ошибки, среднеквадратичного отклонения при известном числе наблюденнй Достоверность различий проверяли с помощью критерия достоверности Стьюдента. Статистический обсчет результатов проводили при помоши ШМ совместимого компьютера в, программе "Excel" (Version 5,0).

Результаты исследования а ах обсуждевяе.

Разработанная нами схема получения NSE (Рис. 1) существенно отличалась от раннее предложенных Grasso А. (1977 г) и Бурбаевой Г Ш. (1984 г.) способов получения NSE.

ГОМОГЕНИЗАЦИЯ

10000% в 0.0SM ТРИС-глициновом JJ буфере, рН 8.2, с 0.1% Твин-80 и

0.1 % Тритон Х-100 ВОДНО-СОЛЕВОЙ ЭКСТРАКТ

Осаждение (NH4)2SOt, 60% насыщения У осаоокрастворяли в (NHjiSOt 32% насыщения, осаждение ацетоном

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ДЕАЕ-52-целлюлоза, отбирали фрак-il ции, элюируюгциеся в диапазоне кон-

центраций NaCI от О,15Мдо 0,22 М. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ

(J Уяьтрафилыпрация на мембране ХМ-30 ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ

Сефадекс G-150, отбирали U фракцию с Wm- 75±10 kD

ГИДРОФОБНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Фенил-сефароза, отбирачи фракцию, I) злюирующуюся в диапазоне концен-

траций (NH<)2S04 от 1М до 0.8 М ИЗОХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ

РВЕ-гелъ, отбирали фракцию, элюиру-U ющуюся в диапазоне рН от 4.6 до 5.3

ЛИОФШШЗАЦИЯ

U

XSE

Рисунок 1. Схема очистки INSE.

Нами было предложено использовать ацетоновое фракционирование, которое помогало избавиться от целого ряда примесных белков (до Ю-12 %) Мы исключили предложенную Сггаз$о А. хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе и ввели в Сталин очистки методы гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе и изохроматофокусирования, что дало нам возможность в значительной степени сократить количество примесей в препарате МБЕ при идентичном уровне потерь антигенной (25 %) и енолазной активности (20 %).

На основе препаратов МЕ я анта-^Е-антител, полученных при иммунизации кроликов, нами бьш разработай твердофазный "сендвич"-вариант их иммунофер-ментного анализа. Апробация иммуноферментного метода дала нам возможность определять КБЕ и анти-ЭДЗЕ-актитела в интервале концентраций от 1 нг/мл до 128 нг/мл и от 0 8 до 500 нг/мл, соответственно (Рис. 2 и 3), Проверка специфичности иммуноферментной тест-системы позволяет выявить отсутствие перекрестных иммунохимических реакций между белками сыворотки крови человека, крысы, собаки, крупного рогатого скота, такими нейроспецифическими белками как с^-ЕЮ, аг-ВО, Б-!00, ОРАР, ссгСгР, 14-3-3, 10-40-4, клатрином, тубулином, калмодулином, а также аа-изоферментом енолазы.

Рисунок 2. Калибровочная кривая иммуноферментного определения КБЕ.

иг/мл

Рисунок 3. Калибровочная кривая иммуноферментного определения антител к "

Данная тест-система использовалась нами для изучения проницаемости гемато-энцефалического барьера в направлении мозг-кровь при некоторых неврологических и психических заболеваниях, нейроинфекциях, опухолях и травмах головного мозга, а также в экспериментах по исследованию влияния на организм млекопитающих некоторых экстремальных факторов, нарушающих функцию гематоэнцефалического барьера

Тест-система определения анти-№Е-антител была применена не только для поиска их в.биологических жидкостях больных и здоровых людей, но и в целях оценки степени возможной аутоантнтелъной агрессии в мозг.

Иммуноферментный скрининг ИБЕ в сыворотке крови и спинномозговой жидкости здоровых людей позволил установить максимальное значение концентрации ^Е (донорский уровень). Он составил менее 16 нг/мл (в сыворотке крови) и 32 нг/мл (в спинномозговой жидкости)

Иммуноферментный скрининг ЫБЕ и последующий статистический анализ, позволил сделать вывод о том, что прорыв гематоэнцефалического барьера ЫБЕ наиболее часто обнаруживался при гнойном менингите (41 %), менингоэнцефалите (44.5 %), опухолях головного мозга нейронального происхождения (47 %), а глюке при целолд ряде критических состояний, где поражение ЦНС является вторичным. Наиболее высокие концентрации КБЕ были отмечены при критических состояниях, обусловленных

о

фебрильной шизофренией (25 %), нейролепсией (33.3 %), гнойном (41 %) и вирусном (35 %) менингите, а также при клетевом менингоэнцефалате (44 5 %) и болезни Лайма

(Табл. 1).

Таблица 1.

Результаты иммуноферментного определения ^Е в сыворотке крови больных

Диагноз Число проб Концентрация нг/мл % положительных проб

16 32 64 128 256

1) Критические состояния, обусловленные:

а) фебрильной шизофренией 62 7 4 1 I 3 25

б) острой алкогольной энцефалопатией 69 6 3 2 1 17

в) нейролепсией 57 9 5 2 1 2 33,3

г) тяжелым алкогольным делирием 5$ 10 2 1 22,4

2) Болезнь Паркинсона 15 2 13,3

3) Рассеянный склероз в фазе обострения 34 6 2 23,5

4) Рассеянный склероз в фазе ремиссии 48 2 2 8,3

5) Инсульты: а) геморрагический

88 7 2 1 11,4

б) тромботический 88 1! 4 3 20,4

6) Менингит: а) гнойный

88 21 5 5 1 4 41

б) серозный $8 12 2 3 19,3

в) вирусный 83 20 5 1 1 4 35

7) Клещевой менингоэкцефалит 176 36 17 15 4 6 44,5

8) Болезнь Лайма 44 12 4 1 1 41

9) Опухоли головного мозга: а) астроцитарные

44 4 1 11,3

б) нейрональные (нейробластомы) 19 4 4 1 47

в) олигодендроглиальные 44 5 2 1 18

г) ннзкодифференцированные 19 1 1 10

10) Критические состояния, обусловленные нейротоксическим синдромом'

а) гриппом 36 6 1 19,4

б) кишечными инфекциями 27 4 1 18.5

в) пневмонией 11 3 1 1 45

г) перитонитом 30 5 1 2 26,6

д) панкреатитом 17 3 2 2 41

11) Другие заболевания, не сопровождающиеся нервнопсихической симптоматикой:

а)перитонит 32 1 1 ! 6

б) панкреатит 36 1 | | 2,7

Концентрация М5Е в спинномозговой жидкости может значительно превышать ее уровень в сыворотке крови (до 3 раз). Частота появления ЫЭЕ в спинномозговой жидкости, была выше чем таковая в сыворотке крови на 20-30 %.

Таким образом, иммуноферменгный анализ ^Е в биологических жидкостях больных может быть использован для комплексной оценки степени нарушения про--нииаемосто ГЭБ при целом ряде заболеваний, характеризующихся его органическим или функциональный поражением, а также в качестве способа диагностики и дифференциальной диагностики глиальных и нейрональных опухолей головного мозга.

Количественный мониторинг Ь'БЕ, кроне того, может быть использован для анализа уровня репарагивных процессов в клетках, формирующих гематоэнцефа-лический барьер, а, следовательно, в качестве объективного критерия при оценке эффективности проводимой терапии.

Другим прикладным аспектом применения ЫБЕ в диагностических целях явилось исследование феномена увеличения концентрации данного антигена в сыворотке крови больных с опухолями ненейрональиого происхождения

Иммуноферменгный анализ ^Е позволил выявить данный антиген в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легкого (42 %), Р-клеточной аденомой поджелудочной железы (у 2 из 5 пациентов), зндометриоидной аденокарциномой (у 1 из 5 пациентов), эмбриональным раком яичка (у 1 из 3 пациентов), тератомой яичка (у 2 из 3 пациентов), а также у 2 из 5 больных с феохромацитомой и у 15 % больных .со злокачественной меланомой (Табл. 2).

Таким образом, иммуноферменгный метод анализа ЫБЕ может быть также использован в качестве дополнительного метода диагностики и дифференциальной диагностики мелкоклегочного рака легкого, и в частности одной из его разновидностей -овсяноклеточного варианта мелкоклеточного рака легкого, при котором процент выявления ШЕ превышает 80 %.

Следующим этапом нашей работы был иммуноферментный анализ анти-КБЕ-ангител в сыворотоке крови больных нервно-психическими заболеваниями.

