Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перекисное окисление липидов и состояние мембран эритроцитов и микросом при многократном длительном действии факторов гипербарической гелиокислородной среды

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Перекисное окисление липидов и состояние мембран эритроцитов и микросом при многократном длительном действии факторов гипербарической гелиокислородной среды"

Министерство науки, высшей школы и технической политики Российской Федерации РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ Специализированный совет К 063.62.09 по биологическим наукам

На правах рукописи

САПОЖНИКОВ Валерий Маркович

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПВДОВ И СОСТОЯНИЕ ВДЖРАН ЭРИТРОЦИТОВ И МИКРОСШ ПРИ МНОГОКРАТНОМ даТЕЛЬНОМ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ ГИПЕРБАРИЧЕСКОЙ ГЕЛИОКИОЛОРОДНЮЙ СРЕДЫ

(03.00.04 - Биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой стэпени кандидата биологических наук

Роотов-на-Дону 1992

Работа йшолнена в НИИ БиологшГ Ростовского госунивврситета

Натчдае руководители: доктор биологических наук, профессор А.А.Кримевокая (г. Ростов-на-Дону), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н.П.Милютина (г. Ростов-на-Дону) ^шальные оппоненты: член-хорр. ASI Pí доктор биологических ниук, прсфессо'р Э.Б. Эмнрбеков

/г. Махьчкьла, ДГУ/ доктор ыеднцинсккх наук, профессор Л.Г.Медведев /Сшкт-Цетер-

г

бург, Военно-Меднццнская Академия С.М.Карова.

Ведущая организация: Физиологичаский НИИ нм. А.А.Ухтомского, Санкт-Петерйург

г

Защита состоится1892 г. на заседании специализированного совета К 063.62.09 в Ростовском государственном мшшрситеяв^ 344006, г,-Ростов-на-Дону, ул. Энгельса ДОЕ^^д^^Тш. (30

О диссертацией, 1&жно ознакомиться в библиотеке РТУ Автореферат разослан " ^ЛЛ^О Ж^ 1992 Г.

Ученый секретарь

специализированного совета (

доктор биологических наук _ . /Гг7 _(Кирой В.Н.)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы: В настоящее время в практике подводных работ все шире применяется техника насыщенных (сатурацион-ных) погружений в искусственных газовых средах, содержащих в качестве компонентов инертные газы. Применение таких смесей позволяет акванавтам длительное время находиться на глубине под давлениями до 6,7 МПа (Беннетт, 1988). Компонентом подобных газовых смесей часто является гелий. Смесь гелия с килородом, применяемая для дыхания в ходе длительных глубоководных погружений, носит название гелиокса.

Однако длительное пребывание акванавтов на глубкне в обитаемых гипербарических комплексах в гелиокислородной среде под давлением связано с опасностью неблагоприятного действия комплекса стрессорных факторов, (Зальцман и др., 1979), вызывавших в организме обратимые и необратимые изменения. Возможно, эти сдвиги лежат в основе этиопатогенеза профессиональных заболеваний водолазов.

Необходимость изучения уровня ПОЛ и структурных свойств мембран эритроцитов и микросом при гипербарии объясняется важнейшей ролью процессов ПОЛ в развитии стресс-реакции (Меерсон, 1984; Барабой, 1989) и регуляции структурного состояния биомембран (Владимиров, 1987). Эта информация позволит судить об особенностях адаптаптвционно-приспособительнчх реакций при действии многократной гипербарии. Кроме того, для понимания влияния гипербарической газовой среды на организм существенным является изучение активности микросомальной монооксигеназной системы, выполняющей детоксикационную и пластическую функцию в клетке.

Полагают, что вакнэйяей точкой прилокания гипербарической газовой среды являются биологические, мембраны, через которые реализуется микрос^руктурннй аффект .компрессионного и ' анестетического действия- индифферентных газов (Беннетт, 1988; Miller, 1981). В то же время, согласно концепции Е.М. Kpenca (1981), биологические мембраны являются главной мишенью адаптации организма . Значит, исследование механизмов действия факторов гипербарической среда на организм долкно быть, прежде всего, направлено на выявление изменений в свойствах субклеточных и клеточных мембран.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось выяснение роли процессов ПОЛ и изменений структурно-функционального состояния мембран эритроцитов и микросом различных тканей мышей в ответной реакции на многократное длительное действие гипербарической ге-лиокислородной среды (3,6 МПа, 6 суток; 1,3.5-кратное действие) и в период последействия (через 2 месяца После гипербарии).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование интенсивности ПОЛ в плазме крови, мембранах . эритроцитов и микросом мозга, легких, печени и почек.

