Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние производных имидазола на состояние клеточных мембран в условиях воздействия серосодержащих соединений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние производных имидазола на состояние клеточных мембран в условиях воздействия серосодержащих соединений"

(гШЙСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОМ ПРСШаЛЕННОСТИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ШККО-ЙАШШВТШЕСКИИ ИНСТИТУТ

На правах рукошси

1"~знецова Ольга Алексеевна

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ШИДАЗОЛА НА СОСТОЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ СЕРОСОДЕРШШ СОЕДИНЕНИИ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сокскгшз ученей степени кандидата биологических наук

САШСТ-ПЕТЕРБУРГ 19%

Работа выполнена на кафэдре биохимии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова (ректор - д.м.н., профессор А.В.Шабров).

Научный руководитель:

доктор химических наук.

профессор В. А. ДАДАЛИ

Официальные оппоненты:

доктор медгщшаш. наук Е. Е. ДУБИНИНА

профессор

кандидат биологических наук Н. Н. ЗЫБИНА

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский институт токсикологии МЗМП РФ, лаборатория биохимической фармакологии.

Зашита состоится << ¡¡-^ » 1996г. в часов

на заседании специализированного совета К 084.63.01 при СПХФИ (197376, Санкт-Петербург, ул. ср. Попова,. 14)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СПХФИ.

Автореферат разослан « К ЛИ&Х' 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н.В.КИРИЛЛОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Антропогенное химическое загрязнение окружающей среда является одним из наиболее опасных повреждающих. факторов, приводящих при хронических воздействиях на организм к глубока нарушениям обмена веществ, что лежит в основе возникновения многочисленных заболеваний. В связи с этим поиск путей фармакологической защиты организма от повреждающего действия токсикантов, особенно в условиях производства, является актуальной проблемой.

Из широкого круга синтетических фармакологически активных соединений особого внимания заслуживают производные имидазола в связи с их структурным сходством с физиологически активными компонентами организма и в соответствии с этим низкой токсичностью и отсутствием побочного действия. Более того, среди производных имидазола тлеются офишнальше препараты, обладающие адаптогенными свойствами, например, дибазол (ДБ) и др. Однако эти вещества не били изучены и не применяются как превентивная фармакологическая защита от действия токсикантов.

Изучение производных ишдазола с этой точки зрения представляется заслуживающим серьезного внимания. Одним из вазшых компонентов защитного, а в более широком плане адаптогенного'действия этих соединений является мембранопротекгорный эффект, обеспечивающий стабилизацию клеточных мембран и мембранозависи-мых процессов.

Большинство имевшихся на сегодняшний день методов оценки состояния мембран дает информацию о мембране в целом, тогда как структурные изменения при ее функционировании происходят, нередко, только на отдельных, активных участках. Изучение этих аспектов требует применения.более тонких и более специфичных методов исследования, таких как хемилкюшесценция (ХЛ) липидов и изучение состояния мембран с помощью химических зондов, что позволяет определить ряд функциональных характеристик мембран и оценить их состояние на ранних стадиях повреждения.

Эффекты имидазолов были изучены на интактных мембранах и на модели токсического действия ароматических гаолов в опытах In vivo и In vitro. Известно, что SH-содержавде соединения играют исключительно важную роль в функционировании клетки и е8 защите от токсического действия. Эти соединения, включающие глутатион,

цистеин, SH-групш белков, являются тиолами алифатического ряд, не обладающими токсическими свойствами. Ароматические же тиолы и соответствующие им дисульфиде высокотоксичны. Однако механизг их токсического действия и мишени изучены недостаточно, в силу чего исследование биохимических механизмов действия этих соединений представляет самостоятельный интерес.

Цель и задачи исследования. Цель» работы являлось получение данных о влиянии лмндазолсодержащих соединений на состояние клеточных мембран в условиях интактного организма и при воздействии токсических серусодержащих соединений на примере ароматических тиолов в опытах In vitro и In vivo.

Для достижения, этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование состояния свободно-радикального окисления (СРО) лвдидов мембран эритроцитов и макросом печени крыс при воздействии производных имидазола.

2. Исследование физико-химических свойств мембран эритроцитои и ыикросом печени крыс с использованием флюоресцентных зондов при воздействии производных имидазола.

3. Исследование активности АТФазы и функции ¡э-адренорецепто-ров эритроцитов при воздействии производных имидазола.

4. Исследоваяиэ состояния СРО липидов мембран эритроцитов и , макросом печени крыс при воздействии ароматических тиолов.

5. Исследование физико-химических свойств мембраны с использованием флюоресцентных зондов при воздействии ароматических тиолов.

6. Исследование активности АТФазы и функции /з-адренорецеиго-ров эритроцитов .-Ери воздействии ароматических тиолов.

7. Изучение* возможности коррекции кмидазолсодержащими соединениями сосюкшга мембран эритроцитов и.макросом печени крыс в условиях"токсического.воздействия ароматических тиолов.

Йаучаая иов'лзаа. Впервые получены данные о действии ароматических тао соединена и производных имидазола на фнзико-хкдгчес-кие свойства иетакташс мембран, функцию р-адренорецепторов и активность АТФазы эритроцитов с использованием мембранных зон-'дов и методом 1Л.

Впервые установлено защитное действие производных имидазола, в том числе.препаратов ДБ и этимизол ОТ), и изучен механизм коррекции''состояния мембран и мемОранозависимнх белков и фер-

ме тов, в условиях токсического действия ароматических тиолов.

Практическая значимость. В целях предотвращения повреждающего действия токсических ароматических тиолов и дисульфидов на мембранный аппарат'эритроцитов, эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и мембранннх белков целесообразно использовать имидазол-содержащие соединения.

Лекарственные препараты ДБ и ЭТ являются перспективными профилактическими средства?™, предупреждаювдми повреждающий эффект токсических серусодержащих соединений.

Основные положения, выносише на защиту.

1. Влияние ароматических тиолов и дисульфидов на состояние липидного сислоя мембран эритроцитов и микросом печени крыс и функцию мембранозависимых ферментов и белков №'|\К+-АТФаза1 ^-адренорецепторы).

2. Влияние ишдазолсодеркащих соединений на состояние липидного бислоя мембран эритроцитов и микросом печени крыс и функцию мембранозависимых ферментов и белков (На+,К+-АТФаза, П-адренорецепторы).

3. Механизмы защитного действия имвдазолсодержащих соединений на состояние клеточных мембран эритроцитов и мьсросом печени крыс и функцию мембранозависимых ферментов и белков

(Ыа+, К+-АТФаз а, /?-адренорецепторы).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсувдены на:

- 6-м Всесоюзном биохимическом съезде (С.-Петербург,1992);

- российской научной конференции "Биоэчтиоксидант" (Москва, 1993);

- итоговой научно-исследовательской конференции академии "Актуальные вопросы профилактической и клинической медицины" (С.Петербург, 1994);

-II Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва,1995): По теме диссертации опубликовано 3 работы. Структура я объем диссертации. Диссертация состоит из введе -ния, обзора литературы, 2 глав, содержащих материалы собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 170 источников, в том числе 48 на иностранном языке. Диссертация изложена на 156 страницах маши-

ношеного текста. Иллюстрирована 8 рисунками и 33 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ РАБОТУ

С учетом цели настоящей работы экспериментальные исследования проводились но трем направлениям:

- исследование влияния имидазолсодержавдх соединений на состояние клеточных мембран в условиях: кнтактного организма;

- исследование токсического действия, ароматических тиолов на состояние клеточных мембран макросом, печени и эритроцитов;

- изучение возможности коррекции производными имидазола токсического действия ароматических тиолов:

Состояв мембрак оценивали по интенсивности свободно-радикальиого и перекисного окисления лшидов (CP и ПОЛ), изменению их физико-химических свойств методом флуоресцентного зондирования и функции кембранозависикых белков (tf-адренорецепто-. ры) и ферментов'(К.Ма-АТФаза).

Pao.та выполнена на белых беспородных крысах-самцах и крысах линии Вистар в опытах In vitro и in vivo. Исследовали микросомы, полученные дифференциальным центрифугированием гомогенатов печени крыс по классической схеме и тени эритроцитов, полученные с помощью гипоосмотического гемолиза клеток по методу Dodge and al.(1984).

Изучение действия производных имидазола на состояние клеточных мембран проводили в экспериментах с использованием'мономерных и полимерных соединений:

- мономерные соединения: фармакопейные препараты - дибазол (ДБ), этимизол (3D и синтезированные -- 2-(3'хлорфенил)бенз-, имидазол (Т-4), 2-(3,хлорфенил)-1-(3,диэтЕлеминогидроксипрош1л) -Оензимидазол (1-5), 2,3-дшетилбензимидазол (Бй), 2-(3' хлор-фенил)-!- З'мор^олиницфоксипропил) бензимидазол (д-1);

-полимерны© соединения на основе N-винилпирролэдона: -имидазол (ЕВИ), -Оензимидазол (ГОБИ), содержащие cono л меры.

In vivo эксперименты проводили по нескольким схемам. Первая основывалась на ежедневном введении крысам в течение трех суток внутрижелудочно зондом веществ в дозе 80 мг/кг веса в сутки. Через 48 час после последнего введения ткани животных брали на исследование. Вторая схема - интермиттирующая - основывалась на длительном введении per os малых доз веществ (I мкМ) в течение 28 дней по.схеме: 7 дней - дача препаратов* 7 дней - перерыв. В

двух других была изучена возможность коррекции токсического действия тиофенола (ТФ) в подостром и острой экспериментах. Животные были разделены на несколько групп. В подостром эксперименте: I группа - интактные; 2 груша - получали только ТФ в течение 12 дней в дозе 4 мг/кг (i/30 Ы),0) ежедневно, 3 - получали только ЭТ также в течение 12 дней в дозе 20 мг/кг веса; 4 группа - ТФ в дозе 4 мг/кг через 4 часа после введения соответствующей концентрации ЭТ. В остром эксперименте: I группа -интактные: 2 группа получала только ТФ в дозе 200 мг/кг (LDoo; однократно за 24 часа до проведения исследования; 3 и 4 группы получал! только ЭТ и ДБ в дозе 80 мг/кг ежедневно в течение трех дней, отбор биологического материала на исследование на 5 день через 48 часов после последнего введения препарата; 5 и 6 группам вводили ЭТ и ДБ в таких же дозах в течение Зх дней, на четвертий день, через 24 часа после последнего введения имида-золов, животные получали ТФ (200 мг/кг); забой на 5 день, через 24 часа после введения ТФ.

1п vitro действие ароматических гаолов на мембраны исследовали на примере дифеншшгульфида (ДФДС) после 15 мин, I часа и 2х часов инкубации при 37°С и на фоке предварительного 16 мин воздействия препаратов имидазола. Действие ДФДС исследовано в концетрациях 25, 50 и 100 мкМ, производных имидазола - в концентрации IO~°-IO~*U.

Измерение интенсивности CP и ПОЛ проводили путем регистрации параметров кинетической кривой индуцированной ХЛ в плазме крови, модельной суспензии липосом, тенях эритроцитов и по накоплению малонового диальдегида (МДА). Регистрацию ХЛ осуществляли на биохемилюминометрв БХЛ-06 (НИЦ "Биоавтоматика", г.Н.Новгород). В качестве индуктора применялась система Феятона.Интенсивность процесса оценивали по максимальному значению интенсивности ХЛ (Imaj) и показателю светосуммы медленной вспышки ХЛ (S).

Микровязкость определяли по степени эксимеризации зонда пире-на (1э/1м) на спектрофлюориметре "Schlmadzu" и спектрофотометре "Specord М-40", возбуждая флюоресценцию при 336 нм. Для расчета 1э/1м использовали высоту пиков с максимумами 470 и 395 нм соответственно. Оценку связывания зонда АНСГс мембранами проводили по изменению константы связывания (КС) и концентрации мест

связывания зонда (N). определенных путем титрования при 480 нм, длина волны возбуждения 36S ем, на флвориметре "Квант-7" (ШО "Химавтоматкка", г.Барнэул). Подученные данные рассчитывали в координатах Скэтчарда, выражая их в двойных обратных величинах.

Функцию /7-адренорецепторов оценивали по изменению констант связывания (Кс), концентрации мест связывания (N) и концентрации связанного пропранолола (R) с суспензией эритроцитов, определяемых регистрацией флуоресценции на "Specorti. М-40" с флюори-метрической приставкой при длине волны всзбуэсдения 327 нм и испускания 360 нм методом И.Э.Калниня (1990).

Активность общей АТФазы эритроцитов определяли по приросту неорганического фосфора (Eible Н.,1969), а активность уабакн-чувствительнсй Ка.К-АТФззы рассчитывали по разнице между активностью АТФазы. в присутствия (уабаикрезкстентная фракция) и в • отсутствие (общая) 100 мкМ уабакна. Активность фермента выражали в мкг румг белка/час.

Белок в пробах определяли па. методу Lowry 0.Н.О951).

Статистическую обработку данных проводили по методу Стьюдента с использованием программы Statgraph на компьютере IBM PC/XT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все исследованные имидазолсодеркащие соединения в концентрации 10 мяМ обладают выраженным щгибирущям действием на развитие сзободнорадикального процесса, индуцированного в модели лшосом. Тормозящий эффект, регистрируемый в модельной суспензии липосом по максимальной интенсивности медленной вспышки ХЛ (Inax), составил для соединений Т-4 - 95%, БК - 77%, Т-5 - 5SSS, ИМ - 45$, ЭТ - 323, ДБ - 22%. При увеличении концентрации в 2 раза (20 мкМ) антиоксидантная активность (АОА) всех изученных соединения существенно снижалась (наиболее выраженно для ДБ и ИМ), однако дальнейшее увеличение концентрации до 200 мкМ вызвало нарастание адтиоксидантного действия. При этой концентрации соединения Т-4, Т-5 и БИ .практически полностью препятствовали развитии СРО липидов, для КМ и ДБ ингибирование составило по величине Imax -75%, ЭТ - 49% (Рис.1). Таким образом, АОА производных имидазола в исследованной модели характеризуется повышением активности цри концентрациях 10 и 200 мкы и понижением при 20 МкМ.

Исследование действия этшс соединений на интенсивность ХЛ

плазмы крови в опытах In vitro показало, что производные имида-зола в плазме оказываются менее эффективными в отношении торможения свободнорадикэльных процессов. Более того, в концентрации 100 мкМ все исследованные соединения оказывали прооксидантное действие. В концентрации 200 мкМ - прооксидантное действие сохраняется у имвдазола, БИ, Т-4; все остальные соединения эффекта вообще не оказывали. Однако дальнейшее увеличение концентрации веществ до 500 мкМ привело к появлению АОА. Ингабирувдий эффект ЭТ по Imax составил 42%, Т-4 - 37», ДБ - 40», БМ - Тв%.

Изучение антиокоидантной активности имидазолов в опытах In vivo показало, что мономерные производные, за исключением Т-5, и полимер ПВИ практически не влияют на процессы СРО в плазме крови при длительном введении малых доз (Т-5 на 28 день введения снижал интенсивность образования МДА на 21%, ПВБИ - на 22%). ЭГ при введении по интермиттируюцей схеме не оказывал влияния на процессы СРО плазмы крови. Однако еяодневное введение препарата в дозе 20 мг/кг в течение 12 дней оказывало выраженное прооксидантное действие. Мы полагаем, что этот факт следует учитывать при лечебном применении препарата. Для сравнения отметим значительный (44%) антяоксвдантный эффект ЭТ в микрооо-мах печени.

Более выраженное действие все исследованные соединения при различных режимах введения оказыгэли на состояние антиоксидант-ной системы микросомальных мембран печени. Полимерные производ-Imax

(%)i

100

5

JO.

14 И

9

JOL

24

д

■ч

2S

д

Т-Б

БИ И/ ЭТ ДБ

Конт- Т-4 роль

Рис.1. АОА соединений имидазола в концентрации 200мкМ по изменению показателей ХЛ. индуцированной в модели липосом в % остаточной интенсивности ХЛ

вые быт более эффективны при длительном введении (антиокси-дантный эффект нэ 28 день введения для ПЕБ'Л - 66%'. ПБИ - 60S, а ЭТ - 50S, Т-5 - 28%, ДБ - 25S), мономерные - при кратковременном. Так, при трехкратном введении в дозе 80 мг/кг антиокси-данткое действие ДБ составило -- 73~, ЭТ - 503, з ПВ5И - 21%, ПБК - 143.

После трех дней введения в дозе 80 мг/кг веса у ЭТ и ДБ отмечался Еыраженный антиоксидантный эффект в эритроцитарных мембранах, прячем у ДБ более сильный (остаточная интенсивность ХЛ по, величине Iinax у Д5 составила 28Z от контроля, у ЭТ - 59%).

Б целом можно отметить, что при длительном введении малых доз наиболее эффективным в плазме крови оказались соединения ПВБИ и Т-5, в микросомальнкх мембранах - ПВБИ к ПБИ. При кратковременном введении - препараты ДБ и ЭТ.

Снижение антиоксвдантного эффекта производных имидазола в плазме крови, вероятно, обусловлено связыванием имкдазолов с альбуминаш и другая белхамл плазмы крови, а такке, возможно, с липопротегаами. В опытах in vitro с плазмой крови антиокси-■дангное действие имидазолов, по сравнению с липосомзми, проявлялось лишь при концентрации в 10-15 раз более высокой.

В экспериментах In vivo, имндаголы как антиоксидзнты были более зффектиаш при кратковременном введении больших доз (80 мг/кг в т&ч&иге трех дней), чем при длительном введении малых доз (20 mí/кг в течение 12 дней), Имидазолы в плазме крови in vivo были тайке менее эффективны, чем в микросомах печени крыс.

Исследование АТФазной активности эритроцитов при действии./ имидазолов, показало активацию фермента при низких концентрациях имидазолов и ингибирование при высоких концентрациях. Изменение активности Фермента обнаружило отрицательную корреляцию с микровязкостыо мембраны эритроцитов, найденную по степени эксимеризации пирена (Рис.2). Таким образом, возрастание "структурной яесткости" белкового окружения под влиянием имида-золсодерхших 'соединений, может затруднять конформационную подвижность молекул АТЗазы, препятствуя ее функционированию.

Помимо этого снижение активности эритроцятарной АТФазы под влияньем икидазолсодержавих соединений может быть связано, по крайней мере б случае более осеовных имидазолов (КМ, ДБ), с нейтрализацией электрического заряда фосфатздилсерина и

1в(М)

Рис.2 Изменение активности АТФазы эритроцитов на фоне изменения микрозязкости мембран под действием ИМ (по оси абсцисс-]^ молящих концентраций ИМ, по оси ордшат-активность фермента и микровязкость мембран в % к контролю)

* — * - активность АТФазы х — х - микровязкость мембран

других анионных фосфолипидов, которые являкп ся аллостерическими эффекторами фермента, а фосфатидилсерин рассматривается в качестве кофактора АТФазы.

Раздельное исследование уабаинчувствительной и уабаинрезис-тентной форм АТФазы обнаружило различный характер влияния ими-дазолов н ' активность фер?данта.

Интересно отметить, что в случае дибазола (in vitro и ln vivo) и соединения Д-I (in vivo), у которых степень ингибирования уабаинчувствительной АТФазы была наибольшей по сравнению с другими шдвдазолсодержащими соединениями, происходит активация уабаинрезистентной АТФазы. Поскольку увеличение активности уабашрезистентной АТФазы отмечено как в экспериментах In vivo, так и In vitro, можно исключить версию индукции имидазолами синтеза' различных изоформ АТФазы.

Исследование функции р-адренорецепторов суспензии эритроцитов показало, что связывание пропранолола с эритроцитами, после

воздействия ЭТ и ДБ (100 мкМ), характеризуется снижением констант связывания (Ко), повышением концентрации связанного про-пранолола (R) и увеличением концентрации мест связывания (N).

Таким образом, ЭТ и ДБ в исследованной концентрации вызывают повышение чувствительности /з-адренорецептороз к антагонисту пропранололу.

Изучение защитного действия иыидазолов проводилось в условиях токсического повреждения мембран, вызванных ТФ-и ДФДС. В опытах ln Ylvo показано, что ТФ как в остром, так и в годостром опыте увеличивал интенсивность СРО. В мембранах эритроцитов проокси-дантный эффект ТФ бил более выражен, чем в плазме крови и мик- ■ росомах печени крыс. В остром эксперименте ТФ увеличивал Imax в 2,5 раз, концентрацию МДА в плазме крови - в 1,6 раз, в микросомах - в 1,3 раза, годостром опыте ТФ увеличивал Imax теней эритроцитов в 1,3 раза. Концентрация ВДА в плазме крови практически не изменялась. Действие ТФ на микросомы печени проявлялось по-разному. В остром опыте ТФ обладал явно выраженным про-оксидантным эффектом. В годостром опыте в ответ на длительное введение Тф в малых дозах, наблюдалось снижение интенсивности СРО даже ниже уровня контроля. Этот, на первый взгляд неожиданный эффект, по-видимому, связан с тем, что при воздействии в течение достаточно длительного времени малых доз адаптивно активировалась физиологическая система антирадикальной ж антипе-рекисной защиты. Следует отметить, что и на другие системы ТФ при длительном воздействии-оказал меньший прооксидантный эффект, чем при однократном в дозе IDao.

Сравнение црооксидантного действия ТФ в остром и годостром опытах свидетельствует о том, что антиоксидантный комплекс плазмы и макросом оказывает более существенную защиту, чем антиоксидантный комплекс мембран эритроцитов. -Как при длительном введении малых доз ТФ.гак и при однократном введении большой дозы, интенсивность СРО плазмы тсрови остаётся приблизительно на одном уровне.

Таким образом, полученные данные показывают, что ТФ при длительном воздействии в мглой дозе оказал меньший прооксидантный эффект, чем при кратковременном воздействии в дозе ID^.

ЭТ и ДБ при Зх-дневном предварительном введении оказывали антиоксидантный эффект (Рис.3). ЭТ предотвратил развитие СРО в мембранах эритроцитов - величины Imax и S ниже уровня контроля.

- и -

при этом значения Imax и S, по сравнению с действием одного ТФ снизились соответственно в 3,4 и в 2,7 раза, концентрация МДА в микросомах - в 3,5 раза. В плазме крови его действие было менее эффективным: при одновременном введении ЭТ и ТФ произошло увеличение концентрации МДА в.плазме.

Защитное действие ЭТ и ДБ по отношению к ТФ различно. Эт как антиоксидант в эксперименте ln viro, в отличие от экспериментов

1 2

1 2

1 2

1 2

1 2

Imax мембран эритроцитов

МДА

плазмы

МДА микро-сом

АТФаза

N

(АНС )

Рис.3 Токсическое действие тиофенола (200 мг/кг) и защитный эффект этимизола (80 мг/кг) в остром эксперименте ln vivo:

I- тиофенол;

2 - ЭТ -тиофенол;

I шгх - максимальная интенсивность медленной вспышки ХЯ; . Б - светосумма медленной вспышки ХЛ; АТФаза - активность АТФьзы эритроцитов; N - концентрация центров связывания зонда АЖГв мембранах эритроцитов; Данные представлены в Ж к контролю.

ва интактных мембранах, был эффективней, чем ДБ.

В подостром опыте защитный эффект ЭТ по отношению к Тф проявился только в мембранах эритроцитов, где величина S снизилась в 3,3 раза. Во всех остальных исследованных объектах совместное действие ЭТ и ТФ вызвало прооксидантный эффект. Обращает на себя внимание, что прооксидантный эфХект совместного действия ЭТ и ТФ проявляется только в микросомах печени и плазме крови. В связи с тем, что производные шедазола являвтся индукторами микросомалъной монооксигеназной системы, преаде всего цитохрома Р-450, при функционировании которой продуцируется супероксид-анион, указанный выше эф£ект в микросомах моагет быть обусловлен этим процессом. Что же касается плазмы крови, то, вероятно, ~антиоксидештное действие низких доз ишдазолов ослабляется за счет их связывания с белками, прежде всего альбуминами плазмы киови.

Выраженный прооксидантный эффект тиофенолов как таковых и на фоне протективного действия имидазолов приводит к изменении свойств мембран, что подтверадают данные по флюоресцентному зондированию мембран эритроцитов и макросом.

Исследование параметров связывания зонда АНС с мембранами показало достоверное снижение величины Ке при действии ТФ в мембранах эритроцитов (подострый опыт на 11%, острый - на 27%) и микросомах (подострый и острый опыт- на 30«). Концентрация центров связывания зонда (К) не изменялась, или изменялась незначительно (мембраны эритроцитов).

Добавление ДФДС в инкубационную среду во всех исследованных концентрациях вызвало резкое увеличение микровязкости как мембран эритроцитов, так и микросомальных мембран, увеличиваясь с ростом концентрации и временем инкубации 'Рис.4). Так,- повышение микровязкости при 15 минутном воздействии ДФДС в концентрации 25 мкМ в эритроцитарных м 1бранеа составило 35%, в микросомах - 423»; воздействие ДФДС в концентрации 100 мкМ в течение 2х чесов вызвало изменение микровязкости на 60% в обеих исследованных мембранных фракциях.

Изменение, параметров связывания зонда АНСГ имело не столь выраженный характер. Воздействие ДфЦС в концентрации 25 мкМ на ^рятроцитарныэ мембраны не вызвало достоверных изменений величин Кв и N в течение всего времени инкубации. В микросомах

А

Б

* 8

%

а

юо

юо

'О'

II

X

II

А U

«2

«5

*■

* г

из П

*

1£мин 1час 2часа 15мин 1час t действия ДФДС

2часа t действяя ДФДС

Рис.4 Изменение степени эксимеризации (1э/1м) зонда пирена с микросомами печена (А) и тенями эритроцитов (Б), предварительно инкубированных с производными га.мдазола (ЮОмкМ) при воздействии ДФДС (ЮОмкМ) в опытах in vitro

Данные представлены в % к контролю.

I - ДФДС; 2 - ЭГ+ДФДС; 3 - ДБ+ДФДС; 4 - Т-5+1.ДО

же величина К. снижалась на 30% ужо после 15 минутного воздействия. Уменьшение величины К регистрировалось только после 2х часов инкубации с ДФДС.

Увеличение концентрата! токсического агента привело к более выраженному изменению флуоресценции АКТ. В микросомах наблюдали снижение как К,, так и К; в эритроцитах - только числа центров связывания (в среднем на 10 - 30%). Достоверных изменений константы связывания (К ) зонда в эритроцитах не обнаружено, отмечалась лнзь некоторая тенденция к увеличению этого параметра.

Флюоресцентный зонд АНС является чувствительным'индикатором перестроек, возникающих в клеточных мембранах. При взаимодействии с мембраной он локализуется на поверхности мембрана - водная среда. Снижение Кс зонда при действии тиофенола свидетельствует об уменьшении сродства зонда к мембране.Снижение интенсивности флюоресценции АНС- отражает уменьшение площади контакта зсяда из-за уменьшения гядрофобности липидного бислоя, изменения заряда поверхностного слоя Селок-липидных систем.

Непосредственной причиной таких изменений мембраны является

СРО мембранных липидов и белков. Пероксидация фосфолипидов приводит к образованию промежуточных продуктов, являющихся высокогидрофильными веществами, они эффективно разрыхляют бислой, увеличивая доступность гидрофобных доменов для воды, с появлением на поверхности мембран отрицательно заряженных групп, возможно карбоксилов, вследствие чего мембрана приобретает отрицательный поверхностный заряд, который изменяет сродство мембраны к ионам Ре1*, индуцирующего СРО.

В целом, наблюдаемые отклонения в параметрах связывания зонда ЖГ в экспериментах In vitro соответствовали данным, полученным в экспериментах In vivo. И в том, и в другом случае воздействие токсического соединения приводило к снижению интенсивности флюоресценции АНС", обусловленному либо уменьшением кон-центрадаии мест связывания, либо изменением сродства зонда к мембране. Это свидетельствует об уменьшении гидрофобного объема мембраны и об увеличении еб отрицательного поверхностного заряда вследствие накопления продуктов СРО липидов.

Увеличение микровязкости мембран1.! (зонд пирен) связано, поводимому, также с развитием пероксидации липидов, которое затрагивая преимущественно ненасыщенные цепи, приводит к их выходу из глубоких слоев мембраны на поверхность, тем самым увеличивая "жесткость" мембраны, что находит отражение в уменьшении соотношения 1Э/1М.

Предварительное введение имидазолов снимало указанные изменения в мембранах во всех сериях опытов. При этом в остром эксперименте ЭТ увеличивал в мшфосомах величину Кс на 23%. ЭТ и ДБ - величину N на 1955 по сравнению с контролем. Наиболее активными ыембранопротектораыи in vitro были ЭТ и Т-5. Эти соединения предотвращали указанные выше изменения состояния мембран, подвергнутых 16 минутной инкубации с ДФДС. На фоне действия препаратов наблюдалось даже некоторое нарастание величин К. и N (ЭТ в мшфосомальных шмбранах, зонд АНС") и снижение микровязкости (Т-Б в эритроцитах, зонд - пирен).

При увеличении времени инкубации с ДФДС, в условиях предварительного воздействия имидазолов, наблюдались изменения флюоресценции зондов, оходнае с действием самого токсиканта, но выра-. ценность этих изменений была веб же значительно меньше. Так. микровязкоегь мембран микросом и эритроцитов на фоне действия

ЭТ через I час инкубации с ДФДС была ниже таковой при действии самого ДФДС практически на одну и ту же величину - 43% и 46%, через 2 часа инкубации - макросом на 3SS, эритроцитов - на 51% (Рис.4j. Наибольший эффект проявлял Т-5. Микровязкость мембраЕ после предварительного действия Т-5 практически не отличалась от уровня контроля. Относительно менее активным в эритроцитах оказался ИМ, а в микросомах - ДБ, хотя и в этих случаях защитный эффект проявлялся.

Защитное действие производных имидазола регистрируется и по флюоресценции АКСГ, хотя и менее выраженное. Практически у всех изученных препаратов на фоне токсического действия ДФДС наблюдалось увеличение сродства зонда (Ке) к мембранам, что, видаю, связано с ростом положительного заряда мембраны.

Исследование токсического действия ГФ па активность мембраго-зависямого фермента - эритрощггарной' АТФазы показало, что In vivo ТФ как в остром (Рис.3), так и подостром опытах, оказывал выраженный ингибирущий эффект, причем в подостром опыте наблюдалось практически одинаковое снижение активности как уабаин- •, чувствительной, так и уабаинрезистентной форм (¡£>0%). В остром опыте наиболее чувствительной фракцией била уабакнрезистентнзя АТФаза (общая АТФззная активность снизилась на 46%, уабаинре-зистечтная - на 73%, уабаинчувсвительная - на 16%).

ДФДС (ЮСмкМ) в эксперименте In vitro проявлял ингибируицее действие яа активность АТФ&зы подобное ткофенолу в экспериментах In vl70 (Рис.5). Наиболее ингкбируемой фракцией после 15 мин инкубации была уабаинрезистентная АТФаза. Так, общая АТФаз-ная активность снизилась в 1,8 раз, причем уабаинрезистентной фракции-- в 2,4 раза, уасаинчувствигельной - в 1,6 раза. Через I час воздействия ДФДС- активность АГФазы вообще не регистрировалась.

Производные жадазола на фоне токсического влияния ТФ и ДФДС проявляют вараженноэ защитное действие на функции эритроцитар-ной АТФазы. in vivo (подострый опыт) общая АТФазная активность под действием ЭТ увеличилась в I.E. раза, при этом уабаинчувст-вительная - в 2,1 раза, уабакнрезистенгнар практически не изменилась. В остром оште - общая АТФазная активность увеличилась также в 1,5 раза, но за счет активации уабаинрезистентной (в 2,7 раза), тогда как уасаинчувствителымя не изменялась. При

МКГР1/МГ белка/час

- 12 3

12 3

JUL

12 3

2 3

15мин

I час

15мин I час t

инкубации - с ДФДС

Контроль ДФДС ЭТ+ДФДС

Рис.5 Изменение активности эритпоцитарной АТФазы при воздействии ДФДС (ЮОмкМ) и ЭТ (IOmkM) в опытах In vltn

го

1 - общая АТФазная активность;

2 - уабаиярезистентная АТФазная активность;

3 - уабаинчувствительная АТФазная активность;

действии ДБ в остром опыте общая АТФазная активность, по сравнение с введением одного ТФ увеличилась в 2,0 раза, опять-таки за счет уабаинрезистентной формы (активность повысилась в 5,3 раза), активность уабаинчувствительной не изменилась.

Так как сохранение активности общей АТСазы в остром опыте произошло, в основном, за счет увеличением активности уабаинрезистентной фракции, меньшая выраженность защитного эффекта ЭТ на функцию АТФазы по сравнению с ДБ. может быть связана с его собственным ингибирущим влиянием на уабаинрезистентную форму интактного фермента. Для сравнения отметим, что ДБ на интактную уабаинрезистентную форму оказывает активирующее действие.

In vitro предварительное воздействие ЭТ сохранило активность фермента на уровне контроля после 16 мин инкубации с ДФДС' (доля уабаинрезистентной АТФазы 60%). После I часа инкубации сохраня-

лось вб% общей активности АТФазы: 47% уабаинрезистентной и 87$ уабзинчувствительной (от уровня контроля).

Защитное действие ДБ In vitro так же было менее выраженным. Активность общей АТФазы через 15 мин инкубации с ДФДС составила 81" от контроля, в том числе уабаинрезистентной - 91%, уабаин-чувствительнсй - 71%. После I часа инкубации общая АТФазная акгаекость составила 68%, уабаинрезистентная - 32%, уабаин-чувствительная АТФазная активность - 79% от уровня контроля.

Воздействие ДФДС на мембраны эритроцитов in vitro привело к уменьшению числа функционирующее /э-адренорецепторрв, о чем свидетельствует уменьшение ееличин N и R. Инкубация эритроцитов с 25 мкМ ДФДС вызвала снижение концентрации центров связывания • пропранолола (N) на 36%, с 100 мкМ ДФДС - на 42%. Концентрация сея-энного с эритроцитами пропранолола (R) снизилась в зна<*и-тельно меньшей степени: при 25 мкМ ДФДС - на 7%, 100 мкМ - не 1А%, что связано, по-видимому, с увеличением сродства пропранолола к рецептору.

Предварительная инкубация с ЭТ значительно лшзила выраженность изменений при токсическом действии ДФДС. Все исследованные параметры связывания достоверных отличий от контроля не имели.

Поведение белков-рецепторов в мембране, как и их сродство к лигандам, зависит от микровязкосги окружения. Поэтому увеличение микровязкости эритроцитарных мембран, вызываемое развитием СРО мембранных липидов под воздействием ДЩЗ, приводит к снижению функциональной активности ^-адренорецепторов. В тоже время нельзя исключить возможность непосредственной модификации ароматическими тиолами рецепторов путем восстановления их дисуль-фидных груш.

Анализ результатов биохимического исследования действия ароматических тиолов на мембранные структуры эритроцита и микросом печени крыс показывает, что в механизме токсического действия этих соединений основным эффектом является инициирование реакций свободнорадикального и перекисного окисления липидов и, возможно, белков. Особое место в этом процессе занимает окисление ТФ с образованием супероксид-радикала и ДФДС, обмен которого с GSH, поддерживает этот процесс, пока в системе имеется восстановленный глутатион. В окислении ТФ в эритроцитах вакную

роль играет оксигемоглобин (МишЗау, 1986), однако определенный вклад вносят и реакция окисления с участием переходных металлов и их комплексов, следовые количества которых всегда присутствуют в этих системах. Указанные реакции запускают процессы генерации и других активных форм кислорода, что приводит к образованию продуктов ГОЛ. Процессы СРО и перекисного окисления протекают интенсивней з эритроцитах, чем микросомах. Такта образом, действие ТФ является источником трех неблагоприятных эффектов в клетке:

1. Активизация процессов перекисного и СРО

2. Образование метгемоглобина

3. Истощение пула глутатиона

Первый процесс приводит к деградации липидного бислоя биомембраны и повышению её вязкостных свойств, что является причиной изменения Функций самой мембраны и активности изученных наш мембранных белков: К+,Ыа+-АТФазы (интегральный белок) и Р-адренорецепторов (периферический белок).

Влияние второго фактора - образование метгемоглобина и продуктов глубокого окисления гемоглобина очевидно и детально рассмотрено в работах Мшйау.

Истощение пула глутатиона в эритроцитах и микросомах печени приводит к нарушению функций всех глутатионзависимых ферментов, цитохрома Р-4БО в микросомах и повышении чувствительности этих систем к перекисному окислению. Известно, что система СЗН-СББО служит буфером, защищая эритроциты от деструктивного действия окислителей. СБН может, восстанавливать дисульфидные связи, образованные в белках внешней мембраны эритроцитов при "окислительных стрессах". Кроме того, С8Н обеспечивает защиту эритроцитов от повреждающего действия гемолитиков и метгемоглобинооб-разов&телей, регулируя уровень эндогенной Нг02. активируя мет-гемоглобивредуктазу. Глутатиоп как антиоксидант защищает от окислительного повреждения К+,Ка+-АТФазу, в активности которой важную роль играет БН-группа. Как известно, "выключение" К+,Ыа+-помпы приводит.к нарушению функций и даже структуры эритроцита.

Другим аспектом токсического действия ароматических тиолов «ваяется вызываемое ими изменение активности р-адренорецепто-ров. Модификация их функции.и торможение активности

К1, .^-АТФазы эритроцитов приводят к наруаени» транспортных Функций эритроцитов, снижению деформируемости и, наконец, нару-кенил ионного гомаэотаза, следствием чего в конечном итоге может Сыть осмотически! лизис клеток.

"эким образом, токсическое действие ТФ является многоплановым и характеризуется ыетзбо.шческиии »следствиям! активации СР и ПО, прощения пула йБН, торможения функции Иа4',К+-АТФ?зц и изменения активности гэ-адренорецепторов.

Повреждающее действие ароматических тколов и дисульфидов на микросомы свидетельствует о структурных изменениях в ЭПР клеток печени. Эхо означает, что повреждение мембранного аппарата ЭПР под действием ароматических тиолов может стать причиной подав- ■ ления детоксишрующей функции печени по отношении к другим ксе-нобкотккам и эндогенной синтетической функции соответствуй®!* ферментов.

Протектиэное действие ■ соединений имидазола на эритроциты и макросами печени связано, как следует из наших данных, прежде всего, с их антирадикальной и антиперекисной активностью. АОА . имидазолов реализуется, вероятно, нескольким путями. Во-первых, хорошо известен факт образования производными имидазола комплексов, в ряде случаев хелатных (ЭГ>, с ионами переходных металлов. Удаление из гидрофобной зоны мембран, в первую очередь ионов железа и меда, являющихся катализаторам СРО, снижает возможность инициирования свободно-радикальных процессов. Во-вторых, имидазолсодерасащие соединения могут выступать в роли ловушек синглетного кислорода (102), гидроксильных радшглов

(НО*) и супероксшдаых анион-радикалов ('£). В третьих; производные имидазола являются синергистеми «-токоферола. Предполагают наличие редуктэзы, при участии которой имвдазолсодераащие соединения восстанавливают токофгрилхиясн, накапливающийся в процессе СРО, обратно в токоферол, осуществляя тем самым регенерат» витамина Е.-Облако защитное действие имидЗзольных' производных более многоплановое. Так известно, что ишдазолсодер-жапие соединения активируют один из ферментов гликшигичоского метаболизма глюкозы - глицерэльдегцдфосфатдегидрогеназу (Северин С.Е.,1964). Поскольку глжслиз является единствеишп источником АТФ в эритроците, есть все основания считать, что активация указанного фермента является важным компонентам защитного

действия имидазолов на активность АТФазы эритроцитов.

Имидазольные производные, лревде всего ДБ и ЭТ, являются эффективными модуляторами аденилатциклазной системы. ДБ ингиСиру-ет ФДЭ, а ЭТ кроме того активирует аденилатциклазу, что приводит к накоплению в эритроцитах ЦАМФ. Это может компенсировать ослабление Функции íi-адренорецепторов под действием ароматических дисульфидов.

Использование имидазолсодержащих соединений, в частности офи-цинальных препаратов ЭТ1 и ДБ является перспективным в целях предотвращения повреждающего действия токсических ароматических тиолов и дисульфидов на мембранный аппарат эритроцитов и эндо-плазматического ретикулума*клеток.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что 'лекарственные препараты ЭТ, ДБ и другие фенилпроизводные бензимидазола обладают антиоксидантными свойствами как in vitro, так и In vivo. Концентрационная зависимость антиоксидантной активности имидазолов не является монотонной и характеризуется понижением активности при 2,0-ICf'M и повышением при 1,0-10"" и 2,0-10"4М.

2. Показано, что низкие концентрации 'T.Q-IoAl) производных .имидазола повышают, а высокие (1,0-10~4М) понижают активность Na+,K+-AT®a3H интактных эритроцитов. Изменение активности фермента обнаруживает отрицательную корреляцию с микровязкостью мембран эритроцитов, определенную методом флюоресцентных 'зондов. •

3. Обнаружен различный характер влияния ЭТ, ДБ и других производных имидазола на активность уабаинрезистёнтной и уабаин-чувствительной форм АТФазы. ДБ и Д-I ингибируют уабаинчувстви-тельную, и активируют уабашфезистентную формы фермента.

4. Показано, что ЭГ и ДБ повышают сродство ^-адренорецепто-ров штактных эритроцитов к действию антагониста продранолола.

5. Обнаружено защитное мембраностабилизируюцее и антиокси-дантнов'действие ЭТ, ДБ и других производных имидазола на ли-пидный бислой мембран эритроцитов и микросом печени крыс при токсическом воздействии ароматических тиолов.

' 6. ПоказайЬ, что препараты ЭТ и ДБ проявляют защитное дейст виё в отношении мембранозависимых белков и ферментов - АТФазы а Р-адренорецепторов эритроцитов при воздействии ароматических

тиолов. Сохранение активности АТФазы как в опытах In vivo, так ■и In vitro связано с увеличением доли активности уабаинрезис-тентной АТФазн.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1) К вопросу о механизме антиоксидантного действия ппроизвод-ных имидазолз. // Сб.: Биоантиоксидант. М..1993.-Т.I.-С.45-46 (соавторы В.А.Дадали.Р.Н.Павлова).

2) Мембранная активность этимизола и дибазола при токсическом воздействии дафениддисульфида.//» Сб. Актуальные вопросы профилактической и клинической медицины.-СПб., I994-C754-55 (соавтор Соколова Е.А.)

3) Концентрационная зависимость действия этимизола и дибазола на уровень перекисного окисления и активности АТФаз в меабранах и их моделях. // СО. "Механизмы действия сверхмалых доз".-М., 1995. - С. 102-103. (соавторы Дадали В.А., Масевич Ц.Г., Павлова Р.Н.)

Подписано в печать 2.-1,0 5 96. Заказ №19 . Тираж • 50 экз. Формат бумаги 60x84/16. Усл. печ. л. 0,75. Цена договорная.

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47

Типография ТОО' "Доверие1