Факт присутствия ан-ги-№Е-антител был выявлен при критических состояниях, обусловленных психическими заболеваниями (15-45 %), нейробластомах (до 55 %), а также при критических состояниях, обусловленных нейротоксическим синдромом: при гриппе (до 20 %), кишечной инфекции (до 19 %), пневмонии (до 22 %), перитоните и панкриотите (до 33 %) (Табл. 3).

Таблица 2.

Результаты иммуноферментного скрининга КБЕ б сыворотке крови больных опухолями ненейронального происхождения

Диагноо Число проб Кониектрааия ^Е, нг/мл % положительных проб

16 32 64 128 256

1) Рак легкого а) плоскоклегочный

и 0

б) мелкяслЕтточный 38 10 1 4 1 42

в) аденокарцинома 12 0

г) крулноклеточный 12 0

2) Опухоли поджелудочной железы: \

а) ацинарньш рак 9 0

б) (5-клеточная аденома 5 2 (2 из 5)

3} Опухоли яичников а) серозная аденокарцинома

19 0

б) муцинозкая аденокарцинома 8 0

в) эндометриоидаая аденокарцинома 5 1 (I из 5)

4) Опухоли яичка: а) семинома

9 0

б) эмбриональный рах 3 1 (1 изЗ)

в) тератома 3 2 (2 из 3)

5) Опухоли хромофинной ткани

а) феохромацитома 5 2 (2 из 5)

6) Опухоли кожи: а) базально-клеточный

11 ' 0

б) плоскоклеточный рак 8 0

в) недифференцированный рак 3 0

г) злокачественная меланома 21 2 14

д) злокачественная липосаркома 4 0

Таблица 3.

Результаты иммунофермеитвого «пределсиня АТ к ^Е в сыворотке крови

больших

1 Коли- Дыагвоз { чсство | проб Какцагтрапи АТ к ЫБЕ, иг/мл. % положительных проб

... ... ... ... ! 0.8 | 1.6 | и | М | 12.1 | 23.6 | 51Д | 1И.4 |

1) Критические состояния, обусловленные:

а) фебрнльной шизофренией 19 4 1 3 --? 47

б) острой алкогольной эназефалоштией 27 4 2 1 1 33

&) нейрояевсией 20 2 2 1 2 1 40

г) тяжелы* алхопмьным делирием 30 б 2 3 1 21 50

2) Ра£се*шщй в фазе обострения 17 2 1 1 1 2 41

3) Инсульты: а) геморрагический

16 3 2 1 1 43

б) тромботическнн 23 2 2 1 1 26

4) Бактериальный менинптт:

а} гнойный 17 1 1 2 3 41

6) серозный 29 1 1 3 4 2 3 48

5) Вирусный менингит 24 2 2 1 1 1 3 41

6) Энцефалит 23 1 3 1 3 2 2 52

7) Черепно-мозговая травма:

а) открытая 21 2 2 2 1 3 47

б) закрытая 34 3 2 1 1 ' 2 2 32

8) Опухоли головного мозга'

а) апроцитарные 16 0

б) олигодендроглиалъные 12 0

в) нейрональные 7 1 1 28

г) гапкодафференциро-ванные 15 1 1 1 20

9) Менннгиома 8 1 1 25

10) Неврилеммоча 5 1 1 40

11 > Ненрофибросаркома 5 1 2й

12) Критические состояния, обусловленные нейротоксичесюш синдромом при:

а) панкреатите 15 2 1 1 26

б)грште 35 2 1 1 1 14

в)пневмонии 12 1 1 16

г) перетоните 30 1 1 2 2 • 20

Исследование динамики появления ^Е и анти-№Е-ангктел в сыворотке крови больных, находящихся в критическом состоянии, обусловленном тяжелой нейролепсией и острой алкогольной энцефалопатией показало, что практически у всех наблюдаемых больных к моменту поступления в реанимационное отделение определяется прорыв гематоэниефалического барьера и элиминация ЫБЕ в кровь. Уровень этого антигена стремительно нарастал, достигая максимума к 7-10 дню от момента развития критического состояния. Параллельно с 8-12 дня в сыворотке крови начинали определяться антитела к №Е, концеятрадия которых увеличивалась экспоненциально, достигая максимума к 21-25 суткам (Рис. 4) По нашим данным, образование антител к Н5Е происходило в тех случаях, когда концентрация антигена в сыворотке превышала 16 нг/'мл.

сутки жизни

Рисунок 4. Графическое изображение типичной зависимости ^Е и анти-№Е-антител от времени после начала развития критического состояния

Сопоставление количественных характеристик ТМБЕ и антител к ней, со стадийностью и тяжестью течения заболевания, позволяет сделать вывод о том, что кризисный период течения заболевания, сопровождающийся массивным прорывом гематоэн-

цефалмческого барьера, приходится на 7-10 сутки. Именно в этот период обнаруживалась максимальная концентрация ЫБЕ и начинали определяться антитела к ней Интенсивное появление антител с максимумом, приходящимся на 21-27 супск, косвенно свидетельствовало о восстановлении функции ГЭБ и предвещало благоприятный выход больного из критического состояния Напротив, отсутствие антител к 10 суткам и-параллельное нарастание уровня КБЕ, косвенно указывало на то, что восстановление функции ГЭБ происходит аномально, прогнозируя тем самым неблагоприятный исход. Более того, в этом случае при иммуноферментном скрининге аити-№Е-антигел мы обнаруживали их в спинномозговой жидкости, подтвердив тем самым существовавшую гипотезу о забросе антител из крови в ткань мозга при нарушенной функции ГЭБ

Таким образом, совместный иммуноферментный скрининг К5Е и анти-^Е-аитител позволяет надежно и адекватно определять стадию и степень тяжести патологического процесса и может быть рекомендован в качестве дополнительного подхода к дифференциальной диагностике и контролю за эффективностью проводимой терапии целого ряда нервных и психических заболеваний.

Поставленная перед нами задача, касающаяся исследования механизмов ауто-агрессии антител к ИБЕ в мозг, решалась нами по пути исследования проблем моделирования прорыва ГЭБ для ЭДБЕ в направлении мозг-кровь, а также механизмов прорыва ат-и-№Е-антител в направлении кровь-мозг.

В качестве методов экспериментального прорыва ГЭБ нами были использованы два направления: одно из которых базировалось на прорыве гематоэнцефалического барьера путем парентерального введения галоперидола в дозе 7.5 мг на 100 г массы тела крыс, а второе - путем экспериментальной острой ишемизации головного мозга животных.

Нарушение проницаемости ГЭБ при парэнтеральном введении высоких доз галоперидола происходило к 5 минуте после инъекции. Уровень ЫБЕ при этом достигал максимума к 8 часу, а к 6 суткам уровень ЫБЕ не отличался от нормального. По нашему мнению, нарушение проницаемости ГЭБ в данном случае является следствием экспериментально вызванной нейролептической реакции, основательно изученной Пе1еу в. и Оагакег Р. в 1961 г. Патофизиологические и морфологические исследования ткани мозга животных, а также людей, погибших при явлениях острой нейролепсии, позволяют нам сделать вывод о том, что причиной нарушения проницаемости ГЭБ в направлении мозг-кровь при воздействии высоких доз галоперидола является частное проявление токсического воздействия соединения, относящегося к классу бутирофено-нов на клеточные структуры головного мозга. Понятно, что исследуемый нами феномен

может иметь не только экспериментальное значение, заключающееся а искусственном изменении проницаемости гемагоэяцефалического барьера, крайне необходимом для изучения механизмов этого явления. Мы уверены также в том, что иммуноферментньш мониторинг нейроспеиифических белков и ТЯЯЕ в частности, может быть использован в клинической практике при лечении нейролептиками, особенно у лиц, отличающихся аномальной чувствительностью к нейролептикам

Установив факт нарушения проницаемости геиатоэнцефалического барьера при воздействии таких экстремальных факторов, как экспериме1гпшьная ишемия головного мозга и галоперидоловая нейролеясиж, перед нами открылась возможность для решения задачи по исследованию феномена прорыва анти-КБЕ-анштел через гемаггоэнцефа-лический барьер непосредственно после его экспериментального прорыва. Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о том, что первый контакт иммунной системы с №Е, инициированный путем галоперидолового прорыва гематоэнце-фалического барьера, способен вызвать сенсебилизацию организма. Тогда как второй и третий прорывы приводили к появлению в сыворотке крови анги-ЫБЕ-антител, соответственно, у 15 % и 60 % экспериментальных животных. При этом уровни анти-НЭЕ-ангител росли от инъекции к инъекции, достигая максимума к третьему эксперименту. Период их полувыведения в наших экспериментах равнялся в среднемЮ суткам.

Исследуя появление алти-КЗЕ-актител при воздействии экстремальных факторов неспецифической природы, у нас есть все основания полагать, что образование антител - процесс, не зависящий от характера и природы внешнего воздействия, и определяющийся лишь факторами, способными нарушать проницаемость гематоэнцефа-лического барьера в рамках проявления феномена элиминации КБЕ в кровоток.

В связи с вышеуказанным, одним из основных разделов диссертационной работы явилось экспериментальное доказательство прорыва анти-Ы8Е-антигеп через искусственно поврежденный гематоэнцефалический барьера с одновременной морфологической верификацией процессов, происходящих в ткани мозга. Анализ распределения меченых 1231 анти-№Е-АТ, а также контрольных препаратов антител в опытных н контрольных образцах ткани мозга показал, что при полноценном ГЭБ препарат анти-^Е-АТ в ткане мозга не накапливается, а имеющаяся радиоактивность (0.013 ± 0 002 мкКю) обусловлена радиоактивностью крови в сосудах головного мозга (Рис. 5). Напротив, в экспериментах на животных с искусственно поврежденным гематоэнцефа-лическим барьером анти-ШЕ-антитела накапливались в ткани мозга, причем количество содержащейся метки в 1 г ткани превышало как минимум на 60 % его количества в других исследуемых органах (Рис. 5).

сердпс

кровь

селезенка

□ «пет« 1-115 «ит-№АТ, вмдеяаые после прерии ГЭБ

□ мечеяьм 1-125 шгт-М5Е-АТ, виденные оермаллым «потаим

'исунок 5. Распределение меченых АТ к К8Е на третьи сутгн после введения [репарата.

Изучение локализационного индекса показало, что максимум накопления 1нтител после инъекции приходился на 3-4 сутки. Напротив, введение препарата меченых щ-ВО- и аг-ВО-антител, видонеспецифнчных для крыс, не характеризовалось скоплением их в ткани мозга (Рнс 6).

и меченые 1-125 анти-альфа-1-ВС- и аити-альфа-2-ВС-АТ, введенные после прорыва ГЭБ Ш меченые 1-125 анта-альфа-1-ВС- и анти-альфа-2-ВС-АТ, введенные нормальным животным

Рисунок 6. Распределение 1251 меченых АТ к а,-ПС и а2-ВО на третьи сутки после

введения препарата.

Сравнение морфологической картины ткани мозга у животных, с доказанньш феноменом аутоантительной агрессии показало, что у животных с нарушенным гемато-знцефалическнм барьером акти-ЫЭЕ-антитела, прорвавшиеся через гематоэнцефали-чесхнй барьер приводили к эффекту выраженного набухания нейронов, к их диф-

фузному отеку, а также - расширению межклеточных промежутков. Кроме того, цитоплазма нейронов просветлялась, наблюдался периферический хроматолиз, увеличивалось количество светлых вакуолей. С другой стороны, был обнаружен отек и набухание астроцитов и диффузная пролиферация олигодедроглиоцитов. Однако эта изменения по сравнению с вышеуказанными отступали на второй план по степени их выраженности. В контрольной группе животных (животные с неповрежденным гематоэн-цефалическим барьером) вышеуказанные эффекты отсутствовали.

Таким образом, в настоящий момент у нас негг сомнений в том, что прорыв анги-^Е-антитела через поврежденный гематоэнцефалкческий барьер в направлении кровь-мозг, может вызвать целый ряд метаболических нарушений, следствием которых являются обнаруживаемые морфологические изменения в ткани мозга.

Эти данные, на наш взгляд, определяют очевидные перспективы в анализе механизмов целого ряда нервно-психических заболеваний, в патогенезе которых имеет место нарушение функций гематоэнцефалического барьера, а также формируют новые подходы, на основе которых могут быть разработаны методы их специфической коррекции.

ВЫВОДЫ

1) Разработан способ очистки нейроспепифической енолазы на основе комбинации высаливания, ацетонового фракционирования, ионообменной, гидрофобной хроматографии, гель-фильтрации и изохроматофокусирования, позволяющий получать препарат ^Е высокой степени гомогенности, необходимой для изучения физико-химических свойтств, структуры и для создания иммунохимических диагностикумов.

2) Разработаны и апробированы в клинико-лабораторной практике высокочувствительные иммуноферментные тест-системы для определения ЫБЕ и анти-ЫБЕ-антител в биологических жидкостях. Созданные тест-системы отличаются высокой точностью, надежностью и специфичностью.

3) Иммуноферментные тест-системы анализа ЫБЕ и анти-МЗЕ-антител мшут быть использованы при диагностике и контроле за эффективностью проводимой терапии ряда заболеваний ЦНС, в патогенезе которых имеет место нарушение проницаемости гемагоэнцефалического барьера.

4) Иммуноферментный анализ ЫЭЕ может быть внедрен в комплексную диагностику, дифференциальную диагностику и контроль за эффективностью проводимой терапии мелкоклеточного рака легкого

5) 3 эксперименте на крысах показан феномен появления н анти-К5Е-антител в сыворотке крови животных в том случае, когда имеет место нарушение

проницаемости гематоэнцефалического барьера при экспериментально вызванной нейролепсии и острой ишемии головного мозга.

6) Экспериментально доказана возможность избирательного накопления радиоактивной метки в ткани мозга при введении в кровоток, меченых 1И1 анти-ЫЗЕ-антител на фоне повышенной проницаемости гематоэнцефалического барьера. Эсперименталь-, но подтвержден факт агрессии анти-К5£-аяютел в направлении кровь-мозг с последующим повреждающим воздействием на клеточные структуры мозга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Иммуноферментные тест-системы для анализа ЫБЕ и анти-ЫЗЕ-атител могут быть использованы в комплексной диагностике и контроле за эффективностью проводимой терапии заболеваний, в патогенезе которых имеет место нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера.

Иммуноферменгная тест-система для анализа КЭЕ может быть рекомендована для диагностики, дифференциальной диагностики н контроля за эффективностью проводимой терапии мелкоклегочного рака легкого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. В.П. Чехонин, Н.Ю Беляева, С.П. Пауков, Р.Ц. Лиджиева, Е.А.. Коротеева, СГ. Морозов, Л.Т. Михальчук, Е.А. Караганова, Е.В. Матушевская, ДА. Лабунский, Р.Г Биктимиров. И. А. Беляева, О.И. Турина, О.М. Антонова - Механизмы аутоагрессии антител к неироспецифическим белкам в эксперименте. // В кн.: Актуальные проблемы обшей и судебной психиатрии., М., 1993 г.-С. 352-359.

2 Чехонин В.П, рябухин И А., Белопасов ВВ., Турина О.И., Бреусенко Л.Е., Анин А..Б , Матушевская Е.В., Антонова О.М. - Иммуноферментный анализ антител к нейроспецифическим белкам в оценке состояния функции ГЭБ.// Иммунология, 1997 -JVs 2 - С. 67-69.

3. V.P. Chekhonin, I.A. Ryabukhin, О.М. Antonova, LA. Beiyacva - Targeting transport of the hydrophobized anti GFAP and az-glycoprotein antibodies into the rat brain // Fifth International Simposium on Delivary and Targeting of Peptides, proteins and genes, 1995, Leiden, The Netherlands - P 14.

4. Беляева И.А., Антонова O.M., Анин A.H., Чехонин В.П. - Резистентность гемато-энцефаличесхого барьера при клещевой нейроинфекции (болезнь Лайма, клещевой энцефалит) // ЖНИГ1 им. Корсакова - 1995 - Л° 6 - с. 25-29.

5. Chekhonin V., Kabanov A, Ryabukhin I, Antonova О., Khrustaleva N., Belyaeva i., Anin A., Alexandrovsky U., Dmitrieva T. - Anti-alpha2-GP and anti-GFA antibodies as the Vectors for Targeted Delivery Haloperidol into the Giial Cells.// XXth C.J.N.P.Congress, Australia, 1996-30-P. 110.

6. Турина О.И., Рябухин И.А., Анин A.H., Антонова О.М., Дегтярев Д.Н., Рогапсин С.О., Володин Н.Н, Чехонин В.П. - Исследование проницаемости ГЭБ у новорожденных крысят в условиях индуцированных гипертермических судорог // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997 - №2 - С. 17-20. .

7. Chekhonin V., Antonova О., Anin A., Ajkamalov S. - Targeting delivery of halloperidol into the human brain-new approach for drug delivery // X World Congress of Psychiartry, Madrid, 1996 - Poster, № 6 - P. 316.

8. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Турина О.И., Анин АН., Антонова О.М., Белопасов В В. - К вопросу о механизмах аутоагрессии антител к нейроспецифическим белкам через ГЭБ. // Российский психиатрический журнал - 1997 - № 1 - С. 43-45.