Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нейроспецифические белки в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера человека и животных
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Нейроспецифические белки в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера человека и животных"
На правах рукописи
РЯБУХИН ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ
НБЙРОСПЕЦИФИЧБСКИЕ БЕЛКИ В ОЦЕНКЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЕМАТОЭНЦФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ.
03.00.04-Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
МОСКВА
2004
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Государственного Научного Центра социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского Научный консультант: член-корр. РАМН, профессор Чехонин В.П. Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Бурбаева Г.Ш; доктор медицинских наук, профессор Терентьев А.А.; доктор медицинских наук, профессор. Петрунин Д.Д.
Ведущее учреждение - Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Защита диссертации состоится «_»_2004 года
в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.
Автореферат разослан «_»_2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
Доктор медицинских наук, профессор Джанашия П.Х.
1. Актуальность проблемы
Хорошо известно, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) обеспечивает не только защиту нервной ткани или клеток мозга от токсинов и продуктов метаболизма, но и предотвращает проникновение в кровь различных антигенов, специфичных для нервной ткани. За последние 30 лет накопилось большое количество научных данных о нейроспецифических белках (НСБ), методах их выделения, идентификации, биохимических и иммунохимических свойствах (Мооге В. W. и соавт., 1976, 1992, Eng L.F. и соавт., 1971, 2000., Deibler G.E. и соавт., 1978, Воск Е. и соавт., 1978, 2004., Березин В.А., 1990, Чехонин В.П. и соавт., 2000). Показана практическая значимость их прижизненного иммунохимического анализа в биологических жидкостях при различных заболеваниях и патологических процессах в центральной нервной системе (ЦНС) (Бурбаева Г.Ш. и соавт., 1989., Barone F.C. и соавт.,1993, Ro-sengreen L.E. и соавт., 1994., Blennow M. и соавт., 1996., Чехонин В.П. и соавт., 2000, Eng L., 2001., Checkonin V. и соавт., 2002., Beems Т. и соавт., 2003).
К наиболее изученным и информативным НСБ, наряду с антигенами группы S100 (Мооге W.B. и соавт., 1996), нейрональными молекулами клеточной адгезии NCAM (Bock E. и соавт., 1974.,) антигенами, ассоциированными с миелином-MAG (Poltorak М. и соавт., 1987.,) и MBP (Deibler G.E. и соавт., 1995), относятся и такие белки как нейроспецифическая енолаза (NSEXMarangos P.J., 1988), глиофибриллярный кислый протеин (GFAP)(Eng L.F., 1988), а также специфические а2-гликопротеин мозга (ci2GP)(Warecka К., 1982), ai и аг-глобулины мозга (ctiBG и a2BG)(Chekhonin V. и соавт., 2002). Иммуноферментный анализ этих НСБ и соответствующих антител (AT) к ним позволяет не только косвенно оценить степень нарушения функций ГЭБ, но и адекватно отразить характер и степень повреждения нейронов, астроцитов и олигодендроглиоцитов (Чехонин В.П. и соавт., 2000., Fri-driksson Т. и соавт, 2001., van Geel WJ. и соавт., 2002). При этом количественный динамический анализ НСБ и
ных заболеваниями, сопровождающимися нарушением функции ГЭБ, может служить дополнительным критерием степени выраженности патологического процесса в ЦНС, а также объективизации оценки тяжести состояния пациента и прогноза течения заболевания (Barone F., 1993, Schaarschmidt H., 1994., Verdu Perez А. и соавт., 2001., Herrmann M. и соавт., 2000, 2003, Seung-Hum., 2003).
Кроме этого, из-за отсутствия иммунологической толерантности к НСБ их прорыв в кровь при заболеваниях, сопровождающихся длительным или периодическим нарушением резистентности ГЭБ, нередко сопровождается появлением специфических анти-НСБ антител (Jankovic B.D., 1985., Chek-honin V. и соавт., 1994, 1999, Silber E. и соавт., 2002). В связи с этим оправданно встает вопрос о целесообразности их количественного определения и исследования механизмов их аутоагрессии в направлении кровь-мозг. Понимание этих механизмов при тех или иных патологических процессах откроет новые перспективы специфической терапии нервно-психических заболеваний, включая высокоспецифичный способ защиты мозга от агрессии анти-НСБ антител из крови в мозг методом экстракорпоральной иммуносорбции (Taniguchi Y, 1995., Toepfer M. и соавт., 1999., Benny W.B. и соавт., 1999, Schneidewind J.M., 2001).
В настоящее время в связи со значительным увеличением количества оперативных вмешательств с применением аппарата искусственного кровообращения, возрастает роль НСБ в оценке функций ЦНС и резистентности ГЭБ у больных, перенесших такие операции (Rasmussen L.S. и соавт., 1999, 2002, Anderson R. и соавт., 2003., Меупааг I.A. и соавт., 2003). Нет сомнений в том, что надежный количественный иммунохимический контроль этих параметров не только позволить получать объективную информацию о состоянии клеток нервной ткани в раннем постоперационном периоде, но и определит перспективы создания методов стабилизации их функций в условиях гипоксии и ишемии.
Цельработы
Целью данной работы явилось иммунохимическое исследование ней-роспецифических белков и антител к ним как критериев оценки резистентности гематоэнцефалического барьера человека и животных в норме и при патологии.
Задачи исследования
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи исследования:
1. На основе очищенных препаратов нейроспецифических белков и соответствующих препаратов поликлональных AT разработать иммунофер-ментные системы для анализа NSE, GFAP, агвР, с^ЕЮ, (ХгВС и AT к ним в сыворотке крови и ликворе человека и животных.
2. Провести иммуноферментный анализ каждого из пяти нейроспецифических белков и AT к ним в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями с целью оценки резистентности ГЭБ.
3. Провести комплексный иммуноферментный анализ пяти нейроспецифических белков и AT к ним в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями с целью оценки резистентности ГЭБ.
4. Провести сравнительный анализ диагностической значимости индивидуального и комплексного иммунохимического определения НСБ и анти-НСБ-АТ в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями.
5. Исследовать в эксперименте взаимосвязь между выраженностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ и концентрацией НСБ в крови, а также исследовать эффект проникновения AT к НСБ через поврежденный ГЭБ.
6. Исследовать проницаемость меченных 1251 анти-НСБ антител через ГЭБ крыс после внутривенного введения в норме и при экспериментальной окклюзии средней мозговой артерии.
7. Разработать способ защиты мозга от патологического воздействия AT к НСБ на основе принципа экстракорпоральной иммуноадсорбции.
Научная новизна работы.
Модифицированные способы очистки НСБ и полученные на основе иммунизации ими поликлональные AT позволили разработать иммунофермент-ные тест-системы анализа НСБ и анти-НСБ AT в биологических жидкостях человека и животных.
Впервые разработан иммуноферментный метод определения с^ВС и ОгВС и AT к ним на основе принципа колоночного микрореактора с пределом чувствительности определения 50 пг/мл для а\ ВС, 100 пг/мл для агВв и 350 пг/мл для АТ к с^ ВС и а2ВС.
С помощью иммуноферментных тест-систем анализа GFAP и агСР, являющихся межвидовыми белками, исследованы и количественно оценены уровни этих НСБ в крови у животных с экспериментальным повреждением ГЭБ. В этих экспериментах впервые показано наличие прямой зависимости между выраженностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ в частности, и изменением уровня НСБ и AT к ним в крови.
Впервые, в эксперименте, выявлен феномен селективного накопления меченных в ткани мозга после их внутри-
венного введения на фоне повреждения ГЭБ, вызванного ишемией головного мозга (односторонняя окклюзия средней мозговой артерии).
Впервые в клинико-лабораторной практике применен комплексный метод иммуноферментного определения пяти НСБ и AT к ним в биологических жидкостях при заболеваниях и патологических состояниях, сопровождающихся нарушением функции ГЭБ. Анализ полученных результатов выявил высокую диагностическую и прогностическую значимость определения НСБ и AT к ним, как при одномоментном, так и при динамическом исследовании.
Впервые получена серия результатов, свидетельствующих о принципиальной возможности прорыва анти-НСБ антител через поврежденный ГЭБ, сопровождающегося комплексом патологических процессов в нервной ткани.
б
На основе этих результатов проведены исследования, послужившие основой для разработки методологии защиты нервной ткани от аутоантительной агрессии анти-НСБ антител из крови путем их экстракорпоральной иммуноад-сорбции.
Впервые разработан твердофазный иммуносорбент на основе сополимера стирола и дивинилбензола и иммобилизованных высокоочищенных препаратов НСБ. Стендовые, лабораторные и токсикологические испытания полученного иммуносорбента показали его гемосовместимость, высокую емкость по отношению к сорбируемым AT и отсутствие токсичности. На способ приготовления твердофазного иммуносорбента получено авторское свидетельство на изобретение (№ 1476648).
Впервые в рамках программы ограниченных клинических испытаний метода экстракорпоральной иммуноадсорбции были проведены успешные процедуры по извлечению AT к NSE, GFAP, агвР, с^Вй и с^ВО из крови трех больных, находящихся в критическом состоянии, обусловленном нейро-лепсией, а также AT к NSE, GFAP, агвР и МВР у больного с бульбарной формой бокового амиотрофического склероза.
Практическая ценность
На основе выделенных НСБ и поликлональных AT к ним разработаны иммуноферментные тест-системы их комплексного определения в сыворотке крови и ликворе пациентов с заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ. Используя эти иммуноферментные тест-системы в клинико-лабораторной практике, удалось выявить особенности изменения концентрации НСБ и AT к ним в сыворотке крови в зависимости от степени тяжести и длительности течения заболевания.
Комплексный метод иммуноферментного определения НСБ и анти-НСБ AT в сыворотке крови и ликворе может быть использован в клинико-лабораторной практике для диагностики нервных, психических, нейроонко-
логических, нейроинфекционных или соматических заболеваний, течение которых сопровождается нарушением резистентное ГЭБ.
Динамическое определение уровней НСБ и AT к ним у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и выраженность патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания.
В рамках выполнения программы ограниченных клинических испытаний иммуноадсорбции анти-НСБ антител показано, что этот метод удаления антител к нейроспецифическим белкам из крови является эффективным методом специфической терапии, способной предотвратить развитие аутоанти-тельной агрессии у больных нервно-психическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ на фоне высоких концентраций анти-НСБ антител.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанные способы очистки NSE, GFAP, а^ОР, а|1Ю, агВв позволяют применять их для получения моноспецифических антисывороток и высококачественных препаратов соответствующих антител. Полученные препараты НСБ и анти-НСБ антител дают возможность разработать на их основе иммуноферментные диагностические тест-системы анализа NSE, GFAP, агСР, с^Вв, а^ВО и антител к ним, характеризующиеся точностью, воспроизводимостью, надежностью, и соответствующие общепринятым стандартам.
2. Комплексный иммуноферментный анализ НСБ и анти-НСБ AT в сыворотке крови и в ликворе может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением барьерной функции ГЭБ.
3. Нарушение резистентности ГЭБ не является специфическим процессом, характерным для того или иного заболевания, или внешнего воздейст-
вия, повлекшего за собой его повреждение, а является универсальным патогенетическим механизмом и определяется лишь интенсивностью и продолжительностью патологического воздействия.
4. Количественный динамический анализ НСБ и анти-НСБ AT у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и степень выраженности патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания. Определение концентрации НСБ и AT к ним в критические сроки (7, 14,21 и 30 сутки) патологического процесса позволяет оценить степень репарационных процессов в нервной ткани и степень восстановления ГЭБ, уровень сенсибилизации организма к НСБ, и прогнозировать исход заболевания.
5. Повторный контакт НСБ с иммунокомпетентными клетками приводит к появлению в крови анти-НСБ AT, способных, при определенных условиях, проникать через поврежденный ГЭБ в мозг и связываться с антигенами-мишенями. Для предотвращения патологического воздействия на клетки-мишени возможно применение метода экстракорпоральной иммуноадсорб-ции, позволяющей селективно удалять эти AT из крови больных.
Апробация работы, внедрение, публикации
Диссертация выполнена в соответствии с планами научных исследований ГНЦ ССП им. В.П. Сербского и была апробирована на объединенной научной конференции ГНЦ ССП им. В.П. Сербского.
Результаты диссертационной работы успешно используются в клиниках нервных болезней ММА им. И.М. Сеченова, Российского государственного медицинского университета и НИИ неврологии РАМН. Различные аспекты диссертационной работы явились основанием для планирования новых научных тем, продолжающих данное научное направление.
Основные положения были представлены и обсуждены на VIII International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems (Salt Lake City, Utah, 1997), III European Meeting on dial Cell Function in Health and Disease,
9
Greece, 1998, IV European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Barcelona, 2000; в материалах II Российского Конгресса по патофизиологии, Москва, 2000; на заседаниях Проблемного Совета по биологическим основам психиатрии ГНЦ ССП им. В.П.Сербского, 2000; 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drags", Suzdal, 2001; на Международной конференции «Biochemical and molecular biological aspects of the brain immune system», Yerevan, 2001; V European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Rome, Italy, 2002; на Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии", "Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия", Москва, 2002; на семинаре "Актуальные проблемы современной психиатрии", Томск, 10-11 декабря 2002.; на 3-й школе-семинаре для молодых ученых и международной научной конференции "Белки-маркеры патологических состояний", 2003, г. Астрахань, VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Germany, Berlin 2003.
По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, результаты диссертации включены в монографию «Иммунохимический анализ нейро-специфических антигенов» Москва., "Медицина", 2000. Список публикаций приводится в конце автореферата.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на . . . .страницах машинописи и иллюстрирована .... рисунками. . . . таблицами. Она состоит из введения, 9 глав, выводов и списка литературы, состоящего из......отечественных и.......зарубежных источников.
Содержание работы
Материалы иметоды исследования
Ткань мозга человека, необходимую для получения препаратов НСБ, а также образцы нормальных органов и тканей получали из морга НИИ скорой
помощи им. Н.И. Склифосовского и судебно-медицинского морга № 6 ГУЗ г. Москвы. Для получения препаратов НСБ был использован мозг погибших людей, взятый в первые 6 часов после смерти.
Кроликов, крыс и мышей для работы получали из вивария ГНЦ ССП им. В.П. Сербского, собак - из вивария ГНЦПЗ РАМН и РГМУ.
Образцы сыворотки крови и ликвора больных получали из клиник факультетской хирургии, неврологии и детской неврологии, педиатрии РГМУ, отделения нейрохирургии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, клинической психиатрической больницы № 1 им. Н.А. Алексеева, областной клинической больницы № 1 г. Кемерово, отделений неврологии и нейрохирургии 2-й Областной клинической больницы г. Астрахань. Образцы сыворотки крови доноров получали со станций переливания крови г. Москвы. Все полученные образцы хранились при t = -70° С до момента проведения исследования.
Прорыв ГЭБ у экспериментальных животных осуществляли путем моделирования галоперидоловой нейролепсии (Delay G. и Deniker P., 1961), острой ишемии путем одно- и двухсторонней перевязки сонной артерии (Levine S., 1969.,Чехонин В.П. и соавт, 1988), окклюзии средней мозговой артерии (Menzies S.A. и соавт., 1992), индуцированных гипертермических судорог (Holtzman D. и соавт., 1981), барбитуратового наркоза (Ершов А.Ф.,1984) и острого у-облучения (Mickley G.A. и соавт., 1989). Экспериментальные исследования проводились на половозрелых крысах породы Вистар массой 180-230 г, содержащихся в стационарных условиях с естественным световым циклом и свободным доступом к воде и пище, а также крысятах обоего пола в возрасте 5-8 суток и массой тела 10-15 г. Контрольную группу составляли крысы аналогичной массы тела и возраста.
Забор крови у кроликов проводили из краевой вены уха, у крыс при де-капитации, из бедренной или хвостовой вены. Полученную из образцов крови животных сыворотку хранили до исследования при t = -70° С.
Для выделения и очистки NSE, GFAP и oAGP были использованы схемы Dahl D. (1977), Bignami A.(1979), Grasso A.(1977) и Warecka K.(1972) в нашей
модификации. Для выделения и очистки CtiBG и CI2BG была использована схема Чехонина В.П. (1989).
На разных стадиях выделения и очистки НСБ и анти-НСБ AT применяли следующие биохимические и иммунохимические методы: солевое фракционированием сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на DEAE-52 целлюлозе ("Sigma-AIdrich",CUIA), гидрофобную хроматографию на фе-нил-сефарозе 4В ("Sigma-Aldrich",CHIA), гель-фильтрацию на TOYOPERL HW50 Fine TSK-Gel (Япония), биогеле А-0,5 (Bio-Rad, США) сефакриле S-200 Superfine, сефадексах G-50, 100, 150 и G-200 ("Sigma-Aldrich",CIUA), изохроматофокусирование (Sluyterman L, 1978), аналитический и препаративный электрофорез в ПААГ. Аффинную хроматографию проводили на Con-А сефарозе 4В ("Sigma-Aldrich", США), иммуноаффинную хроматографию — на иммуноадсорбентах с иммобилизованными на сефарозе 4B(-Sigraa-AldrichM,CUIA) НСБ или анти-НСБ AT.
Для очистки GFAP от примесей сывороточного альбумина человека (ЧСА) на последней стадии выделения применяли иммуноаффинную хроматографию на CNBr-сефарозе 4В ("Sigma-Aldrich", США) с иммобилизованными AT к ЧСА. Оценку чистоты выделяемых препаратов НСБ, а также определение их молекулярной массы проводили с помощью электрофореза в ПААГ (Ornstein L, 1964, Davis В, 1964), содержащем додецилсульфат-натрия, с последующей окраской Кумасси G-250.
Схема выделения NSE. GFAP. 0[ BG. ohBG и ctiGP
Водно-солевая экстракиия из ткани мозга человека Гомогенизация ткани мозга в 0,05 М трис-глициновом буфере (pH 8,2), содержащем 0,1%
твина 80 и тритона Х-100. Объемное соотношение ткани мозга и буфера -1:2. После трехкратного замораживания-оттаивания экстракт центрифугируется при 24000 g/30 мин, супернатант подвергается дальнейшему фракционированию.
осавдение (NH^SOi при 60% насыщения, осадок растворяли в растворе (NH^SOi 32% насыщения, затем проводится осаждение охлажденным ацетоном. Полученный осадок растворяли в используемом рабочем буфере и подвергали ионообменной хроматографии.
Ионообменная хроматография ШЭАЭ-иеллюлоза)
собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации NaCl от 0,15 до 0,22 MNaCl.
Гель-фильтрация (TOYOPERL-HW5Q Fine TSK-Gel) собираются фракции, соответствующие молекулярной массе 75 ± 10 кД Гидрофобная хроматография (фенил-сефароза 4В) собираются фракция, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации (NH^SO«
от 1 М до 0,8 М. Изохромато<Ьокусирование собираются фракции, элюирующиеся с РВЕ-геля в диапазоне рН 5,3 - 4,6; собранный раствор диализуется против 0,01М раствора карбоната аммония и лиофилизируется.
Процедура выделения GFAP'
Водно-солевая экстракиия из ткани мозга человека. Фракиионирование суль<Ьатом аммония осаждение (NH^SO« при 40% насыщения; осадок растворяли в растворе (NH4)2S04 20% насыщения; супернатант подвергается дальнейшему фракционированию. Ионообменная хроматография (ЦЭАЭ-иеллюлоза) собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации NaCl от 0,25 до
0,40 М.
Гелъ-фильтуаиия (TOYOPERL-HW5Q Fine TSK-Gel) собираются фракции, соответствующие молекулярной массе 55 ± 10 кД. Гидрофобная хроматография ((Ьенил-сеФароза 4В) собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации (NHO2SO4
от 0,78 М до 0,65 М. Препаративный диск-электрофорез в 7.5% ПААГ экстракция из геля белковой фракции, содержащей GFAP (под контролем иммунодиффу-зионного метода или иммуноблота). Иммуноаффинная хроматография удаление примесей альбумина на CNBr-сефарозе 4В с иммобилизованными кроличьими антителами к сывороточному альбумину человека. Изохроматофокусигювание собираются фракции, элюирующиеся с РВЕ-геля в диапазоне рН 5,95 - 5,65; собранный раствор диализуется против 0,01М раствора карбоната аммония и лиофилизируется.
Процедура выделения at BG
Водно-солевая экстракиия из ткани мозга человека. Фракиионирование сульфатом аммония осаждение (NHi^SOi при 70% насыщения; осадок растворяется в растворе (NIL|)2S04 при 35% насыщения; супернатант подвергается дальнейшему фракционированию. Ионообменная хроматография (ЦЭАЭ-иеллюлоза) собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации NaCl от 0,25 до 0,3 М. Гель-фильтраиия (сефакрил S-200 Superfine) собираются фракции, соответствующие молекулярной массе 110 ±10 кД.
Гидрофобная хроматография (фенш-сефароза 4В) сбор фракций элюата в линейном градиенте концентрации (NHO2SO4 от 0,45 до 0,12 М. Аффинная хроматография собираются фракции, элюирующиеся с сефарозы 4В с иммобилизованным лектином из чечевицы («lentil-lectin») в линейном градиенте концентрации а-метил-О-глюкопиранозы
в диапазоне 0,18 - 0.20М. Изохроматофокусирование собираются фракции, элюирующиеся с РВЕ-геля в диапазоне рН 3,1 - 2,9; собранный раствор диализуется против 0,01М раствора карбоната аммония и лиофилизируется.
Процедура выделения a2BG
Водно-солевая экстракция из ткани мозга человека Фракционирование сульфатом аммония осаждение (NHO2SO4 при 70% насыщения; осадок растворяем в растворе (NH^SO« при 40% насыщении; супернатант подвергается дальнейшему фракционированию. Ионообменная хроматография ШЭАЭ-иеллюлоза) собираются фракции, не связавшиеся с ионообменником Гель-фильтрация iced)акрил S-200 Superfine) собираются фракции, соответствующие молекулярной массе 90 ± 10 кД. Гидрофобная хроматография (фенил-сефароза 4В) сбор фракций элюата в линейном градиенте концентрации (NH^SO* от 0,45 до 0,17 М. Аффинная хроматография (конканаеалин А-сефароза 4В) собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации а-метил-D-глюкопиранозы в диапазоне от 0,15 до 0,3 М. Изохроматофокусирование собираются фракция, элюирующиеся с РВЕ-геля в диапазоне рН 4,25 - 4,1; собранный раствор диализуется против 0,01М раствора карбоната аммония и лиофилизируется.
Процедура выделения а2 GP
Водно-солевая экстракция из ткани мозга человека. Ионообменная хроматография ШЭАЭ-иеллюлоза) Этап 1 - элюция ступенчатым восходящим градиентом концентрации NaCl 0,2-0,5-1,0 М, собираются фракции, выходящие с колонки при концентрации NaCI 1М, диализуются, и
подвергаются повторной ионообменной хроматографии. Этап 2 - собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации NaCl
от 0,65 до 1,0 М. Гель-фильтрация (TOYOPERL-HW5Q Fine TSK-Gel) собираются фракции, соответствующие молекулярной массе 50 ±10 кД. Аффинная хроматография (конканаеалин А-сефароза 4В) собираются фракции, элюирующиеся в линейном градиенте концентрации а-метил-D-глюкопиранозы в диапазоне от 0,15 до 0,3 М. Изохроматофокусирование собираются фракции, элюирующиеся с РВЕ-геля в диапазоне рН 6,1 - 5,3; собранный раствор диализуется против 0,01М раствора карбоната аммония и лиофилизируется.
Очищенные препараты НСБ применяли для иммунизации кроликов с целью получения моноспецифических антисывороток (АС). Для оценки качества АС и поликлональных AT применяли различные варианты иммуно-диффузионного анализа (Ouchterlony О, 1958, Храмкова Н, Абелев Г, 1961), иммуноэлектрофореза (Grabar Р, 1957, Laurell С, 1966), а также иммуноблот (Towbin H. и соавт., 1979). Оценку результатов проводили путем окрашивания понсо S, амидошварц 10В, Кумасси G-250. AT из АС выделяли методом иммуноаффинной хроматографии с помощью иммуносорбентов, приготовленных на основе препаратов соответствующих НСБ и CNBr-сефарозы 4В. Полученные таким образом моноспецифические поликлональные AT использовали для разработки иммуноферментных тест-систем анализа НСБ и анти-НСБ-АТ.
Конъюгацию антител с пероксидазой из хрена VI-го типа. ("Sigma-Aldrich", США) проводили периодатным методом (Nakane P. и соавт., 1974).
Йодирование антител
125,
проводили хлорамидовым методом (Fraker P, 1978). Распределение меченных антител по органам и тканям экспериментальных животных оценивали путем сканирования соответствующих образцов в гамма-счетчике (1260 CompuGamma LKB, Швеция).
Общий белок в исследуемых образцах и на стадиях очистки НСБ определяли при помощи бицинхониновой кислоты (BSA Protein Assay Reagent Kit, Pierce, США) или по Bradford M. (1976).
Иммобилизацию специфических антигенов мозга на твердофазном полимерном сорбенте-носителе проводили по собственной оригинальной методике (Чехонин и соавт., 2000).
Количественный анализ НСБ и AT к ним в исследуемых образцах сыворотки крови и ликвора проводили методом "сэндвич'-варианта иммунофер-ментного анализа (Voller А. и соавт., 1976), и двухцентрового иммуносорб-ционного иммуноферментного анализа (Yamamoto R. и соавт., 1986) в нашей модификации (Чехонин В.П., 1989). Определение оптимальных концентраций раствора антител, применяющегося для активации полистирольных
планшетов, а также оптимального разведения конъюгата антител с ферментом осуществлялось в каждом конкретном случае экспериментально Стандартизацию разработанных иммуноферментных тест-систем для определения НСБ и AT к ним проводили в тестах надежности, точности, специфичности и воспроизводимости, используя критерии, принятые для радиоиммунных методов (Ткачева Г.А. и соавт., 1983) и адаптированные для иммуноферментно-го анализа (Калашников В.В. 1986).
Статистический анализ результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами при помощи пакета статистических программ Prophet 5.0 (BBN SYSTEMS AND TECHNOLOGIES, A Division of Bolt Bera-nek and Newman Inc., 1996).
Результатысобственныхисследований
I. Получение препаратов НСБ, анти-НСБ-антител и разработка иммуноферментных методов их анализа
Используя приведенные выше схемы выделения нейроспецифических белков, были получены гомогенные препараты НСБ (Рис.1 А.), иммунизация которыми позволила получить моноспецифические антисыворотки. Из АС методом иммуноадсорбции были выделены соответствующие препараты по-ликлональных AT (Рис. 1 Б.).
Рис. 1 А. Диск-элекгрофореграммы препаратов НСБ в 8В8-ПААГ (1 - препарат ОРАР,2-аг 6Р, З-аг Вв, 4-а) Вв, б-ШЕ), 6 - стандарты белковых маркеров с соответствующими молекулярными массами 14,21,30,46,67,92 и 200 кДа.
На основе стандартных препаратов НСБ и анти-НСБ антител разработаны иммуноферментные тест-системы их анализа. Предел чувствительности "сендвич" варианта иммуноферментного определения NSE, GFAP, и 012 GP составил 1 нг/мл, анти-NSE и анти-GFAP AT - 0,8 нг/мл, a анти-аг GP AT -0,9 нг/мл.
кД» _
92- ' 1
» I '
* Ь Ч
I 1'г *
46- ' \ <
>
30- [ -
Г" Г "
1 2
Рис. 1Б. Результатыиммуноблот-анализапрепаратовШЕ(1), СРАР(2), (»2 6Р (3), а.2 Вв (4), (*1 ВО (5) с соответствующими поликлоналышми антителами.
Иммуноферментный анализ (ИФА) <Х| Вв и аг Вв на основе колоночного микрореактора имел предел чувствительности 50 пг/мл и 100 пг/мл соответственно, анти-с»! ВС и анти-аг ВО антител - 0,35 нг/мл. Для определения концентрации каждого НСБ и соответствующих AT строились калибровочные кривые (Рис 2,3,4,5).
Таблица 1.Физико-химические свойства NSE, GFAP, агСР, С^ВС и а^ВС.
ИБЕ ОБ АР <х2СР а|ВО а2ВС
Относительная молекулярная масса (по результатам гель-фильтрации), кД 75+10 55+5 52+5 110±10 90+10
Изоэлектрическая точка 4,6-5,3 5,65-5,95 5,3-6,0 2,9-3,1 4,1-4,3
Рис. 2. Калибровочные кривые иммуноферментного определения агвР и вРАР.
Рис. 3. Калибровочные кривые иммуноферментного определения АТ к№Е,
агОРноБАР.
Рис.4. Калибровочные кривые иммуноферментного определения си Вв и а^ Вв.
0.0 ........——•— I • ■ • ■ I ■ ■ • • I
0 5 10 15 20 25-
Концапрщня, тЛа
Рис.5. Калибровочные кривые иммуноферментного определения АТкО| ВО и а.1 ВО.
После проверки разработанных иммуноферментных тест-систем на точность, надежность и специфичность, и в соответствии с поставленными задачами, они были использованы в дальнейшей работе для определения НСБ и AT к ним в биологических жидкостях пациентов и экспериментальных животных.
II. Иммуноферментный анализ НСБ и анти-НСБ антител в сыворотке крови
больных
Всего было обследовано ИЗО больных с нервными, психическими, инфекционными заболеваниями, черепно-мозговыми травмами, онкологическими заболеваниями ЦНС, с нейротоксическим синдромом, сопровождающим соматические заболевания, а также 190 новорожденных детей с нарушением мозгового кровообращения (НМК) Ш-Ш степени. Контрольная группа была представлена 84 здоровыми донорами обоего пола.
Результаты исследований показали, что нарушение резистентности ГЭБ наиболее часто отмечается при менингитах различной этиологии, при менин-гоэнцефалитах, закрытой и открытой черепно-мозговой травме, НМК ЬП-Ш степени у новорожденных детей, некоторых видах опухолей головного мозга,
а также при ряде критических состояний, обусловленных фебрильной шизофренией, нейролепсией и др. (Таб. 2). Данные проведенного исследования показали, что при ряде заболеваний определение только одного НСБ не всегда позволяет достоверно подтвердить или опровергнуть прорыв ГЭБ у конкретного больного. Это можно объяснить тем, что один и тот же патологический процесс у разных пациентов нередко характеризуется нарушением резистентности ГЭБ и элиминацией в кровь различных НСБ. Причем их концентрации также могут отличаться, т. е. весьма вероятно, что при повышенном уровне одного антигена в крови уровень другого НСБ может не превышать донорский. Донорский уровень нейроспецифических белков в сыворотке крови контрольной группы составил для а2 <7 нг/мл, а! Вв < 0,05 нг/мл, а2 Вв < 0,1 нг/мл.
Полученные результаты послужили основанием для проведения комплексного иммуноферментного анализа, который предполагал одновременное определение всех пяти НСБ в одном образце сыворотке крови, повышая, таким образом, вероятность выявления НСБ, уровень которого бы превышал донорский.
Таблица 2. Сводная таблица результатов ИФА НСБ в сыворотке крови больных.
Диагноз Кол-во больных Количество больных с уровнем НСБ, превышающим донорский, (%)
ЫБЕ вРАР аг вР а, ВО <*2 Вв
Критические состояния, обусловленные фебрильной шизофренией 30 23 20 20 67 57
Критические состояния, обусловленные острой алкогольной энцефалопатией 28 18 10 10 54 50
Критические состояния, обусловленные нейролепсией 39 28 23 20 54 56
Болезнь Паркинсона 15 13 0 13 0 0
Диагноз Кол-во больных Количество больных с уровнем НСБ, превышающим донорский, (%)
ИБЕ вРАР а2 вР СИ ВО Я2 ВО
Рассеянный склероз в Фазе обострения 34 24 20 26 29 26
Рассеянный склероз ■ в фазе ремиссии 48 8 4 6 2 2
Инсульт геморрагический 58 24 27 22 60 57
Инсульт ишемический 72 33 26 24 66 66
Менингит гнойный 88 41 44 26 70 57
Менингит серозный 88 19 24 22 59 42
Менингит вирусный 88 35 33 23 63- 65
Менингоэнцефалит 76 42 42 25 58 62
Болезнь Лайма 29 10 65 72 96 72
Астроцитома 16 12 62 75 50 56
Нейробластома 14 43 7 0 7 0
Олигодендроглиома 20 15 45 60 55 60
Низкодифференциро-ванная опухоль головного мозга. 21 10 48 19 40 43
Критическое состояние, обусловленное развитием перитонита 30 23 30- 13 30 27
Черепно-мозговая травма открытая 52 50 42 46 44 50
-закрытая 94 45 39 41 37 21
Критические состояния у новорожденных детей, обусловленные НМК I степени 48 31 33 20 25 29
Критические состояния у новорожденных детей, обусловленные НМК П степени 60 35 38 27 50 47
Критические состояния у новорожденных детей, обусловленные НМК Шстепени 82 37 40 32 54 52
Результаты комплексного ИФА пяти НСБ в сыворотке крови больных
представлены в Таб. 3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что
вероятность диагностики прорыва ГЭБ при комплексном определении пяти
НСБ в среднем возрастает на 16%.
Таблица 3. Результаты индивидуального и комплексного ИФА^Е, GFAP, а2СР, о^ВС и а2ВС в сыворотке крови больных с открытой черепно-мозговой травмой (ОЧМТ) и геморрагическим инсультом.
СБ АР ЫБЕ а! ВС а, ВС а2 СР
ОЧМТ (п=52). Результаты определения только одного НСБ (% положительных результатов). 42 50 44 50 46
ОЧМТ (п=52). Результаты комплексного определения пяти НСБ (% положительных результатов). 61
Геморрагический инсульт (п=58). Результаты определения только одного НСБ (% положительных результатов). 22 11 59 58 18
Геморрагический инсульт (п=58). Результаты комплексного определения пяти НСБ (% положительных результатов). 64
Сопоставляя стадийность и тяжесть течения заболевания с концентрацией НСБ в сыворотке крови, можно было отметить совпадение пика концентрации исследуемых белков с тяжестью состояния пациента. Наиболее опасный период для больных, находящихся в тяжелом или критическом состоянии, обычно приходится на 5-10-е сутки от начала развития заболевания. Именно в это время выявляется максимальная (в 15-20 и более раз выше нормы) концентрация НСБ в сыворотке крови. Благоприятный исход заболевания характеризовался стабилизацией уровня НСБ в крови к 14-17 суткам и постепенным снижением их концентрации к 20-30-м суткам. (Рис.6).
Анализируя в определенные сроки, обычно на 5-7-14 день от начала заболевания уровень НСБ в сыворотке крови, можно с высокой степенью достоверности судить о процессах восстановления барьерной функции ГЭБ. Если концентрация НСБ в сыворотке крови больных превышала донорский уровень не менее чем в 4-6 раз, к 5-7 суткам у таких пациентов в ряде случаев
О -------.---,-
1 5 7 10 15 20 25
Время от начала развития критического состояния, сутки - ■» - ыгЕ — —вРАР —*— а-2ГП
Рис. 6. Результаты ИФА №Е, ОБ АР и агвР в сыворотке крови больных в динамике критического состояния, обусловленного острой алкогольной энцефалопатией.
начинали определяться АТ к НСБ, достигая максимальной концентрации к 14-19 суткам. Поэтому было принято решение провести исследование по определению АТ к пяти НСБ всем больным, у которых предварительно определяли ШЕ, вРАР, агОР, с^Вв и агВв. (Таб. 4). Следует отметить, что в 84 образцах сыворотки крови контрольной группы АТ к этим НСБ не выявлялись.
Как и ожидалось, АТ к НСБ были выявлены в тех же группах больных, у которых ранее отмечались максимальные уровни этих белков. Концентрация АТ обычно достигала своего максимума к 18-21-м суткам, затем начинала снижаться, и при благоприятном течении заболевания к 45-м суткам АТ в сыворотке крови практически не определялись у большинства пациентов (Рис.7.). Анализируя и сопоставляя эти данные с тяжестью течения заболевания, можно сделать вывод о том, что наиболее опасный, кризисный период заболевания приходится на 7 - 12-е сутки от начала развития заболевания или критического состояния. Именно в этот период выявлялась максимальная
| 250
х
| 100 | 50
концентрация НСБ, и начинали определяться АТ к ним. Снижение концентрации АТ к НСБ после 21 - 24-х суток на фоне нормализации уровня НСБ косвенно свидетельствовало о восстановлении ГЭБ и предвещало благоприятный выход больного из критического состояния. Напротив, отсутствие АТ
1 5 7 10 15 20 25 30 35 40 Время от начала развития критического состояния, сутки - - ♦ • -АТ к N56 —о— АТ к СЯАР —А—АТ ка-2 ГП
Рис. 7. Результаты ИФААТ к №Е, ОЕАР и а^вР в сыворотке крови больных в динамике критического состояния, обусловленного острой нейролепсией.
в сыворотке крови к 10-м суткам и продолжающееся нарастание уровня НСБ косвенно указывали на отсутствие нормализации функции ГЭБ, прогнозируя тем самым неблагоприятный исход.
Таблица 4. Результаты ИФА АТ к НСБ в сыворотке крови больных.
Диагноз Кол-во больных Количество больных с выявленными анти-НСБ антителами, (%)
АТк ГОЕ АТк ОБАР АТк а2СР АТк аДО. АТк а2 Вв
Критические состояния, обусловленные фебриль-ной шизофренией 30 10 13 10 20 17
Критические состояния,-обусловленные острой алкогольной энцефалопатией 28 7 7 4 21 14
Диагноз Кол-во Количество больных с выявленны-
больных ми анти-НСБ антителами, (%)
АТк АТк АТк АТк АТк
N88 ОБАР а2ОР сиВв аг ВО
Критические состояния, обусловленные нейролеп- 39 18 10 8 15 18
сиеи
Болезнь Паркинсона 15 0 0 0 0 0
Рассеянный склероз в Фазе обострения 34 9 8 9 12 12
Рассеянный склероз в фазе ремиссии 48 0 0 0 0 2
Инсульт геморрагический • 58 8 8 6 19 13
Инсульт ишемический 72 10 5 5 -13 9
Менингит гнойный 88 10 9 7 16 17
Менингит серозный 88 7 6 5 14 9
Менингит вирусный 88 11 11 7 17 17
Менингоэнцефалит 76 17 16 10 22 20
Болезнь Лайма 29 38 24 31 45 45
Астроцитома 16 0 13 6 12 12
Нейробластома 14 14 0 0 0 0
Олигодендроглиома 20 14 15 0 5 25
Низкодифференцирован- 21 14 14 0 0 10
ная опухоль головного
мозга.
Критическое состояние, обусловленное развитием 30 3 3 3 6 3
перитонита
Черепно-мозговая травма 52 25 21 23 21 19
открытая
-закрытая 94 13 7 15 14 16
Критические состояния у 48 0 2 0 0 0
новорожденных детей, обусловленные НМК
I степени
Критические состояния у 60 1 3 3 2 3
новорожденных детей, обусловленные НМК
II степени
Критические состояния у 82 4 2 4 2 5
новорожденных детей, обусловленные НМК
III степени
По аналогии с комплексным анализом НСБ в сыворотке крови было принято решение о проведении комплексного иммуноферментного анализа по определению антител ко всем пяти НСБ в одном образце сыворотке крови. Полученные нами результаты свидетельствовали о том, что при этом в сре-нем на 13% возрастает вероятность выявления AT к НСБ (Таб. 5.).
Таблица 5. Результаты индивидуального и комплексного ИФА AT к NSE, GFAP, <ХгСР, с^ВО и агВО в сыворотке крови больных с открытой черепно-мозговой травмой (ОЧМТ) и геморрагическим инсультом.
Диагноз АТ к СБАР АТ к ЫБЕ АТк а, Вв АТк а2ВО АТ к а2СР
ОЧМТ (п=52). Результаты определения АТ к одному НСБ (% положительных результатов) 21 25 21 19 23
ОЧМТ (п=52). Результаты определения- АТ к пяти НСБ (% положительных результатов) 32
Геморрагический инсульт (п=58). Результаты определения АТ к одному НСБ (% положительных результатов) 8 8 19 13 8
Геморрагический инсульт (п=58). Результаты определения АТ к пяти НСБ (% положительных результатов) 24
III. Иммуноферментный анализ НСБ и анти-НСБ антител в оценке проницаемости ГЭБ животных при экспериментальных воздействиях на ГЭБ
В соответствии с поставленными задачами, следующим этапом работы стало экспериментальное исследование взаимосвязи между интенсивностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ и концентрацией НСБ в сыворотке крови крыс. Кроме этого, исследовался эффект проникновения анти-НСБ антител через поврежденный ГЭБ. Для оценки проницаемости ГЭБ у животных применяли ИФА GFAP и 0C2GP, являющихся межвидовыми белками, что позволило использовать в этих экспериментах иммуноферментные тест-системы, разработанные нами для определения GFAP и oAGP в сыворотке крови человека.
Для определения нормального уровня GFAP и в сыворотке крови крыс нами исследовалась контрольная группа, состоящая из 30 животных. Оказалось, что максимальное значение концентрации GFAP не превышало 16 нг/мл (среднее - 7,6+1,2 нг/), а ajGP не превышало — 15,6 нг/мл (среднее — 8+1,3 нг/мл). Данные значения — 7,6 нг/мл и 8 нг/мл и были приняты нами за нормальный уровень данных НСБ у интактных крыс.
Прорыв ГЭБ у крыс вызывался с помощью острого гамма-облучения, острой ишемии головного мозга, экспериментальной галоперидоловой ней-ролепсии, барбитуратового наркоза и гипертермических судорог. Все эти экспериментальные модели в той или иной степени аналогичны состояниям и заболеваниям, встречающимся у человека и приводящим к нарушению нормального функционирования ГЭБ.
1. Иммуноферментный анализ GFAP и (X2GP в сыворотке крови крыс, подвергшихся острому гамма-облучению, позволил выявить эффект повышения проницаемости ГЭБ для этих антигенов. Острое гамма-облучение крыс в дозе от 1 до 10 Гр вызывало прорыв ГЭБ по отношению к GFAP и который определялся по элиминации в кровь этих белков уже на 20-й минуте после воздействия ионизирующим излучением, достигая своего мак-
симума к 100-120 минуте. При этом была выявлена зависимость между увеличением дозы облучения и увеличением концентрации этих белков в сыворотке крови. Так, если при дозе в 1 Гр пиковая концентрация ОРАР составляла 50+4,7 нг/мл, а агвР -около 90+9,2нг/мл, то при дозе в Ю Гр -190+18,7 и 230+24,6 нг/мл соответственно (Рис.8). Таким образом, иммунофермент-ный скрининг ОРАР и агСР обеспечивает объективный анализ степени повреждения ГЭБ ионизирующим излучением в первые часы после радиационного воздействия, и позволяет косвенно оценить степень повреждения ГЭБ (и соответственно ЦНС).
Рис. 8. Результаты ИФА ОРАР в сыворотке крови крыс после острого у-облучения.
2. Прорыв ГЭБ по отношению к ОРАР и агвР был выявлен и при экспериментальной галоперидоловой нейролепсии у крыс. Введение внутрибрю-шинно галоперидола в дозе 25 мг/кг вызывало у крыс развитие характерного нейролептического симптомокомплекса, который возникал на 10-й - 20-й минуте после инъекции. В дальнейшем нейролептическая симптоматика нарастала, достигая максимума к 30—70-й минуте после введения препарата, затем наблюдалось ее ослабление, а к 6 часам она практически не обнаруживалась.
Введение галоперидола в дозах, менее 10 мг/кг, не вызывало нарушения
целостности ГЭБ. С^СР начинал обнаруживаться в сыворотке крови крыс
лишь при дозах галоперидола, превышающих 10 мг/кг, a GFAP — 15 мг/кг.
Максимальная концентрация агвР в сыворотке крови приходилась к 3 часу, а
GFAP — к 5 часу от момента введения галоперидола (Рис.9.). На 3-й сутки их
сывороточные концентрации практически не отличались от нормального
уровня этих НСБ в крови.
Результаты этого эксперимента подтвердили вероятность клинической
ситуации, которая может иметь место при применении нейролептиков, когда 1 в о -
О 2 4 « е 10 12 14 1« 1(20 55 24 2« 2« Д о >• Г. Л О О . р » Д О Л . (а П.г)
Рис.9. Зависимость изменения концентрации GFAP и агбР в сыворотке крови крыс от дозы введенного галоперидола.
на фоне развития острой нейролепсии может иметь место реальная угроза прорыва ГЭБ и элиминации НСБ в кровь.
3. Третьей серией экспериментов по изучению проницаемости ГЭБ под влиянием различных факторов, стало моделирование острой ишемии головного мозга у крыс.
Острую ишемию головного мозга у крыс моделировали путем односторонней перевязки сонной артерии. Односторонняя перевязка общей сонной артерии вызывала выраженную ипсилатеральную ишемию головного мозга, сопровождавшуюся элиминацией в кровь НСБ. Однако, в отличие от прорыва ГЭБ, вызванного острой нейролепсией, в данном случае нарушение проницаемости ГЭБ отмечалось лишь через 15—20 ч после проведенной окклю-
зии, при этом концентрация GFAP не превышала 15+1,3 нг/мл, (X2GB- не более 20+ 2,2 нг/мл. Уровень концентрации GFAP и CX2GP в крови продолжал подниматься, достигая максимума к 3—4 суткам (70-80 нг/мл) (Рис. 10.).
Односторонняя окклюзия сонной артерии сопровождалась появлением НСБ в крови, но не приводила к выработке AT к этим антигенам. Однако вторичная окклюзия другой сонной артерии, проведенная спустя 1 месяц после первой, вызывала повторный прорыв ГЭБ и способствовала появлению
100
i 80
"t
х
I 60
I 40
s
I 20 0
6 12 18 24 48 72 96 120 Время после односторонней перевязки сонной артерии,часы
—4—GFAP —•- a2GP
Рис. 10. Динамика изменения концентраций GFAP и CC2GP в сыворотке крови крыс после операции односторонней перевязки сонной артерии.
AT к НСБ в сыворотке крови у 12% крыс, входивших в экспериментальную группу. AT у этих крыс начинали определяться на 5 сутки и достигая своего максимума к 12-14-м суткам после проведенной операции.
4. Следующим экспериментом стало моделирование прорыва ГЭБ за счет индуцированных гипертермических судорог у новорожденных крысят. В ряде работ (Germano I.M. и соавт., 1996., Holmes GX. и соавт., 1998, Bridget К. McCabe. и соавт., 2001) были продемонстрированы морфологические изменения в клетках различных структур головного мозга (гиппокампе, зубчатом ядре и др.), нарушение поведенческих реакций или поглощение меченого уридина вследствии гипертермических судорог.
Прорыв ГЭБ моделировали путем стимуляции судорожных пароксизмов у новорожденных крысят при воздействии инфракрасного излучения с по-
следующей регистрацией в сыворотке крови вРАР. Одновременно проводилось испытание стабилизирующего действия глюкокортикоида дексаметазо-на (БЕХ; препарат "Дексазон" фирмы "Кгка", Словения) на функции ГЭБ при данной модели его повреждения;
о -I—.—.—.—.—.—.—.—,—.—,—,—,—.—.—,—.—.—^—,—.——,— О 5 1 0 1 5 20 25
Время (ч)
Рис. 11. Результаты ИФА вРАР в сыворотке крови новорожденных крысят после индуцированных пшертермических судорог. (БЕХ -дексазон).
Концентрация вРАР в сыворотке крови у животных контрольной группы не превышала 11+1,8нг/мл, в то время как максимальный уровень вРАР у животных, перенесших однократный приступ индуцированных гипертермических судорог, достигал 88+9,9 нг/мл. (Рис.11.) Предварительное профилактическое введение дексаметазона способствовало понижению сывороточной концентрации вРАР, определяемой на высоте судорог, до 32+3,7 нг/мл. В то же время ведение дексаметазона спустя 30-минут после начала судорожного приступа приводило примерно к 2-х кратному снижению концентрации вРАР, до 43+4,5 нг/мл. Введение глюкокортикоида спустя 3 часа после начала судорог практически не снижало уровня вРАР. Полученные результаты свидетельствуют о важности максимально раннего начала проведения лекар-
ственной терапии (в частности, применения глюкокортикоидов) в условиях развивающегося повреждения ГЭБ.
5. Следующей экспериментальной моделью, отражающей реальную клиническую ситуацию, может служить острая интоксикация барбитуратами. Барбитураты оказывают выраженное токсическое действие на ЦНС, основанное на развитии гипоксии и нарушении окислительных процессов в органах и тканях на клеточном уровне.
Исследуя возможность прорыва ГЭБ крыс на фоне внутрибрюпшнного введения наркотической(снотворной) и токсической (смертельной) доз бар-битала натрия (БН), удалось выявить повышение проницаемости ГЭБ по отношению к GFAP и с^вР.
После введения крысам наркотической дозы БН (280 мг/кг) уже через 1 час концентрация GFAP в сыворотке крови составляла в среднем 45+4,3 нг/мл и 53+5,9 нг/мл д л ИгН&ч иная со 2-го и по 12-й час, концентрации НСБ оставались практически неизменными и составляли в среднем нг/мл и 70+6,2 нг/мл соответственно. Спустя 24 часа отмечалось постепенное снижение концентрации GFAP и агОР до уровня 34+2,1 нг/мл и 38+2,6 нг/мл соответственно, а к 72 часу эксперимента концентрации исследуемых белков соответствовали их нормальному уровню в сыворотке крови (Рис.12.).
[Ь < — £ í 1
£ 1
\rV77l • Ш хгт пет
контроль 1 2 6 12 24 72 144
время а часах
□ БРАР Иа2-вР
Рис. 12. ИФА GFAP и «гвР в сыворотке крови крыс после введения наркотической (снотворной) дозы барбитала натрия.
В случае введения крысам токсической дозы БН (480 мг/кг), отмечалось более выраженное повышение концентрации обоих исследуемых белков, которая через 1 час после введения препарата составила 96+3,9 нг/мл для GFAP и 83+2,3 нг/мл для ОгвР. Эти концентрации практически не менялись
Рис. 13. ИФА GFAP и азбР в сыворотке крови крыс после введения токсической (смертельной) дозы барбитала натрия.
до момента смерти, наступавшей приблизительно к 3-му часу от момента инъекции (Рис.13.).
Результаты, полученные в ходе проведения этого эксперимента позволяют сделать вывод о том, что при отравлении барбитуратами имеет место нарушение проницаемости ГЭБ, причем этот эффект имеет дозозависимый эффект. Применение метода иммуноферментного анализа НСБ в сыворотке крови у пациентов с отравлением препаратами барбитуратов может служить дополнительным критерием оценки степени тяжести состояния пострадавших. Дальнейшим этапом работы стало исследование возможности проникновения AT к НСБ из крови в мозг через поврежденный ГЭБ.
IV. Исследование проникновения анти НСБ антител через гематоэнцефалический барьер крыс путем анализа их селективного накопления в ткани головного мозга
Считается, что процессы проникновения (пенетрации) аутоантител к НСБ через поврежденный ГЭБ и их взаимодействие с клетками-мишенями
могут иметь место и и определегптугп гтпттпгтптггтгуЮ.роль и некохо_
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ/ I БИБЛИОТЕКА ! ] СПетсрбург I 33
1 О» НО акт 1
рых нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваниях, сопровождающихся поражением ГЭБ (Bluestein H.G. и соавт., 1983, Hung K.L. и соавт., 1995, Silber Е. и соавт., 2002).
Для подтверждения феномена проникновения анти-НСБ антител через поврежденный ГЭБ были проведены экспериментальные исследования возможного эффекта пенетрации и накопления меченных1251 моноклональных антител (МАТ) к GFAP и NSE в ткани мозга крыс на фоне поврежденного ГЭБ. Меченные 12iI МАТ к GFAP, NSE, а также неспецифические по отношению к НСБ меченные мыши были введены внутривенно крысам, подверг-
шимся операции окклюзии левой средней мозговой артерии (ОСМА), а также здоровым, не оперированным крысам. Через 24,48 и 72 часа, после предварительной перфузии животного через левый желудочек, проводили забор мозга, иечени, селезенки, почек и щитовидной железы.
I 0,12
I 0,1
о 0,08
S 0,06
^ 0,04
m
S 0,02
£ О
Рис. 15. Резрьтагы определения радиоакшвносш мозга крыс после в/в введения меченных 12iI IgG, антител к GFAP и NSE спустя 48 часов после ОСМА
Кроме этого, через определенные промежутки времени отбирали образцы крови. Во всех полученных образцах определялась радиоактивность в перерасчете на 1 г ткани.
Крысам были введены пробы объемом 300 мкл, с активностью »16,31+ 1,4'106 срм (count per minute - количество импульсов в минуту), что соответствовало 5,5 мкг анти GFAP МАТ (8,4 микрокюри/мкг белка), 5,6 мкг IgG (8,2 микрокюри/мкг белка) и 9,5 мкг анти NSE MAT (8 микрокюри/мкг белка).
т
■1
S в
1 < -
И
1 ,.;-„! а*. "г
IgG МАТ к GFAP МАТ к NSE
Распределение меченных 1-125 антител в мозге крыс с ОСМА
Определение радиоактивности в исследуемых образцах свидетельствовало о том, что распределение 1251 меченных IgG, анти GFAP и анти NSE МАТ в щитовидной железе, печени, почках и селезенке практически не отличалось как для специфических МАТ, так и для неспецифических IgG мыши.
В то же время оказалось, что специфические анти-НСБ-АТ накапливаются в ткани мозга крыс в количестве 0,09 % от введенной дозы, что практически в четыре раза превышало аналогичный показатель для неспецифических иммуноглобулинов (0,024%)(Рис.15., Таб. 5.).
Таблица 5. Результаты определения радиоактивности ткани мозга крыс с ОСМА через 48 часов после введения меченных 1251 _IgG мыши, анти GFAP MAT и анти NSE MAT.
анти GFAP МАТ, (п=5) IgG, (п=6) анти NSE МАТ (п=5)
срм /1 г мозга 8268+1842 1668+2242 8641+1961
% от введенной дозы/1 г мозга 0,0466+0,011 0,0117+0,0045 0,046+0,009
Отношение срм в левом / правом полушарии 15,84+3,21 3,76 8,09
срм, целый мозг 16040+3664 3365+214 16777+4389
% от введенной дозы, целый мозг 0,091+0,02 0,024+0,009 0,089+0,017
Активность введенного препарата, срм 17758080 14912993 17500000
п - число экспериментальных животных; срм-количество импульсов/мин.
В контрольной (не оперированной) группе крыс меченные 1251 IgG и МАТ к GFAP и ^Е в мозге определялись в количестве 0,01% от введенной дозы. Анализируя полученные результаты, необходимо отметить, что эффект проникновения и накопления в ткани мозга таких высокомолекулярных соединений как антитела, в первую очередь определяется сохранностью и функциональной целостностью ГЭБ, и уже затем специфичностью антител по отношению к тем или иным нейроспецифическим белкам. Поэтому функциональную целостность ГЭБ следует считать первостепенным по значимости фактором, определяющим проникновение любых молекул через ГЭБ. Естест-
венно предположить, что при ряде заболеваний, сопровождающихся нарушением функций ГЭБ, в крови могут появляться анти-НСБ антитела (Чехонин В.П. и соавт., 1989, 2000,'Zoppo G. и соавт., 2000., Farkas E. и соавт., 2001). Эти антитела, в свою очередь, при определенной ситуации способны проникать через поврежденный ГЭБ в мозг и специфически связываться с клетками-мишенями (Bard F. и соавт., 2000, Banks W.A. и соавт., 2002. Pardrige W. и соавт.,1996,2003).
V. Экстракорпоральная иммуноадсорбция анти-НСБ антител в эксперименте
и клинике
Ранее показано, что удаление циркулирующих в крови аутоантител при целом ряде заболеваний (миастения, синдром Гийена-Барре, рассеянный склероз, поли-и дерматомиозиты и др.) может быть эффективным видом терапии (Лопухин Ю.М, 1984., Avanzi G., 1993., Grob D. и соавт, 1995). В связи с этим была предпринята попытка разработать и исследовать в эксперименте, а впоследствии и в клинической практике метод экстракорпоральной имму-носорбции, позволяющий проводить высокоселективное удаление анти-НСБ антител из крови за счет реакции антиген — антитело.
Эта работа состояла из следующих этапов:
1). Подготовка твердофазного сорбента-носителя для иммобилизации специфических антигенов мозга.
2). Иммобилизация специфических антигенов мозга (GFAP, NSE, ajBG, a2BG, CI2GP) на твердофазном сорбенте-носителе.
3). Получение иммуносорбента и оценка прочности связывания иммобилизованных антигенов с твердофазным носителем, гемосовместимости, токсичности и непосредственно иммуносорбционных свойств.
4). Экспериментальное обоснование эффективности и безопасности экстракорпоральной иммуносорбции.
5). Ограниченные клинические испытания метода экстракорпоральной иммуносорбции в клинике.
В качестве твердофазного носителя применялась высокомолекулярная матрица, представляющая собой сополимер стирола и дивинилбензола с введенными в его структуру оксиметилполистирилфосфоновокислотными
группами (К-2-6), любезно предоставленная лабораторией синтеза и исследования сорбентов РХТУ им. Д.И. Менделеева (зав. лабораторией - профессор Ю.А. Лейкин): Твердофазный носитель конъюгировали с высокоочищенны-ми препаратами нейроспецифических белков. Стерилизацию готового имму-носорбента проводили у-облучением дозой в 10 кГр.
Оценку гемосовместимости, токсичности и иммуносорбционных свойств сорбента проверяли в экспериментах на мышах, крысах, кроликах и собаках. Эти исследования показали отсутствие токсичности, хорошую гемосовме-стимость и высокие иммуносорбционные свойства разработанного иммуно-сорбента.
Динамика восстановления уровня АТ к НСБ у кроликов, предварительно иммунизированных препаратами НСБ, после процедуры иммуносорбции свидетельствовала о том, что приблизительно 7 - 10% от исходного количества АТ восстанавливается уже через 24 ч после иммуносорбции. К концу 2-х суток их уровень достигал 40 - 50%, а после 4-х суток уже соответствовал показателю до сорбции (Рис.16.). Эти результаты свидетельствовали об отсутствии так называемого «геЬоипё-феномена», нередко наблюдаемого при проведении селективного удаления антител из крови, хотя скорость восстановления концентрации АТ в сыворотке крови все же была достаточно высокой.
После дополнительной серии токсикологических экспертиз, проведен-
1 150
1 125
чГ 100
I 75
| 50
§. 25
5 0
Рис. 16. Динамика восстановления уровня антител к GFAP и (ХЭОР в сыворотке крови кроликов после процедуры экстракорпоральной иммуносорбции (животные иммунизировались очищенными препаратами гетерологических антигенов).
ных во ВНИИМТ МЗ СССР и РФ, этот иммуносорбент в рамках программы ограниченных клинических испытаний метода экстракорпоральной иммуно-адсорбции был рекомендован для клинического применения (протокол №2 Комиссии АУМ МЗ СССР от 1987 г., заключение ВНИИМТ СССР №34/9313 от 1988 г. и ВНИИМТ РФ №34/2442 от 2001 г.).
Для клинических испытаний были отобраны 3 больных, находившихся в критическом состоянии, обусловленном тяжелой нейролепсией, возникшей на фоне лечении шизофрении, и один больной с бульбарной формой бокового амиотрофического склероза. Основными критериями для проведения процедуры экстракорпоральной иммуноадсорбции стало наличие АТ к НСБ в ликворе, и угроза развития отека мозга.
Эффективность иммуноадсорбции оценивалась по изменению концентраций АТ к НСБ в сыворотке крови до и после иммуносорбции. Результаты мониторинга определения анти-НСБ-АТ показали, что в течение 12 ч после иммуносорбции удаленные АТ в сыворотке крови больных на пределе чувствительности иммуноферментных тест-систем не обнаруживались. К концу 1-х суток их концентрации восстанавливались в среднем на 1 - 6% от исходного уровня, в конце 2-х — на 6 - 12%, 3-х — на 30 - 50%, а к концу 4 - 5-х суток достигали исходных значений (Рис.17.).
Время после иммуносорбции, сутки - АТкСРАР—.АТкагвР
1 2 3 4 5 6
Время после иммуносорбции, сутки
|—»—СРАР » а-1В6 - ■*- а-2Вб —О- а-20Р |
Рис. 17. Динамика восстановления уровня АТ к НСБ в сыворотке крови больных после процедуры иммуносорбции.
После каждой процедуры иммуносорбции проводился количественный анализ АТ, адсорбированных на иммуносорбенте (Таб. 6.).
Таблица 6. Количество (мкг) АТ к НСБ, извлеченных из крови трех пациентов при проведении процедуры экстракорпоральной иммуносорбции.
Больной АТк АТ к а2ОР АТк АТк Всего
ОРАР а,ВО а2ВО
П. 260 580 230 210 1280
П. 490 270 210 250 1220
Б. 270 300 120 140 830
Процедуры иммуносорбции у трех больных психическими заболеваниями проводились с применением сорбента, на поверхности которого были иммобилизованы а^ ОР, вРАР, а] и а г ВО. Аналогичная процедура у больного с бульбарной формой бокового амиотрофического склероза проводилась с применением иммуносорбента, на котором в качестве антигенов были иммобилизованы (Хг ОР, вРАР, и МБР (основной белок миелина), любезно предоставленный к.м.н. Семеновой А.В. Выбор этих НСБ был продиктован наличием в сыворотке крови и в ликворе пациента АТ именно к этим антигенам. После проведения процедуры иммуносорбции с сорбента было элюировано в общей сложности 177 мкг анти-НСБ антител (Таб. 7.)
Таблица 7. Количество (мкг) АТ к НСБ, извлеченных из крови пациента при проведении процедуры экстракорпоральной иммуносорбции.
Таким образом, проведенные лабораторные исследования, стендовые и клинические испытания позволяют сделать вывод о том, что высокоселективные иммуносорбенты на основе очищенных препаратов НСБ, иммобилизованных на гранулированном полимерном носителе, обладают высокой емкостью по отношению к сорбируемым молекулам АТ, достаточно гемосов-местимы и специфичны. Процедура экстракорпоральной иммуносорбции АТ к НСБ может быть рекомендована в качестве составной части комплексной эфферентной терапии критических состояний, сопровождающихся прорывом ГЭБ и угрозой аутоантительной агрессией в мозг.
Выводы
1. Способы очистки №Е, вРАР, агОР, с^ВО и а^Вв на основе комбинаций солевого фракционирования, ионообменной, гиброфобной, аффинной хроматографии, гель-фильтрации и изохроматофокусирования позволяют выделять высокоочищенные препараты этих НСБ, иммунизация которыми дает возможность получить моноспецифические антисыворотки. Полученные препараты ^Е, ОЕАР, агОР, С(]ВО, С^ВО и соответствующих антител могут быть использованы для разработки иммуноферментных систем их количественного определения.
2. Разработанные и апробированные в эксперименте и клинической практике системы количественного иммуноферментного анализа №Е, вЕАР, а! ОР, (X] ВО, а2 ВО и антител к ним позволяют специфично, надежно, воспроизводимо и достоверно определять эти антигены и антитела в сыворотке крови и ликворе человека и животных.
3. Количественный иммуноферментный анализ №Е, GFAP, агвР, а|ВО и ОгВв позволяет достоверно анализировать степень нарушения резистентности ГЭБ, проводить динамический мониторинг его функций, а также оценивать срок восстановления резистентности, эффективность проводимой терапии и прогнозировать исход заболевания.
4. Комплексный иммуноферментный анализ исследуемых ^Е, GFAP,
в сыворотке крови больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением резистентности ГЭБ, позволяет повысить вероятность их диагностики, по сравнению с индивидуальным определением, в среднем на 16%. Соответствующий комплексный иммуноферментный анализ антител к К8Е, GFAP, агОР, с^ВО и агВЭ дает возможность повысить эффективность диагностики нарушений проницаемости ГЭБ, по сравнению с индивидуальным определением, в среднем на 13 %.
5. Исследование резистентности ГЭБ крыс с моделированным нарушением проницаемости ГЭБ (острое гамма-облучение, острая ишемия головного мозга, экспериментальная галоперидоловая нейролепсия, барбитуратовая интоксикация, гипертермические судороги) методом количественного имму-ноферментного мониторинга межвидовых GFAP и ОгвР в сыворотке крови показало, что нарушение барьерной функции ГЭБ не зависит от способа патологического воздействия на ЦНС, и определяется интенсивностью и продолжительностью патологического воздействия.
6. Гипоксическое и ишемическое воздействие, моделированное путем
окклюзии средней мозговой артерии сопровождается феноменом нарушения
125
проницаемости ГЭБ для меченных I антИ-^Е и анти-GFAP антител, характеризующимся накоплением введенной метки, достоверно превышающим аналогичный показатель у крыс контрольной группы.
7. Разработанный способ приготовления и стерилизации твердофазного иммуносорбента на основе стирола и дивинилбензола с иммобилизованными на его поверхности высокоочищенными препаратами №Е, GFAP, агвР, С^Вв, агВО и МВР позволяет получать иммуноадсорбенты, характеризую-
41
щиеся высокой адсорбционной способностью по отношению к соответствующим антителам, механической устойчивостью, гемосовместимостью и отсутствием токсичности.
8. Экстракорпоральная иммуносорбция антител к №Е, GFAP, агСР, aiBG, СШО и МВР является методом специфической терапии и адекватным способом защиты клеток нервной ткани от аутоантительной агрессии при критических состояниях, сопровождающихся выраженным нарушением проницаемости ГЭБ.
Практические рекомендации
Комплексный иммуноферментный анализ НСБ и АТ к ним в сыворотке крови и в ликворе может быть использован в клинико-лабораторной практике у больных различными психическими, нервными, онкологическими, инфекционными или соматическими заболеваниями, течение которых сопровождается нарушением резистентности ГЭБ.
Комплексный иммуноферментный анализ НСБ и АТ к ним целесообразно применять после любого патологического воздействия на ЦНС, способного вызывать нарушение резистентности ГЭБ и элиминацию НСБ в кровь.
Иммунохимический мониторинг НСБ и АТ необходимо использовать у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, для оценки характера и степени выраженности патологического процесса в ЦНС, оптимизации лекарственной терапии и прогнозирования исхода заболевания.
Комплексный иммунохимический анализ АТ к НСБ в сыворотке крови позволяет определить выраженность сенсибилизации организма больного по отношению к тому или иному НСБ.
Селективная иммуносорбция является эффективным методом специфической терапии, способной предотвратить развитие аутоантительной агрессии у больных с высоким титром АТ к НСБ на фоне повышенной проницаемости ГЭБ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Chekhonin V.P., Kekelidse Z.I., Gurina O.I., Breusenko L.E., Anin A.N., Matushevska E.V // Immunoadsorption of the NSA antibodies in the complex therapy of patients suffering from hypertoxic schizofrenia. // Int J. Immunorehabilitation. - 1994. -№ 1.- Suppl. P. 80.
2.Чехонин В.П., Турина О.И., Рябухин И.А., Шепелева И.И., Анин А.Н., Дегтярев Д.Н., Рогаткин CO., Володин Н.Н. // Иммуноферментный анализ уровня глиофибриллярного протеина и антител к нему в оценке перинатальных поражений ЦНС у недоношенных детей.-Педиатрия.-№ 3.-1995. -С. 15-17.
3. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Белопасов В.В., Бреусенко Л.Е., Анин
A.Н., Матушевская Е.В., Турина О.И. // Иммуноферментный анализ антител к нейроспецифическим белкам в оценке состояния функции гематоэнцефа-лического барьера. - В кн. «Моноклональные антитела в нейробиологии». -Новосибирск, АО «Офсет». -1995. - С. 160-170.
4. Chekhonin V.P., Ryabukhin IA., Antonova O.M., Belyaeva LA. // Targeting transport of the hydrophobized anti GFAP and ct2-glycoprotein antibodies into the rat brain Delivery and Targeting of Peptides, Proteins and Genes. - Fifth Int. Symposium, Leiden. -№ 14. - 1995.
5. Chekhonin V., Ryabukhin I, Zhirkov Yu., Kashparov I., Dmitrieva T.
// Transport of hydrophobized fragments of antibodies through the blood-brain barrier. -NeuroReport -1995 - № 7 - P. 129-132.
6. Chekhonin V., Kabanov A., Rjabukhin I., Antonova O., Khrustaleva N., Beljaeva I., Anin A., Alexandrovsky Y., Dmitrieva T. // Anti-alpha-2-GP and anti-GFAP antibodies as the Vectors for Targeted Delivery of Haloperidol into the Glial Cells. - Europ. J. Neuropsychiatry 1996 - V.6 - supl. 3 -P. 110.
7. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Жирков Ю.А., Кашпаров И.А. // Направленный транспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. - В кн. "Социальная судебная психиатрия". - Москва. - ГНЦССП им.
B.П.Сербского. - 1996. - С. 271-275.
8. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Турина О.И., Антонова О.М., Белопасов В.В., Анин А.Н. // К вопросу о механизмах аутоагрессии антител к нейроспе-цифическим белкам через гематоэнцефалический барьер. - Российский психиатрический журнал -1997. — № 1. - С.43-45.
9. Чехонин В.П., Рябухин НА., Белопасов В.В., Турина О.И., Бреусенко Л.Е., Анин А.Н., Матушевская Е.В., Антонова О.М. // Иммуноферментный анализ антител к нейроспецифическим белкам в оценке состояния функции ГЭБ. - Иммунология. - 1997. - № 2. - С. 67-69.
10. Турина О.И., Рябухин И.А., Анин А.Н., Антонова О.М., Дегтярев Д.Н., Рогаткин CO., Володин Н.Н., Чехонин В.П. // Исследование проницаемости ГЭБ у новорожденных крысят в условиях индуцированных гипертермических судорог. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 1997.-№2.-С.17-20.
И. Рябухин И А., Турина О.И., Тимофеева Л.А., Преображенская И.С., Ажкамалов СИ., Беляева И.А // Иммуноферментный анализ нейрос-пецифических белков и антител к ним в диагностике нервно-психических заболеваний. - Новости науки и техники, реферативный сборник ВИНИТИ. - Серия Медицина. Психиатрия. - Москва. - 1997. - № 7.
12. Chekhonin V., Rjabuckin I.,. Zirkov Yu, Alexandrovsky Y., Dmitrieva T. // Targeted transport of artificially hydrophobized antibodies across the BBB. -VIII International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Februay. 24-27. -1997. - Salt Lake City, Utah. - P. 219-222.
13. Чехонин В.П., Кекелидзе З.И., Рябухин И.А, Турина О.И., Тимофеева Л.А., Ажкамалов СИ., Артемкина И.В. // Комплексный иммунофер-ментный анализ нейроспецифических белков как критерий оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера при нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал. - № 2. — 1998. - С. 49-54.
14. Чехонин В.П., Кекелидзе З.И., Рябухин И.А., Турина О.И., Лейкин Ю.А., Черкасова Т.А. // Твердофазная иммуносорбция антител к нейроспе-
цифическим антигенам. - Российский психиатрический журнал. - № 6, 1998 -С. 22-30.
15. Chekhonin V.P., Gurina O.I., Rjabukhin LA., Timofeeva L.I., Artemkina I.V., Azhkamalov S.I., Dmitrieva T.B. // Immunochemical study of mechanisms of anti-GSP-antibodies autoagression across the BBB On glial cell function in healt and disease. - 3-rd European Meeting. - Greece. - 1998. - May 6.-10, P. 69.
16. Chekhonin V.P, Rjabukhin I.A., Dmitrieva T.B., Gurina O.I. // Immunoabsorption of the anti-NSA-antibodies in the complex therapy of patients suffering from hypertoxic schizophrenia. - 5 IBRO WORDL CONGRESS OF NEURO-SCffiNCE. - Jerusalem. - Israel. - 1999.
17. Чехонин В.П., Кекелидзе З.И., Рябухин И.А., Турина О.И., Лейкин Ю.А., Беляева И.А., Тимофеева Л.А., Сергиенко В.И., Артемкина И.В., Дмитриева Т.Б. // Иммуноадсорбция антител к нейроспецифическим белкам в эксперименте и клинической практике. - Новости науки и техники, реферативный сборник ВИНИТИ. Серия Медицина. Психиатрия. - № 1. - Москва. -1999.-С. 2-12.
18Лехонин В.П., Турина О.И., Рябухин И. А., Шепелева И.И., Савченко Е.А., Семенова А.В., Хаустова М.Ю., Биктимиров Р.Г., Кекелидзе З.И., Дмитриева Т.Б. // Иммуноферментный анализ GFAP на основе моноклональ-ных антител в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал. -№ 1.-2000.-С. 14-18.
19. Chekhonin V.P., Rjabukhin I.A., Kashparov I.A., Dmitrieva T.B., Gurina O.I // Neurotrophic effect of the hydrophobized conjugates of BDNF with anti-GFAP-antibodies in the therapy of experimental brain ischemia. - IV European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease. - Barcelona. May 24а-27л. - 2000.
20. Артемкина И.В., Рябухин И.А., Турина О.И., Мартынов А.К., Чехонин В.П., Сергиенко В.И., Егоров Д.Ю. // Влияние гипохлорида натрия на содержание нейропептидов в крови крыс, подвергнутых воздействию барбита-
ла натрия. - Материалы II Российского Конгресса по патофизиологии. - Москва. - 2000.
21. Жирков Ю.А., Чехонин В.П., Турина О.И., Рябухин И.А., Кекелидзе З.И., Семенова А.В., Савченко Е.А. // Количественно-кинетические параметры элиминации нейроспецифических антигенов и антител к ним при некоторых нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал. - № 4. - 2000. - С. 4-8.
22. Турина О Л , Чехонин В.П., Рябухин И.А., Портная Т.С., Семенова А.В., Кекелидзе З.И., Дмитриева Т.Б. // Иммуноферментный анализ нейрос-пецифической енолазы на основе моноклональных антител в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал. - № 4. - 2000. - С. 15-19.
23. Gurina O.I., Ryabukhin I.A., Shepeleva I.I. // Immunoenzymatic analysis on the basis of monoclonal antibodies to GFAP in the diagnosis of neuropsychiatrie diseases. — 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs"., Suzdal., May 15-18. - 2001.
24. Рябухин И.А., Артемкина И.А., Сергиенко В.И., Чехонин В.П. // Иммунохимический анализ глиоспецифических антигенов как критерий проницаемости ГЭБ крыс при острой интоксикации барбиталом натрия. - БЭБМ. -2001.-№5.-С.502-504.
25. Чехонин В.П., Турина О.И., Дмитриева Т.Б., Шепелева И.И., Рябухин И.А., Бабич Т.Н. // Моноклональные анти-GFAP антитела: получение характеристика и иммуноферментный анализ. - БЭБМ. - 2001. - № 8. - С. 188-191.
26. Galoyan A.A., Chekhonin V.P, Gurina O., Rjabukhin I.A., Savchenko E.A. // Immunochemical study of the effect of neurotrophins on the GFAP synthesis in astrocyte culture. - Biochemical and molecular-biological aspects of the brain immune system. - Proceeding of the International Conference. - September 15-19.-2001.-Yerevan.-pp 140-145.
27. Chekhonin V.P, Zhirkov Yu.A., Belyaeva LA., Ryabukhin I.A., Gurina O.I., Dmitriyeva T.B. // Serum time course oftwo brain-specific proteins, a\ brain globulin and neuron-specific enolase, in tick-born encephalitis and Lyme disease. - Clinica Cliimica Act 2002. -V. 320. - P. 117-125.
28. Chekhonin V.P, Dmitriyeva T.B., Ryabukhin I.A., Gurina O.I., Semenova A.V. // Immunoenzyme analysis of anti-MBP-antibodies in the diagnostics of multiple sclerosis. Immunoenzyme analysis of anti-MBP-antibodies in the diagnostics of multiple sclerosis. - Fifth European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease. - 2002. - Rome. - Italy. - May 21-25.
29. Chekhonin V.P, Gurina O.I., Rjabukhin I.A., Kashparov I.A., Dmitrieva T.B. // Neuroprotective effect of the conjugates of pegylated BDNF with artificially hydrophobized complex of Fab fragments of 0X26 and anti-GFAP-antibodies in therapy of experimental brain ischemia. Fifth European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease. - 2002. - Rome. - Italy. -May 21-25.
30. Рябухин И.А., Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б. // Перспективы имму-нохимического анализа NSE в диагностике нервно-психических заболеваний. — Всероссийская конференция "Проблемы медицинской энзимологии", "Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия". -Международный симпозиум "Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина". - 2002. - Москва.
31. Чехонин В.П., Турина О.И., Портная Т.С., Рябухин И.А., Шепелева И.И. // Моноклональные анти-К8Е-антитела: получение, характеристика и иммуноферментный анализ. - Вопросы медицинской химии. - 2002. - Выпуск 5. - Т. 48. - С. 477-484.
32. Рябухин И.А., Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б. // Гематоэнцефаличе-ский барьер. Часть 1 (эмбриоморфогенез, клеточная и субклеточная биология плотных контактов эндотелиоцитов). - Нейрохимия. - 2003. -Т. 20. - №1. -С.12-23.
33. Skurkovich S.V., Chekhonin V.P., Aleksanrovsky Y.A., Ryabukhin I.A., Chakhava K.O., Skurkovich B. // Improvement in Negative Symptoms of Schizophrenia With Antibodies to Tumor Necrosis Factor-alpha and to Interferon-gamma: A Case Report - J. Clinical Psychiatry. - 2003.- V. 64. - P. 734 - 735.
34. Chekhonin V.P, Zhirkov Yu.A., Gurina O.I., Ryabukhin I.A., Dmitri-yeva T.B. // Targeted transport ofthe stealth immunoliposomes to the brain astro-cites. - GLIA-2003. -, Suppl. 2. - VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease. - Berlin September 3-6. - 2003. - P. 19.
35. Жирков Ю.А., Чехонин В.П., Турина О.И., Рябухин И.А., Лебедев СВ., Кашпаров И.А., Блинов Д.В., Дмитриева Т. Б. // ПЭГилированные им-мунолипосомы, специфичные к астроцитам. — Доклады РАН. - Серия: Биофизика и биохимия. - 2003. - № 391. - С. 236-239.
36. Chekhonin V.P., Y.A. Zhirkov, Gurina O.I., Rjabukhin I.A., Dmitrieva T.B. // Stealth Immunoliposomes Specific to Brain Astrocytes. — Sixth IBRO WORDL CONGRESS OF NEUROSCIENCE. - Prague. - Czech Republic. - July 10- 15.-2003.-P. 21.
37. Чехонин В.П., Лебедев СВ., Блинов Д.В., Турина О.И., Семенова А.В., Лазаренко И.П., Петров СВ., Рябухин И.А., Рогаткин CO., Володин Н.Н. // Патогенетическая роль нарушения проницаемости гематоэнцефаличе-ского барьера для нейроспецифических белков при перинатальных гипокси-чески-ишемических поражениях центральной нервной системы у новорожденных.- Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. — 2004. - Т.З. — №3-С. 50-61.
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 25.06.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 275. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
Ьз133
Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Рябухин, Игорь Александрович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ:.
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность проблемы.
Цель работы.
Задачи исследования.
Научная новизна работы.
Практическая ценность.
Основные положения, выносимые на защиту.
ГЛАВА 1. РОЛЬ И ЗНАЧЕНИЕ НСБ И АТ К НИМ В ДИАГНОСТИКЕ СОСТОЯНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЕМ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЭБ.
1.1. Гематоэнцефалический барьер— строение, роль и функция в организме.
1.2. Морфология плотных контактов гематоэнцефалического барьера
1.3. Молекулярная структура плотных контактов.
1.3.1. Белки адгезивных соединений.
1.3.2. Белки плотных контактов.
1.4. Проницаемость ГЭБ в норме и при патологии.
1.5. НСБ — идентификация, физико-химические свойства и клеточная локализация.
1.5.1. Глиофибриллярный кислый протеин (ОРАР).
1.5.1.1. Идентификация, очистка и физико-химические свойства ОРАР.
1.5.1.2. Тканевая и клеточная локализация вБАР.
1.5.2. Нейроспецифическая енолаза.
1.5.2.1 ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЕНОЛАЗЫ.
1.5.2.2. Тканевая и клеточная локализация ЫБЕ.
1.5.3. Альфа-2-гликопротеин (агвР).
1.5.3.1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА а2СР.
1.5.3.2. Клеточная локализация ссгвР.
1.5.4. Специфические (*! и (*2 глобулины мозга (с^Вв и агВв).
1.5.4.1. Идентификация, очистка и физико-химические свойства с^Вв и агВв.
1.5.4.2. Клеточная локализация с^Вв и ссгВв.
1.6. Роль НСБ в диагностике состояний и заболеваний, сопровождающихся нарушением барьерной функции ГЭБ.
1.6.1. Патофизиологические аспекты повреждения ГЭБ.
1.6.2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НСБ.
1.7. роль анти-НСБ АТ в диагностике состояний и заболеваний, сопровождающихся нарушением барьерной функции ГЭБ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Общие биохимические методики, применяемые при выделении и очистке нейроспецифических белков.
2.2. Методы иммунохимического анализа.
2.3. Методы выделения и очистки белков.
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ АНАЛИЗА НСБ И АНТИ-НСБ-АТ.
3.1. Получение высокоочищенных препаратов НСБ.
3.2. Получение моноспецифических анти-НСБ антисывороток и препаратов ат.
3.3. «Сендвич»-вариантиммуноферментного анализа GFAP, NSE, a2GP и соответствующих АТ к ним.
3.4. двухцентровой иммуноферментный анализ ajBG ha2BG на основе колоночного микрореактора (кмр).
3.5. Общие вопросы стандартизации иммуноферментного анализа
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НСБ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ЛИКВОРЕ БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ, СОПРОВОЖДАЮЩИМИСЯ НАРУШЕНИЕМ ФУНКЦИИ ГЭБ.
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АТ К НСБ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ЛИКВОРЕ БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ, СОПРОВОЖДАЮЩИМИСЯ НАРУШЕНИЕМ ФУНКЦИИ ГЭБ.
ГЛАВА 6. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ КОМПЛЕКСНОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НСБ И АТ К НИМ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ЛИКВОРЕ БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ, СОПРОВОЖДАЮЩИМИСЯ
НАРУШЕНИЕМ ФУНКЦИИ ГЭБ.
ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЭБ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ.
7.1. Экспериментальные методы моделирования прорыва ГЭБ с применением индуцированной нейролепсии.
7.2. Экспериментальные методы моделирования прорыва ГЭБ с использованием острой экспериментальной ишемии головного мозга
7.3. Экспериментальное моделирование повреждения ГЭБ, вызываемое индуцированными гипертермическими судорогами.
7.4. Экспериментальные методы моделирования прорыва ГЭБ с применением барбитуратового наркоза.
7.5. Экспериментальные методы моделирования прорыва ГЭБ за счет острого у- облучения.
7.6. Экспериментальное подтверждение проникновения AT к НСБ в мозг (на примере at, меченных радиоактивной меткой).
7.7. Экспериментальное подтверждение патологического воздействия AT к НСБ на мозг (морфологическое исследование результатов воздействия AT к GFAP и a2GP на фоне повреждения ГЭБ).
ГЛАВА 8. ИММУНОСОРБЦИЯ АНТИ-НСБ-АТ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ.
8.1. Разработка селективных иммуносорбентов на основе пористых сополимеров стирола и дивинилбензола и высокоочищенных препаратов НСБ.
8.2. Стендовые испытания иммуносорбентов.
8.3. Иммуносорбция анти-НСБ-АТ в эксперименте.
8.4. Опыт клинического применения экстракорпоральной иммуносорбции аутоантител к нейроспецифическим белкам в клинике нервных и психических заболеваний.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Нейроспецифические белки в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера человека и животных"
Актуальность проблемы
Постоянство внутренней среды, необходимой для нормального функционирования клеток центральной нервной системы (ЦНС) обеспечивается особым морфо-функциональным образованием - гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ). ГЭБ обеспечивает не только защиту мозга от токсинов и продуктов метоболизма, но и предотвращает проникновение в кровь белков-антигенов, специфичных для нервной ткани. За последние 30 лет накопилось большое количество научных данных о нейроспецифических белках (НСБ), методах их выделения, идентификации, биохимических и иммуно-химических свойствах (Moore В. W. и соавт., 1976, 1992, Eng L.F. и соавт., 1971, 2000., Deibler G.E. и соавт., 1978, Bock Е. и соавт., 1978, 2004., Березин В.А., 1990, Чехонин В.П. и соавт., 2000). Показана практическая значимость их прижизненного иммунохимического анализа в биологических жидкостях при различных заболеваниях и патологических процессах в центральной нервной системе (ЦНС) (Бурбаева Г.Ш. и соавт., 1989., Barone F.С. и соавт., 1993, Rosengreen L.E. и соавт., 1994., Blennow M. и соавт., 1996., Чехонин В.П. и соавт., 2000, Eng L., 2001., Checkonin V. и соавт., 2002., Beems Т. и соавт., 2003).
К наиболее изученным и информативным НСБ, наряду с антигенами группы S100 (Moore В. W. и соавт., 1996), нейрональными молекулами клеточной адгезии NCAM (Bock Е. и соавт., 1974.,) антигенами, ассоциированными с миелином - MAG (Poltorak M. и соавт., 1987.,) и МБР (Deibler G.E. и соавт., 1995), относятся и такие белки как нейроспецифическая енолаза (NSE)(Marangos P.J., 1988), глиофибриллярный кислый протеин (GFAP)(Eng L.F., 1988), а также специфические аг-гликопротеин мозга (a2GP)(Warecka К., 1982), aj и ос2-глобулины мозга (ociBG и a2BG)(Chekhonin V. и соавт., 2002). Иммуноферментный анализ этих НСБ и соответствующих антител (AT) к ним позволяет не только косвенно оценить степень нарушения функций ГЭБ, но и адекватно отразить характер и степень повреждения нейронов, астроцитов и олигодендроглиоцитов (Чехонин В.П. и соавт., 2000., Fridriksson Т. и соавт, 2001., Van Geel W.J. и соавт., 2002). При этом количественный динамический анализ НСБ и анти-НСБ-АТ в сыворотке крови больных заболеваниями, сопровождающимися нарушением функции ГЭБ, может служить дополнительным критерием степени выраженности патологического процесса в ЦНС, а также объективизации оценки тяжести состояния пациента и прогноза течения заболевания (Barone F., 1993, Schaarschmidt H., 1994., Verdu Perez А. и соавт., 2001., Herrmann M. и соавт., 2000, 2003, Seung-Huin., 2003).
Кроме этого, из-за отсутствия иммунологической толерантности к НСБ их прорыв в кровь при заболеваниях, сопровождающихся длительным или периодическим нарушением резистентности ГЭБ, нередко сопровождается появлением специфических анти-НСБ антител (Jankovic B.D., 1985., Chekhonin V. и соавт., 1994, 1999, Silber Е. и соавт., 2002). В связи с этим оправданно встает вопрос о целесообразности их количественного определения и исследования механизмов их аутоагрессии в направлении кровь-мозг. Понимание этих механизмов при тех или иных патологических процессах откроет новые перспективы специфической терапии нервно-психических заболеваний, включая высокоспецифичный способ защиты мозга от агрессии анти-НСБ антител из крови в мозг методом экстракорпоральной иммуносорбции (Taniguchi Y, 1995., Toepfer M. и соавт., 1999., Benny W.B. и соавт., 1999, Schneidewind J.M., 2001).
В настоящее время в связи со значительным увеличением количества оперативных вмешательств с применением аппарата искусственного кровообращения, возрастает роль НСБ в оценке функций ЦНС и резистентности ГЭБ у больных, перенесших такие операции (Rasinussen L.S. и соавт., 1999, 2002, Anderson R. и соавт., 2003., Меупааг I.A. и соавт., 2003). Нет сомнений в том, что надежный количественный иммунохимический контроль этих параметров не только позволить получать объективную информацию о состоянии клеток нервной ткани в раннем постоперационном периоде, но и определит перспективы создания методов стабилизации их функций в условиях гипоксии и ишемии. Цель работы
Целью данной работы явилось иммунохимическое исследование ней-роспецифических белков и антител к ним как критериев оценки резистентности гематоэнцефалического барьера человека и животных в норме и при патологии.
Задачи исследования
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи исследования:
1. На основе очищенных препаратов нейроспецифических белков и соответствующих препаратов поликлональных АТ разработать иммунофер-ментные системы для анализа ЫБЕ, вРАР, а^вР, о^ЕЮ, о^ЕЮ и АТ к ним в сыворотке крови и ликворе человека и животных.
2. Провести иммуноферментный анализ каждого из пяти нейроспецифических белков и АТ к ним в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями с целью оценки резистентности ГЭБ.
3. Провести комплексный иммуноферментный анализ пяти нейроспецифических белков и АТ к ним в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями с целью оценки резистентности ГЭБ.4. Провести сравнительный анализ диагностической значимости индивидуального и комплексного иммунохимического определения НСБ и анти-НСБ-АТ в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями.
5. Исследовать в эксперименте взаимосвязь между выраженностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ и концентрацией НСБ в крови, а также исследовать эффект проникновения АТ к НСБ через поврежденный ГЭБ.
1 'У 5
6. Исследовать проницаемость меченных I анти-НСБ антител через ГЭБ крыс после внутривенного введения в норме и при экспериментальной окклюзии средней мозговой артерии.
7. Разработать способ защиты мозга от патологического воздействия АТ к НСБ на основе принципа экстракорпоральной иммуноадсорбции.
Научная новизна работы
Модифицированные способы очистки НСБ и полученные на основе иммунизации ими поликлональные АТ позволили разработать иммунофер-ментные тест-системы анализа НСБ и анти-НСБ АТ в биологических жидкостях человека и животных.
Впервые разработан иммуноферментный метод определения си ЕЮ и сцЕЮ и АТ к ним на основе принципа колоночного микрореактора с пределом чувствительности определения 50 пг/мл для с^ ВС, 100 пг/мл для агВС и 350 пг/мл для АТ к с^ ВС и агВС.
С помощью иммуноферментных тест-систем анализа вБАР и с^вР, являющихся межвидовыми белками, исследованы и количественно оценены уровни этих НСБ в крови у животных с экспериментальным повреждением ГЭБ. В этих экспериментах впервые показано наличие прямой зависимости между выраженностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ в частности, и изменением уровня НСБ и АТ к ним в крови.
Впервые, в эксперименте, выявлен феномен селективного накопления меченных 12э1 анти-ОБАР и 1251 анти-МБЕ-АТ в ткани мозга после их внутривенного введения на фоне повреждения ГЭБ, вызванного ишемией головного мозга (односторонняя окклюзия средней мозговой артерии).
Впервые в клинико-лабораторной практике применен комплексный метод иммуноферментного определения пяти НСБ и АТ к ним в биологических жидкостях при заболеваниях и патологических состояниях, сопровождающихся нарушением функции ГЭБ. Анализ полученных результатов выявил высокую диагностическую и прогностическую значимость определения НСБ и АТ к ним, как при одномоментном, так и при динамическом исследовании.
Впервые получена серия результатов, свидетельствующих о принципиальной возможности прорыва анти-НСБ антител через поврежденный ГЭБ, сопровождающегося комплексом патологических процессов в нервной ткани. На основе этих результатов проведены исследования, послужившие основой для разработки методологии защиты нервной ткани от аутоантитель-ной агрессии анти-НСБ антител из крови путем их экстракорпоральной им-муноадсорбции.
Впервые разработан твердофазный иммуносорбент на основе сополимера стирола и дивинилбензола и иммобилизованных высокоочищенных препаратов НСБ. Стендовые, лабораторные и токсикологические испытания полученного иммуносорбента показали его гемосовместимость, высокую емкость по отношению к сорбируемым АТ и отсутствие токсичности. На способ приготовления твердофазного иммуносорбента получено авторское свидетельство на изобретение (№ 1476648).
Впервые в рамках программы ограниченных клинических испытаний метода экстракорпоральной иммуноадсорбции были проведены успешные процедуры по извлечению АТ к ШЕ, вРАР, (^вР, с^Вв и (^Вв из крови трех больных, находящихся в критическом состоянии, обусловленном ней-ролепсией, а также АТ к ШЕ, вРАР, агвР и МВР у больного с бульбарной формой бокового амиотрофического склероза. Практическая ценность
На основе выделенных НСБ и поликлональных АТ к ним разработаны иммуноферментные тест-системы их комплексного определения в сыворотке крови и ликворе пациентов с заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ. Используя эти иммуноферментные тест-системы в клинико-лабораторной практике, удалось выявить особенности изменения концентрации НСБ и АТ к ним в сыворотке крови в зависимости от степени тяжести и длительности течения заболевания.
Комплексный метод иммуноферментного определения НСБ и анти-НСБ АТ в сыворотке крови и ликворе может быть использован в клинико-лабораторной практике для диагностики нервных, психических, нейроонко-логических, нейроинфекционных или соматических заболеваний, течение которых сопровождается нарушением резистентности ГЭБ.
Динамическое определение уровней НСБ и АТ к ним у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и выраженность патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания.
В рамках выполнения программы ограниченных клинических испытаний иммуноадсорбции анти-НСБ антител показано, что этот метод удаления антител к нейроспецифическим белкам из крови является эффективным методом специфической терапии, способной предотвратить развитие аутоан-тительной агрессии у больных нервно-психическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ на фоне высоких концентраций анти-НСБ антител.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанные способы очистки ЫБЕ, ОРАР, агвР, с^ЕЮ, о^ЕЮ позволяют применять их для получения моноспецифических антисывороток и высококачественных препаратов соответствующих антител. Полученные препараты НСБ и анти-НСБ антител дают возможность разработать на их основе иммуноферментные диагностические тест-системы анализа ЫБЕ, вРАР, агвР, а[ВО, агВО и антител к ним, характеризующиеся точностью, воспроизводимостью, надежностью, и соответствующие общепринятым стандартам.
2. Комплексный иммуноферментный анализ НСБ и анти-НСБ АТ в сыворотке крови и в ликворе может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением барьерной функции ГЭБ.
3. Нарушение резистентности ГЭБ не является специфическим процессом, характерным для того или иного заболевания, или внешнего воздействия, повлекшего за собой его повреждение, а является универсальным патогенетическим механизмом и определяется лишь интенсивностью и продолжительностью патологического воздействия.
4. Количественный динамический анализ НСБ и анти-НСБ АТ у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и степень выраженности патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания. Определение концентрации НСБ и АТ к ним в критические сроки (7, 14, 21 и 30 сутки) патологического процесса позволяет оценить степень репарационных процессов в нервной ткани и степень восстановления ГЭБ, уровень сенсибилизации организма к НСБ, и прогнозировать исход заболевания.
5. Повторный контакт НСБ с иммунокомпетентными клетками приводит к появлению в крови анти-НСБ АТ, способных, при определенных условиях, проникать через поврежденный ГЭБ в мозг и связываться с антигенами-мишенями. Для предотвращения патологического воздействия на клетки-мишени возможно применение метода экстракорпоральной иммуноад-сорбции, позволяющей селективно удалять эти АТ из крови больных.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рябухин, Игорь Александрович
Выводы
1. Способы очистки ЫБЕ, СБАР, а2СР, о^ВС и а2ВС на основе комбинаций солевого фракционирования, ионообменной, гидрофобной, аффинной хроматографий, гель-фильтрации и изохроматофокусирования позволяют выделять высокоочищенные препараты этих НСБ, иммунизация которыми дает возможность получить моноспецифические антисыворотки. Полученные препараты Ы8Е, СБАР, а2СР, (XI ВС, а2ВС и соответствующих антител могут быть использованы для разработки иммуноферментных систем их количественного определения.
2. Разработанные и апробированные в эксперименте и клинической практике системы количественного иммуноферментного анализа ЫБЕ, СБАР, (XI СР, (XI ВС, а2 ВС и антител к ним позволяют специфично, надежно, воспроизводимо и достоверно определять эти антигены и антитела в сыворотке крови и ликворе человека и животных.
3. Количественный иммуноферментный анализ ЫБЕ, СБАР, а2СР, о^ВС и а2ВС позволяет достоверно анализировать степень нарушения резистентности ГЭБ, проводить динамический мониторинг его функций, а также оценивать срок восстановления резистентности, эффективности проводимой терапии и прогнозировать исход заболевания.
4. Комплексный иммуноферментный анализ исследуемых ЫБЕ, СБАР, а2СР, о^ВС и а2ВС в сыворотке крови больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением резистентности ГЭБ, позволяет повысить вероятность их диагностики, по сравнению с индивидуальным определением, в среднем на 16%. Соответствующий комплексный иммуноферментный анализ антител к ЫБЕ, СБАР, а2СР, о^ВС и а2ВС дает возможность повысить эффективность диагностики нарушений проницаемости ГЭБ, по сравнению с индивидуальным определением, в среднем на 13 %.
5. Исследование резистентности ГЭБ крыс с моделированным нарушением проницаемости ГЭБ (острое гамма-облучение, острая ишемия головного мозга, экспериментальная галоперидоловая нейролепсия, барбитурато-вая интоксикация, гипертермические судороги) методом количественного иммуноферментного мониторинга межвидовых вБАР и а^вР в сыворотке крови показало, что нарушение барьерной функции ГЭБ не зависит от способа патологического воздействия на ЦНС, и определяется интенсивностью и продолжительностью патологического воздействия.
6. Гипоксическое и ишемическое воздействие, моделированное путем окклюзии средней мозговой артерии сопровождается феноменом нарушения
1 л с проницаемости ГЭБ для меченных I анти-ЫБЕ и анти-ОБАР антител, характеризующимся накоплением введенной метки, достоверно превышающим аналогичный показатель у крыс контрольной группы.
7. Разработанный способ приготовления и стерилизации твердофазного иммуносорбента на основе стирола и дивинилбензола с иммобилизованными на его поверхности высокоочищенными препаратами ЫБЕ, ОБ АР, а^Р, о^Вв, агВв и МБР позволяет получать иммуноадсорбенты, характеризующиеся высокой адсорбционной способностью по отношению к соответствующим антителам, механической устойчивостью, гемосовместимостью и отсутствием токсичности.
8. Экстракорпоральная иммуносорбция антител к ЫБЕ, ОБАР, а^вР, о^Вв, агВв и МВР является методом специфической терапии и адекватным способом защиты клеток нервной ткани от аутоантительной агрессии при критических состояниях, сопровождающихся выраженным нарушением проницаемости ГЭБ.
Практические рекомендации
Комплексный метод иммуноферментного определения НСБ и АТ к ним в сыворотке крови и ликворе может быть использован в клинико-лабораторной практике у больных различными нервными, психическими, онкологическими, инфекционными или соматическими заболеваниями, течение которых сопровождается нарушением резистентности ГЭБ.
Комплексный иммуноферментный анализ НСБ и АТ к ним целесообразно применять после любого патологического воздействия на ЦНС, способного вызывать нарушение резистентности ГЭБ и элиминацию НСБ в кровь.
Динамика изменения концентрации НСБ и АТ к ним в сыворотке крови определяется степенью тяжести и длительностью течения заболевания.
Динамическое определение уровней НСБ и АТ к ним у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и степень выраженности патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания.
Комплексное определение АТ к НСБ в сыворотке крови позволяет определить выраженность сенсибилизации организма больного по отношению к тому или иному НСБ.
Селективная иммуноадсорбция является эффективным методом специфической терапии, способной предотвратить развитие аутоантительной агрессии у больных с высоким титром АТ к НСБ, на фоне повышенной проницаемости ГЭБ.
Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Рябухин, Игорь Александрович, Москва
1. Бадалян Л.О., Чехонин В.П., Бембеева Р.Ц. Специфические белки нервной ткани в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при коматозных состояниях у детей. // Ж. Невропатол. Психиатрии им. С.С.Корсакова., 1997., Т. 97., № 1., С. 461 —466.
2. Березин В.А. Специфические белки нервной ткани в норме и при патологии: // Дисс. д-ра. мед. наук., Днепропетровск, 1985.
3. Борисенко С.А., Буров Ю.А. Фармакололгические аспекты гематоэнцефалического барьера. // Молекулярные основы действия психотропных веществ. М. АМН СССР., 1986.,С. 129-138.
4. Бредбери М. Концепция гематоэнцефалического барьера. // М.: Мир, 1983.
5. Бурбаева Г.Ш. Физиологически активные белки мозга как возможные маркеры психиатрических заболеваний // Вестник РАМН, 1992., № 7., С. 51-54.
6. Ватазин A.B., Оноприенко Г.А., Шумский В.И. Эфферентные методы лечения в многопрофильном научно-исследовательском институте. // В сб.: Сорбционные электрохимические и гравитационные методы в современной медицине., Москва, 1999., С.14-15.
7. Турина О.И. Клинико-иммунохимическая оценка нарушений функций гематоэнцефалического барьера у недоношенных детей с перинатальными поражениями ЦНС. // Дисс. канд. мед. наук., М., 1996.
8. Турина О.И., Рябухин И.А., Анин А.Н. и др. Исследование проницаемости гематоэнцефалического барьера у новорожденных крысят в условиях индуцированных гипертермических судорог. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1997., Т. 123., № 2., С. 146-149.
9. Ершов А.Ф.Клиника, диагностика, патогенез и вопросы лечения острых отравлений производными барбитуровой кислоты. // Докт. дисс., Л., 1984 г.
10. Калашников В.В. Раково-эмбриональные белки человека. // Дисс. докт. мед. наук., Москва, 1986.
11. Кузнецова H.H. К характеристике противомозговых гетероанти-тел в сыворотке больных нервно-психическими заболеваниями. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1964., Т. 4., С. 90-94.
12. Кузнецова H.H., Докучаева О.Н., Лукачер Г.Я. Некоторые данные клинико-иммунологического обследования больных в отдаленном периоде черепно-мозговой травмы. //Ж. Невропатол. Психиатрии им. С.С.Корсакова., 1974., Т. 74., Вып. 5., С. 757-763.
13. Кузнецова Н.И., Семенов С.Ф. Обнаружение антител к мозгу в сыворотке больных нервно-психическими заболеваниями. // Ж. Невропатол. Психиатрии им. С.С.Корсакова., 1961., Т. 61., Вып. 2., С. 201-207.
14. Логвинов C.B. Влияние микроволн термогенной интенсивности на структуру гематоретинального и гематоэнцефалического барьеров. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1993., Т. 115., № 1., С. 86-88.
15. Лопухин Ю.М., Махлин Н.В. Иммуносорбция. От метода исследования к методу лечения. // Иммунология., 1984., № 5., С. 9-14.
16. Полетаев А.Б. Мозгоспецифические белки группы S100: их эндогенные акцепторы и лиганды и регуляция метаболических процессов в нервной ткани. // Дисс. докт. мед. наук. М. 1987.
17. Полетаев А.Б., Карлов В.А., Помочаева М.В., Селифанова О.П. Иммуноферментный анализ антигенной направленности антимозговых антител сыворотки крови больных эпилепсией. // Ж. Невропатол. Психиатрии им. С.С.Корсакова., 1985., Т. 85., № 6., С. 831-833.
18. Полетаев А.Б., Селифанова О.П., Бова М.Е. Исследование аутоиммунных процессов при нервно-психических заболеваниях с помощью количественного иммуноферментного анализа. // Иммунология., 1985., Т. 4., № 2., С. 75-76.
19. Руднев В.А., Опольский М.Б, Рапацкий К.Н., Маремкулов А.З. Ликворосорбция-прогрессивный метод в неврологии (перспективы развития и использования). // Кремлевская больница. Клинический вестник., 2003., №2., С.55-57.
20. Рябухин И.А., Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б. Гематоэнцефаличе-ский барьер. Часть 1. (эмбриоморфогенез, клеточная и субклеточная биология плотных контактов эндотелиоцитов). Нейрохимия., 2003, Т. 20, № 1, С.12-23.
21. Семенов C.B., Назаров К.Н., Чуприков А.П. Аутоиммунные процессы при врожденных энцефалопатиях, эпилепсии, шизофрении. // М. Медицина, 1973. С. 33.
22. Скоупс Р. Методы очистки белков. // М., Мир., 1985.
23. Ткачева Г.А., Балаболкин М.И., Ларичева И.П. Радиоиммунохи-мические методы исследования. // М.: Медицина, 1983. С. 86-91.
24. Тоболов Н.И. Сравнительный анализ применения плазмоиммуно-сорбции (Ig-афереза) и плазмосорбции в лечении больных рассеянным склерозом. // Кремлевская медицина. Клинический вестник., 2001., № 2., С. 2831.
25. Храмкова H.H., Абелев Г.И. Предел чувствительности метода преципитации в агаре. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1961., № 12., С. 107-109.
26. Чехонин В.П. Специфические белки нервной ткани человека и животных (идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и клинико-лабораторные исследования). // Дисс. докт. мед. наук., М., 1989.
27. Чехонин В.П., Кекелидзе З.И., Рябухин И.А., Турина О.И., Лей-кин Ю.А., Черкасова Т.А. Твердофазная иммуносорбция антител к нейрос-пецифическим антигенам. // Рос. Психиатр. Ж. 1998., № 6., С. 22-30.
28. Чехонин В.П., Морозов Г.В., Морковкин В.М. Иммунофермент-ная детекция специфических антигенов мозга как критерий проницаемости гематоэнцефалического барьера у крыс при острой ишемии головного мозга. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1988., № 5., С. 581-585.
29. Штерн Л.С. Непосредственная питательная среда органов и тканей. // Избр. труды. М.: Изд-во АН СССР, I960., С. 133.
30. Aaku-Saraste Е., Hellwig A., Huttner W.R. Loss of occludin and functional tight junctions, but not ZO-1, during neural tube closure—remodeling of the neuroepithelium prior to neurogenesis. // Dev. Biol., 1996., V. 180., P. 664679.
31. Abbott N.J, Mendonca L.L, Dolman D.E. The blood-brain barrier in systemic lupus erythematosus. // Lupus., 2003, V. 12., P. 908-915.
32. Albrechtsen M., Bock E. Quantification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in human body fluids by means of ELISA employing a monoclonal antibody. //J. Neuroimmunol., 1985., V. 8., P. 301-309.
33. Anderson J.M. Cell signalling: MAGUK magic. // Curr. Biol., 1997., V. 6., P. 382-384.
34. Andersen S.M., Ling C.C., Zhang P., Townson K., Willison H.J., Bundle D.R. Synthesis of ganglioside epitopes for oligosaccharide specific immunoadsorption therapy of Guillian-Barre syndrome. // Org. Biomol. Chem., 2004., V.2., P. 1199-1212.
35. Antonelli-Orlidge A, Smith S.R., DAmore PA. Influence of pericytes on capillary endothelial cell growth. // Am Rev Respir Dis., 1989, V. 140., P. 1129-31.
36. Avanzi G., Marconi G. Semiselective immunoadsorbtion of antiAChR abs on tryptophan column in myastenia gravis. Clinical experience in 32 patients. // Transfus. Sci., 1993.,V. 14., P. 17-21.
37. Avanzi G., Marconi G., Calacoci L. Plasmafiltration and immunoadsorbtion on a tryptophane column in myastenia gravis: a study of 22 patients. // Ital. J. Neurol. Sci., 1991, V. 1 (suppl)., P. 47-51.
38. Ballabh P., Braun A., Nedergaard M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. // Neurobiol. Dis., 2004., V. 16., P. 1-13.
39. Baron M., Stern M., Anavi R., Witz I.R. Tissue binding factor in schizophrenic sera: a clinical and genetic study. // Biol. Psychiatry.,1977., V. 12., P. 199-219.
40. Barone F.C., Clerk R.K., Price W. Neuron-specific enolase increases in cerebral and systemic circulation following focal ischemia. // Brain Res., 1993., V. 1, P. 71-82.
41. Bartnik E., Weber K. Widespread occurrence of intermediate filaments in invertebrates; common principles and aspects of diversion. // Eur. J. Cell biol., 1989., V. 50., P. 17-33.
42. Bartosik-Psujek H., Archelos J.J. Tau protein and 14-3-3 are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and correlate with intrathecal synthesis of IgG. // J. Neurol., 2004., V. 251., P. 414-420.
43. Bauer J., Rauschka H., Lassman H. Inflammation in the Nervous System:The Human Perspective. // Glia., 2002., V. 36., P. 235-243.
44. Beggs J.L., Waggener J.D. Transendothelial vesicular transport of protein following compression injury to the spinal cord. // Lab. Invest. 1976., V. 34., P. 428-439.
45. Beems T., Simons K.S., Van Geel W.J., De Reus H.P., Vos P.E., Verbeek M.M. Serum- and CSF-concentrations of brain specific proteins in hydrocephalus.// Acta Neurochir (Wien). 2003., V. 145., P. 37-43.
46. Benny W.B., Sutton D.M., Oger J, Bril V, McAteer M.J., Rock G. Clinical evaluation of a staphylococcal protein A immunoadsorption system in the treatment of myasthenia gravis patients. // Transfiis., 1999., V. 39., P. 682-687.
47. Bergen J.R., Grinspoon L., Ryte H.M. Immunologic studies in schizophrenic and control subjects. // Biol. Psychiatry., 1980., V. 15., P. 369-379.
48. Besnard F., Brenner M., Nakatani Y. Multiple interacting sites regulate astrocyte-specific transcription of the human gene for glial fibrillary acidic protein. //J. Biol. Chem., 1991., V. 266., P. 18877-18883.
49. Bianchi R., Giambanco I., Donato R. S-100 protein, but not calmodulin, binds to the glial fibrillary acidic protein and inhibits its polymerization in a Ca2+-dependent manner. //J. Biol. Chem., 1993., V. 268., P. 12669-12674.
50. Bigbee J.W., Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein synthesized in vitro using messenger RNA from Jimpy mouse spinal cord. //Brain Res., 1982., V. 249., P. 383-386.
51. Bignami A., Dalil D. Isolation of GFA protein from normal brain — a comment. // J. Histochem. Cytochem., 1979., V. 27., P. 693.
52. Bignami A., Eng L.F., Dahl D., Uyeda C.T. Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by immunofluorescence. // Brain Res., 1972., V. 43., P. 429-435.
53. Bishop A.E., Polak J.M., Facer P, Ferri GL, Marangos PJ, Pearse AG. Neuron specific enolase: a common marker for the endocrine cells and innervation of the gut and pancreas. //Gastroenterology., 1982., V. 83., P. 902-915.
54. Bjorklund H., Dahl D., Seiger A. Neurofilament and glial fibrillary acid protein-related immunoreactivity in rodent enteric nervous system. //Neuroscience., 1984., V. 12., P. 277-287.
55. Blennow M., Rosengren L., Jonsson S., Forssberg H. Glial fibrillary acidic protein is increased in the cerebrospinal fluid of preterm infants with abnormal neurological findings. // Acta Paediatr., 1996., V. 85., P. 485-489.
56. Bohn W., Roser K., Hohenberg H., Mannweiler K, Traub P. Cytoskeleton architecture of C6 rat glioma cell subclones differing in intermediate filament protein expression. // J. Struct. Biol., 1993., V. 111., P. 48-58.
57. Borda T, Gomez R, Berria M.I., Sterin-Borda L. Antibodies against astrocyte Ml and M2 muscarinic cholinoceptor from schizophrenic patients' sera.// Glia, 2004., V. 45., P. 144-154.
58. Bosch T. Current status in extracorporeal immunomodulation: immune disorders. // Artif Organs., 1996., V. 20., P. 902-905.
59. Bradbury, M. W. B.: The blood-brain barrier: transport across the cerebral endothelium. // Circ. Res., 1985., V. 57., P. 213-222.
60. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. //Anal. Biochem., 1976., V. 72., P. 248-254.
61. Brady S.T., Lasek R.J. Nerve specific enolase and creatine phosphokinase in axonal transport: soluble protein and the axoplasmic matrix. //Cell., 1981., V. 23., P. 515-520.
62. Braun N, Risler T. Immunoadsorption as a tool for the immunomodulation of the humoral and cellular immune system in autoimmune disease. // Ther Apheresis., 1999., V. 3., P. 240-245.
63. Brenner M. Structure and transcriptional regulation of GFAP gene. // Brain Pathol., 1994., V. 4., P. 245-257.
64. Brenner M., Lampel K., Nakatani Y., Mill J., Banner C., Mearow K., Dohadwala M., Lipsky R., Freese E. Characterization of human cDNA and genomic clones for glial fibrillary acidic protein. //Mol. Brain Res., 1990., V. 7., P. 277-286.
65. Brightman M.W. The anatomic basis of the blood-brain barrier. // In: Neuwelt EA (ed) Implications of the blood-brain barrier and its manipulation., Basis science aspects., Plenum., New York., 1989., V. 1., P. 53-83.
66. Brightman MW, Reese TS. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. // J Cell Biol., 1969., V. 40., P. 48-77.
67. Broadwell R.D., Brightman M.W. Entry of peroxidase into neurons of the central and peripheral nervous system from extracellular and cerebral blood. // J. Comp. neurol. 1976., V. 166., P. 257-284.
68. Broadwell RD, Sofroniew MV Serum proteins bypass the blood-brain fluid barriers for extracellular entry to the central nervous system. // Exp Neurol. 1993., V. 120., P. 245-263.
69. Brown R.C., Egleton R.D., Davis T.P. Mannitol opening of the blood-brain barrier: regional variation in the permeability of sucrose, but not (86)Rb(+) or albumin. // Brain Res., 2004., V. 1014., P. 221-227.
70. Brunngraber E., Susz J.P., Hof H.I. Binding of concanavalin A to the brain-specific proteins obtained from human white matter by affinity chromatography. //J. Neurochem., 1975., V. 24., P. 805-806.
71. Bruns R. R., Palade G.E. Studies on blood capillaries, Part 2 (Transport of ferritin molecules across the wall of muscle capillaries). // J. Cell Biol., 1968., V. 37., P. 277-299.
72. Burtrum D., Silverstein F.S. Excitotoxic injury stimulates glial fibrillary acidic protein mRNA expression in perinatal rat brain. // Exp. Neurol., 1993., V. 121., P. 127-132.
73. Butt A.M., Jones H. Effect of histamine and antagonists on electrical resistance across the blood-brain barrier in rat brain-surface microvessels. // Brain Res., 1992., V. 569., P. 100-105.
74. Celtik C., Acunas B., Oner N., Pala O. Neuron-specific enolase as a marker of the severity and outcome of hypoxic ischemic encephalopathy. // Brain Dev., 2004., V. 26., P. 398-402.
75. Cervos-Navarro J., Sampaolo S., Hamdorf G. Brain changes in experimental chronic hypoxia // Exp. Pathol., 1991., V. 42., P. 205-212.
76. Chan P.H., Huston J.S., Dahl D. Initial characterization of astroglial protein from bovine brain. // Fed Proc., 1975., V. 34., P. 224.
77. Chiu F.C., Goldman J.E. Regulation of glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression in CNS development and in pathological states. // J. Neuroimmunol., 1985., V. 8., P. 283-292.
78. Choi B.H., Kim R.C. Expression of glial fibrillary acidic protein by immature oligodendroglia and its implications. //J. Neuroimmunol., 1985., V. 8., P. 215-235.
79. Choi D.W. Cerebral hypoxia: some new approaches and unanswered questions. //J. Neurosc., 1990., V. 10., P. 2493-2501.
80. Cicciarello R, D'Axella D, Gagiardi M.E., Tomasello F. Time-related ultrastructural changes in an experimental model of whole brain irradiation.//Neurosugery, 1996, V. 38., P. 772-780.
81. Cicero T.J., Cowan W.M., Moore B.W.,. Suntzeff V. The cellular localization of the two brain specific proteins, SI00 and 14-3-2. //Brain Res., 1970., V. 18., P. 25-34.
82. Citi S., Sabanay H., Jakes R., Geiger B., Kendrick-Jones J. Cingulin, a new peripheral component o flight junctions. // Nature., 1988., V. 33., P. 272-276.
83. Clarke H.G., Freeman T. Quantitative Immunoelectrophoresis of human serum proteins. // Clin Sci., 1968., V. 35., P. 403-413.
84. Clough G., Michel C.C. The role of vesicles in the transport of ferritin through frog endothelium. //J. Physiol. (London). 1981., V. 315., P. 127-142.
85. Cohen I., Shani Y, Schwartz M. Cloning and characteristics of fish glial fibrillary acidic protein: implications for optic nerve regeneration. // J. Comp. Neurol., 1993., V. 334., P. 431-443.
86. Connell C.J., Mercer K.L. Freeze-fracture appearance of the capillary endothelium in the cerebral cortex of mouse brain. // Am. J. Anat., 1974., V. 140., P. 595-599.
87. Coomber B.L. Stewart P.A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium.// Microvasc Res. 1985, V. 30., P. 99-115.
88. Coomber B.L., Stewart P.A., Hayakawa K. A quantitative estimate of microvessel ultrastructure in C6 astrocytoma spteroids transplanted to brain and muscle. //J. Neuropath. Exp. Neurol., 1988., V. 47., P. 299-307.
89. Crols R., Noppe M., Caers J., Lowenthal A. a-Albumin (GFA) as a marker of astrocytic involment human cerebrospinal fluid. // Neurochem. Pathol., 1983., V. l.,P. 91-102.
90. D'Axella D, Cicciarello R, Angileri F.F., Lucerna S, La Torre D, Tomasello F. Radiation-induced blood-brain barrier changes: phatophysiological mechanisms and clinical implications.//Acta Neurochir. Suppl. (Wien), 1998, V. 71., P. 282-284.
91. Dahl D., Bignami A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. // Brain Res., 1973., V. 57., P. 343.
92. Dahl D., Chi N.H., Miles L.E. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in Schwann cells. // J. Histochem. Cytochem., 1982., V. 30., P. 912-918.
93. Dahl D., Crosby C.J., Sethi J.S., Bignami A. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in vertebrates: immunofluorescence and immunoblotting study with monoclonal and polyclonal antibodies. // J. Comp. Neurol., 1985., V. 239., P. 75-88.
94. Dauberschmidt R., Marangos P.J., Zinsmeyer J., Bender V, Klages G, Gross J. Severe head trauma and the changes of concentration of neuron-specific enolase in plasma and cerebrospinal fluid. //Clin. Chim. Acta., 1983., V. 131., P. 165-170.
95. Davidson A., Diamond B. Autoimmune diseases. // N. E. J. Medic., 2001., V. 345., P. 340-350.
96. Davis B.J. Disc-electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. //Ann. NY Acad. Sci., 1964., V. 121., P. 404-412.
97. Davson H. History of blood-brain barrier concept. // In: Neuwelt EA (ed) Implications of the blood-brain barrier and its manipulation., Basis science aspects., Plenum., New York., 1989., V. 1., P. 27-52.
98. Day I.N.M., Thompson R.J. Levels of immunoreactive aldolase C, creatine kinase-BB, neuronal and non-neuronal enolase and 14-3-2 protein in circulating human blood cells. // Clin. Chim. Acta., 1984., V. 136., P. 219-228.
99. DeArmond S.J., Lee Y.L., Kretzschmar H.A., Eng L.F. Turnover of glial filaments in mouse spinal cord. //J. Neurochem., 1986., V. 47., P. 1749-1753.
100. Debus E., Weber K., Osborn M. Monoclonal antibodies specific for glial fibrillary acidic (GFA) protein and for each of the neurofilament triplet polypeptides. // Differentiation., 1983., V. 25., P. 193-203
101. Deck J.H., Eng L.F., Bigbee J., Woodscoks S.M. The role of glial fibrillary acidic protein in the diagnosis of central nervous system tumors. // Acta Neuropathol., 1978., V. 42., P. 183-190.
102. Deibler GE, Burlin TV, Stone AL. Three isoforms of human myelin basic protein: purification and structure. // J. Neurosci. Res., 1995., V. 41., P. 819827.
103. Delay G., Deniker P. Methodes chimiotherapique en psichiatrie. // Paris., Mosson, 1961.
104. DeLisi L., Weber R., Pert C.B. Are there antibodies against brain in sera from schizophrenic patients? // Biol. Psychiatry., 1985., V. 20., P. 110-115.
105. Dhandapani M.K., Mahesh V.B., Brann D.W. Astrocytes and brain function.Tmplications for reproduction. // Experimental Biology and Medicine., 2003., V. 228., P. 253-260.
106. Dotevall L., Rosengren L.E., Hagberg L. Increased cerebrospinal fluid levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in Lyme neuroborreliosis. // Infection., 1996., V. 24., P. 125-129.
107. Dux E., Joo F. Effects of histamine on brain capillaries, fine structural and immunohistochemical studies after intracarotid infusion. // Exp. Brain Res., 1982., V. 47., P. 252-258.
108. Dwyer D.S., Bradley R.J., Urguhart C.K., Kearney J.F. An enzyme-linked immunoadsorbent assay measuring antibodies against muscle acetyl choline receptor. // J. Immunol. Methods., 1983., V. 57., P. 111-119.
109. Ehrlich P.: Das Sauerstoffbeduerfnis des Organismus: Eine Farbenanalytiche Studie. //Hirschwald, Berlin, 1885., V. 8., P. 167.
110. Elirnst A., Wiese L.F., Wjerkenstedt L., Tribukait B., Jonsson J. Failure to detect immunologic stigmata in schizophrenia. // Neuropsychobiology., 1982., V. 8., P. 169-171.
111. El-Fawal H. A. N., Cong Z.L., Little A., Evans H.L. Exposure to methyl mercury results in serum autoantibodies in neurotypic and gliotypic proteins. //Neurotoxic., 1995., V. 16.
112. El-Gazzar R.M., Shamy M.Y., Addel-Moneim I., El-Fawal H.A.N. Occupation exposure to mercury results in serum autoantibodies to neurotypic and gliatypic proteins. Toxicolog., 1994., V. 14., P. 124.
113. Eng L.F. Experimental models for astrocyte activation and fibrous gliosis. // In: Althaus H.H., Seifert W. (Eds.) Glial-neuronal communication. NY: Springer, 1987., V. 2., P. 27-40.
114. Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein: the major protein of glial intermediate filaments in differentiated astrocytes. // J. Neuroimmunol., 1985., V. 8., P. 203-214.
115. Eng L.F., Chemical characterization of the glial fibrillary acidic protein. // Fed. Proc., 1973., V. 32., P. 485.
116. Eng L.F., Gerstl B., Vanderhaeghen J.J. A study of proteins in old multiple sclerosis plaques. // Trans. Amer. Soc. Neurochem., 1970., V. 1., P. 42.
117. Eng L.F., Ghirnikar R.S., Lee Y.L.Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). // Neurochem. Res., 2000., V. 25., P.1439-1451.
118. Eng L.F., Smith M.E., De Velles T., Scoff R.P. Recent studies of the glial fibrillary acidic protein. In: Intermediate filaments. //Ann. NY Acad. Sci., 1985., V. 455., P. 527-537.
119. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. //Immunochem., 1971., V. 8., P. 871-879.
120. Errante L.D., Wiche G., Shaw G. Distribution of plectin, an intermediate filament-associated protein, in the adult rat central nervous system. //J. Neurosci. Res., 1994., V. 37., P. 515-528.
121. Evans H.L., El-Fawal H. A. N., Increased brain GFAP occurs with behavioral and neuromuscular effects of chronic oral methylmercury. // Neurotoxicology., 1995., V. 15., P. 969.
122. Evans H.L., Taioli E., Tonoolo P., El-Fawal H.A.N. Serum autoantibody to nervous system proteins: isotypes in workers exposed to cadmium and nickel. //Toxicolog., 1994., V. 14., P. 291.
123. Far A.G., Nakane P.K. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review. //J. Immunol. Methods., 1981., V. 47., P. 129-144.
124. Farkas E, Luiten G.M. Cerebral microvascular pathology in aging and Alzheimer's disease // Progress in Neurobiol., 2001.,V. 64., P. 575-611.
125. Farquhar M.G., Palade G.E. Junctional complexes in various epithelia. //J. Cell. Biol., 1963., V. 17., P. 375-412.
126. Fessel W.J. The "antibrain factor" in psychiatric patients sera. I. Further studies with a hemagglutination technique. //Arch. Psychiatry., 1962., V. 8., P. 110-117.
127. Fletcher L., Rider C.C., Taylor C.B. Enolase isoenzymes. III. Chromatographic and immunological characteristics of rat brain enolase. //Biochim. Biophys. Acta., 1976., V. 452., P. 245-252.
128. Ford, J. M.: Experimental reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by pharmacological chemosensitizers. // Eur. J. Cancer., 1996., V. 32A., P. : 991-1001.
129. Fraker P.J., Spick J.C. Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide, l,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphrenylglycoluril. // Biochem. Biohys. Res. Commun, 1978., V. 80., P. 849-857.
130. Frikke M.J., Sechi B., Bell R.C.E. Monoclonal antibodies in human neuron-specific enolase reveal heterogeneity of the enzyme in neurons of the central nervous system. // Brain Res., 1987., V. 417., P. 283-292.
131. Fridriksson T., Kini N., Walsh-Kelly C., Hennes H. Serum neuron-specific enolase as a predictor of intracranial lesions in children with head trauma: a pilot study.// Acad. Emerg. Med., 2000., V. 7., P. 816-820.
132. Fuchs E., Weber K. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. // Ann. Rev. Biochem., 1994., V. 63., P. 345-382.
133. Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S. Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. //J. Cell. Biol., 1998., V. 141., P. 1539-1550.
134. Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagaiuchi A, Yonemura S, Tsukita S, Tsukita S.Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. //J. Cell. Biol., 1993., V. 123., P. 1777-1788.
135. Galou M., Pourmin S., Ensergueix D., Ridet J.L., Tchelingerian J.L., Lossouarn L., Privat A., Babinet C., Dupouey P. Normal and pathological expression of GFAP promoter elements in transgenic mice. // Glia., 1994., V. 12., P. 281-293.
136. Geiger B., Ayalon O. Cadherins. // Annu. Rev. Cell Biol., 1992., V. 8., P. 307-322.
137. Ghandour M.S., Langley O.K., Keller A. A comparative immunohistochemical study of cerebellar enolases: double labeling techniques and immunoelectromicroscopy. // Exp. Brain Res., 1981., V. 41., P. 271-279.
138. Giallongo A., Feo S., Moore R., Croce C.M., Showe L.C. Molecular cloning and nucleotide sequence of a full-length cDNA for human a enolase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1986., V. 83., P. 6741-6745.
139. Golden P.L., Pardridge W.M. Brain microvascular P-glycoprotein and a revised model of multidrugs resistance in brain. // Cell. Molec. Neurob., 2000., V. 20., P.165-183.
140. Goldman J.E., Chiu F.-C. Dibutyryl cyclic AMP causes intermediate filament accumulation and actin reorganization in primary astrocytes. //Brain Res., 1984., V. 306., P. 85-95.
141. Goldman R.D., Zackroff R.V., Steinert P.M. Intermediate filaments: overview. // In: Goldman R.D., Steinert P.M. (Eds.) Cellular and molecular biology of intermediate filaments., NY. Plenum, 1990., P. 3-20.
142. Gomi H., Yokoyama T., Fujimoto K., Ikeda T., Katoh A., Itoh T., Itohara S. Mice devoid of the glial fibrillary acidic protein develop normally and are susceptible to scrapie prions. //Neuron., 1995., V. 14., P. 29-41.
143. Gottesman, M. M.: How cancer cells evade chemotherapy: sixteenth Richard and Hindo Rosenthal Foundation Award Lecture. // Cancer Res., 1993., V. 53., P.747-754.
144. Grabar P. Agar-gel diffusion and immunoelectrophoretic analysis.// Ann. N. Y. Acad. Sci., 1957., V. 69., P. 591-607.
145. Graeber M.B., Kreutzberg. Actrocytes increase in glial fibrillary acidic protein during retrograde changes of facial motor neurons. // J. Neurocytol., 1986., V. 15., P. 363-374.
146. Graham D.I., Thomas D.G.T., Brown I. Nervous system antigens. Invited review. // Histopathol., 1983., V. 7., P. 1-21.
147. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney; ultrastructure cytochemistry by a ney tachnique. // J. Histochem. Cytochem. 1966., V.4., P. 291-302.
148. Grasso A., Haglid K.J., Hansson H.A., Persson L., Ronnback L. Localization of 14-3-2 protein in the rat brain by immunoelectron microscopy. //Brain Res., 1977., V. 122., P. 582-585.
149. Grasso A., Roda G., Hogue-Angeletti R.A., Moore B.W., Perez V.J. Preparation and properties of the brain specific protein 14-3-2. //Brain Res., 1977., V. 124., P. 497-507.
150. Griveas I., Sourgounis A., Visvardis G., Zarifis I., Kyriklidou P., Sakellariou G. Iminunoadsorption in Lupus Myocarditis. // Therapeutic Apheresis and Dialysis., 2004., V. 8., P. 281-285.
151. Grob D., Simpson D., Mitsumoto H. Treatment of myastenia gravis by immunoadsorbtion of plasma. // Neurolog., 1995., V. 45., P. 338-344.
152. Gules I., Satoh M., Nanda A., Zhang J.H. Apoptosis, blood-brain barrier, and subarachnoid hemorrhage. // Acta Neurochir. Suppl., 2003., V. 86., P. 483-487.
153. Gurnett CA, Landt M, Wong M. Analysis of cerebrospinal fluid glial fibrillary acidic protein after seizures in children.// Epilepsia., 2003., V. 44., P.1455-1458.
154. Hafler DA, Weiner HL. In vivo labeling of blood T cells: rapid traffic into cerebrospinal fluid in multiple sclerosis.// Ann Neurol., 1987., V. 22., P. 8993.
155. Hafler DA, Weiner HL. In vivo labeling of blood T cells: rapid traffic into cerebrospinal fluid in multiple sclerosis.// Ann Neurol., 1987., V. 22., P. 8993.
156. Hagiwara N., Imada S., Sueoka N. Cell-type specific segregation of transcriptional expression of glial genes in the rat peripheral neurotumor RT4 cell lines. // J. Neurosci. Res., 1993., V. 36., P. 646-656.
157. Hagiwara N., Imada S., Sueoka N. Cell-type specific segregation of transcriptional expression of glial genes in the rat peripheral neurotumor RT4 cell lines. //J. Neurosci. Res., 1993., V. 36., P. 646-656.
158. Hai J., Lin Q., Li S.T., Pan Q.G. Chronic cerebral hypoperfusion and reperfiision injury of restoration of normal perfusion pressure contributes to the neuropathological changes in rat brain. // Brain Res. Mol. Brain Res., 2004.,V. 126., P. 137-145.
159. Hailey D, Topfer L.A. Extracorporeal immunoadsorption treatment for rheumatoid arthritis. // Iss.Emerg. Health Technol., 2002., V. 28., P. 1-4.
160. Hall E.D. Neuroprotective actions of glucocorticoid and nonglucocorticoid steroids in acute neuronal injury. / /Cell Mol. Neurobiol., 1993., V. 13., P. 415-32.
161. Hall E.D., Yonkers P.A.„ McCall J.M., Braughler J,M. Effects of the 21-aminosteroid U74006F on experimental head injury in mice. // J. Neurosurg., 1988., V. 68., P. 456-61.
162. Haluska M., Anthony M.L. Osmotic blood-brain barrier modification for the treatment of malignant brain tumors. // Clin. J. Oncol. Nurs., 2004., V. 8., P. 263-267.
163. Hashimoto, P. H.: Aspects of normal cerebrospinal fluid circulation and circumventricular organs. // Prog. Brain Res., 1992., V. 91., P. 439-443.
164. Haskins J, Gu L, Wittchen ES, Hibbard J, Stevenson BR. ZO-3, a novel member of the MAGUK protein family found at the tight junction, interacts with ZO-1 and occludin. //J. Cell. Biol., 1998., V. 141., P. 199-208.
165. Hatfield J.S., Skoff R.P., Maisel H., Eng L. Glial fibrillary acidic protein is localized in the lens epithelium. //J. Cell Biol., 1984., V. 98., P. 1895-1898.
166. Heath R.G., Krupp I.M. Schizophrenia as an immunologic disorder. I. Demonstration of antibrain globulins by fluorescent antibody techniques. // Arch. Gen. Psychiatry., 1967., V. 16., P. 1-9.
167. Heath R.G., Krupp I.M., Byers L.W. Schizophrenia as an immunologic disorder. II. Effects of serum protein fractions on brain function. //Arch. Gen. Psychiatry., 1967., V. 16., P. 10-22.
168. Heath R.G., Krupp I.M., Byers L.W. Schizophrenia as an immunologic disorder. III. Effects of antimonkey and antihuman brain antibody on brain function. //Arch. Gen. Psychiatry., 1967., V. 16., P. 24-33.
169. Hegmann, E. J., Bauer, H. C, Kerbel, S. Expression and functional activity of P-glycoprotein in cultured cerebral capillary endothelial cells. // Cancer Res., 1992., V. 52., P. 6969-6975.
170. Hellstrom M, Gerhardt H, Kalen M, Li X, Eriksson U, Wolburg H, Betsholtz C. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis.// J Cell Biol., 2001., V. 153., P. 543-553.
171. Herrmann M., Elirenreich H. Brain derived proteins as markers of acute stroke: their relation to pathophysiology, outcome prediction and neuroprotective drug monitoring // Restor Neurol Neurosci., 2003., V. 21., P.177-90.
172. Higley H.R., McNuIty J.A., Rowden G. Glial fibrillary acidic protein and SI00 protein in pineal supportive cells: an electron microscopic study. // Brain Res., 1984., V. 304., P. 117-120.
173. Holtzman D., Obana K., Olson J. Hyperthermia-induced seizures in the rat pup: a model for febrile convulsions in children. // Science., 1981., V. 213., P. 1034-1036.
174. Hopewall J.W.,Van der Kogel A.J. Pathophysiological mechanisms leading to the development of late radiation-induced damage to the central nervous system. // Front Radial Ther. Oncol., 1999., V. 33., P. 265-275.
175. Hossman K.A. Development and resolution of ischemic brain swelling. In: Pappins H.M., Feindel W. (Eds.). Dynamics of brain edema. // Berlin etc.: Springer Verlag, 1976.
176. Hout M.S., LeJeune K.E., Schaack T.M., Bristow D.K., Federspiel W.J. Specific removal of anti-A and anti-B antibodies by using modified dialysis filters. // ASAIO J. 2000., V. 46., P. 702-706.
177. Huzby G., Wedege E., Williams R.C., Jr. Characterization of brain proteins reacting in vitro with anti-neuronal antibodies in patients with Huntington's disease. //Clin. Immunol. Immunopathol., 1978., V. 11., P. 131-141.
178. Hynes R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. // Cell., 2002., V. 110., P. 673-87.
179. Iida K., Takashima S., Ohno T., Ueda K. Neuropathologic study of newborns with prenatal-onset leukomalacia. //Pediatr. Neurol., 1993., V. 9., P. 45-48.
180. Inagaki M., Nakamura Y., Takeda M., Nishimura T., Inagaki N. Glial fibrillary acidic protein: dynamic property and regulation by phosphorylation. //Brain Pathol., 1994., V. 4., P. 239-243.
181. Ingebrigtsen T., Romner B. Biochemical serum markers for brain damage: a short review with emphasis on clinical utility in mild head injury. // Restor. Neurol. Neurosci., 2003., V. 21., P. 171-176.
182. Ishiguro Y., Kato K., Ito T., Horisawa M., Nagaya M. Enolase isoenzymes as markers for differential diagnosis of neuroblastoma, rhabdomyosarcoma and Wilms' tumor. // Gann., 1984., V. 75., P. 53-60.
183. Ishiguro Y., Kato K., Shimizu A, Ito T, Nagaya M. High levels of immunoreactive nervous system-specific enolase in sera of patients with neuroblastoma. //Clin. Chim. Acta., 1982., V. 121., P. 173-180.
184. Itoh M., Nagafiichi A., Moroi S., Tsukita S. InV.vement of ZO-1 in cadherin-based cell adhesion through its direct binding to alpha catenin and actin filaments.//J. Cell. Biol., 1997., V. 138., P. 181-192.
185. Jackson P., Tompson R. The demonstration of new human brain-specific proteins by high-resolution two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. //J. Neurol. Sci., 1981. V. 49., P. 429.
186. Jankovic B. D, Djordjijevic D. Differential appearance of autoantibodies to human brain SI00 protein, neuron specific enolase and myelin basic protein in psychiatric patients. // Int J Neurosci., 1991., V.60 ., P. 119-127.
187. Jankovic B.D. Neural tissue hypersensitivity in psychiatric disorders with immunologic features. // J. Immunol., 1985., V. 135., P. 8536-8575.
188. Jankovic B.D., Jakulic S., Horvat J. Delayed skin hypersensitivity reactions to human brain SI00 protein in psychiatric patients. //Biol. Psychiatry., 1982., V. 17., P. 687-692.
189. Jesaitis L.A., Goodenough D.A. Molecular characterization and tissue distribution of ZO-2, a tight junction protein homologous to ZO-1 and the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. // J. Cell. Biol., 1994., V. 124., P. 949-961.
190. Joo F. Insights into the regulation by second messenger molecules of the permeability of the blood-brain barrier. // Microsc. Res. Tech., 1994., V. 27., P. 507-515.
191. Kamouchi M., Kitazono T., Ago T., Wakisaka M., Ooboshi H., Ibayashi S., Iida M. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. // Brain Res. Mol. Brain Res., 2004., V. 126., P. 114-120.
192. Karcher D., Soler-Federspiel B.S., Lowenthal F.S., Lowenthal A. Anti-neurofilament antibodies in blood of patients with neurological diseases. // Acta Neuropathol. (Berlin)., 1986., V. 72., P. 82-85.
193. Kato K., Nakajima T., Ishiguro Y. Sensitive enzyme immunoassay for SI00 protein: determination in human cerebrospinal fluid. //Biomed. Res., 1982., V. 3., P. 24-28.
194. Kato K., Umeda Y., Suzuki F., Kosaka A. Use of antibody Fabfragments to remove interference by rheumatoid factors with the enzyme-linked sandwich immunoassay. // FEBS Lett., 1979., V. 102., P. 253-256.
195. Kemper E.M., Boogerd W., Thuis I., Beijnen J.H., Van Tellingen O. Modulation of the blood-brain barrier in oncology: therapeutic opportunities for the treatment of brain tumours? // Cancer Treat. Rev., 2004., V. 30., P. 415-423.
196. Kepes J.J., Rubinstein L.J., Chiang H. The role of astrocytes in the formation of cartilage in gliomas. An immunohistochemical study of four cases. // Am. J. Pathol., 1984., V. 117., P. 471-483.
197. Keyeux A, Brucher J.M., Oclirymowicz-Bemelmams D. Late effect of X-irradiation on regulation of cerebral blood flow after whole-brain exposure in rats. // Radiat Res., 1997., V. 147., P. 621-630.
198. Kintner C. Regulation of embryonic cell adhesion by the cadherin cytoplasmic domain. // Cell., 1992., V. 69., P. 225-236.
199. Kniesel U., Wolburg H. Tight junction complexity in the retinal pigment epithelium of the chicken during development. // Neurosci. Lett., 1993., V. 149., P. 71-74.
200. Kobayashi H., Yokoo H., Yanagita T., Wada A. Regulation of brain microvessel function.// Nippon Yakurigaku Zasshi., 2002 .,V. 119., P. 281-286.
201. Koning G.A., SchifFelers R.M., Storm G. Endothelial cells at inflammatory sites as target for therapeutic intervention. // Endothel., 2002., V. 9., P. 161-171.
202. Kornblith P.L. Humoral immunity. In: Thomas D.G.T., Graham D.I. (Eds.) Brain tumours: scientific basis, clinical investigation and current therapy. // London: Butterworth., 1980., P. 133-144.
203. Kozler P, Pokorny J. Evans blue distribution in the rate brain after intracarotid injection with the blood-brain barrier intact and open to osmosis. // Sb Lek., 2003.,V. 104., P. 255-262.
204. Kragh J., Bolwig T.G., Woldbye D.P., Jorgensen O.S. Electroconvulsive shock and lidocaine-induced seizures in the rat activateastrocytes as measured by glial fibrillary acidic protein. // Biol. Psychiatry., 1993., V. 33., P. 794-800.
205. Krakauer M., Schaldemose Nielsen H., Jensen J., Sellebjerg F. Intrathecal syntesis of free immunoglobulin light chains in multiple sclerosis. // Acta Neurol. Scand. 1998., V. 98., P. 161-165.
206. Krogh A. The active and passive exchanges of inorganic ions through the surfaces of living cells and through living membranes generally. // Proc. Roy. Soc. B., 1946., V. 133., P. 140-200.
207. Kuroiwa T., Shibutani S., Okeda R. Blood-brain barrier disruption and exacerbation of ischemic brain edema after restoration of blood flow in experimental focal cerebral ischemia.// Acta Neuropathol. (Berl.)., 1988., V. 76., P. 62-70.
208. Lamers K.J., Van Engelen B.G.M. Cerebrospinal neuron-specific enolase, SI00 and myelin basic protein in neurological disorders. //Acta Neurol. Scand., 1995., V. 92., P. 247-251.
209. Langley O.K., Ghandour M.S., Vincendon G., Gombos G. An ultrastructural immunocytochemical study of nerve-specific protein in rat cerebellum. //J. Neurocytol., 1980., V. 9., P. 783-798.
210. Laping N.J., Teter B., Nichols N.R., Rozovsky I., Finch C.E. Glial fibrillary acidic protein: regulation by hormones, cytokines, and growth factors. // Brain Pathol., 1994., V. 1., P. 259-275.
211. Lapinski TW, Prokopowicz D. Plasmapheresis in medical practice. // Wiad. Lek., 2001., V. 54., P. 437-443.
212. Larson D.M., Carson M.P., Haudenschild C.C. Junctional transfer of small molecules in cultured bovine brain microvascular endothelial cells and pericytes. // Microvasc. Res., 1987., V. 34., P. 184-199.
213. Laurell C.A. Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies. // Anal. Biochem., 1966., V. 15., P. 45-52.
214. Laws E.R., Jr., Taylor W.F., Clifton M.B., Okazaki H. Neurosurgical management of low-grade astrocytomas of the cerebral hemispheres. // J. Neurosurg., 1984., V. 61., P. 665-673.
215. Ledermann J.A. Serum neurone-specific enolase and other neuroendocrine markers in lung cancer. //European J. Cancer., 1994., V. 30A., P. 574-576.
216. Lehmann-Facius H. Über die Liquordiagnose der Schizophrenien. //Klin. Wochenschr., 1937., B. 16., S. 1646-1648.
217. Leibowitz S., Hughes R.A.C. Immunology of the nervous system. // Current topics in immunology., London: Edward Arnold, 1983., V. 17., P. 303.
218. Leibowitz S., Hughes R.A.C. Immunology of the nervous system. // (Current topics in immunology.)., London: Edward Arnold, 1983., V. 17., P. 303.
219. Lendahl U., Zimmerman L.B., McKay R.D.G. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. // Cell., 1990., V. 60., P. 585-595.
220. Levy J., Degani N. Correcting Immune Imbalance: The Use of Prosorba Column Treatment for Immune Disorders. // Therapeutic Apheresis and Dialysis., 2003., V. 7., P. 197-205.
221. Levine S, Sohn D. Cerebral ischemia in infant and adult gerbils. Relation to incomplete circle of Willis. // Arch. Pathol., 1969., V. 87., P. 315-317.
222. Liem R.K.H., Shelanski M.L. Identity of the major protein in "native" glial fibrillary acidic protein preparations with tubulin. //Brain Res., 1978., V. 145., P. 196.
223. Lima J.E., Takayanagui O.M., Garcia L.V., Leite J.P. Use of neuron-specific enolase for assessing the severity and outcome of neurological disorders in patients.// Braz. J. Med. Biol. Res., 2004., V. 37., P. 19-26.
224. Logan D.G., Deodhar S.D. Schizophrenia, an immunologic disorder. //JAMA., 1970., V. 212., P. 1703-1704.
225. Lolli F., Siracusa G., Amato M.P., Fratiglioni L., Dal Pozzo G., Galli E., Amaducci L. Intrathecal synthesis of free immunoglobulin light chains and igM in initial multiple sclerosis. // Acta neurol. Scand. 1991., V. 83., P. 239-243.
226. Lossinsky A.S., Song M.J., Wisniewsky H.M. High Voltage electron microscopic studies of endothelial cell tubular structures in the mouse blood-brain barrier following brain trauma. // Acta Neuropathol. 1989., V. 77., P. 480-488.
227. Lossinsky A.S., Vorbrodt A.W., Wisniewsky H.M. Ultracytochemical srudies of vesicular and canacular transport structures in the injured mammalian blood-brain barrier// Acta Neuropathol. 1983., V. 61., P. 239-245.
228. Madison R.E., Broughton A., Thrasher J.D. Immunologic biomarkers associated with an acute exposure to exothermic byproducts of a ureaformaldehyde spill. //Environ Health Persp., 1991., V. 94., P. 291.
229. Malloch D.A., Clark T.B., Burnet F.R. Glial fibrillary acidic protein in the cytoskeletal and soluble protein fractions of the developing rat brain. // J. Neurochem., 1987., V. 49., P. 299-306.
230. Malmestrom C., Haghighi S., Rosengren L., Andersen O., Lycke J. Neurofilament light protein and glial fibrillary acidic protein as biological markers in MS. //Neurology., 2003., V. 61., P. 1720-1725.
231. Marangos P.J., Campbell I.C., Schmechel D.E., Murphy D.L., Goodwin F.K. Blood platelets contain a neuron specific enolase subunit. // J. Neurochem., 1980., V. 34., P. 1254-1258.
232. Marangos P.J., Gazdar A.F., Carney D.N. Neuron specific enolase in human small cell carcinoma cultures. // Cancer Lett., 1982., V. 15., P. 67-71.
233. Marangos P.J., Parma A.M., Goodwin F.K. Functional properties of neuronal and glial isoenzymes of brain enolase. // J. Neurochem., 1978., V. 31., P. 727-732.
234. Marangos P.J., Paul S.M. Brain levels of neuron-specific and nonneuronal enolase in Huntington's disease. //J. Neurochem., 1981., V. 35., P. 1338-1340.
235. Marangos P.J., Polak J.M., Pearse A.G.E. Neuron specific enolase: a probe for neurons and neuroendocrine cells. //Trends Neurosci., 1982., V. 5., P. 193-196.
236. Marangos P.J., Schmechel D., Parma A.M., Clark R.L., Goodwin F.K. . Measurement of neuronal and non-neuronal enolase of rat, monkey and human tissues. //J. Neurochem., 1979., V. 33., P. 319-329.
237. Marangos P.J., Zis A.P., Clark R.L., Goodwin F.K. Neuronal, nonneuronal and hybrid forms of enolase in brain; structural, immunological and functional comparisons. // Brain Res., 1978., V. 150., P. 117-133.
238. Marangos P.J., Zomzely-Neurath C. Determination and characterization of neuron specific protein (NSP) associated enolase activity. //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976., V. 68., P. 1309-1316.
239. Marangos P.J., Zomzely-Neurath C., Goodwin F.K. Structural and functional properties of neuron specific protein (NSP) from rat, cat and human brain. // J. Neurochem., 1977., V. 28., P. 1097-1107.
240. Mayhan W.G. Regulation of blood-brain barrier permeability. // Microcirculat., 2001., V. 8., P. 89-104.
241. McCarron R.M., Wang L., Staminirovic D.B., Spatz M. Differential Regulation of Adhesion Molecule Expression by Human Cerebrovascular and Umbilical Vein Endothelial Cells. // Endothelium., 1995., V. 2., P. 339-346.
242. McCaugran J.A., Schechter N. Experimental febrile convulsions: long-term effects of hyperthermia-induced convulsions in the developing rat. //Epilepsia., 1982., V. 23., P. 173-183.
243. McCaugran J.A., Schechter N. Hyperthermia-induced convulsions in the rat pup. An animal model of human infantile febrile convulsions. // Soc. Neurosci. Abstr., 1980., V. 6., P. 403-183.
244. Mencarelli C., Magi B., Marzocchi B., Pallini V. Immunological and charge properties of GFAP in lower vertebrates. // Comp. Biochem. Physiol., 1993., V. 105B., P. 375-380.
245. Menzies S.A., Hoff J.T., Betz L.A. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. // Neurosurg., 1992.,V. 31., P. 100-107.
246. Mickley G.A., Ferguson J.L., Nemeth T.J. Spontaneous perseverative turning in rats with radiation induced hippocampal damage. // Behav Neurosci. 1989., V. 103.,P.722—730.
247. Miller D.B., Blackman C.F., O'Callaghan J.P. An increase in glial fibrillary acidic protein follows brain hyperthermia in rats. // Brain Res., 1987., V. 415., P. 371-374.
248. Minakawa T, Bready J, Berliner J, Fisher M, Cancilla P.A. In vitro interaction of astrocytes and pericytes with capillary-like structures of brain microvessel endothelium. // Lab Invest., 1991., V. 65., P. 32-40.
249. Missler U, Wiesmann M, Friedrich C, Kaps M. S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. // Stroke., 1997., V. 28., P. 1956-1960.
250. Mito T., Becker L.E. Developmental changes of SI00 protein and glial fibrillary acidic protein in the brain in Down syndrome. // Exp. Neurol., 1993., V. 120., P. 170-176.
251. Mobini R., Maschke H., Waagstein F. New insights into the pathogenesis of dilated cardiomyopathy: possible underlying autoimmune mechanisms and therapy. // Autoimmun. Rev., 2004., V. 3., P. 277-84.
252. Moore B.W. Brain-specific proteins. In: Schneider D.J. (ed.) Proteins of the nervous system., NY., Raven Press, 1973., P. 1-12.
253. Moore B.W., McGregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver. // J. Biol. Chem., 1965., V. 133., P. 1647-1653.
254. Mori T., Morimoto K., Hayakawa T.,, Ushio Y, Mogami H, Sekiguchi K. Radioimmunoassay of astroprotein (an astrocyte specific cerebroprotein) incerebrospinal fluid and its clinical significance. //Neurol. Med.-Chir. (Tokyo)., 1978., V. 18., P. 25-31.
255. Moryama E., Salkman M., Broadwell R.D. Blood-brain barrier alteration after microwave-induced hyperthermia is purely a thermal effect. 1. Temperature and power measurements. //Surg. Neurol., 1991., V. 35., P. 177-182.
256. Mossakowski M.J., Weinrauder N. Glial fibrillary acidic protein and S100 protein in abnormal astrocytes in Wilson's disease. // J. Neuropathol., 1986., V. 24., P. 365-374.
257. Nacane P. K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. //J. Histochem. Cytochem., 1974., V. 22., P. 1084-1091.
258. Nag S. Cerebral changes in chronic hypertension, combined permeability and immunohistochemical studies. // Acta Neuropathol., 1984a., V. 62., P. 178-184.
259. Nag S. Cerebral endothelial mechanisms in increased penneabilityinchronic hypertension. // Ad. Exp. Med. Biol., 1993., V. 331., P. 263-266.
260. Nag S. Cerebral endothelial plasma membrane alterations in acute hypertension. // Acta Neuropathol., 1986., V. 70., P. 38-43.
261. Nag S. Cold-injury of the cerebral cortex, immunolocalization of cellular protein and blood-brain barrier permeability studies. // J. Neuropathol. Exp. Neurol., 1996., V. 55., P. 880-888.
262. Nag S. Localization of calcium-acrivated adenosine-triphosphatase (Ca2+-ATPase) in intercerebral arterioles in acute hypertension. // Acta Neuropathol., 1988., V. 75., P. 547-553.
263. Nag S. Role of the endothelial cytosceleton in blood-brain barrier permeability to proteins. // Acta Neuropathol., 1995., V. 90., P. 454-460.
264. Nag S. Vascular changes in the spinal cord in N-methyl-d-aspartate-induced exitotoxicity, morphological and permeability studies. // Acta Neuropathol., 1992., V. 84., P. 471-477.
265. Nag S., Robertson D.M., Dinsdale H.B. Cerebral cortical changws in acute experimental hypertension. An ultrastructural study. // Lab. Invest., 1977., V. 33., P. 150-157.
266. Nag S., Robertson D.M., Dinsdale H.B. Quantitative estimate of pinocytosis in experimental acute hypertension. // Acta Neuropathol., 1979., V. 46., P. 107-116.
267. Nagashima G, Suzuki R, Asai J, Fujimoto T. Immunohistochemical analysis of reactive astrocytes around glioblastoma: an immunohistochemical study of postmortem glioblastoma cases. // Clin. Neurol. Neurosurg., 2002., V. 104., P. 125-31.
268. Nagy Z., Peters H., Huttner 1. Charge-related alterations of the cerebral endothelium. // Lab. Invest., 1983., V. 49., P. 662-671.
269. Nakazato Y., Ishizeki J., et al. Localization of SI00 and glial fibrillary acidic protein-related antigen in pleomorphic adenoma of salivary glands. // Lab. Invest., 1982., V. 46., P. 621—626.
270. Nehls V, Drenckhahn D. Heterogeneity of microvascular pericytes for smooth muscle type alpha-actin. // J Cell Biol., 1991., V. 113., P. 147-54.
271. Nguyen V., Gaber M. W., Sontag M.R., Kiani M.F. Late effects of ionizing radiation on the microvascular networks in normal tissue. // Radiat. Res., 2000., V. 154., P.531-536.
272. Niebroj-Dobosz I., Rafalowska J., Lukasiuk M., Pfeffer A., Mossakowski M.J. // Immunochemical analysis of some proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with ischemic strokes. //Folia Neuropathol., 1994., V. 34., P. 182-186.
273. O'Callaghan J.P., Lavin K.L., Chess G., Clouet D.H. A method for dissection of discrete regions of rat brain following microwave irradiation. //Brain Res. Bull., 1983., V. 11., P. 31-42.
274. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory. //Ann. NY Acad. Sci., 1964., V. 121., P. 321-329.
275. Ouchterlony O. // Ark. kemi., 1950., V. 1., P. 43-50.
276. Palade G.E., Simionescu M., Simionescu N. Strustural aspects of the permeability of the microvascular endothelium. // Acta Physiol. Scand., 1979., V. 463., P. 11-32.
277. Pandey R.S., Gupta A.K., Chaturvedi U.C. Autoimmune model of schizophrenia with special reference to antibrain antibodies. // Biol. Psychiatry., 1981., V. 16., P. 1123-1136.
278. Papasozomenos S., Shapiro S. Pineal astrocytoma — report of a case, confined to the epiphysis, with immunocytochemical and electron microscopic studies. //Cancer (Philadelphia)., 1981., V. 47., P. 99-103.
279. Pardridge W.M. Blood-brain barrier transport of nutrients. // Fed. Proc., 1986., V. 45., P. 2047-2049.
280. Pardridge W.M. Blood-brain barrier drug targeting: the future of brain drug development. // Mol. Interv., 2003., V. 3., P. 90-105.
281. Pearse A.G.E. Neurotransmission and the APUD concept. In: Coupland R.E., Fujita T. (eds.) Chromaffin, enterochromaffin and related cells. // Amsterdam: Elsevier, 1976., P. 147.
282. Pegram C.N., Eng L.F., Wikstrand C.J., McComb R.D, Lee Y.L., Bigner D.D. Monoclonal antibodies reactive with epitopes restricted to glial fibrillary acidic proteins of several species. //Neurochem. Pathol., 1985., V. 3., P. 119-138.
283. Peress N.S., Fleit H.B., Perille E., Kuljis R., Pezzullo C., Identification of Fc gamma RI, II and III on normal human brain ramified microglia and on microglia in senile plaques in Alzheimer's diseas. // J. Neuroimmunol., 1993., V. 48., P. 71-79.
284. Perry G., Friedman R., Kang D.N., Manetto V, Autilio-Gambetti L, Gambetti P. Antibodies to the neuronal cytoskeleton are elicited by Alzheimer paired helical filament fractions. // Brain Res., 1987., V. 420., P. 233-242.
285. Peshavaria M., Day I.N.M. Molecular structure of the human muscle-specific enolase gene (EN03). // Biochem. J., 1991., V. 275., P. 427-433.
286. Petito C.K., Halaby I.A. Relationship between ischemia and ischemic neuronal necrosis to astrocyte expression of glial fibrillary acidic protein. // Int. J. Dev. Neurosci., 1993., V. 11., P. 239-247.
287. Petito C.K., Levy D.E. The importance of cerebral arterioles in alterations og the blood-brain barrier. // Lab. Invest., 1980., V. 43., P. 262-268.
288. Pettmann B., Henderson C.E. Neuronal cell death. // Neuron., 1998., V. 20., P. 633-647.
289. Poletaev A.B, Morozov S.G, Gnedenko BB, Zlunikin VM, Korzhenevskey DA. Serum anti-SlOOb, anti-GFAP and anti-NGF autoantibodies of IgG class in healthy persons and patients with mental and neurological disorders.//Autoimmunity., 2000., V. 32., P.33-38.
290. Ptak J. Changes of plasma proteins after immunoadsorption using Ig-Adsopak columns in patients with myasthenia gravis. // Transfiis. Apheresis Sci., 2004.,V. 30., P.125-129.
291. Prat A, Biernacki K, Wosik K, Antel J.P. Glial cell influence on the human blood-brain barrier. // Glia., 2000., V. 36., P. 145-155.
292. Prinz R.A., Marangos P.J. Use of neuron-specific enolase as a serum marker for neuroendocrine neoplasms. // Surgery., 1982., V. 92., P. 887-889.
293. Qin D.X., Zheng R., Tang J, Li J. X., Hu Y.H. Influence of radiation on the blood-brain barrier and optimum time of chemotherapy. // Int. J. Radial. Oncol. Biol. Physiol., 1990., V. 19., P. 1507-1510.
294. Quinlan R.A., Moir R.D., Stewart M. Expression in Escherichia coli fragments of glial fibrillary acidic protein: characterization, assembly, properties and paracrystal formation. // J. Cell Sci., 1989., V. 93., P. 71-83.
295. Quinn G.B., Reeves I.G., Day I.N.M. Mapping of antigenic sites in human neuron-specific enolase by expression subcloning. //Clin. Chem., 1994., V. 40., P. 790-795.
296. Rajasekaran A.K., Hojo M., Hima T., Rodrigues-Boulan E. Catenins and zonula occludens-1 form a complex during early stages in the assembly of tight junctions. // J. Cell. Biol., 1996., V. 132., P. 451-464.
297. Ralton J.E., Lu X., et al. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. //J. Cell Sci., 1994., V. 107., P. 1935-1948.
298. Rapoport S.I., Olino, K., Pettigrew, K. D.: Drug entry into the brain. // Brain Res., 1979., V. 172., P. 354-359.
299. Rasmussen L.S, Christiansen M, Eliasen K., Sander-Jensen K., Moller J.T. Biochemical markers for brain damage after cardiac surgery ~ time profile and correlation with cognitive dysfunction. // Acta Anaesthesiol. Scand., 2002., V. 46., P.547-551.
300. Raymond J.J., Robertson D.M., Dinsdale H.B. Pharmacological modification of bradykinin inducedbreakdown of the blod-brain barrier. // Can. J. Neurol. Sci., 1986., V. 13., P. 214-220.
301. Reese, T. S. Karnovsky, M. J.: Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. // J. Cell. Biol., 1967., V. 34., P. 207-217.
302. Regner A., Alves L.B., Chemalel., Costa M.S., Friedman G., Achaval M., Leal L., Emanuelli T. Neurochemical characterization of traumatic brain injury in humans. // J.Neurotrauma., 2001., V. 18., P. 783-792.
303. Reid D.M., Rerry V.H., Anderson P.B., Gordon S. Mitosis and apoptosis of microglia in vivo induced by an anti-CR3 antibody which crosses the blood-brain barrie. // Neuroscience., 1993., V. 56., P. 529-533.
304. Rember M.P., Marcussen W.H., Tiller-Borsich J. The late effects of radiation on the blood brain barrier. //Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1986., V. 12., P. 1965-1969.
305. Povlsen, G.K., Ditlevsen, D.K., Berezin, V., Bock, E. Intracellular signalling by the Neural Cell Adhesion Molecule. // Neurochem. Res., 2003.,V. 28., P. 127-141.
306. Ronnback L., Persson L., Hansson H.A., Haglid K.G., Grasso A. 14-3-2 protein in rat brain synapses. // Experientia., 1977., V. 33., P. 1094-1095.
307. Ronspeck W., Brinckmann R., Egner R., Gebauer F., Winkler D., Jekow P., Wallukat G., Miiller J., Kunze R. Peptide Based Adsorbers for Therapeutic Immunoadsorption. // Therapeutic Apheresis and Dialysis., 2003., V. 7., P. 91-97.
308. Rosenberg GA, Estrada E, Kelley RO, Kornfeld M. Bacterial collagenase disrupts extracellular matrix and opens blood-brain barrier in rat. // Neurosci. Lett., 1993., V. 160., P.l 17-119.
309. Rosengren L.E., Lycke J., Andersen O. Glial fibrillary acidic protein in CSF of multiple sclerosis patients: relation to neurological deficit. // J. Neurol. Sci., 1995., V. 133., P. 61-65.
310. Rosengren L.E., Wikkelso C., Hagberg L. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: application in CSF of adults. //J. Neurosci. Methods., 1994., V. 51., P. 197-204.
311. Rubin P., Gash D.M., Hansen J.T. Disruption of the blood-brain barrier as the primary effect of CNC irradiation. // Radiother. Oncol., 1994., V. 31., P.51-60.
312. Rubin R.T. Investigation of precipitins to human brain in sera of psychotic patients. // Br. J. Psychiatry., 1963., V. 111., P. 1003-1106.
313. Rubinstein L.J. Diagnostic markers in human neurooncology. A progress report. In: Raine C.S. (ed.) Advances in neuroimmunology. // Ann. NY Acad. Sci., 1988., V. 540., P. 78-90.
314. Rubinstein L.J. Tumors of the central nervous system.// Atlas of tumor pathology. Series 2, Fascicle 6., Washington, DC: Ann. Forces Inst. Pathol., 1972.
315. Rueger R., Dahl D., Bignami A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. //Anal. Biochem., 1978., V. 89., P. 360.
316. Rutka J.T., Giblin J.R., Apodaca G. Inhibition of growth and induction of differentiation in a malignant human glioma cell line by normal leptomeningeal extracellular matrix proteins. //Cancer Res., 1987., V. 47., P. 3515-3522.
317. Rutka J.T., Murakami M., Dirks P.B., Hubbard S.L., Becker L.E., Fukuyama K, Jung S., Tsugu A., Matsuzawa K. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. // J. Neurosurg., 1997., V. 87., P. 420-430.
318. Rutka J.T., Smith S.L. Transfection of human astrocytoma cells with glial fibrillary acidic protein complementary DNA: analysis of expression, proliferation, and tumorigenecity. // Cancer Res., 1993., V. 53., P. 3624-3641.
319. Sakimura K. Kushiya E., Obinata M, Takahashi Y. Molecular cloning and the nucleotide sequence of cDNA to mRNA for non-neuronal enolase (aa-enolase) of rat brain and liver. //Nucleic Acids Res., 1985., V. 13., P. 4365-4378.
320. Salm A.K., Hatton G.I., Nilaver G. Immunoreactive glial fibrillary acidic protein in pituicytes of the neurohypophysis. //Brain Res., 1982., V. 236., P. 471-476.
321. Sankar R., Domer S.R., Merine D.S. Effects of dopaminergic and adrenergic blockade on amphetamine induced extravasation of protein into the brain of normotensive and spontaneously hypertensive rats. // Neuropharmacol., 1981., V. 20., P. 667-673.
322. Sano K., Tanihara H. Heimark RL, Obata S, Davidson M, St John T, Taketani S. Protocadherins: a large family of cadherin-related molecules in central nervous system. // EMBO J., 1993., V. 12., P. 2249-2256.
323. Sapolsky R.,M, Pulsinelli WA. Glucocorticoids potentiate ischemic injury to neurons: therapeutic implications. // Science. ,1985., V. 229., P. 13971400.
324. Schmechel D.E., Marangos P.J. Neuron specific enolase as a marker for differentiation in neurons and neuroendocrine cells. // In: McKelvey J., Barker J. (eds.). Current methods in cellular neurobiology., NY.,Wiley, 1983., P. 1-62.
325. Schuize C, Firth J.A. Immunohistochemical localization of adherens junction components in blood-brain barrier microvessels of the rat.// J. Cell. Sci., 1993., V. 104., P. 773-782.
326. Schulthesis T.E., Kun L.E., Ang K.K. Radiation response of the central nervous system. //Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1995., V. 31., P. 10931112.
327. Schuize C., Smales C., Rubin L.L. Staddon J.M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. // J. Neurochem., 1997., V. 68., P. 991-1000.
328. Segal M. B. Extracellular and cerebrospinal fluids. // J. Inher. Metab., 1993., V. 16., P. 617-638.
329. Seifert G.J., Lawson D., Wiche G. Immunolocalization of the intermediate filament-associated protein plectin at focal contacts and actin stress fibers. // Eur. J. Cell biol., 1992., V. 59, P. 138-147.
330. Shamy M.Y, El-Fawal H.A.N. Titer profiles of autoantibodies against neurofilament triplet proteins in lead exposed workers. // Toxicolog, 1993, V. 13, P. 124.
331. Silber E, Semra Y.K, Gregson N.A, Sharief M.K. Patients with progressive multiple sclerosis have elevated antibodies to neurofilament subunit. //Neurology, 2002, V. 58, P. 1372-81.
332. Singh V.K, Averett R, Warren R, Ghaziuddin M. Circulating autoantibodies to neuronal and glial filament proteins in autism. // Pediatr Neurol, 1997, V. 17, P. 88-90.
333. Singh V.K, Rivas W.H. Prevalence of serum antibodies to caudate nucleus in autistic children. // Neurosci. Lett, 2004, V. 355, P. 53-56/
334. Sluyterman L.A.A., Eldersma O. Chromatofocusing: isoelectric focusing on ion-exchange column. I. General principles. // J. Chromatogr., 1978., V. 150., P. 1-30.
335. Smith Q.R., Rapoport S.I. Cerebrovascular permeability coefficients to sodium, potassium, and chloride. //J. Neurocem. 1986., V. 46., P. 1732-1742.
336. Spatz H. Die Bedeutung der vitalen Färbung fur die Lehre vom Stoffaustausch zwischen dem Zentralnervensystem und dem übrigen Korper. // Arch. Psychiat. Nervenkr., 1933., V. 101., P. 267-358.
337. Staddon J.M., Rubin L.I. Cell adhesion, cell junctions and the blood-brain barrier. // Curr. Op. in Neurobiol., 1996., V. 6., P. 622-627.
338. Staddon J.M., Smales C., Rubin L.L. Schulze C, Esch F.S. pl20, a pl20-related protein (plOO), and the cadherin/catenin complex. // J. Cell. Biol., 1995.,V. 130., P. 369-381.
339. Stancova I., Prokesova L, Trojan S. Is the identification of antibodies against the nervous tissue an indicator of brain injury? // Physiol Res., 1999., V. 48., P. 383-387.
340. Stalnacke B.M., Tegner Y., Sojka P. Playing soccer increases serum concentrations of the biochemical markers of brain damage S-100B and neuron-specific enolase in elite players: a pilot study. // Brain Inj., 2004., V. 18., P. 899909.
341. Stein T.D., Fedynyshyn J.P., Kalil R.E. Circulating autoantibodies recognize and bind dying neurons following injury to the brain. // J. Neuropathol. Exp Neurol., 2002., V. 61., P. 1100-1108.
342. Stevenson B.R., Anderson J.M., Goodenough D. A., Mooseker M.S. Tight junction structure and ZO-1 content are identical in two strains of Madin
343. Darby canine kidney cells which differ in transepithelial resistance. // J. Cell. Biol., 1988., V. 107., P. 2401-2408.
344. Stevenson B.R., Siliciano J.D., Mooseker M.S., Goodenough D.A. Identification of ZO-1: a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction (zonula occludens) in a variety of epithelia. // J. Cell. Biol., 1986., V. 103., P. 755-766.
345. Steward O., Torre E.R., Tomasulo R., Lothman E. Seizures and the regulation of astroglial gene expression. //Epilepsy Res. Suppl., 1992., V. 7., P. 197-209.
346. Stewart M. Intermediate filament structure and assembly. // Curr. Opin. Cell Biol., 1993., V. 5., P. 3-11.
347. Takeda H., Tsukita S. Effects of tyrosine phosphorylation on tight junctions in temperature-sensitive v-src-transfected MDCK cells. // Cell Struct. Funct., 1995., V. 20., P. 387-393.
348. Takeichi M. Nagafuchi A, Tsukita S. Transmembrane control of cadherin-mediated cell-cell adhesion. // Semin. Cell Biol., 1993., V. 4., P. 175-81.
349. Taniguchi Y, Yorioka N, Okushin S, Oda H, Usui K, Yamakido M. Usefulness of immunoadsorption therapy for systemic lupus erythematosus associated with transverse myelitis. A case report. // Int. J. Artif. Organs.,1995., V. 18., P. 799-801.
350. Tapia F.J., Polak J.M., Barbosa A.J., Bloom S.R., Marangos P.J., Dermody C, Pearse A.G. Neuron-specific enolase is produced by neuroendocrine tumours.//Lancet., 1981., V.I., P. 808-812.
351. Terman D., Buffaloe G., Mattioli C, Cook G, Tillquist R, Sullivan M, Ayus JC. Extracorporeal immunoadsorption initial experience in human systemic lupus erythematosus. // Lancet., 1979., V. 2., P. 824-826.
352. Tiainen M, Roine R.O., Pettila V., Takkunen O. Serum neuron-specific enolase and S-100B protein in cardiac arrest patients treated with hypothermia. // Stroke., 2003., V. 34., P. 2881-2886.
353. Tilling T, Engelbertz C., Decker S, Dorothea Korte, Sabine Huwe and Hans-Joachim Gallal. Expression and adhesive properties of basement membrane proteins in cerebral capillary endothelial cell cultures. //Cell Tiss. Res., 2002., V. 310., P. 19-29.
354. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.// Proc. Natl. Acad. Sci U S A., 1979,V. 76, P. 4350-4334.
355. Trojanowski J.Q., Lee V.M.-Y., Schlaepfer W.W. An immunohistochemical study of human central and peripheral nervous system tumors, using monoclonal antibodies against neurofilaments and glial filaments. // Hum. Pathol., 1984., V. 15., P. 248-257.
356. Tsujimura K., Tanaka J., Ando S. Identification of phosphorylation • * ■ *sites on glial fibrillary acidic protein for cdc2 kinase and Ca -calmoduhn-dependent protein kinase II. // J. Biochem., 1994., V. 116., P. 426-434.
357. Ullrich H., Kuelinl P. New trends in specific immunoadsorption. // Transfus. Apheresis Sci., 2004., V. 30., P. 223-231.
358. Van Engelen B.G., Renier W.O., Weemaes C.M. Immunoglobulin treatment in human and experimental epilepsy. // J. Neurol. Neurosurg. Rsychiat.,1994., V. 57., P.72-75.
359. Van Geel W.J., de Reus H.P., Nijzing H., Verbeek M.M., Vos P.E., Lamers K.J. Measurement of glial fibrillary acidic protein in blood: an analytical method. //Clin Chim Acta., 2002., V. 326., P. 151-154.
360. Van Noorden S., Polak J.M., Robinson M., Pearse A.G., Marangos P.J. Neuron specific enolase in the pituitary gland. //Neuroendocrinol., 1984., V. 38., P. 309-316.
361. Van Reempts J.L.H. The hypoxic brain: histological and ultrastructural aspects. //Behav. Brain Res., 1984., V. 14., P. 99-108.
362. Van Reempts J.L.H., Borgers M. Structural damage in experimental cerebral ischemia. In: Schurr A., Rigor B.M. (Eds.) // Cerebral ischemia and resuscitation., Boca Raton, Florida: CRC, 1990., P. 235-257.
363. Van Vulpen M., Kal H.B., Taphoorn M.J., El-Sharouni S.Y. Changes in blood-brain barrier permeability induced by radiotherapy: implications for timing of chemotherapy? (Review).//Oncol. Rep., 2002., V.9., P.683-688.
364. Vaquero J, Chung C, Blei A.T. Brain edema in acute liver failure. A window to the pathogenesis of hepatic encephalopathy. // Ann. Hepatol. 2003.,V. 2., P. 12-22.
365. Verdu Perez A., Falero M.P., Arroyos A., Estevez F., Felix V., Lopez Y., Pantoja A., Ureta A. Blood neuronal specific enolase in newborns with perinatal asphyxia. //Rev. Neurol., 2001., V. 3., P. 714-717.
366. Vinores S.A., Herman M.M., Rubinstein L.J, Marangos P.J. Electron microscopic localization of neuron-specific enolase in rat and mouse brain. // J. Histochem. Cytochem., 1984., V. 32., P. 1295-1302.
367. Vinores S.A., Marangos P.J., Bonnin J.M, Rubinstein L.J. Immunoradiometric and immunohistochemical demonstration of neuron-specific enolase in experimental rat gliomas. // Cancer Res., 1984., V. 44., P. 2595-2601.
368. Virgintino D., Errede M., Robertson D., Capobianco C., Girolamo F., Vimercati A., Bertossi M., Roncali L. Immunolocalization of tight junctionproteins in the adult and developing human brain. II Histochem. Cell Biol., 2004., V. 122., P. 51-59.
369. Vorbrodt A.W., Dobrogowska D.H. Molecular anatomy of interendothelial junctions in human blood-brain barrier microvessels. // Folia Histochem. Cytobiol., 2004., V. 42., P. 67-75.
370. Vorbrodt A.W., Dobrogowska D.H. Molecular anatomy of intercellular junctions in brain endothelial and epithelial barriers: electron microscopist's view. // Brain Res. Brain Res. Rev., 2003., V. 42., P. 221-242.
371. Vries H.E., Kuiper J, Boer A.G., Van Berkel T.J.C., Breimer D. The Blood-Brain Barrier in Neuroinflammatory Diseases. // Pharmacol. Rev., 1997., V. 49, P. 143-156.
372. Walret F.K. Die Allgemeinen Grundlagen des Stoffaustausches zwischen dem Zenrtralnervensystem und dem übrigen Koroer. // Arch. Psychiat. Nervenkr., 1933., V. 101., P. 195-230.
373. Warecka K. Alpha-2-glycoprotein. //Scand. J. Immunol., 1982., V. 15., P. 279.
374. Warecka K. Immunological differential diagnosis of human brain tumors. //J. Neurol. Sei., 1975., V. 26., P. 511.
375. Warecka K. Isolation of brain-specific glycoprotein. //J. Neurochem., 1970., V. 17., P. 829.
376. Warecka K., Miller P. The appearance of human "brain-specific" glycoprotein in ontogenesis. //J. Neurol. Sei., 1969., V. 8., P. 3.
377. Waterman S.J., El-Fawal H.A.N., Shyder C.A. Lead alters the immunogenicity of two neural proteins: a potential mechanism for the progression of lead-induced neurotoxixity. // Environ Health Percpec., 1994., V. 102., P. 1052-1056.
378. Werner A., Kloss C.U.A., WaLter J., Kreutzberg G.W., Rivich G. Intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the regenerating mouse facial motor nucleus. //J. Neurocytol. 1998. V. 27. P. 219-232.
379. Westergaard E. The effect of serotonin, norepinephrine and cyclic AMP on the BBB. // Ultrastructural Res., 1975., V. 50., P. 383.
380. Westergaard E., Van Deurs B., Brondsted H.E. Increased transfer of reroxidase across cerebral enditelium, evoked by acute hypertension. // Acta Neuropathol., 1977., V. 37., P. 141-152.
381. Williams K., Ulvestad E., Antel J. Immune regulatory and effector properties of human adult microglia: studies in vitro and in situ. // Adv. Neuroimmunol., 1994., V. 4., P. 273-281.
382. Witebsky E. The question of self-recognition by the host and problems of autoantibodies and their specificity. // Cancer Res., 1961., V. 21., P. 1216-1222.
383. Wolburg H., Lippoldt A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. // Vascular Pharmacol., 2002., V. 32., P. 323-337.
384. Yagihashi A., Kikuchi K. Apheresis of Immune Diseases and Apheresis Using Immunological Specificity. // Therapeutic Apheresis and Dialysis., 2002., V. .6, P. 358-364.
385. Yamamoto R., Kimura S., Matsuura A, Fukuda Y, Hayakawa T, Kato K. Two-site enzyme immunoassay for A-fetoprotein involving column chromatography. //J. Immunol. Methods., 1986., V. 87., P. 197-201.
386. Yang Y., Dowling J., Yu Q. C., Kouklis P., Cleveland D.W., Fuchs E. An essential cytoskeletal linker protein connecting actin microfilaments to intermediate filaments. // Cell., 1996., V. 86., P. 655-665.
387. Yang K., Kenpe K., Yamaji K., Tsuda H., Hashimoto H. Plasma Adsorption in Critical Care. // Therapeutic Apheresis and Dialysis., 2002.,V. 6., P. 184-188.
388. Yeh J.H., Chiu H.C. Comparison between double-filtration plasmapheresis and immunoadsorption plasmapheresis in the treatment of patients with myasthenia gravis. // J. Neurol., 2000., V. 247., P. 510-513.
389. Yuan H., Gaber M.W., McColgan T, Naimark M.D., Kiani M.F., Merchant T.E. Radiation-induced permeability and leukocyte adhesion in the rat blood-brain barrier: modulation with anti-ICAM-1 antibodies. // Brain Res., 2003., V. 18., P. 59-69.
390. Zelter P.M., Marangos P.J. Prognostic importance of serum neuron specific enolase in local and widespread neuroblastoma.// In: Evans A. (ed.) Advances in neuroblastoma research., NY: Alan R. Liss., 1985., P. 319-329.
391. Zhong Y, Enomoto K, Isomura H, Sawada N, Minase T, Oyamada M, Konishi Y, Mori M. Localization of the 7H6 antigen at tight junctions correlates with the paracellular barrier function of MDCK cells. // Exp. Cell Res., 1994., V. 214., P. 614-20.
392. Zomzely-Neurath C.E., York C., Moore B.W. In vitro synthesis of two brain specific proteins (SI00 and 14-3-2) by polyribosomes from rat brain. // Arch. Biochem. Biophys., 1973., V. 155., P. 58-69.
393. Zoppo G., Ginis I., Hallenbeck J.M., Iadecola C., Wang X., Feuerstein G.Z. Inflammation and stroke: putative role for cytokines, adhesion molecules and iNOS in brain response to ischemia. // Brain Phatology., 2000., V. 10., P. 95112.
-
Рябухин, Игорь Александрович
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.04
- Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмахантительной агрессии в мозг
- Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован
- Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков в оценке нейродегенеративного процесса при экспериментальном ишемическом инсульте головного мозга
- Состояние обмена гликопротеинов у больных клещевым энцефалитом и клещевым боррелиозом
- Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций ЦНС у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом
