Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Соавнительное исследование белково-липидного состава мембран микросом тканей позвоночных животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Соавнительное исследование белково-липидного состава мембран микросом тканей позвоночных животных"

На правах рукописи

РГо ОД

7 9 Ь?,Т /1П1

МЕДВЕДЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВО-ЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН МИКРОСОМ ТКАНЕЙ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Самара-2000

Работа выполнена на кафедре биохимии Самарского государственного университета и в Центральной научно-исследовательской лаборатории Самарского государственного медицинского университета.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор СЕРЫХ М.М.

доктор биологических наук, профессор ГЛЕБОВ Р.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ГЕНИНГ Т.П.

кандидат биологических наук,доцент МОЛЧАТСКАЯ В.Ф.

Ведущая организация:

Институт теоретической и

экспериментальной биофизики РАН (г.Пущино)

Защита состоится «2000 г. в часов на заседании

диссертационного совета К 063.94.10 в Самарском государственном университете по адресу:

443011, г.Самара, ул. Академика Павлова, 1, Самарский государственный университет, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Самарского государственного университета.

Автореферат разослан « ьИ-йл.] 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук доцент

--Ведясова О.А.

ЕШ.Н-М, О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Работа выполнялась в направлении решения двух основных проблем: 1) изучение филогенеза позвоночных на субклеточном, мембранном уровне; 2) исследование белково-липидного состава мембран тканей в сравнительном аспекте в ряду видов основных классов позвоночных для более тонкого понимании функциональных различий печени, мозга и мышц животных.

С вопросами структурной и функциональной эволюции тесно связаны вопросы их биохимической эволюции. Если в недавнем прошлом биохимия и физиология давали лишь убедительные свидетельства единства происхождения органического мира (Krebs, 1981), сейчас, с развитием широких сравнительных исследований и накоплением большого фактического материала, возникает возможность биохимическими и физиологическими методами выяснить степень родства между различными организмами (Яблоков, Юсуфов,1981). Сейчас уже известно, что молекулярные родословные поразительным образом подтверждают филогенетические связи, предложенные на основе классических методов сравнительной морфологии (Хадорн, Венер, 1989). Исследование липидов мозговых мембран во всех классах позвоночных животных и у многих беспозвоночных, а также в ходе онтогенетического развития ряда форм позволило высказать соображения о биохимической эволюции мозга и специально его липидного состава, представляющего основу структуры клеточных мембран (Крепе,1981). В то же время практически отсутствуют работы, в которых мембрана рассматривалась бы как целостная структура, как взаимосвязь, единство ее основных компонентов - белков и липидов. Не упоминаются также исследования белково-липидного состава мембранных структур других тканей позвоночных - печени, мышц и т.д., которые позволили бы более полно осветить закономерности филогенеза животных на уровне их мембранной организации.

Вторая проблема связана с более глубоким изучением функциональных проявлений мозга и печени позвоночных. В работах акад. J1.A. Орбели, основоположника эволюционного направления в физиологии в нашей стране, сравнительно-физиологическое или сравнительно-биохимическое изучение какого-нибудь явления или процесса в хорошо продуманном ряду животных, занимающих разное положение в филетической системе, рассматривается как один из путей к выяснению развития данной функции или данного процесса (Крепе, 1981).

Цель и основные задачи работы .

Целью работы является сравнительное исследование белково-липидного состава мембран микросом тканей (печени, мозга и в отдельном фрагменте работы мышц) у представителей пяти основных классов позвоночных (рыб, земноводных, пресмыкающихся, птиц и млекопитающих). Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

-изучить содержание периферических и интегральных белков в мембранах микросом печени и мозга позвоночных;

-провести аминокислотный анализ мембранных белков; -исследовать гетерогенность белков методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях;

-дать сравнительную характеристику соотношениям основных мембранных компонентов - белков и липидов в микросомах печени, мозга и скелетных мышц;

-определить содержание общих фосфолипидов и холестерина в этих же мембранных фракциях;

-изучить фосфолипидный состав мембран печени и мозга позвоночных; -с помощью методов корреляционного анализа и математического анализа исследовать взаимосвязи компонентов мембран, построить соответствующие модели и выявить возможности их использования для изучения филогенеза позвоночных и функциональных особенностей тканей животных.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование белково-липидного состава мембран микросом тканей видов, относящихся к пяти основным классам позвоночных, для выявления сходства и различий животных на субклеточном уровне, на уровне их мембранной организации, и для выяснения возможностей использования характеристик мембраны как целостной структуры в сравнительно-эволюционных физиологических и биохимических исследованиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Исследования процессов и механизмов филогенеза относятся к числу фундаментальных. Значительный вклад в разработку данных проблем вносит эволюционная биохимия, задача которой - поиск закономерностей биохимической эволюции организмов. Работы по изучению состава мембраны, ее основных составляющих, белкового и липидного компонентов могут рассматриваться как новое направление в области физиологии и биохимии филогенеза, которое обогатит теоретическую науку. Полученные результаты углубляют наши представления о взаимосвязи, единстве и разнообразии химического строения хордовых животных, подтипа позвоночные, и могут служить основой дальнейшего совершенствования учения о биохимической эволюции.Материалы диссертации могут быть использованы при подготовке к лекционным курсам и практическим занятиям в университетах, в учебных пособиях, статьях, научных изданиях.

Реализация: результатов исследования:. Представленные в диссертации оригинальные материалы использованы в курсах лекций и практических занятиях по биохимии в Самарском государственном университете и по физиологии животных в Самарской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на: XIV и XV съездах Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Баку, 1983; Кишинев, 1987); V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986); областных научно-технических конференциях ( «Молодые ученые и специалисты - народному хозяйству», 1986; «Актуальные проблемы молодых ученых и специалистов области в организации научно-технического творчества молодежи»,1988; «Молодые ученые и специалисты -производству», 1990); научных конференциях преподавателей и сотрудников Самарского государственного университета (1985-1990) и Самарского государственного медицинского университета (1991-1998); итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Военно-медицинского факультета при Самарском медицинском институте им. Д.И. Ульянова (1992-1994), на расширенном заседании кафедры биохимии Самарского государственного университета (2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Декларация личного участия автора. Приобретение, сбор и отлов использованных в работе видов позвоночных животных осуществлялся автором самостоятельно или благодаря сотрудничеству со студентами и преподавателями Самарского государственного университета. Экспериментальные исследования проведены самостоятельно. Техническая помощь была оказана автору при выполнении аминокислотного анализа белков, сканировании и фотографировании гелей. В диссертации использованы работы, опубликованные в соавторстве. Доля личного участия автора в написании и подготовке публикаций составляет 50-90%.

Основные положения, вьшосамые ка защиту.

1 .Филогенетическая изменчивость белковэ-липидного состава мембран микросом печени, мозга и мышц у видов пяти основных классов позвоночных выявлена на всех уровнях организации мембраны и затрагивает аминокислотный состав и содержание периферических и интегральных белков, гетерогенность белковых спектров, показатели общих фосфолипидов и их индивидуальных фракций, холестерина, соотношений белкового и липидного компонентов.

2.Благодаря методам корреляционного анализа представлена детальная характеристика взаимодействий основных компонентов мембран микросом печени и мозга пойкилотермных и гомойотермных видов.

3.С помощью методов кластерного анализа получены пространственные модели видов, которые - при анализе объединенных показателей белков и липидов мембран микросом печени, мозга и мышц - в значительной степени совпадают с классическими, традиционными построениями, полученными на основании морфолого-анатомических признаков животных.

4.Различия белково-липидного состава мембран микросом печени, мозга

и мышц позвоночных свидетельствуют о более сложной организации мембран мозга в сравнении с мембранами других тканей.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, шести экспериментальных глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Её объем составляет 310 страниц, в том числе 180 страниц собственно текста, 33 таблицы, 38 рисунков, 39 приложений. Список литературы содержит 127 отечественных и 343 зарубежных источников.

1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРОЕНИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН. ИЗМЕНЧИВОСТЬ БЕЛКОВЫХ СТРУКТУР И СОСТАВА ЛИПИДОВ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ (Обзор литературы)

На основе изучения обширного литературного материала рассматриваются современные представления о строении и функционировании биологических мембран: их химический состав (Бергельсон, 1982;Сим, 1985 ¡Болдырев и др.,1990;Антонов и др.,1992;Неупе,1995), молекулярная организация и динамика бислоя

(Quinn,1981;Chapman,1982;Robinson et al., 1995; Mukheijee, Chattopadhyay, 199б),белок-липидные взаимодействия (Дергунов и др., 1984; Newton,1993; White,WimIey,1994; Pinder et al., 1995), использование детергентов для изучения строения и свойств биомембран (Helenius, Simons,1975; Waehneldt, 1975; Helenius et al., 1979; Tanford,1980). Обсуждается также вопрос об изменчивости белков - первичной структуры (Айала,1981, 1984, 1986;Perutz,1984; Ambler, Daniel, 1991), активности ферментов (Surholt, Newsholme, 1981 ;Огородникова, 1981, 1986; Межмерин, 1992), электрофоретической подвижности (Rourke, 1982; Patton, Avise, 1983; Macgregor et al., 1990) и состава липидов (Крепе, 1981; Шулындин,1983;Костецкий,Сергеюк,1985, 1986; Аврова,1982, 1984, 1986; Круглова, 1984-1986) в эволюции беспозвоночных и позвоночных. Выделены основные проблемы: изучение состава мембраны как целостной структуры, ее белкового и липидного компонентов в тканях позвоночных в соответствии с целью и задачами работы.

2. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на представителях пяти основных классов позвоночных (рыбы, земноводные, пресмыкающиеся, птицы и млекопитающие). В работе использовали ткани печени, головного мозга и - в отдельном фрагменте эксперимента - скелетных мышц 16 видов позвоночных. Объектами исследования служили следующие виды:

Рыбы - карп Cyprinus carpió, красноперка Scardinius erythrophthalmus, окунь Perca íluviatilis, судак обыкновенный Stizostedion lucioperca, щука Esox lucius;

Земноводные - жаба серая Bufo bufo, лягушка остромордая Rana terrestris;

Пресмыкающиеся - уж обыкновенный Natrix natrix, черепаха степная Testudo horsfieldi, ящерица зеленая Lacerta viridis;

Птицы - голубь сизый Columba livia , курица домашняя Gallus domesticus, утка домашняя Anas platyrhynchos;

Млекопитающие - бык Bos taurus, кошка домашняя Felis domestica, крыса Rattus norvegicus (var. albin).

Для работы отбирали половозрелых особей обоего пола. Сбор и отлов животных осуществляли согласно общепринятой методике. Рыб, земноводных, пресмыкающихся, птиц и крыс декапитировали. Кошек перед умерщвлением усыпляли эфиром. Ткани быка замораживали в жидком азоте сразу же после забоя животных на мясокомбинате и доставляли в лабораторию. Для исследования у животных брали печень, головной мозг и мышцы: у рыб -спинные, у птиц - грудные, у земноводных, пресмыкающихся и млекопитающих — мышцы конечностей.

Фракции микросом из печени и мозга выделяли по методу Де-Пьера и Далльнера (1979), из мышц - по методу Ритова и соавт. (Ритов и др., 1977). Исследование состава мембран сопровождалось энзиматическим и электронномикроскопическим контролем за чистотой фракций, выделенных из тканей некоторых видов позвоночных.

Для экстракции периферических белков осадок микросом суспендировали в 5-кратном объеме по отношению к массе взятой ткани 1 М раствора KCl, pH 9,0, и выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Суспензию центрифугировали при 70000g, 60 мин. Для экстракции интегральных белков полученный осадок аналогичным образом последовательно обрабатывали растворами детергентов: 1%-ным раствором тритона Х-100 в 0,06 М трис-НС1 буфере, pH 6,7, и 0,3%-ным раствором додецилсульфата натрия (ДДС) в 0,06 М трис-HCl буфере, pH 6,7 (Древаль и др., 1982;Серых и др.,1984; Макурина.Древаль, 1985).Содержание белка в экстрактах определяли по методу Лоури. В опытах по изучению соотношений мембранных компонентов осадок микросом суспендировали в 1 М растворе KCl, pH 9,0, суспензию центрифугировали при 70000 g , 1 ч. После удаления периферических белков исследовали химический состав фракции: содержание белка, общих липидов (Методы биохимических исследований. Липидный и энергетический обмен. М., 1982), фосфолипидов (Bartlett, 1959; Кейтс, 1975) и холестерина (Балаховский С.Д., Балаховский И. С., 1953).

Подготовку белков для аминокислотного анализа осуществляли по методу Бенсона и Патерсона (1974). Анализ проводили на аминокислотном анализаторе AAA 881 (Чехословакия). Электрофорез мембранных белков в ПААГ проводили по методу Laemmli (1970). Молекулярную массу периферических и интегральных белков определяли с помощью набора белков-маркеров с известными молекулярными массами (кДа): альбумин сывороточный (66,0), альбумин яичный (45,0), пепсин (34,7), трипсиноген (24,0) , лактальбумин (18,4), лизоцим (14,3) (Остерман, 1981).Сканирование гелей осуществляли на денситометре Transmittance Reflectance Scanning

Densitometer GS -300 (Hoefer Scientific Instruments, США).

Разделение фосфолипидов, плазмалогеннок и дкацильной форм фосфатидилхолина и фосфатидилзтаноламина проводили по методу Хоррокс и Сан (Horrocks, Sun, 1972) в модификации Кругловой (1982, 1985). Для идентификации фосфатидилхолина использовали яичный лецитин, остальные фосфолипиды выявляли с помощью специфических красителей (Кейтс, 1975).

Статистическая обработка цифровых данных проводилась с помощью программы Microsoft Excel 97 с использованием встроенного пакета стандартных показателей параметрической статистики.

3. ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЧИСТОТЫ ПРЕПАРАТОВ МИКРОСОМ

Приводятся данные об активности маркерных ферментов в осадках, полученных из гомогенатов тканей некоторых видов позвоночных (карпа, лягушки, курицы, крысы). Митохондрии отсутствуют в препаратах микросом печени и мозга, о чем можно судить по активности сукцинатдегидрогеназы. Активность кислой фосфатазы и каталазы низка, что указывает на незначительное загрязнение фракции лизосомами и пероксисомами. Трактовка результатов для активности щелочной фосфатазы может быть соотнесена не только с присутствием в препаратах микросом фрагментов плазматических мембран и аппарата Гольджи, но и с биосинтезом в эндоплазматическом ретикулуме щелочной фосфатазы, которая затем транспортируется через аппарат Гольджи к плазматическим мембранам (Tokumitsu, Fishman,1983).Bo фракции микросом саркоплазматического ретикулума лягушки не выявлена активность пероксисом, в небольшом количестве обнаруживается активность маркерных ферментов лизосом и митохондрий. Происхождение активности сукцинатдегидрогеназы можно объяснить, в частности, существованием внемитохондриального фермента, связанного с гранулярным эндоплазматическим ретикулумом (Cascarano et al., 1982).

Данные злектронномикроскопического контроля показали, что препараты везикул, выделенных из субклеточной фракции (4,2x10б g мин) гомогената печени, содержат мембраны гладкого и шероховатого зндоплазматического ретикулума, свободные рибосомы, гранулы гликогена, незамкнутые мембранные структуры, представляющие собой, по-видимому, обрывки плазматических мембран. Фрагменты митохондрий и лизосомы обнаруживались крайне редко. Субклеточная фракция гомогената мозга не содержит фрагментов митохондрий и представляет собой мембранные структуры, включающие элементы гладкой и гранулярной зндоплазматической сети, плазматических мембран, отдельные свободные рибосомы, мелкие синаптосомы, миелиноподобные структуры, отдельные злектронноплотные гранулы нейросекрета, единичные лизосомы. Препараты везикул (2,4x10б g мин), выделенные из субклеточной фракции гомогената скелетных мышц, не содержат фрагментов митохондрий, в них также нет лизосом. В целом энзиматический и злектронномикроскопический контроль свидетельствуют о

достаточно высокой степени чистоты препаратов макросом, изолированных из трех тканей позвоночных животных.

4. СОДЕРЖАНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ В МИКРОСОМАХ ПЕЧЕНИ И МОЗГА

Головной мозг и печень позвоночных существенно различаются по содержанию периферических и интегральных белков: в мембранах печени 44,569,5 и 30,5-55,5% соответственно, в мембранах мозга 18-26 и 74-82%. Соотношения тритон-растворимых и ДДС-растворимых белков (%) в мембранах печени 4,4:32 - 13:42,5, в мембранах мозга 40,4:37,4 - 49:25 (рис.1). Закономерность увеличения содержания периферических белков и соответственного при этом уменьшения интегральных в мембранах печени проявлена в ряду видов четырех классов, начиная с рыб. Однако у млекопитающих доля периферических белков вновь снижается, причем до уровня, меньшего, чем у рыб. Рыбы и земноводные практически не различаются между собой по содержанию ДДС-растворимых белков, увеличение доли периферических белков при этом происходит одновременно с уменьшением количества тритон-растворимых. У пресмыкающихся при продолжающейся тенденции к увеличению содержания периферических белков доля тритон-растворимых убывает всего лишь на 2% по сравнению с земноводными, в то время как ДДС-растворимых становится меньше в 2,8 раза. Закономерность дальнейшего увеличения содержания периферических белков сохраняется и у птиц, но при этом на 11% снижается доля тритон-растворимых белков и в 2,1 раза возрастает доля ДДС-растворимых. Другая ветвь развития -млекопитающие - демонстрирует иные мембранные параметры:

уменьшение содержания периферических белков до 44,5%, при этом наблюдаются наибольшие показатели как ДДС-растворимых, так и тритон-растворимых белков.

В мембранах мозга выявлена тенденция к постепенному снижению содержания периферических белков (с 22% у рыб до 18% у млекопитающих). Повышение уровня периферических белков отмечено только у пресмыкающихся. Доля тритон-растворимых белков в среднем у первых четырех классов примерно в 2 раза больше доли периферических, у млекопитающих это соотношение увеличивается до разницы в 2,7 раза. Меньше всего ДДС-растворимых белков в мембранах мозга пресмыкающихся (25% общего белка в сравнении, например, с 38% у птиц). Из представленных результатов следует, что, во-первых, для мембран мозга характерна большая плотность, ригидность, упорядоченность структуры, чем для мембран печени, во-вторых, по-видимому, для функционирования мозговых мембран очень важна фракция тритон-растворимых интегральных белков. Маловероятна при значительном содержании чисто балластная роль ДДС-растворимых белков, поэтому можно выдвинуть предположение о существенном вкладе группы белков, солюбилизируемых детергентом с выраженными денатурирующими

Печень

Мозг

34

32

21,1

42,5

12

47 12,5

53.5

4,4

63, 9,4

69,6 44,5

Рис. I. Диаграмма распределения периферических и интегральных белков в мембранах микросом печени и мозга позвоночных, (Данные приведены в процентах). Обозначения:

I | - периферические белки,

I | - интегральные тритон-растворимые и

интегральные ДДС-растворимые белки.

свойствами, возможно, в интирации, кооперации с тритон-растворимыми белками.Большая доля ДЦС-растворимых белков микросом мозга объясняется доминированием в нейрональных мембранах белков-рецепторов, ионных каналов и насосов. В ряду рассмотренных классов особое место отводится пресмыкающимся с их выделенными показателями содержания белков различных фракций.

5. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ МЕМБРАН МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ И МОЗГА

Выявлена определенная вариабельность содержания большей части аминокислот в периферических и интегральных белках мембран микросом

печени и мозга исследованных представителей, которую мы рассматриваем как видовые особенности животных. При этом сохраняется идентичность спектров распределения основных групп аминокислотных остатков (1 -основные аминокислоты, 2 -кислые, 3 -общие заряженные, 4- гидрофильные, 5 -гидрофобные, 6 - имеющие положительный а-спиральный потенциал, 7 отрицательный а-спиральный потенциал,8-положительный Р-структурный потенциал,9-отрицательный Р-структурный потенциал, 10-основные аминокислоты/кислые аминокислоты, 11-гидрофильные/гидрофобные, 12-поло-жительный/отрицательный а-спиральный потенциал, 13-положительный / отрицательный Р-структурный потенциал) (Волькенштейн,1975) во всех мембранных белках независимо от вида животного и типа ткани, что свидетельствует о равномерности распределения близких по своей природе аминокислот во фракциях мембранных белков печени и мозга позвоночных (рис.2).

Вариабельность серина характерна для всех мембранных белков мозга. Это может быть объяснено тем, что в нервной ткани широко распространена посттрансляционная система фосфорилирования ОН-групп серина функционально значимых белков, причем широкий спектр варьирования может быть объяснен как гетерогенностью фракции микросом (нейрон+глия), так и специализацией "индивидуальных" нейронов. Отмечено снижение содержания серина во всех фракциях мембранных белков мозга с усложнением нервной системы животных.

Аминокислотный анализ мембранных белков' печени и мозга изученных видов показал, что во всех случаях в ряду сходных аминокислот охраняются классические соотношения: глутаминовая кислота > аспарагиновой кислоты, серин > треонина, лейцин > изолейцина, фенилаланин > тирозина, лизин > аргинина.

6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ МЕМБРАН МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ И МОЗГА

Методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия во фракциях мембранных белков обнаружено от 15 до 34 полос с молекулярной массой от 12400 до 280000 Да. В большинстве случаев периферические белки обнаруживают самый насыщенный спектр полос. Белки со средней и высокой подвижностью играют ведущую роль в формировании структуры и осуществлении функциональных проявлений мембран микросом печени и мозга позвоночных. Значимость высокомолекулярных зон возрастает в группе интегральных белков печени, причем в тритон-растворимых белках они отличаются у экто- и эндотермных видов, а в ДЦС-растворимых -количественно выражены только у высших позвоночных. В мембранах мозга содержание высокомолекулярных фракций повышено в периферических белках, в интегральных тритон-растворимых высокомолекулярные белки значимы только у высших позвоночных. Определенные черты межвидового и

Печень

Мозг

Периферические белки

60 50 40 30 20 10 0

3 5

9 11 13

1 3

9 11 13

Интегральные тритон-растворимые белки

■я* ж»

1 3 5 7 9 11 13

1 3 5 7 9 11 13

-Карп

-Судак

-Лягушка

-Жаба

-Ящерица

-Уж

-Кура

-Бык

- Кошка

-Крыса

5

1

7

Интегральные ДДС-растворимые белки

Рис. 2. Характер распределения основных групп аминокислотных остатков в периферических и интегральных белках мембран микросом печени и мозга позвоночных.

межклассового сходства - белковых спектров высших позвоночных, обнаруженные в мембранах печени и мозга, во всех исследованных солюбилизатах, свидетельствуют о близких родственных отношениях между пресмыкающимися, птицами и млекопитающими.

Рис.3 .Денситограммы электрофореза в 10%-ном ПААГ интегральных ДЦС-растворимых белкоэ мембран микросом печени утки и кошки

7. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА МЕМБРАН МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ, МОЗГА И МЫШЦ ПОЗВОНОЧНЫХ

В среднем содержание фосфолипидов в мембранах тканей рыб, земноводных, пресмыкающихся, птиц и млекопитающих составляет соответственно: в микросомах печени 57, 65, 63, (4, 75%, в микросомах мозга 70,67,59, 64,64%, в микросомах мышц 63,59, 60,66, 60%.

В сравнительном аспекте наибольшее количество холестерина выявлено в мембранах мозга (в среднем 18-19% у всех классов позвоночных, за исключением пресмыкающихся), наименьшее - , в мембранах саркоплазматического ретикулума рыб, земноводных, птиц и млекопитающих

I

Утка

Кошка

(4-6%). Промежуточное положение занимают мембраны эндоплазматического ретикулума печени (у рыб и земноводных 7,5-8,2%, у млекопитающих 4,8%). В мембранах микросом мозга и скелетных мышц рептилий обнаружено повышенное по сравнению о представителями других классов позвоночных содержание холестерина (в среднем 26,5 и 13,4% соответственно).

Доля белкового и липидного компонентов в мембранах мозга примерно одинакова у всех исследованных представителей позвоночных, в то время как в мембранах микросом печени и мышц белковый компонент преобладает над липидным. В микросомах печени наименьшая величина отношения у рыб (0,55), у остальных, классов оно различается незначительно (0,69-0,74). В микросомах мышц обнаружена тенденция к возрастанию величины г липид/белок с усложнением организации позвоночных (с 0,63 у рыб до 1,08 у млекопитающих). Величина отношения фосфолипид/белок в мембранах мозга ..:' , снижается с 0,76 до 0,60 у пресмыкающихся и в дальнейшем, у представителей высших позвоночных практически не изменяется (0,63). В микросомах печени наименьшая величина отношения (0,35) выявлена у рыб, наибольшая (0,53) у 4 млекопитающих. В мембранах саркоплазматического ретикулума в ряду четырех классов намечается тенденция к увеличению значений показателя (0,4 у рыб и земноводных, 0,47 у пресмыкающихся и птиц и 0,63 у млекопитающих). В микросомах печени величина отношения холестерин/белок варьирует от 0,04 у млекопитающих до 0,08 у птиц, принимая промежуточные значения у видов других классов. В мембранах саркоплазматического ретикулума значения отношения 0,03-0,05, в мембранах мозга 0,18-0,20. Исключение составляют рептилии, в мозговых мембранах которых отношение холестерин/белок 0,27, в мембранах мышц 0,11.

Полученные результаты, по-видимому, определяются особенностями структурной организации мембран печени, мозга и мышц и некоторыми различиями их функций. Для мембран микросом печени и мышц характерны преобладание белкового компонента над липидным, близкие значения отношений липид/белок, фосфолипид/белок и низкое содержание холестерина. По-видимому, это показатели тканей с активно протекающими процессами метаболизма. В мембранах микросом мозга обнаружено примерно одинаковое содержание белков и липидов. Вместе с тем доля фосфолипидов, приходящихся на интегральные белки, оказывается больше, чем в тканях печени и мышц. Однако отмечаемое при этом и более высокое содержание холестерина дает основание предполагать более ригидный характер липидного бислоя микросом мозга по сравнению с микросомами печени и мышц.

& МЕМБРАННЫЕ ФОСФОЛИПИДЫ ПЕЧЕНИ И МОЗГА

Анализ содержания идентифицированных семейств фосфолипидов в печени и мозге позволил выявить ряд закономерностей. Везде количественно преобладают фосфатидилхо;.йн и фосфатидилэтаноламин (сумма диацильной и плазмалогенной форм) (табл.1). Как правило, доля фосфатидилхолина в микросомах мозга' меньше, чем в мембранной фракции печени. Подобная

картина наблюдается и в отношении фосфатидилинозита. Два других фосфолипида, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин, содержатся в мембранах микросом печени в меньших количествах, чем в мембранах мозга. Если у рыб доля сфингомиелина в мозге превышает таковую в печени в 1,5 раза, то у земноводных межтканевой разницы пог'ти нет, в то время как у высших позвоночных содержание сфингомиелина в .мозге больше, чем в печени в 1,7 и 2,1 раза.

Для фосфатидилхолина мембран печени и мозга отмечено снижение доли фосфолипида с усложнением организации позвоночных. Существенное увеличение количества сфингомиелина в мозговых мембранах (в 3 раза у птиц и в 4 раза у млекопитающих по сравнению с рыбами) связывают с усложнением строения нервной системы, головного мозга позвоночных, с процессами миелинизации (Крепе, 1981). Для фосфатидилсерина характерна тенденция к увеличению количества фосфолипида с повышением уровня организации изученных видов как в печени, так и в мозге, проявленная в большей степени в мозговых мембранах. Фосфатидилинозит также демонстрирует подобную тенденцию, более выраженную в мозге.

Диацильная форма фосфатидилхолина я1ляется доминирующей в мембранах микросом печени (76,6-94,5% всего фосфолипида), причем количество ее убывает в ряду позвоночных, и основной формой в исследованных мембранах мозга. На долю холин-члазмалогена в мембранной фракции печени приходится 5,5-23,4% общею фосфолипида, в мозге доля плазмалогена незначительна. Содержание холин-плазмалогена в микросомах печени у земноводных у меньшается по сравнению с рыбами, а затем вновь увеличивается у более высокоорганизованных представителей. Соотношение плазмалогенной и диацильной фракций фосфатидилэтаноламина в печени и мозге различно. В мембранах мозга превалирует этаноламин-плазмалоген: у рыб 48,0-74,7% общего фосфатидилэтаноламина, у остальных видов 53,6-60,4%. В печени высокое содержание плазмалогена обнаружено у рыб (49,5-77,2%), но уже у земноводных доля его существенно снижается и составляет у различных видов 13,4-40,0%. Количество плазмалогена во фракции микросом мозга земноводных убывает наполовину по сравнению с классом рыб, возрастает затем у птиц и млекопитающих, но не достигая при этом уровня рыб. В мембранах печени земноводных доля плазмалогенной формы фосфатидилэтаноламина уменьшается по сравнению с рыбами в 3 раза, а затем, увеличиваясь на 50-60%, остается почти без изменений у других классов. Содержание диацильной формы в печени птиц превышает ее долю у рыб и пресмыкающихся в 2 раза и имеет близкие показатели у земноводных и млекопитающих. По количеству диацильной формы мембранные фракции мозга земноводных и птиц различаются в 1,9 раза, ближе показатели рыб и млекопитающих (разница на 13,1%).

Таблица 1

Содержание фосфолипидов в мембранах микросом печени и мозга позвоночных (% от суммы фосфолипидов)

Печень

Вид ФХ ФЭА СФМ ФИ ФС

Карп 60.0 ,23.3 4.5 9.2 3.0

Судак 61.5 : 18.0 5.9 11.3 3.2

Лягушка 50.1 22.0 8.3 15.3 3.5

Жаба 54.0 23.0 4.8 12.2 6.1

Уж- 57.2 17.7 5.9 14.9 4.4

Курица 47.3 32.9 4.1 10.8 4.7

Утка 41.5 27.0 8.8 12.7 10.0

Бык 53.0 22.1 5.1 15.8 4.0

Кошка 38.9 127.3 9.5 14.6 9.6

Крыса 53.9 120.9 5.1 16.1 4.0

Мозг

Вид ФХ ФЭА СФМ ФИ ФС

Карп 57.0 31.0 2.2 2.2 5.3

Судак 47.6 38.0 4.5 4.5 5.5

Лягушка 56.0 19.4 6.1 6.1 9.7

Курица 31.0 35.8 10.6 10.6 14.6

Утка 33.6 31.5 10.9 10.9 13.1

Бык 36.4 20.2 22.0 22.0 11.4

Кошка 29.1 33.9 11.6 11.6 15.0

Крыса 46.1 27.1 7.9 7.9 12.4

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Внутриклеточные мембраны тканей позвоночных в ряду изученных зидов претерпевают определенные изменения с усложнением организации «ивотных, в ходе приобретения ими все более ;овершенных механизмов адаптации. Филогенетическая изменчивость хими^ского состава мембран имеет сложный характер и затрагивает аминокислотный состав, содержание и гетерогенность периферических и интегральных белков, количественные показатели липидов, фосфолипидов, холестерина и основных соотношений белкового и липидного компонентов. По ряду показателей (содержание белка, электрофоретические спектры белковых полос, доля холестерина, соотношение белкового и липидного компонентов) класс пресмыкающихся выделен как переходная группа животных от низкоорганизованных представителей к высокоорганизованным. Пространственные модели кластеризации видов, полученные на основе кластерного анализа, подтверждают это, а также позволяют провести классификацию видов в соответствии с их мембранными показателями. Наиболее успешными в этом отношении оказываются модели, построенные на основании данных об общем содержании фосфолипидов и холестерина, соотношений белкового и липидного компонентов, а также выведенные по совокупности показателей - объединенных данных по белкам и липидам. Полученная таким образом классификация в значительной степени совпадает с традиционными построениями на основе морфологоанатомических признаков животных. Иначе говоря, архитектура мембраны, комплекс ее основных компонентов, своего рода ее пространственный "синтез" в наибольшей степени несет на сеиг печать родственных связей вида и класса. Методы корреляционного анализа позволили детально обсудить особенности взаимодействия мембранных компонентов г: выявить интересные закономерности. В частности, используемый метод позволяет приблизиться к пониманию роли обеих форм фосфатидилхольна1 в мембранах печени животных. Структурно-функциональные параметры мембран гомойотермных представителей по сравнению с лойкилотермными видами характеризуются более широким включением мембранных компонентов в тесные, устойчивые корреляционные связи, что делает мембрану теплокровного животного более динамичной и , возможно, более устойчивой и жизнеспособной в меняющихся условиях внешней и внутренней среды.

Важным моментом нашей работы являлось выяснение различий химического состава мембран мнкросом печени, мозга и мышц для обоснования их функциональных различий. Показатели содержания периферических и интегральных белков, холестерина, индивидуальных фосфолипидов, соотношений липидного и белкового компонентов свидетельствуют о более плотной организации мембраны мозга по сравнению с мембранами печени и мышц.

Полученный экспериментальный материал может служить определенным вкладом в разработку проблем филогенеза позвоночных, поскольку позволяет выдвинуть представление о возможности использования данных о химическом

составе мембран в вопросах классификации видов, для выяснения родственных

связей между различными животными.

ВЫВОДЫ

1. Головной мозг и печень позвоночных существенно различаются по содержанию периферических и интегральных белков: в мембранах печени 44,5-69,5 и 30,5-55,5%, в мембранах микросом мозга 18,0-26,0 и 74,0-82,0%.

2. В ряду позвоночных в мембранах печени изученных видов увеличивается содержание периферических белков и уменьшается количество интегральных. Исключением являются млекопитающие, в мембранах которых выявлено по сравнению с другими классами наименьшее количество периферических белков и наибольшее - обеих фракций интегральных. В мембранах мозга с усложнением строения нервной системы животных снижается содержание периферических белков и увеличивается количество интегральных.

3. Обнаружена вариабельность содержания большей части аминокислотных остатков - пяти общих для всех белков печени (метионин, лейцин, гистидин, лизин, аргинин) и такого же числа для белков мозга (аланин, валин, метионин, гистидин, серив). В белках мембран микросом мозга отмечена вариабельность серина, содержание которого снижается в ряду позвоночных с усложнением нервной системы животных. Для аминокислотного состава мембран печени и мозга сохраняются классические соотношения: глутаминовая кислота > аспарапшовой кислоты, серин > треонина, лейцин > изолейцина, фенилаланин > тирозина, лизин > аргинина.

4. Методом электрофореза в ПААГ с ДДС определена молекулярная масса мембранных белков 12400-280000 Да. На электрофореграммах выявлено от 15 до 34 полос. В большинстве случаев периферические белки обнаруживают самый насыщенный спектр полос. Эта закономерность соблюдается в мембранах мозга изученных видов от низкоорганизованных до высших классов.

5. Белки со средней и высокой подвижностью играют ведущую роль в формировании структуры мембран микросом печени и мозга позвоночных. Выраженность высокомолекулярных зон возрастает в группе интегральных белков печени: в тритон-растворимых белках они отличаются у экто- и эндотермных видов, в ДДС-растворимых -количественно выражены только у высших позвоночных. В мембранах' мозга содержание высокомолекулярных зон повышено в периферических белках, в интегральных тритон-растворимых - высокомолекулярные белки выделены количественно только у высших позвоночных.

6. У изученных видов животных фосфолипиды составляют 50-80% общих липидов в мембранах микросом печени, головного мозга и скелетных мышц.

7. В сравнительном аспекте количество холестерина в микросомах тканей

образует ряд: мозг»печень>мышцы. В мембранах микросом мозга и скелетных мышц рептилий обнаружено повышенное по сравнению с представителями других классов позвоночных содержание холестерина.

8. Доля белкового и липидного компонентов в мозговых мембранах примерно одинакова у всех исследованных представителей позвоночных животных; белковый компонент преобладает над липидным в мембранах микросом печени и мышц. В мембранах мозга величина отношения фосфолипид/белок уменьшается, а в мембранах печени возрастает с усложнением организации позвоночных.

9. Обнаружены межтканевые различия и филогенетическая изменчивость содержания основных семейств фосфолипидов. На всех уровнях развития позвоночных ФХ и ФЭА встречаются в двух формах -плазмалогенной и диацильной. Диацильная форма ФХ является доминирующей в мембранах микросом печени и основной формой в мембранах мозга. Количество диацильной формы ФХ убывает в ряду позвоночных. Соотношение плазмалогенной и диацильной форм ФЭА в печени и мозге различно: в мембранах мозга превалирует ФЭА-плазмалоген; в мембранах печени доля плазмалогена велика у рыб, начиная с класса земноводных она существенно снижается.

10.По ряду мембранных показателей (содержание белка, электрофоретические спектры белковых полос, доля холестерина, соотношение белкового и липидного компонентов) пресмыкающиеся выделены как переходная группа от низкоорганизованных к высокоорганизованным классам позвоночных.

11 .В соответствии с данными о химическом составе мембраны мозга имеют более сложную организацию по сравнению с мембранами печени и мышц.

12.С помощью методов корреляционного анализа представлена детальная характеристика взаимоотношений мембранных компонентов. Благодаря методам кластерного анализа получены пространственные модели, которые при использовании объединенных показателе!, для белков и липидов в наибольшей степени соответствуют естественно! классификации животных, делению их на классы.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Серых М.М., Древаль В.И., Макурина О.Н., Медведева Т.Н. Возрастные изменения цитоплазматических, микросомальных и негистоновых белков печени кур //Материалы XIV съезда Всесоюзного физиологического общества им. И. П. Павлова. Баку, 1983. Т. 2. С. 289-290.

2. Серых М.М., Медведева Т.Н., Макурина О.Н.,Коровина O.E., Рокицкая Н. В. Исследование белкового и липидного компонентов микросомальных мембран у некоторых представителей позвоночных животных //Материалы V Всесоюзного биохимического съезда. Киев, 1986. Т. 3. С- 178.

3. Медведева Т.Н., Серых М.М. Исследование белкового и липидного компонентов микросомальных мембран различных тканей //Закономерности индивидуального развития животных. Куйбышев, 1985.С. 53-59.

4. Медведева Т.Н. Состав "тонких" мембран саркоплазматического ретикулума у низших и высших позвоночных //Молодые ученые и специалисты -народному хозяйству: Материалы областной научно-техн. конф. Куйбышев, 1986. С. 59.

5. Медведева Т.Н., Жукова O.E. Филогенетическая изменчивость белок-липидных комплексов микросомальных мембран печени и мозга //Молодые ученые и специалисты - народному хозяйству: Материалы областной научно-техн. конф. Куйбышев, 1986. С. 58-60.

6. Серых М.М., Медведева Т.Н., Макурина О.Н., Рокицкая Н.В. Структурные и функциональные особенности микросомальных мембран тканей позвоночных животных //Материалы XV съезда Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова. Кишинев, 1987. Т. 2. С. 547.

7. Медведева Т.Н., Серых М.М. Содержание периферических и интегральных белков в мембранах микросом печени и мозга пресмыкающихся и млекопитающих //Сравнительная биохимия позвоночных. Куйбышев, 1987. С. 10-15.

8. Медведева Т.Н. Содержание фосфолипидов и холестерина в микросомальных мембранах тканей позвоночных животных //Сравнительная биохимия позвоночных. Куйбьшев, 1987. С. 16-24.

9. Медведева Т.Н. Фосфолипидный состав микросом печени рыб, земноводных и пресмыкающихся //Актуальные проблемы молодых ученых и специалистов области в организации научно-технического творчества молодежи: Материалы областной научно-технической конф. Куйбышев, 1988.С. 58.

10. Медведева Т.Н., Авдошина Н.В. Белки микросом печени земноводных, пресмыкающихся и млекопитающих //Актуальные проблемы молодых ученых и специалистов области в организации научно-технического творчества молодежи: Материалы областной научно-техн.конф. Куйбышев, 1988.С.59.

11. Жукова O.E. .Медведева Т.Н. Сравнительная характеристика состава мембран микросом тканей позвоночных животных //Молодые ученые и специалисты - производству //Материалы областной научно-техн. конф. Куйбышев, 1990.С.68.

12. Медведева Т.Н. Аминокислотный состав периферических и интегральных белков мембран микросом мозга крысы. Самара, 1991. Деп. в ВИНИТИ 11.07.91 .№ 2959-В91.7 с.

13. Медведева Т.Н. Белки микросом печени млекопитающих //Материалы XXV итоговой научн.конф. проф.-препод. состава Военно-медиц. факультета при Самарском медицинском институте им.Д.И.Ульянова. Вып.ХХ.Самара, 1992.С. 272.

Н.Медведева Т.Н. Сравнительное исследование состава мембран микросом печени, мозга и скелетных мышц позвоночных //Журн. эвол.биохим. и физиол., 1991 .Т.27.№6.С.694-700.

15. Медведева Т.Н. Изменчивость мембраносвязанных белков печени позвоночных //Материалы XXIV итоговой научн.конф. проф.-препод.состава

Военно-медиц. факультета при Самарском медицинском институте им.Д.И.Ульянова. Вып.ХХ1.Самара, 1993.С. 104-105,

6. Медведева Т.Н.Сравнителыюе исследование содержания периферических и интегральных белков в мембранах микросом печени позвоночных //Журн.эвол.биохим. и физиол., 1993.Т.29. № З.С.244-249.

7. Медведева Т.Н. Мембраносвязанные белки микросом мозга земноводных и млекопитающих //Материалы XXVII итоговой научн. конф. проф.-препод.состава Военно-медиц. факультета при Самарском государственном медицинском университете.Вып.ХХП.Самара, 1994. С.228-229.

.8. Медведева Т.Н. Аминокислотный состав белков мембран микросом печени позвоночных. Самара, 1994.Деп. в ВИНИТИ 22.08.94. № 2101-В94.21 с.

. 9. Медведева Т.Н. Белки микросом мозга холоднокровных и теплокровных животных //Материалы XXIII итоговой научн.конф. проф.-препод, состава Военно-медиц. факультета при Самарском государственном медицинском университете. Вып.ХХШ. Самара, 1995.С.245-246.

!0. Медведева Т.Н. Характеристика аминокислотного 'состава белков мембран микросом мозга позвоночных. Самара, 1995.Де1. в ВИНИТИ 25.10.95.№ 2847-В95.21 с.

Список принятых сокращений:

ДЦС - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

СФМ - сфингомиелин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ФИ - фосфатидилинозит

ФС - фосфатидилсерин

ЛР№ 0203316 от 14.12.1996 Подписано в печать 10.05.2000 г. Форм, лист 60x84/16. Бумага офсетная Печать оперативная Заказ № 400 Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз.

Изд-во "Самарский университет" 443011, г.Самара, ул.ак.Павлова,1 УОП СамГУ ПЛД № 67-43 от 19.02.1998 г.