2. Определение активности антиоксидантнах ферментов - СОД и каталазы в эритроцитах.

3. Определение стабильности мембран эритроцитов по уровню суммарной п-эроксвдэзной активности и активности СОД в плазме крови.

4. Изучение структурных свойств 'рмОран эритроцитов и микросом различных тканей: определение относительно.! микровязкости лишщного бислоя, зон белок- липидных контактов и степени погружения белков в липидный бислой.

Б. Определение гидроксшшрувдей активности микросомной мо-нооксигеназы - цитохрома Р-450 - с двумя субстратами (анилином и амидопирином) в мозгу, легких, печени и почках.

Научная новизна. В данной работе впервые была исследована динамика структурно-функционального состояния эритроцитарных и микросомальных мембран при многократном действии гиперОарической дыхательной смеси. Было выявлено изменение активности цитохрома р-450 - ключевого звена монооксигеназной системы (МОС)" микросом в гипербарических условиях. На основании полученных нами результатов и анализа дйннйх литературы была предпринята попытка обобщить имеющиеся.материалы и рассмотреть возможные механизмы воздействия гипербарического гелиокса на эритроцитарные и микросо-мальные мембраны.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в результате работы данные предсталяют интерес с точки зрения поиска механизмов воздействия на клеточнные и субклеточны в мембраны гиперОарической гешйсодвржщвй дыхательной смеси. Заслуживает внимания интерпретация изменений, наблюдаемых в мембранах эритроцитов и микросом в течение пятикратного дли-

- Б - '

тельного гипербарического воздействия как одного из проявлений развития приспособительных реакций к действию гипербарии на тканевом и организменном уровне. В работе высказывается предположение о возможном влиянии изменений в мембранах, микросом мозга под действием гипербарии на развитие нервного синдрома высоких давлений (НСВД).

Практическая значимость данной работы определяется возможностью на основе полученной информации корректировать с помощью мембранопротекторов антиоксидантной природы состояние липидной фазы мембранных структур клеток, от которой зависит их функциональная активность . Кроме того, информация о состоякии эритро-цитарных и микросомальных мембран в последействии позволит в дальнейшем подбирать оптимальные режимы рабоуы водолазов- глубоководников..

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 6-й Ростовской научно-практической школе-семинаре (Ростов-на-Дону, 1990), Всесоюзном симопзиуме "Механизмы зимней спячки" (Махачкала, 1990), конференциях молодых ученых Ростовского университета (Ростов-на-Дону, 1989, 1992) и на заседании Ростовского отделения Всероссийского биохимического общества (Ростов-на-Дону, 1992).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 8 работ, 2 находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация выполнена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав,'выводов и списка литературы, 'Включающего. 204 отечественных и-зарубежных источника. Работа иллюстрирована 21 рисунком, 26 таблицами и I фэтографиай.-

Материалы и методы исследования • Материалом .служили самцы белых беспородных мышей массой 23-35 г, содержавшиеся в условиях вивария.

Постановка эксперимента осуществлялась о помощью гипербарической установки, снабженной' системами жизнеобеспечения и контроля за животными. Животные находились в барокамере в гелиокио-лородной среде под давлением 3,6 МПа, при ьормоксии, оптимальной температуре и влажности (условия для нормальной жизнедеятельв.-сти организма мышей при данном давлении). Животных делили на две группы (I и II). Первую группу (опыт) подвергали воздействию ги-пербаричеокого гелиокса, а вторую (камерный контроль) помещали в

такую же установку, заполненную воздухом при нормобарии (нормальном давлении) на такой же срок (6 сут). Контрольных животных (контроль) содержали в'условиях вивария. Равные по длительности гипербарические воздействия (по 6 сут) повторяли 5 раз с перерывами мезду ними (по б сут), в течение которых животные находились в виварии. После завершения I, III и V/гипербарических воздействий часть мышей декапитировали. Одновременно забивали контрольных животных. Мышей, оставшихся после пяти гипербарических воздействий, содержали в вивари,! еще в течение 2 мес. для исследования отдаленных последствий многократного действия гшерба-ркческого гедиокса.

После забоя у животных собирали кровь и извлекали мозг, легкие, печень и почки. Ткани гомогенизировали, выделяли микро-сомальную фракцию (Карузина, Арчаков, 1977). Кровь центрифугировали, плазму отделяли от эритроцитов. В плазме крови и эритроцитах определяли активность СОД (Fried,1975) и каталазы (Luck, 1963) . Центрифугированием выделяли мембраны эри.роцитов (Кол-чшская и др., 1976) и микросом (Карузина, Арчаков, 1977), из них экстрагировали липида (Bligh, Dyer, 1959). В хлороформных липидных экстрактах определяли уровень продуктов ПОЛ - ДК -диеновых коныогатов (Владимиров, Арчаков, 1972) и ШО - шиффовых оснований (Bldlack, Tappel, 1973). Содержание ДК и ШО рассчитывали в отношении к содержанию-общих липидов (Колб, Камышников, 1982).

Методом флуоресцентных зондов на . спектрофлуориметре "Hitachi 650-60" определяли относительную микровязкость эритро-цитарных и микросомальных мембран, микровязкость зон белок-липидного контакта и погруженность белков в липидный Оислой (Добрецов, Владимиров, 1980). Микровязкость липидного Сислоя мембран оценивалй По коэффициенту эксимеризации пирена РЛ(334), равного отношению интенсивности флуоресценции его эксимеров и мономеров при длине волны возбуждающего света (Квоз0) 334 нм. Микровязкость зон белок-липидного контакта оценивали по коэффициенту Pg/T-M(286) при A.0OSÖ=286 нм. Параметры РЭЛН(334> и Fg/Fsi(286) находятся в обратной зависимости от величины микровязкости, так как в вязкой среде эксимеризация пирена снижается. Степень погружения белкового компонента в липидный матрикс мембран определяли по тушению флуоресценции белков пиреном (АР), происходящему вследствие безызлучательного переноса энергии с триптофанилои- мембранных белков на пирен при

\доаа=2Вв нм.Для определения двух первых показателей пробы выравнивали по содержанию фосфолипидов (Кушманова, Ивченко, 1983), последнего - по содержонию белка (Shacterle, Pollack, 1973).

В микросомах определяли деметилазную (Nash, 1953) и гидрок-силазнуи (Орехович, 1977) активность цитохрома Р-4БО. Данные обрабатывались статистически с применением критерия Стьюдента (Владимирский, 1983). Резко выделяющиеся показатели отбрасывались с помощью критерия Шовене (Кокунин, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Состояние дедбран эритроцитов и плазм, крови при лногократ-нол действии ГБГ. После однократного действия ГБГ а®лйзме и МЭ резко возрастает содержание ДК и ШО. В частности, в МЭ уровень НЮ повышается на 450%. Одновременно с этим в ¿эритроцитах наблюдается снижение активности СОД на 44%. Очевидно, снижение активности СОД - ключевого фермента антиоксидантной защиты (АОЗ) -обусловливает интенсификацию ПОЛ в ЫЭ.

Не скомпенсированное усиление процессов пероксидяции, . по-видимому, указывает на истощение адаптационных, возможностей организма и переход начальной адаптивной стресс-реакции в патологическую. Причин усиления ПОЛ при действии ГБГ может быть несколько: повышенная продукция и выброс в кровь отрессоршх гормонов - катехоламинов и глюкокортикоидов "(Зальцман и др., 1979; Manalaysay et al., 1983), являющихся активными, стимуляторами ПОЛ. (Меерсон, 1984); гипоксемия, развивающаяся в гштерЗариче-ских условиях и связанная с диффузионными и респираторными нарушениями "(Гуляр, 1988); инактивация СОД в эритроцитах и т.д.

Следствием усиления ПОД в МЭ после однократного действия ГБГ является роот относительной микровязкости на 27% и высокое содержание холестерина в МЗ. Известно, .что,.увеличение микровязкости эритроцитаршх мембран изменяет их вязкоэластические свойства, т.е., способность к обратимой деформации, что сопровоада-ется нарастанием ригидности клетки, это приводит к усилению вну-трикапиллярного гемолиза.

• Одновременно в плазме наблюдвется рост активности СОД и СПА. Однако СОД в норме имеет исключительно внутриэритроцнтарйую локализацию, а основной вклад в СПА плазмы вносит внеэрнтроци-тарный гемоглобин (Дудкин, 1983). Следовательно, возрастание"в плазме активности СОД и СПА говорит о нарушении стабильности эритроцитарных мембран и выходе СОД в плазму.

100*

141

ДК

и

17

24

Ю

45

13 3

13 5

?а/?м(334) Рэ/Рм(28б)

100%

67

90

13 3

11

г

181

ДК 134

□

пю

1 з

64

12

АР

I 1 з Холестерин

97 □

13 3

27'

1 з

Т] 18

Плазма 1

и

23

45

Мембраны эритроцитов

СОД

Каталаза

54

37

13 3

3 5

шт

16 17

Плазма

СОД

267

О

СЕМ

93

44

МЭ

1, 3,-в - сеансы ГБГ ДК - диеновые конъюгата ШО - шиффовы основания МЭ - мембраны эритроцитов СОД - супероксиддисмутаза СПА - суммарная пероксидазная активность • - достоверные различия относительно контроля

Рв/Р„(334) - шзф&щиент эксимеризации

м щрена при \=334 нм

Р„/Р,.(334) - коэффициент экгашеризации

пирена при \=334 нм АР - тушение флуоресценции белка пиреном

? ■

Рис. I. Интенсивность ПОЛ, активность антиокислительных ферментов в кровй И структурные свойства мембран эритроцитов мышей при многократном действии 3,6 Ша гшербаричебкоГО ' гелиокеа. (в % к контролю).

*

После 3-кратного действия ГБГ в эритроцитах -наблюдайся возрастшше активности СОД до контрольного уровня. Параллельно росту активности СОД снижается интенсивность ПОЛ в !4Э. Относительная микровязкость липидного бнслоя после III гипербарического воздействия остается повшшной. Одновременно наблюдается снижение глкровязкости зон белок-лшшдного контакта на 67Ж и погруженности белков в липидный Сиовой на 45Ж.

После Б-кратного воздействия ГБГ активность СОД в эритроцитах превышает контроль на 6496, в уровень ДК и ШО в МЭ и плазма крови достигает контрольного уровня. Параметры структурного состояния МЭ нормализуются, однако микровязкость ¡зон белок-липидного контакта на 90% ниже контроля.

Таким образом, ингибированиэ СОД в эритроцитах вызывает усиление ПОЛ и свидетельствует о недостаточности антиоксидантной защиты при однократном действии ГБГ. После 3- кратцрго действия ГБГ происходит нормализация активности СОД, в к концу пятого воздействия на 6395 возрастает активность СОД, что сопровог^аэт-ся выраженным снижением интенсивности ПОЛ. При ртом на протяжении многократного дейотвия ГБГ активность каталазы измэняатоя незначительно. Положительная динамика активности СОД по море увеличения количества гшербарических воздействий говорит о стимуляции антиоксидантной системы и развитии компенсаторно- приспособительных реакций.

В период последействия (через 2 месяца паада. окончания ги-пебарического эксперимента) вновь наблидаэтся интенсификация ПОД в плазме крови. Уровень ДК на Б4Ж превышает контроль, в то время как содержание ШО остается а пределах норды. Активйость СОД возрастает на 150?'при тенде^щии к сникешга активности каталазы. Это модат создатьзначительный дисбаланс р работе сопряженных внтйоксидантных ферментов и способствовать накоплению Hgp^. -Последняя, взаимодействуя с ионами аелеза,,чэроз посредство двух-стадийной реакции Габзра-Ввйса поровдает тадроксапь«ые радикалы, которые активируют ПОЛ.

Итак, однократное действие ГБГ обусловливает интенсификацию ПОЛ в МЭ, которая вызывает изменение структурного состояния-эритроцитаршх мэмбран. Однако после V гицэрбарического воздействия . отмечается стабилизация всех иопладованних параметров структурно- функционального состояния МЭ ва исключением микро-вязкостр зон белок-липидного контакта, которая остается онияен-

- ICL,-

ной. У мышей,.находившихся в барокамере при нормобарии, изменения уровня продуктов ПОЛ в плазме и МЭ и изменения структурных параметров МЭ имеют ту же направленность, что и у животных, подвергнутых многократному длительному действию ГБГ, но они значительно менее выражены и нормализуются, как правило, после трехкратного длительного пребывания в замкнутом,- объеме.

Состояние лелбран ликросол лшей при лногократнол действии ГБГ и в поолвдейстоии. Наиболее значительное усиление процессов ПОЛ в микросомах наблюдается прл однократном действии ГБГ. Уровень ДК в микросомах мозга, легких, печени и почек превышает контроль соответственно на 131%; 66%; 142? и-264%, а уровень ШО - на 80%; 152%; 159% и 107%. После III гипербарического воздействия наблюдается заметное снижение инициации ПОЛ, выраженное в падении урояня ДК по сравнению с I воздействием ГБГ. К окончанию V гипербарического воздействия уровень ДК в мембранах микросом мозга, легких и печени достигает контрольного уровня, оставаясь повышенным лишь в микросомах почек на 54%. Уровень ШО в микросомах всех тканей после V воздействия ГБГ остается выше контроля. Спустя 2 месяца после V сеанса ГБГ наблюдается вторичный всплеск инициации ПОЛ в мембранах микросом легких, печени и почек.

Вместе с тем, важнейшей особенностью динамики ПОЛ при многократном действии ГБГ является прогрессивное снижение интенсивности ПОЛ в мембранах микросом по мере увеличения количества гипербарических воздействий. Можно предположить, что постепенное снижение скорости процессов свободнорадикального окисления (СРО) липидов при многократном действии ГБГ свидетельствует о повышении резистентности организма к стрессорным факторам гипербарии и активации компенсаторных процессоз. Полученные нами результаты согласуются с литбраФурными данными, которые показывают, что при многократном участии акванавтов в насыщенных погружениях наблюдается постепенное угасание сгресс-реакции, устраняется чрезмерный катабрлический эффект стресса <=и сопутствувдиэ ему повреждения (Гуляр, 1988; Гуляр, Ильин, 1990).

После однократного действия ГБГ возрастает относительная микровязкость мембран микросом легких, печени и почек. Это согласуется с данными об интенсификации ПОЛ после однократного действия ГБГ в микросомальных мембранах этих тканей. В ходе последующих 'гипербарических воздействий относительная микровязкость микросомальных мембран достигает контрольного уровня.

■ Мозг дк то

80,

87

72

40

48

1'3

Ю

1Ь_

п

1 3 в п

22

Печень ДК СЮ

159

142

62

34

1 з

35

44

66

1 3 8 П

око Легкие ДК 250 211 ШО ~ 152 192

104

56

9

68

1 Э В П 1 3 S п

Почки

264

да

198

т

70

64

107

72

78

б4

1 3 В П

1 3 в п

Рис. 2. Содержание продуктов ПОЛ в мембранах микросом тканей майей при многократном действии 3,6 №а гипербаричеокбГо гелиокса (в Ж к контролю)-. 1.з,в, - сеансы ГВГ; п-последействив; * - достоверные различия отйосительно контроля; М - диеновые' кснъюгаты; ШО - шийовы осноаания.

Мозг

Ра/?м(334) Рэ/Гн(286) 33

> Легкие Рэ/Гм(334) 4т5Д Гэ/Гй(286)

1Т

9 е 3, I

Еч?

3 „ п

30

АР

13 3

40 V

1 3 в п

Печень

• 32

— 30

л *

Л1

1 3 в п

3131

Рё/Рц(334) РЕ/Ря(28б) 61

96

12

13В

П.

1 эйп

34 ДР28 Холестерин

тз

25

и

т<Я

ЗВ.П 1

* ••

3 в п

31

Ру?й(334)

1 3 в п

Пеней 53

«0 ' .»

1 3 В II

Р-^/Рв(286)

з а

29

Холестерин

25

I] 21

и

47

23.

-1=а

1 3

'27

в п

43

Рио. 3. Структурное состояние мембран микросом мышей при многократном длительном действии 3,6 Ша тгероарического гелиокса (в % к контролю)

1.з,в. - сеансы ГБГ; п-даследействие; * - достоверные различия относительно контроля; 334) и Г3/?м(286)- коэффициент эк-

■симеризации пирена при Х=334 нм и *.=286 нм; АР - тушение флуоресценции белка пиреном.

Через 2 месяца последействия относительная микровязкость не от . лячается от контроля в микросомальных мембранах 'легких, печени и почек, в микросомах мозга она на 335S ниже контроля. Другой ваяний показатель структурного состояния микросомальных мембран -шжровязкость збй белок-липвдного контакта - после III 'гипербарического воздействия снижается в мембранах микросом мовга, легких, печени и почек соответственно, на 1835, 47$, 96% и БЗЖ. После 5-кратного действия ГБГ этот параметр остается сниженным в мембранах микросом легких и печени. Через 2 месяца последействия в микросомах всех тканей микровязкость зон белок-лшшдного контакта нормализуется.

Активность цитохрома Р-4БО в ходе многократного действия ГБГ претерпевает значительные изменения. Деметилазная активность цитохрома Р-450 (ДМА) при однократном действии ГБГ снижается в микросомах мозга, легких, печени и почек соответственно, на 4556, Б63», 28% и 55%. Парагидроксилазная активность (ПГА) в микросомах мозга, печени и почек возрастает соответственно на 6956, 64« и. 4593. ЭТч направленность изменений ДМА в целом сохраняется и при последующих воздействиях ГБГ, однако ПГА в микросомах мозга и печени опускается ниже контроля. В микросомах печени ПГА ниже контроля и в последействии.

Цитохром Р-450 связан с гидрофобной частью мембраны (Кару-зина, Арчаков, 1988), кроме того, его активность зависит от минровязкости участков лшшдного бислоя, щтткфаюх к молекуле фермента (Адрианов, Уваров, 1988). Интенсификация ПОЛ вызывает изменение гидрофобного «шсроокружэния цитохрома Р-460 и микровязкости микросомальных мембран. Возможным следствием этого является изменение активности цитохрома P-4SH Л Имеющиеся в литературе данные указывают на важную роль белоК-липидных взаимодействий в функционировании системы цитохрома Р-450 (Арчаков, 1975; Бурлакова и др., 1982). Кроме того, снижение микровязкости вон белок-лшшдных контактов мембран микросом вследствие активации ПОЛ, по-видимому, повышает доступность гемовой группы для экзогенных субстратов и стимулирует скорость гидроксилирования.

Нами показано, что в микросомах ■проявляется двунаправленная реакция отдельных изоформ цитохрома Р-450 на : мноиифатное действие ГБГ. Деметилазная активность цитохрома Р-450 снижается после однократного действия ГБГ в микросомах есэх исследованных, тканей, а после третьего и пятого сеансов ГБГ ингибирование

.100«

мох

Легкие ш яга

50

* 9 Е

56,

'67

69

ДМА

1 э в

28

26

33

• *

3 в

и

31

495

.Почки

ПГД

73,

* * »

3 в

и

65

Рио. 4.; Активность цатохрома Р-450 при многократном длительном действии 3,6 Ша гигарбарического гейюкса (в % I контролю) . 1,3,в, - оеанси ГВГ; п - последействие; * - достовэрше различия относительно контроля; Щк - дзметилазнвя активность, ПГА па-рагидроксшшзйбя активность.

N-деметилирования амидопирина сохраняется только в микросомах легких и печени. Напротив, шшлингидроксилазнвЯ активность цито-хрома Р-450 значительно повышается при многократном действии ГБГ. Наибольшая скорость гвдроксилирования анилина отмечена в микросомах мозга'п печени после третьего сеанса ГБГ, а в микросомах почек после первого сеанса. Негативной стороной - резкого повышения анилингидроксилазной активности цитохрома Р-450 в микросомах при многократном действии ГБГ может быть образование двух типов метаболитов - активных форм кислорода (АФК; и конъю-гированных диенов (Арчаков, 1983).

По-видимому, одной из причин разнонаправленного действия ГБГ на активность цитохрома Р-450 являются особенности взаимодействия изоформ фермента с субстратами I (амидопирин) и II (анилин) типа. Можно'предполокить, что при многократном действии ГБГ возросшая интенсивность ПОЛ нарушает взаимодействие .цитохрома Р-450 с субстратом I типа, что приводит к депрессии' демети-лазной активности. Взаимодействие цитохрома Р-450 с субстратами II типа может стимулироваться этим действием и приводить к повышению гидроксилазной активности. Известно, что гемовая груша цитохрома Р-450 расположена на границе раздела фаз в микросо-мальных мембранах (Райхман и др., 1973).

Таким образом, однократное действие ГБГ обусловливает выраженную интенсификацию процессов ПОЛ в микросомальных мембранах, которая, в свою очередь, вызывает изменения структурно- функционального состояния микросомальных мембран, выражающееся, прежде всего, в возрастании микровязкости липидного , бислоя мембран и разноййяравленном изменении активности цитохрома Р-450 по отно-йению к субстратам I и II типа.

Мояно заключить,' что первоначально однократное действие ГБГ на мышей реализуется как стресс-реакция чрезмерной силы с переходом в патологическую, неспецифическим пусковым механизмом которой является интенсификация ПОЛ и недостаточность антиокси-дантной защиты. Присутствие в газовой смеси гелия вносит определенную специфику в микроструктурный эффект гипербарии на мембраны. Гелий, хорошо растворим в воде, но/слабо растворим в липи-дах. Усиление ПОЛ в мембранах способствует появлению гидрофильных кластеров, повышая проникновение молекул вода в мембраны. В лишдной фазе мембран атомы гелия окружаются молекулами мембранной воды, образуя водно-гелиевые гидраты кластерного- типа. Про-

никновэние молекул вода в толщ мембран разупорядочивает их структуру и приводит к "водной коррозии" мембран, что является ввкнейшим следствием усиления ПОЛ в мембранах (Владимиров, 1987). В условиях дейстьия ГБГ, по-видимому, можно предположить возникновение "водно-гелиевой коррозии" ыикросомальных и эритро-цитарных мембран. Следствием этого является снижение микровязкости белок-липидных контактов в мембранах и разобщение гидрокси-лазных реакций млкросомального окисления.

Главная причина превращения адаптационной реакции в патологическую - низкий исходный уровень стресс-лимитирующей антиокси-дантной системы мышей, характерный для данного биологического вида. Последующее многократное действие ГБГ стимулирует компенсаторные защитные механизмы и способствует формированию адаптивных изменений. К последним относятся повышение антиоксидантного статуса, приводящее к снижению интенсивности свободшрадикалъно-го окисления дипидов, тенденция к нормализации микроструктура плазматических и субклеточных мембран, умеренная активаций гад-роксичазной активности цитохрома Р—150.

Поскольку мембраны являются осноьной точкой приложения для действия факторов гипербарии, целесообразно применение антиокси-дантов мембранопротекторного действия для ослабления повреждающего 'вф|екта стресса и снижения порога адаптации.

ВЫВОДЫ '

1. Однократноэ действие гипербарического гелиокса под давлвш-ем 3,6 МПа приводит к резкому росту уровня продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов и плазма крови, Активное^ СОД значительно снижается. Трех*и пятикратное воздействие¿ГБГ сопровождается сяижен&см накопления продуктов ПОЛ как в плазме крови, так н в мембранах эритроцитов, проходящее на фоне резкого роста активности СОД. Однако через 2 месяца после пятого гдаюрба-рического воздействия при высоком (на 1Б0Ж выше контроля) уро-.вне активности 00Д наблюдается рост содержания продуктов ПОЛ в плазме крови. Активность каталазы в плазме и эритроцитах во все сроки воздействия ГБГ ортеется неизменной.

2. Многократное действие ГБГ приводит к изменению параметров структурного состояния МЭ. Уве после первого сеанса ГБГ наблюдается рост относительной никровязкости липидного бислоя мембран и погруженности белка в липидный метрике, е.также снижение микровязкости вон белок-липидкого контакта. Однако после . пятикрат- '

•ного действия ГБГ наблюдается нормализация структурных параметров.

3. В микросомах мозга, легких, печени и почек мышей однократное действие ГБГ вызывает резкий рост уровня продуктов ПОЛ. К концу пятпго тапербарического воздействия наблюдается снижение уровня ДК в микросомах всех тканей, кроме почек. Уровень ШО после пятикратного действия ГБГ остается повышенным в мембранах микросом всех исследованных тканей. В период последействия няблюдчется вторичный рост интенсивности ПОЛ в микросомах мозга, легких и печьни.

4. Структурные параметры мембран микросом всех исследованных тканей мышей претерпевают выраженные разнонаправленные изменения в ходе пятикратного действия ГБГ. Так в мембранах микросом легких, печени и почек наблюдается рост относительной микро вязко сто. после однократного гттербаричьского воздействия, в то время, как в микросомах мозга этот параметр снижается после первого и третьего сеансов ГБГ. Микровязкость зон белок -лишдногс контакта снижается в мембранах микросом легких, печени и почек, оставаясь в легких и печени ниже контроля и после пятого сеанса ГБГ. УроЬень холестерина отличается от контроля в мембранах микросом легких, печени и почек.

5. В ходе пятикратного действия ГБГ как деметилазная, так и гидроксилазнея активность цитохрома Р-450 подвергаются. значительным изменениям. В мембранах микросом всех тканей снижение деметилазной активности цитохрома Р-450 сопровождается ростом парагщроксилазной активности. К концу пятого, воздействия ГБГ большая часть изменений сохраняется.

6. Вахной составляющей гшербарического воздействия является нахождение животных в ограниченном объеме барокамеры, о чем • свидетельствуют данные камерного контроля: возрастает уровень продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов и микросом мышей после пребывания животных в барокамере, заполненной атмосферным воздухом при нормальном давлении.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Некоторые характеристики индивидуальной чувствительности и эффективности ГБО (К.В. Шёрстнвв.А.А. Кричевская, Е.Е. Николаева, г.Г. Жданов» Н.П. Милютина, И.я. Шерстнева, Е.В. Минкина, Е.В. Лыкова) // Гипербарическая оксигенация, IV симп.- М.,

^ЭвЭ.-С. 167-168.

2. Влияние унитиола на ПОЛ и антиоксидантные форменты эритроцитов при гипербароксигенации ъ условиях сердечно-сосудистой патологии.(К.Б. Шерстнев, Г.Г. Жданов, Е.Е. Николаева, Н.П. Милютина, И.Я. Шерстнева, Новикова Е.И.). / Биоантиоксидант, 3 Всес. конф. М., 1989.- С. 126-126.

3. Оценка химического' состава крови и структурно-функционального состояния мембран эритроцитов и микросомальной фракции мозга, легких, печеьл и почек мышей при многократном

. действии гипербарии (A.A. Ананян, Н.П. Милрина, Е.И. Новикова, К.Б. Шерстнев). // Отчет по НИР ИЭФВ им. И.М. Сеченова АН СССР ГОпережавдиэ исследования на животных по многократному пребыва-,НИЮ под давлением".- Л., 1989.- С. 60, 103, 130, 185, 200, 239.

4. Отдаленные последствия многократной гипербарии (A.A. Ананян, Н.П. Милютина, Е.И. Новикова, К.Б. Шерстнев).. // Отчет по НИР ИЭФБ им. И.М. Сеченова АН СССР "Опережающе иссладоэвния на животных по многократному пребыванию под давление« ч. Л,, 1989.- 0. 296.

Б. Влияние rampa арии на активность ПОЛ и структуру мембран эритроцитов и микросом мышей (Е.И. Новикова, B.C. Дашевский) // Тез. 6-й Ростовской обл. научно-практ. школы-семинара.-Ростов-на-Дону, 1990.- г.- С. 32.

6. Влияние гипоксии ца структурно-функциональные —свойства эритроцитов (Н.П. .Ыйлютина.'В.А. Херувимова, A.A. Ананян, Е.И. Новикова). // Тез.'докл. Всесоюз. симп. "Механизмы зимней спячки".- Махачкала, 1990. - С. 80-81.

7. Структурно-химическое состояние мембран эритроцитов и микросом клетоюмозга, легких, печени, почек, сердца и семенников морских свинок при гщтербарии (A.A. Ананян, А.И. Лукаш, Н.П. Милютина, Е.И. Новикова)'. // Отчет по НИР ИЭФБ им. И.М. Сеченова АН СССР "Оценка состояния основных функциональных систем организма теплокровных живо1*шх в условиях длительного пребывания под давлением". Л., 1990.- С. 89, 98, 104, 206, 289.

8. "Соотояниэ мембран макросом мозга и эритроцитов шшей при действии пшероарического гелишса" (Н.П. Милютина, Е.И. Новикова) // Известия СШЩ ВШ. Естеств. науки.- 1992.- Ш.- C.I42-146 '

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНЫ АФК - активные форш кислорода ГБГ - гипврбарический гелйокО МЭ - мэнбраны эритроцитов ДК - диеновые конт&югаты ШО - шиффэвн основания СРО - свободнорадикальноэ окисление ПОЛ - тарекисное окисление липидон СОД - супероксиддисмутаза СПА - суммарная пвроксидазная ектиеность МОС - швооксигеяааная система

Подписано к п§н*ги 21,05,9<г, Бумаге тип.)4Э. формад £0x84/16. Офом. Объем " уод, п. уч.-изд. л. ^»квз Тира* ЛОО, Беспдатнр.,

Огпечагакаи лаборяяюрик офсетной печати РИСХМа Адрво полиграфического предприятия: 3^706, г# Ростов-на-Дону, пл. Гагарина, 1