Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте.

Кониева, Алина Аланбековна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте.
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте."

004*1

На правах рукописи

КОНИЕВА АЛИНА АЛАНБЕКОВНА

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА НА ДИНАМИКУ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ЦНС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 АВГ 2010

Москва-2010

004608939

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор

медицинских наук, профессор Владимир Никитич Ярыгин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Татьяна Клеониковна Дубовая

профессор

доктор медицинских наук,

профессор Сергей Андреевич Гусев

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный

медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится «_»_2010 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»_2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.И. Щёголев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клеточная терапия в настоящее время рассматривается как перспективный и многообещающий метод лечения тяжелых заболеваний. Среди них важное место занимают цереброваскулярные и травматические поражения ЦНС, создающие острую медико-социальную проблему, наносящую огромный экономический ущерб обществу. Инсульт, как наиболее частая форма острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК), ежегодно в мире поражает от 5,6 до 6,6 млн человек. В течение первого года смертность от инсульта составляет около 50% заболевших. Инсульт является основной причиной инвалидизации больных, т.к. у 80% выживших имеются ограничения трудоспособности в связи с сохраняющимися двигательными нарушениями. Более того, за последнее десятилетие наметилась тенденция к «омоложению» инсульта. Так, в последние годы не менее 20% ОНМК диагностируется у лиц трудоспособного возраста. Это делает рассматриваемую патологию общественно значимой.

Травматическая болезнь спинного мозга (ТБСМ) приобрела чрезвычайную актуальность в связи с ростом технического прогресса, что привело к резкому увеличению частоты травматических поражений позвоночника и спинного мозга. По данным ВОЗ число больных с поражением спинного мозга составляет около 30 человек на 100 000 населения. В России численность больных с последствиями ТБСМ составляет порядка 8 тысяч человек. При этом зачастую пострадавшими являются социально-активные, работоспособные люди. В подавляющем большинстве случаев последствием тяжелых повреждений спинного мозга является инвалидизация пациентов, что ведет за собой стойкую утрату трудоспособности и, как следствие, значительные социальные и экономические потери.

Существующие на сегодняшний день протоколы нейрохирургической коррекции и медикаментозной терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических повреждений не способны обеспечить полное восстановление структуры и функции ЦНС и направлены лишь на предотвращение гибели нейронов, окружающих очаг поражения, развивающейся вследствие запуска каскада патобиохимических реакций. Многочисленные экспериментальные исследования возможностей клеточной терапии в лечении данных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как методов, стимулирующих структурно-функциональное восстановление

ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость.

Цель исследования: изучение влияния экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на восстановительные процессы в условиях экспериментального ишемического инсульта и спинальной травмы; исследование распределения трансплантированных клеток в организме животных.

Задачи исследования:

1. Разработать метод эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека магнитными флуоресцентными микросферами и проанализировать влияние этих микрочастиц на физиологические функции клеток in vitro;

2. Изучить распределение меченых человеческих МСК после интраспинальной трансплантации животным с травмой спинного мозга;

3. Изучить распределение меченых человеческих МСК после внутривенной трансплантации животным с экспериментальным ишемическим инсультом;

4. Оценить эффективность действия трансплантированных человеческих МСК на восстановление локомоторных функций по шкале BMS у мышей после травмы спинного мозга;

5. Оценить неврологический статус крыс с экспериментальным ишемическим инсультом после трансплантации человеческих МСК в тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт»;

6. Методом магнитно-резонансной томографии проследить за динамикой изменения очага ишемии в головном мозге крыс после трансплантации человеческих МСК;

7. Охарактеризовать клеточные механизмы действия МСК после их трансплантации мышам с травмой спинного мозга и крысам с ишемическим инсультом.

Научная новизна. Подобрана методика эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток магнитными флуоресцентными микрочастицами, что позволило визуализировать МСК после трансплантации животным как прижизненно, с помощью МРТ, так и постмортально, с использованием флуоресцентной микроскопии. Детально изучены возможные нежелательные эффекты этих частиц на функциональное состояние клеток в культуре.

Впервые изучены механизмы действия мезенхимальных стволовых клеток,

выделенных из плаценты человека, на эндоваскулярной модели инсульта у крыс и на

модели позвоночно-спинномозговой травмы у мышей. Показано восстановление неврологического дефицита у животных в обоих случаях повреждения ЦНС после трансплантации человеческих плацентарных клеток. Впервые выявлена миграция меченых клеток в гиппокамп обоих полушарий мозга, как при инсульте, так и при спинальной травме. Также установлен факт дифференцировки МСК плаценты человека в нейрональном направлении после трансплантации грызунам с моделью инсульта и спинальной травмы.

При помощи МРТ показано достоверное уменьшение очага ишемии у опытных крыс, по сравнению с контрольными животными. Впервые была показана временная характеристика распределения меченых клеток в организме крыс с инсультом, свидетельствующая о том, что МСК проникают в мозг через сосуды, вокруг которых концентрируются в течение первых 7 дней. Затем происходит их миграция в зону ишемии, где они достигают максимальной концентрации к концу 3 недели. Впервые определена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием трансплантации МСК, выделенных из плаценты человека, у крыс с ишемией головного мозга.

Практическая значимость. Результаты исследования позволяют расширить и дополнить существующие представления о клеточной терапии заболеваний центральной нервной системы. Данная работа является частью обширных доклинических исследований терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических поражений спинного мозга и вносит определенный вклад в подготовку клинических испытаний и, в дальнейшем, внедрения в практическую медицину. Активное изучение механизмов действия МСК в доклиническом формате является залогом эффективного и безопасного применения их в будущем.

Внедрение в практику. Методические рекомендации по выделению мезенхимальных стволовых клеток из экстраэмбриональных органов, их культивированию и дифференицровке в условиях in vitro использованы при выполнении научной работы в группе липидных модуляторов иммунитета отдела иммунологии ИБХ РАН, а методические рекомендации по мечению МСК плаценты человека внедрены в практику лаборатории клеточной биологии ИБМХ им. В.Н.Ореховича.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 9-м международном

семинаре по магнитному резонансу (г. Ростов-на-Дону, 2008), на научно-практической

конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической

медицины» (г. Москва, 2008), на итоговой конференции по результатам выполнения

мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП

«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-

технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (г. Москва, 2008), на 6-м Всемирном конгрессе по инсульту (г. Вена, 2009), на 2-ой ежегодной европейской конференции «Stem Cells & Regenerative Medicine» (г. Эдинбург, 2009), на российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (г. Пятигорск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 243 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и культивирование мезенхимальиых стволовых клеток (МСК) из

плаценты человека. Выделение МСК из тканей плаценты человека производили

ферментативным способом. Для получения клеток использовали фрагмент ткани

плаценты после нормальных родов вблизи пупочного канатика. После промывания его

раствором Хэнкса (ПанЭко, РФ), содержащим антибиотики, и механического

воздействия, полученную взвесь инкубировали в 0,1%-ном растворе коллагеназы 1-го

типа (Gibco, США) в течение 30 мин при 37°С. По окончании инкубации суспензию

отмывали раствором Хэнкса (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендировали в DMEM-F12

(Gibco, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, США), 100

мкг/мл стрептомицина, 100 U/мл пенициллина, 2 мМ L-глютамина (все - Gibco, США),

и суспензию помещали в культуральные флаконы (площадью 75 см2 с фильтром

(Greiner, Германия)). Культивирование проводили в С02-инкубаторе со следующими

параметрами: 37° С, 5 % С02, 80 % влажности. При достижении 80-90%

конфлюентности, клетки снимали с пластика раствором трипсина-версена (ПанЭко, РФ)

(в соотношении 1:1) и рассаживали в концентрации 2,5ХЮ5клеток/флакон. Подсчет

клеток проводили в камере Горяева.

Мечение МСК магнитными флуоресцентными микрочастицами. Для мечения

МСК использовали магнитные флуоресцентные = 480 нм, = 520 нм)

микрочастицы диаметром 0,96 мкм (Bangs lab. Inc., США). По достижении 80-90%

конфлюентности к культуре МСК добавляли суспензию частиц (5 мкл стоковой

суспензии на 1 мл культуральной среды). Клетки инкубировали с частицами 24 часа в

СОг-инкубаторе. Эффективность мечения оценивали на проточном цитофлуориметре EPICS Coulter XL. Для каждого образца регистрировали не менее 1х104 событий. Обработку полученных результатов проводили в программе WinMDI.

Оценка уровня пролиферации МСК. меченых магнитными микрочастицами. МСК культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах (1000 клеток на лунку) с последовательными разведениями частиц (от 25 до 2,5 мкл стоковой суспензии частиц на 1 мл культуральной среды). Клетки инкубировали 3 дня, затем удаляли супернатант и добавляли по 30 мкл/лунку раствора МТТ (исходная концентрация 5 мг/мл) (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) (Sigma, США) для определения пролиферации клеток колориметрическим способом. После завершения инкубации (2-4 ч) добавляли 100 мкл DMSO (ПанЭко, РФ) на лунку. Оптическое поглощение измеряли через 15 мин на приборе Multiscan (Titertek, Швейцария) при длине волны 540 нм. Эксперимент был выполнен в 3-х повторах. Обработку статистических данных производили в программе Microsoft Excel.

Анализ клеточной гибели в Pi-тесте. МСК метили магнитными частицами, как описано выше, и культивировали в течение 3 сут. Затем клетки снимали с пластика раствором трипсинаУверсена (1:1), дважды отмывали раствором Хэнкса и проводили фиксацию и пермеабилизацию ледяным 70 %-ным этанолом не менее 1 ч при 4°С. После этого клетки дважды отмывали в PBS (ПанЭко, РФ) центрифугированием (5 мин, 300 g), осадок ресуспендировали в растворе пропидиум иодида (PI) (конечная концентрация 25 мкг/мл), приготовленном на основе PBS и содержащем 10 мкг/мл РНКазы (Sigma, США). Оценку клеточной гибели проводили на проточном цитофлуориметре EPICS Coulter XL. Для каждого образца регистрировали не менее 1х104 событий. Обработку полученных результатов проводили в программе WinMDI. На гистограммах учитывали долю гиподиплоидных клеток, обладающих более низкой флуоресценцией.

Нейрональная дифференцировка МСК in vitro. Клетки рассаживали в 24-

луночных планшетах на покровные стекла в концентрации 2,5 тыс/лунку и метили их

микрочастицами, как описано выше. В течение суток проводилась предварительная

индукция дифференцировки путем замены обычной культуральной среды на среду,

содержащую 1 % FBS и 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF).

Контрольные клетки культивировали в той же среде, не содержащей bFGF. Инкубация

проводилась при 37°С в атмосфере 5% С02. Через сутки индукционную среду заменяли

на дифференцировочную следующего состава: DMEM F-12, 1цМ RA (ретиноевая

кислота), 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 100 нг/мл NGF, 10 нг/мл NT-3, 5 мг/мл

инсулина, 1 цМ гидрокортизона, 1 цМ прогестерона (все - Sigma, США), пенициллин,

стрептомицин, L-глютамин. Клетки культивировали в течение 4 недель в С02-инкубаторе со сменой среды 2 раза в неделю. Контрольные клетки культивировали в среде DMEM F-12 с добавлением пенициллина, стрептомицина, L-глютамина, но без факторов дифференцировки.

Анализ экспрессии нейрональных маркеров мезенхимальными стволовыми клетками, выделенными из плаценты человека. Иммуноцитохимическую оценку экспрессии нейрональных маркеров мезенхимальными стволовыми клетками проводили через 4 недели после индукции дифференцировки. МСК дважды промывали раствором PBS, рН 7.4, и фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида (рН 7.4) (Sigma, США) в течение 20 мин при комнатной температуре. После фиксации клетки дважды отмывали PBS и проводили пермеабшшзацию 0,6%-ным раствором сапонина (Sigma, США), в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки трижды отмывали PBS. Блокирование неспецифического связывания проводили в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 1% FBS (HyClone, США), 0.1% Tween 20 (Sigma, США). Далее клетки инкубировали с мышиными антителами к человеческим нейрональным маркерам NSE и GFAP (все - 1:100, Chemicon, США) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего проводили две отмывки, как описано выше. Затем клетки инкубировали с антивидовыми антителами (1:100), мечеными родамином = 550 нм, Хет, = 570 нм) в течение 40-60 мин при комнатной температуре, дважды отмывали их в PBS, содержащем 1% FBS, 0.1% Tween 20. Ядра клеток докрашивали DAPI (1 мкг/мл PBS) (Sigma, США). Визуализацию клеток и получение изображений проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Моделирование спинальной травмы. В исследовании были использованы 44 взрослые (2-3 месяца) самки мышей линии С57В1/6 серии №26 (питомник лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН). Выполняли ламинэктомию 6-8 грудных позвонков (Т6-Т8), обнажая дорсальную поверхность спинного мозга. Для создания стандартизованного ушиба спинного мозга использовали металлический стерильный импактор, цилиндрической формы и окончанием в виде конуса, весом 1 г. Прицельное падение импактора на обнаженную зону спинного мозга проводили однократно с высоты 13 см. Опытным животным (п=21) в область травмы непосредственно после ушиба вводили меченые флуоресцентными микрочастицами МСК плаценты человека (1 млн в 0,1 мл физ. раствора). Контрольной группе (п=23) в область травмы аналогичным образом вводили 0,1 мл физиологического раствора. Протокол экспериментов с

животными был рассмотрен и утвержден Этическим комитетом при РГМУ.

Анализ восстановления локомоторных функции у мышей с травмой синимого мозга. Оценка восстановления локомоторной функции проводилась непосредственно после операции, а также через 1, 3, 7, 14, 19, 21, 25 и 30 суток в тесте открытое поле с использованием шкалы BMS, в которой учитывали активность и объем движений в суставах, участие конечности в акте движения, позицию, положение по отношению к туловищу, координацию функции передних и задних конечностей, а также способность удерживать стабильное положение тела. Шкала разделена на 10 баллов от 0 до 9, где 0 баллов - полный паралич конечностей, а 9 - отсутствие дефицита локомоторной активности.

Гистологическое окрашивание тканей спинного мозга мышей. На 30 сутки после создания травмы спинного мозга мышей забивали методом цервикальной дислокации и выделяли фрагменты позвоночного столба длиной 3 см, включающие зону травмы и неповрежденные сегменты выше и ниже травмы. Фрагменты позвоночного столба освобождали от мягких тканей и убирали остистые отростки. Полученные образцы ткани спинного мозга фиксировали в 2,5%-ном растворе формальдегида в течение 24 часов. Затем проводили импрегнацию 1% 0s04 (Sigma, США), обезвоживали в спиртах и заключали в аралдит. Срезы фотографировали с помощью цифровой фотокамеры и проводили двумерную реконструкцию ткани, используя программу PhotoStitch (Canon, Япония).

Иммуногистохнмическнй аналнз крносрезов спинного и головного мозга мышей с травмой спинного мозга. Извлеченные органы быстро замораживали в парах азота и хранили при -80°С. Продольные серийные срезы (10 мкм) спинного мозга, а также серийные фронтальные срезы головного мозга производили на криотоме Microm НМ560 (Cail Zeiss, Германия). Криосрезы фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида, дважды отмывали PBS и докрашивали DAPI (1 мкг/мл). Для иммуногистохимической окраски фиксированные срезы спинного мозга отмывали PBS, блокировали в течение 30 мин в PBS, содержащем 0.5% бычьего сывороточного альбумина, 2% нормальной козьей сыворотки, 0.05% Tween 20, 0.01% мертиолята. После отмывки инкубировали с первичными антителами против человеческого нейроспецифического пептида (NeuN) (1:100) в течение 1 часа, затем трижды промывали PBS. Инкубировали срезы со вторичными анти-видовыми антителами, мечеными родамином (1:200, все - Chemicon, США), в течение часа с последующими отмывками в растворе PBS. Ядра клеток докрашивали раствором DAPI (1 мкг/мл). Анализ окрашенных криосрезов проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с

использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Экспериментальные животные и модель инсульта. Работа выполнена на белых крысах-самцах линии Вистар, с исходной массой 260-300 г. Животных наркотизировали хлоралгидратом в дозе 300 мг/кг веса внутрибрюшинно. Для эндоваскулярной окклюзии средней мозговой артерии (СМА) использовали нейлоновую нить 4-0 с силиконовым наконечником диаметром 0,25 мм, которую через катетер из наружной сонной артерии вводили во внутреннюю сонную артерию, продвигая ее "вслепую" до места отхождения СМА (на 17—20 мм). Контролируемая продолжительность окклюзии СМА составляла 1 час, после чего нить удаляли. Опытной группе животных (п=22) через 24 ч после операции внутривенно вводили МСК, меченые магнитными микрочастицами (2 млн клеток в 1 мл физиологического раствора в бедренную вену). Контрольной группе животных (п=24) вместо МСК аналогичным образом инъецировали физиологический раствор в объеме 1мл. Протокол экспериментов с животными был рассмотрен и утвержден Этическим комитетом при РГМУ.

Поведенческое тестирование крыс с экспериментальным ишемнческим инсультом. Оценку неврологического статуса у животных проводили по модифицированной шкале mNSS (modified Neurological Stroke Scale). Оценивали сенсорную и рефлексную деятельность по рефлексу с ушной раковины, роговичному рефлексу, старт-рефлексу. Каждый показатель оценивался от 1 до 3 баллов, в зависимости от степени выраженности. Исследование интегративной деятельности мозга животных оценивали по их поведению в тестах "Открытое поле", где фиксировали горизонтальную и вертикальную активность животного, а также в тесте "Крестообразный лабиринт", где в течение 3 минут регистрировали общее время нахождения животного на свету, а также количество выглядываний из закрытых концов лабиринта.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга крыс. МРТ

головного мозга экспериментальных животных проводили на 1-е, 7-е, 14-е, 21-е сутки после операции с помощью установки BioSpec 70/30 (Bruker, Германия) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м. Для передачи РЧ-сигнала использовали линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции РЧ-сигнала - поверхностную приемную катушку для мозга крысы. Для оценки ишемического очага и визуализации МСК, меченых магнитными микрочастицами были использованы следующие импульсные последовательности:

• режим Т2-ВИ - импульсная последовательность на основе спинового эха RARE со следующими параметрами: TR = 6000 мс, ТЕ = 63,9 мс, толщина среза 0,5 мм, разрешение 0,164 х 0,164 мм/пиксел;

• для получения Т2*-ВИ (сильная чувствительность к локальной неоднородности магнитного поля) - импульсная последовательность на основе градиентного эха -SNAP, со следующими параметрами: TR =113 мс, ТЕ = 13 мс, толщина среза 1 мм, разрешение 0,156 х 0,156 мм/пиксел. Анализ МР-изображений проводили в программе Image J.

Иммуногистохимнческий анализ распределения меченых человеческих МСК в организме крыс. Экспериментальных животных декапитировали на фоне хлоралгидратного наркоза на 1, 5, 12 и 19 сутки после введения МСК (т.е. на 3, 7, 14 и 21 сутки после операции, соответственно). Сразу после этого извлекали головной мозг, легкие, печень, селезенку и костный мозг и замораживали в парах жидкого азота в течение 20 мин. Полученные образцы хранили при -80°С. Фронтальные серийные срезы головного мозга крыс, а также срезы внутренних органов, толщиной 10 мкм, готовили на криотоме Microm НМ560 (Cari Zeiss, Германия). Криосрезы фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида. Фиксированные срезы докрашивали DAPI .(1 мкг/мл). Для оценки возможной дифференцировки трансплантированных человеческих клеток в ишемизированном мозге крысы, фиксированные фронтальные срезы мозга окрашивали антителами, специфичными к человеческим нейрональным (NeuN) и глиальным (GFAP) белкам (разведение антител 1:100) по методике, описанной выше. Ядра докрашивали раствором DAPI (1 мкг/мл). Визуализацию тканей и получение изображений проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Cari Zeiss, Германия). Кроме того, срезы головного мозга крыс окрашивали антителами к ядерному белку Ki-67, маркеру пролиферирующих клеток (титр антител 1:100). В качестве вторичных антител использовали анти-видовые антитела, меченые пероксидазой хрена. Окрашивание проводили с использованием DAB системы визуализации (DakoCytomation, Дания).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения межгрупповых показателей динамики восстановительных процессов использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. При нормальном распределении выборки для парных сравнений использовался t-критерий Стьюдента. Различия рассматривали как статистически значимые при значении уровня достоверности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влняние магннтных микросфер на уровень пролиферации МСК в культуре.

Поскольку используемые в работе микрочастицы состоят из оксида железа, который является токсичным для клеток, необходимо было оценить возможное влияние этих частиц на физиологические функции МСК в культуре. Кроме того, необходимо было выявить максимальную концентрацию частиц, при которой клетки эффективно метились бы и не подвергались токсическому воздействию. Для этого была проведена оценка влияния микрочастиц на уровень пролиферации клеток. Анализ пролиферативного потенциала МСК в присутствии различных концентраций магнитных флуоресцентных микрочастиц показал, что заметное снижение пролиферации клеток происходит при добавлении к культуре 15 мкл стоковой суспензии микрочастиц. Максимальная концентрация микрочастиц, которая не влияла на пролиферацию МСК плаценты человека, составила 5 мкл/мл (Рис.1). Имеено такая концентрация использовалась в дальнейших экспериментах для мечения клеток.

уровня

О 0.7

0.6 0,5 : 1— 1

0.4 |

оз 0.2

од ; 0

0 2.5 5 10 15 20 25

количество мжнитых микросфер, мил/мл

Рис. 1. Зависимость пролиферации МСК от количества магнитных микрочастиц в среде. Ось У - оптическая плотность при длине волны 540 нм; ось X - количество микрочастиц в культуральной среде (мкл стоковой суспензии/мл культуральной среды).

Анализ гибели меченых микрочастицами МСК в культуре. Важной физиологической составляющей жизнедеятельности клеток, кроме пролиферативного потенциала, является спонтанная гибель клеток в культуре, связанная, в частности, с их

старением.

<3т: 12975 | СУ: 18.72 1

[182-805] 182 (3.7%)

104 10' 10; 10' 10' аз ЮЗ

Ст 110.89 СУ: 17.41

1182-805] 202 (3.9 %)

10е 10' 10; 10' 10' аз 100

Рис. 2. Гистограммы

распределения уровня

флуоресценции МСК в Р1-тесте после их инкубации с микрочастицами (5 мкл/мл, 3 дня). А - контрольные (немеченые) МСК; Б - меченые МСК

Для того чтобы оценить влияние микросфер на этот процесс, МСК культивировали с микрочастицами (5 мкл/мл) в течение трех дней и оценивали уровень клеточной гибели в пропидиум иодидном тесте (Р1 тест). Результаты этого теста показали, что микрочастицы в выбранной концентрации (5мкл/мл) не повышали уровень спонтанной клеточной гибели в культуре по сравнению с контрольными клетками, культивируемыми без микросфер (Рис. 2).

Эффективность мечеиня МСК магнитными микрочастицами. По данным проточной цитофлюорометрии эффективность мечения мезенхимальных стволовых клеток магнитными флуоресцентными микрочастицами составляла порядка 90%. Тем не менее, со временем в процессе культивирования клеток происходила потеря ими магнитных частиц, в связи с экзоцитозом и распределением частиц между дочерними клетками при делении. Так, было показано, что число меченых клеток существенно снижалось после 4-го пассажа (оставалось не более 35% меченых клеток от общего числа клеток в культуре) (Рис. 3). Кроме того, количество метки на клетку также уменьшалось при пассировании. Однако полученный результат нисколько не отразился на дальнейшей работе, поскольку для трансплантации животным использовали клетки, меченые непосредственно перед экспериментом, а визуализацию трансплантированных клеток проводили не позднее 3-4 недель после введения.

Рис. 3. Уменьшение числа меченых клеток при пассировании в культуре. Ось У - % меченых клеток, ось X - число пассажей.

число пассажей

Нейрональная дифференцировка МСК in vitro. Через 4 недели после индукции нейрональной дифференцировки иммуноцитохимический анализ экспрессии нейрональных маркеров показал, что и меченые, и немеченые клетки проявляют признаки нейрональной дифференцировки, экспрессируя глиальный фибрилярный кислый белок (GFAP) - маркер астроглии, и нейронспецифичную энолазу (NSE) -маркер зрелых нейронов. МСК, культивируемые в среде без добавления факторов роста и гормонов, не экспрессировали ни NSE, ни GFAP (данные не представлены).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что загрузка МСК магнитными флуоресцентными микрочастицами не влияет на их основные физиологические функции (пролиферацию, спонтанную гибель и дифференцировку) в условиях in vitro, что позволяет использовать эти частицы в качестве метки в дальнейших экспериментах in vivo.

Спинальная травма.

Анализ функционального восстановления животных. У всех животных сразу после операции по созданию ушиба спинного мозга и в течение еще нескольких дней отмечались явления спинального шока, характеризующиеся вялыми параличами и выпадением сенсорной и рефлекторной функций задних конечностей, таким образом, средний балл по шкале BMS составлял 0 баллов. Уже к 7 суткам после операции и трансплантации МСК происходило достоверное увеличение объема движения в задних конечностях животных опытной группы (р<0,05). В дальнейшем у 83% животных опытной группы в той или иной степени восстанавливалась произвольная функция задних конечностей, в то время как в контрольной группе способность к произвольным движениям не выявлялась на протяжении всего времени наблюдения. Так, на 30 сутки средний балл опытной группы составил 4,33±0,41, что по шкале BMS соответствует произвольным движениям задних конечностей, участию их в ходьбе, способности опираться при ходьбе на задние конечности, а также положению конечности на подошвенной поверхности стопы. Большинство мышей контрольной группы оставались парализованными в течение всего срока эксперимента, и лишь у 17% отмечалась смена параплегии спастическим парезом с частичным восстановлением чувствительности задних конечностей. В контрольной группе средний балл по шкале BMS составил 1,33±0,67, что соответствует легкому непроизвольному движению в отдельных суставах задних конечностей (Рис. 4).

Рис. 4.

Восстановление локомоторной функции задних конечностей по шкале BMS.

время после операции

Гистологический анализ спинного мозга после трансплантации человеческих МСК. У животных контрольной группы в зоне травмы и вокруг нее формировался соединительнотканный рубец, через который на протяжении 30 суток не наблюдали прорастания аксонов.

У опытных животных через 30 суток после операции в зоне травмы наблюдали активный рост и миелинизацию нервных проводников (Рис. 5).

-V

■ >■•: -Щ.

:* Рис. 5. А - косой срез миелинизированного нервного волокна в соединительнотканном рубце (показан стрелкой); Б - миелинизированные нервные волокна ниже уровня травмы через 30 дней после операции и трансплантации клеток плаценты. Двумерная реконструкция полутонких срезов (импрегнация тетраоксидом осмия).

Анализ миграции и нейрональной дифференцировки МСК после трансплантации в зону травмы спинного мозга. Через 30 дней после трансплантации человеческих МСК в зону повреждения спинного мозга большие скопления клеток обнаруживались в месте введения клеток. Кроме того, они распространялись в тканях спинного мозга в ростральном и каудальном направлениях от места повреждения. Незначительная часть трансплантированных клеток мигрировала вглубь ткани и расселялась в радиусе нескольких миллиметров от травмы. Через 30 дней после трансплантации эти клетки начинали экспрессировать маркер нейрональной дифференцировки КеиМ. Таким образом, было показано, что часть введенных клеток плаценты выживает в тканях спинного мозга мыши, по крайней мере, в течение 1 месяца. При этом часть клеток приобретает признаки нейрональной дифференцировки. При исследовании серийных фронтальных срезов головного мозга животных опытной группы, оказалось, что через 30 дней после интраспинального введения человеческих клеток, большие скопления метки обнаруживаются в гиппокампе, в области зубчатой извилины (данные не представлены).

Ишемический инсульт.

Магнитно-резонансная томография. В эксперимент вошли животные, объем поражения головного мозга которых, по данным МРТ (в режиме Т2-ВИ), на первые сутки составил в среднем 0,182±0,04 см3. Уже с 7 суток после инфаркта (и, соответственно, через 5 суток после трансплантации МСК), объем поражения мозга опытных крыс характеризовался более быстрым и полным регрессом.

Таблица 1. Сравнительная динамика уменьшения очага ишемии, вызванного окклюзией СМА, в контрольной группе крыс и в группе животных, которым

Экспериментальная группа Объем очага ишемии (режим Т2-ВИ), см3

1 день 7 дней 14 дней 21 день

Окклюзия СМА 0,184±0,03 0,105±0,02 0,08±0,02 0,064±0,012

Окклюзия СМА+ человеческие МСК 0,179±0,05 0,048±0,01 0,012±0,03 0,006±0,002

Через 3 недели после окклюзии СМА средний объем очага ишемии у крысы экспериментальной группы был уже в 10,6 раз меньше (0,006 см3), чем у контрольного животного (0,064 см ) (Таблица 1).__

Рис. 6. МРТ головного мозга опытного животного на 14 сутки после операции. Режим Т2*-ВИ. А - концентрация меченых МСК в области ишемии. Участки концентрации трансплантированных МСК показаны стрелками. Б - треки МСК, меченых магнитными микрочастицами, в ипсилатеральном полушарии головного мозга опытной крысы.

В режиме Т2* - взвешенных изображений удалось зафиксировать в ишемизированном полушарии крысы меченые МСК, которые через 2 недели после операции формировали направленные «треки» и накапливались в районе очага инсульта (Рис. 6).

Оценка неврологического статуса. В первые сутки после операции при оценке неврологических отклонений у всех крыс с ишемическим инсультом наблюдались

умеренные неврологические нарушения в виде вялости и замедленности движении. Средняя оценка по шкале т1Ч88 составила 13,3±0,27 баллов, что соответствует поражению средней тяжести. В дальнейшем восстановление неврологического дефицита, связанное с собственными репаративными возможностями нервной системы крыс, происходило в обеих группах. Тем не менее, в опытной группе наблюдалось статистически достоверное улучшение показателей уже на 7 сутки после операции (достоверность отличий при сравнении опытной и контрольной групп при р<0,01), которое сохранялось на протяжении всего эксперимента (данные не представлены).

При исследованиях в тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт» выявилось, что восстановление активности и ориентации в экспериментальной установке животных, перенесших трансплантацию МСК, более выражено и происходит быстрее, чем у животных контрольной группы (Рис. 7).

Локомоторная активность животных в тесте "Открытое поле"

Исследовательская деятельность животных в тесте "Крестообразный лабиринт"

до операции 7 суток

время после операции

до операции 10 сутки

время после операции

□ контроль □опыт

[о контроль [

Рис. 7. Оценка функционального восстановления животных в поведенческих тестах.

Иммуногистохимический анализ криосрезов головного мозга и внутренних органов крыс с ишемическим инсультом после трансплантации человеческих МСК, меченых магнитными флуоресцентными микрочастицами. Анализ серийных фронтальных срезов головного мозга и внутренних органов показал, что в течение первых суток после трансплантации клетки распространяются в паренхиматозных органах (печень, селезенка, легкие, почки), а также в костном мозге, в то время как в головном мозге обнаруживаются лишь единичные меченые клетки (данные не представлены). Через 5 дней после внутривенного введения меченых МСК, они образовывали скопления в головном мозге преимущественно вокруг сосудов, в большей степени в ипсилатеральном полушарии. На второй неделе после трансплантации МСК, эти клетки формировали «треки», начинающиеся от периваскулярных зон скопления. В это время появлялись также незначительные их скопления в области ишемии, где они

достигали максимальной концентрации к 3 неделе. Также на 3 неделе значительны: скопления меченых клеток наблюдались в гиппокампе обоих I

■ V . » * •

Рис. 8. А - периваскулярная локализация меченых магнитными флуоресцентными частицами МСК в ишемизированном полушарии крысы через 5 дней поел: трансплантации клеток. Б - формирование мезенхимальными стволовыми клетками «треков» в ишемизированном полушарии через 12 дней после трансплантации. В -скопление меченых МСК в гиппокампе ишемизированного полушария. Г - скоплени" меченых человеческих МСК в зоне ишемии через 21 после инсульта.

В головном мозге трансплантированные МСК проявляют несколько механизмов действия. В частности, иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга антителами к человеческому глиальному фибриллярному кислому белку - маркеру астроглии, а также нейрон-специфическому ядерному белку - маркеру нейронов, выявило, что некоторое число меченых клеток в зоне ишемии проявляет признаки

г• У' г 1 • » • \ ■■ . 1.'* Ч »

А Б

Рис. 9. Экспрессия человеческими МСК нейрональных маркеров в периинфарктной зоне головного мозга крыс с ишемическим инсультом через 3 недели после трансплантации клеток. А - экспрессия человеческого вРАР; Б - экспрессия человеческого №иЫ.

Также в работе было установлено, что через 12 дней после внутривенного введения человеческих клеток крысам с ишемическим инсультом происходит активная стимуляция пролиферации резидентных нейрональных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне обоих полушарий. Используя маркер пролиферирующих клеток КЛ-67, было показано, что по сравнению с контрольными животными, количество делящихся клеток в субвентрикулярной зоне опытных животных становится существенно выше. Более того, Кл-67-позитивные клетки (т.е. пролиферирующие клетки) у опытных животных формируют отчетливые тангенциально направленные «треки», чего не наблюдается у контрольных крыс. Вдобавок, у экспериментальных животных, в отличие от контрольных, в очаге ишемии и вокруг него наблюдаются массивные скопления пролиферирующих клеток (Рис. 10).

1. Разработан метод мечения МСК плаценты человека магнитными флуоресцентными микрочастицами, обеспечивающий 90%-ую эффективность мечения и не влияющий на основные характеристики клеток в культуре - скорость пролиферации, способность к нейрогенной дифференцировке и жизнеспособность.

2. При интраспинальном введении животным с травмой спинного мозга меченые МСК активно мигрируют в спинном мозге в ростральном, каудальном и вентральном направлениях. Некоторое количество клеток обнаруживается в зубчатой извилине гиппокампа головного мозга.

Рис. 10. Стимуляция пролиферации резидентных клеток СВЗ (окрашивание антителами к К1-67). А - СВЗ контроль; Б - СВЗ опыт; В -путь миграции контроль; Г -путь миграции опыт; Д -

периинфарктная зона контроль; Е - периинфарктная зона опыт.

ВЫВОДЫ

недель после трансплантации меченые МСК проникают в ткань головного мозга, формируют треки миграции, начинающиеся от кровеносных сосудов, и обнаруживаются в зоне ишемии и в гиппокампе.

4. Интраспинальная трансплантация МСК плаценты человека мышам с травмой спинного мозга способствует трехкратному улучшению локомоторной функции задних конечностей по шкале BMS.

5. В тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт» в опытной группе животных с ишемическим инсультом статистически достоверное улучшение показателей неврологического статуса (по сравнению с контрольными животными) происходит уже на 7 сутки после операции, подобная тенденция сохраняется на протяжении всего эксперимента.

6. По данным МРТ, вследствие трансплантации человеческих МСК крысам с ишемией мозга, размер очага ишемии существенно уменьшается к 7 суткам, а через месяц у опытных животных объем очага поражения уже в 10 раз меньше, чем у контрольных животных.

7. Человеческие плацентарные МСК, трансплантированные мышам со спинальной травмой и крысам с экспериментальным ишемическим инсультом, в единичных случаях проявляют признаки неполной видоспецифичной нейрональной дифференцировки.

8. Положительные эффекты трансплантированных МСК связаны не с замещением погибших клеток реципиента трансплантированными клетками, а в большей степени с паракринной стимуляцией собственных репаративных процессов, в частности, с усилением миелинизации нервных проводников при спинальной травме и с активацией пролиферации эндогенных нейральных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне животных с экспериментальным ишемическим инсультом и их миграции в очаг поражения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Количество магнитных флуоресцентных микрочастиц (Bangs laboratories, Inc., США), использующихся для мечения мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека должно составлять не более 5 мкл стоковой суспензии на 1 мл культуральной среды.

2. Перед внутривенным введением животным человеческих плацентарных МСК клетки необходимо тщательно суспендировать, а для инъекции использовать

катетер с фильтром, во избежание окклюзии сосудов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Губский JI.B., Учеваткин А.А., Леденев В.В., Таирова Р.Т., Чеглаков И.Б., Цебоева А.А., Бурунова В.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н., Скворцова В.И. Изучение влияния мезенхимальных стволовых клеток, меченых микрочастицами оксида железа в декстрановой оболочке на экспериментальных моделях ишемического инсульта у крыс // Сб. материалов 9-го международного семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону, 2008. Стр. 76-77.

2. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева А.А., Таирова Р.Т. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс // Сб. материалов научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины". Москва, 2008. Стр. 90-91.

3. Ярыгин К.Н., Чеглаков И.Б., Кониева А.А., Бурунова В.В., Таирова Р.Т., Губский JI.B., Каралкин П.А., Лупатов А.Ю., Шрагина О.А., Черкезов Я.А. Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований в области клеточных технологий // Сб. материалов Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2008. Стр. 159.

4. Gubskiy L., Tairova R., Pirogov Yu.A., Ceboeva A.A., Burunova V.V., Yarygin K.N., Yarygin V.N., Skvortsova V.I. The influence of intravenous introduction mesenchymal stem cells marked by ultra small particles of iron oxide at infarct in rats // International Journal of Stroke. 2008. Vol. 3, suppl. 1. 6th World Stroke Congress, Vienna, Austria: Abstract POOl-297.

5. Yarygin K.N., Kholodenko I.V., Konieva A.A., Burunova V.V., Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Yarygin V.N., Skvortsova V.I. Mechanisms of beneficial effects of human placenta MSC transplantation in rats with experimental ischemic stroke // Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe conference. Edinburgh, 2009. P. 276.

6. Ярыгин K.H., Холоденко И.В., Кониева A.A., Бурунова В.В., Таирова Р.Т., Губский Л.В., Чеглаков И.Б., Пирогов Ю.А., Ярыгин В.Н., Скворцова В.И. Механизмы положительного влияния трансплантации МСК плаценты человека на восстановление крыс после экспериментального ишемического инсульта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009, т. 148, № 12, С. 699-702.

7. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Пирогов Ю.А., Ярыгин К.Н., Губский JI.B., Таирова Р.Т., Холоденко И.В., Кониева A.A., Бурунова В.В. Хоуминг-эффект мезенхимальных стволовых клеток на модели острой фокальной ишемии мозга у крыс // Сб. материалов Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение». Пятигорск, 2010. Стр. 41.

Подписано в печать:

30.06.2010

Заказ № 3924 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кониева, Алина Аланбековна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие характеристики стволовых клеток.

1.1.1. История открытия стволовых клеток.

1.1.2. Определения и понятия биологии стволовых клеток.

1.1.3. Ниши мультипотентных стволовых клеток.

1.2. Мезенхимальные стволовые клетки.

1.2.1. Развитие концепции мезенхимальных стволовых клеток.

1.2.2. Общие характеристики мезенхимальных стволовых клеток.

1.2.3. Фенотипическая характеристика МСК.

1.2.4. Дифференцировочный потенциал МСК in vitro.

1.3. Плацентарные стволовые клетки.

1.3.1. Происхождение плаценты в эмбриогенезе.

1.3.2. Структура человеческой плаценты.

1.4. Клеточная терапия заболеваний центральной нервной системы.

1.4.1. Ишемический инсульт.

1.4.1.1. Клеточная терапия ишемического инсульта.

1.4.1.2. Потенциальные механизмы действия 42 трансплантированных стволовых клеток.

1.4.1.3. Клинические испытания клеточной терапии при 46 инсульте.

1.4.2. Травматическая болезнь спинного мозга.

1.4.2.1. Клеточная терапия травмы спинного мозга.

1.4.2.2. Клинические испытания трансплантации стволовых 56 клеток при травме спинного мозга.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

2.2. Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых 59 клеток (МСК) из плаценты человека.

2.2.1. Мечение МСК магнитными микрочастицами.

2.2.2'. Оценка уровня пролиферации МСК, меченых магнитными 60 микрочастицами.

2.2.3. Анализ клеточной гибели в PI-тесте.

2.2.4. Нейрональная дифференцировка MCK in vitro.

2.2.5. Анализ экспрессии нейрональных маркеров 62 мезенхимальными стволовыми клетками, выделенными из плаценты человека.

2.3. Моделирование спинальной травмы.

2.3.1. Анализ восстановления локомоторных функций у мышей с 64 травмой спинного мозга.

2.3.2. Гистологическое окрашивание тканей спинного мозга 64 мышей.

2.3.3. Иммуногистохимический анализ криосрезов спинного и 65 головного мозга мышей с травмой спинного мозга.

2.4. Экспериментальные животные и модель инсульта.

2.4.1. Поведенческое тестирование крыс с инсультом.

2.4.2. Магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга 68 крыс.

2.4.3. Иммуногистохимический анализ распределения меченых 69 человеческих МСК в организме крыс.

2.5. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1.1 Влияние магнитных микросфер на уровень пролиферации 71 МСК в культуре.

3.1.2. Эффективность мечения МСК магнитными 72 микрочастицами.

3.1.3. Анализ гибели меченых микрочастицами МСК в культуре.

3.1.4.Нейрональная дифференцировка МСК in vitro.

3.2. Спинальная травма

3.2.1. Анализ смертности животных.

3.2.2. Анализ функционального восстановления животных.

3.2.3. Гистологический анализ спинного мозга после 85 трансплантации человеческих МСК.

3.2.4. Анализ миграции и нейрональной дифференцировки МСК 87 после трансплантации в зону травмы спинного мозга.

3.3. Ишемический инсульт

3.3.1. Магнитно-резонансная томография.

3.3.2. Оценка неврологического статуса

3.3.3. Тест «Открытое поле».

3.3.4. Тест «Крестообразный лабиринт».

3.3.5. Иммуногистохимический анализ криосрезов головного 99 мозга и внутренних органов крыс с ишемическим инсультом после трансплантации человеческих МСК, меченых магнитными флуоресцирующими микрочастицами.

3.3.6. Паракринный эффект трансплантированных человеческих 105 МСК при ишемии головного мозга у крыс.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Мечение человеческих плацентарных МСК магнитными 107 флуоресцирующими микрочастицами.

4.2. Спинальная травма.

4.3. Ишемический инсульт.

4.4. Хоуминг МСК.

4.5. Механизм действия МСК. 126 ВЫВОДЫ 130 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте."

Актуальность

Клеточная терапия в настоящее время рассматривается как перспективный и многообещающий метод лечения тяжелых заболеваний. Среди них важное место занимают цереброваскулярные и травматические поражения ЦНС, создающие острую медико-социальную проблему, наносящую огромный экономический ущерб обществу.

Инсульты, как наиболее частая форма острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК), ежегодно в мире поражают от 5,6 до 6,6 млн человек [1]. В течение первого года смертность от инсульта составляет около 50% заболевших [2]. Инсульт является основной причиной инвалидизации больных, т.к. у 80% выживших имеются ограничения трудоспособности в связи с сохраняющимися двигательными нарушениями. Треть из таких пациентов нуждается в посторонней помощи, и только 20% больных способны вернуться к более или менее нормальной жизни [1]. В последнее время наметилась тенденция к «омоложению» инсульта. Так, в последние годы не менее 20% ОНМК диагностируется у лиц трудоспособного возраста [3]. Это делает рассматриваемую патологию общественно значимой.

Травматическая болезнь спинного мозга (ТБСМ) приобрела чрезвычайную актуальность в связи с ростом технического прогресса, что привело к резкому увеличению частоты травматических поражений позвоночника и спинного мозга. По данным Всемирной организации здравоохранения, число больных с поражением спинного мозга составляет около 30 человек на 100 000 населения. В России численность больных с последствиями травматической болезни спинного мозга (ТБСМ) составляет порядка 8 тысяч человек [4]. При этом, зачастую пострадавшими является социально-активное, работоспособное и работающее население. В подавляющем большинстве случаев последствием тяжелых повреждений спинного мозга является инвалидизация пациентов, что ведет за собой стойкую утрату трудоспособности и, как следствие, значительные социальные и экономические потери.

Многочисленные экспериментальные исследования возможностей клеточной терапии в лечении данных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как методов, стимулирующих структурно-функциональное восстановление ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость.

Задачи исследования:

Научная новизна

Подобрана методика эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток магнитными флуоресцирующими микрочастицами, что позволило визуализировать МСК после трансплантации животным, как прижизненно, с помощью МРТ, так и постмортально, с использованием флюоресцентной микроскопии. Детально изучены возможные нежелательные эффекты этих частиц на функциональное состояние клеток в культуре.

Впервые изучены механизмы действия мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека, на эндоваскулярной модели инсульта у крыс и позвоночно-спинномозговой травмы у мышей. Показано восстановление неврологического дефицита у животных в обоих случаях повреждения ЦНС в эксперименте после трансплантации человеческих плацентарных клеток. При помощи МРТ показано достоверное уменьшение очага ишемии у опытных крыс, по сравнению с контрольными животными. Впервые была показана временная характеристика распределения меченых клеток в организме крыс с инсультом, свидетельствующая о том, что МСК проникают в мозг через сосуды, вокруг которых концентрируются в течение первых 7 дней. Затем происходит их миграция в зону ишемии, где они достигают максимальной концентрации к концу 3 недели. Впервые выявлена миграция меченых клеток в гиппокамп обоих полушарий мозга, как при инсульте, так и при спинальной травме. Впервые определена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием трансплантации МСК, выделенных из плаценты человека, у крыс с ишемией головного мозга. Также установлен факт дифференцировки МСК плаценты человека в нейроналыюм направлении после трансплантации грызунам с моделью инсульта и спинальной травмы.

Практическая значимость

Результаты исследования позволяют расширить и дополнить существующие представления о клеточной терапии заболеваний центральной нервной системы. Данная работа является частью обширных доклинических исследований терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических поражений спинного мозга и вносит определенный вклад в подготовку клинических испытаний и, в дальнейшем, внедрения в практическую медицину. Активное изучение механизмов действия МСК в доклиническом формате является залогом эффективного и безопасного применения их в будущем.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Кониева, Алина Аланбековна

выводы

1. Разработан метод мечения МСК плаценты человека магнитными флуоресцентными микрочастицами, обеспечивающий 90%-ую эффективность мечения и не влияющий на основные характеристики клеток в культуре -скорость пролиферации, способность к нейрогенной дифференцировке и жизнеспособность.

3. При внутривенном введении меченых человеческих МСК крысам с экспериментальным ишемическим инсультом, в течение первых суток после трансплантации они обнаруживаются во всех паренхиматозных органах. В течение 2 недель после трансплантации меченые МСК проникают в ткань головного мозга, формируют треки миграции, начинающиеся от кровеносных сосудов, и обнаруживаются в зоне ишемии и в гиппокампе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кониева, Алина Аланбековна, Москва

1. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская Л.В. Эпидемиология инсульта в России. Журн неврол и психиат (приложение «Инсульт») 2003; 8: 4—9.

2. Валикова Т.А., Алифирова В.М. Инсульт: этиология, патогенез, классификация, клинические формы, лечение и профилактика. Томск: СГМУ, 2003.- 44с.

3. Смертность населения Российской Федерации, 1998 г. (статистические материалы). М: Минздрав РФ 2006; - 36.

4. Протокол ведения больных с последствиями травм спинного мозга в восстановительном и позднем периоде/ Под ред. Сельцовского А.П. М.: Департамент здравоохранения г.Москвы, 2007; - 77.

5. Weissman I.L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and.units in' evolution. Cell. 2000; 100(1): 157-68.

6. Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 2005;19(10):1129-55.

7. Dalerba P., Cho R.W., Clarke M.F. Cancer stem cells: models and concepts. Annu Rev Med. 2007;58:267-84.

8. Ramalho-Santos M., Willenbring H. On the Origin of the Term "Stem Cell". Cell Stem Cell. 2007;l(l):35-8.

9. Maienschein J. Whose View of Life?: Embryos, Cloning, and Stem Cells. -Cambridge: Harvard University Press, 2003; 368.

10. Lichtman M.A., Williams W.J. Williams Hematology, 7th edn. New York: McGraw-Hill, 2006; - 2297.

11. Мяделец О.Д., Кичигина Т.Н., Грушин В.Н., Мяделец Н.Я., Мяделец М.О. А.А. Максимов и его революционное учение о мезенхимных стволовых клетках. Вест, витебского гос. мед. универ. 2007;6(3):139-147.

12. Becker AJ, McCulloch ЕА, Till JE. Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature. 1963; 197:452-4.

13. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N., Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev. 2003;17(1):126-40.

14. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K, Niwa H, Klewe-Nebenius D, Chambers I, Scholer H, Smith A Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 1998;95(3):379-91.

15. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 2003;113(5):643-55.

16. Цымбалюк В.И., Медведев B.B. Нейрогенные стволовые клетки. Киев: «Коваль», 2005; - 596.

17. Donovan P., Gearhart J. The end of beginning for pluripotent stem cells. Nature. 2001 ;414(6859):92-7.

18. Fuchs E., Segre J.A. Stem cells: anew lease on life. Cell. 2000;100(l):143-55.

19. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. Stem cells find their niche. Nature. 2001;414(6859):98-104.

20. Scadden D.T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 2006;441(7097): 1075-9.

21. Riquelme P.A., Drapeau E., Doetsch F. Brain micro-ecologies: neural stem cell niches in the adult mammalian brain. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2008;363(1489): 123-37.

22. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 2007;9(1):204-13.

23. Lapidot Т., Kollet O. The essential roles of the chemokine SDF-1 and its receptor CXCR4 in human stem cell homing and repopulation of transplanted immune-deficient NOD/SCID and NOD/SCID/B2m(null) mice. Leukemia. 2002;16(10): 1992-2003.

24. Xie Y., Yin Т., Wiegraebe W. et al. Detection of functional haematopoietic stem cell niche using real-time imaging. Nature. 2009;457(7225):97-101.

25. Lo Celso C., Fleming H.E., Wu J.W. et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 2009;457(7225):92-6.

26. Vaananen HiK. Mesenchymal stem cells. Ann Med. 2005;37(7):469-79.

27. Jones E., McGonagle D. Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo. Rheumatology. 2008;47(2): 126-31.

28. Sell S. Stem cell handbook. Totowa: Humana Press, 2003; - 528

29. Haniffa MA, Collin MP, Buckley CD, Dazzi F. Mesenchymal stem cells: the fibroblasts' new clothes? Haematologica. 2009;94(2):258-63.

30. Owen M, Friedenstein AJ. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp. 1988;136:42-60.

31. Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1991; 9(5): 641-50

32. Токин Б. П., Общая эмбриология, 2 изд., М.: Высшая школа, 1970; 508.

33. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411):143-7.

34. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S., Satomura K., Bianco P., Robey P.G. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol. 2001 May 28; 153(5): 1133-40.

35. Bieback K., Kern S., Kluter H., Eichler H. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells. 2004;22(4):625-34.

36. Igura K., Zhang X., Takahashi K., Mitsuru A., Yamaguchi S., Takashi T.A. Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from chorionic villi of human placenta. Cytotherapy. 2004;6(6):543-53.

37. Tsai M.S., Lee J.L., Chang Y.J., Hwang S.M. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum Reprod. 2004; 19(6): 1450-6.

38. Warejcka D.J., Harvey R., Taylor B.J., Young H.E., Lucas P. A. A population of cells isolated from rat heart capable of differentiation into several mesodermal phenotypes. J Surg Res. 1996;62(2):233-42.

39. Young H.E., Mancini M.L., Wright R.P., Smith J.C., Black A.C. Jr, Reagan C.R., Lucas P.A. Mesenchymal stem cells reside within the connective tissues of many organs. DevDyn. 1995;202(2): 137-44.

40. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., Shang H., Ogle R.C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 2005;23(3):412-23.

41. Fickert S., Fiedler J., Brenner R.E. Identification, quantification and isolation of mesenchymal progenitor cells from osteoarthritic synovium by fluorescence automated cell sorting. Osteoarthritis Cartilage. 2003;11(11):790-800.

42. Hu Y., Liao L., Wang Q., Ma L., Ma G., Jiang X., et al. Isolation and identification of mesenchymal stem cells from human fetal pancreas. J Lab Clin Med. 2003;141(5):342-9.

43. Blashki D, Short B, Bertoncello I, Simmons PJ, Brouard N: Identification of stromal MSC candidates from multiple adult mouse tissues. Int Soc Stem Cell Res 4th Annual Meeting 2006: 206.

44. Shi S., Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Bone Miner Res. 2003;18(4):696-704.

45. Doherty M.J., Canfield A.E. Gene expression during vascular pericyte differentiation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 1999;9(1):1-17.

46. Gronthos S., Graves S.E., Ohta S., Simmons P.J. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. Blood. 1994;84(12):4164-73.

47. Jackson L., Jones D.R., Scotting P., Sottile V. Adult mesenchymal stem cells: Differentiation potential and therapeutic applications. J Postgrad Med. 2007;53(2): 121-7.

48. Covas D.T., Siufi J.L., Silva A.R., Orellana M.D. Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells Braz J Med Biol Res. 2003;36(9): 1179-83.

49. Phinney D.G., Prockop D.J. Concise Review: Mesenchymal Stem/Multipotent Stromal Cells: The State of Transdifferentiation and Modes of Tissue Repair—Current Views. Stem Cells. 2007;25(11):2896-902.

50. Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. ProcNatl Acad Sci USA. 1999;96(19):10711-6.

51. Munoz-Elias G., Marcus A.J., Coyne T.M., Woodbury D., Black I.B. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: Engraftment, migration, differentiation, and long-term survival. J Neurosci. 2004;24(19):4585-95.

52. Chen Y., Teng F.Y., Tang B.L. Coaxing bone marrow stromal mesenchymal stem cells towards neuronal differentiation: Progress and uncertainties. Cell Mol Life Sci. 2006;63(14): 1649-57.

53. Lu P., Blesch A., Tuszynski M.H. Induction of bone marrow stromal cells to neurons: differentiation, transdifferentiation, or artifact? J Neurosci Res. 2004;77(2): 174-91.

54. Padovan C.S., Jahn K., Birnbaum Т., Reich P., Sostak P., Strupp M, Straube A, Expression of neuronal markers in differentiated marrow stromal cells and CD 133+ stemlike cells. Cell Transplant. 2003;12(8):839-48.

55. Zhang H., Wang J.Z., Sun H.Y., Zhang J.N., Yang S.Y. The effects of GM1 and bFGF synergistically inducing adult rat bone marrow stromal cells to form neural progenitor cells and their differentiation. Chin J Traumatol. 2004;7(l):3-6.

56. Reh T.A. Neural stem cells: form and function, Nat Neurosci. 2002;5(5):392-4.

57. Wislet-Gendebien S, Hans G, Leprince P, Rigo JM, Moonen G, Rogister B. Plasticity of cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin-positive to excitable neuron-like phenotype. Stem Cells. 2005;23(3):392-402.

58. Eichna D.M., Brown K.S., Breen A., Dean R.B. Mucormycosis: a rare but serious infection. Clin J Oncol Nurs. 2008; 12(1): 108-12.

59. D'Ippolito G., Schiller P.C., Ricordi C., Roos B.A., Howard G.A. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow. J Bone Miner Res. 1999; 14(7): 1115-22.

60. Mareschi K., Ferrero I., Rustichelli D., Aschero S., Gammaitoni L., Aglietta M., Madon E,. Fagioli F. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. J Cell Biochem. 2006 Mar l;97(4):744-54.

61. Гистология, цитология и эмбриология/ Под ред. Ю.И.Афанасьева, Кузнецова СЛ., Юриной Н.А. 6-е изд. - М.: Медицина, 2004; - 768.

62. Benirschke К., Kaufmann P. Pathology of the human placenta. — New York: Springer-Verlag, 2000. — 947 c.

63. Evangelista M., Soncini M., Parolini O. Placenta-derived stem cells: new hope for cell therapy? Cytotechnology. 2008;58(l):33-42.

64. Ilancheran S., Michalska A., Peh G., Wallace E.M., Рега M., Manuelpillai U. Stem cells derived from human fetal membranes display multi-lineage differentiation potential, Biol Reprod. 2007;77(3):577-88.

65. Koyano S., Fukui A., Uchida S., Yamada K., Asashima M., SakuragawaN. Synthesis and release of activin and noggin by cultured human amniotic epithelial cells. Dev Growth Differ. 2002;44(2):103-12.

66. Liu Т., Wu J., Huang Q., Hou Y., Jiang Z., Zang S., Guo L. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 2008;29(5):603-ll.

67. Sakuragawa N., Kakinuma K., Kikuchi A., Okano H., Uchida S., Kamo I., Kobayashi M., Yokoyama Y. Human amnion mesenchyme cells express phenotypes of neuroglial progenitor cells. J Neurosci Res. 2004;78(2):208-14.

68. Alviano F., Fossati V., Marchionni C., Arpinati M., Bonsi L., Franchina M., Lanzoni G., Cantoni S., Cavallini C., Bianchi F., Tazzari P.L., Pasquinelli G., Foroni L., Ventura

69. C., Grossi A., Bagnara G.P. Term Amniotic membrane is a high throughput source for multipotent Mesenchymal Stem Cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Dev Biol. 2007;7:11.

70. Wei J.P., Zhang T.S., Kawa S., Aizawa Т., Ota M., Akaike Т., Kato K., Konishi I., Nikaido T. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 2003;12(5):545-52.

71. Kaviani A., Perry Т.Е., Barnes C.M., Oh J.T., Ziegler M.M., Fishman S.J., Fauza

72. D.O. The placenta as a cell source in fetal tissue engineering. J Pediatr Surg. 2002;37(7):995-9.

73. Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., Smirnov V.N. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells. 2003;21(1):105-10.

74. Yen B.L., Chien C.C., Chen Y.C., Chen J.T., Huang J.S., Lee F.K., Huang H.I. Placenta-derived multipotent cells differentiate into neuronal and glial cells in vitro. Tissue Eng Part A. 2008;14(1):9-17.

75. Chang C.M., Kao C.L., Chang Y.L,. Yang M.J., Chen Y.C., Sung B.L., Tsai Т.Н., Chao K.C., Chiou S.H., Ku H.H. Placenta-derived multipotent stem cells induced to differentiateinto insulin-positive cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;357(2):414-20.

76. Chien C.C, Yen B.L., Lee F.K., Lai Т.Н., Chen Y.C., Chan S.H., Huang H.I. In vitro differentiation of human placenta-derived multipotent cells into hepatocyte-like cells. Stem Cells. 2006;24(7): 1759-68.

77. Altman J., Das G.D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J Comp Neurol. 1965; 124(3):319-35.

78. Arvidsson A., Collin Т., Kirik D., Kokaia Z., Lindvall O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med. 2002;8(9):963-70.

79. Jin K., Wang X., Xie L., Мао X.O., Zhu W., Wang Y., Shen J., Mao Y., Banwait S., Greenberg D.A. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(35).T 3198-202

80. Blau H.M., Brazelton T.R., Weimann J.M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? Cell.,2001; 105(7):829-41.

81. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Платонова И.А. Терапия ишемического инсульта. Consilium Medicum. 2003; 5(8):466-473.

82. Мамчур В.И., Дронов С.Н., Жилюк В.И. Церебропротекция: возможности медикаментозной защиты ишемизированного мозга. Рацюнальна фармакотератя, 2008,3:1-7.

83. Fisher М., Bogousslavsky J. Current Review of Cerebrovascular Disease. 2nd ed. -Philadelphia: Current Medicine; 1996; - 237.

84. Жданов Г.Н., Герасимова M.M., Антипина Ю.В. Изучение антител к нейротрофинам у больных с ишемическим и геморрагическим инсультами. Неврологический вестник, 2004;XXXVI(3-4):17-19.

85. Gwag B.J., Canzoniero L.M., Sensi S.L., Demaro J.A, Koh JY, Goldberg MP, Jacquin M, Choi DW. Calcium ionophores can induce either apoptosis or necrosis in cultured cortical neurons. Neuroscience. 1999;90(4): 1339-48.

86. Takeda A., Onodera H., Yamasaki Y., Furukawa K., Kogure K., Obinata M., Shibahara S. Decreased expression of neurotrophin-3 mRNA in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia. Brain Res. 1992;569(1): 177-80.

87. Schabitz W.-R., Schwab S., Spranger M., Hacke W. Intraventricular brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size after focal cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 1997;17(5):500-6.

88. Gross C.E., Howard D.B., Dooley R.H., Raymond S.J., Fuller S., Bednar M.M. TGF-beta 1 post-treatment in a rabbit model of cerebral ischaemia. Neurol Res. 1994;16(6):465-70.

89. Yoshimura S., Takagi Y., Harada J., Teramoto Т., Thomas S.S., Waeber C., Bakowska J.C., Breakefield X.O., Moskowitz M.A. FGF-2 regulation of neurogenesis in adult hippocampus after brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98(10):5874-9.

90. Teramoto Т., Qiu J., Plumier J.C., Moskowitz M.A. EGF amplifies the replacement of parvalbumin-expressing striatal interneurons after ischemia. J Clin Invest. 2003; 111 (8): 1125-32.

91. Ahn S., Joyner A.L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to sonic hedgehog. Nature. 2005;437(7060):894-7.

92. Robin A.M., Zhang Z.G., Wang L., Zhang R.L., Katakowski M., Zhang L., Wang Y., Zhang C., Chopp M. Stromal cell-derived factor 1 alpha mediates neural progenitor cell motility after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 2006;26(1): 12534.

93. Parent J.M., Vexler Z.S., Gong C., Derugin N., Ferriero D.M. Rat forebrain neurogenesis and striatal neuron replacement after focal stroke. Ann Neurol. 2002;52(6):802-13.

94. Monje M.L., Toda H., Palmer T.D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 2003;302(5651): 1760-5.

95. Lindvall O, Kokaia Z. Recovery and rehabilitation in stroke: stem cells. Stroke. 2004 Nov;35(l 1 Suppl l):2691-4.

96. Ohab J.J., Fleming S., Blesch A., Carmichael S.T. A neurovascular niche for neurogenesis after stroke. J Neurosci. 2006;26(50):13007-16.

97. Tsai P.T., Ohab J.J., Kertesz N., Groszer M., Matter C., Gao J., Liu X., Wu H., Carmichael S.T. A critical role of erythropoietin receptor in neurogenesis and post-stroke recovery. J Neurosci. 2006;26(4): 1269-74.

98. Greenberg D.A., Jin K. Growth factors and stroke. NeuroRx. 2006;3(4):458-65.

99. Bliss Т., Guzman R., Daadi M., Steinberg G.K. Cell transplantation therapy for stroke Stroke. 2007;38(2 Suppl):817-26.

100. Andrews P.W., Damjanov I., Simon D., Banting G.S., Carlin C., Dracopoli N.C., Fogh J. Pluripotent embryonal carcinoma clones derived from the human teratocarcinoma cell line tera-2: differentiation in vivo and in vitro. Lab Invest. 1984;50(2): 147-62.

101. Kleppner S.R., Robinson K.A., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Transplanted human neurons derived from a teratocarcinoma cell line (ntera-2) mature, integrate, and survive for over 1 year in the nude mouse brain. J Comp Neurol. 1995;357(4):618-32.

102. Saporta S., Borlongan C.Y., Sanberg P.R. Neural transplantation of human neuroteratocarcinoma (hNT) neurons into ischemic rats: a quantitative dose-response analysis of cell survival and behavioral recovery. Neuroscience. 1999;91(2):519-25.

103. Newman M.B., Emerich D.F., Borlongan C.V., Sanberg C.D., Sanberg P.R. Use of human umbilical cord blood (FIUCB) cells to repair the damaged brain. Curr Neurovasc Res. 2004;1(3):269-81.

104. Castro R.F., Jackson K.A., Goodell M.A., Robertson C.S., Liu H., Shine H.D. Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. Science. 2002;297(5585):1299.

105. Newman M.B., Willing A.E., Manresa J.J., Davis-Sanberg C., Sanberg P.R. Stroke-induced migration of human umbilical cord blood cells: time course and cytokines. Stem Cells Dev. 2005;14(5):576-86.

106. Vendrame M., Gemma C., de Mesquita D., Collier L., Bickford P.C., Sanberg C.D., Sanberg P.R., Pennypacker K.R., Willing A.E. Anti-inflammatory effects of human cord blood cells in a rat model of stroke. Stem Cells Dev. 2005;14(5):595-604.

107. Roybon L., Ma Z., Asztely F., Fosum A., Jacobsen S.E., Brundin P., Li J.Y. Failureof transdifferentiation of adult hematopoietic stem cells into neurons. Stem Cells,j 2006;24(6): 1594-604.

108. Li Y., Chen J., Chen X.G., Wang L., Gautam S.C., Xu Y.X., Katakowski M., Zhang L.J., Lu M., Janakiraman N., Chopp M. Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat: neurotrophins and functional recovery. Neurology. 2002 27;59(4):514-23.

109. Borlongan C.V., Hadman M., Sanberg C.D., Sanberg P.R. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke. Stroke. 2004;35(10):2385-9.

110. Toda H., Takahashi J., Iwakami N., Kimura Т., Hoki S., Mozumi-Kitamura K., Ono S., Hashimoto N. Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats. Neurosci Lett. 2001;316(1):9-12.

111. Bacigaluppi M., Pluchino S., Martino G., Kilic E., Hermann D.M: Neural stem/precursor cells for the treatment of ischemic stroke. J Neurol Sci. 2008;265(l-2):73-7.

112. Vora N., Jovin Т., Kondziolka D. Cell transplantation for ischemic stroke. Neurodegener Dis. 2006;3( 1 -2): 101 -5.

113. Li Y., Chen J., Zhang C.L., Wang L., Lu D., Katakowski M., Gao Q., Shen L.H., Zhang J., Lu M., Chopp M. Gliosis and brain remodeling after treatment of stroke in rats with marrow stromal cells. Glia. 2005;49(3):407-17.

114. Carmichael S.T. Cellular and molecular mechanisms of neural repair after stroke: making waves. Ann Neurol. 2006;59(5):735-42.

115. Xiao J., Nan Z., Motooka Y., Low W.C. Transplantation of a novel' cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev. 2005;14(6):722-33.

116. Shen L.H., Li Y., Chen J., Zhang J., Vanguri P., Borneman J., Chopp M. Intracarotid transplantation of bone marrow stromal cells increases axon-myelin remodeling after stroke. Neuroscience. 2006;137(2):393-9.

117. Shetty A.K., Zaman V., Hattiangady B. Repair of the injured adult hippocampus through graft-mediated modulation of the plasticity of the dentate gyrus in a rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci. 2005;25(37):8391-401.

118. Zhang Z.G, Zhang L., Jiang Q., Chopp M. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells participate in cerebral neovascularization after focal cerebral ischemia in the adult mouse. Circ Res. 2002;90(3):284-8.

119. Chen J., Zhang Z.G., Li Y„ Wang L., Xu Y.X., Gautam S.C., Lu M., Zhu Z., Chopp M. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ Res. 2003;92(6):692-9.

120. Shyu W.C., Lin S.Z., Chiang M.F., Su C.Y., Li H. Intracerebral peripheral blood stem cell (CD34+) implantation induces neuroplasticity by enhancing betal integrin-mediated angiogenesis in chronic stroke rats. J Neurosci. 2006;26(13):3444-53.

121. Kondziolka D., Wechsler L., Goldstein S., Meltzer C., Thulborn K.R., Gebel J., Jannetta P., DeCesare S., Elder E.M., McGrogan M., Reitman M.A. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. Neurology. 2000;55(4):565-9.

122. Savitz S.I., Dinsmore J., Wu J., Henderson G.V., Stieg P., Caplan L.R. Neurotransplantation of fetal porcine cells in patients with basal ganglia infarcts: a preliminary safety and feasibility study. Cerebrovasc Dis. 2005;20(2): 101-7.

123. Bang O.Y., Lee J.S., Lee P.H., Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol. 2005;57(6):874-82.

124. Лечение и реабилитация пациентов с травматической болезнью спинного мозга. Реабилитация инвалидов с нарушением функций опоры и движения. Под ред. JI.B. Сытина, F.K. Золоева, Е.М. Васильченко. Новосибирск, 2003. - 384.

125. Брюховецкий А.С.,. Менткевич ГЛ., Зайцев А.Ю., Лаврентьев А.В., Долгополов И.С. и соавт. Лечение травматической болезни спинного мозга сиспользованием клеточных технологий. (электронный ресурс) http://www.neurovita.ru/reports/rusreportO 11 .htm.

126. Amar А.Р., Levy М. Pathogenesis and pharmacological strategies for mitigating secondary damage in acute spinal cord injury. Neurosurgery. 1999;44(5): 1027-39.

127. Agrawal S.K., Fehlings M.G. Role of NMDA and non-NMDA ionotropic glutamate receptors in traumatic spinal cord axonal injury. J Neurosci. 1997;17(3): 1055-63.

128. Tator C.H., Fehlings M.G. Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms. J Neurosurg. 1991;75(l):15-26.

129. Young W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 1993;1 l(Suppl 1): 13-22.

130. Шлапак И.П., Баран Ю.В., Лисянский M.C. Спинальная травма: патофизиологические и клинические аспекты. УкраТньский медичний часопис. 2002; 5(31) IX-X: 39-44.

131. Carlson GD, Minato Y, Okada A, Gorden CD, Warden KE, Barbeau JM'.Biro CL, Bahnuik E, Bohlman FIH, Lamanna JC. Early time-dependent decompression for spinal cord injury: vascular mechanisms of recovery. J Neurotrauma. 1997;14(12):951.-62.

132. Choi D.W. Calcium-mediated neurotoxicity: relationship to specific channel types and role in ischemic damage. Trends Neurosci. 1988;11(10):465-9.

133. Lipton S.A., Rosenberg P.A. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med. 1994;330(9):613-22.

134. Christie S.D., Comeau В., Myers Т., Sadi D., Purdy M., Mendez I. Duration of lipid peroxidation after acute spinal cord injury in rats and the effect of methylprednisolone. Neurosurg Focus. 2008;25(5):E5.

135. Hausmann O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 2003;41(7):369-78.

136. Durieux M.E. Pathophysiology of cerebral inflammation: Abstr. Euro-Neuro 2000: Second International Update on Neuro-Anaesthesia and Neuro-Intensive Care, Genk, 2-5 Febr., 2000 // Eur. J. Anaesthesiol. 2000; 17(Suppl. 18):7-8.

137. Борщенко И.А., Басков A.B., Коршунов А.Г., Сатанова Ф.С. Некоторые аспекты патофизиологии травматического повреждения и регенерации спинного мозга. Вопр. нейрохир. 2000;2:28-31. (Электронный ресурс) http://sci-rus.com/pathology/index.htm.

138. Taoka Y., Okajima К. Role of leucocytes in spinal cord injury in rats. J Neurotrauma. 2000; 17(3):219-29.

139. Watanabe T, Yamamoto T, Abe Y, Saito N, Kumagai T, Kayama H. Differential activation of microglia after experimental spinal cord injury. J Neurotrauma. 1999;16(3):255-65.

140. Schnell L, Fearn S, Klassen H, Schwab ME, Perry VH. Acute inflammatory responses to mechanical lesions in the CNS: differences between brain and spinal cord. Eur. Eur J Neurosci. 1999;ll(10):3648-58.

141. Баснакьян А.Г., Басков A.B., Соколов H.H., Борщенко И.А. Апоптоз при травматическом повреждении спинного мозга: перспективы фармакологической коррекции. Вопр. Мед. химии. 2000;5. (электронный ресурс) -http://medi.ru/pbmc/8800501 .htm.

142. Casha S., Yu W.R., Fehlings M.G. Oligodendroglial apoptosis occurs along degenerating axons and is associated with FAS and p75 expression following spinal cord injury in the rat. Neuroscience. 2001;103(1):203-18.

143. Emery E, Aldana P, Bunge MB, Puckett W, Srinivasan A, Keane RW, Bethea J, Levi AD. Apoptosis after traumatic human spinal cord injury. J Neurosurg. 1998;89(6):911-20.

144. Cao F.-j., Feng S.-q: Human, umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury. Chinese Medical. Journal, 2009;122(2):225-231.

145. Zurita M., Vaquero J. Functional recovery in chronic paraplegia after bone marrow stromal cells transplantation. Neuroreport., 2004;15(7):1105-1108.

146. Vaquero J., Zurita M., Oya S., Santos M. Cell therapy using bone marrow stromal cells in chronic paraplegic rats: systemic or local administration? Neurosci Lett. 2006;398(l-2): 129-34.

147. Liang H., Liang P., Xu Y., Wu J., Liang Т., Xu X. DHAM-BMSC matrix.promotes axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury in adult rats. J. Neurotrauma, 2009;26( 10): 1745-57.

148. Reier P.J. Cellular transplantation strategies for spinal cord injury and translational neurobiology. NeuroRx. 2004;1(4):424-51.

149. Moviglia G.A., Varela G., Gaeta C.A., Brizuela J.A., Bastos F., Saslavsky J. Autoreactive T cells induce in vitro BM mesenchymal stem cell transdifferentiation to neural stem cells. Cytotherapy. 2006;8(3): 196-201.

150. Callera F., do Nascimento R.X. Delivery of autologous bone marrow precursor cells into the spinal-cordsvia lumbar puncture technique in patients with spinal cord injury: A preliminary safety study. ExpHematol. 2006;34(2): 130-1.

151. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(l-2):55-63.

152. Basso DM, Fisher LC, Anderson AJ, Jakeman LB, McTigue DM, Popovich PG. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 2006;23(5):635-59

153. Takano K., Tatlisumak Т., Bergmann A.G., Gibson D.G. 3rd, Fisher M. Reproducibility and reliability of middle cerebral artery occlusion using a silicone-coated suture (Koizumi) in rats. J Neurol Sci. 1997;153(1):8-11

154. Shen L.H., Li.Y, Chen J., Zacharek A, Gao Q, Kapke A., Lu M.,.Raginsk K., Vanguri P., Smith A., Chopp M. Therapeutic benefit of bone marrow stromal cells administered 1 month after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 2007;27(1):6-13,.

155. Shapiro E. M., Skrtic S., Sharer K., Hill J.M., Dunbar C.E., Koretsky A.P. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101(30): 10901-6.

156. Lewin, M., Carlesso, N., Tung, C.H., Tang, X.W., Cory, D., Scadden, D. Т., Weissleder, R. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat Biotechnol. 2000; 18(4):410-4.

157. Etheridge SL, Spencer GJ, Heath DJ, Genever PG. Expression profiling and functional analysis of wnt signaling mechanisms in mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2004;22(5):849-60.

158. Deng J, Petersen BE, Steindler DA, Jorgensen ML, Laywell ED. Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation. Stem Cells. 2006;24(4): 1054-64.

159. Белова A.H. "Нейрореабилитация: Руководство для врачей". Москва, 2000. -566 с.

160. Патологическая физиология: Учебн. для студентов мед. Вузов / Под ред. Н.Н. Зайко и Ю.В. Быця. 3-е изд. - М.: МЕДпресс-информ, 2002 - 644 с.

161. Меламуд Э.Е. Прогнозирование течения и исходов при позвоночно-спинномозговой травмы / Нейротравматология: Под ред. А.Н.Коновалова, Л.Б.Лихтермана, А.А.Потапова.-М.: Вазар-Ферро, 1994.-С. 281.

162. Полищук Н.Е., Корж FI.A. Повреждения позвоночника и спинного мозга.: Книга плюс. 2001 г., 388 стр.

163. Курилец И. П., Полещук Н. Е., Колесников Г. Ф. Восстановление функции мочевого пузыря при позвоночно-спинномозговой травме: Методические рекомендации. — Киев, 1989. — 22.

164. Нейротравматология. Справочник. Под ред. А.Н. Коновалова, Л.Б. Лихтермана, А.А. Потапова. М.: Феникс, 1994. 567.

165. Fitch МТ, Silver J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 2008;209(2):294-301.

166. Miller RH; Bai L, Lennon DP, Caplan Al, The potential of mesenchymal stem cells for neural repair. Discov Med. 2010;9(46):236-42.

167. Deans R., Moseley A. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol. 2000;28(8):875-84.

168. Cook MM, Kollar K, Brooke GP, Atkinson K. Cellular therapy for repair of cardiac damage after acute myocardial infarction. Int J Cell Biol. 2009;2009:906507.

169. Chen X, Li Y, Wang L, Katakowski M, Zhang L, Chen J, Xu Y, Gautam SC, Chopp M. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology. 2002;22(4):275-9.

170. Ярыгин B.H., Банин B.B. и Ярыгин К.Н. Регенерация спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомии: восстановление анатомической целостности спинного мозга. Морфология, 2005;127(2):39-43

171. Vanquero J., Zurita М., Оуа S., Santos М. Cell therapy using bone marrow stromal cells in chronic paraplegic rats: Systemic or local administration? Neurosci Lett. 2006;398( 1-2): 129-34.

172. Chopp M, Zhang XH, Li Y, Wang L, Chen J, Lu D, Lu M, Rosenblum-M. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation. Neuroreport. 2000;11(13):3001-5.

173. Urdzikova L, Jendelova P., Glogarova K. et al. Transplantation of bone marrow stem cells as well as mobilization by granulocyte-colony stimulating factor promotes recovery after spinal cord injury in rats. J. Neurotrauma 2006; 23(9): 1379-91.

174. Cizkova D., Rosocha J., Vanicky I. et al. Transplants of Human Mesenchymal Stem Cells Improve Functional Recovery After Spinal Cord Injury in the Rat. Cell. Mol. Neurobiol. 2006; 26(7-8):l 165-78.

175. Терновой С. К., Синицын В. Е., Беличенко О. И., Стукалова О. В. Клиническое применение магнитно-резонансной томографии. РМЖ. 1996;3(7). электронный ресурс. Код доступа: http://www.rmj.ru/articles3305.htm

176. Коновалов А.Н. Корниено В.Н. Пронин И.Н. Магнитно-ядерный резонанс в нейрохирургии. М.: «Видар», 1997г. - 472.

177. Liu J, Solway K, Messing RO, Sharp FR. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci. 1998;18(19):7768-78.

178. Li Y, Chen J, Wang L, Lu M, Chopp M. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells. Neurology. 2001;56( 12): 1666-72.

179. Lu D, Li Y, Wang L, Chen J, Mahmood A, Chopp M. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2001;18(8):813-9.

180. Ji JF, He BP, Dheen ST, Tay SS. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury. Stem Cells. 2004;22(3):415-27.

181. Strieter R.M., Belperio J.A., Keane M.P. CXC chemokines in angiogenesis related to pulmonary fibrosis. Chest. 2002 Dec; 122(6 Suppl):298S-301S

182. Григорян A.C. Роль миграционной оси SDF-1-CXCR4 в хоуминге клеток предшественников и метастазировании злокачественных опухолей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006;4(6):32-38.

183. Nagasawa Т, Hirota S, Tachibana К, Takakura N, Nishikawa S, Kitamura Y, Yoshida N, Kikutani H, Kishimoto T. Defects of B-cell lymphopoiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1. Nature. 1996;382(6592):635-8.

184. Misao Y, Takemura G, Arai M, Ohno T, Onogi H, Takahashi T, Minatoguchi S, Fujiwara T, Fujiwara H. Importance of recruitment of bone marrow-derived CXCR4+ cells in post-infarct cardiac repair mediated by G-CSF. Cardiovasc Res. 2006;71(3):455-65.

185. Zou YR, Kottmann AH, Kuroda M, Taniuchi I, Littman DR. Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and the cerebellar development. Nature. 1998;393(6685):595-9.

186. Shekaari M. A., Panahi M., Vaghefi S.H.E., Zadeh A.A.D.N. Ultrastructural study of neuronal death in rat hippocampus after transient and permanent focal cerebral ischemia. Yakhteh Medical Journal. 2009;1 l(l):23-28.

187. Greco SJ, Rameshwar P. Microenvironmental considerations in the application of human mesenchymal stem cells in regenerative therapies. Biologies. 2008;2(4):699-705.

188. Bagri A, Gurney T, He X, Zou YR, Littman DR, Tessier-Lavigne M, Pleasure SJ. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 2002;129(18):4249-60.

189. Tran PB, Banisadr G, Ren D, Chenn A, Miller RJ. Chemokine receptor expression by neural progenitor cells in neurogenic regions of mouse brain. J Comp Neurol. 2007;500(6): 1007-33.

190. Bhattacharyya B.J., Banisadr G., Jung H., Ren D., Cronshaw D.G., Zou Y., Miller R.J. The Chemokine Stromal Cell-Derived Factor-1 Regulates GABAergic Inputs to Neural Progenitors in the Postnatal Dentate Gyrus. J Neurosci. 2008;28(26):6720-6730.

191. Гилерович Е.Г., Отеллин В.А. Трансплантация эбриональной нервной ткани как модель изучения ранних этапов становления центральной нервной системы. Успехи физиологических наук. 2001;1:38-47.

192. Chavakis Е, Urbich С, Dimmeler S. Homing and engraftment of progenitor cells: a prerequisite for cell therapy. J Mol Cell Cardiol. 2008;45(4):514-22.

193. Karp JM, Leng Teo GS. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 2009;4(3):206-16.

194. Toma C, Wagner WR, Bowry S, Schwartz A, Villanueva F. Fate of culture-expanded mesenchymal stem cells in the micro vasculature: in vivo observations of cell kinetics. CircRes. 2009;104(3):398-402.

195. Steingen C, Brenig F, Baumgartner L, Schmidt J, Schmidt A, Bloch W. Characterization of key mechanisms in transmigration and invasion of mesenchymal stem cells. J Mol Cell Cardiol. 2008;44(6): 1072-84.

Информация о работе

Кониева, Алина Аланбековна
кандидата медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы