Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций ЦНС у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом

Волков, Андрей Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций ЦНС у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций ЦНС у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом"

На правах рукописи

ВОЛКОВ АНДРЕЙ ИГОРЕВИЧ

НЕИРОГЕННЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ВОССТАНОВЛЕНИИ ФУНКЦИЙ ЦНС У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ

03.01.04 - Биохимия 14.03.03 - Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 7 ЩР 2ои

МОСКВА-2011

4840207

Работа выполнена в ФГУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского» Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию.

Научные руководители:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, Чехонин Владимир Павлович

профессор

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Лебедев Сергей Васильевич

Терентьев Александр Александрович

Кукушкин Михаил Львович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Защита состоится «.......» ............................. 2011 года в 14:00 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан «.......».........................2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Н.Г. Потешкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Инсульт занимает первое место как причина инвалидизации и второе место в структуре общей смертности населения [Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, JI.B. Ста-ховская, 2007], что указывает на его высокую социально-медицинскую значимость. Благодаря изучению свойств нейрогенных стволовых клеток (ИСК) открылись новые перспективы в разработке средств лечения иисульта. В многочисленных доклинических исследованиях продемонстрировано, что имплантация НСК оказывает терапевтическое действие при экспериментальном инсульте. Среди гипотез, объясняющих этот феномен, наибольшее внимание уделяется рассмотрению роли НСК в качестве продуцентов и индукторов выделения факторов роста в окружающих тканях. Экспрессия СК терапевтических количеств факторов роста (в частности, мозгового нейротрофичсского фактора, BDNF) продемонстрирована in vitro [García R et al., 2004; Harms K.M.et al., 2010]. Вместе с тем нет исчерпывающих доказательств, подтверждающих подобные свойства НСК in vivo. Исходя из этого, особую актуальность имеет вопрос, в какой мере имплантация НСК может изменить уровень экспрессии BDNF в мозге и отразится ли это на течении нейродегенеративного процесса и функциональном состоянии ЦНС крыс после моделирования ишемических инсультов?

Цель работы

Исследовать влияние имплантации нейрогенных стволовых (прогенитор-ных) клеток на функциональное состояние ЦНС, биохимические показатели дегенеративных и репаративных процессов в ЦНС (нейроспецифические белки и факторы роста) после моделирования у крыс распространенного корково-подкоркового и локального коркового ишемических инсультов.

Задачи исследования: 1. Осуществить иммуногистохимическую верификацию клеточных препаратов эмбриональной нервной ткани крысы (ЭНТкр), нейрогенных стволовых клеток из обонятельной выстилки человека (НСКовч) и фибробластов крысы (Фкр) и исследовать жизнеспособность имплантированных клеток.

2. Воспроизвести модель распространённого корово-подкоркового ишемиче-ского инсульта путём односторонней окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) у крыс и осуществить мониторинг состояния двигательных и когнитивных функций после трансфузии им клеток ЭНТкр и Фкр (клеточный контроль) в большую цистерну мозга.

3. Определить уровни экспрессии факторов роста (мРНК NGF, ВОЫР, ЫТ-З) в клеточных препаратах (ЭНТкр, Фкр, НСКовч), использованных в работе для экспериментальной клеточной терапии ишемического инсульта.

4. Определить концентрации нейроспецифических белков (ЫБЕ, СРЛР) и ЫОР в цереброспинальной жидкости и сыворотке крови у крыс с ОСМА после трансфузии им клеток ЭНТкр и Фкр (клеточный контроль) в большую цистерну мозга.

5. Воспроизвести у крыс односторонний локальный ишемический инсульт в сенсомоторной зоне коры головного мозга по методу [Ко1Ь й а1., 2007] в доминантном и недоминантном полушариях головного мозга (по показателю преимущественного использования лапы при захвате пищи) и осуществить в течение двух месяцев еженедельный мониторинг функций контралатералыюй передней лапы.

6. У крыс с ишемическим инсультом в сенсомоторной зоне коры мозга исследовать влияние имплантации НСК (ЭНТкр и НСКовч) и Фкр (клеточный контроль) в периинфарктную корковую зону на восстановление функций ЦНС и экспрессию ВГЖР в зонах имплантации клеточных препаратов.

Научная новизна

Впервые показано, что имплантации крысам в большую цистерну головного мозга или в периинфарктную область препаратов клеток без стволовых (про-генитоных) свойств в качестве клеточного контроля (Фкр) в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов не оказывает положительного терапевтического эффекта по показателям состояния интегральных функций ЦНС и экспрессии В1ЖР.

Впервые установлен терапевтический эффект имплантации клеточного препарата ЭНТкр в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемичсских инсультов. Показана специфичность действия клеток ЭНТкр в сравнении с «клеточным контролем» (Фкр).

Впервые применен метод анализа уровней нсйроспсцифических белков (НСБ) в ликворе и крови для прижизненной верификации нейропротективного эффекта клеточной терапии ишемического инсульта у крыс.

Впервые установлено, что восстановление функций контралатералыюй передней лапы крыс после моделирования одностороннего инсульта в зоне ее представительства в коре головного мозга крыс по методу Колб и соавт. [Ко1Ь е1 а1., 2007] происходит существенно лучше при моделировании упомянутого инсульта в «доминантном» (тест захвата пищи) полушарии головного мозга, чем при операциях на «субдоминантном» полушарии.

Теоретическая значимость работы:

1. Обобщен обширный литературный материал в сфере изучения роли стволовых клеток при ишемическом инсульте и выделены основные нерешенные проблемы изучения механизмов лечебного действия НСК и перспективы экспериментального исследования эффективности клеточной терапии

2. Экспериментальные данные о влиянии имплантации ЭНТкр на интегральные и «парциальные» функции ЦНС на моделях обширного и локального ишемического инсульта в сочетании с результатами биохимических исследований свидетельствуют о системных и паракринных механизмах терапевтического эффекта НСК.

3. В исследовании продемонстрировано значение функциональной асимметрии полушарий мозга крыс в восстановлении после инсульта в сенсомоторной коре в доминантном и субдоминантном полушариях головного мозга.

Научно-практическое значение работы:

1. Предложен методологический подход с использованием клеточного контроля и оценки функциональной асимметрии головного мозга, позволяющий повысить достоверность доклинических исследований стволовых клеток на мо-

делях ишемического инсульта.

2. Экспериментально апробирован способ диагностики повреждения клеток нервной ткани с помощью анализа НСБ в крови и ликворе для прижизненной верификации нейропротективного эффекта клеточной терапии инсульта у крыс.

3. Полученные в работе данные могут использоваться для планирования дизайна доклинических исследований в сфере клеточной терапии инсульта.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В механизмах нейрорепаративного действия СК у крыс с ишемическим инсультом присутствуют системные и паракршшые эффекты, поскольку:

- трансфузия в большую цистерну головного мозга клеток ЭНТкр в острой стадии ишемическом инсульта после ОСМА у крыс приводит к существенному восстановлению нарушенных двигательных и когнитивных функций ЦНС, а также снижению концентраций в ликворе и сыворотке крови маркёров нейроде-генеративного процесса - N811, и СРЛР.

- имплантация ЭНТкр в периинфарктную зону крысам с экспериментальным ишемическим фокальным инсультом в сенсомоторной коре мозга оказывает стойкий положительный эффект на восстановление нарушенных функций кон-тралатералыюй передней лапы, что сопровождается 4-х кратным повышением экспрессии мРНК 1ШЫР в местах имплантации клеток ЭНТкр в сравнении с местами имплантации Фкр (клеточный контроль) и более чем 20-кратным повышением - по сравнению с периинфарктной областью без имплантации клеток.

2. Имеются существенные различия влияния имплантации аллогенных (ЭНТкр) и ксеногенных (НСКовч) на восстановление функций ЦНС после ишемического повреждения мозга и активацию экспрессии ВГУЫН в местах их имплантации в мозг.

3. При доклинических исследованиях клеточных препаратов (новых средств лечения) с использованием моделей одностороннего инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга у крыс объективные данные об эффективности испытуемых средств могут быть получены при условии учёта доминантности полушария головного мозга, определяемой с помощью теста захвата пищи передней лапой.

4. В дизайн экспериментальных исследований in vivo по изучению биохимических механизмов биологического действия препаратов стволовых (прогепи-торных) клеток и их эффективности на организменном уровне должны быть включены исследования с использованием препаратов клеток без стволовых (прогениторных) свойств (клеточный контроль).

Апробация работы проведена на совместном заседании Проблемного учёного совета по Фундаментальной и прикладной нейробиологии, с участием сотрудников отдела Фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП» Минздравсоцразвития, кафедры Неврологии и нейрохирургии с курсом ФУВ, кафедры Нано- и биомедицинских технологий и кафедры Патологической физиологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Основные положения работы представлены в периодической научной печати и докладах на научных конференциях: Всероссийские научные школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2009, 2010); 14 Международный конгресс по психофизиологии "The Olympics of the Ьгат"(Санкт-Петербург, 2008); Всероссийская школа-конференция «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); 8 Международный конгресс Европейской Коллегии по нейропсихофармакологии -8th ECNP Regional Meeting (Москва, 2005).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 6 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на русском языке, изложена на 134 страницах и состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения) выводов, практических рекомендаций и списка публикаций по теме диссертации.

Диссертация содержит 22 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 32 источника отечественной и 205 - зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах - самцах (п=147) с исходной массой 300 - 350 г. Условия содержание животных и манипуляции с ними соответствовали требованиям приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также международным правилам «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Хирургические манипуляции выполняли под наркозом (кетамин 100 мг/кг, диазепам 50 мг/кг, внутрибрюшинно).

Модель корково-подкоркового ишемического инсульта вследствие окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) воспроизводили по методу Tamura в модификации Bederson [Bederson, 1986] (п=8). Контрольным животным осуществляли «ложную» операцию (J10CMA) (п=6).Функционалыюе состояние ЦНС оценивали с помощью неврологической шкалы Menzies [Menzies, 1992], К-теста [Лебедев C.B., Петров C.B., Блинов Д.В. и соавт., 2003] и теста пассивного избегания [Borlongan, 1998] в течение 12 недель.

Односторонний корковый ишемический инсульт воспроизводили в зоне представительства передней лапы по методу Kolb и соавторов [Kolb et al., 2007]. Поверхностные сосуды коры удаляли стерильным ватным тампоном вместе с мягкой мозговой оболочкой в пределах прямоугольного костного окна с координатами от брегмы +3 и -1 мм и 1.5 и 4.5 мм от средней линии. Открытую поверхность мозга укрывали лоскутом твердой мозговой оболочки, рану ушивали. Антибиотики не использовали. В группе ложного коркового инсульта воспроизводили все этапы операции, за исключением удаления сосудов (п=6). Моторику передней лапы оценивали в течение 8 недель с помощью цилиндр-теста, виб-рисс-теста и теста плавания согласно [Kolb et al., 2007] с незначительными модификациями. Функциональную асимметрию полушарий головного мозга передних лап определяли с помощью теста на захват пищи левой или правой передними лапами (reaching-test). В случае если крыса пользовалась одной лапой более чем в 29 попытках из 50, ее относили к особям, характеризующимся «доминантностью» соответствующего полушария головного мозга. Крыс, захваты-

вающих корм одной из лап в 22-28 попытках из 50, относили к амбидекстрам и в дальнейших экспериментах не использовали [BetaneurC. etal, 1991]. Для анализа влияния функциональной асимметрии мозга на восстановление функции передней лапы корковый инсульт моделировали в доминантном и субдоминантном полушариях (по 12 крыс в каждой группе).

Морфологические изменения мозга оценивали во всех экспериментальных группах в конце экспериментов (от 6 до 24 крыс в различных группах). Для выявления картины морфологической динамики зоны повреждения исследовали отдельные группы крыс с ОСМА, корковым инфарктом и животных соответствующих контрольных групп через 4 и 30 суток после операций (п=4 в каждой группе). Серийные срезы мозга (12 срезов между 4,7 мм и -5,3 мм относительно брегмы) окрашивали по методу Ниссля. Рассчитывали необходимые объёмы ткани мозга. Дефицит нервной ткани определяли, вычитая из объема вещества мозга неповрежденного полушария объем вещества поврежденной гемисферы.

Клеточный препарат ЭНТкр получали согласно протоколу [YuanY. 2002], НСКовч - в соответствии с [Викторов И.В., 2007]. В качестве «клеточного контроля» использовали препарат крысиных фибробластов линии «Rat2» - аллоген-ные клетки без прогениторных свойств. Верификацию клеточного состава ЭНТкр и НСКовч проводили иммуноцитохимическим методом с использованием первичных антител к beta-tubulin 1:300 (Millipore), 04 1:100 (Millipore), nestin 1:100 (Millipore), GFAP 1:500 (собственного производства) и вторичных антител, конъюгированных с Alexa (Invitrogen, США). Препарат Фкр оценивали по способности поглощать коллагеновые флюоресцентные наночастицы (Invitrogen, США) из раствора. Жизнеспособность клеток in vitro перед имплантацией, определяли методом окраски трипановым синим. Она составляла не менее 90%.

Клеточные препараты имплантировали сразу после воспроизведения ишемии в обеих моделях инсульта с помощью шприца со стальной иглой диаметром 0,6мм, соединённого с микропомпой (Stoelting, США), закрепленного в микроманипуляторе стереотаксического аппарата (Narishige, Япония). Скорость вве-денияи выведения иглы - 10 мкм/сек. Крысам с ОСМА клеточные препараты

(ЭНТкр (п=6), Фкр (п=7)) вводили со скоростью 5 мкл/мин в количестве 2 млн в 20 мкл раствора физиологического солевого буфера (ФСБ) в большую цистерну мозга стереотаксическим методом [Лебедев C.B. и соавт, 2004]. Животным с корковым инсультом клеточные препараты (ЭНТкр (п=6), НСКовч (п=7), Фкр (п=12) в количестве 1 млн клеток в 12 мкл раствора ФСБ имплантировали в два участка коры мозга (проксимальнее и дистальнее границы зоны деваскуляриза-ции) по координатам: а) +3 мм от брегмы, 2.3 мм от средней линии и 2.2 мм от поверхности мозга и б) -1 мм от брегмы, 2.7 мм от средней линии и 2.2 мм от поверхности мозга. Скорость введения клеточных препаратов составила 1 мкл/мин. Выведение иглы начинали через 5 мин после окончания имплантации препаратов.

Исследование жизнеспособности имплантированных клеток проводили на отдельных группах крыс с ОСМА (п=6) и корковым ишемическим инсультом (п=14). Клетки перед имплантацией метили витальным красителем CFDA SE (карбоксифлуоресцеин-диацетатсукцинимидный эфир, Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Через 4, 7 и 16 суток животных подвергали эвтаназии, готовили серийные коронарные срезы головного мозга и исследовали их методом флюоресцентной микроскопии.

Для анализа НСБ в отдельных группах крыс с ОСМА (n=8), ЛОСМА (п=6) и ОСМА+ЭНТкр (п=14) осуществляли забор крови на 7, 14 и 30 сутки из бедренной вены (объем 1000 мкл) и ликвора на 14 сутки (объем 100 мкл) - путем пункции большой цистерны мозга стереотаксическим методом [Лебедев C.B. и соавт, 2004]. Образцы сыворотки крови и СМЖ хранили при -70°С до процедуры количественного анализа в них НСБ.

Концентрации NSE и GFAP в СМЖ и сыворотке крови измеряли методом sandwich ELISA по A. Voller и соавт. в модификации В.П. Чехонина с соавт. [В.П. Чехонин, Т.Б. Дмитриева, Ю.А. Жирков, 2000]. Применяли собственные иммунохимические тест-системы на основе моноклональных антител (лаборатория иммунохимии ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава»). Концентрацию НСБ в тести-

руемых пробах определяли по калибровочной кривой, построенной исходя из данных многократного их определения в растворах с известной концентрацией.

Концентрации NGF в образцах крови, полученных через 7, 14 и 30 суток в группах крыс с ОСМА, ЛОСМА и ОСМА+ЭНТкр и образцах ликвора, выделенных через 14 суток после ОСМА, исследовали с использованием Sandwich ELISA kit компании Chemicon (Millipore) International согласно рекомендациям производителя.

Для исследования экспрессии мРНК BDNF, отдельным группам крыс сразу после удаления сосудов коры мозга, в два участка коры, проксимальнее и дис-тальнее границы зоны деваскуляризации, имплантировали препараты НСК (ЭНТкр, п=4 и НСКовч, п=8) и Фкр (п=8), соответственно. Координаты мест введения клеток представлены выше. Через 7 суток крыс подвергали эвтаназии введением кетамина (200 мг/кг внутрибрюшинно). В пределах зон имплантации клеток и соответствующих участков мозга без клеточной имплантации (п=4) выделяли фрагменты ткани мозга размерами 1.5x1.5x2.4 мм и немедленно помещали их в жидкий азот. Осуществляли выделение тотальной РНК из биопта-тов мозга и клеточных культур ЭНТкр, НСКовч и Фкр. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью набора для обратной транскрипции Superscript II (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве праймера использовали олиго-сГГ18 праймер. Эффективность обратной транскрипции оценивали постановкой ПЦР с праймерами к GAPDH с последующей визуализацией продуктов реакции в 2% агарозном геле.

Оценку результатов осуществляли стандартным методом [Burns Т.С. et al. 2009], характеризующим кратность увеличения уровня экспрессии гена (в нашем случае BDNF) по отношению к уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства клетки» (GAPDH). Вычисляли по формуле:

Уровень экспрессии BDNF =

Е,

.ACt (контроль—эксперимент) (GADPH) _

Е,

, ACt (контроль—эксперимент) (BDNF)

где Е - эффективность реакции, О - пороговый цикл в эксперименте и контроле. Для постановки эксперимента в качестве контроля использовали усредненное значение С1 для ткани периинфарктной области мозга крысы, выделенной на 7 день после моделирования инсульта. Для анализа клеточных препаратов в качестве контроля использовали усредненное значение О для культуры нормальных фибробластов крысы.

При статистической обработке данных использовали ^критерий Стьюдента и непараметрический анализ Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса.

Результаты исследования и их обсуждение

Характеристика модели корково-подкоркового ишемического инсульта вследствие окклюзии СМА

Выживаемость крыс в группе ОСМА и группе ЛОСМА (контроль) составила 100 % на протяжении 3 месяцев эксперимента. Крысы с инсультом существенно отставали в прибавке массы тела от контрольных животных. Относительный прирост массы тела в конце эксперимента составил в группе ОСМА 86±11г, а в группе ЛОСМА - 131 ± 8 г (р<0,01, критерий Стьюдента).

Морфологический анализ срезов мозга, проведенный на 4-е сутки после ОСМА выявил зону паннекроза, охватывающую весь бассейн средней мозговой артерии с вовлечением обширных областей сенсомоторной коры, стриатума, лимбических структур (первичной обонятельной коры, энторинальной коры) и наружной капсулы. Вокруг зоны инфаркта отмечали скопление клеток глии и лейкоцитов (глиомезодермальный вал). Через 90 суток после ОСМА отмечалось образование кисты, глиальных рубцов, деформация структур полушария, расширение бокового желудочка на стороне инфаркта, который в части случаев был соединен с кистой. У крыс с ЛОСМА морфологических изменений мозга выявлено не было.

Функциональные тесты - неврологическая шкала Мепг1е5, К-тест и тест пассивного избегания - регистрировали грубый неврологический дефицит в группе ОСМА в течение всего периода наблюдения (рис. 4). В группе ЛОСМА у 2 крыс из 6 на 3 сутки после операции регистрировались легкие функциональ-

ные нарушения в 1 балл по шкале Мегшеэ (тоническая флексия контралатераль-ной передней лапы при поднятии крысы за хвост). В дальнейшем на всех сроках тестирования неврологический дефицит в этой группе не выявлялся.

Морфометрический анализ показал, что дефицит вещества мозга через 3 месяца после ОСМА составляет 291 ± 34 мм3 (36% от размеров противоположного полушария мозга).

Таким образом, воспроизведена модель обширного корково-подкоркового ишемического инсульта, удовлетворяющая задачам исследования по изучению влияния клеточной имплантации на интегральные функции ЦНС в течение длительного времени (не менее 3 месяцев).

Характеристика модели ишемического инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга

Гибели животных после моделирования коркового инсульта и ложного инсульта в течение 2 месяцев мониторинга не было. Наблюдалась тенденция к отставанию в прибавке массы тела в группе с инсультом, составившая через 2 месяца 118±12г, по сравнению с группой ложного инсульта (126±15г), которая, однако не достигла 95% статистической достоверности (р=0,12, критерий Стью-дента).

Морфологические исследования выявили формирование и последующую организацию инфаркта коры, не выходящего за пределы зоны удаления мягкой мозговой оболочки. На 4 сутки на коронарных срезах мозга, окрашенных по Нисслю, в зоне удаления мягкой мозговой оболочки визуализировась деструкция тел нейральных и глиальных клеток, дефрагментация хроматина. В периин-фарктной зоне в пределах приблизительно 800 мкм от области инфаркта определялся цитоплазматический отек, гиперхромная окраска ядер клеток и гиперхро-мия цитоплазмы клеток пирамидного слоя. В эпицентре и по периферии инфаркта визуализировалось значительное количество клеток глии. Через 16 суток зона инфаркта четко ограничена астроглиальным валом, определяются единичные клетки с гиперхромными ядрами в периинфарктной зоне. Через 30 суток и через 8 недель визуализировались четко организованная киста, окруженная аст-

роглиальным валом, деформация окружающих структур мозга и увеличение бокового желудочка.

Размеры постинсультного дефицита вещества неокортекса, рассчитанные через 8 недель после операции, составили - 36,8±7,2 ммЗ.

Моделирование инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга вызвало нарушения, которые выявлялись в цилиндр-тесте, тесте плавания и вибрисс-тесте на всех сроках наблюдения (рис. 1,5). В группе с ложной операцией у отдельных крыс выявлялись легкие отклонения функциональных показателей лишь в течение первых двух недель мониторинга. У крыс с инсультом в «доминантном» полушарии мозга моторика контралатеральной лапы восстанавливалась лучше, чем у животных с поражением субдоминантной гемисферы. Значимые различия между этими группами по показателям цилиндр-теста выявлялись на сроках 4-8 недель, теста «плавание» - на 6-8 неделях и вибрисс-теста - на 8 неделе мониторинга (р<0,05 - критерий Манна-Уитни с поправкой для двух пар сравнений) (рис. 1). Впоследствии всем экспериментальным животным корковый инсульт моделировали на доминантном полушарии. Результаты оценки функций у крыс с инсультом в доминантном полушарии, представленные выше, использовали в экспериментах с клеточной имплантацией в качестве контроля (рис. 5).

Таким образом, воспроизведена модель фокального ишемического инсульта в коре мозга. Инсульт имеет четкие границы и вызывает нарушения функций передней лапы, детектируемые в течение не менее 8 недель. Исследован метод отбора экспериментальных групп, характеризующихся однородной динамикой восстановления моторики лапы, и основанный на учете функциональной асимметрии полушарий головного мозга. Эти особенности модели позволяют изучать влияние имплантации стволовых клеток в периинфарктую зону мозга на восстановление функций ЦНС и экспрессию ВО№ в этой области мозга.

1»

ЯП 60 40 20 0

Цшшндр-тест

1 2 3 4 5

Плавание

♦ Инсульт в доминантном полушарии

-♦-Инсульт в субдоминантном полушарии

•о Впбрпсс-тест

недели

Рисунок 1. Динамика относительных показателей функций контралатеральной передней лапы в группах крыс с корковым инсультом в доминантном и субдоминантном полушариях мозга (100% - уровень показателей тестов до операции), *-достоверные отличия групп (р<0,05, критерий Манна-Уитни с поправкой для двух пар сравнений).

Цитохимическая характеристика клеточных препаратов

Препарат ЭНТкр включал 90% пезйп +, 50% Ье1а-П1-шЬиНп + и 2-3% СРАР+ клеток. Препарат НСКовч - до 90% пЫт +, 30% Ьйа-ПЫиЫШп, 2-4% ОРАР+, до 2% 04+клеток. Препарат фибробластов крысы характеризовался активным поглощением коллагеновых флюоресцирующих наночастиц.

Таким образом, были подтверждены прогениторные свойства ЭНТкр и НСКовч и дана функциональная характеристика клеточного препарата Фкр.

Жизнеспособность клеточных препаратов после имплантации

ЭНТкр, меченые витальным красителем СРБА, введенные в большую цистерну мозга сразу после моделирования ОСМА, обнаруживались на 4 и 7 сутки в оболочках, выстилающих цистерну (рис. 2). На 16 сутки клетки в цистерне не визуализировались. У крыс с корковым инсультом исследовали жизнеспособность ЭНТкр, НСКовч и Фкр через 4, 7, 16 и 30 суток после имплантации этих

клеток в периинфарктную зону коры. На 4, 7 и 16 сутки клетки визуализировались в паренхиме мозга вблизи инъекционного трека. На 16 сутки часть меченых ЭНТкр и НСКовч формировали сеть отростков, что свидетельствует о жизнеспособности клеток и признаках их дифференцировки (рис. 3). Тем не менее, через 30 суток меченые клетки в мозге не визуализировались.

Рисунок 2. Визуализация клеток, меченых витальным красителем CFDA SE, в оболочках мозга, выстилающих cisterna magna, через 4 суток (А) и 7 суток (Б) после имплантации ЭНТкр (флюоресцентная микроскопия).

Рисунок 3. Визуализация клеток, меченых витальным красителем СЕБАЗЕ, в пери-инфарктной зоне коры мозга через 7 суток (А, Б, В) и 16 суток (Г, Д, Е) после имплантации (флюоресцентная микроскопия). А, Е - НСКовч; Б, Д - ЭНТкр; В,Е - Фкр

При анализе окрашенных по Нисслю коронарных срезов мозга, выполненных через 8 недель после имплантации, в большинстве препаратов не было выявлено компактных скоплений клеточных масс, характеризующих присутствие имплантата.

Таким образом, после имплантации значительное количество клеток сохраняли жизнеспособность, что позволило приступить к исследованиям влияния имплантации клеток на функциональное состояние животных.

Мониторинг функционального состояния ЦНСу крыс с ОСМА после имплантации клеточных препаратов

Гибели крыс в экспериментальных группах не было. Прибавка массы тела у крыс с ОСМА после имплантации Фкр и ЭНТкр, через 3 месяца составляла 91±13г и 95±10г, соответственно. Эти данные статистически не отличались от группы ОСМА без клеточной терапии (86±11г) (дисперсионный анализ, р>0.05).

Имплантация Фкр (клеточный контроль) не вызвала статистически достоверных отклонений функциональных показателей ЦНС от животных, которым клетки не вводились (рис. 4).

сек 120 100 80 60 40 20 0

Пассивное тбегание

-♦-ОСМА (п=8) ОСМА+Фкр (п=7) - - ОСМА+ЭНГкр (п=6)

сутки

Неврологическая шкала Мепх1ея

Ол'мпн

7 6 5 4 3 2 1 0

К-тест

15 30 45 60 75

90 СуТКИ 15

75 90 сутки

Рисунок 4. Показатели функционального состояния ЦНС у крыс с корково-подкорковым ишемическим инсультом и имплантацией клеточных препаратов, п- количество животных в экспериментальных группах;

*- статистически достоверные отличия от групп ОСМА и ОСМА+Фкр (р<0,05, критерий Крускала-Уоллиса)

Инфузия ЭНТкр в большую цистерну мозга оказала положительный эффект на все исследуемые функции ЦНС (рис. 4). Достоверные отличия от группы без клеточной имплантации и животных, получавших фибробласты, в выполнении теста пассивного избегания регистрировались на всех сроках тестирования, в неврологической шкале - на 3, 30, 60 и 90 сутки, в К-тесте - на 15 и 30 сутки после ОСМА.

Таким образом, у крыс с ОСМА инфузия ЭНТкр в большую цистерну мозга оказала специфичный терапевтический эффект на интегральные показатели функционального состояния ЦНС: функцию памяти, неврологический статус и вращательную асимметрию. Это позволило приступить к исследованиям биохимических маркеров наблюдаемых системных изменений (определению концентраций НСБ и N0? в ликворе и крови).

Мониторинг функционального состояния ЦНС у крыс с корковым инсультом после имплантации клеточных препаратов

Гибели крыс в экспериментальных группах не было. Прирост массы тела крыс в экспериментальных группах был одинаковым. Он составил в группе с инсультом без клеточной терапии, с имплантацией Фкр, ЭНТкр и НСКовч 118±12г, 116±15г, 122±9г, 126±14г, соответственно, (Р<0,01, дисперсионный анализ).

Имплантация Фкр (клеточный контроль) не оказала существенного влияния на функции лапы в сравнении с контрольной группой без введения клеток (рис. 5). У крыс, которым вводили ЭНТкр (рис.5), отмечалось стойкое превышение функциональных показателей цилиндр-теста и теста плавания над соответствующими значениями в контрольных группах в течение всего периода наблюдения. Наблюдаемые отличия достигли статистической значимости в цилиндр-тесте на 1,2 и 6 неделе, в тесте плавания - на 4 и 5 неделях (р<0,05, критерий Крускала-Уоллиса), при этом уровень функционального восстановления приближался к дооперационному. По результатам вибрисс-теста подобных различий не отмечалось. В группе крыс с имплантацией НСКовч (рис.5) показатели моторики передней лапы не отличались от контролей.

Таким образом, у крыс с инсультом в сенсомоторной зоне коры мозга выявлен терапевтический эффект имплантации ЭНТкр на специфические функции этой области мозга - моторику контралатеральной передней лапы. Это позволило приступить к исследованиям экспрессии мРНК ЕШЫР в месте имплантации этих клеток в качестве предполагаемого механизма наблюдаемого эффекта. Вместе с тем у крыс с имплантацией НСКовч функциональные показатели ЦНС существенно не изменились, несмотря на близкие иммуноцитохимические характеристики этого клеточного препарата с ЭНТкр. Отражает ли уровень экспрессии мРНК ВВОТ различную терапевтическую эффективность ЭНТкр и НСКовч - не ивестно.

100

Цилиндр-тест

""" Икгаюные (п=6)

♦ Инсульт (п=12)

♦ Инсульт +Фкр (п=12)

- •-- Инсульт + ЭНТкр (п=6) Инсульт + НСКовч (п=7)

gHeдeли

Вибрисс-тест

Л"

___л

Рисунок 5. Показатели функционального состояния ЦНС (моторика передней лапы) у крыс с корковым ишемическим инсультом и имплантацией клеточных препаратов, п- количество животных в экспериментальных группах; *- статистически достоверные отличия от групп ОСМА и ОСМА+Фкр (р<0,05, критерий Крускала-Уоллиса)

Результаты морфометрии мозга у крыс с ОСМА и корковым инсультом после имплантации клеточных препаратов

У крыс с ОСМА размеры постинсультного дефицита вещества мозга через 90 суток после инфузии Фкр и ЭНТкр в большую цистерну мозга составляли 288±32 и 275±26 мм3 соответственно. Эти результаты статистически не отличаются от группы животных с инсультом, не получавших клеточную терапию (291±34 мм3) (дисперсионный анализ, р>0.05).

У крыс с инсультом в коре мозга, размеры атрофии коры, рассчитанные через 8 недель после операции, в группах без клеточной терапии, имплантацией Фкр, ЭНТкр и НСКовч, также достоверно не различались (дисперсионный анализ, р>0.05) и составляли 36,8±7,2; 37,3±11,6; 33,4±8,1 и 36,2±12,2 мм3, соответственно.

Таким образом, морфометрия дефицита нервной ткани на моделях ишеми-ческого инсульта различной тяжести не выявила существенного влияния имплантации ЭНТкр и НСКовч на этот показатель.

Уровни нейроспецифических белков в крови и ликвореу крыс с ОСМА и инфузией ЭНТкр в большую цистерну мозга

Рабочий отрезок калибровочных кривых иммуноферментного анализа NSE и GFAP составляет 2-128 нг/мл. Погрешность измерений - 1,5-2 нг/мл.

Исследование уровней NSE и GFAP в ликворе и сыворотке крови крыс с ОСМА и клеточной терапией выявило, что имплантация ЭНТкр приводит к достоверному снижению уровня этих белков как в ликворе, так и в сыворотке крови (см. рис.6). В настоящем эксперименте также были воспроизведены результаты [Петров C.B., Лебедев C.B., Турина О.И., Чехонин В.П. Иммунохимическая верификация хронизациинейродегенеративного процесса у крыс после окклюзии средней мозговой артерии. Нейрохимия. 2005. №2. С. 133-137.], свидетельствующие о повышении уровня НСБ в этих биологических жидкостях на 14 сутки после ОСМА.

□ ЛОСМА (и=б) "ОСМА (п=8) ОСМА+ЭНТкр (п= 14) Сыворотка крови

N81

С¥АР

О. нг/мя 50

40 30 20 10 0

С. нг/мя 20

?0 Сутки

с!1, л1

Сутки

Рисунок 6. Концентрации ШЕ и йЕАР сыворотке крови и ликворе крыс с ОСМА и имплантацией ЭНТкр. п- количество животных в экспериментальных группах; *- статистически достоверные отличия от группы ОСМА (р<0,05, критерий Манна-Уитни)

Таким образом, у крыс с ОСМА продемонстрировано системное влияние инфузии ЭНТкр на уровни НСБ в крови и ликворе. Вместе с тем прижизненный анализ НСБ в образцах ликвора и крови продемонстрировал большую чувствительность в регистрации степени повреждения нервной ткани, чем морфометри-ческие исследования.

Уровни !\аГ в клеточном препарате ЭНТкр, ликворе и сыворотке крови крыс с ОСМА и инфузией ЭНТкр в большую цистерну мозга

Рабочий отрезок калибровочных кривой иммуноферментного анализа N0? составляет 15,6 - 500 пг/мл. Погрешность измерений - 10-15 пг/мл. Исследование образцов надосадочной жидкости, полученной через 24 и 48 ч после культи-

вации ЭНТкр в количестве 4 млн клеток в 40 мкл среды DMEM показал, что уровень NGF не превышает 15,6 пг/мл, т.е. пределов чувствительности метода. Концентрация NGF в ликворе и сыворотке крови у крыс с ОСМА и имплантацией ЭНТкр также не превышала порога чувствительности метода. Таким образом, исследование концентраций NGF в клеточном препарате ЭНТкр и образцах крови и ликвора крыс с ОСМА и инфузией ЭНТкр не увенчалось успехом в связи с недостаточной чувствительностью использованного метода ELISA. В связи с этим, нами предпринята попытка использовать более чувствительный анализ -ПЦР в реальном времени - для исследования уровня экспрессии мРНК NGF, наряду с другими факторами роста, в клеточных препаратах ЭНТкр, НСКовч, Фкр и образцах периинфарктной ткани мозга после имплантации этих клеток.

Экспрессия мРНК факторов роста (NGF, BDNF, NT-3, VEGF) в клеточных препаратах ЭНТкр, НСКовч, Фкр и BDNF в образцах периинфарктной ткани мозга после имплантации этих клеток

Выход тотальной РНК из клеток и тканей составил 30-50 мкг с одной пробы. Значения А260/280 лежали в диапазоне от 1,97 до 2,07. На 1,2% формалин-агарозном геле визуализировались две четкие полоски, по молекулярной массе соответствующие 18S и 28S рРНК. При постановке ПЦР реакции с ген-специфическими праймерами с использованием 1 мкл реакционной ОТ-ПЦР смеси в качестве матрицы на 2% агарозном геле визуализировались единичные четкие полоски с ожидаемой длиной 161 п.н. и 130, 137, 107, 83 п.о. для GAPDH и NGF, BDNF, GDNF и VEGF, соответственно.

Уровень экспрессии мРНК NGF, BDNF, NT-3 и VEGF был минимальным и не превышал экспрессию гена GAPDH «домашнего хозяйства» клетки.

Уровень мРНК BDNF в образцах периинфарктной ткани мозга через 7 суток после имплантации Фкр и НСКовч повышался в 6 и 5 раз, соответственно, тогда как имплантация ЭНТкр приводила к 23-кратному увеличению мРНК BDNF (р<0,001 в сравнении с группами Фкр и НСКовч, см рис 7). Эти данные были воспроизведены в двух сериях экспериментов.

Таким образом, обнаружен феномен повышения экспрессии мРНК ЕШ^ в зоне имплантации всех применявшихся клеточных препаратов. При этом наиболее высокая экспрессия ЕШЫР стабильно регистрировалась у крыс, получавших ЭНТкр - клеточный препарат, оказавший терапевтический эффект у крыс с ОСМА и корковым инсультом.

мРНК воз- 30 1

вратность

увеличения 25

относительно

образцов ткани в 20

периинфарктной

области без 15

имплантации

клеток - 10

II)

I :

Ль

Периинфарктная Область г---------

НСКовч

ЭНТф

Клеточные имплантаты

Зона . инфаркта 1 ........ ^

Рисунок 7. Экспрессия мРНК BDNF в образцах ткани периинфарктной области (7 сутки после операции), метод ПЦР в реальном времени. *р<0,05 с группами Фкр и НСКовч

Резюмируя полученные экспериментальные данные, можно отметить, что использование клеточного контроля (Фкр) позволило оценить специфичность влияния имплантации ЭНТкр на функции ЦНС у крыс с корково-подкорковым (ОСМА) и корковым ишемическими инсультами. У крыс с ОСМА обнаружен терапевтический эффект ЭНТкр на интегральные функциональные показатели ЦНС и элиминацию НСБ в ликвор и кровь. Этот результат свидетельствует о системном механизме влияния НСК на состояние животных. Для исследования

паракринного эффекта НСК воспроизведена модель ишемического инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга и проведена оценка моторики передней лапы крыс с учётом функциональной асимметрии полушарий головного мозга. Исследование эффекта аллогенного (ЭНТкр) и ксеногенного (НСКовч) препаратов НСК показало, что только имплантация ЭНТкр способствовала восстановлению моторики передней лапы. В образцах периинфарктной ткани мозга, выделенной в зонах имплантации ЭНТкр, отмечалось значительное повышение экспрессии мРНК ВБОТ.

Полученные в работе данные могут быть использованы при разработке механизмов биологического действия стволовых клеток, доклинической оценки клеточных препаратов и других новых средств лечения инсульта, а также в учебном процессе.

Выводы:

1. Имплантации Фкр - клеток без прогениторных свойств (клеточный контроль) крысам с распространенным корково-подкорковым и локальным корковым ишемическими инсультами не оказывали существенного влияния на функциональное состояние, размеры постинсультной атрофии мозга и биохимические показатели нейродегенеративных и нейрорепаративных процессов в ЦНС.

2. Имплантация в большую цистерну головного мозга крыс препарата алло-генных стволовых (прогениторных) клеток ЭНТкр после ОСМА приводит к достоверному снижению дефицита двигательных (неврологический статус, К-тест) и когнитивных (пассивное избегание) функций ЦНС (р<0,05, в сравнении с группами ОСМА и ОСМА+Фкр) и снижению концентраций ШЕ и вРАР в сыворотке крови и спинномозговой жидкости (р<0,05 в сравнении с группой ОСМА).

Самовосстановление нарушенных функций (вибрисс-тест, цилиндр-тест, плавание) происходит достоверно (р<0,05) лучше при моделировании инсульта в «доминантном» полушарии, чем в «субдоминантном» полушарии головного мозга.

4. Имплантация крысам препарата аллогенных стволовых (прогениторных) клеток (ЭНТкр) на границе участка деваскуляризации в сепсомоторной коре мозга приводит, по результатам 8-неделыюго мониторинга, к достоверному улучшению функциональных показателей контралатералыюй передней лапы в цилиндр-тесте и тесте плавания (р<0,05, в сравнении с группами «корковый инсульт» и «корковый инсульт+Фкр). При аналогичных условиях имплантации препарата ксеногенных стволовых (прогениторных) клеток - нейрогенных стволовых клеток из обонятельной выстилки человека (НСКовч) эффекта на функциональные показатели ЦНС не выявлено.

5. Имплантация крысам аллогенных стволовых (прогениторных) клеток (ЭНТкр) приводит к достоверному повышению экспрессии мРНК ЕШЫН в коре мозга в месте их введения (в 23 раза по сравнению с группой «корковый инсульт» и в 4 раза по сравнению с группой «корковый инсульт+Фкр», р<0.05). Экспрессия мРНК ЕШОТ в коре мозга после имплантации НСКовч по сравнению с имплантацией фибробластов крысы («клеточный контроль») достоверно не изменяется (Р>0,05).

Практические рекомендации

1. Для повышения достоверности результатов доклинических исследований эффективности препаратов стволовых (прогениторных) клеток и при изучении механизмов их нейротропного действия в план экспериментов целесообразно включать исследования с использованием препаратов клеток без стволовых (прогениторных) свойств (клеточный контроль) и определение функциональной асимметрии головного мозга экспериментальных животных до моделирования патологических процессов.

2. Определение НСБ в ликворе и крови можно использовать в качестве чувствительного метода прижизненной верификации эффектов клеточной терапии на

течение нейродегенеративного процесса.

3. Для определения уровней факторов роста в ликворе и крови у крыс с экспериментальным инсультом необходимо использовать тест-системы с порогом чувствительности менее 15,6 пг/мл или исследовать уровни экспрессии соответствующих мРНК методом ПЦР в реальном времени.

4. При получении образцов ликвора из большой цистерны мозга наркотизированных крыс предпочтительно использовать технику пункции с применением стереотаксического манипулятора, обеспечивающей минимальный риск травмирования ткани мозга экспериментальных животных.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Чехонин В.П., Лебедев С.В., Рябухин И.А., Петров С.В., Турина О.И., Дмитриева Т.Е., Волков А.И., Кашпаров И.А., Скоблов Ю.С.// Селективное накопление моноклональных антител к нейроспецифическойенолазе в ткани мозга крыс с окклюзией средней мозговой артерии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2004, N 10, стр.388-392

2. Chekhonin V.P., Lebedcv S.V., Blinov D.V., Savchenko E.A., Lasarenko I.P., Volkov A.I. Correction of motor disturbances in rats with perinatal hypoxic-ischemic affection of the CNS by transplantation of embryonic nervous cell preparation into the hyppocamp CA1 zone. // European Neuropsychopharmacology. Vol. 15. Sup. 2. April 2005, p. 249-250.

3. Чехонин В.П., Лебедев C.B., Турина О.И., Петров С.В., Давыдовская М.В., Волков А.И., Семенова А.В. Элиминация нейроспецифических белков из ЦНС (патогенетические и методические аспекты). Вестиик Российской академии медицинских наук, 2006. №6. стр. 3-12.

4. Лебедев С.В., Волков А.И., Петров С.В., Чехонин В.П.// Анализ экспериментального опыта клеточной терапии инсульта. Материалы IX Всероссийского съезда неврологов, Ярославль, 2006, с.563

5. Лебедев С.В., Волков А.И., Петров С.В., Бектимиров Р.Б.// Иммунный статус и трансплантационный иммунитет мозга. Материалы IX Всероссийского съезда неврологов, Ярославль, 2006, с. 582

6. Лебедев С.В., Петров С.В., Волков А.И., Чехонин В.П. // Транслокация макромолекул через гематоэнцефалический барьер. Вестник Российской академии медицинских наук, 2007. №6. стр. 37-49.

7. Lebedev S.V., Viktorov I.V., Volkov A.I., Karasev A.V., Volodin N.N., Chekhonin V.P. Changes in behavioral functions after progenitor cell transplantation therapy for hypoxic and ischemic brain injury in neonatal and adult rat. // International Journal of Psychophysiology 2008;69(3)p. 316. Abstracts of the 14th world congress of psychophysiology "The Olympics of the brain" 8-13 sept. 2008

8. Старых Е.П., Волков А.И., Карасёв A.B., Лебедев C.B., Чехонин В.П. Патогенетические предпосылки комбинированной терапии клеточными и медикаментозными препаратами гипоксических и ишемических повреждений ЦНС. Материалы всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» МГУ, 2008, стр.53

9. Волков А.И., Старых Е.П., Савченко Е.А., Ухова О.В., Лебедев C.B., Чехонин В.П. Эффективность нейрогенных стволовых клеток в восстановлении функций ЦНС при фокальном инсульте в моторной зоне коры мозга. Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения». МГУ, 2008, стр. 22.

Ю.Волков А.И., Петров C.B., Ухова О.В., Старых Е.П., Лебедев C.B., Чехонин В.П. Влияние трансфузии в большую цистерну мозга клеток эмбриональной нервной ткани и стромальных клеток жировой ткани на восстановление функций ЦНС у крыс с ишемическим инсультом. Материалы конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Санкт-Петербург, 2008, стр. 22.

11. Старых Е.П., Волков А.И., Карасёв A.B., Лебедев C.B., Чехонин В.П. Патогенетические предпосылки комбинированной терапии клеточными и медикаментозными препаратами гипоксических и ишемических повреждений ЦНС. Материалы конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Санкт-Петербург, 2008, стр. 134.

12. Лебедев C.B., Волков А.И., Карасёв A.B., Петров C.B., Чехонин В.П. Клеточная терапия нарушений функционирования ЦНС различного генеза. Аналитический обзор. Редакция ФГУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского» Минздравсоц-развития, Москва, 2009 г. 120 стр.

13.Волков А.И., Лебедев C.B., Старых Е.П., Волкова H.A., Чехонин В.П.// По-

стинсультные неврологические нарушения у крыс с функциональной асимметрией полушарий головного мозга. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. №9. стр. 57-62.

14. Чехонин В.П., Лебедев C.B., Волков А.И., Павлов К.А., Тер-Арутюнянц A.A., Волгина Н.Е., Савченко Е.А., Гриненко Н.Ф., Лазаренко И.П. Активация экспрессии нейротрофического фактора мозга в зоне имплантации аллогенных и кссногенных стволовых (прогепиторных) клеток нервной ткани у крыс с ише-мическим корковым инсультом. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. №4. стр. 195-198.

15. Волков А.И., Лебедев C.B., Павлов К.А., Тер-Арутюнянц A.A.,, Гриненко Н.Ф., Савченко Е.А., Чехонин В.П. // Экспрессия мРНК BDNF в параинфаркт-ной зоне после имплантации нейрогенпых стволовых клеток крысам с инсультом в сенсомоторной коре. Материалы всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». 25-28 октября 2010 г. стр. 19.

16. Волков А.И., Лебедев C.B. Турина О.И., Петров С.В Гриненко Н.Ф., Савченко Е.А., Чехонин В.П. // Элиминация нейроспецифических белков в ликвор и кровь после введения в большую цистерну мозга алогенных клеток эмбриональной нервной ткани крысам с ишемическим инсультом. Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». 25-28 октября 2010 г. стр. 17-18.

17. Лебедев C.B., Карасёв A.B. Волков А.И. // Является ли обязательным присутствие в паренхиме головного мозга терапевтических ИСК для проявления их нейротропного действия? Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». 25-28 октября 2010 г. стр. 45-46.

18. Волков А.И., Карасёв A.B., Лебедев C.B., Чехонин В.П. Проблемы применения стволовых клеток для лечения инсульта. Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» 6-10 апреля 2010 года. Санкт-Петербург.стр. 199.

19. Волков А.И., Лебедев C.B., Викторов И.В., Чехонин В.П., Старых Е.П., Савченко Е.А., Гриненко Н.Ф., Лазаренко И.П. // Влияние трансплантации ней-рогенных стволовых клеток на восстановление функций ЦНС у крыс с инсультом в коре мозга. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. №12. стр. 64-72.

Подписано в печать 26.02.2011 г. Печать лазерная цифровая Тираж 120 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Волков, Андрей Игоревич

ВВЕДЕНИЕ.

Цель работы.

Задачи:.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна.

Теоретическая значимость работы:.

Научно-практическое значение работы:.

Апробация работы.

Публикации.

Объем и структура диссертации.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Введение.

1.2. Стратегии клеточной терапии инсульта.

1.2.1. Заместительная (реконструктивная) стратегия.

1.2.2. Терапевтический ангиогенез.

1.2.3. Клеточная терапия как средство трофической поддержки мозга.

1.3. Вопросы тактики клеточной терапии (место, способ и время введения клеточных препаратов).

1.4. Проблемы безопасности.

1.5. Эффективность клеточной терапии ишемического инсульта в эксперименте.

1.5.1. Влияние клеточной терапии на объём ишемического повреждения мозга

1.5.2. Влияние клеточной терапии на восстановление функций ЦНС.

1.6. Клинический опыт клеточной терапии ишемического инсульта.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций ЦНС у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом"

Инсульт занимает первое место как причина инвалидизации и второе место в структуре общей смертности населения [Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, JI.B. Стаховская, 2007], что указывает на его высокую социально-медицинскую значимость. Подавляющее большинство клинических исследований нейропротективных средств не выявило ожидаемого терапевтического эффекта [Labiche LA et al, 2004]. На сегодняшний день лечение этого заболевания ограничивается своевременным введением тканевого активатора плазминогена, стабилизацией состояния пациента симптоматическими и патогенетическими средствами, ранней реабилитацией и профилактикой факторов риска [Guidelines, 2005]. Новые перспективы в разработке средств лечения инсульта открылись благодаря достижениям при изучении биологических свойств нейрогенных стволовых клеток (НСК) и их участия в репаративных процессах в мозге при инсульте [European Scientific Community, 2005]. В большинстве экспериментальных исследований на моделях ишемического инсульта продемонстрировано позитивное влияние имплантации нейрогенных стволовых., (прогениторных) клеток (далее СК) на функциональное состояние ЦНС при введении их парентерально [Shen С., 2010], в ликвор [Sun С, 2010] или прямо в область ишемии головного мозга [Modo M., 2002]. Среди гипотез, объясняющих этот феномен, наибольшее внимание уделяется рассмотрению роли ростовых факторов в качестве активаторов конститутивного нейрогенеза [Madhavan L, 2009; Stroemer Р, 2009], неоангиогенеза [Jiang Q, 2005] и нейропротекции [Harms КМ, 2010]. Продукция СК терапевтических количеств факторов роста продемонстрирована in vitro [García R et al., 2004; Harms KM, 2010]. Вместе с тем нет исчерпывающих доказательств, подтверждающих подобные свойства стволовых клеток in vivo. Не ясно, создаются ли терапевтические концентрации этих факторов при введении СК в ликвор или непосредственно в зону ишемии?

Чтобы получить ответ на этот вопрос необходимо сопоставить результаты измерений факторов роста со степенью повреждения нервной ткани при экспериментальном инсульте и влиянием имплантации СК на восстановление нарушенных функций ЦНС, т.е. с их терапевтической активностью. Такое направление исследований на сегодняшний день освещено лишь в единичных публикациях [Dah-Ching Ding, 2007; Wakabayashi, 2010 Dah-Ching Ding, 2007].

Современный методический аппарат позволяет успешно решать такие задачи. Одним из наиболее точных и чувствительных методов определения ростовых факторов является метод ПЦР в реальном времени, а для прижизненной биохимической верификации нейродегенеративного процесса - анализ уровней нейроспецифических белков (НСБ) - NSE и GFAP в ликворе и крови [Чехонин В.П. и соавт., 2000]. Важно, что уровни НСБ в ликворе и сыворотке крови прямо коррелируют с нарушениями функций ЦНС [Петров C.B., Лебедев C.B., Турина О.И., Чехонин В.П, 2005]

Существующие методические подходы к моделированию инсульта дают широкую возможность выбора животных моделей с функциональными нарушениями различной тяжести. В частности, модели одностороннего обширного корково-подкоркового инсульта у крыс вследствие окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) позволяют дать преимущественно интегральную оценку функционального состояния ЦНС, а модели локального повреждения мозга в строго определённой морфо-функциональной области - оценку парциальных функций ЦНС [Schallert Т., 2006; Kolb В, 2007].

Однако имеются ряд нерешённых методологических задач при проведении экспериментальной клеточной терапии ишемического инсульта. В частности, это отсутствие контроля специфичности действия СК в сравнении с эффектами непрогениторных клеток, вопросы учёта функциональной асимметрии головного мозга при одностороннем его повреждении, выбора сроков мониторинга с учётом самовосстановления функций после моделирования ишемического повреждения головного мозга. Не решена проблема выбора вида СК, адекватных клиническому 9 применению. В экспериментальных исследованиях чаще других использовали клетки эмбриональной нервной ткани крыс (ЭНТкр). Однако очевидно, что клиническое применение соответствующего аллогенного клеточного препарата (эмбриональных клеток человека) не имеет перспектив, прежде всего, с этической точки зрения. Альтернативой могут быть аутологичные нейрогенные клетки, выделяемые из обонятельной выстилки человека (НСКовч). Однако неизвестно, проявляют ли эти клетки такие же свойства, что и ЭНТ. В связи с этим, отдельная задача нашего исследования заключалась в проверке эффектов, выявленных при имплантации ЭНТкр, на клеточном препарате НСКовч.

Цель работы

Исследовать влияние имплантации нейрогенных стволовых (прогениторных) клеток на функциональное состояние ЦНС, биохимические показатели дегенеративных и репаративных процессов в ЦНС (нейроспецифические белки и факторы роста) после моделирования у крыс распространенного корково-подкоркового и локального коркового ишемических инсультов.

Задачи:

1. Осуществить иммуногистохимическую верификацию клеточных препаратов эмбриональной нервной ткани крысы (ЭНТкр), нейрогенных стволовых клеток из обонятельной выстилки человека (НСКовч) и фибробластов крысы (Фкр) и исследовать жизнеспособность имплантированных клеток.

2. Воспроизвести модель распространённого корово-подкоркового ишемического инсульта путём односторонней окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) у крыс и осуществить мониторинг состояния двигательных и когнитивных функций после трансфузии им клеток ЭНТкр и Фкр (клеточный контроль) в большую цистерну мозга.

3. Определить уровни экспрессии факторов роста (мРНК NGF, BDNF, NT-3) в клеточных препаратах (ЭНТкр, Фкр, НСКовч), использованных в работе для экспериментальной клеточной терапии ишемического инсульта.

4. Определить концентрации нейроспецифических белков (NSE, GFAP) и NGF в цереброспинальной жидкости и сыворотке крови у крыс с ОСМА после трансфузии им клеток ЭНТкр и Фкр (клеточный контроль) в большую цистерну мозга.

5. Воспроизвести у крыс односторонний локальный ишемический инсульт в сенсомоторной зоне коры головного мозга по методу [Kolb et al., 2007] в доминантном и не доминантном полушариях головного мозга (по показателю преимущественного использования лапы при захвате пищи) и осуществить в течение двух месяцев еженедельный мониторинг функций контралатеральной передней лапы.

6. У крыс с ишемическим инсультом в сенсомоторной зоне коры мозга исследовать влияние имплантации НСК (ЭНТкр и НСКовч) и Фкр (клеточный контроль) в периинфарктную корковую зону на восстановление функций ЦНС и экспрессию BDNF в зонах имплантации клеточных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В механизмах нейрорепаративного действия СК у крыс с ишемическим инсультом присутствуют системные и паракринные эффекты, поскольку:

- трансфузия в большую цистерну головного мозга клеток ЭНТкр в острой стадии ишемическом инсульта после ОСМА у крыс приводит к существенному восстановлению нарушенных двигательных и когнитивных функций ЦНС, а также снижению концентраций в ликворе и сыворотке крови маркёров нейродегенеративного процесса - NSE и GFAP.

- имплантация ЭНТкр в периинфарктную зону крысам с экспериментальным ишемическим фокальным инсультом в сенсомоторной коре мозга оказывает

11 стойкий положительный эффект на восстановление нарушенных функций контралатеральной передней лапы, что сочетается с 4-х кратном повышением экспрессии мРНК ЬШТЧБ в местах имплантации клеток ЭНТкр в сравнении с местами имплантации фибробластов (клеточный контроль) и более чем 20-кратным повышением - по сравнению с периинфарктной областью без имплантации клеток.

2. Имеются существенные различия по влиянию имплантации аллогенных (ЭНТкр) и ксеногенных (НСКовч) на восстановление функций ЦНС после ишемического повреждения мозга и активацию экспрессии ЬЮМ7 в местах их имплантации в мозг.

3. При доклинических исследованиях клеточных препаратов (новых средств лечения) с использованием моделей одностороннего инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга у крыс, объективные данные об эффективности испытуемых средств могут быть получены только при условии учёта доминантности полушария головного мозга, определяемой, в частности, с помощью теста захвата пищи передней лапой.

Научная новизна

Впервые показано, что имплантации крысам в большую цистерну головного мозга или в периинфарктную область препаратов клеток без стволовых (прогениторных) свойств в качестве клеточного контроля (Фкр) в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов не оказывает положительного терапевтического эффекта по показателям состояния интегральных функций ЦНС и экспрессии ВВ№\

Впервые установлен терапевтический эффект имплантации клеточного препарата ЭНТкр в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов. Показана специфичность действия клеток ЭНТкр в сравнении с «клеточным контролем» (Фкр).

Впервые применен метод анализа уровней нейроспецифических белков (НСБ) в ликворе и крови для прижизненной верификации нейропротективного эффекта клеточной терапии ишемического инсульта у крыс.

Впервые установлено, что восстановление функций контралатеральной передней лапы крыс после моделирования одностороннего инсульта в зоне её представительства в коре головного мозга крыс по методу Колб и соавт. [Ко1Ь е1 а1., 2007] происходит существенно лучше при моделировании упомянутого инсульта в «доминантном» (тест захвата пищи) полушарии головного мозга, чем при операциях на «субдоминантном» полушарии.

Теоретическая значимость работы:

Научно-практическое значение работы:

Апробация работы

Апробация работы проведена на совместном заседании Проблемного учёного совета по Фундаментальной и прикладной нейробиологии, сотрудников отдела Фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП» Минздравсоцразвития, кафедры Неврологии и нейрохирургии с курсом ФУВ, кафедры Нано- и биомедицинских технологий и кафедры Патологической физиологии РГМУ. Основные положения работы представлены в периодической научной печати и докладах на научных конференциях: Всероссийские научные школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2009, 2010); 14 Международный конгресс по психофизиологии "The Olympics of the brain" (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийская школа-конференция «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); 8 Международный конгресс Европейской Коллегии по нейропсихофармакологии - 8th ECNP Regional Meeting (Москва, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 6 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на русском языке, изложена на 138 страницах и состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения) выводов, практических рекомендаций и списка публикаций по теме диссертации .

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Волков, Андрей Игоревич

ВЫВОДЫ:

2. Имплантация в большую цистерну головного мозга крыс препарата аллогенных стволовых (прогениторных) клеток ЭНТкр после ОСМА приводит к достоверному снижению дефицита двигательных (неврологический статус, К-тест) и когнитивных (пассивное избегание) функций ЦНС (р<0,05, в сравнении с группами ОСМА и ОСМА+Фкр) и снижению концентраций №Е и вРАР в сыворотке крови и спинномозговой жидкости (р<0,05 в сравнении с группой ОСМА).

3. Уровни повреждения и восстановления моторики передней лапы крыс после моделирования одностороннего локального коркового инсульта в зоне представительства передней лапы зависят от функциональной асимметрии («доминантности» того или иного полушария) головного мозга животных, выявляемой в тесте преимущественного захвата пищи правой или левой передней лапой. Самовосстановление нарушенных функций (вибрисс-тест, цилиндр-тест, плавание) происходит достоверно (р<0,05) лучше при моделировании инсульта в «доминантном» полушарии, чем в «субдоминантном» полушарии головного мозга.

Имплантация крысам препарата аллогенных стволовых (прогениторных) клеток (ЭНТкр) на границе участка деваскуляризации в сенсомоторной коре мозга приводит, по результатам- 8-недельного мониторинга, к достоверному улучшению функциональных показателей контралатеральной передней лапы в цилиндр-тесте и тесте плавания (р<0,05, в сравнении с группами «корковый инсульт» и «корковый инсульт+Фкр): При аналогичных условиях имплантации препарата ксеногенных стволовых (прогениторных) клеток -нейрогенных стволовых клеток из обонятельной выстилки человека (НСКовч) эффекта на функциональные показатели ЦНС не выявлено. Имплантация крысам аллогенных стволовых (прогениторных) клеток (ЭНТкр) приводит к достоверному повышению экспрессии мРНК ВБ№" в коре мозга в месте их введения (в 23 раза по сравнению с группой «корковый инсульт» и в 4 раза по сравнению с группой «корковый инсульт+Фкр», р<0.05). Экспрессия мРНК ВБ№ в коре мозга после имплантации НСКовч по сравнению с имплантацией фибробластов крысы («клеточный контроль») достоверно не изменяется (Р>0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для повышения достоверности результатов доклинических исследований эффективности препаратов стволовых (прогениторных) клеток и при изучении механизмов их нейротропного действия в- план экспериментов целесообразно включать исследования с использованием препаратовг клеток без стволовых (прогениторных) свойств (клеточный контроль) и определение функциональной асимметрии головного мозга экспериментальных животных до моделирования патологических процессов.

Определение НСБ в ликворе и крови можно использовать в качестве чувствительного метода прижизненной верификации эффектов клеточной' терапии на течение нейродегенеративного процесса.

4. При получении образцов ликвора из большой^ ' цистерны мозга наркотизированных крыс предпочтительно использовать технику пункции с применением стереотаксического манипулятора, обеспечивающей минимальный риск травмирования ткани мозга экспериментальных животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чехонин В.П., Лебедев С.В., Рябухин И.А., Петров С.В., Турина О.И., Дмитриева Т.Б., Волков А.И., Кашпаров И.А., Скоблов Ю.С.// Селективное накопление моноклональных антител к нейроспецифическойенолазе в ткани мозга крыс с окклюзией средней мозговой артерии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2004, N 10, стр.388-392

2. Chekhonin V.P., Lebedev S.V., Blinov D.V., Savchenko E.A., Lasarenko I.P., Volkov A.I. Correction of motor disturbances in rats with perinatal hypoxic-ischemic affection of the CNS by transplantation of embryonic nervous cell preparation into the hyppocamp CA1 zone. // European Neuropsychopharmacology. Vol. 15. Sup. 2. April 2005, p. 249-250.

3. Чехонин В.П., Лебедев C.B., Турина О.И., Петров С.В., Давыдовская М.В., Волков А.И., Семенова А.В. Элиминация нейроспецифических белков из ЦНС (патогенетические и методические аспекты). Вестник Российской академии медицинских наук, 2006. №6. стр. 3-12.

Лебедев С.В., Волков А.И., Петров С.В., Чехонин В.П.// Анализ экспериментального опыта клеточной терапии инсульта. Материалы IX Всероссийского съезда неврологов, Ярославль, 2006, с.563 Лебедев С.В., Волков А.И., Петров С.В., Бектимиров Р.Б.// Иммунный.статус и трансплантационный иммунитет мозга. Материалы IX Всероссийского съезда неврологов, Ярославль, 2006, с. 582

Лебедев С.В., Петров С.В., Волков А.И., Чехонин В.П. // Транслокация макромолекул через гематоэнцефалический барьер. Вестник Российской академии медицинских наук, 2007. №6. стр. 37-49.

Lebedev S.V., Viktorov I.V., Volkov A.I., Karasev A.V., Volodin N.N., Chekhonin V.P. Changes in behavioral functíons after progenitor cell transplantation therapy for hypoxic and ischemic brain injury in neonatal and adult rat. // International Journal of Psychophysiology 2008;69(3)p. 316. Abstracts of the 14th world congress of psychophysiology "The Olympics of the brain" 8-13 sept. 2008

Старых Е.П., Волков А.И., Карасёв A.B., Лебедев С.В., Чехонин В.П. Патогенетические предпосылки комбинированной терапии клеточными и медикаментозными препаратами гипоксических и ишемических повреждений ЦНС. Материалы всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» МГУ, 2008, стр.53

Волков А.И., Старых Е.П., Савченко Е.А., Ухова О.В., Лебедев С.В., Чехонин В.П. Эффективность нейрогенных стволовых клеток в восстановлении функций ЦНС при фокальном инсульте в моторной зоне коры мозга. Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения». МГУ, 2008, стр. 22.

Волков А.И., Петров С.В., Ухова О.В., Старых Е.П., Лебедев С.В., Чехонин В.П. Влияние трансфузии в большую цистерну мозга клеток эмбриональной

109 нервной ткани и стромальных клеток жировой ткани на восстановление функций ЦНС у крыс с ишемическим инсультом. Материалы конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Санкт-Петербург, 2008, стр. 22.

12. Лебедев C.B., Волков А.И., Карасев A.B., Петров C.B., Чехонин В.П. Клеточная терапия нарушений функционирования ЦНС различного генеза. Аналитический обзор. Редакция ФГУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского» Минздравсоцразвития, Москва, 2009 г. 120 стр.

13. Волков А.И., Лебедев C.B., Старых Е.П.4, Волкова H.A., Чехонин В.П.// Постинсультные неврологические нарушения у крыс с функциональной асимметрией полушарий головного мозга. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. №9. стр. 57-62.

14. Чехонин В.П., Лебедев C.B., Волков А.И., Павлов К.А., Тер-Арутюнянц A.A., Волгина Н.Е., Савченко Е.А., Гриненко Н.Ф., Лазаренко И.П. Активация экспрессии нейротрофического фактора мозга в зоне имплантации аллогенных и ксеногенных стволовых (прогениторных) клеток нервной ткани у крыс с ишемическим корковым инсультом. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. №4. стр. 195-198.

15. Волков А.И., Лебедев C.B., Павлов К.А., Тер-Арутюнянц A.A.,, Гриненко Н.Ф., Савченко Е.А., Чехонин В.П. // Экспрессия мРНК BDNF в параинфарктной зоне после имплантации нейрогенных стволовых клеток

110 крысам с инсультом в сенсомоторной коре. Материалы всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». 25-28 октября 2010 г. стр. 19.

16. Волков А.И., Лебедев C.B. Турина О.И., Петров С.В Гриненко Н.Ф., Савченко Е.А., Чехонин В.П. // Элиминация нейроспецифических белков в ликвор и кровь после введения в большую цистерну мозга алогенных клеток эмбриональной' нервной ткани крысам с ишемическим инсультом. Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». 25-28 октября 2010 г. стр. 17-18.

17. Лебедев C.B., Карасёв A.B. Волков А.И. // Является ли обязательным присутствие в паренхиме головного мозга терапевтических НСК для проявления их нейротропного действия? Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». 25-28 октября 2010 г. стр. 45-46.

18. Волков А.И., Карасёв A.B., Лебедев C.B., Чехонин В.П. Проблемы применения стволовых клеток для лечения инсульта. Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» 610 апреля 2010 года. Санкт-Петербург.стр. 199.

19. Волков А.И., Лебедев C.B., Викторов И.В., Чехонин В.П., Старых Е.П., Савченко Е.А., Гриненко Н.Ф., Лазаренко И.П. // Влияние трансплантации нейрогенных стволовых клеток на восстановление функций ЦНС у крыс с инсультом в коре мозга. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. №12. стр. 64-72.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Волков, Андрей Игоревич, Москва

1. Антонова О.М. Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмах антительной агрессии в мозг. Дисс. к.м.н., 1997; 121с.

2. Ашмарин.И.П., Стукалов П.В. Нейрохимия. 1996. М. Изд-во РАМН.

3. Белопасов В.В., Хрусталева H.A., Гроппа С. А. Иммунохимические показатели структурного повреждения мозговой ткани в различные периоды травматической болезни головного мозга. Вопр. нейрохир. 1994; №2: с. 7477.

4. Беляева H.A. Нейроспецифические белки в крови и ликворе при клещевой нейроинфекции (клинико-диагностические и прогностические аспекты). Дисс. к.м.н., 1995; 177 с.

5. Бережной Г.А., Лисяный H.H., Белик Я.В. Содержание • некоторых нейроспецифических белков в крови больных с черепно-мозговой травмой. Нейрохимия. 1991; № 10(1-2): с. 76-80.

6. Березин В.А. Специфические белки нервной ткани в норме и при патологии. Дисс. д.м.н., 1985; 164 с.

7. Березин В.А., Шевченко Г.М., Бунятин Г.Г. Специфические белки промежуточных филаментов в нормальной нервной ткани и в опухолях головного мозга. Нейрохимия. 1987; №6: с. 77-81.

8. Биктимиров Р.Г. Роль комплексного иммуноферментного определения нейроспецифических белков в диагностике опухолей головного мозга. Автореф. дисс. к.м.н., 1993; 133 с.

9. Блинов Д.В. Иммуноферментный анализ нерйоспецифических антигенов в оценке проницаемости ГЭБ при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС. Дисс. К.м.н., 2004. 150с

10. Верещагин Н.В., Моргунов В.А., Гулевская Т.С. Патология сосудов головного мозга при атеросклерозе и артериальной гипертонии. М. Медицина, 1997

11. Викторов И.В., Савченко Е.А., Чехонин В.П. Спонтанная нейральная дифференциация стволовых клеток в культуре обонятельного эпителия человека. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007 №4, стр. 183 -188

12. Турина О.И. Клинико-иммунохимическая оценка нарушений функций гематоэнцефалического барьера у новорожденных детей с перинатальными поражениями ЦНС. Дисс. к.м.н.,1996; 142 с.

13. Турина О.И. Моноклональные антитела к нейроспецифическим антигенам. Дисс. Д.м.н., 2005, 300с.

14. Турина О.И., Рябухин И.А., Анин А.Н. Исследование проницаемости ГЭБ у , новорожденных крысят в условиях индуцированных гипертермическихсудорог. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 1997; т. 123, №2: с. 146-149.

15. Гусев Е.И., Скворцова Е.А. Ишемия головного мозга. Медицина, 2001.

16. Доброхотова Т.А., Брагина H.H., Карменян К.К. Главы 2,3 в книге Доброхотова Т.А. Нейропсихиатрия. М. Бином, 2006 г. 26-82.

17. Лебедев C.B., Блинов Д.В., Петров C.B. Пространственные параметры Большой цистерны мозга у крыс и новая техника её пункции с помощью стереотаксического манипулятора. Бюллетень экспериментальной- биологии и медицины. 2004, Том 137, №6, С. 717-720.f

18. Петров C.B., Лебедев C.B., Турина О.И., Чехонин В.П. // Иммунохимическая верификация хронизации нейродегенеративного процесса у крыс после окклюзии средней мозговой артерии. Нейрохимия. 2005. №2. С. 133-137.

19. Семенова A.B. Основной белок миелина (получение моноклональных антител, разработка иммуноферментного анализа и клинико-лабораторное применение): Дис. . канд. мед.наук. — М., 2002.

20. Семченко В.В., Еремиев С.И., Степанов С.С., Сергеенко Г.Г. Трансплантация незрелой нервной ткани в экспериментальной и клинической неврологии. Омск, 2000.

21. Сташкевич И.С. Формирование и организация моторного предпочтения у крыс. В книге: Фокин В.Ф., Боголепова И.Н., Гутник Б., Кобрин В.И., Шульговский В.В. Руководство по функциональной межполушарной асимметрии. М.: Научный мир, 2009. - 124-145.

22. Фокин В.Ф., Боголепова И.Н., Гутник Б., Кобрин В.И., Шульговский В.В. Руководство по функциональной межполушарной асимметрии. — М.: Научный мир, 2009

23. Чехонин В.П. Специфические белки нервной ткани человека и животных (идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и клинико-лабора-торные исследования). Дисс. д.м.н., 1989; 379 с.

24. Чехонин В.П., Турина О.И., Семенова A.B. и др. Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний. // Вопросы медицинской химии — 2000 Т. 46 - № 6 - с. 549563.

25. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. Медицина, 2000.

26. Чехонин В.П., Лебедев.С.В., Петров-С.В., etal. // Моделирование фокальной ишемии головного мозга. Вестник РАМН. 2004. №3. Стр. 1-56.

27. Чехонин В.П., Лебедев С.В., Петров С.В., etal. // Мониторинг неврологического дефицита и нарушений- высшей нервной деятельности у крыс с фокальной-ишемией'головного мозга. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Том 135. № 6. С. 629-633.

28. Чехонин В.П., Лиджиева Р.Ц., Коротеева Е.А. Иммунохимическое изучение механизмов аутоиммунной агрессии антител к нейроспецифическим белкам у крыс с экспериментальным прорывом ГЭБ. Нейрохимия. 1989; 9(2): 241246.

29. Чехонин В.П., Морозов Г.В., Морковкин В.М. Иммуноферментативная детекция специфических антигенов мозга как критерий проницаемости гематоэнцефалического барьера крыс при острой ишемии головного мозга. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1988; 4: 581-583.

30. Adams HP et al. Guidelines, for the early management of adults with ischemic stroke/ Circulation. 2007 May 22;115(20):e478-534. Erratum in: Circulation. 2007 Oct 30;116(18):e515.

31. Aggestam F, Cahusac PM. Behavioural lateralization of tactile performance in the rat. Physiol Behav. 2007 Jun 8;91(2-3):335-339.

32. Aihara N, Mizukawa K, Koide K, Mabe H, Nishino H. Striatal grafts in infarct striatopallidum increase GABA release, reorganize GABAA receptor and improve water-maze learning in the rat. Brain Res Bull. 1994;33(5):483-8.

33. Alonso J, Castellano MA, Rodriguez M. Behavioral lateralization in rats: prenatal stress effects on sex differences. Brain Res. 1991 Jan 18;539(l):45-50.

34. Andrews EM, Tsai SY, Johnson SC, Farrer JR, Wagner JP, Kopen GC, Kartje GL. Human adult bone marrow-derived somatic cell therapy results in functional recovery and axonal plasticity following stroke in the rat. Exp Neurol. 2008 Jun;211(2):588-92.

35. Arien-Zakay H, Lecht S, Bercu MM, Tabakman R, Kohen R, Galski H, Nagler A, Lazarovici P. Neuroprotection by cord blood neural progenitors involves antioxidants, neurotrophic and angiogenic factors. Exp Neurol. 2009 Mar;216(l):83-94. Epub 2008 Nov 25.

36. Arvidsson A., Collin T., Kirik D., Kokaia Z., and Lindvall O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med. 2002; 8: 963-970.

37. Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol. 2005 Jun;57(6):874-82.

38. Bani-Yaghoub M, Tremblay RG, Ajji A, Nzau M, Gangaraju S, Chitty D, Zurakowski B, Sikorska M. Neuroregenerative strategies in the brain: emerging significance of bone morphogenetic protein 7 (BMP7). Biochem Cell Biol. 2008 Oct;86(5):361-9. Review.

39. Barker RA, Widner H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRx. 2004 Oct;l(4):472-81. Review.

40. Bederson J.B, Pitts L.H., Tsuji M., et al. // Stroke. 1986. - Vol. 17. - P.472-476.

41. Beites C.L., Kawauchi S., Crocker C.E., Calof A.L. Identification and molecular regulation of neural stem cells in the olfactory epithelium. Exp. Cell Res. 2005,-Vol.19.- P. 3309-3316

42. Belcheva I, Tashev R, Belcheva S Hippocampal asymmetry in serotonergic modulation of learning and memory in rats. Laterality. 2007 Nov; 12(6):475-486.

43. Betaneur C, Neveu PJ, Le Moal M: Strain and sex differences in the degree of pawipreference in mice. Behav Brain Res 1991, 45:97-101.

44. Betaneur C, Neveu PJ, Le Moal'M: Strain and sex differences in the degree of paw preference in mice. Behav Brain Res 1991, 45:97-101.

45. Bliss T, Guzman R, Daadi M, Steinberg GK. Cell transplantation* therapy for stroke. Stroke. 2007 Feb;38(2 Suppl):817-26. Review.

46. Borlongan CV, Evans A, Yu G, Hess DC. Limitations of intravenous human bone marrow CD133 cell grafts in stroke rats. Brain Res. 2005;1048:116 -122.

47. Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke.Stroke. 2004 0ct;35(10):2385~9.

48. Borlongan CV, Skinner SJ, Geaney M, Vasconcellos AV, Elliott RB, Emerich DF. Intracerebral transplantation of porcine choroid plexus provides structural and functional neuroprotection in a rodent model of stroke. Stroke. 2004 Sep;35(9):2206-10.

49. Buhnemann C, Scholz A, Bernreuther C, Malik CY, Braun H, Schachner M, Reymann KG, Dihne M. Neuronal differentiation of transplanted embryonic stem cell-derived precursors in stroke lesions of adult rats. Brain. 2006 Dec;129(Pt 12):3238-48.

50. Buga AM, Dunoiu C, Bal§eanu A, Popa-Wagner A. Cellular and molecular mechanisms underlying neurorehabilitation after stroke in aged subjects. Rom J Morphol Embryol. 2008;49(3):279-302. Review.

51. Caplan AI. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J Pathol. 2009 Jan;217(2):318-24. Review.

52. Carlen M, Cassidy RM, Brismar H, Smith GA, Enquist LW, Frisen J. Functional integration of adult-born neurons. Curr Biol. 2002 Apr 2;12(7):606-8.

53. Carmeliet P, Storkebaum E. Vascular and neuronal effects of VEGF in the nervous system: implications for neurological;disorders. Semin Cell Dev Biol 2002; 13:39-53.

54. Carmichael ST. Cellular and molecular mechanisms of neural repair after stroke: Making waves. Ann Neurol 2006;59:735-742.

55. Castellano, M.A., Diaz-Palarea, M.D., Barroso, J. and Rodriguez, M., Behavioral lateralization in rats and dopaminergic system: individual and population laterality, Behav. Neurosci., 103 (1989) 46-53.

56. Chen J, Chopp M. Neurorestorative treatment of stroke: cell and pharmacological approaches. NeuroRx. 2006 Oct;3(4):466-73. Review.

57. Chen J, Li Y, Katakowski M, Chen X, Wang L, Lu D, et al: Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat. JNeurosci Res 73:778-786, 2003

58. Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats.Stroke. 2001 Apr;32(4): 1005-11.

59. Chen J, Li Y, Zhang R, Katakowski<M, Gautam SC, Xu Y, Lu M, Zhang Z, Chopp M. Combination therapy of stroke in rats with a nitric oxide donor and human bone marrow stromal cells enhances angiogenesis and neurogenesis. Brain Res. 2004 .

60. Chen-J, Sanberg P.R., Li Y., Wang L., Lu M., Willing A.E., Sanchez-Ramos J., Chopp' M. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke. 2001 Nov;32(l l):2682-8.

61. Chen J, Sanberg PR, Li Y, Wang L, Lu M, Willing AE, et al: Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 32:2682-2688, 2001

62. Chen J, Zhang ZG, Li Y, Wang L, Xu YX, Gautam SC, Lu M, Zhu Z, Chopp M. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ Res. 2003 Apr 4;92(6):692-9.

63. Chen X, Li Y, Wang L, et al. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology 2002;22:275-279.

64. Chiang YH, Lin SZ, Borlongan CV, Hoffer BJ, Morales M, Wang Y. Transplantation of fetal kidney tissue reduces cerebral infarction induced by middle cerebral artery ligation. J Cereb Blood Flow Metab. 1999; 19: 1329-1335.

65. Christie MA, Dalrymple-Alford JC. Behavioural consequences of frontal cortex grafts and enriched environments after sensorimotor cortex lesions. J Neurol Transplant Plast. 1995;5:199-210.

66. Christie MA, Dalrymple-Alford JC. Behavioural consequences of frontal cortex grafts and enriched environments after sensorimotor cortex lesions. J Neurol Transplant Plast. 1995;5:199-210.

67. Corballis MC. The evolution and genetics of cerebral asymmetry. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci. 2009 Apr 12;364(1519):867-879.

68. Daadi MM, Davis AS, Arac A, Li Z, Maag AL, Bhatnagar R, Jiang K, Sun G, Wu JC, Steinberg GK. Human neural stem cell grafts modify microglial response and enhance axonal sprouting in neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Stroke. 2010 Mar;41(3):516-23.

69. Dancause N, Barbay S, Frost SB, Plautz EJ, Chen D, Zoubina EV, Stowe AM, Nudo RJ. Extensive cortical rewiring after brain injury. J Neurosci. 2005 Nov 2;25(44): 10167-79.

70. Dobkin BH. Behavioral, temporal, and spatial targets for cellular transplants as adjuncts to rehabilitation for stroke. Stroke. 2007 Feb;38(2 Suppl):832-9. Review.

71. Dunn-Meynell AA, Levin BE. Lateralized effect of unilateral somatosensory cortex contusion on behavior and cortical reorganization. Brain Res. 1995 Mar 27;675(l-2): 143-156.

72. Ekdahl CT, Claasen JH, Bonde S, Kokaia Z, Lindvall O. Inflammation is detrimental for neurogenesis in adult brain. Proc Natl Acad Sci USA 2003. 100:13632-13637,

73. Elalmis DD, Ozgiinen KT, Binokay S, Tan M, Ozgunen T, Tan U. Differential contributions of right and left brains to paw skill in right- and left-pawed female rats. Int J Neurosci. 2003 Aug; 113(8): 1023-1042.

74. Englund U, Bjorklund A, Wictorin K, Lindvall O, Kokaia M. Grafted neural stem cells develop into functional pyramidal neurons and integrate into host cortical circuitry. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99: 17089-17094.

75. Erdo F, Trapp T, Buhrle C, Fleischmann B, Hossmann KA. Embryonic stem cell therapy in experimental stroke: host-dependent malignant transformation Orv Hetil. 2004 Jun 20; 145(25): 1307-13.

76. Fan Y, Yang GY. Therapeutic angiogenesis for brain ischemia: a brief review. J Neuroimmune Pharmacol. 2007 Sep;2(3):284-9. Epub 2007 May 1.

77. Gao H, Zhang M. Asymmetry in the brain influenced the neurological deficits and infarction volume following the middle cerebral artery occlusion in rats. Behav Brain Funct. 2008 Dec 22;4:57.

78. Glick SD, Ross DA. Right-sided population bias and lateralization of activity in normal rats. Brain Res. 1981 Jan 26;205(l):222-225.

79. Gonzalez CL, Kolb B. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur J Neurosci 2003; 18:1950-1962

80. Graber JJ, Dhib-Jalbut S. Protective autoimmunity in the nervous system. Pharmacol Ther. 2009 Feb;121(2): 147-59. Epub 2008 Nov 1.

81. Grabowski M, Brundin P, Johansson BB. Fetal neocortical grafts implanted in hypertensive rats with cortical infarcts following a middle cerebral artery121occlusion: ingrowth of afferent fibers from the host brain. Exp Neurol. 1992;116:105-121.

82. Grabowski M, Brundin P, Johansson BB. Functional integration of cortical grafts placed in brain infarcts of rats. Ann Neurol. 1993;34:362-368.

83. Grabowski >M, Johansson BB, Brundin P. Neocortical grafts placed in the infarcted brain of adult rats: few or no.efferent fibers grow from transplant to host. Exp Neurol. 1995;134:273-276.

84. Guerra-Crespo M, Gleason D, Sistos A, Toosky T, Solaroglu I, Zhang JH, Bryant PJ, Fallon JH. Transforming growth factor-alpha induces neurogenesis and behavioral improvement in a chronic stroke model. Neuroscience. 2009 May 5;160(2):470-83.

85. Giiven M, Elalmi§ DD, Binokay S, Tan U. Population-level right-paw preference in rats assessed by a new computerized food-reaching test. Int J Neurosci. 2003 Dec;113(12):1675-1689.

86. Gunsilius E, Duba HC, Petzer AL, Kahler CM, Gastl GA. Contribution of endothelial cells of hematopoietic origin to blood vessel formation. Circ Res. 2001 Jan 19;88(1):E1.

87. Guzman R, Choi R, Gera A, De Los Angeles A, Andres RH, Steinberg GK.Intravascular cell replacement therapy for stroke. Neurosurg Focus. 2008;24(3-4):E15. Review.

88. Haas, S., Weidner, N., Winkler, J., 2005. Adult stem cell therapy in stroke. Curr. Opin. Neurol. 18, 59-64.

89. Habisch HJ, Fiedler J, Ludolph AC, Storch A, Brenner RE. Altered migration and adhesion potential of pro-neurally converted human bone marrow stromal cells. Cytotherapy. 2008;10(8):824-33.

90. Hanabusa K, Nagaya N, Iwase T, Itoh T, Murakami S, Shimizu Y, Taki W, Miyatake K, Kangawa K. Adrenomedullin enhances therapeutic potency of mesenchymal stem cells after experimental stroke in rats.Stroke. 2005 Apr;36(4):853-8.

91. Hardy SA, Maltman DJ; Przyborski SA Mesenchymal stem cells as mediators of neural differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. 2008 Jan;3(l):43-52. Review.

92. Harms KM, Li L, Cunningham LA. Murine neural stem/progenitor cells protect neurons against ischemia by HIF-1 alpha-regulated VEGF signaling. PLoS One. 2010 Mar 22;5(3):e9767.

93. Hess DC, Hill WD, Martin-Studdard A, Carothers J, Brailer J, Carroll J Blood into brain after stroke. Trends Mol Med. 2002 Sep;8(9):452-3.

94. Hess DC, Hill WD, Martin-Studdard A, Carroll J, Brailer J, Carothers J. Bone marrow as a source of endothelial cells and NeuN-expressing cells After stroke. Stroke. 2002'May;33(5): 1362-8.

95. Hicks AU, MacLellan CL, Chernenko GA, Corbett D. Long-term assessment of enriched housing and subventricular zone derived cell transplantation after focal ischemia in rats. Brain Res. 2008 Sep 22; 1231:103-12.

96. Honmou O, Harada K, Nakamura K, Houkin K, Hamada H, Kocsis JD. Neuroprotection by P1GF gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischaemia.Brain. Oct;129(Pt 10):2734-45.

97. Hou SW, Wang YQ, Xu M, Shen DH, Wang JJ, Huang F, Yu Z, Sun FY. Functional integration of newly generated neurons into striatum after cerebral ischemia in the adult rat brain. Stroke. 2008 Oct;39(10):2837-44.

98. Ivanova M, Ternianov A, Belcheva S, Tashev R, Negrev N, Belcheva I. Hippocampal asymmetry in exploratory behavior to vasoactive intestinal polypeptide. Peptides. 2008 Jun;29(6):940-947.

99. Jessberger S, Kempermann G. Adult-born hippocampal neurons mature into activity-dependent responsiveness. Eur J Neurosci. 2003 Nov;18(10):2707-12.

100. Jiang S, Walker L, Afentoulis M, Anderson DA, Jauron-Mills L, Corless CL, Fleming WH. Transplanted human bone marrow contributes to vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:16891-16896.

101. Jiang W, Gu W, Brannstrom T, Rosqvist R, Wester P. Cortical neurogenesis in adult rats after transient middle cerebral artery occlusion. Stroke. 2001 May;32(5): 1201-7.

102. Jin K, Greenberg DA. Tales of transdifferentiation. Exp Neurol. 2003 Oct;183(2):255-7. No abstract available.

103. Jin K, Sun Y, Xie L, Peel A, Mao XO, Batteur S, Greenberg DA. Directed migration of neuronal precursors into the ischemic cerebral cortex and striatum. Mol Cell Neurosci. 2003 Sep;24(l): 171-89.

104. Jin K, Xie L, Childs J, Sun Y, Mao XO, Logvinova A, Greenberg DA. Cerebral neurogenesis is induced by intranasal administration of growth factors. Ann Neurol. 2003 Mar;53(3):405-9.

105. Johnston RE, Dillon-Carter O, Freed WJ, Borlongan CV. Trophic factor secreting kidney cell lines: in vitro characterization and functional effects following transplantation in ischemic rats. Brain Res. 2001;900:268-276.

106. Kang SK, Lee DH, Bae YC, Kim HK, Baik SY, Jung JS. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol. 2003 Oct;183(2):355-66.

107. Kauppinen TM, Suh SW, Berman AE, Hamby AM, Swanson RA. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase suppresses inflammation and promotes recovery after ischemic injury. J Cereb Blood Flow Metab. 2009 Apr;29(4):820-9.

108. Kitagawa K Therapeutic application of cell transplantation and increased neurogenesis in cerebral infarction Rinsho Shinkeigaku, November 1, 2004; 44(11): 756-9.

109. Kolb B, Cote S, Ribeiro-da-Silva A, Cuello AC. Nerve growth factor treatment prevents dendritic atrophy and promotes recovery of function after cortical injury. Neuroscience 1997; 76:1139-1151

110. Kolb B, Morshead C, Gonzalez C, Kim M, Gregg C, Shingo T, Weiss S. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 2007 May;27(5):983-97.

111. Kondziolka D, Wechsler L, Tyler-Kabara E, Achim C. The role of cell therapy for stroke. Neurosurg Focus. 2002 Nov 15;13(5):el. Review.

112. Kondziolka D., Wechsler L., Goldstein S., et al. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. Neurology. 2000; 55: 565-569

113. Kurozumi K, Nakamura K, Tamiya T, et al. Mesenchymal stem cells that produce neurotrophic factors reduce ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model. Mol Ther 2005; 11:96-104.

114. Kutlu N, Vatansever HS, Bayazit TO, Ekerbicer N, Tan U. Blood brain barrier in right- and left-pawed' female rats assessed by a new staining method. Int J Neurosci. 2002 Sep; 112(9): 1037-1046.

115. Lai B., Mao X.O., Xie L., Jin K., Greenberg D.A. Electrophysiological neurodifferentiation of subventricular zone-derived precursor cells following stroke. Neurosci. Lett. 2008 ;19;442(3):305-8.

116. Lee HJ, Kim KS, Park IH, Kim SU. Human neural stem cells over-expressing VEGF provide neuroprotection, angiogenesis and functional recovery in mouse stroke model. PLoS ONE. 2007 Jan 17;2:el56.

117. Leker RR, Soldner F, Velasco I, Gavin DK, Androutsellis-Theotokis A, McKay RD. Long-lasting regeneration after ischemia in the cerebral cortex. Stroke. 2007 Jan;38(l):153-61. Epub 2006 Nov 22.

118. Li WY, Choi YJ, Lee PH, Huh K, Kang YM, Kim HS, Ahn YH, Lee G, Bang OY. Mesenchymal stem cells for ischemic stroke: changes in effects after ex vivo culturing. Cell Transplant. 2008; 17(9): 1045-59:

119. Li Y, Chen J, Chen XG, Wang L, Gautam SC, Xu YX, Katakowski M, Zhang LJ, Lu M, Janakiraman N, Chopp M. Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat: neurotrophins and functional recovery. Neurology. 2002 Aug 27;59(4):514-23.

120. Li Y, Chen J, Chopp M. Cell proliferation and differentiation from ependymal, subependymal and choroid plexus cells in response to stroke in rats. J Neurol Sci 193:137-146, 2002.

121. Li Y, Chen J, Wang L, Lu M Chopp M: Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells. Neurology 56:1666-1672, 2001

122. Li Y, Chen J, Wang L, Lu M, Chopp M. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells.Neurology. 2001 Jun 26;56(12): 1666-72.

123. Li Y, Chen J, Zhang CL, Wang L, Lu D, Katakowski M, Gao Q, Shen LH, Zhang J, Lu M, Chopp M. Gliosis and brain remodeling after treatment of stroke in rats with marrow stromal cells. Glia. 2005 Feb;49(3):407-17.

124. Liao W, Xie'J, Zhong J- Liu Y, Du L, Zhou B, Xu J, Liu P, Yang S, Wang J, Han« Z, Han ZC. Therapeutic effect of human umbilical cord multipotent mesenchymal stromal cells in a rat model of stroke. Transplantation. 2009- Feb T5;87(3):350-9.

125. Liu H, Honmou O, Harada K, Nakamura K, Houkin K, Hamada H, Kocsis JD. Neuroprotection by P1GF gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischaemia. Brain. 2006 Oct;129(PtlO):2734-45.

126. Liu YP, Lang BT, Baskaya MK, Dempsey RJ, Vemuganti R. The potential of neural stem cells to repair stroke-induced brain damage. Acta Neuropathol. 2009 May;l 17(5):469-80.

127. Madhavan L, Daley BF, Paumier KL, Collier TJ. Transplantation of subventricular zone neural precursors induces an endogenous precursor cell response in a rat model of Parkinson's disease. J Comp Neurol. 2009 Jul 1;515(1):102-15.

128. Meairs S, Wahlgren N, Dirnagl U, Lindvall O, Rothwell P, Baron JC, Hossmann K, Engelhardt B, Ferro J; McCulloch J, Kaste M, Endres M, Koistinaho J, Planas A, Vivien D, Dijkhuizen R, Czlonkowska A, Hagen A, Evans A, De Libera G,129

129. Nagy Z, Rastenyte D, Reess J, Davalos A, Lenzi GL, Amarenco P, Hennerici M. Stroke research priorities for the next decade—A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 2006;22(2-3):75-82.

130. Modo M, Stroemer RP, Tang E, Patel S, Hodges H. Effects of implantation site of stem cell grafts on behavioral recovery from stroke damage. Stroke. 2002;33:2270 -2278.

131. Nelson PT, Soma LA, Lavi E. Microglia in diseases of the central nervous system. Ann Med. 2002;34(7-8):491-500. Review.

132. Nishino H, Koide K, Aihara N, Kumazaki M, Sakurai T, Nagai H. Striatal'grafts in the ischemic striatum improve pallidal GABA release and passive avoidance. Brain Res Bull. 1993;32(5):517-20.

133. Nottebohm F. Why are some neurons replaced in adult brain? J Neurosci. 2002 Feb l;22(3):624-8. Review.

134. Nudo RJ, Wise BM, SiFuentes F, Milliken GW. Neural substrates for the effects of rehabilitative training on motor recovery after ischemic infarct. Science• 1996;272:1791-1794.

135. Pardridge WM. Brain drug development and brain drug targeting. Pharm Res. 2007 Sep;24(9): 1729-32.

136. Parent JM, Vexler ZS, Gong C, Derugin N, Ferriero DM. Rat forebrain neurogenesis and striatal neuron replacement after focal stroke. Ann Neurol. 2002 Dec;52(6):802-13.

137. Pençe S. Paw preference in rats. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2002; 13(1):41-49.

138. Pleasure SJ, Lee VM. NTera 2 cells: a human cell line which displays characteristics expected of a human committed neuronal progenitor cell. J Neurosci Res. 1993 Aug 15;35(6):585-602.

139. Plumet J; Ebrahimi A, Guitet J, Roger M. Partial recovery of skilled forelimb reaching after transplantation of fetal cortical tissue in adult rats with motor cortex lesions: anatomical and functional aspects. Restor Neurol Neurosci. 1993;6:9-27.

140. Rabinovich SS, Seledtsov VI, Banul NV, Poveshchenko OV, Senyukov VV, Astrakov SV, Samarin DM, Taraban VY. Cell therapy of brain stroke. Bull Exp Biol Med. 2005 Jan;139(l):126-8.

141. Ramos-Cabrer P, Justicia C, Wiedermann D, Hoehn Stem cell mediation of functional recovery after stroke in the rat. M.PLoS One. 2010 Sep 22;5(9):el2779.

142. Robinson RG: Differential behavioral and biochemical effects of right and left hemispheric cerebral infarction in rat. Science 1979, 205:707-710.

143. Savitz SI, Dinsmore JH, Wechsler LR, Rosenbaum DM, Caplan LR. Cell therapy for stroke. NeuroRx. 2004 0ct;l(4):406-14. Review.

144. Sbarbati A, Pietra C, Baldassarri AM, Guerrini U, Ziviani L, Reggiani A, Boicelli A, Osculati F. The microvascular system in ischemic cortical lesions. Acta Neuropathol. 1996 Jul;92(l):56-63.

145. Schabitz WR, Steigleder T, Cooper-Kuhn CM, Schwab S, Sommer C, Schneider A, Kuhn HG. Intravenous brain-derived neurotrophic factor enhances poststroke sensorimotor recovery and stimulates neurogenesis. Stroke. 2007 Jul;38(7):2165-72.

146. Schallert T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 2006 0ct;3(4):497-504.

147. Schiene K, Bruehl C, Zilles K, Qu M, Hagemann G, 'Kraemer M, Witte OW. Neuronal hyperexcitability and reduction of gabaareceptor expression in the surround of cerebral photothrombosis. J Cereb Blood Flow Metab 1996;16:906 -914.

148. Grabowski M, Nordborg C, Johansson BB.Sensorimotor performance and rotation correlate to lesion size in right but not left hemisphere brain infarcts in the spontaneously hypertensive rat. Brain Res. 1991 May 3;547(2):249-257.

149. Shen CC, Lin CH, Yang YC, Chiao MT, Cheng WY, Ko JL. Intravenous implanted neural stem cells migrate to injury site, reduce infarct volume, and improve behavior after cerebral ischemia. Curr Neurovasc Res. 2010 Aug l;7(3):167-79.

150. Shen H, Wang Y. Correlation of locomotor activity and brain infarction in rats with transient focal ischemia. J Neurosci Methods. 2009 Nov 13.

151. Shen LH, Li Y, Chen J, Zhang C, Kapke A, Lu M, et al: One-year follow-up after bone marrow stromal cell treatment in middleaged female rats with stroke. Stroke 38:2150-2156, 2007

152. Shen LH, Li Y, Chen J, Zhang J, Vanguri P, Borneman J, Chopp M: Intracarotid transplantation of bone marrow stromal cells increases axon-myelin remodeling after stroke. Neuroscience 137:393-399, 2006

153. Shintani S, Murohara T, Ikeda H, Ueno T, Sasaki K, Duan J, Imaizumi T. Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circulation. 2001 Feb 13;103(6):897~903.

154. Shyu WC, Lin SZ, Chiang MF, Su CY, Li H: Intracerebral peripheral blood stem cell (CD34+) implantation induces neuroplasticity by enhancing betal integrin-mediated angiogenesis in chronic stroke rats. JNeurosci 26:3444-3453, 2006

155. Shyu WC, Lin SZ, Yang HI, Tzeng YS, Pang CY, Yen PS, Li H. Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colony-stimulating factor-stimulated stem cells. Circulation. 2004 Sep 28;110(13):1847-54

156. Shyu WC, Lin SZ, Yen PS, Su CY, Chen DC, Wang HJ, Li H. Stromal cell-derived factor-1 alpha promotes neuroprotection, angiogenesis, and mobilization/homing of bone marrow-derived cells in stroke rats. J Pharmacol Exp Ther. 2008 Feb;324(2):834-49.

157. Shyu WC, Liu DD, Lin SZ, Li WW, Su CY, Chang YC, Wang HJ, Wang HW, Tsai CH, Li H. Implantation of olfactory ensheathing cells promotes neuroplasticity in murine models of stroke. J Clin Invest. 2008 Jul;l 18(7):2482-95.

158. Slevin M, Krupinski J, Slowik A, Rubio F, Szczudlik A, Gaffney J. Activation of MAP kinase (ERK-l/ERK-2), tyrosine kinase and VEGF in the human brain following acute ischaemic stroke. Neuroreport. 2000 Aug 21; 11(12):2759-64.

159. Song HJ, Stevens CF, Gage FH. Neural stem cells from adult hippocampus develop essential properties of functional CNS neurons. Nat Neurosci. 2002;5:438-445.

160. Sowell ER, Peterson BS, Thompson PM, Welcome SE, Henkenius AL, Toga AW. Mapping cortical change across the human life span. Nat Neurosci. 2003 Mar;6(3):309-15.

161. Stroemer RP, Kent TA, Hulsebosch CE. Neocortical neural sprouting, synaptogenesis, and behavioral recovery after neocortical infarction in rats. Stroke 1995;26:2135-2144.

162. Sun> Y, Jin K, Xie L, et al. VEGF-induced neuroprotection, neurogenesis, andangiogenesis after focal cerebral Ischemia. J« Clin Invest 2003; 111:1843-1851.i

163. Taguchi A, Soma T, Tanaka H, Kanda T, Nishimura H, Yoshikawa H, et al: Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. J Clin Invest 114:330-338, 2004.

164. Thompson TP, Lunsford LD, Kondziolka D. Restorative neurosurgery: opportunities for restoration of function in acquired, degenerative, and idiopathic neurological diseases. Neurosurgery. 1999 Oct;45(4):741-52. Review.

165. Thored P, Wood J, Arvidsson A, Cammenga J, Kokaia Z, Lindvall O. Long-term neuroblast migration along blood vessels in an area with transient angiogenesis and increased vascularization after stroke. Stroke. 2007 Nov;38(l l):3032-9.

166. Toyama K, Honmou O, Harada K, Suzuki J, Houkin K, Hamada H, Kocsis JD. Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia. Exp Neurol. 2009 Mar;216(l):47-55.

167. Tsai PT, Ohab JJ, Kertesz N, et al. A critical role of erythropoietin receptor in neurogenesis and post-stroke recovery. J Neurosci 2006;26:1269 -1274.

168. Vallortigara G, Rogers LJ. Survival with an asymmetrical brain: advantages and disadvantages of cerebral lateralization. Behav Brain Sci. 2005 Aug;28(4):575-89; discussion 589-633.

169. Veizovic T, Beech JS, Stroemer RP, Watson WP, Hodges H. Resolution of stroke deficits; following contralateral grafts- of conditionally immortal neuroepithelial stem cells. Stroke. 2001 Apr;32(4): 1012-9.

170. Vendrame M, Gassady J, Newcomb J, Butler T, Pennypacker KR, Zigova T, et al: Infusion? of human umbilical cord" blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 35:2390-2395, 2004

171. Wang L, Zhang Z, Wang Y, Zhang R, Ghopp M. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats. Stroke 2004;35: 1732-1737.

172. Wang YQ, Guo X, Qiu MH, Feng XY, Sun FY. VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Res. 2007 Jan;85(l):73-82.

173. Wang ZL, Cheng SM, Ma MM, Ma YP, Yang JP, Xu GL, Liu XF. Intranasally delivered bFGF enhances neurogenesis in adult rats following cerebral ischemia. Neurosci Lett. 2008 Nov 28;446(l):30-5.

174. Whishaw IQ, Piecharka DM, Zeeb F, Stein DG. Unilateral frontal lobe contusion; and forelimb function: chronic quantitative and qualitative impairments in reflexive and skilled forelimb movements in rats. J Neurotrauma. 2004 Nov;21(ll):1584-1600.

175. Willing AE, Lixian J; Milliken M, Poulos S, Zigova T, Song S, Hart C, Sanchez-Ramos J, Sanberg PR. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke.J Neurosci Res. 2003 Aug l;73(3):296-307.

176. Wolff SC, Hruska Z; Nguyen L, Dohanich GP. Asymmetrical distributions of muscarinic receptor binding in the hippocampus of female rats. Eur J Pharmacol. 2008 Jul7;588(2-3):248-250.

177. Yao RQ, Zhang L, Wang W, Li L. Cornel iridoid glycoside promotes neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res Bull. 2009 Apr 6;79(l):69-76.

178. Yoder MC, Mead LE, Prater D, Krier TR, Mroueh KN, Li F, Krasich R, Temm CJ, Prchal JT, Ingram DA. Redefinining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 2007; 109:1801— 1809.

179. Yuan Y. Wu, Tahmina Mujtaba and Manhendra S.Rao. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue, from Methods in Molecular Biology, 2002 .vol. 198.

180. Zhang J, Li Y, Chen J, Yang M, Katakowski M, Lu M, Chopp M. Expression of insulin-like growth factor 1 and receptor in ischemic rats treated with human marrow stromal cells.Brain Res. 2004 Dec 24;1030(l):19-27.

181. Zhang R, Zhang L, Zhang Z, et al. A nitric oxide donor induces neurogenesis and reduces functional deficits after stroke in rats. Ann Neurol 2001;50:602- 611.

182. Zhang RL, Zhang Z, Zhang L, Wang Y, Zhang C, Chopp M. Delayed treatment with sildenafil enhances neurogenesis and improves functional recoveiy in aged rats after focal cerebral ischemia. J Neurosci Res 2006;83:1213-1219.

183. Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, Chopp M: Bone marrow-derived; endothelial progenitor cells participate in cerebral neovascularization after focal cerebral ischemia in the adult mouse. Circ Res 90:284-288, 2002

184. Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, et al. VEGF enhances angiogenesis and promotes blood- brain barrier leakage in the ischemic brain. J Clin Invest 2000; 106:829838.

185. Zhao MZ, Nonoguchi N, Ikeda N, et al. Novel therapeutic strategy for stroke in rats by bone marrow stromal cells and ex vivo HGF gene transfer with HSV-1 vector. J Cereb Blood Flow Metab 2006. Epub 2006 Jan 18.

186. Zhao, L.R., Duan, W.M., Reyes, M., Keene, C.D., Verfaillie, C.M., Low, W.C., 2002. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats. Exp. Neurol. 174, 11-20.

187. Zhu W, Zhou LF, Wang Y, Zhu JH, Mao Y. Transplantation of gene-transfected neural stem cells for transient cerebral ischemia in rats Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2004 Jun 17;84(12): 1029-34. Chinese.

Информация о работе

Волков, Андрей Игоревич
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций ЦНС у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы