Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие гипотермии и церебрамина на нейромедиаторный баланс крыс при окклюзии сонных артерий

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Действие гипотермии и церебрамина на нейромедиаторный баланс крыс при окклюзии сонных артерий"

На правах рукописи

/I

Айдунбеков Фарух Тахпрович

ДЕЙСТВИЕ ГИПОТЕРМИИ И ЦЕРЕБРАМИНА НА ИЕЙРОМЕДИАТОРНЫЙ БАЛАНС КРЫС ПРИ ОККЛЮЗИИ СОННЫХ

АРТЕРИЙ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Ростов-на-Дону 2013

005541705

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Дагестанский государственный университет».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Эмирбеков Эмирбек Зиядович

Официальные оппоненты:

Менджернцкнй Александр Маркович

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии и физиологии детей и подростков (г. Ростов-на-Дону)

Олемпиева Елена Владимировна

доктор медицинских наук, руководитель научно-консультативной группы МУМЦ медико-санитарной части УФСБ России по Ростовской области (г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация:

Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Росмедтехнологии (РНИИАП)

Защита диссертации состоится « 20 » декабря 2013 г. в « 11.00 » часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт. зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.

Автореферат разослан «_» ноябрь 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с.

Е.В. Асланян

Актуальность. В последние годы отмечен рост распространенности сосудистых заболеваний, в том числе, острых нарушений мозгового кровообращения. Инсульт ежегодно в мире переносят около 6 млн. человек. Особенно актуальной эта проблема является в связи с увеличением распространенности инсульта у лиц работоспособного возраста (Яхно, Парфенов, 2000). Данное заболевание является основной причиной инвалидизации населения и только 20% выживших после перенесенного инсульта людей могут вернуться к прежней работе. Окклюзия магистральных сосудов приводит к общесистемным нарушениям метаболизма, приводящим к эндотелиальной дисфункции, изменению гемодинамики, реологических свойств крови, развитию тромбозов (Дамбинова и соавт., 2003).

Физиологической основой развития ишемического и реперфузионного повреждений мозга является нарушение его кровоснабжения (Bari et al., 1998; Thompson, 1976). Ишемия мозга провоцирует энергетическое голодание мозговой ткани, повреждение мембран клеток мозга и нарушения в метаболизме нейромедиаторных аминокислот вследствие высокой реактивности свободных радикалов кислорода (Даудова 2006; Даудова JI. А. Даудова Т.Н., 2006). В результате данных изменений, в нейронах и глиальных клетках головного мозга нарушаются процессы рецепторного связывания (Гусев и соавт., 1999; Гусев, Скворцова, 2001; Bilenko, 2001). Наряду с этим, ишемические и реперфузионные изменения мозга способствуют аккумуляции повреждений в структуре ДНК в результате окислительного стресса, что в дальнейшем приводит к запуску процесса гибели клеток (Luo et al., 2007). Каскад реакций при ишемических/реперфузионных нарушениях мозга сопровождается гипертермией, что усугубляет степень повреждений нейронов мозга (Noor et al., 2005).

В то же время, умеренная гипотермия на фоне или сразу после церебральной ишемии оказывает нейропротективное действие за счет снижения окислительных повреждений метаболизма (Ji et al., 2007), повышения выживаемости нейронов в результате снижения активности проапоптотических и некротических факторов (Van Hemelrijck et al., 2005). Гипотермическое воздействие влияет и на нейромедиаторные системы мозга (Эмирбеков и соавт., 2011).

Таким образом, температура является одним из наиболее значимых факторов, определяющих функциональное состояние мозга. Даже при повышении температуры на 0,5°С наблюдается значительное снижение шансов больного на выживание (Киншт и соавт., 2006). Температура тела больного влияет на развитие инсульта и на размер инфарктной зоны мозга. Установлено, что действие высокой температуры во время острой фазы ишемии мозга опосредовано через выброс глутамата и глицина (Chio et al., 2007). При температуре выше 38°С при развитии инсульта или ишемии головного мозга резко снижаются шансы больных на выживание (Hsu et al., 2006).

При этом, несмотря на огромное количество работ в области применения гипотермии, механизмы, лежащие в основе ее протекторных свойств при ишёмиче-ских/гипоксических повреждениях мозга, изучены недостаточно.

В настоящее время изучается вопрос изменения температуры мозга в зависимости от интенсивности мозгового кровообращения (71ш й а1., 2002). Решение данной проблемы может привести к выявлению критерия устойчивости организма к нарушению мозгового кровообращения (НМК).

Каскад метаболических реакций в мозге при нарушении его кровоснабжения прослеживают в различных исследованиях на клеточных культурах и экспериментальных моделях на животных. Так, продемонстрирована эффективность антагонистов глутаматовых рецепторов, кальций-стабилизирующих соединений и антиокси-дантов, введение которых приводит к снижению ишемического повреждения нейронов (Хазанов и соавт., 1989; ВПепко, 1999; Шмырев и соавт., 1999; Гусев, Скворцова, 2003; Аврова и соавт., 2003).

В связи с изложенным, в экспериментальных моделях и клинических испытаниях важна разработка комбинированной патофизиологически значимой терапии с количественной оценкой обратимости повреждений мозга при ишемии/гипоксии (Фишер, Шебитз, 2000).

Применение сочетанного действия умеренной гипотермии и препаратов-нейропротекторов на фоне нарушения мозгового кровообращения является актуальным в решении вопроса об эффективности снижения последствий ишемическо-го/реперфузионного повреждения мозга.

Целью данного исследования явилось изучение влияния умеренной гипотермии и введения церебрамина на метаболические процессы в мозге и крови крыс, подвергнутых двусторонней окклюзии сонных артерий разной продолжительности.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить эффекты гипотермии и окклюзии сонных артерий на показатели свободнорадикального окисления в структурах мозга крыс.

2. Изучить влияние окклюзии сонных артерий и гипотермии на содержание аминокислотных и моноаминергических медиаторов в структурах мозга и крови крыс.

3. Установить влияние церебрамина на показатели свободнорадикального окисления и содержание аминокислотных и моноаминергических медиаторов в структурах мозга и крови крыс, подвергнутых окклюзии сонных артерий и гипотермии.

4. Исследовать влияние церебрамина на ректальную температуру и температуру мозга, а также изучить динамику самосогревания крыс, подвергнутых предварительному пероральному введению церебрамина перед гипотермией и окклюзией сонных артерий.

Положения, выносимые на защиту

При окклюзии сонных артерий и последующем моделировании умеренной гипотермии происходит незначительное снижение температуры мозга, накопление продуктов свободнорадикального окисления, повышение активности ряда антиоксидант-ных ферментов, по сравнению с аналогичными показателями у крыс, подвергнутых только окклюзии сонных артерий.

Введение церебрамина или гипотермия в отдельности влияют на нейромедиа-торный баланс и состояние про- и антиоксидантных систем мозга: в обоих случаях происходит повышение содержания норадреналина и снижение уровня серотонина, накопление продуктов свободнорадикального окисления и активация отдельных звеньев глутатионовой системы в мозге животных.

Сочетанное влияние церебрамина и гипотермии при окклюзии сонных артерий способствует повышению температуры мозга животных, изменению содержания глицина, норадреналина и дофамина в коре больших полушарий.

Научная новизна результатов исследования

Впервые было показано, что в условиях перорального введения церебрамина повышается ректальная температуры и температура мозга; в мозге происходит повышение интенсивности процессов свободнорадикального окисления, накопление содержания норадреналина, дофамина, аспартата и ГАМК и снижается уровень серотонина. В стволовых структурах мозга накапливается глицин.

Впервые показано, что в условиях введения церебрамина перед окклюзией сонных артерий ректальная температура и температура мозга не изменяются относительно контроля. На этом фоне в мозге происходит накопление норадреналина; в коре больших полушарий возрастает содержание серототнина, аспаратата и ГАМК, тогда как в стволовых структурах - снижаются уровни дофамина и серотонина. Уровень свободнорадикальных процессов в мозге снижается относительно крыс, которым моделируют окклюзию сонных артерий.

Впервые показано, что сочетанное воздействие церебрамина и умеренной гипотермии в условиях окклюзии сонных артерий сопровождается повышением температуры мозга крыс, при этом наиболее значительные изменения медиаторного баланса происходят в коре больших полушарий.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования расширяют теоретические представления об эффектах ноотропных препаратов и гипотермии на состояние свободнорадикальных процессов и медиаторный баланс в мозге животных при окклюзии сонных артерий.

Результаты диссертационной работы представляют практический интерес в экспериментальной биологии и медицине.

Выявленный эффект церебрамина на температуру мозга животных в моделях окклюзии сонных артерий и/или гипотермии дает основание рекомендовать его соче-танное применение с гипотермией при ишемии/гипоксии мозга.

Установленные эффекты церебрамина и гипотермии при окклюзии сонных артерий вносят вклад в развитие представлений о биохимических механизмах регуляции метаболического ответа на ишемическое повреждение мозга.

Внедрение результатов исследований в практику

Основные результаты работы внедрены в учебный процесс, используются при чтении курсов биохимии, нейрохимии и биофизики, а также НИР Дагестанского государственного университета и Южного федерального университета.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования» (Ростов-на-Дону - Махачкала, 2011 г); научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Дагестанского государственного университета (Махачкала, 2012 г); на заседании кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Общий объем публикаций 1,33 п.л., личный вклад - 87%.

Структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описание методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 242 источника, из них 137 на иностранном языке. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками, 25 таблицами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили белые беспородные половозрелые крысы-самцы в возрасте 6 месяцев, массой 200-250 г в количестве 128 шт. Животных содержали в условиях вивария при температуре +18 - +20°С на стандартном рационе питания. Для избежания сезонных колебаний метаболизма и регуляции функций опыты проводили в зимние месяцы: декабрь - февраль (Егулова и соавт., 1977, Тендитная, 1977).

Все животные были разбиты на следующие группы: 1-я группа — (контрольная) ложнооперированные (которым проводили все процедуры до момента перевязки сонных артерий) (л/о) крысы (п=16); 2-я группа (модель ОСА) - животные, которым проводили перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 минуты (с последующей 24-часовой реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на 24 часа (п=16); 3-я группа (модель действие церебрамина) - животные, которым перорально (per os) вводили це-ребрамин в течение 5 суток (кормление 1 раз в сутки в утренние часы) в дозе 0,5 мг/кг

с последующим проведением л/о (п=16); 4-я группа - животные, которым перед проведением 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА пероралыю вводили церебрамин в дозе 0,5 мг/кг в течение 5 суток (п=16); 5-я группа (модель гипотермии) - животные, которых после проведения л/о помещали в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой позволяла регулировать уровень охлаждения и непрерывно фиксировать термодатчиком ректальную температуру тела животного с точностью до 0,01°С (n-1 б); 6-я группа - животные, которых после проведения 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии JICA помещали в холодовую камеру (п=16); 7-я группа - животные, которым перорально вводили церебрамин в течение 5 суток. После проведения л/о крыс помещали в холодовую камеру (п=16); 8-я группа - животные, которым перед проведением 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА перорально вводили церебрамин в дозе 0,5 мг/кг в течение 5-ти суток. После проведения операции крыс помещали в холодовую камеру (п=16). Дополнительным контролем выступала группа интактных животных.

Через 24 часа после манипуляции животных декапитировали. Кровь собирали в центрифужные пробирки с 3,2% оксалатом натрия в соотношении 1:9, мозг извлекали и выделяли кору и стволовые структуры. Во всех сериях эксперимента в крови и мозге определяли: содержание биогенных аминов - норадреналина (НА), дофамина (ДА) и серотонина, а также нейромедиаторных аминокислот - глицина, глутаминовой и гаммааминомаслянной кислоты (ГАМК). Все хирургические процедуры проводили стерильно под наркозом, создаваемым внутрибрюшинным введением барбамила в дозе 2-4 мг на 100 г массы животного. Животных 5-7 групп выдерживали в холодовой камере до тех пор, пока ректальная температура крысы не снижалась до 30°С (модель умеренной гипотермии). Температура воды в водяной рубашке составляла 8°С. После гипотермии животных помещали в клетки, где они находились при комнатной температуре (20°С). В процессе самосогревания у крыс каждые 10 минут измеряли температуру мозга (tM°) и ректальную температуру (tp°) с точностью до 0,01°С. Во всех сериях эксперимента проводили замер как ректальной температуры, так и температуры мозга.

Определение содержания биогенных аминов. Образцы крови и гомогенаты структур мозга анализировали, применяя обращенно-фазный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на установке «Liquochrom» (Венгрия) с колонкой фирмы «Serva». В качестве детектора использовали флюоресцентный спектрофотометр "Hitachi F-4010" (Япония) со встроенным процессором, с помощью которого производили расчет концентраций моноаминов в образцах, используя стандартные растворы норадреналина гидрохлорида, серотонина креатининсульфата и дофамина гидрохлорида фирмы "Serva" с 3,4-дигидро-бензиламинов гидрохлоридом в качестве внутреннего стандарта (Krstulovic, Powell, 1979).

Определение уровня свободных аминокислот в мозге и глутамата в крови жи-

вотных проводили методом низковольтного электрофореза на бумаге (Tapia, 1983). Также в мозге определяли показатели свободнорадикальных процессов: содержание гидроперекисей липидов и ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП (Арутюнян, 2000), активность каталазы (Королюк, 1988), глутатионпероксидазы (ГПО) (Gunzler, 1986), глутатион-8-трансферазы (ГТ) (Карпищенко, 1999), глутатионредуктазы (ГР) (Beutler, 1975), уровень восстановленного глутатиона (ВГ) (Ellman, 1959). Для статистического анализа и графического представления данных использовали программы Statistica 6.0 (Microsoft Inc., США). Для оценки достоверности различий средних арифметических сравниваемых рядов использовали критерий достоверности Стьюдента (t). Различия между двумя выборками считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменение ректальной температуры и температуры мозга в условиях окклюзии сонных артерий и гипотермии.

Нормальной температурой мозга (как и ректальной) у крыс считается 39°С. Сравнение показателей температуры в правой и левой ушных раковинах животных не выявило различий в показателях ни в одной из исследованных групп животных. В связи с этим в качестве температуры мозга далее приводятся усредненные значения температуры, измеренной в правой и левой ушных раковинах крыс. Температура мозга и ректальная температуры сравнивались у интактных животных и крыс, перенесших л/о. После проведения л/о с использованием наркоза наблюдали снижение ректальной температуры животных (At t=l,7°C; р<0,001) относительно интактных крыс. Аналогичные изменения отмечали и у крыс сразу после 3-х минутной окклюзии ПСА (At t=l,6°C; р<0,001). Подобным образом изменялась и температура мозга: наблюдалось снижение температуры на 1,8°С (р<0,001) после проведения л/о и на 2°С (р<0,001) после 3-х минутной окклюзии ПСА. Однако через 24 часа после повторного измерения ректальная температура и температура мозга не имела статистически значимых отличий от показателей у интактных крыс, поэтому далее в качестве контроля использовались значения 1-ой группы животных. При двухсторонней окклюзии сонных артерий (ОСА) (2-я группа) ректальная температура увеличивалась на 0,77°С (р<0,01) однако температура мозга не имела достоверных отличий от контроля.

Однократное снижение температуры тела до 30°С (5-я группа) не вызывало значимых изменений ни ректальной температуры, ни температуры мозга через 24 часа после воздействия.

ю.

О 10 20 30 40 50 60

Т мин

Гипотермия —ОСА+Гипотермия

Рис. 1. Изменения ректальной температуры в процессе самосогревания после гипотермии и при ОСА, * - достоверные различия между группами при р< 0,05

Однако, совместное действие гипотермии и ОСА приводило к снижению ректальной температуры (Д11=33°С; р<0,05 относительно 2-й группы)

Температура мозга животных 6-й группы на +0,52°С (р<0,05) превышала показатели контрольной группы. У всех животных, помещенных в холодовые камеры, температура тела достигала 32°С со средней скоростью 0,25°С/мин. На рисунках 1 и 2 представлены графики изменения ректальной температуры и температуры мозга в процессе самосогревания. Наблюдались существенные различия в скорости выхода животных с ОСА из состояния гипотермии. Рассматривая динамику восстановления ректальной температуры и температуры мозга крыс, подвергнутых ОСА, необходимо отметить неравномерность протекания этого процесса, по сравнению с 5-й группой. У крыс 5-й группы показатель средней скорости самосогревания нарастал от 0,12°С до 0,27°С /мин. до тех пор, пока ректальная температура не достигала 35,1°С к 30-й минуте. После чего нарастание температуры замедлялось, а после 40-й минуты - прекращалось. К 60-й минуте ректальная температура составляла 35°С. Температура мозга восстанавливалась медленнее, чем ректальная температура, средняя скорость самосогревания составила 0,04°С, к 30-й минуте температура мозга составляла 35,63°С и к 60-й минуте снижалась на 0,51°С. Скорость самосогревания у животных 6-й группы составляла 0,05°С/мин и к 60-й минуте ректальная температура повышалась до 34,5 С. После 20-й минуты процесс самосогревания ещё более замедлялся и далее скорость роста температуры тела повышалась лишь после 50-й минуты. Подобную динамику наблюдали в изменении температуры мозга животных 6-й группы: средняя скорость изменения температуры составляла 0,02°С, к 40-й минуте температура мозга составляла 35,14°С, к 50-й минуте температура снижалась на 0,12°С, но уже к 60-й минуте скорость увеличивалась на 0,04°С и к концу регистрирования составила 35,39°С.

Т мин

" Гипотермии-0- ОСА+Гипотермия

Рис. 2. Изменения температуры мозга в процессе самосогревания после гипотермии и при ОСА, * - достоверные различия между группами при р< 0,05

Таким образом, гипотермическое воздействие оказывало менее значительное влияние на температуру мозга животных, чем сочетанное влияние снижения температуры тела и ОСА. Это связано с тем, что у животных 6-й группы ОСА также способствует понижению температуры мозга. Но через 1 час после воздействия в данной группе крыс температура мозга уже превышает показатель температуры мозга относительно животных 5-й группы, подвергавшихся только охлаждению, т.е. скорость самосогревания мозга увеличивается в условиях ОСА.

Эффекты окклюзии сонных артерий и гипотермии на показатели свобод-норадикальных процессов.

В модели ОСА (2-я группа) выявлено увеличение концентрации гидроперекисей липидов на 63% (р<0,05) и ТБК-реактивных продуктов на 63% (р<0,05) в коре больших полушарий (КБП) крыс на фоне повышения активности ГПО на 25% (р<0,05) и ГТ на 39% (р<0,05), а также снижения содержания ВГ в сравнении с контролем (1-я группа). Кроме того, показано снижение активности ГР на 36% (р<0,05) в КБП относительно контрольной группы. Следовательно, в условиях ОСА недостаточная активация ферментов, восстанавливающих образующиеся гидроперекиси липидов, способствует накоплению вторичных продуктов свободнорадикальных процессов (СРП) в мозге животных. Вероятно, это происходит в результате снижения синтеза ВГ и активности ГР в клетках в условиях развивающегося ацидоза при ишемии мозга (табл.1).

При моделировании гипотермии (5 группа) также наблюдали повышение содержания липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов в мозге животных. Однако анти-оксидантный статус в КБП и стволовых структурах (СС) различался. В том числе, в КБП было установлено снижение уровня ВГ на 20% (р<0,05) и активности ГР на 33%

(р<0,05), тогда как в СС на фоне снижения активности ГР на 23% (р<0,05) и каталазы на 28% (р<0,05) наблюдалось увеличение активности ГТ на 31% (р<0,05) и содержания ВГ на 23% (р<0,05) в сравнении с контрольной группой. В результате этого накопление вторичных продуктов СРП в КБП было выше, чем в СС.

У животных в модели ОСА и последующей гипотермии (6 гр.) повышение содержания липоперекисей в мозге было менее выражено относительно крыс, которым моделировали только ОСА или только гипотермию: в 6-й группе крыс значительное накопление первичных продуктов СРП наблюдалось только в КБП (относительно контроля) (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние церсбрамина и гипотермии на содержание свободмораднкальных

продуктов в структурах коры мозга крыс. (М±ш)

КОРА БОЛЬШИХ ПОЛУШАРИЙ

Группы Гидроперекиси липи- дов ТБК- РП, гшоль /мг ГПО, мкмОЛЬ / мин/г белка ВГ, мкмоль/ г ткани ГТ, ммоль/ мин/г ГР, мкмоль /мин/г белка Ката-лазная активность,

1. контроль 89,02± 3,51 24,35± 1,23 20,79± 0,87 0,15± 0,02 6,82± 0,83 19,80± 0,74 2,94± 0,09

2. ОСА 145,34± 6,75* 39,64± 1.43* 25,92± 1,12* 0,11± 0,05* 9,46± 0,31 12,75± 0,59* 3,75± 0,11*

3. Церебр. + л/о 102,54± 5,01 33,42± 1,21* 26,75± 1,03* 0,19± 0,007* 8,30± 0,42* 23,17± 0,52 3,97± 0,12*

4. Церебр. + ОСА 124,75± 5,29 29,47± 1,16* 27,92± 1,34* 0,13± 0,006 9,79± 0,45* 14,38± 0,64* 3,61± 0,13*

5. л/о + гипотермия 133,93± 6,91* 32,38± 1,45* 21,59± 0,09 0,12± 0,005* 6,03± 0,27 13,22± 0,61* 2,46± 0,10

6. ОСА + гипотермия 120,60± 5,72* 28,51± 1,06 26,17± 1,11* 0,09± 0,004* 8,3± 0,40* 11,53± 0,49* 3,25± 0,12

7. Церебр. + л/о + гипотермия 95,3 5± 4,24 26,58± 1,20 24,55± 1,21 0,18± 0,007 6,26± 0,23 18,36± 0,09 3,42± 0,13

8. Церебр. + ОСА + гипотермия 113,52± 5,63* 28,29± 1,13 18,04± 0,08 0,17± 0,03 7,13± 0,29 16,04± 0,05* 3,04± 0,14

Статистически значимые отличия показателей относительно контрольных значений; *- при (р < 0,05)

Одновременно наблюдалось повышение активности ГПО и ГТ на фоне снижения содержания ВГ в мозге.

Однако такие изменения происходили при разнонаправленных изменениях активности ГР в структурах мозга: если в КБП происходило снижение данного показателя на 42% (р<0,05), то в СС - его повышение на 29% (р<0,05) относительно контрольной группы. Также в СС наблюдался рост каталазной активности на 37% (р<0,05) в сравнении с 1-й группой крыс. Таким образом, в данной модели эксперимента были установлены особенности ответа антиоксидантного звена свободноради-кальных процессов в разных структурах мозга: предотвращение чрезмерной активации СРП в КБП происходит на фоне увеличения антиоксидантной емкости ГПО и ГТ, тогда как в СС — преимущественно за счет активации ГТ и каталазы.

Таблица 2.

Влияние церебрамина и гипотермии на содержание свободнорадикальных продуктов в стволовых структурах мозга крыс. (М±ш)

СТВОЛОВЫЕ СТРУКТУРЫ МОЗГА

1. контроль 95,64± 4.38 31,55± 1.72 46,83± 1.39 0,13± 0.01 10,64± 0.45 14,19± 1.06 2,97± 0.15

2. ОСА 138,83± 6,09* 42,7 8± 2,11* 58,72± 2,33* 0,0 8± 0,003* 15,83± 0,71* 15,04± 0,61 3,42± 0,11

3. Церебр. + л/о 112,06± 0,47 35,41± 1,66 49,70± 2,31 0,17± 0,005* 16,44± 0,68* 16,62± 0,58* 3,78± 0,12*

4. Церебр. + ОСА 132,75± 0,55* 37,59± 1,52* 54,11± 2,49* 0,10± 0,004* 14,29± 0,59* 17,38± 0,83* 3,29± 0,10

5. л/о + гипотермия 143,89± 0,59* 37,22± 1,37* 41,35± 1,96 0,16± 0,009* 13,94± 0,64* 10,86± 0,44* 2,13± 0,09*

6. ОСА + гипотер- 106,28± 0,37 36,52± 1.15 53,04± 2,07* 0,07± 0,003' 15,32± 0,70* 18,25± 0.74* 4,06± 0.18*

7. Церебр. + л/о + гипо- 120,53± 0,49* 30,06± 1,32 42,77± 2,16 0,14± 0,006 13,09± ' 0,54* 12,09± 0,50 2,54± 0,13

8. Церебр. + ОСА + гипо- 109,67± 0,51 33,85± 1,04 49,48± 2,35 0,11± 0,004 14,70± 0,69* 16,77± 0,77 3,48± 0,14

Статистически значимые отличия показателей относительно контрольных значений; *- при (р < 0,05)

Известно, что сродство ГПО к пероксиду водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях субстрата, а при высоких концентрациях ключевая роль принадлежит каталазе (Меньшикова и соавт., 2006). Действительно, согласно полученным результатам исследования, именно в ко-

ре больших полушарий происходило накопление гидроперекисей.

Влияние гипотермии и окклюзии сонных артерий на баланс моноаминов в мозге и крови крыс. При двусторонней ОСА (2-я группа) наблюдали снижение содержания дофамина как в крови (на 61%, р<0,01) так и в мозге: в КБП - на 62% (р<0,01) в СС - на 70% (р<0,01) (табл. 3). Одновременно со снижением концентрации ДА в КБП и СС происходил рост уровня НА, соответственно, на 62% (р<0,01) и 79% (р<0,01). При этом в крови содержание НА снижалось на 39% (р<0,05) относительно контроля. Концентрация серотонина в крови увеличивалась на 103% (р<0,01), в СС снижалась на 27% (р<0,05), в КБП значительных изменений не наблюдалось. Действие умеренной гипотермии (5-я группа) вызывало снижение содержания ДА в крови на 41% (р<0,05) и в мозге: в КБП - на 74% (р<0,01), а СС - на 37% (р<0,05). Одновременно повышался уровень НА в КБП на 99% (р<0,01) и в СС на 173% (р<0,01). При этом изменения в концентрации серотонина наблюдалось только в КБП (-43%, р<0,05).

Таблица 3.

Содержание моноаминов в крови (мкг/л крови) н мозге (мкг/г сырого веса тка-

ни) крыс при ОСА и умеренной гипотермии, (М±ш)

Серии Норадреналин Дофамин Серотонин

Кровь

1 - Контроль, л/о 0,181±0,012 0,297±0,019 1,905±0,106

2-ОСА 0,110±0,008* 0,115±0,010** 3,861±0,203**

5 - Гипотермия, л/о 0,157±0,011 0,175±0,010* 1,708±0,078

6 - ОСА + Гипотермия 0,112±0,09* 1,015±0,051*** 1,837±0,088

Кора больших полушарий

1 - Контроль, л/о 0,217±0,015 1,255±0,074 0,604±0,034

2-ОСА 0,352±0,022** 0,478±0,027** 0,583±0,029

5 - Гипотермия, л/о 0,432±0,024** 0,325±0,017** 0,346±0,019*

6 - ОСА + Гипотермия 1,132±0,083*** 2,269±0,142* 0,333±0,021*

Стволовые структуры

1 - Контроль, л/о 0,385±0,021 1,279±0,080 0,871±0,058

2-ОСА 0,690±0,058** 0,384±0,027** 0,640±0,038*

5 - Гипотермия, л/о 1,049±0,050** 0,804±0,050* 0,986±0,058

6 - ОСА + Гипотермия 0,672±0,037* 0,318±0,015* 0,526±0,035*

Статистически значимые различия в сравнении с контрольной группой *- при р<0,05; **- при р<0,01; ***- при р<0,001:

Действие гипотермии после ОСА (6-я группа) приводило к снижению уровня НА в крови на 38% (р<0,05) при повышении его уровня в мозге: на 422% (р<0,001) в КБП и на 75% (р<0,05) в СС. Изменение концентрации ДА носило обратный характер: происходило повышение уровня ДА в крови на 242% (р<0,001) и снижение на 75% (р<0,05) в СС, в КБП было отмечено повышение концентрации ДА на 81% (р<0,05) относительно уровня контроля. Также наблюдалось снижение содержание серотонина в мозге и крови животных, особенно в мозге: в КБП - на 45% (р<0,05) и в СС - на 40% (р<0,05).

Влияние гипотермии и окклюзии сонных артерий на содержание неироме-днаторпых аминокислот в крови и мозге крыс.

При ОСА (2-я группа) происходило повышение концентрации аспарагиновой и глутаминовой кислот в КБП (на 85% (р<0,01) и 36% (р<0,05)) и в СС крыс (на 32% (р<0,05) и 23% (р<0,05)). Одновременно отмечали снижение уровня ГАМК на 32% (р<0,05) в КБП и на 63% (р<0,05) в СС. Снижение уровня глицина было обнаружено только в СС (45%; р<0,05). В крови животных при ОСА наблюдалось повышение концентрации глутамата на 62% (р<0,05) относительно контроля (табл. 4).

Таблица 4.

Содержание неиромедиаторных аминокислот в крови крыс при ОСА и умеренной гипотермии (мкМ/1мл сыворотки крови, М±ш)

Группы животных Содержание глутамата

Контроль, л/о (1-я группа) 1,09±0,044

ОСА (2-я группа) 1,77±0,035*

Гипотермия, л/о (5-я группа) 0,90±0,022

ОСА + Гипотермия (6-я группа) 1,87±0,031**#

Статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой *- при (р<0,05), ** - при (р<0,01), # - Статистически значимые различия по сравнению с показателями 5-й гр. при (р<0,05)

При умеренной гипотермии (5-я группа) происходило повышение концентрации всех исследованных аминокислот в КБП животных (табл. 4): содержание аспартата и глутамата было увеличено, соответственно, на 59% (р<0,01) и 28% (р<0,05), уровни ГАМК и глицина были повышены на 132% (р<0,01) и 119% (р<0,01) относительно контроля. Такие изменения в медиаторном балансе могут происходить в случае усиления процесса возбуждения в КБП, что может отражать усиление информационных процессов в ЦНС в результате повышения уровня общего метаболизма в нервных клетках. На фоне сочетанного действия ОСА и гипотермии (6-я группа) уровни исследованных нейротрансмиттеров были снижены в мозге, за исключением содержа-

ния ГАМК, а также аспартата в СС, концентрации которых возрастали на 46% (р<0,05) и 83% (р<0,05) соответственно в сравнении с 5-й гр. В крови наблюдалось повышение содержания глутамата на 72% (р<0,01), относительно контроля и на 108% (р<0,01) относительно показателя 5-й группы.

Таблица 5.

Содержание ненромеднаторных аминокислот в коре больших полушарий крыс

при ОСА и умеренной гипотермии (мкМ/г сырого веса ткани; М±ш, )

Группы животных Аспартат Глутамат ГАМК Глицин

Кора больших полушарий

1-Контроль, л/о 2,38±0,09 7,94±0,21 2,11±0,06 0,43±0,06

2- ОСА 4,40±0,10** 10,83±0,16* 1,43±0,08* 0,41±0,04

5-Гипотермия, л/о 3,79±0,07** 10,15±0,19* 4,90±0,11** 0,94±0,05**

6-ОСА +Гипотермия 3,36±0,06* 8,58±0,22 3,86±0,06** 0,86±0,08**

Стволовые структуры

1-Контроль, л/о 2,13±0,14 6,85±0,21 2,89±0,17 0,58±0,09

2- ОСА 2,80±0,11* 8,44±0,31 1,06±0,09* 0,32±0,06*

5-Гипотермия, л/о 1,45±0,10* 9,16±0,17* 3,08±0,14 0,63±0,12

6-ОСА +Гипотермия 2,65±0,11 *# 7,92±0,25 4,51±0,24 *# 0,85±0,10 *

Статистически значимые различия в сравнении с контрольной группой: *- при р<0,05, ** - при р<0,01, # - Статистически значимые различия в сравнении с показателями 5-й

гр. при р<0,05

Влияние церебрамина на ректальную температуру и температуру мозга крыс при окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии.

Добавление в рацион питания церебрамина вызывало повышение ректальной температуры на 0,39°С (р<0,05) и температуры мозга на 0,41°С (р<0,05) у 3-й группы животных. Сразу после проведения ложной операции ректальная температура и температура мозга животных резко снижалась, соответственно, на 3°С (р<0,001) и 1,68°С (р<0,001) относительно 1-й группы (л/о). Через 24 часа после операции температурные показатели не имели достоверных отличий от показателей 1-й группы. Уровень ректальной температуры и температуры мозга в 3-й группе превышал контрольные значения на 0,44°С (р<0,01) и 0,41°С (р<0,01). Усредненные показатели ректальной температуры и температуры в ушных раковинах у разных групп животных приведены на (рис. 3, 4).

Рис. 3. Изменения ректальной температуры в процессе самосогревания после гипотермии и при ОСА на фоне введения церебрамина (°С, п=16)

* - достоверные отличия между показателями животных в моделях «гипотермия» и «церебрамин+ОСА+гипотермия»

Предварительное введение церебрамина перед ОСА (4-я группа) повышало ректальную температуру на 0,74°С (р<0,001) относительно контроля, что значимо не отличалось от показателя 2-й группы, при этом температура мозга повышалась на 0,62°С (р<0,001), что было выше уровня 2-й группы (Д11=0,33°С; р<0,05). Через 24 часа после действия гипотермии на фоне введения церебрамина (7-я группа) наблюдалось повышение ректальной температуры тела (Л1 1=0,36°С; р<0,05), превышающее таковое, зарегистрированное у 5-й группы (Д11=0,13°С; р<0,05), по сравнению со 2-й группой.

Рост ректальной температуры у 8-й группы оказался более выраженным на 0,64°С (р<0,01) относительно контроля, чем у животных 5-й группы (без церебрамина) (Д11=0,41°С).

В отличие от ректальной температуры, температура мозга и у 8-й группы (церебрамин+ОСА+гипотермия) и у 5-й группы снижалась по сравнению с контролем. Если действие церебрамина (5-я группа) вызывало снижение температуры на 0,70°С (р<0,01), то совместное действие ноотропа и ОСА приводило к менее выраженному снижению температуры на 0,41°С (р<0,01). Введение церебрамина способствовало ускорению процесса самосогревания после гипотермии (7-я группа). Средняя скорость роста ректальной температуры составляла 0,09°С/мин. (рис. 3). К 50-й минуте температура тела достигала 36,24°С, затем происходило снижение температуры на 0,45°С. Температура мозга изменялась со средней скоростью 0,03°С и максимального

значения достигала также к 50-й минуте (Зб,25°С) (рис. 4). На 40-й и 60-й минуте происходило некоторое ее снижение (35,87°С и 36,14°С), тем не менее, показатели температуры мозга, уже начиная с 20-й минуты, были выше аналогичных значений в 5-й, и тем более в 6-й групп. Введение церебрамина до ОСА с последующей гипотермией (8-я группа) оказывало более выраженное влияние на изменение температуры мозга в процессе самосогревания. Так средняя скорость прироста составляла 0,03°С/мин., однако сразу после извлечения животных из холодовой камеры температура мозга в среднем равнялась 34,79°С, что превосходило показатели в 5-й (Д1 1=0,34°С, р<0,05) и в 6-й (Д11=0,53°С, р<0,01) группах. Скорость восстановления ректальной температуры в процессе самосогревания составляла 0,05°С/мин. К 10-й минуте разница температур по отношению к 5-й группе составляла 1,7°С (р<0,001), а по отношению к 6-й группе - 0,9°С (р<0,001).

37

36.5 38 -35,5 35 34,5 - 34 33,5 - ,0С * * * * —.ь——I

0 10 20 30 40 50 60 Т мин

~~Гипотермия ~~Церебрамин+Гипотермия Церебрамин+ОСА+Гипотермия

Рис. 4. Изменения температуры мозга в процессе самосогревания после гипотермии и при ОСА на фоне введения церебрамина (°С, п=16) * - достоверные отличия между показателями животных в моделях «гипотермия» и «церебрамин+ОСА+гипотермия»

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженном влиянии церебрамина на регуляцию температуры тела и мозга крыс как в условиях нормотер-мии, так и после гипотермии. Было показано, что церебрамин способствует ускорению процесса самосогревания у крыс, усиливая интенсивность термогенеза уже на начальных этапах перехода животных из состояния гипотермии в состояние нормо-термии, причем этот эффект наиболее выражен в отношении влияния ноотропа на температуру мозга. Действие умеренной гипотермии значительно усиливало эффект церебрамина.

Эффекты церебрамнна на показатели свободнорадикальных процессов в условиях окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии.

При введении церебрамина (3-я группа) увеличение содержания ТБК-реактивных продуктов на 37% (р<0,05) происходило только в КБП крыс относительно контроля. Одновременно было показано увеличение в стволовых структурах мозга уровня ВГ на 31% (р<0,05), активности ГТ на 55% (р<0,05) и каталазы на 27% (р<0,05); в КБП также было обнаружено усиление активности ГПО на 29% (р<0,05). Повышение про- и антиоксидантных звеньев свободнорадикальных процессов при введении пептидных препаратов связывают с так называемым прекондиционирую-щим эффектом (Лысенко и соавт., 1999).

В условиях введения церебрамина перед моделированием ОСА (4-я группа) в мозге было выявлено накопление липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов, повышением активности ГПО и ГТ относительно контроля. В КБП была снижена активность ГР на 27% (р<0,05) и повышена каталазная активность на 23% (р<0,05), в то же время в СС активность ГР на 22% (р<0,05) была выше контроля. Следовательно, введение церебрамина перед ОСА снижает интенсивность СРП в мозге животных, однако механизмы, лежащие в основе данного явления различаются в КБП и СС: в КБП большую роль в снижении накопления продуктов СРП берут на себя ферменты, обладающие каталазной активностью, тогда как в СС - глутатионтрансфераза.

При введении церебрамина перед гипотермией (7-я группа) изменения показателей СРП были выявлены только в СС: происходило повышение уровня липоперекисей на 26% (р<0,05) и активности глутатионтрансферазы на 23% (р<0,05) по сравнению с контролем. При введении церебрамина перед ОСА и моделированием гипотермии (8-я группа) были обнаружены минимальные отклонения от контрольного уровня в состоянии СРП. Так в КБП было показано накопление липоперекисей 28% (р<0,05) на фоне снижения активности ГР на 19% (р<0,05), в СС наблюдалось лишь повышение активности ГТ на 38% (р<0,05). Таким образом, сочетанное влияние церебрамина и гипотермии оказывает более существенное защитное действие на метаболические процессы в структурах мозга крыс при окклюзии сонных артерий, нежели их раздельное применение в качестве факторов, снижающих эффекты ишемии мозга. Также установлены региональные различия защитных механизмов против развития окислительного повреждения ткани мозга.

Эффекты влияния церебрамина на баланс моноаминов в условиях окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии.

При введении церебрамина (3-я группа) происходило выраженное увеличение концентрации НА в крови (на 98%; р<0,01), КБП (на 405%; р<0,001) и СС (на 141%; р<0,01). В мозге также наблюдалось повышение уровня ДА: в КБП - на 93% (р<0,01) и стволовых структурах на 102% (р<0,01) относительно контроля. Содержание серо-тонина снижалось и в КБП (на 34%; р<0,05) и в СС (на 39%; р<0,05).

При ОСА на фоне введения церебрамина (4-я группа) было обнаружено более выраженное изменение баланса моноаминов в мозге относительно контроля: в КБП и СС наблюдалось повышение уровня НА соответственно на 76% (р<0,01) и 39% (р<0,05). Одновременно происходило снижение содержания серотонина в КБП на 58% (р<0,05), в СС - на 51% (р<0,05) и в крови животных - на 45%, (р<0,05) по сравнению с контролем. Концентрация ДА изменялась только в КБП (на 34%, р<0,05). При сравнении со 2-й группой животных, которых подвергали ОСА, введение церебрамина перед ОСА способствовало повышению уровней НА и ДА в крови соответственно на 33% (р<0,05) и 162% (р<0,01) и одновременно снижению концентрации серотонина (на 73%, р<0,05). В КБП и СС содержание ДА возрастало соответственно на 75% (р<0,05) и 216% (р<0,01), а уровень серотонина снижался на 56% (р<0,05) и 33% (р<0,05) относительно показателей 2-й группы.

В крови животных 7-й группы, которым после введения церебрамина моделировали гипотермию, происходило повышение уровня НА (на 37%, р<0,05) относительно контрольной группы (табл. 5). Но в сравнении с показателями 5-й группы животных, уровни НА и ДА были выше, соответственно, на 58% (р<0,05) и 56% (р<0,05). В КБП крыс 7-й группы наблюдалось увеличение уровня НА (на 48%, р<0,05) и снижение содержания серотонина (на 32%, р<0,05) в сравнении с контролем. По отношению к показателям 5-й группы происходило увеличение концентрации ДА (на 265%, р<0,05) и серотонина (на 130%, р<0,01). У крыс 8-й группы по сравнению с 5-й, уровень НА был ниже на 9% (р<0,05), а содержание ДА, напротив, выше на 86% (р<0,05). Также введение церебрамина способствовало повышению концентрации НА (на 131%; р<0,01) в крови крыс 8-й группы. Относительно показателей 2-й и 5-й групп уровень НА животных 8-й группы был выше соответственно на 280% (р<0,01) и 166% (р<0,01). В КБП содержание НА было повышенным (на 62%, р<0,05) в сравнении с группой контроля и достоверно не отличалось от такового у 2-й группы крыс. Концентрация ДА снижалась относительно контроля на 35% (р<0,05), но в сравнении с показателями 2-й и 5-й групп животных, содержание дофамина было выше, соответственно на 72% (р<0,05) и 153% (р<0,01). По сравнению со 2-й и 5-й группам в СС крыс 8-й группы происходило снижение уровня НА соответственно на 53% (р<0,05) и 69% (р<0,05), а также повышение уровня ДА соответственно на 653% (р<0,001) и на 260% (р<0,01).

Таким образом, наибольший эффект влияния на моноаминергический медиатор-ный баланс наблюдался в группах животных, которые на фоне ОСА подвергались одному из корректирующих воздействий (либо гипотермии, либо пероралыюму введению церебрамина). Тогда как совместное применение гипотермии и введения ноотро-па снижает эффекты друг друга.

Таблица 6.

Содержание моноаминов в крови (мкг/л) и мозге (мкг/г сырого веса ткани) крыс при ОСА и гипотермии в условиях введения церебрамина, (М±ш)

Серии Норадреналин Дофамин Серотонин

Кровь

1 - Контроль, л/о 0,181+0,012 0,297+0,019 1,905+0,106

3 - Церебрамин 0,358+0,020** 0,353+0,018 2,123+0,101

4 - Церебрамин+ОСА 0,146+0,010 # 0,301+0,015 # 1,048±0,050*#

7 - Церебрамин+ Гипо- 0,248+0,021*$ 0,273+0,017$ 1,911+0,097

термия

8 - Церебрамин+ОСА+ Гипотермия 0,418+0,017* *# $ 0,240+0,013 $ 2,124+0,112 #

Кора больших полушарий

1 - Контроль, л/о 0,217+0,015 1,255+0,074 0,604+0,034

3 - Церебрамин 1,095+0,068*** 2,426+0,152** 0,397+0,027*

4 - Церебрамин+ОСА 0,381+0,027** 0,837+0,049 # 0,257+0,016* #

7 - Церебрамин+ Гипо- 0,322+0,027* 1,187+0,117 # 0,795+0,0418 #

термия

8 - Церебрамин+ОСА+ Гипотермия 0,352+0,021 * 0,821+0,048*# $ 0,389+0,028*#

Стволовые структуры

1 - Контроль, л/о 0,385+0,021 1,279+0,080 0,871+0,058

3 — Церебрамин 0,929+0,062** 2,587+0,199** 0,528+0,033*

4 - Церебрамин+ОСА 0,536+0,034* 1,215+0,068 # 0,429+0,023* #

7 - Церебрамин+ Гипо- 0,427+0,033 $ 1,496+0,026 $ 0,787+0,043

термия

8 - Церебрамин+ОСА+ Гипотермия 0,322+0,019 #$ 2,892+0,138** U $ 0,665+0,042 $

Статистически значимые различия в сравнении с контрольной группой *- при (р<0,05), ** - при (р<0,01), *** - при (р<0,001), # - Статистически значимые различия по сравнению с показателями 2-й группы (р<0,05), $ - Статистически значимые различия в сравнении с показателями 5-й группы (р<0,05) (см. таб. 3)

Эффекты влияния церебрамина на баланс меднаторных аминокислот в условиях окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии.

Добавление в рацион питания церебрамина (3-я группа) способствовало накоплению ГАМК в СС (на 28%; р<0,05) и особенно в КБП (на 41%, р<0,05). Одновремен-

но происходило увеличение концентрации аспартата в КБП на 65% (р<0,01) и СС - на 25% (р<0,05) в сравнении с контролем (табл.7)

Подобные изменения в балансе аминокислот обычно характерны для действия препаратов ноотропного ряда. Введение церебрамина способствовало нормализации исследованных показателей после ОСА у животных 4-й группы наблюдалось снижение уровня аспартата на 44% (р<0,05) и глутамата на 26% (р<0,05) в КБП и СС, по сравнению со 2-й группой животных.

Таблица 7

Содержание пейромедиаторпых аминокислот в мозге крыс при ОСА и гипотермии в условиях введения церебрамина (мкМ/г сырого веса ткани; М±ш; п=8)

Группы Аспартат Глутамат ГАМК Глицин

Кора б.п.

1 - Контроль, л/о 2,38±0,09 7,94±0,21 2,11 ±0,06 0,43±0,06

3 - Церебрамин 3,93±0,12 7,53±0,19 2, 98±0,09 0,64±0,06

** # *# *#

4 - Церебрамин+ОСА 2,47±0,11# 8,04±0,17# 2,46±0,11# 0,49±0,04

7 - Церебрамин+ 3,70±0,12 8,04±0,14 2,87±0,09 0,48±0,05

Гипотермия ** # *$ $

8 - Церебрамин+ОСА+ 2,45±0,10 8,23±0,18 2,32±0,05 0,70±0,04

Гипотермия #$ # #$ *#$

Стволовые структуры

1 - Контроль, л/о 2,13±0,14 6,85±0,21 2,89±0,17 0,58±0,09

3 - Церебрамин 2,67±0ДЗ* 6,95±0,19 3,70±0,12* 0,54±0,07

4 - Церебрамин+ОСА 2,24±0,06 7,01±0,22 3,18±0,14# 0,59±0,08#

7 - Церебрамин+ 1,98±0,11 7,10±0,18 3,11 ±0,07 0,61±0,07

Гипотермия $ $

8 - Церебрамин+ОСА+ 2,30±0,10$ 7,42±0,15 3,17±0,21# 0,60±0,09#

Гипотермия

Статистически значимые различия в сравнении с контрольной группой *- при (р<0,05), ** - при (р<0,01), # - Статистически значимые различия в сравнении с показателями 2-й группы (р<0,05), $ - Статистически значимые различия в сравнении с показателями 5-й группы (р<0,05) (см. таб. 5)

В мозге происходило значительное повышение содержания ГАМК, как в КБП (на 72%; р<0,01), так и в СС (на 200%; р<0,001). Введение церебрамина перед гипотермией животным 7-й группы способствовало преимущественному изменению состояния нейромедиаторного пула изученных аминокислот в КБП животных. Так уро-

вень аспарагиновой кислоты возрастал на 56% (р<0,01), а ГАМК - на 36% (р<0,05) относительно контроля. В СС наблюдалось повышение содержания аспартата (на 37%, р<0,05) и снижение уровня глутаминовой кислоты (на 23%, р<0,05) относительно 5-й группы. В условиях введения церебрамина перед ОСА и гипотермией (8 гр.) отмечалось снижение уровней возбуждающих аминокислот в мозге и значительное повышение концентрации тормозных нейромедиаторов до уровня контроля (1 гр.) В частности, было обнаружено накопление ГАМК в КБП (на 71%; р<0,01) и СС (на 199%; р<0,01) относительно крыс 2-й группы, подвергнутых ОСА. Однако в сравнении с группой л/о животных отмечался только рост уровня глицина в КБП на 63% (р<0,05). Необходимо также отметить, что сочетанное воздействие церебрамина и гипотермии в условиях ОСА (8-я группа) вызывает разнонаправленные изменения в содержании нейромедиаторов мозга и глутаминовой кислоты в крови.

ВЫВОДЫ

1. В условиях умеренной гипотермии происходит накопление норадреналина и снижение содержания дофамина в мозге крыс. В коре больших полушарий снижается уровень серотонина и возрастает содержание аспартата, ГАМК и глицина; в стволовых структурах снижается уровень аспартата и накапливается глутамат. Данные изменения в медиаторном балансе сопровождаются интенсификацией свободноради-кальных процессов в мозге крыс: одновременно с накоплением гидроперекисей липи-дов и ТБК-реактивных продуктов происходят снижение активности глутатионредук-тазы в мозге и разнонаправленные изменения уровня восстановленного глутатиона в коре больших полушарий и стволовых структурах.

2. Введение церебрамина обладает сходным с гипотермическим воздействием на содержание норадреналина, серотонина, аспартата, ГАМК и глицина в коре больших полушарий. В стволовых структурах изменения в концентрациях нейромедиаторов носят разнонаправленный характер при введении ноотропа и гипотермии. Интенсивность свободнорадикальных процессов в мозге в условиях введения церебрамина повышается. Сочетанное влияние церебрамина и гипотермии оказывает разнонаправленное действие на нейромедиаторные системы мозга животных, что сопровождается сохранением ректальной температуры и температуры мозга крыс, а также показателей свободнорадикальных процессов на уровне контрольных значений.

3. В условиях окклюзии сонных артерий накопление продуктов свободноради-кального окисления сопровождается повышением активности глутатионпероксидазы в мозге крыс, снижением содержания восстановленного глутатиона, понижением ка-талазной активности в коре больших полушарий и повышением активности глутати-онтрансферазы в стволовых структурах. Одновременно происходит снижение содержания дофамина и глицина, а также накопление аспартата в мозге крыс.

4. В условиях предварительного введения церебрамина перед окклюзией сонных артерий и последующего воздействия гипотермии происходит понижение температуры мозга. Наблюдаются разнонаправленные изменения уровня дофамина в структурах мозга; в коре больших полушарий повышается уровень норадреналина и глицина, снижается содержание серотонина. Сочетанное влияние церебрамина, окклюзии сонных артерий и гипотермии способствует накоплению гидроперекисей ли-пидов и активности глутатионредуктазы в коре больших полушарий крыс.

5. Сочетанное влияние церебрамина и гипотермии оказывает более существенное протективное действие на метаболические процессы в структурах мозга крыс при окклюзии сонных артерий, нежели их раздельное применение в качестве факторов, снижающих эффекты ишемии мозга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Айдунбеков Ф.Т. Влияние сочетанного воздействия гипотермии, церебрамина и окклюзии сонных артерий на баланс аминокислотных нейротрансмиттеров крыс. / Айдунбеков Ф.Т., Эмирбеков Э.З. // «Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион». Естественные науки. Ростов-на-Дону, 2009. № 5. - С. 108-111. (0,16 п.л., личн. вкл 80%)

2. Айдунбеков Ф.Т. Влияние гипотермии и церебрамина на содержание моноаминов в мозге и крови крыс при окклюзии сонных артерий / Айдунбеков Ф.Т., Эмирбеков Э.З.// «Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион». Естественные науки. Ростов-на-Дону, 2009. № 4. - С. 78-81 (0,16 п.л., личн. вкл 80%)

3. Айдунбеков Ф.Т. Влияние церебрамина и умеренной гипотермии на сво-боднорадикальные процессы в мозге крыс при окклюзии сонных артерий/ Айдунбеков Ф.Т., Эмирбеков Э.З., Магомедов К.К. // «Фундаментальные исследования» - №10 (часть 4) - 2013,- С. 797-801 (0,20 п.л., личн. вкл. 60%)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

4. Айдунбеков Ф.Т. Эффекты умеренной гипотермии и церебрамина на баланс аминокислотных нейротрансмиттеров крыс, подвергнуть« окклюзии сонных артерий. // Академия молодых исследователей. Ростов-на-Дону, 2008. - № 2. - С. 72-79 (0.33 п.л., личн. вкл. 100%)

5. Айдунбеков Ф.Т. Влияние предварительного введения церебрамина перед окклюзией сонных артерий и последующей гипотермии на баланс моноаминов в мозге и крови крыс. // Академия молодых исследователей. Ростов-на-Дону, 2008. - № 3. -С. 116-121 (0.24 п.л., личн. вкл. 100%).

6. Айдунбеков Ф.Т.Влияние предварительного введения церебрамина перед окклюзией сонных артерий и последующей гипотермии на баланс моноаминов в мозге и крови крыс // В матер. Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования». - Ростов-на-Дону - Махачкала, 2011. - С. 23-28 (0,24 п.л., личн. вкл. 100%).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГАМК - гаммааминомаслянная кислота ГПО - глутатионпероксидаза ГТ - глутатионтрансфераза ГР - глутатионредуктаза ВГ - восстановленный глутатион ДА - дофамин

КБП - кора больших полушарий НА - норадреналина

НМК - нарушение мозгового кровообращения

ЛСА - левая сонная артерия

ОСА - окклюзия сонных артерий

ПСА - правая сонная артерия

СРП — свободнорадикальные процессы

СС — стволовые структуры

ТБК-РП - реактивные продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой ЦНС - центральная нервная система 4р° - ректальная температура

1м° - температура мозга, регистрируемая внутри наружного слухового прохода

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 3213. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Айдунбеков, Фарух Тахирович, Ростов-на-Дону

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет»

На правах рукописи

04201456121

Айдунбеков Фарух Тахирович

ДЕЙСТВИЕ ГИПОТЕРМИИ И ЦЕРЕБРАМИНА НА НЕЙРОМЕДИАТОРНЫЙ БАЛАНС КРЫС ПРИ ОККЛЮЗИИ СОННЫХ АРТЕРИЙ

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Эмирбеков Эмирбек Зиядович

Ростов-на-Дону 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATP - аденозинтрифосфорная кислота

БЖТ - бурая жирования ткань

ВГ - восстановленный глутатион

ГАМК - гаммааминомаслянная кислота

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ДА - дофамин

КА - катехоламины

НА - норадреналина

НМК - нарушение мозгового кровообращения

JICA - левая сонная артерий

МА - моноамины

ОСА - окклюзия сонных артерий

ПСА - правая сонная артерия

СРП - свободнорадикальные процессы

ТБК-РП - реактивные продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой

ЦНС - центральная нервная система

NPY - нейропептид Y

tp° - ректальная температура

tM° - температура мозга, регистрируемая внутри наружного слухового прохода

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................2

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................11

1.1. Механизмы влияния нарушения мозгового кровообращения на нейрохимические системы.........................................................И

1.2. Современные представления эффектов гипотермии при нарушении мозгового кровообращения.........................................................21

1.3. Эффекты препаратов ноотропного действия при нарушении мозгового кровообращения.........................................................31

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................39

2.1 Постановка эксперимента............................................................39

2.2. Модель ишемии мозга...............................................................40

2.3. Модель гипотермии..................................................................41

2.4. Приготовление гомогенатов тканей..............................................41

2.5. Биохимические методы исследрвания...........................................42

2.5.1. Определение содержания биогенных аминов................................42

2.5.2 Определение уровня свободных аминокислот в мозге и крови животных...................................................................................43

2.5.3. Определение содержания гидроперекисей липидов и ТБК-реактивных продуктов....................................................................................44

2.5.4. Определение активности глутатионпероксидазы...........................45

2.4.3. Определение концентрации восстановленного глутатиона...............46

2.4.4. Определение активности глутатионредуктазы...............................46

2.4.5. Определение активности глутатион-8-трансферазы........................47

2.4.6. Определение активности каталазы.............................................47

2.6. Статистическая обработка результатов исследования........................48

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................49

3.1 Изменение ректальной температуры и температуры мозга в

условиях окклюзии сонных артерий и гипотермии...........................49

3.2. Влияние гипотермии и окклюзии сонных артерий на показатели свободнорадикальных процессов......................................................54

3.3. Влияние гипотермии и окклюзии сонных артерий на баланс моноаминов в мозге и крови крыс.....................................................................59

3.4. Влияние гипотермии и окклюзии сонных артерий на содержание нейромедиаторных аминокислот в крови и структурах мозга крыс............64

3.5. Влияние церебрамина на ректальную температуру и температуру мозга крыс при окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии.................69

3.6. Эффекты церебрамина на показатели свободноридикальных процессов у крыс в условиях окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии........73

3.7. Эффекты церебрамина на баланс моноаминов в условиях окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии...........................................79

3.8. Эффекты церебрамина на баланс медиаторных аминокислот в условиях

окклюзии сонных артерий и умеренной гипотермии..............................84

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................................89

ВЫВОДЫ....................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................99

ВВЕДЕНИЕ

Следствием общесистемных нарушений метаболизма, приводящих к эндотелиальной дисфункции, изменению гемодинамики, реологических свойств крови, развитию тромбозов является окклюзия магистральных сосудов (Дамбинова и соавт., 2003).

В последние годы отмечен рост распространенности сосудистых заболеваний, в том числе, острых нарушений мозгового кровообращения. Инсульт ежегодно в мире переносят около 6 млн. человек. Особенно актуальной эта проблема является в связи с увеличением распространенности инсульта у лиц работоспособного возраста (Яхно, Парфенов, 2000). Данное заболевание является основной причиной инвалидизации населения и только 20% выживших после перенесенного инсульта людей могут вернуться к прежней работе. Окклюзия магистральных сосудов приводит к общесистемным нарушениям метаболизма, приводящим к эндотелиальной дисфункции, изменению гемодинамики, реологических свойств крови, развитию тромбозов (Дамбинова и соавт., 2003).

Физиологической основой развития ишемического и реперфузионного повреждений мозга является нарушение кровоснабжения мозга (Bari et al., 1998; Thompson, 1976). Ишемия мозга провоцирует энергетическое голодание мозговой ткани, повреждение мембран клеток мозга и нарушения в метаболизме нейромедиаторных аминокислот вследствие высокой реактивности свободных радикалов кислорода (Даудова 2006; Даудова JI. А. Даудова Т.Н., 2006). В результате данных изменений, в нейронах и глиальных клетках головного мозга нарушаются процессы рецепторного связывания (Гусев и соавт., 1999; Гусев, Скворцова, 2001; Bilenko, 2001). Наряду с этим, ишемические и реперфузионные изменения мозга способствуют аккумуляции повреждений структуры ДНК в результате окислительного стресса, что в дальнейшем приводит к запуску процесса

гибели клетки (Luo et al, 2007). Каскад реакций при ишемических/реперфузионных нарушениях мозга сопровождается гипертермией, что усугубляет степень повреждений нейронов мозга (Noor et al, 2005).

В то же время умеренная гипотермия на фоне или сразу после церебральной ишемии оказывает нейропротективное действие за счет снижения окислительных повреждений метаболизма (Ji et al, 2007), повышения выживаемости нейронов в результате снижения активности проапоптотических и некротических факторов (Van Hemelrijck et al, 2005). Гипотермическое воздействие влияет так же, и на нейромедиаторные системы мозга (Эмирбеков и соавт, 2011).

Таким образом, температура является одним из наиболее значимых факторов, определяющих функциональное состояние мозга. Даже при повышении температуры на 0,5°С наблюдается значительное снижение шансов больного на выживание (Киншт и соавт, 2006).

Температура тела больного влияет на развитие инсульта и на размер инфарктной зоны мозга. Установлено, что действие высокой температуры во время острой фазы ишемии мозга опосредовано через выброс глутамата и глицина (Chio et al, 2007). При температуре выше 38°С, при развитии инсульта или ишемии головного мозга, резко снижаются шансы больных на выживание (Hsu et al, 2006).

При этом, несмотря на огромное количество работ в области применения гипотермии, механизмы, лежащие в основе ее протекторных свойств при ишемических/гипоксических повреждениях мозга, изучены недостаточно.

В настоящее время изучается врпрос изменения температуры мозга в зависимости от интенсивности мозгового кровообращения (Zhu et al, 2002). Решение данной проблемы может привести к выявлению критерия устойчивости организма к нарушению мозгового кровообращения (НМК).

Каскад метаболических реакций в мозге при нарушении его кровоснабжения прослеживают в различных исследованиях на клеточных культурах и экспериментальных моделях на животных. Так продемонстрирована эффективность антагонистов глутаматовых рецепторов, кальций-стабилизирующих соединений и антиоксидантов, введение которых приводит к снижению ишемического повреждения нейронов (Хазанов и соавт, 1989; ВПепко, 1999; Шмырев и соавт., 1999; Гусев, Скворцова, 2003; Аврова и соавт, 2003).

В связи с изложенным, в экспериментальных моделях и клинических испытаниях важна разработка комбинированной патофизиологически значимой терапии с количественной, оценкой обратимости повреждений мозга при ишемии/гипоксии (Фишер, Шебитз, 2000).

Применение сочетанного действия умеренной гипотермии и препаратов-нейропротекторов, на фоне нарушения мозгового кровообращения, является актуальным в решении вопроса об эффективности снижения последствий ишемического/реперфузионного повреждения мозга.

Целью данного исследования явилось изучение влияния умеренной гипотермии и введения церебрамина на содержание показателей свободнорадикального окисления в мозге и уровень медиаторов в мозге и крови крыс, подвергнутых двусторонней окклюзии сонных артерий разной продолжительности.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить эффекты гипотермии и окклюзии сонных артерий на показатели свободнорадикального окисления в структурах мозга крыс.

2. Изучить влияние окклюзии сонных артерий и гипотермии на содержание аминокислотных и моноаминергических медиаторов в структурах мозга и крови крыс.

3. Установить влияние церебрамина на показатели свободнорадикального окисления в мозге и содержание аминокислотных и

моноаминергических медиаторов в структурах мозга и крови крыс, подвергнутых окклюзии сонных артерий и гипотермии.

4. Исследовать влияние церебрамина на ректальную температуру и температуру мозга, а также изучить динамику самосогревания крыс, подвергнутых предварительному пероральному введению церебрамина перед гипотермией и окклюзией сонных артерий.

Положения, выносимые на защиту

При окклюзии сонных артерий и последующем моделировании умеренной гипотермии происходит незначительное снижение температуры мозга, накопление продуктов свободнорадикального окисления, повышение активности ряда антиоксидантных ферментов, по сравнению с аналогичными показателями у крыс, подвергнутых только окклюзии сонных артерий.

Введение церебрамина или гипотермия в отдельности влияют на нейромедиаторный баланс и состояние про - и антиоксидантных систем мозга: в обоих случаях происходит повышение содержания норадреналина и снижение уровня серотонина, накопление продуктов свободнорадикального окисления и активация отдельных звеньев глутатионовой системы в мозге животных.

Сочетанное влияние церебрамина и гипотермии при окклюзии сонных артерий способствует повышению температуры мозга животных, изменению содержания глицина, норадреналина и дофамина в коре больших полушарий.

Научная новизна результатов исследования

Впервые было показано, что в условиях перорального введения церебрамина повышается ректальная температуры и температура мозга; в мозге происходит повышение интенсивности процессов свободнорадикального окисления, накопление содержания норадреналина, дофамина, аспартата и ГАМК и снижается уровень серотонина. В стволовых структурах мозга накапливается глицин.

Впервые показано, что в условиях введения церебрамина перед окклюзией сонных артерий ректальная температура и температура мозга не изменяются относительно контроля. На этом фоне в мозге происходит накопление норадреналина; в коре больших полушарий возрастает содержание серототнина, аспаратата и ГАМК, тогда как в стволовых структурах - снижаются уровни дофамина и серотонина. Уровень свободнорадикальных процессов в мозге снижается относительно крыс, которым моделируют окклюзию сонных артерий.

" Впервые показано, что сочетанное воздействие церебрамина и умеренной гипотермии в условиях окклюзии сонных артерий сопровождается повышением температуры мозга крыс, при этом наиболее значительные изменения медиаторного баланса происходят в коре больших полушарий животных.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования расширяют теоретические представления об эффектах ноотропных препаратов и гипотермии на состояние свободнорадикальных процессов и медиаторный баланс в мозге животных при окклюзии сонных артерий.

Результаты диссертационной работы представляют практический интерес в экспериментальной биологии и медицине.

Выявленный эффект церебрамина на температуру мозга животных в моделях окклюзии сонных артерий и/или гипотермии дает основание рекомендовать его сочетанное применение с гипотермией при ишемии/гипоксии мозга.

Установленные эффекты церебрамина и гипотермии при окклюзии сонных артерий вносят вклад в развитие представлений о биохимических механизмах регуляции метаболического ответа на ишемическое повреждение мозга.

Внедрение результатов исследований в практику

Основные результаты работы внедрены в учебный процесс, используются при чтении курсов биохимии, нейрохимии и биофизики, а также НИР Дагестанского государственного университета и Южного федерального университета. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования» (Ростов-на-Дону -Махачкала, 2011 г); научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Дагестанского государственного университета (Махачкала, 2012 г); на заседании кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Общий объем публикаций 1,33 п.л., личный вклад - 87%.

Структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описание методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 242 источника, из них 137 на иностранном языке. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками, 25 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы влияния нарушения мозгового кровообращения на

нейрохимические системы

Головной мозг среди всех органов и тканей, отличается высокой интенсивностью дыхания. В периоды максимальной активности и быстрого развития он может использовать до 50% поступающего в организм кислорода (Ашмарин и соавт., 1999; Бетепга, 2000; Лукьянова, Дудченко, 2007). Другой отличительной особенностью мозга является его высокое потребление глюкозы из крови (до 70%). Однако в отличие от всех других органов головной мозг обладает ограниченной способностью компенсировать недостаток глюкозы за счет окисления других энергетических субстратов, вследствие их низкой проницаемости через гематоэнцефалический барьер. При нарушении мозгового кровообращения для поддержания окислительно-восстановительных процессов ткань мозга начинает использовать свободную фракцию гликогена, однако полное окисление гликогена заканчивается уже через 5-7 минут (Гусев, Скворцова, 2001).

Способность организма переносить различные уровни кислородной недостаточности - эволюционно древний способ адаптации, изучив сущность которого, представляется возможным корректировать ишемические повреждения мозга (Кургалюк, 2002). Ишемия (¡зсЬаегша, местное малокровие) - уменьшение содержания крови в органах или тканях, вызываемое недостаточным притоком артериальной крови (Зайчик и соавт., 2003). Хроническая ишемия мозга - особая разновидность сосудистой церебральной патологии, обусловленная медленно прогрессирующим диффузным нарушением кровоснабжения головного мозга с постепенно нарастающими разнообразными дефектами его функционирования (Путилина, 2008, 2009). В свете современных представлений о патогенезе мозгового инсульта, формирование ишемического каскада повреждения

мозга можно представить следующей схемой последовательных этапов: 1) снижение мозгового кровотока; 2) глутаматная эксайтотоксичность; 3) внутриклеточное повышение кальция; 4) активация Са2+-зависимых ферментов; 5) повышение синтеза активных форм кислорода и развитие окислительного стресса; 6)экспрессия генов раннего реагирования, локальная воспалительная реакция, апоптоз.

Тяжесть ишемического мозгового инсульта определяется степенью снижения мозгового кровообращения. В норме у молодого здорового человека уровень мозгового кровообращения равен 58 мл/100 г мин. Область мозга с наиболее выраженным снижением мозгового кровотока - ниже 10 мл/100г мин. очень быстро (в течение 6-8 минут с момента появления первых клинических симптомов) становится необратимо поврежденной. Это, так называемая, «ядерная» зона инфаркта (Astrup et al, 1981). В течение нескольких часов ядерная зона инфаркта остается окруженной ишемизированной, но живой тканью, где мозговое кровоо