Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован

Блинов, Дмитрий Владиславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован"

На правах рукописи УДК 612.648+16-053.3/(048)

БЛИНОВ

ДМИТРИЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙАНАЛИЗ НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ В ОЦЕНКЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ПЕРИНАТАЛЬНОМ ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ЦНС (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.00.04 -Биохимия 14.00.09-Педиатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2004

Работа выполнена в ПНЦССП им. В.П. Сербского, Российском Государственном Медицинском Университете

Научные руководители:

Член-корреспондент РАМН, профессор В П.Чехонин Член-корреспондент РАМН, профессор Н.Н. Володин Научный консультант:

Кандидат медицинских наук, с.н.с. СВ. Лебедев Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Терентьев Александр Александрович. Доктор медицинских наук, профессор Дементьева Галина Михайловна

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины.

Защита состоится «_»_2004 г.

в «_» часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.072.01 Российского

Государственного Медицинского университета. Адрес: г. Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор.

Джанашия П.Х

2004-4 26855 |

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Гипоксически-ишемическое поражение головного мозга в перинатальном периоде (ГИППГМ) является одной из основных причин смертности новорожденных, а также развития тяжелой патологии ЦНС с исходом в инвалидизацию [Барашнев ЮЛ, 2000; Almini R. et al, 2000; Volpe J. et al, 2000].

Несмотря на интенсивные исследования в этой области, надежных средств . лечения последствий ГИППГМ практически нет, поскольку патогенез хронгоации нейродегенеративного процесса, являющегося определяющим моментом для течения и исходов ГИППГМ, во многом не известен. В качестве достаточно продуктивной рассматривается гипотеза о включении аутоиммунных механизмов в патологический процесс вслед за первичным повреждением нервной ткани при ряде заболеваний (опухоли, болезнь Паркинсона, травма мозга) [Чехонин и соавт., 2000; Ганнушкина ИВ., 2003]. В связи с этим, в последние десятилетия отмечен возрастающий интерес к нейроспецифическим белкам (НСБ), как к сывороточным маркерам патологических процессов и травм головного мозга, в которых определенное место отводится нарушению резистентности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [Buttner Т. et al., 1997; Eng L.F et а!., 2000; Nagdyman N. et al., 2001; Nedelcu J. et al., 1999]. Это также актуально и в связи тем, что клиническое и инструментальное обследование не всегда дают возможность достоверно верифицировать дегенерацию нервных клеток в ткани головного мозга у детей с ГИППГМ, что существенно затрудняет адекватную оценку состояния больного и прогноз.

Для исследования нейродегенеративного процесса и. проницаемости ГЭБ в направлении мозг-кровь широко применяется иммуноферментный анализ нейрос-пецифических антигенов (Чехонин BJL и соавт., 2000; Дмитриева Т.Б., 2003; Eiig L.F et al., 2000]. Одними из наиболее изученными среди них являются глиофибрил-лярный кислый протеин (GFAP) структурный белок промежуточных филаментов астроцитов, и нейроспецифическая енолаза (NSE) - гликолитический цитоплазма-тический фермент нейронов, катализирующий превращение 2-фосфоглицерата в 2-фосфоенолпируват [Eng LF et al., 2000; Oh S.R et al., 2003].

Исследования, выявившие повышение проницаемости ГЭБ для НСБ у новорожденных с ГИППГМ, преимущественно проводились лишь в течение нескольких первых суток жизни, с анализом лишь одного из НСБ [Blennow M. et al., 2001; Garcia-Alix A. et al., 1994; Nagdyman N. et al., 2001]. Динамика проницаемости ГЭБ при ГИППГМ одновременно для нескольких НСБ, которые помогли бы охарактеризовать дегенеративный процесс и глиального и нейронального компонентов ткани мозга в относительно отдалённом периоде патологического процесса, до сих пор не была изучена ни в клинике, ни в эксперименте.

Известно, что нейродегенеративный процесс сопровождается изменением содержания НСБ не только в периферической крови, но и (по-видимому, в первую очередь) в цереброспинальной жидкости. Последнему посвящено большое количество исследований [Berger R. et al., 2002; Blennow M et al., 2001; Garcia-Alix A. et aL, 1994]. Вместе с тем, результаты сопоставления таких данных с уровнем НСБ в сыворотке крови, до сих пор остаются не известными.

Очевидно, что решение поставленных проблем практически невозможно только путём клинических исследований, т.к. неизбежно возникают ограниче-. ния, обусловленные частотой взятия проб крови и ликвора у детей с ГИППГМ. Поэтому необходимо проведение исследований на адекватных экспериментальных моделях данной патологии для уточнения патогенеза ГИППГМ, в частности, с целью выяснения pоли нарушения проницаемости ГЭБ для НСБ в хронизации нейродегенеративного процесса и поиска новых подходов к диагностике, терапии и реабилитации пациентов с ГИППГМ. Наиболее часто используется моделирование ГИППГМ по методу J. Rice [J.Rice J. et al., 1981], воспроизводящему преимущественно одностороннее постнатальное гипоксиче-ски-ишемическое повреждение мозга, и по методу В. Lubec [Lubec В. et al., 1997], моделирующему внутриутробную асфиксию плода которая вызывает диффузное повреждение ткани обеих полушарий мозга.

В существующих моделях ГИППГМ недостаточно проработаны вопросы морфологических, неврологических и поведенческих критериев оценки динамики нарушения деятельности нервной системы в постнатальном периоде, что совершенно необходимо для анализа результатов экспериментальной терапии. В част-

ности, традиционные методы оценки моторных и неврологических нарушений у крысят носят во многом субъективный характер [Чехонин В.П. и соавт., 2002; Balduini W. et al., 2000]. Следует отметить, что в большинстве экспериментов животных исследуют лишь в острый период, до 7 дней после гипоксически-ишемического повреждения, без анализа возрастной динамики состояния ЦНС [Almini R et al., Kohlhauser С. et al., 2000; Lubec B. et aL, 1999; Pulera M. R. et al., 1998]. Это определило необходимость разработки и испытания комплекса объективных инструментальных тестов для оценки динамики психоневрологического дефицита, проведения морфологического анализа состояния высокочувствительных к гипоксии и ишемии нейронов CAl-зоны гиппокампа в обеих используемых моделях ГИППГМ, а также анализа изменений размеров полушарий и боковых желудочков мозга у крыс с асимметричным повреждением мозга.

Цель работы: Количественный иммунохимический анализ NSE и GFAP, как критериев проницаемости ГЭБ в динамике гипоксически-ишемического перинатального поражения головного мозга в клинике и эксперименте.

Задачиработ ы:

-иммунохимический мониторинг NSE и GFAP в сыворотке крови детей с ГИППГМ различной тяжести в течение 24 недель постнатального развития;

-моделирование ГИППГМ на крысах и мониторинг состояния функций ЦНС в течение 12 недель с помощью инструментальных методов оценки психоневрологического статуса животных;

- количественный динамический иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сыворотке крови и СМЖ крыс с ГИППГМ;

- анализ связи концентраций NSE и GFAP в сыворотке крови и ликворе с тяжестью поражения ЦНС, его функциональным состоянием, а также с процессами нейродегенерации после ГИППГМ в клинике и эксперименте.

Научная новизна:

1. Впервые устаноален феномен устойчивого (в течение 6 месяцев) достоверного повышения уровня NSE и GFAP в сыворотке крови у детей с ГИППГМ характеризующийся наличием двух пиков (на 1-й неделе и в конце первого месяца жизни).

2. Впервые установлено, что концентрации NSE в образцах сыворотки крови детей с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (ВЖК) существенно (в 3-8 раз) превышают таковые у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией (ПВЛХ что может быть использовано при оценке особенностей патологических изменений в ткани мозга при ГИППГМ.

3. Впервые установлено, что при моделировании ГИППГМ по методу J. Rice [J. Rice et al., 1981] и по методу В. Lubec [В. Lubec et al., 1997] нарушения интегральных показателей (отставание массы тела, двигательная гиперреактивность) и психоневрологический дефицит имеют место длительный период времени, вплоть до половозрелого возраста. При этом впервые выявлен феномен кетамин-индуцированной вращательной асимметрии у животных с ГИППГМ, моделированной по методу J. Rice et al., которая сохраняется на высоком уровне не менее трех месяцев постнатального развития.

4. Впервые показано, что у животных, при моделировании ГИППГМ обоими методами в течение 3-х месяцев постнатального развития выявляется хронически протекающий процесс нейродегенерации и нарушение проницаемости ГЭБ для NSE и GFAP. Эти процессы характеризуются периодическим возрастанием концентраций исследуемых антигенов до пиковых значений, коррелирующих с ухудшением ряда показателей функций ЦНС (прирост массы тела, К-тест, неврологический статус, тесты пассивного избегания, Ротород, У-образный лабиринт).

5. Впервые установлено, что у крыс с моделированным ГИППГМ происходит резкое увеличение содержания NSE и GFAP в ликворе большой цистерны мозга, что прямо свидетельствует о наличии нейродегенеративного процесса. Характер динамики этих показателей аналогичен таковым в сыворотке крови.

Практическаязначимость:

- Комплексный иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сыворотке крови позволяет объективно оценить резистентность ГЭБ при ГИППГМ течение нейро-дегенеративного процесса и, что может быть использовано для выбора адекватной терапии.

- Результаты исследования содержания НСБ в сыворотке крови и ликворе могут быть использованы для биохимической верификации тяжести и типа перинатального повреждения головного мозга новорожденных детей.

- Разработанный нами комплекс инструментальных методов мониторинга физиологических функции организма при моделировании ГИППГМ на животных по методу J.Rice и методу B.Lubec может быть использован при поиске новых подходов к лечению и реабилитации пациентов в постишемический период.

Апробация работы проведена на объединенной научно-практической конференции кафедры неонатологии ФУВ и кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ, сотрудников лаборатории иммунохимии отдела биологической психиатрии ГНЦССП им. В.П. Сербского, сотрудников ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова, Основные положения работы были представлены в периодической печати и на межлабораторных конференциях ГНЦССП им. В.П. Сербского (2000-2003 гг.).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано_печатных работ,

из них - статьи в периодической печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на_машинописных страницах; состоит из введения,_глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В работе приведены данные обзора литературы, характеристика объекта, материалов и методов исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение.

Диссертация иллюстрирована_рисунками и содержит_таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

Определение NSE и GFAP в сыворотке крови и ликворе осуществляли при помощи "сэндвич-варианта" твердофазного иммуноферментного анализа [Voller A. et al, 1976] в модификации В Л Чехонина и соавт. [2000], с помощью иммунофер-ментных тест-систем на основе препаратов моноклональных анти NSE и GFAP антител, полученных в лаборатории в лаборатории иммунохимии ГНЦССП им. В.П. Сербского. Тест-системы иммуноферментного анализа NSE и GFAP, разработанные и стандартизованные в этой же лаборатории позволяли специфично, надежно, воспроизводимо определять нейроспецифические антигены в интервале концентраций от 1 до 64 нг/мл.

Клинико-лабораторные исследования Проанализированы образцы сыворотки крови 49 детей (срок гестации 3241 неделя), с гипоксически-ишемическим перина-

тальным поражением ЦНС (пациентам проводилось необходимое обследование и адекватная терапия, в т.ч. интенсивная) и 28 здоровых доношенных детей, родившихся от здоровых матерей с физиологически протекавшими беременностью и родами (контрольная группа).

У детей обеих групп определяли содержание №Е и ОРЛР в сыворотке крови, взятой из периферических вен на 1,2,3,4,8 и 24-й неделях жизни при плановом биохимическом исследовании периферической крови.

При анализе результатов исследований содержания НСБ в крови выделены группы с различной степенью тяжести по шкале Апгар на первой минуте: (1-6 балла - 28 и 7-10 баллов - 19 детей), с особенностям очаговых поражений ткани мозга: внутрижелудочковые кровоизлияния (ВЖК — 14 детей) и перивентрикулярные лей-комаляции (ПВЛ - 7 детей).

Экспериментальные исследования. Всего использовали 386 крыс линии Вистар обоих полов. Проведено две серии экспериментов по моделированию ГИППГМ по методу .Г.Шсе е! а1. (135 крыс - 12 пометов) и по методуВ. ЬиЪес е! а1. (220 крыс - 19 помётов). При моделировании по .Г.Шсе е! а1. в опытную группу вошло 68, а в контрольную 67 животных, при моделировании по В. ЬиЪес е! а1. 66 и 69 крыс, соответственно. Относительное количество мужских и женских особей в этих группах было одинаковым.. Эксперименты проводили в соответствие с этическими требованиями соответствующей декларации ВМА.

При моделировании по I. Шсе 7-дневным крысятам через разрез на шее выполняли одностороннюю окклюзию ОСА с последующей гипоксической гипоксией (помещение в атмосферу, содержащую 8% О2) в течение 3,5 часов._Животным из группы контроля выполняли все манипуляции, кроме окклюзии ОСА и гипоксиче-ской гипоксии.

При моделировании по В. ЬиЪес выделенные рога матки крыс на последнем дне гестации помещали в водяную баню (37°С) на 15 минут (аноксическая экспозиция). Затем плоды извлекались и после перевязки пуповины помещались в инкубатор на 1 час, после чего подсаживались к кормящим самкам. В качестве контроля использовали животных, которых выделяли из рогов матки немедленно после гис-тероэктомии, т.е. без аноксической экспозиции.

Измерение массы тела, определение неврологического статуса, двигательной активности проводили еженедельно, сразу после моделирования поражения мозга.

Для исключения эффектов, связанных со сменой тала питания, изменениями гормонального фона вследствие полового созревания и т.п., тестирование моторных и когнитивных функций ЦНС начата через 4 недели после повреждения и определяли каждые последующие две недели в отдельные дни для каждого теста.

Неврологический статус крыс определяли по максимальному баллу шкалы Menzies [ Menzies S. et al, 1992].

Двигательную активность исследовали на автоматическом мониторе Coulboum (Coulbom, США). Измеряли абсолютное количество движений, в том числе, мелких и крупных движений в течение 30 минут.

Двигательно-координационные нарушения определяли по способности животных к удержанию на вращающемся стержне - тест «Ротород» [Balduini W. et aL, 2000].

Для выявления вращательной асимметрии животным вводили внугрибрю-шинно 5% раствор кетамина в дозе 50 мг/кг и помещали в полусферу автоматического ротометра конструкции U. Ungerstend на 30 минут. Анализировали разницу между количеством оборотов влево и вправо у отдельных крыс за 1 мин (К-тест) [Лебедев, и соавт., 2003].

В тесте пассивного избегания учитывали продолжительность латентного периода в секундах от момента посадки на платформу до касания пола камеры всеми лапами у предварительно обученной крысы. При анализе результатов сравнивали количество особей с латентным периодом менее 40 сек.

При исследовании в У-образном лабиринте водно-депривированные животные находили поилку в одном из рукавов лабиринта При анализе результатов сравнивали количество особей с латентным периодом подхода к поилке более 40 сек.

В различные сроки часть крыс перфузировали 4%-м раствором парафор-мальдегида для выполнения морфологического анализа головного мозга.

Площадь полушарий и боковых желудочков оценивали на 8 серийных коронарных криосрезах толщиной 40 мкм от каждого мозга (4 на уровне paraveniricu-lar thalamus nucleus, paraventricular thalamus nucleus posterior и 4 на уровне triangular septal nucleus), окрашенных по методу Ниссля. Препараты сканировали, и средствами программы Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems, США) выделяли контуры полушарий и боковых желудочков мозга Площади упомянутых структур измеряли в пикселях.

Анализ наличия погибших нейронов в зоне СА1 гиппокампа проводили на коронарных парафиновых срезах толщиной б мкм, окрашенных по Нисслю. Погибшими считали нейроны измененной формы (полигональные), гиперхроматиро-ванные, без визуализации ядерных структур, с отеком вокруг клетки (зона просветления).

Образцы крови получали путем пункции нижней полой вены у наркотизированных животных непосредственно перед перфузией, а ликвор - путем пункции большой цистерны мозга стереотаксическим методом. Образцы сывороток крови и ликвора хранили при -70°С до исследования в них концентраций NSE и GFAP.

При статистической обработке данных использовали методы дисперсионного анализа, t-критерий Стьюдента, коэффициент ранговой корреляции Спирмена и U-критерий с использованием функции Фишера. Также анализировали относительные величины исследованных показателей, выраженные в натуральных логарифмах Обработку результатов проводили, используя программы Prophet 5.0 (BBN System and Technologies, США) и Excel XP из пакета приложений Microsoft Office ХР (Microsoft, США).

Результаты исследования их обсуждение.

Характеристика иммунохимическихтест-систем для определения концентрации NSEu GFAP в биологических жидкостях

Перед проведением иммуноферментного анализа были стандартизованы иммуноферментные тест-системы на основе полученных моноклональных антител для определения уровня NSE и GFAP в биологических жидкостях. Калибровочные кривые иммуноферментного определения NSE и GFAP представлены на рисунке 1.

Работы, проведенные в направлении стандартизации тест-систем, позволяют их характеризовать как высокоспецифичные, обладающие высокой специфичностью, точностью, надежностью и воспроизводимостью.

Чувствительность использованных в работе тест-систем составляла 0,8 нг/мл., а рабочий участок определения антигенов локализовался в диапазоне концентраций 0,8-128 нг/мл как для GFAP, так и для NSE.

0,4 0,8 1,6 4 16 32 64 128 256

нгАмл

- ■ - ЫЭЕ —СРАР

Рис. 1. Калибровочные кривые иммуноферментного определения NSE и GFAP. Выделены рабочие отрезки калибровочных кривых.

Динамика содержания NSEи GFAP в сыворотке крови детей с ГИППГМ

Уровни концентраций исследуемых НСБ у здоровых детей составили: NSE

У детей с

ГИППГМ концентрации НСБ в образцах сыворотки крови на всех сроках исследований (1,2,3,4,8 и 24 нед) были достоверно выше (табл. 1) Профиль элиминации НСБ в кровь у них в течение первого месяца жизни характеризуется наличием двух максимумов концентраций: на 1-й неделе (ЛБЕ - 28,9±1,9 НгЛиг И СРАР - 42,1±2,7 нг/мл) и в конце месяца У детей с

большей степенью тяжести ГИППГМ по шкале Апгар (1-6 баллов) определялись достоверно более высокие пиковые уровни NSE и GFAP, чем в группе с оценкой 710 баллов (см. табл. 1). Обращает на себя внимание определенная очередность появления вторых «пиков» НСБ - GFAP на 3-й неделе, NSE - на 4-й неделе жизни.

Концентрации NSE и GFAP в сыворотке крови детей с ГИППГМ в течение 6 месяцев постнатального развития имели отрицательную корреляционную связь с показателем тяжести перинатального поражения ЦНС по шкале Апгар на 1-й мину-

те в баллах (коэффициенты корреляции г всей группы детей с ГИППГМ составили для ШЕ от -0,48 до-0,69, для ОРЛР от -0,37 до -0,56).

Табл. 1. Содержание НСБ в сыворотке кровидетей с ГИППГМ.

НСБ Группы детей Концентрация НСБ, нг/мл.

1 пса. 2 над. 3 над. 4 над. 8 вед. 24 вед.

Контроль 2,5±0,5 2^±0,4 2^5*0,5 2,7±0,5

ГИППГМ, в т.ч.: 28,9±1,9 14,7±1,6 15,7±1,5 23,1£2£ 12,9*1,9 13Д£23

Апгар 1-6 33,2±2,6и 21,5±1,8^ 20&2,01Л 33,Ш,^ 18,7*2,71"£ 20,4*3,4м

Апгар 7-10 23,ШД' &,5±1,0* 5,1±1,1'* №1,4

СРЛР Контроль 4,ОНО,8 4,1*0,8 3,610,7 2,1*0,4 3,5±0,7 3,0±0,6

ГИППГМ, в т.ч.: 42,1±2,7 36,2±2,4 39,1±3,3 18,4±2^ 17,0±2,4 15,(Ш^

Апгар 1-6 45,'7±3,24-5 44, Ш;б^ 52,1±3^ 25,Ш,0^ 22,1±3Г34'3 годьз,^

Апгар 7-10 26,1±2,86 23,7±ЗД6 11,043,0" 8,7±2,8

Примечание. Различия в концентрации №Е и ОРЛР с контрольной группой достоверны на всех сроках исследования. Различия в концентрациях №Е и ОРЛР статистически достоверны (р<0.05) между группами (указано цифрами верхнего регистра): -Апгар 1-6 и Апгар 7-10;2- Апгар 1-6 и группой контроля;3- Апгар 7-10 и группой контроля;4- Апгар 1-6 и Апгар 7-10;5- Апгар 1-6 и группой контроля;6- Апгар 7-10 и группой контроля.

Оказалось, что концентрации №Е и ОРЛР в образцах сыворотки крови детей с ВЖК существенно превышали (в 3-8 раз) таковые у детей с ПВЛ (табл. 2).

Таким образом, установлено, что у детей с ГИППГМ имеет место длительное (не менее 6 месяцев постнатального развития) повышение содержания нейроспецифических антигенов К8Е и ОРЛР в сыворотке крови, что свидетельствует о наличии хронического деструктивного процесса в мембранах нейронов и астроцитов, сопровождающегося нарушением проницаемости ГЭБ для исследуемых НСБ. При этом содержание НСБ в сыворотке крови коррелировало как с тяжестью исходного состояния новорожденных с ГИППГМ, так и с особенностями поражения ткани мозга.

Табл. 2. Содержание НСБ в сыворотке крови детей с ВЖК и П,ВЛ

НСБ Группы детей Концентрация НСБ, нг/мл.

1 вед. 2 иед. Знед. 4нед. 8 вед. 24 вед.

NSE ВЖК 18,б±2,6" 22,3*2,6* 35*4,9* 21,3*4,1' 23,9±4,9"

ПВЛ 20,5*2,2 5,8*1,5 7,9*3,2 3,8*0,8 2^±1,1

GFAP ВЖК 49,1 ±5,0 41,&ЬЗ,9" 49,7*6,2" 21,6Н5™ 25,1*3,1" 22,7*4,1"

ПВЛ 38,8*0,7 26,04,6 19,9*4,2 7,5*3,5 4,7±1,8 3,3±1,4

Примечания: Различия концентрации в группах ВЖК и ПВЛ статистически достоверны (р<0.05): *-NSE;**-GFAP

Для проверки выявленных особенностей динамики элиминации НСБ в периферическую кровь у детей с ГИППГМ проведен детальный анализ изменений концентрации NSE и GFAP в сыворотке крови и ликворе крыс с моделированным ГИППГМ. Важно было ответить на вопросы: действительно ли при развитии патологического процесса в ЦНС после гипоксически-ишемического повреждения головного мозга в перинатальном периоде происходит спонтанное периодическое повышение уровня НСБ в сыворотке крови, а повышению концентрации NSE предшествует пик концентрации GFAP.

Исследование содержания NSEu GFAPв биологических жидкостях и анализ связи уровня НСБс функциональным состояниемЦНСприэкспериментальноммодели-ровании ГИППГМ.

При моделировании перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС по методу J. Rice et al. выживаемость крыс за 12 недель наблюдения составила 90%, (контроль -100%), по методу B.Lubec et al. - 70%, (контроль - 90%).

В таблицах 3 и 4 представлены данные о состоянии функций организма животных с ГИППГМ в течение 3 месяцев постнатального развития, касающиеся, в частности, длительности, направления и статистической достоверности изменений.

Установлено, что при моделировании ГИППГМ обоими методами имели место длительные, вплоть до половозрелого возраста (3 месяца), и достоверные в сравнении с контрольной группой изменения: отставание в приросте массы тела,

двигательная гиперреактивность (количество мелких и крупных движений), нарушения моторной координации (тест РотородХ а также отклонения в когнитивной сфере (тест пассивного избегания, тест в У-образном лабиринте).

Табл. 3. Изменение показателей общего состояния крыс и функционирования ЦНС при моделировании ГИППГМ по методу XRюe.

Показатели в гесты Характер и статистическая достоверность изменения показателей в сравнении с группами контроля на различных сроках, иед.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Масса тела - 1** ф*« 4.** 4,*ф 4** i-

Мелкие до-я - f f*» t» "I1** X*»

Крупные дв-я I1*» - f* T*

Невр. дефицит f** f** -ft» f**

К-Тест f»* f

Тесг«ротород» l* i** i*

Теств У-обрлаб. - t - - -

Тест пасс, изб-я i - 1 - i

Обозначения: | - превышение показателей; | - снижение показателей, - - без изменений; *• р<0.05;**-р<0.01.

Табл. 4. Изменение показателей общего состояния крыс и функционирования ЦНС при моделировании ГИППГМ по методу B.Lubec.

Показатели и тесты Характер и сгатнсгнческая достоверность изменения показателей в сравнении с группами контроля на различных сроках, лея.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Масса тела - 4** i** 4*

Мелкие до-я - f - t f t* t t

Крупные дв-я - - - t f t t f*»

Тест «ротород» i i - 4

Теств Y-обрлаб. - - - -

Тест пасс, изб-я 1* - - 1* 4,.

Обозначения: см. табл. 3

Животные с ГИППГМ по методу J. Rice, кроме того, характеризовались устойчивыми неврологическим дефицитом и вращательной кетамин-индуцированной асимметрией (К-тест).

Моделирование по методу 1 Rico с соавт. Моделирование по методу El Lubec с coasr.

1 2 3 4 6 8 10 12 1 2 3 4 6 8 10 12

•♦♦-масса меткие дамвмя -в-иуиывдадавния

-*-Ротарод -*-у-обр. паб. -*-гйсс. юб.

—К-тест -*-Невр.дефЧ1Т

Рис. 2. Степень отклонений показателей состояния крыс с ГИППГМ от таковых в контрольных группах животных.

По оси абсцисс - время после повреждения, недели; по оси ординат -- натуральный логарифм (Ьп) относительныхвеличин показателей сосотоянияживотныхопытной группы (показатели контрольной группы приняты за 100% и соответствуют нулевому уровню Ьп)

Анализ исследованных показателей выявил, что наибольшую степень отклонения от уровней контроля, имел неврологический дефицит и вращательная асимметрия (К-тест) у животных с ГИППГМ по методу ЬШсе, а при моделировании ГИППГМ по методу Б.ЬиЬес - нарушения в когнитивной сфере (тест пассивного избегания, тест в У-образном лабиринтеХрис. 2).

При морфологическом исследовании мозга в СА1 зоне гиппокампа мозга крыс с ГИППГМ по методу ЬШсе е! аЬ и по методу Б.ЬиЬес е! а1. на всех сроках исследований визуализированы погибшие нейроны, располагавшиеся группами, или сплошь. Кроме того, у крыс с ГИППГМ по методу ЬШсе е! аЬ происходило достоверное уменьшение размеров левого полушария мозга на стороне ОСА в течение первого месяца после моделирования. Последующие колебания этого показателя находились в пределах физиологической нормы (рис. 3).

Изменения размеров левого бокового желудочка мозга были более выраженными и динамичными. Так, через 1 неделю после повреждающего воздействия на мозг происходило уменьшение (по-видимому, из-за послеоперационного отёка ткани мозга), а затем - резкое увеличение размеров левого бокового желудочка в течение последующих трех недель. В последующем, на 2-м и 3-м месяцах тестирования,

этот показатель снижался, однако к концу эксперимента левый желудочек оставался несколько увеличенным (см рис 3).

1 2 3 4 6 8 10 12

время после повреждения, нед.

Рис. 3. Изменение размеров полушарий и боковых желудочков мозга крыс с ГИППГМ по !Шсе

А% - относительные различия площадей левых и правых полушарий и желудочков на срезах мозга (нулевой уровень - размеры правого полушария и правого бокового желудочка мозга, принятые за 100%) — полушария; -желудочки; затемненная зона - уровень различий размеров левых и правых полушарий и боковых желудочков мозга у контрольных крыс (не превышал 4%) •- р<0.05 в сравнении с контролем

Представленные результаты свидетельствуют о том, что методы моделирования ГИППГМ J.Rice et al. и BLubec et al. вполне адекватны для динамического исследования патологического процесса в ЦНС после гипоксически-ишемического поражения организма в перинатальном периоде Это позволило нам приступить к следующему этапу экспериментальных исследований - иммунохимическому анализу нейродегенеративного процесса в ЦНС и состояния проницаемости ГЭБ для НСБ в течение относительно длительного постнатального периода (до половозрелости) у крыс с ГИППГМ

У животных контрольных групп в течение первых трёх месяцев жизни уровень GFAP в сыворотке крови составлял в среднем, 1,7±0,4 нг/мл, a NSE 0,7± 0,1 нг/мл Максимальные концентрации НСБ отмечались в первые две недели эксперимента и не превышали 2,8±2,4 нг/мл для GFAP и 1,7±1.3 нг/мл для NSE.

Рис. 4. Средние значения концентраций NSE и GFAP в сыворотке крови у крыс с ГИППГМ: А - по J. Rice; Б - по В. Lubec.-NSE, - GFAP; * -р<0,05 в сравнении с контролем.

Результаты исследования концентраций НСБ в сыворотках крови у животных при моделировании по методу J.Rice и B.Lubec представлены на рисунке 4. Концентрации НСБ в сыворотке крови крыс с ГИППГМ в течение всего времени наблюдения были достоверно выше таковых у крыс из группы контроля и претерпевали выраженные «волнообразные» изменения. Так, через 1 неделю после гипоксически-ишемического воздействия имели место максимальные уровни NSE 19,6±5,8 нг/мл; GFAP 24,9±11,0 нг/мл (ГИППГМ по методу J.Rice et al.), NSE 24,0±0,9 нг/мл; GFAP 18,6±8,4 нг/мл (ГИППГМ по методу B.Lubec et al.), а затем "пиковые" подъёмы содержания НСБ. При этом, при моделировании по методу J. Rice et al. пики GFAP предшествовали подъемам концентра-

ции NSE, и расхождения профилей НСБ носили существенный характер (коэффициенты корреляции г, на 3, 8 и 12 неделях после повреждения, соответственно, составили -0,52; -0,47 и -0,45). При моделировании ГИППГМ по методу B.Lubec выраженные волнообразные изменения были характерны только для GFAP (пики на 3 и 10 неделях), а регресс концентраций NSE происходил более равномерно, хотя на 3 и 8 неделях имело место определенное "расхождение" профилей концентраций GFAP и NSE (r-0,40 и r- 0,33, соответственно).

Для выявления связи повышения уровня НСБ в сыворотках крови с показателями функционирования ЦНС и организма в целом был выполнен корреляционный анализ. Уровни НСБ в сыворотке крови в большей мере коррелировали с показателями функционального состояния организма при моделировании ГИППГМ по методу J.Rice, чем по методу B.Lubec, а коэффициенты корреляции (г) с концентрациями NSE были более высокими, чем в отношении GFAP. Так, при моделировании ГИППГМ по методу J.Rice концентрация NSE коррелировала на всех сроках исследований с показателями К-теста (r от 0,56 до 0,63Х теста пассивного избегания; исследований в У-образном лабиринте (r от -0,35 до -0,54) и в аппарате Ротород (г от -0,46 до -0,73); с массой тела на 4,6,8 и 10-й неделях (r = 0,59; -0,69; -0,40 и -0,50; со-ответственноХ с количеством мелких движений на 8-й (r = -0,73) и 12-й нед. (г = -0.48); крупных движений на 12-й нед. (r = -0,74) и неврологическим статусом на 4-й (r = 0,38) и 8-й нед, (г = 0,60) после повреждения в перинатальном периоде. Следовательно, с выходом NSE в периферический кровоток при ГИППГМ связаны патологические процессы в ЦНС, сопровождающиеся неврологическим дефицитом, нарушениями в двигательной сфере, моторной координации и в высшей нервной деятельности.

Обнаружение в сыворотке крови NSE и GFAP, концентрации которых в десятки раз превышали донорский уровень, свидетельствует не только о нарушении проницаемости ГЭБ для НСБ, но и, очевидно, в первую очередь, о наличии нейро-дегенеративного процесса (гибель клеток нервной ткани). Поэтому, важно было проанализировать уровень данных нейроспецифических антигенов в СМЖ крыс с ГИППГМ

Концентрации NSE и GFAP в СМЖ у контрольных животных существенно не изменялись на протяжении всего эксперимента. Для моделирования по методу J.Rice et al. средний уровень контроля составлял: NSE 3,70±0,64 нг/мл, GFAP -

6,82±1,08 нг/мл; по методу В. Lubec et al. - 7,00±0,9 шУмл и 5Д9Ю.7 нг/мл, соответственно, за исключением первой недели , когда уровни НСБ были максимальными

и составляли для метода J. Rice: NSE - 16,1044,4 нг/мл; GFAP — 7,93±5,5 иг/мл, для В. Lubec - 30,45±5,0 нг/мл и 82Дк 17,4 нг/мл, соответственно.

Рис. 5. Средние значения концентраций NSE и GFAP в ликворе у крыс с ГИППГМ: А - по J. Rice; Б - по В. Lubec.-NSE, -GFAP; • -р<0.05 в сравнении с контролем

У животных опытных групп концентрации NSE и GFAP в СМЖ превышали таковые в сыворотке крови в 3-8 раз, а динамика изменения их уровней была аналогична профилю НСБ в сыворотке крови (рис. 5) Так, при моделировании

ГИППГМ по методу J.Rice et al. после первоначального повышения обоих НСБ в ликворе на первой неделе (концентрация NSE составила 73,87±26,7 нг/мл; GFAP -82,5±34,0 нг/мл) вторичные пики уровня NSE регистрировались на 6 и 10-й неделях после повреждения (34,2±9,2 нг/мл и 21,8±5,8 нг/мл, соответственно), GFAP - на 3 и 8-й неделях (54,3±17,8 и 25,8±7,8 нг/мл, соответственно). При моделировании по методу В. Lubec et al. уровни NSE и GFAP на первой неделе составили, соответственно, 101,6±29,2 нг/мл и 161,4±19,4 нг/мл. Далее регресс концентраций NSE проходил достаточно плавно, однако и в этом случае сохранялись достоверные различия с контрольными значениями на 6-й неделе, когда уровень данного НСБ составил 32,1±8,4 нг\мл. Пик концентрации GFAP (40,3±12,3 нг/мл) отмечался на 8-й неделе после повреждения.

Анализ показывает, что изменения концентрации НСБ в ликворе прямо и достоверно связаны с изменениями их в крови. Так, коэффициенты корреляции (г) концентраций данных антигенов в сыворотке крови и ликворе составили при моделировании по методу J. Rice на 2,6 и 12 неделях 0,97; 0,81; 0,89 для NSE и 0,69; 0,16; 0,96 для GFAP; при моделировании по В. Lubec на 2,4,6 и 8 нед 0,68; 0,19; 0,95; 0,07 для NSE и 0,%; 0,99; 0,95; 0,95 для GFAP, соответственно (р<0,05). Степень отклонения содержания НСБ в сыворотке крови и ликворе от контрольного уровня также была практически одинакова.

Таким образом, с помощью определения в сыворотке крови и ликворе имму-нохимических маркеров нейронов (NSE) и астроцитов (GFAP) установлено, что после гипоксически-ишемического воздействия в перинатальном периоде изменения в ЦНС характеризуются развитием нейродегенерации, нарушением проницаемости ГЭБ для НСБ и хроническим течением этих процессов.

Исследование феномена прорыва НСБ в периферический кровоток и рати нарушения проницаемости ГЭБ в патогенезе заболеваний и повреждений ЦНС, в том числе и при ГИППГМ, относится к перспективным направлениям современной нейробиологии [Ганнушкина КВ., 2003; Дмитриева Т.Б., 2003; Чехонин B.IL и со-авт., 2000]. Поскольку причины хронизации нейродегенеративного процесса, являющегося определяющим моментом для течения и исходов ГИППГМ у детей, не известны [Барашне'в Ю.И, 2001], необходимо было провести иммунохимическую верификацию нейродегенеративного процесса и состояния ГЭБ при ГИППГМ, и на

этой основе проанализировать связь элиминации НСБ из мозга с нарушениями функций ЦНС.

Наши исследования показали, что у детей, перенесших гипоксически-ишемическое воздействие в перинатальном периоде, имело место выраженное повышение содержания нейроспецифических антигенов NSE и GFAP в сыворотке крови в течение относительно длительного периода (не менее 6 месяцев постна-тального развития). При этом уровни NSE и GFAP были прямо коррелировали с тяжестью перинатального поражения ЦНС (шкала Апгар на 1-й минуте), а концентрации NSE и GFAP в крови детей с ВЖК существенно превышали таковые у детей с ПВЛ Изменения содержания НСБ в крови в течение первого месяца жизни детей с ГИППГМ характеризовались наличием двух максимумов их концентраций: на 1-ой неделе и в конце месяца. При этом второй «пик» концентраций GFAP (через 3 нед) предшествовал второму «пику» концентраций NSE (4 нед) (см. табл.1). Полученные результаты свидетельствуют о текущем процессе нейродегенерации при ГИППГМ (по меньшей мере, о гибели нейронов и астроцитов), сопровождающемся нарушением резистентности ГЭБ для НСБ и их проникновением из ткани мозга в периферический кровоток.

Для выяснения возможной длительности, особенностей течения этих процессов и роли нарушений проницаемости ГЭБ для НСБ в хронизации ней-родегенеративного процесса у детей с ГИППГМ проведены исследования на крысах с моделированными по методам J.Rice et al. и B.Lubec et al. ГИППГМ. Для решения таких задач нами впервые применён комплекс тестов, позволяющих оценивать функциональное состояние ЦНС у крыс от момента рождения до половозрелого возраста (исследование массы тела; двигательной активности; неврологического дефицита; К-тесг, тестирование в Ротароде; в У-образном лабиринте; тест пассивного избегания). Важно, что исследования на животных позволили объективно оценить с помощью иммунохимических критериев не только функциональное состояние ГЭБ (уровень НСБ в сыворотке кровиХ но и собственно, нейродегенера-тивный процесс (по содержанию НСБ в ликворе животных).

Исследования показали, что через 1 неделю после моделирования ГИППГМ происходило резкое увеличение концентрации NSE и GFAP в ликворе, их массивный выход в периферический кровоток (первичное повреждение ГЭБ) и существенное снижение показателей ко 2-й недели после моделирования ГИППГМ. Затем на-

блюдали периодическое (1 раз в 2-3 недели) синхронное повышение этих показателей в ликворе и крови. При этом увеличение содержания GFAP всегда происходило до увеличения концентрации NSE. Повышение уровней НСБ в биологических жидкостях животных совладало с выраженными нарушениями функционирования ЦНС и общего состояния организма (неврологический дефицит, тесты в Ротароде, У-образном лабиринте, тест пассивного избегания). К концу эксперимента содержание НСБ в биологических жидкостях прогрессивно снижалось, но оставалось достоверно выше уровня у контрольных животных включительно до 10 недель постнаталь-ного развития крысят.

Таким образом, в клинических и экспериментальных исследованиях динамики GFAP и NSE в биологических жидкостях при ГИППГМ нами установлен факт продолжительного стойкого увеличения концентрации НСБ с периодическими повторными эпизодами резкого возрастания этих показателей, прямо коррелировавших с тяжестью перинатального поражения ЦНС у детей (шкала Апгар на 1-й минуте) и с нарушениями функционального состояния ЦНС у экспериментальных животных. Полученные данные свидетельствуют о развитии хронического нейродеге-неративного процесса после первичного повреждения нервной ткани при гипокси-чески-ишемическом воздействии в перинатальный период Основываясь на результатах собственных исследований, есть основания, с определённой долей вероятности, связать хронизацию нейродегенеративных процессов в мембранах нейронов и астроцитов при ГИППГМ с выходом нейроспецифических антигенов в периферический кровоток, образованием к ним соответствующих антител (вследствие отсутствия толерантности) и последующим развитием аутоиммунных процессов в ЦНС. По-видимому, зафиксированные нами повторные повышения концентраций NSE и GFAP в ликворе и сыворотке крови при ГИППГМ в клинике и эксперименте обусловлены особенностями течения аугосенсибилизации организма и аутоиммунным повреждением нервных клеток, в том числе астроцитов, формирующих ГЭБ.

Выводы

1. Гипоксически-ишемическое перинатальное поражение головного мозга характеризуется достоверным, более чем 10 кратным (по сравнению с показателями в сыворотке крови здоровых детей) увеличением концентраций NSE и GFAP в сыворотке крови детей на всех сроках исследования (1,2,3,4,8 и 24 нед)-максимально на 1-ой неделе (NSE и GFAP), 3 нед (GFAP) и 4 нед (NSE) постна-тального развития.

2. Моделирование ГИППГМ на крысах, выполненное по методам J.Rice et al. и Lubec et al. может быть применено для исследований динамики нейроде-генеративного процесса и нарушений функционирования ГЭБ в хроническом эксперименте. У животных с моделированными гипоксически-ишемическими перинатальными поражениями головного мозга имеют место стойкие (вплоть до половозрелого возраста) и достоверные изменения состояния ЦНС в сравнении с контрольной группой: отставание в приросте массы тела, двигательная гиперактивность, нарушения моторной координации, а также нарушения в когнитивной сфере. Животные с ГИППГМ, моделированной по методу J. Rice et al., кроме того, характеризуются устойчивыми неврологическим дефицитом и вращательной кетамин-индуцированной асимметрией (К-тест).

3. Иммуноферментный мониторинг GFAP и NSE у крыс с моделированным ГИППГМ выявил феномен продолжительного (10-12 нед.), периодического (1 раз в 2-3 недели) увеличения концентрации этих антигенов в сыворотке крови и ликворе. При этом феномен увеличения уровня GFAP в ликворе и сыворотке крови предшествовал повышению концентрации NSE

4. Повышение концентраций GFAP и NSE в сыворотке крови и ликворе крыс с ГИППГМ прямо коррелируют с функциональными показателями ЦНС и общего состояния организма животных в течение 3 месяцев после экспериментального перинатального повреждения (неврологический дефицит, нарушения в

двигательной сфере и высшей нервной деятельности, отставание прироста массы тела).

5. Иммуноферментный мониторинг GFAP и NSE в сыворотке крови и ликворе позволяет выявлять нарушения резистентности ГЭБ при хронически протекающих процессах нейродегенерации вызванных экспериментальным ги-поксически-ишемическим перинатальным поражением головного мозга. Имму-нохимическая верификация перинатального поражения ЦНС может быть положена в основу оценки динамики патологического процесса, эффективности проводимой терапии, а также поиска новых подходов к лечению и реабилитации пациентов с ГИППГМ.

Практические рекомендации

Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков в сыворотке крови детей, перенесших ГИППГМ, может быть рекомендован для оценки степени тяжести поражения ЦНС и прогноза дальнейшего течения патологического процесса

Динамический иммуноферментный анализ GFAP и NSE может быть рекомендован для объективной оценки резистентности ГЭБ в постнатальном периоде у детей с ГИППГМ. Увеличение концентрации исследуемых НСБ в сыворотке крови свидетельствует о повышении проницаемости ГЭБ гипоксиче-ски-ишемического генеза.

Моделирование ГИППГМ по методам J. Rice et al. и В. Lubec et al. в варианте хронического эксперимента, а также результаты объективных методов динамической оценки функционального состояния ЦНС (кетаминовый-тест, тестирование в ротароде, в У-образном лабиринте, тест пассивного избегания и др.) и иммуноферментного анализа НСБ в сыворотке крови ликворе крыс могут быть рекомендованы для разработки новых подходов к лечению и реабилитации новорожденных с ГИППГМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. В П. Чехонин, С.В Лебедев, Н.Н. Володин, ДВ. Блинов, СВ.Петров, СО. Рогаткин.// Экспериментальное моделирование перинатального гипокси-чески-ишемического поражения мозга - Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2002 - т. 1 - №2 - стр. 9-16.

2. СВ. Лебедев, СВ. Петров, ДВ. Блинов, И.П. Лазаренко, B.IL Чехонин //

Феномен кетамин-индуцированной вращательной асимметрии в оценке двигательных нарушений у крыс с окклюзией средней мозговой артерии. - Бюлл. Эксп. Биол.. Мед. - 2003 - т. 135 - №5 - стр. 500-504.

3. В.П. Чехонин, С.В. Лебедев, С.В. Петров, Д.В. Блинов, И.П. Лазаренко, А.Н. Бойко, ЮМ Мартынов, Е.И. Гусев // Мониторинг неврологического дефицита и нарушений высшей нервной деятельности у крыс с фокальной ишемией головного мозга.. - Бюлл. Эксп. Биол.. Мед. - 2003 - т. 135 -№6-стр. 629-633..

4. В.П. Чехонин, С.В. Лебедев, Т.Б. Дмитриева, Д.В. Блинов, О.И. Турина,

A.В. Семенова, К.Н. Володин // Иммуноферментный анализ №Е и GFAP, как критерий динамической оценки проницаемости гематоэнцефаличе-ского барьера крыс при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС - Бюлл. Экса Биол. Мед. - 2003 - Т. 136 - № 9 - стр. 299303.

5. С.В. Лебедев, Н.Н. Володин, Д.В. Блинов, И.П. Лазаренко, С.О. Рогаткин,

B.П. Чехонин // Динамика неврологического дефицита и нарушений высшей нервной деятельности при моделировании перинатального ги-поксически-ишемического поражения ЦНС у крыс - Бюлл. Эксп. Биол. Мед.-2003-Т. 136-№9-стр277-281.

6. СО. Рогаткин, ДВ. Блинов, НИ Володин, О.И. Турина, А.В. Семенова,

C.В, Лебедев, С.В. Петров, В.П, Чехонин // Перспективы применения им-муноферментного анализа нейроспецифических антигенов в перинатальной неврологии (клинико-экспериментальное исследование) - Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2003 - т.2 - № 4 - стр. 815.

7. Д В.Блинов, С.В. Лебедев, В.П. Чехонин, Н.Н Володин, С.О. Рогаткин,

С.В. Петров // Изменения высшей нервной деятельности у крыс с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС - Российский психиатрический журнал - 2003 - № 6,9-13.

8. В.П. Чехонин, С.В. Лебедев, Д.В. Блинов, О.И. Турина, А.В. Семенова,

И.П. Лазаренко, С.В. Петров, И.Л. Рябухин, СО. Рогаткин, Н.Н. Володин // Патогенетическая роль нарушения проницаемости гематоэн-цефалического барьера для нейроспецифических белков при перинатальных гипоксически-ишемических поражениях ЦНС. - Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии — 2004 - № 1 - стр. 9-17.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 13.012004 г. Формат 60x90 1/16. Усллгечл. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 007. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

*-1б15

РНБ Русский фонд

2004-4 26855

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Блинов, Дмитрий Владиславович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Гипоксически-ишемическое поражение ЦНС в перинатальном периоде и проницаемость ГЭБ для ЫБЕ и вРАР

1.1. Особенности течения и исходы ГИППГМ.

1.2. Структурно-функциональная организация ГЭБ

1.3. Содержание ЫБЕ и ОРАР в биологических жидкостях при ГИППГМ как критерий оценки проницаемости ГЭБ.

1.4. Экспериментальное моделирование ГИППГМ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ ЫБЕ и ОРАР в биологических жидкостях.

2.2. Клинико-лабораторные методы обследования.

2.3. Экспериментальные исследования.

2.4. Статистический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов при ГИППГМ в клинике и эксперименте

3.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных детей.

3.2. Характеристика используемых иммуноферментных тест-систем.

3.3. Иммуноферментный анализ ЫБЕ и вРАР в сыворотке крови детей с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС.

3.4. Исследование проницаемости ГЭБ для ^Е и ОРАР у крыс с моделированием ГИППГМ.

3.4.1. Динамика неврологического дефицита и нарушений высшей нервной деятельности крыс после моделирования ГИППГМ.

3.4.2. Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в биологических жидкостях у крыс с ГИППГМ.

3.4.3. Анализ связи показателей функционального состояния организма и содержания ЫБЕ и вРАР в биологических жидкостях крыс в динамике развития патологического процесса, вызванного ГИППГМ.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован"

Гипоксически-ишемическое поражение ткани мозга в перинатальном периоде является одной из основных причин смертности новорожденных, а также развития тяжелой патологии ЦНС с исходом в инвалидизацию [2,51,59,132,176,184].

У 20-50% новорожденных, перенесших системную гипоксию во внутриутробном периоде и во время родов, развиваются морфофункциональные нарушения со стороны ЦНС.

В наиболее выраженных случаях для перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС характерны необратимые структурные повреждения ЦНС, которые клинически могут проявляться в виде различных форм гидроцефалии, вторичной микроцефалии, детского церебрального паралича, судорожного синдрома и практически всегда сопровождаются задержкой психомоторного развития [271]. Клиническое и инструментальное обследование новорожденных не всегда дает возможность выявить степень тяжести ГИППГМ и, следовательно, не позволяет надежно прогнозировать его течение и исход [23,42,132,264,271]. Несмотря на интенсивные исследования в этой области, надёжных средств лечения последствий ГИППГМ практически нет, поскольку патогенез хронизации нейродегенеративного процесса, являющегося определяющим моментом для течения и исходов данной патологии, во многом не известен. В качестве достаточно продуктивной рассматривается гипотеза о включении аутоиммунных механизмов в патологический процесс вслед за первичным повреждением нервной ткани при ряде заболеваний (опухоли, болезнь Паркинсона, травма мозга) [14,39].

В связи с этим, в последние десятилетия отмечен возрастающий интерес к нейроспецифическим белкам (НСБ), как к сывороточным маркерам патологических процессов и травм головного мозга, в которых определенное место отводится нарушению резистентности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [39,80,113,116,117,210]. Одними из наиболее изученных среди них являются глиофибриллярный кислый протеин (ОРАР), структурный белок промежуточных филаментов астроцитов, и нейроспецифическая енолаза (КБЕ) - гликолитический цитоплазматический фермент нейронов, катализирующий превращение 2-фосфоглицерата в 2-фосфоенолпируват [117,215].

В ряде исследований проведенных ранее, оценивалось состояние ГЭБ для глиоспецифических антигенов только в течение нескольких первых суток жизни

72,124]. Динамика проницаемости ГЭБ при ГИППГМ одновременно для нескольких НСБ, которые помогли бы охарактеризовать дегенеративный процесс и глиального и нейронального компонентов ткани (ОРАР и мозга в относительно отдалённом периоде патологического процесса (месяц и более после ГИППГМ) , до сих пор не была изучена ни в клинике и ни в эксперименте.

Течение нейродегенеративного процесса сопровождается изменением содержания НСБ не только в периферической крови, но и в цереброспинальной жидкости. Последнему посвящено большое количество исследований [67,69,70,71,98,124]. Однако, изменение содержания НСБ при ГИППГМ в ликворе изучены, как и в сыворотке крови, преимущественно в первые несколько суток жизни. Кроме того, нет данных о результатах сопоставления содержания НСБ в ликворе с уровнем НСБ в сыворотке крови.

Решение поставленных проблем практически невозможно только путём клинических исследований, поскольку неизбежно возникают технические и этические проблемы, связанные с получением необходимых биологических материалов, обусловленные частотой взятия крови у детей с ГИППГМ и получения у них проб СМЖ, а также с применением новых способов фармакотерапии.

Очевидно, что для поиска новых подходов к диагностике, терапии и реабилитации пациентов с ГИППГМ, уточнения некоторых сторон патогенеза ГИППГМ (в том числе, для выяснения роли нарушения проницаемости ГЭБ для НСБ в хронизации нейродегенеративного процесса) необходимо проведение исследований на экспериментальных моделях данной патологии. При этом должна быть обеспечена возможность объективно регистрировать динамику восстановления нарушенных функций ЦНС в течение относительно длительного периода, по меньшей мере, до полового созревания организма.

В существующих экспериментальных моделях перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС недостаточно хорошо проработаны вопросы морфологических, неврологических и поведенческих критериев оценки динамики нарушений деятельности нервной системы в постнатальном периоде. В частности, традиционные методы оценки моторных и неврологических нарушений у крысят носят во многом субъективный характер [59]. Следует отметить, что в большинстве экспериментов с использованием моделей ГИППГМ животных исследуют лишь в острый период, до 7 дней после гипоксически-ишемического повреждения, без анализа их возрастной динамики состояния ЦНС [51,175,176,187,232,237]. Это определяет необходимость разработки и испытания комплекса объективных клинико-инструментальных тестов для оценки психоневрологического дефицита, проведения морфологического исследования состояния высокочувствительных к гипоксии и ишемии нейронов CAI зоны гиппокампа, а также анализа изменений размеров полушарий и боковых желудочков мозга у крыс с асимметричным повреждением мозга.

Таким образом, актуальными представляются исследования процессов элиминации в биологические жидкости НСБ у детей с ГИППГМ. При этом важное значение будет иметь анализ маркеров (НСБ), отражающих как состояние ГЭБ, так и степень ишемического повреждения нейронов. Очевидно, что результаты таких клинических исследований потребуют детальной верификации в экспериментальных исследованиях с использованием адекватных моделей ГИППГМ на животных.

Исходя из вышесказанного, целью исследования явился количественный иммунохимический анализ NSE и GFAP в биологических жидкостях как критериев проницаемости ГЭБ при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга в клинике и эксперименте.

Задачи исследования

1) Иммунохимический мониторинг NSE и GFAP в сыворотке крови детей с ГИППГМ различной тяжести в течение 24 недель постнатального развития;

2) Моделирование ГИППГМ на крысах и мониторинг состояния функций ЦНС в течение 12 недель с помощью инструментальных методов оценки психоневрологического статуса животных;

3) Количественный динамический иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сыворотке крови и СМЖ крыс с ГИППГМ;

4) Анализ связи концентраций NSE и GFAP в сыворотке крови и ликворе с тяжестью поражения ЦНС, его функциональным состоянием, а также с процессами нейродегенерации после ГИППГМ в клинике и эксперименте.

Научная новизна

1) Впервые установлен феномен устойчивого (в течение 6 месяцев) достоверного повышения уровня NSE и GFAP в сыворотке крови у детей с ГИППГМ характеризующийся наличием двух пиков (на 1-й неделе и в конце первого месяца жизни).

2) Впервые установлено, что концентрации NSE в образцах сыворотки крови детей с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (ВЖК) существенно (в 3-8 раз) превышают таковые у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией (ПВЛ), что может быть использовано при оценке особенностей патологических изменений в ткани мозга при ГИППГМ.

3) Впервые установлено, что при моделировании ГИППГМ по методу J. Rice [J. Rice et al., 1981] и по методу В. Lubec [В. Lubec et al., 1997] нарушения интегральных показателей (отставание массы тела, двигательная гиперреактивность) и психоневрологический дефицит имеют место длительный период времени, вплоть до половозрелого возраста. При этом впервые выявлен феномен кетамин-индуцированной вращательной асимметрии у животных с ГИППГМ, моделированной по методу J. Rice et al., которая сохраняется на высоком уровне не менее трёх месяцев постнатального развития.

4) Впервые показано, что у животных, при моделировании ГИППГМ обоими методами в течение 3-х месяцев постнатального развития выявляется хронически протекающий процесс нейродегенерации и нарушение проницаемости ГЭБ для NSE и GFAP. Эти процессы характеризуются периодическим возрастанием концентраций исследуемых антигенов до пиковых значений, коррелирующих с ухудшением ряда показателей функций ЦНС (прирост массы тела, K-тест, неврологический статус, тесты пассивного избегания, Ротород, У-образный лабиринт).

5) Впервые установлено, что у крыс с моделированным ГИППГМ происходит резкое увеличение содержания NSE и GFAP в ликворе большой цистерны мозга, что прямо свидетельствует о наличии нейродегенеративного процесса. Характер динамики этих показателей аналогичен таковым в сыворотке крови.

Практическая значимость

1) Комплексный иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сыворотке крови позволяет объективно оценить резистентность ГЭБ при ГИППГМ течение нейродегенеративного процесса и, что может быть использовано для выбора адекватной терапии.

2) Результаты исследования содержания НСБ в сыворотке крови и ликворе могут быть использованы для биохимической верификации тяжести и типа перинатального повреждения головного мозга новорожденных детей.

3) Разработанный нами комплекс инструментальных методов мониторинга физиологических функций организма при моделировании ГИППГМ на животных по методу J.Rice и методу B.Lubec может быть использован при поиске новых подходов к лечению и реабилитации пациентов в постишемический период.

Основные положения работы были представлены в периодической печати, на межлабораторных конференциях ГНЦССП им. В.П. Сербского (2000-2003 гг.).

Объем и структура диссертации: Диссертация написана на русском языке, изложена на 153 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. В основных главах работы приведены данные обзора литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Блинов, Дмитрий Владиславович

выводы

1. Гипоксически-ишемическое перинатальное поражение головного мозга характеризуется достоверным, более чем 10-кратным (по сравнению с показателями в сыворотке крови здоровых детей) увеличением концентраций NSE и GFAP в сыворотке крови детей на всех сроках исследования (1,2,3,4,8 и 24 нед.)- максимально на 1-й неделе (NSE и GFAP), 3-й нед. (GFAP) и 4-й нед. (NSE) постнатального развития.

2. Моделирование ГИППГМ на крысах, выполненное по методам J.Rice с соавт. и В. Lubec с соавт. может быть применено для исследований динамики нейродегенеративного процесса и нарушений функционирования ГЭБ в хроническом эксперименте. У животных с моделированными гипоксически-ишемическими перинатальными поражениями головного мозга имеют место стойкие (вплоть до половозрелого возраста) и достоверные изменения состояния ЦНС в сравнении с контрольной группой: отставание в приросте массы тела, двигательная гиперактивность, нарушения моторной координации, а также нарушения в когнитивной сфере. Животные с ГИППГМ, моделированной по методу J. Rice с соавт., кроме того, характеризуются устойчивыми неврологическим дефицитом и вращательной кетамин-индуцированной асимметрией (К-тест).

3. Иммуноферментный мониторинг GFAP и NSE у крыс с моделированным ГИППГМ выявил феномен продолжительного (10-12 нед.), периодического (1 раз в 23 нед.) увеличения концентрации этих антигенов в сыворотке крови и ликворе. При этом феномен увеличения уровня GFAP в ликворе и сыворотке крови предшествовал повышению концентрации NSE.

4. Повышение концентраций GFAP и NSE в сыворотке крови и ликворе крыс с ГИППГМ прямо коррелирует с функциональными показателями ЦНС и общего состояния организма животных в течение 3 месяцев после экспериментального перинатального повреждения (неврологический дефицит, нарушения в двигательной сфере и высшей нервной деятельности, отставание прироста массы тела).

5. Иммуноферментный мониторинг GFAP и NSE в сыворотке крови и ликворе позволяет выявлять нарушения резистентности ГЭБ при хронически протекающих процессах нейродегенерации вызванных экспериментальным гипоксическиишемическим перинатальным поражением головного мозга. Иммунохимическая верификация перинатального поражения ЦНС может быть положена в основу оценки динамики патологического процесса, эффективности проводимой терапии, а также поиска новых подходов к лечению и реабилитации пациентов с ГИППГМ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков в сыворотке крови детей, перенесших ГИППГМ, может быть рекомендован для оценки степени тяжести поражения ЦНС и прогноза дальнейшего течения патологического процесса

2. Динамический иммуноферментный анализ GFAP и NSE может быть рекомендован для объективной оценки резистентности ГЭБ в постнатальном периоде у детей с ГИППГМ. Увеличение концентрации исследуемых НСБ в сыворотке крови свидетельствует о повышении проницаемости ГЭБ гипоксически-ишемического генеза.

3. Моделирование ГИППГМ по методам J. Rice с соавт. и В. Lubec с соавт. в варианте хронического эксперимента, а также результаты объективных методов динамической оценки функционального состояния ЦНС (кетаминовый тест, тестирование в ротароде, в У-образном лабиринте, тест пассивного избегания и др.) и иммуноферментного анализа НСБ в сыворотке крови ликворе крыс могут быть рекомендованы для разработки новых подходов к лечению и реабилитации новорожденных с ГИППГМ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Блинов, Дмитрий Владиславович, Москва

1. Антонова О.М. Нейроспецифнческая енолаза и ее роль в механизмах антительной агрессии в мозг. Дисс. к.м.н., 1997; 121с.

2. Барашнев Ю.И., Перинатальная неврология. Триада-Х. 2001; 640 с.

3. Белопасов В.В., Хрусталева H.A., Гроппа С.А. Иммунохимические показатели структурного повреждения мозговой ткани в различные периоды травматической болезни головного мозга. Вопр. нейрохир. 1994; №2: с. 74-77.

4. Беляева И.А. Нейроспецифические белки в крови и ликворе при клещевой нейроинфекции (клинико-диагностические и прогностические аспекты). Дисс. к.м.н., 1995; 177 с.

5. Бережной Г.А., Лисяный H.H., Белик Я.В. Содержание некоторых нейроспецифических белков в крови больных с черепно-мозговой травмой. Ней-рохимия. 1991; № 10(1-2): с. 76-80.

6. Березин В.А. Специфические белки нервной ткани в норме и при патологии. Дисс. д.м.н., 1985; 164 с.

7. Березин В.А., Шевченко Г.М., Бунятин Г.Г. Специфические белки промежуточных филаментов в нормальной нервной ткани и в опухолях головного мозга. Нейрохимия. 1987; №6: с. 77-81.

8. Биктимиров Р.Г. Роль комплексного иммуноферментного определения нейроспецифических белков в диагностике опухолей головного мозга. Автореф. дисс. к.м.н., 1993; 133 с.

9. Бредбери М. Концепция гематоэнцефалического барьера. Москва. 1983; 480 с.

10. П.Вейн А. М. Вегетативные расстройства. Клиника. Диагностика. Лечение. Мед. Информ. Агентство. 2000; 164 с.

11. Викторов И.В., Современные методы морфологических исследований мозга. Медицина. 1969; 156 с.

12. Володин H.H., Рогаткин С.О., Кучинскас А. Диагностика и прогноз поражений ЦНС у недоношенных детей в раннем неонатальном периоде. Тез. докл. научно-пр. конф.: "Актуальные проблемы педиатрии". Тамбов. 1990; с. 25-26.

13. Ганнушкина И.В. Патофизиология нарушений мозгового кровообращения. Кн. Мозг: теоретические и клинические аспекты (под ред. Покровского В.И.). Медицина. 2003; с. 463-489.

14. Гроппа С.А., Чехонин В.П. Специфические антигены мозга как показатели проницаемости гематоэнцефалического барьера при болезни Альцгеймера. Ж. невропат, и психиатр. 1998; №3: с. 50-52.

15. Турина О.И., Рябухин И.А., Рогаткин С.О. Иммуноферментный анализ НСБ и антител к ним в оценке перинатальных поражений ЦНС у недоношенных детей. Педиатрия. 1995; №3: с. 15-19.

16. Турина О.И. Клинико-иммунохимическая оценка нарушений функций гематоэнцефалического барьера у новорожденных детей с перинатальными поражениями ЦНС. Дисс. к.м.н.,1996; 142 с.

17. Турина О.И., Рябухин И.А., Анин А.Н. Исследование проницаемости ГЭБ у новорожденных крысят в условиях индуцированных гипертермических судорог. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 1997; т. 123, №2: с. 146-149.

18. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Ишемия головного мозга. Медицина. 2001; 328 с.

19. Дегтярева М.Г. Динамический контроль функционального состояния ЦНС у детей с перинатальными постгипоксическими поражениями головного мозга на первом году жизни. Дисс. к.м.н. 2002; 254 с.

20. Журба JI.Т., Мастюкова Е.М. Нарушение психомоторного развития детей первого года жизни. Медицина. 1981 ; 272 с.

21. Зубарева Е.А., Дворяковский И.В. Доплерография перинатальных поражений головного мозга. Видар. 1999; 358 с.

22. Казьмин A.M., Дайхина Л.В., Озерова O.E. Состояние нервной системы в первые12.16 месяцев у детей, перенесших перивентрикулярную лейкомаляцию в периоде новорожденности. Ж. материнство и детство. 1992; № 37 (4-5): с. 8 13.

23. Каушанская Е.Я. Значение нейроспецифических белков и протеолитических ферментов в оценке тяжести критического состояния мозга новорожденных и их нервно-психического развития в раннем возрасте. Автореф., дисс. к.м.н. 1993; 22 с.

24. Классификация перинатальных поражений нервной системы у новорожденных. Методические рекомендации. ВУНМЦ МЗ РФ. 2000; 40 с.

25. Лиджиева Р.Ц. Специфические белки нервной ткани в оценке проницаемости гематоэнефалического барьера при коматозных состояниях у детей. Дисс. к.м.н. 1990; 218 с.

26. Майзелис М.Я. Гематоэнцефалический барьер и его регуляция. Медицина. 1973; 288 с.

27. Рогаткин С.О. Клинико-нейросонографические и иммунохимические критерии диагностики и прогноза перинатальных поражений ЦНС у новорожденных детей различного гестационного возраста. Автореф. дисс. к.м.н. 1993; 23 с.

28. Рябухин И. А., Дмитриева Т.Б., Чехонин В.П. Гематоэнцефалический барьер (часть I). Эмбриоморфогенез, клеточная и субклеточная биология плотных контактов эндотелиоцитов. Нейрохимия 2003; 20: 12-23.

29. Тимофеева JI.А. Клинико-иммунохимическая оценка нарушений проницаемости ГЭБ у плодов и новорожденных с гипербилирубинемией. Дисс. к.м.н. 1999; 132 с.

30. Федоров В.П., Ушаков И.Б., Корденко А.Н. Структурно-функциональная организация гематоэнцефалического барьера. Изв. АН России, Сер. биол. 1989; 1 : 24 с.

31. Хохлов А.П., Фетисова И.Г., Подлесный A.M. Защитная реакция клеток мозга при изменении проницаемости гематоэнцефалического барьера. Вопросы мед. химии 1993; 39(4): 25-27.

32. Чехонин В.П., Морозов Г.В., Морковкин В.М. Иммуноферментативная детекция специфических антигенов мозга как критерий проницаемости гематоэнцефалического барьера крыс при острой ишемии головного мозга. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1988; 4: 581-583.

33. Чехонин В.П., Лебедев C.B., Володин H.H., Блинов Д.В., Петров C.B., Рогаткин С.О., Экспериментальное моделирование перинатального гипоксически-ишемического поражения мозга. Вопр. гинек., акуш. и перинат. 2002; 1(2): 9-16.

34. Чехонин В.П., Лиджиева Р.Ц., Коротеева Е.А. Иммунохимическое изучение механизмов аутоиммунной агрессии антител к нейроспецифическим белкам у крыс с экспериментальным прорывом ГЭБ. Нейрохимия. 1989; 9(2): 241-246.

35. Чехонин В.П. Специфические белки нервной ткани человека и животных (идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и клинико-лабора-торные исследования). Дисс. д.м.н., 1989; 379 с.

36. Чехонин В.П., Асанова Л.М., Гавриленко А.Я. Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков в сыворотке крови больных эпилепсией. ЖНИП им.С.С. Корсакова. 1995; 3:30-31.

37. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. Москва. 2000; 416 с.

38. Штарк М.Б. Мозгоспецифические белки (антигены) нервной ткани и функции нейрона. Москва. 1985; 313 с.

39. Штерн U.C. Непосредственная питательная среда органов и тканей. Москва. 1960; 224 с.

40. Якунин Ю.А., Перминов B.C. Прогностические критерии гипоксических поражений ЦНС у детей. Рос. Вест, перинат. и пед. 1993; 38(2): 20-24.

41. Abel H.T., Von-Rohden L., Lamme W. Intracerebral hemorrhage and neuron-specific enolase in premature and full-term infants a clinical study. Padiatr. Grenzgeb. 1993; 31(3): 133-140.

42. Abraha H.D., Butterworth R.J., Bath P.M.W., Wassif W.S., Garthwaite J., Sherwood R.A. Serum S-100 protein, relationship to clinical outcome in acute stroke. Ann. Clin. Biochem. 1997; 34: 366 -370.

43. Abraham C.S., Harada N., Deli M.A., Niwa M. Transient forebrain ischemia increases the blood-brain barrier permeability for albumin in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.Cell. Mol. Neurobiol. 2002; 22(4): 455-62.

44. Ahlsen G., Rosengren L., Beifrage M. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of children with autism and other neuropsychiatrie disorders. Biol. Psychiatry. 1993; 15 -33(10): 734-743.

45. Albrechtsen M., Bock E. Quantification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in human body fluids by means of ELISA employing a monoclonal antibody. J. Neuroimmunol. 1985; 8: 301-309.

46. Albrechtsen M., Massaro A., Bock E. Enzyme-linked immunosorbent assay for human glial fibrillary acidic protein using a mouse monoclonal antibody. J. Neurochem. 1985; 44: 560-565.

47. Allan S., Rothwell N. Cytokines and acute neurodegeneration. Neurosci. 2001; 2: 734744.

48. Almini R., Levy T.J., Han B.H., Shan A.R., Gidday J.M., David M. Holtzman D.M., BDNF protect against spatial memory deficit following neonatal hypoxia-ischemia. Experimental neurology. 2000; 166: 99-114.

49. Aquino D., Chiu F., Brosnan C., Norton W. Glial fibrillary acidic protein increases in spinal cord of Lewis rats with acute experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Neurochem. 1988; 51: 1085-1096.

50. Archelos J. J. , Hartung H-P. Pathogenetic role of autoantibodies in neurological diseases. Trends in Neurosciences. 2000; 23: 317-327.

51. Ashwal S., Cole D., Osborne S., Osborne T., Pearce W., A new model of neonatal stroke: reversible middle cerebral artery occlusion in the rat pup. Pediatr Neurol. 1995; 12: 191— 196.

52. Aurell A., Rosengren L.E., Karlsson B., Olsson J.E., Zbornikova V., Haglid K.G. Determination of S-100 and glial fibrillary acidic protein concentrations in cerebrospinal fluid after brain infarction. Stroke. 1991; 22: 1254-1258.

53. Ayata C., Ropper A.H. Ischaemic brain oedema. J. Clin. Neurosci. 2002; 9(2): 113-24.

54. Babu P.P., Kumari L.R., Vemuri M.C. Differential changes in cell morphology, macromolecular composition and membrane protein profiles of neurons and astrocytes in chronic ethanol treated rats. Mol. Cell. Biochem. 1994; 12 (130 (1)): 29-40.

55. Balduini W., De Angelis V., Mazzoni E., Cimino M., Long-lasting behavioral alterations following a hypoxic/ischemic brain injury in neonatal rats. Brain Research. 2000; 859: 318-325.

56. Banati R.B., Gehrmann J., Czech C., Monning U., Jones L.L., Konig G., Beyreuther K., Kreutzberg G.W. Early and rapid de novo synthesis of Alzheimer beta A4-amyloid precursor protein (APP) in activated microglia. Glia. 1993; 9(3): 199-210.

57. Barber P.S., Lindsay M. Schvann cell of the olfactory nerves contain GFAP and resemble astrocytes/Neurosci. 1982; 7(12): 3077-3090.

58. Barone F.C., Clerk R.K., Price W.J. Neuron-specific enolase increases in cerebral and systemic circulation followig focal ishemia. Brain Res. 1993; 1: 71-82.

59. Bauer H.C., Bauer H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cell Mol. Neurobiol. 2000 Feb; 20(1): 13-28.

60. Benjelloun, N., Renolleau, S., Represa, A., Ben-Ari, Y. and Charriaut-Marlangue, C. Inflammatory responses in the cerebral cortex after ischemia in the P7 neonatal rat. Stroke. 1999; 30(9): 1916-1923.

61. Berger R., Pierce M., Wisnievski S., Adelson P., Clark R., Ruppel R., Kochanek P. Neuron-specific enolase and slOOB in cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury in infants and children. Pediatrics. 2002; 109(2): 34-38.

62. Berkovic S.F.; SchefFer I.E. Febrile seizures: genetics and relationship to other epilepsy syndromes. CuiT-Opin-Neurol. 1998; 11(2): 129-134.

63. Blennow K., Wallin A., Ekman R. Neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid: a biochemical marker for neuronal degeneration in dementia disorders? J. Neural. Transm. Park. Dis. Dement. Sect. 1994; 8 (3): 183-191.

64. Blennow M., Hagberg H., Rosengren L. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid: a possible indicator of prognosis in full-term asphyxiated newborn infants? Pediatr. Res. 1995; 37(3): 260-264.

65. Blennow M., Rosengren L., Jonsson S., Forssberg H., Glial fibrillary acidic protein is increased in the cerebrospinal fluid of preterm infants with abnormal neurological findings. ActaPaediatr. 1996; 85: 485-489.

66. Blennow M., Savman K., lives P., Thoresen M., Rosengren L. Brain-specific proteins in the cerebrospinal fluid of severely asphyxiated newborn infants. Acta Paediatr. 2001; 90:1171-1175.

67. Bock E., Dissing J. Demonstration of enolase activity connected to the brain specific protein 14-3-2. Scand. J. Immunol. 1975; 4: 31-36.

68. Bona, E., Andersson A.L., Blomgren K., Gilland E., Puka-Sundvall M., Gustafson K. Chemokine and inflammatory cell response to hypoxia-ischemia in immature rats. Pediatric Research. 1999; 45(4 Part 1): 500-508.

69. Bonhomme V., Hans P., Collette I., Moonen G. Neuron-specific enolase as a marker of in vitro neuronal damage. Part III. Investigation of the astrocyte protective effect against keinate-induced neurotoxicity. J. Neurosurg. Anesthesiol. 1993; 2: 9-22.

70. Bradbery M.W., Deane R. Permeability of the blood-brain barrier to lead. Neurotoxicology. 1993; 3: 1-6.

71. Brown J.K., Minns R.A. Non-accidental head injury, with particular reference to whiplash shaking injury and medico-legal aspects. Dev. Med. Child. Neurol. 1993; 35(10): 849-69.

72. Burtrum D., Silverstein F.S. Excitotoxic injury stimulates glial fibrillary acidic protein mRNA expression in perinatal rat brain. Exp. Neurol. 1993; 121(1): 127-132.

73. Burtrum D., Silverstein F. Hypoxic-ischemic brain injury stimulated glial fibrillary acidic protein mRNA and protein expression in neonatal rats. Exp. Neurol. 1994; 126: 112118.

74. Buttner T., Weyers S., Postert T., Sprengelmeyer R., Khun W. S-100 protein: serum marker of focal brain damage after ischemic territorial MCA infarction. Stroke. 1997; 28: 1961-1965.

75. Chen H., Chopp M, Schultz L, Bodzin G, Garcia JH. Sequential neuronal and astrocytic changes after transient middle cerebral artery occlusion in the rat. J. Neurol. Sci. 1993; 118: 109-116.

76. Chen R., Silverstein F., Aldridge W., Johnston M. Evolution of acute cortical electroencephalogram changes in experimental perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neurology. 1986; 36: 86-90.

77. Chen Y. Swanson R.A. Astrocytes and brain injury. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 2003; 23(2): 137-49.

78. Cheng Y., Gidday J.M., Yan Q., Shah A.R., Holtzman D.M. Marked age-dependent neuroprotection by BDNF against neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Ann. Neurol. 1997; 41:521-529.

79. Chopp M., Li Y. Apoptosis in focal cerebral ischemia. Acta Neurochir. 1996; 66: 21-26.

80. Chopp M., Li Y., Dereski M.O., Levine S.R., Yoshida Y., Garcia J.H. Hypothermia reduces 72-kDa heat-shock protein induction in rat brain after transient forebrain ischemia. Stroke. 1992; 23:104-107.

81. Chopp M., Chan P.H., Hsu C.Y., Cheung M.E., Jacobs T.P. DNA damage and repair in central nervous system injury: National Institute of Neurological Disorders and Stroke Workshop Summary. Stroke. 1996; 27 (3): 363-369

82. Clark R., Kochalek P., Adelson P. Increases in bcl-2 protein in cerebrospinal fluid and evidence for programmed cell death in infants and children after severe traumatic brain injury. J. Pediatr. 2000; 137: 197-204

83. Cunningham R.T., Watt M., Winder J., McKinstry S., Lawson J.T., Johnston C.F., Hawkins S.A., Buchanan K.D. Serum neurone-specific enolase as an indicator of stroke volume. Eur. J. Clin. Invest. 1996; 26: 298-303.

84. Dahl D., Bignami A. Astroglial and axonal protein in isolated brain filaments. Biochim. et Biophys. Acta. 1979; 578 (2): 305-316.

85. Dahl D., Bignami A. Glial fibrillar acidic protein from normal and gliosed human brain. Demonstration of multiple related polipeptides. Biochem. Biophys. Acta. 1975; 386: 4149.

86. Dauberschmidt R., Marangos P.J., Zinsmeyer J. Severe head trauma and the changes of concentration of neuron-specific enolase in plasma and cerebrospinal fluid. Clin. Chim. Acta. 1983; 131: 165-170.

87. DeGiorgio C.M., Correale J.D., Gott P.S. Serum neuron-specific enolase in human status epilepticus. Neurology. 1995; 45 (6): 1134-1137.

88. Dennery P.A. Predicting neonatal brain injury: are we there yet? Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 2003; 157(12): 1151-1152.

89. Dotevall L., Rosengren L.E., Hagberg L. Increased cerebrospinal fluid levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in Lyme neuroborreliosis. Infection. 1996; 24: 125-129.

90. Dell'Anna M.E., Carlozari S., Molinari M., Iuvone L., Calimici L. Neonatal anoxia induces transitory hyperactivity, permanent spatial memory deficit and CA1 cell density reduction in developing rats. Behav. Brain Res. 1991; 45: 125-134.

91. Dell'Anna E., Chen Y., Engidawork E., Andersson K., Lubec G., Luthman J., Herrera-Marschitz M., Delayed neuronal death following perinatal asphyxia in rat. Exp. Brain Res. 1997; 115(1): 105-115.

92. Dell'Anna E., Iuvone L., Carlozari S., Geloso M.C. Effect of acetyl-L-carnitine on hyperactivity and spatial memory deficits of rats exposed to neonatal anoxia. Neuroscience Letters. 1997; 223: 201-205.

93. Delorme P., Gayet J, Grignon G. Ultrastructural study on transcapillary exchanges in the developing telencephalon of the chicken. Brain Res. 1970; 22(3): 269-83.

94. Delpech B., Delpech A., Vidard M. Glial fibrillary acidic protein in tumors of the nervous system. Br. J. Cancer. 1978; 37: 33-38.

95. Derugin N., Ferriero D.M., Vexler Z. Neonatal reversible focal cerebral ischemia: a news model. Neurosci Res. 1998; 32: 349-353

96. Derugin N., Wendland M., Miramatsu K., Roberts T.P.L., Gregory G. Ferriero D.M., Vexler Z.S., Evolution of brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in neonatal rats. Stroke. 2000; 31: 1752-1759.

97. Du Plessis A.J., Volpe J.J. Perinatal brain injury in the preterm and term newborn. Curr. Opin. Neurol. 2002; 15(2): 151-157.

98. Dziegielewska K.M., Saunders N.R. The ins and outs of brain-barrier mechanisms. Trends Neurosci. 2002; 25(2): 69-71.

99. Ehlers S., Kyllerman M., Rosengren L. Analysis of glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of children investigated for encephalopathy. Neuropediatrics. 1994; 25: 129-133.

100. Elimian A., Figueroa R., Verma U., Visintainer P., Sehgal P, Tejani N. Amniotic fluid neuron-specific enolase: a role in predicting neonatal neurologic injury? Obst. Gynecol. 1998; 92(1): 546-550.

101. Endres M., Wang Z.Q., Namura S., Waeber C., Moskowitz M.A. Ischemic brain injury is mediated by the activation of poly(adp-ribose)polymerase. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 1997; 17(11): 1143-51.

102. Eng L.F. Experimental models for astrocyte activation and fibrous gliosis. In: Althaus H.H., Seifert W. (Eds.) Glial-neuronal communication. NY: Springer. 1987; 2: 27-40.

103. Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein (GFAP): The maior protein of glial intermediate filaments in differentiated astrocytes. J. Neuroimmunol. 1981; 8: 203-214.

104. Eng L.F., Vainderhaegen J.J., Bignami A. An acidic protein isolated from fibrous astrocytes. Brain Res. 1971; 28: 42-50.

105. Eng L.F., Lee Y.L., Fukajama G. Isolation of glial fibrillary acidic (GFA) protein from bovine spinal cord. Trans. Amer. Soc. Neurochem. 1979; 26: 513-518.

106. Eng L.F., Ghirnikar R.S. GFAP and astrogliosis. Brain. Pathol. 1994; 4(3): 229-237.

107. Eng L.F., Ghirnikar R.S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem. Res. 2000; 9-10:1439-1451.

108. Engidawork E., Chen Y., Dell'Anna E., Goiny M., Lubec G., Ungerstedt U., Andersson K., Herrera-Marschitz M. Effect of perinatal asphyxia on systemic and intracerebral pH and glycolysis metabolism in the rat. Exp. Neurol. 1997; 145(2 Pt 1): 390-396.

109. Faivre-Sabbailh C., Rami A., Fages C., Tardy M. Effect of thyroid deficiency on GFAP and GFAP-mRNA in the cerebellum and hippocampal formation of the developing rat. Glia. 1991; 4:276-284.

110. Fazzi E., Lanners J., Danova S., Ferrarri-Ginevra O., Gheza C., Luparia A., Balottin U., Lanzi G. Stereotyped behaviours in blind children. Brain Dev. 1999; 21(8): 522-528.

111. Fern R. Ischemia: astrocytes show their sensitive side. Progress in Brain Res. 2001; 132: 405-411.

112. Fox G., Gallacher D., Shevde S., Loftus J., Swayne G., Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 1993; 24: 2087-2093

113. Garcia J., Liu K., Yoshida Y., Lian J., Chen S. del Zoppo G. Influx of leukocytes and platelets in an evolving brain infarct (Wistar rat). Am. J. Pathol. 1994; 144(1): 188-199.

114. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H., Li Y., Zhang Z.G., Lian J., Chen S., Chopp M. Progression from ischemic injury to infarct following middle cerebral artery occlusion in the rat. Am. J. Pathol. 1993; 142(2): 623-635.

115. Gasse H., Meyer W. Neuron-specific enolase as a marker of hypothalamo-neurohypophyseal development in postnatal Monodelphis domestica (Marsupialia). Neurosci. Lett. 1995; 189 (1): 54-56.

116. Goldman I.E., Schaumburg H.H., Norton W.I. Isolation and characterisation of glial filaments and neurofilaments from human brain. Similarity of the major protein components. J. Cell Biol. 1978; 43: 964-970.

117. Grasso A., Chen J.S. 14-3-2 protein in rat brain synaptosonees: An immunochemical study. Febs. Let. 1974; 40: 154-157.

118. Grasso A., Roda G., Hoque-Angeletti R.A. Preparation and properties of the brain specific protein 14-3-2. Brain Res. 1977; 124: 497-507.

119. Grasso A., Haglid K.J., Hanson H.A. Localization of 14-3-2 protein in the rat brain by immunoelectron microscopy. Brain Res. 1977; 122: 582-585.

120. Greishen G., Ischaemia of the preterm brain. Biol. Neonate. 1992; 62: 243-247.

121. Grogaard, B., Schurer, L., Gerdin, B. and Arfors, K.E. Delayed hypoperfusion after incomplete forebrain ischemia in the rat. The role of polymorphonuclear leukocytes. J. Cereb. Blood Flow & Metab. 1989; 9(4): 500-505.

122. Grogaard B., Schurer L., Gerdin B., Arfors K.-E. Q. The role of polymorphonuclear leukocytes in postischemic delayed hypoperfusion. In Oxygen Free Radicals in Shock, ed. U. Novelli, Karger, Basel, Florence. 1985; 74-78.

123. Giulian D., Reactive microglia and ischemic injury. In: Primer on cerebrovascular diseases (Welsh M., Caplan L., Siesjo B., Weir B., Reis D., eds. ). San Diego, CA, Academic. 1997; 117-124.

124. Gunn A.J., Gunn T.R., Dehaan H.H., Williams C.E., Gluckman, P.D. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs. Journal of Clinical Investigation. 1997; 99(2): 248-256.

125. Janesco K., SatchellM., Kochalek P., et al. IL-1 converting enzyme (ICE), IL-1, and cytochrome C in CSF after head injury in infants and children. J. Neurotrauma. 2000; 17: 956.

126. HO.Jankovic B.D., Jakulic S., Howat J. Delayed skin hypersensitivity reactions to human brain S-100 protein in psychiatric patiens. Biol. Psychiatry. 1982; 17: 687-692.

127. Janzer R.C. The blood-brain barrier: cellular basis. J. Inherit. Metab. Dis. 1993; 12: 639647.

128. Johnsson H., Johnsson P., Ailing C., Westaby S., Blomquist S. Significance of SI00 release after coronary artery bypass grafting. Ann. Thorac. Surg. 1998; 65: 1639-1644.

129. Joo F. Minireview: regulation messendger molecules of the permiability in the cerebral microvessels. Neurobiology. 1993; 1:3-10.

130. Joo F. Insigt into the regulation messenger molecules of the permiability of the blood-brain barrier. Micr. Res. Tech. 1994; 27: 507-515.

131. Farrell C.Z., Risan W. Normal and abnormal development of the blood-brain barrier. Micrisc. Res. Tech. 1994; 27(6): 495 506.

132. Haataja L., Mercuri E., Regev R., Cowan F., Rutherford M., Dubowitz V., Dubowitz L. Optimality score for the neurologic examination of the infant at 12 and 18 months of age. J. Pediatr. 1999; 135(2 Pt 1): 153-161.

133. Hagberg H., Gilland E., Bona E., Hanson L.A., Hahn-Zoric M., Blennow M. Enhanced expression of interleukin (IL)-1 and IL-6 messenger RNA and bioactive protein after hypoxia-ischemia in neonatal rats. Pediatric Research. 1996; 40(4): 603-609.

134. Hallenbeck J.M., Mechanisms of secondary brain damage in cerebral ischemia and trauma. New York. 1996; p. 231

135. Hans P., Bonhomme V., Collette J. Neuron-specific enolase as a marker of in vitro neuronal damage. Part I: Assessment of neuron-specific enolase as a quantitative and specific marker of neuronal damage. J. Neurosurg. Anesth. 1993; 5(2): 111-116.

136. Hardemark H., Ericsson N., Kotwica Z., Rundstrom G., Mendel-Hartvig I., Olsson Y., Pahlmann S., Persson L. S-100 protein and neuron-specific enolase on CSF after experimental traumatic or focal ischemic brain damage. J. Neurosurg. 1989; 71: 727731.

137. Hardemark H., Persson L., Bolander H., Hillered L., Olsson Y., Pahlman S. Neuron-specific enolase is a marker of cerebral ischemia and infarct size in rat cerebrospinal fluid. Stroke. 1988; 19:1140-1444.

138. Harris N.G., Gauden V., Fraser P.A., Williams S.R., Parker G.J. MRI measurement of blood-brain barrier permeability following spontaneous reperfusion in the starch microsphere model of ischemia. Magn. Reson. Imaging. 2002; 20(3): 221-230.

139. Hartfield R.H., Mckernan R.M. CSF neuron-specific enolase as a quantitative marker of neuronal damage in a rat sroke model. Brain Res. 1992; 2: 249-252.

140. Hatfield J.S., Scoff R.R., Maisel H. The lens epithelium contains glial fibrillary acidic protein (GFAP). J. Neuroimmunol. 1985; 8(4-6): 347-357.

141. Hattori H., Morin A., Schwartz P., Fujikawa D., Wasterlain C. Posthypoxic treatment with MK-801 reduces hypoxic-ischemic damage in the neonatal rat. Neurology. 1989; 39:713-718.

142. Hay E., Royds J., Davies-Jones G., Lewtas N., Timperley W., Taulor C. Cerebrospinal fluid enolase in stroke. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1984; 47: 724-729.

143. Herrmann M., Curio N., Jost S., Wunderlich M.T., Synowitz H., Wallesch C.W. Protein S-100B and neuron specific enolase as early neurobio-chemical markers of the severity of traumatic brain injury. Restor. Neurol. Neurosci. 1999; 14: 109-114.

144. Hewicker-Trautwein M., Trautwein G. An immunohistochemical study of the fetal sheep neocortex and cerebellum with antibodies against nervous system-specific proteins. J. Comp. Pathol. 1993; 109(4): 409-421.

145. Hoeger H., Englemann M., Bernert G., Seidl R., Bubna-Littitz H., Mosgoeller W., Lubec B., Lubec G., Long term neurological and behavioral effects of graded perinatal asphyxia in the rat. Life sciences. 2000; 66(10): 947-962.

146. Hossmann K.A. Reperfusion of the brain after global ischemia hemodynamic disturbances. Shock. 1997; 8(2): 95-101.

147. Hudome S., Palmer C., Roberts R.L., Mauger D., Housman C. and Towfighi J. The role of neutrophils in the production of hypoxic-ischemic brain injury in the neonatal rat. Pediatric Research. 1997; 41(5): 607-616.

148. Hunt R.W., Loughnan P., Fink A.M., Volpe J.J., Inder T.E. Magnetic resonance demonstration in the newborn of generalized cerebral venous dilation with spontaneous resolution. Eur. J. Paediatr. Neurol. 2002; 6(5): 289-92.

149. Huppi P.S., Warfield S., Kikinis R., Barnes P.D., Zientara G.P., Jolesz F.A., Tsuji M.K., Volpe J.J. Quantitative magnetic resonance imaging of brain development in premature and mature newborns. Ann. Neurol. 1998; 43(2): 224-35.

150. Ishiguro Y., Kato K. Enolase isoenzymes as markers for differential diagnosis of neuroblastoma, rhabdomyosarcoma and Wilms' tumor. Gann. 1984; 75: 53-60.

151. Ito U., Go K.G., Walker J.T. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. Behavior of the blood-brain barrier. Acta Neuropath. 1976; 34: 1-6.

152. Iuvone L., Geloso M.C., Dell'Anna M.E., Changes in open field behavior, spatial memory, and hippocampal parvalbumin immunoreactivity folloving enrichment in rats exposed to neonatal anoxia. Exp. Neurol.1996; 139: 25-33.

153. Kalman M. GFAP expression withdraws a trend of glial evolution? Brain Res. Bulletin. 2002; 57: 509-511.

154. Kato K., Kimura S. SlOOao (oca) protein is mainly located in the heart and striated muscles. Biochim. Biophys. Acta. 1985; 842: 146-150.

155. Kermer P., Klocker N., Bahr M. Neuronal death after brain injury (models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo). Cell Tissue Res. 1999; 298: 383-395.

156. Kim J.S., Yoon S.S., Kim Y.H., Ryu J.S. Serial measurement of interleukin-6, transforming growth factor- b, and S-100 protein in patients with acute stroke. Stroke. 1996; 27: 1553-1557.

157. Kleinschnitz C., Bendszus M., Frank M., Solymosi L., Toyka K.V., Stoll G. In vivo monitoring of macrophage infiltration in experimental ischemic brain lesions by magnetic resonance imaging. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003; 23(11): 1356-61.

158. Kohlhauser C., Kaehler S., Mosgoeller W., Singewald N., Kouvelas D., Prast H., Hoeger H., Lubec B. Histological changes and neurotransmitters levels three month following perinatal asphyxia in the rat. Life Sci. 1999; 64(23): 2109-2124.

159. Kohlhauser C., Mosgoeller W., Hoeger H., Lubec B. Myelination deficits in brain of rats following perinatal asphyxia. Life Sci. 2000; 67: 2355-2368.

160. Kragh J., Bolwig T.G., Woldbye D.P. Electroconvulsive shock and lidocaine-induced seizures in the rat activate astrocytes as measured by glial fibrillary acidic protein. Biol. Psychiatry. 1993; 33(11-12): 794-800.

161. Krause D., Kurz I., Dermictzel R. Cerebral pericytes a second line of deference in controlling blood-brain barrier peptide metabolism. Adv. Exp. Med. Biol. 1993; 331: 149-152.

162. Kretzschmar D., Pflugfelder G. Glia in development, function, and neurodegeneration of the adult incest brain. Brain Res. Bulletin. 2002; 57: 121-131.

163. Krupinski J., Kaluza J., Kumar P., Wang M, Kumar S. Prognostic value of blood vessel density in ischaemic stroke. Lancet. 1993; 342(8873): 742-746.

164. Krupinski J, Kaluza J., Kumar P., Kumar S., Wang J.M. Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke. Stroke. 1994; 25: 1794-1798.

165. Lee J.C., Olszewski J. Increased cerebrovascular permeability after repeated electroshocks. Neurology. 1996; 11: 515-519.

166. Levene M., Role of excitatory amino acid antagonists in the management of birth asphyxia. Biol Neonate. 1992; 62:248-251.

167. Leviton A., Fenton T., Kuban K. C., Pagano M. Labor and delivery characteristics and the risk of germinal matrix hemorrhage in low birth weight infants. J. Child-Neurol. 1991; 6(1): 35-40.

168. Litt L., Hirai K., Basus V.J., James T.L. NTP and PCr responses to hypoxia by hypothermic and normothermic respiring, superfiised, neonatal rat cerebrocortical slices: an NMR spectroscopy study at 14.1 Tesla. Acta Neurochir Suppl. 2003; 86: 71-4.

169. Lubec B., Kozlov A., Krapfenbauer K., Berger A., Hoeger H., Herrera-Marschitz M., Nohl H., Koeck T., Lubec G. Nitric oxide and nitric oxide syntase in the early phase of perinatal asphyxia of the rat Neurosci. 1999; 93(3): 1017-1023.

170. Marangos P.J., Paul S.M. Brain levels of neuron-specific and nonneuronal enolase in Hantingrons disease. J. Neurochem. 1981; 35(5): 1338-1340.

171. Marangos P.J., Cambell I.C., Schmechel D.E. Blood platelets contain a neuron-specific antigen. J. Neurochem. 1980; 34(5): 1254-1258.

172. Marangos P.J., Cambell I.C., Cohen R.M. Neuronal and glial proteins: Structure, function and clinical application. San Diego etc.: Acad. Press. 1998; p. 398.

173. Marks K.A., Mallard E.C., Roberts I., Williams C.E., Sirimanne E.S., Johnston B. Delayed vasodilation and altered oxygenation after cerebral ischemia in fetal sheep. Pediatric Research. 1996; 39(1): 48-54.

174. Martens P., Raabe A., Johnsson P. Serum S-100 and neuron-specific enolase for prediction of regaining consciousness after global cerebral ischemia. Stroke. 1998; 29: 2363-2366.

175. Martin L.J. Neuronal cell death in nervous system development, disease, and injury (Review). Int. J. Mol .Med. 2001; 7(5): 455-478.

176. McDonald J., Silverstein F., Johnston M. MK-801 protect the neonatal brain from hypoxic-ischemic damage. Eur. J. Pharmacol. 1987; 140: 359-361.

177. McGeer P., Itagaki S., Togo H., Mcgeer E. Reactive microglia in patients with senile dementia of the Alzheimer type are positive for the histocompatibility glycoprotein HLA-DR. Neurosci. Lett. 1987; 79(1-2): 195-200.

178. McGeer P.L., Kawamata T., Walker D.G., Akiyama H., Tooyama I., McGeer E.G. Microglia in degenerative neurological disease. Glia. 1993; 7: 84-92.

179. Meisenberg G., Simmons W.H. Peptides and blood-brain barrier. Life Sci. 1993; 32: 2611-2623.

180. Miller D.B., Blekman C.F., O'Callagan J.P. An increase glial fibrillary acidic protein follows brain hypertyermia in rats. Brain Res. 1987; 415: 371-374.

181. Missler U, Wiesmann M., Friedrich C., Kaps M. S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke. 1997; 28: 1956-1960.

182. Mitsufuji N., Yoshioka H., Okano S., Nishiki T., Sawada T., A new model of transient cerebral ischemia in neonatal rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1996; 16: 237-243.

183. Miyake K., Yamamoto W., Tadokoro M., Takagi N., Sasakava K., Nitta A., Furukawa S., Takeo S. Alteration in hippocampal GAP-43, BDNF, and LI following sustained cerebral ischemia. Brain Res. 2002; 935: 24-31.

184. Mokuno K., Kato K., Kavai K., Matsuoka Y., Yanagi T., Sobue I. Neuron-specific enolase and s-100 protein levels in cerebrospinal fluid of patient with various neurological diseases. J. Neurol. Sci. 1983; 60: 443-451.

185. Moller M., Ingild A., Bock E. Immunohistochemical demonstration of S-100 protein and GFA protein in intersticial cells of rat pineal gland. Brain. Res. 1978; 140(1): 1-13.

186. Moore B.W. A soluble protein characteristic of the nervous system. Biochem. biophys. Res. Commun. 1965; 19: 739 744.

187. Mori T., Morimoto K., Hayakawa T. Radioimmunoassay of astroprotein (an astrocyte specific cerebroprotein) in cerebrospinal fluid and its clinical significance. Neurol. Med.-Chir. (Tokyo). 1978; 18: 25-31.

188. Nagdyman N., Körnen W., Ko H., Muller C., Obladen M. Early Biochemical Indicators of Hypoxic-Ischemic Encephalopathy after Birth Asphyxia. Pediatric Research. 2001; 49(4): 133-139.

189. Nakajima W., Ishida, A., Lange M.S., Gabrielson K.L., Wilson M.A., Martin, L.J. Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat. The Journal of Neuroscience. 2000; 20(21): 7994-8004.

190. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. H. Histochem. Cytochem. 1974; 22 : 1084-1091.

191. Nedelcu J., Klein M.A., Aguzzi A., Boesiger P., Martin E. Biphasic edema after hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats reflects early neuronal and late glial damage. Pediatric Research. 1999; 46(3): 297-304.

192. Niebroj-Dobosz I., Rafalowska J., Lukasiuk M. Immunochemical analysis of some proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with ischemic strokes. Folia Neuropathol. 1994; 32(3): 129-137.

193. Northington F.J., Ferriero D.M., Graham E.M., Traystman R.J., Martin L.J. Early neurodegeneration after hypoxia-ischemia in neonatal rat is necrosis while delayed neuronal death is apoptosis. Neurobiol. Dis. 2001; 8(2): 207-219.

194. Padget D.N. The development of the cranial arteries in the human embrio. Carnegie Inst. Publ. 575, Contribution to Embriology. 1948; 32:205-261.

195. Pardridge W.M. Transport of nutrients and hormones through the blood-brain barrier. Fed.Proc. 1984; 43: 201-204.

196. Pardridge W.M. Neurotrophins, neuroprotection and the blood-brain barrier. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2002; 3(12): 1753-1757.

197. Palmer C. Hypoxic-ischemic encephalopathy: Therapeutic approaches against microvascular injury, and role of neutrophils, PAF, and free radicals. Clinics in Perinatology. 1995; 22(2): 481-517.

198. Palmer C. Neurobiology of perinatal asphyxia. Penn. State Coll. Med. 2001; 1:1-18.

199. Palmer C., Menzies S., Roberts R.L., Connor J.R. Iron containing "plaques" develop in the brains of rats months after neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Pediatric Research. 1998;43:322-328.

200. Pantoni L. Pathophysiology of age-related cerebral white matter changes. Cerebrovasc. Dis. 2002; 13 Suppl 2: 7-10.

201. Parati E., Bez A., Ponti D., Grazia U., Corsini E., Cova L., Sala S., Colombo A., Allessandri G., Pagano S. Human stem cells express extra-neural markers. Brain Res. 2002; 925:213-221.

202. Petito C.K., Halaby I.A. Relationship between ischemia and ischemic neuronal necrosis to astrocyte expression of glial fibrillary acidic protein. Int. J. Dev. Neurosci. 1993; 11(2): 239-247.

203. Petty M., Wettstein J. Elements of cerebral microvascular ischaemia. Brain Res. Reviews. 2001; 36: 23-34.

204. Pluta R. Blood-brain barrier dysfunction and amyloid precursor protein accumulation in microvascular compartment following ischemia-reperfusion brain injury with 1-year survival. Acta Neurochir. Suppl. 2003; 86: 117-122.

205. Prinz R.A., Marangos P.J. Use of neuron-specific enolase as a serum marker for neuroendocrine neoplasms. Surgery. 1982; 92(5): 887-889.

206. Pulera M. R., Adams L.M., Liu H., Santos D.G., Nishimura R.N., Yang F., Cole G.M., Wasterlain C.G., Apoptosis in a neonatal rat model of cerebral hypoxia-ischemia. Stroke 1998; 29: 2622-2630.

207. Raabe A., Grolms C., Sorge O., Zimmermann M., Seifert V. Serum S-100B protein in severe head injury. Neurosurgery. 1999; 45:477- 483.

208. Raju T.N.K. Some animal models for the study of perinatal asphyxia. Biol. Neonate. 1992; 1:202-214.

209. Reiber H. Dynamics of brain-derived proteins in cerebrospinal fluid. Clinica Chimica Acta. 2001; 310:173-186.

210. Renolleau S., Aggoun-Zouaoui D., Ben-Ari Y., Charriaut-Marlangue C., A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rats. Stroke. 1998; 29: 1454-1461.

211. Rice J., Vannucci R., Brierley J. The influence of immaturity on hypoxia-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 1981; 9: 131-141.

212. Risau W., Hallmann R, Albrecht U. Differentiation-dependent expression of proteins in brain endothelium during development of the blood-brain barrier. Dev Biol. 1986; 117(2): 537-545.

213. Rodriguez M., Ursy G., Bernal F., Cusi V., Mahy N. Perinatal human hypoxia-ischemia vulnerability correlates with brain calcification. Neurobiology of Diseases. 2001; 8: 5968.

214. Roher A., Wolff. D. Purification, ultrastructure and chemical analysis of Alzheimer's disease amyloid plaque core protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83: 2662— 2666.

215. Roncali L., Nico B., Ribatti D., Bertossi M., Mancini L. Microscopical and ultrastructural investigations on the development of the blood-brain barrier in the chick embryo optic tectum. Acta Neuropathol (Berl). 1986; 70(3-4): 193-20.

216. Rosen H., Rosengren L., Herlitz J., Blomstrand C. Increased serum levels of the S-100 protein are associated with hypoxic brain damage after cardiac arrest. Stroke. 1998; 29: 473-477.

217. Rosengren L.E., Haglid K.G. Long term neurotoxicity of styrene. A quantitative study of glil fibrillary acidic protein (GFAP) and S-100. Brit. J. Industr. Med. 1989; 46:. 316320.

218. Rosengren L.E., Wikkeiso C., Hagberg L. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: application in CSF of adults. J. Neurosci. Methods. 1994; 51: 197-204.

219. Roth S.C., Edwards A.D., Cady E.B., Delpy D.T., Wyatt J.S., Azzopardi D. Relation between cerebral oxidative metabolism following birth asphyxia and neurodevelopmental outcome and brain growth at one year. Dev. Med. Child. Neurol. 1992; 34: 285-95.

220. Ruppel R., Kochalek P., Adelson P. Excitotoxicy after severe traumatic brain injury in infants and children: the role of chield abuse. J. Pediatr. 2001; 138: 18-25.

221. Ruutianen J., Newcombe J., Malmi A. Measurement of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and anti-GFAP-antibodies by solid-phase radioimmunoasseys. J. Acta Neurol. Scandinav. 1981; 63:297-305.

222. Sameshima H., Ikenoue T., Long-term magnesium sulfate treatments as protection against hypoxic-ischemic brain injury in seven-day-old rats. Am. J. Obstet Gynecol. 2001; 184:185-190.

223. Saunders N.R. Handbook of Experimental Pharmacology. 1992. V.103: 328-369.

224. Schaarschmidt H., Prange H.W., Reiber H. Neuron-specific enolase and S-100 protein levels in cerebrospinal fluid of patients with various neurological diseases. J. Neurolog. Sciences. 1983; 60:443-451.

225. Schmechel D.E., Marangos P.J., Brightman M. Neuron specific enolase is a marker for peripheral and central neuroendocrine cells. Nature (London). 1979; 276: 834-836.

226. Schwartz P.H., Massarweh W.F., Vinters H.V., Wasterlain C.G., A rat model of severe neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Stroke. 1992; 23: 539-546.

227. Steinberg R., Gueniau C., Scarna H., Keller A., Worcel M., Pujol J. Experimental brain ischemia: neuron-specific enolase level in cerebrospinal fluid as an index of neuronal damage. J. Neurochem. 1984; 43(1): 19-23.

228. Stewart P.A., Hayakawa K Early ultrastructural changes in blood-brain barrier vessels of the rat embryo. Brain Res. Dev. Brain Res. 1994; 78(1): 25-34.

229. Steward O., Torre E.R., Tomasulo R., Lothman E. Neuronal activity up-regulates astroglial gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88: 6819-6823.

230. Steward O., Torre E.R., Tomasulo R. Seizures and the regulation of astroglial gene expression. Epilepsy Res. Suppl. 1992; 7:197-209.

231. Tan S., Parks D.A. Preserving brain function during neonatal asphyxia. Clinics in Perinatology. 1999; 26(3): 733-735.

232. Thomberg E., Thiringer K., Hagberg H., Kjellmer I. Neuron specific enolase in asphyxiated newborns: association with encephalopathy and cerebral function monitor trace. Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal. 1995; 72: 39^2.

233. Thompson C.M., Puterman A.S., Linley L.L., Hann F.M., Vanderelst C.W., Molteno C.D. The value of a scoring system for hypoxic ischaemic encephalopathy in predicting neurodevelopmental outcome. Acta Paediatr. 1997; 86(7): 757-761.

234. Thoresen M., Penrice J., Lorek A., Cady E.B., Wylezinska M., Kirkbride V. Mild hypothermia after severe transient hypoxia-ischemia ameliorates delayed cerebral energy failure in the newborn piglet. Pediatric Research. 1995; 37(5): 667-670.

235. Verdu Perez A., Falero M.P., Arroyos A., Estevez F., Felix V., Lopez Y., Pantoja A., Ureta A. Blood neuronal specific enolase in newborns with perinatal asphyxia. Rev. Neurol. 2001; 32(8): 714-717.

236. Vinores S.A., Marangos P.J. Immunoradiometric and immunohistochemical demonstration of neuron-specific enolase in experimental rat gliomas. Cancer Res. 1984; 44: 2595-2601.

237. Volbrodt A.W., Dobrogowska D.H. Immunocytochemical evaluation of blood-brain barrier to endogenous albumin in adult, newborn and aged mice. Folia Histochem. Cytobiol. 1994; 32(2): 63-70.

238. Volpe J.J. Brain injury in the premature infant: overview of clinical aspects, neuropathology, and pathogenesis. Semin Pediatr Neurol. 1998; 5(3): 135-151.

239. Volpe J.J. Neonatal seizures: current concepts and revised classification. Pediatrics. 1989; 84(3): 422-428.

240. Volpe J.J. Neurobiology of periventricular leukomalacia in the premature infant. Pediatr. Res. 2001; 50 (5): 553-562.

241. VoIpe J.J. Neurology of the Newborn. Saunders, Philadelfia. 1995; p. 422.

242. Volpe J.J. Overview: normal and abnormal human brain development. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 2000; 6(1): 1-5.

243. Volpe J.J. Perinatal brain injury: from pathogenesis to neuroprotection. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 2001; 7(1): 56-64.

244. Vorgias C.E., Traub P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1983; 115(1): 68-75.

245. Warlow C.P.,Dennis M.S., van Gijn J. Stroke. A practical guide to manadgement. Oxford, Blackwell Science Ltd, 1996; p.430.

246. Wen T.C., Rogido M., Genetta T., Sola A. Permanent focal cerebral ischemia activates erythropoietin receptor in the neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 2004; 355(3): 165-168.

247. Westaby S., Johnsson P., Parry A.J., Blomqvist S., Solem J.O., Ailing C., Pillai R., Taggart D.P., Grebenik C., Stahl E. Serum SI00 protein: a potential marker for cerebral events during cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 1996; 61: 88-92.

248. Williams C.E., Gunn A., Gluckman P.D. Time course of intracellular edema and epileptiform activity following prenatal cerebral ischemia in sheep. Stroke. 1991; 22(4): 516-521.

249. Wilsniewski H., Wegiel J., Wang K.C., Kujawa M., Lach B. Ultrastructural studies of the cells forming amyloid fibers in classical plaques. Can. J. Neurol. Sci. 1989; 16: 535542.

250. Winfree A. SFI studies in the sciences of complexity. Addison Wesley, MA, Reading 1993; 207-298.

251. Whitaker J., Lisak R., Bashir R. Immunoreactive myelin basic protein in the cerebrospinal fluid in neurological disorders. Ann. Neurol. 1980; 7: 58-64.

252. Woertgen C., Rothoerl R.D., Brawanski A. Time profile of neuron specific enolase serum levels after experimental brain injuiy in rat. Acta Neurochir. Suppl. 2000; 76: 371-373.

253. Wunderlich M.T., Ebert A.D., Kratz T., Gortler M., Jost St., Herrmann M. The early neurobehavioral outcome after stroke is related to the release of neurobiochemical markers of brain damage. Stroke. 1999; 30: 1190 -1195.

254. Xiang J., Ennis S.R., Abdelkarim G.E., Fujisawa M., Kawai N., Keep R.F. Glutamine transport at the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers. Neurochem. Int. 2003; 43(4-5): 279-288.

255. Zandbergen E.G., de Haan R.J., Hijdra A. Systematic review of prediction of poor outcome in anoxic-ischaemic coma with biochemical markers of brain damage. Intensive Care Med. 2001; 27(10): 1661-1667.

256. Zhang F., White J., Iadecola C. Nitric oxide donors increase blood flow and reduce brain damage in focal ischemia: evidence that nitric oxide is beneficial in the early stages of cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow. Metab. 1994; 14: 217-226.

257. Zhang R.L., Chopp M., Chen H., Garcia J.H. Temporal profile of ischemic tissue damage, neutrophil response, and vascular plugging following permanent and transient (2H) middle cerebral artery occlusion in the rat. J. Neural. Sci. 1994; 125: 3-10.

Информация о работе

Блинов, Дмитрий Владиславович
кандидата медицинских наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы