Идентификация и исследование функций НАДН-зависимой редуктазы внешних отделов митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков

Никифорова, Анна Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и исследование функций НАДН-зависимой редуктазы внешних отделов митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и исследование функций НАДН-зависимой редуктазы внешних отделов митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков"

На правах рукописи

Никифорова Анна Борисовна

Идентификация и исследование функций НАДН-зависимой редуктазы внешних отделов митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 АПР 2015

Пущино - 2015

005568035

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Круглое Алексей Георгиевич

Официальные оппоненты: Ягужинскии Лев Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, заведующий отделом биоэнергетики

Дерябина Юлия Ивановна,

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук,

заведующая лабораторией экологической и эволюционной биохимии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук

Зашита состоится «24» июня 2015 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН) по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://w\vw.ibbp.psn.ru/)

Автореферат диссертации разослан «_» апреля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Назарова

Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ксенобиотики и многие лекарственные препараты, попадая в организм, кроме прямого лечебного воздействия оказывают повреждающие эффекты на клетки. Механизмы побочного действия не всегда понятны. Известно, что лекарственные препараты (например, противоопухолевые доксорубицин, даунорубицин, митомицин С, противовоспалительный нитрофурантоин, аналог витамина К - менадион) могут восстанавливаться в клетке различными цитозольными НАДН оксидоредуктазами, а также НАДН оксидоредуктазами внешней и внутренней мембраны митохондрий (Kruglov A.G., 2008). Восстановленные ксенобиотики способны вызывать окислительный стресс, повреждение ДНК и, как следствие, апоптоз или некроз (Vasquez-Vivar J., 1996). По данным ряда авторов, мощный кардио- и нефротоксический эффект некоторых групп противоопухолевых препаратов связан с не идентифицированной тканеспецифичной ротенон-чувствительной НАДН оксидоредуктазой внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, способной окислять цитозольный НАДН и активировать препараты, которые, в свою очередь, повреждают ДНК кардиомиоцитов (Nohl Н., 1996). Кроме того, высказывались предположения, что ответственными за восстановление ксенобиотиков митохондриями могут быть белки VDAC 1, AIF или неизвестная НАДН оксидоредуктаза внешней мембраны митохондрий (Baker М. А., 2004; Miseviciene L., 2011). Однако природа НАДН-зависимой редуктазы ксенобиотиков внешних отделов митохондрий в настоящее время не установлена, а ее свойства и биологическая роль не изучены.

Таким образом, снижение побочных эффектов лекарственных препаратов невозможно без выяснения механизмов их активации в клетках. В связи с этим идентификация НАДН оксидоредуктаз митохондрий, ответственных за восстановление ксенобиотиков, и поиск модуляторов их активности являются актуальной задачей.

Цели и задачи исследования

Цель работы состояла в идентификации НАДН-зависимой редуктазы, ответственной за активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий, и в изучении ее роли в индукции Са-зависимой митохондриальной поры (тРТР).

Основные задачи исследования:

• Разработать методы оценки активности НАД(Ф)Н оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий;

• Изучить способность НАДН оксидоредуктазы внешних отделов митохондрий продуцировать активные формы кислорода (АФК) и индуцировать тРТР в присутствии ксенобиотиков;

• Идентифицировать природу НАДН-зависимой редуктазы редокс-активных соединений и ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий.

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые показано, что основной НАДН-зависимой редуктазой ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий является цитохром 65 редуктаза (СубЖЗ), а не УЭАС 1, ротенон-чувствительная хинон редуктаза или А1Б. Показано, что за счет цитозольного НАДН СуйзЯЗ эффективно восстанавливает редокс-активные ксенобиотики, если их стандартный редокс-потенциал > - 270 мВ (например, люцигенин, менадион, нитрофурантоин). Показано, что радикалы ксенобиотиков способны увеличивать продукцию АФК и непосредственно индуцировать шРТР. Продемонстрирована способность известных ингибиторов СуАзКЗ подавлять окисление НАДН, восстановление ксенобиотиков и продукцию АФК митохондриями.

Предложен метод оценки активности НАД(Ф)Н оксидоредуктаз в различных объектах (гомогенаты, суспензии органелл, культуры клеток, срезы тканей), который позволяет определять локализацию ферментов. Метод позволяет оценивать активность широкого ряда НАД(Ф)Н оксидоредуктаз при использовании специфических ингибиторов, субстратов и маркеров внутриклеточных структур.

Впервые выявлены факторы, лимитирующие применимость широко используемого метода регистрации супероксид-аниона с помощью хемилюминесцентного зонда МСЬА. Впервые показана способность серосодержащих соединений «тушить» хемилюминесценцию МСЬА за счет их взаимодействия с окисленной формой зонда.

Научно-практическая значимость работы

Настоящее исследование внесло вклад в понимание механизмов активации ксенобиотиков в клетке. Выявление основной НАДН-зависимой редуктазы ксенобиотиков внешних отделов митохондрий позволяет очертить круг ее потенциальных акцепторов и ингибиторов. В целом, результаты могут применяться в фармакологии для разработки и подбора медикаментов, снижающих побочные действия лекарственных препаратов.

В работе предложен быстрый метод оценки активности и локализации НАД(Ф)Н оксидоредуктаз, который может быть легко адаптирован для широкого круга биологических и медицинских задач. Метод подходит для оценки активности оксидоредуктаз плазматической мембраны, цитоплазмы и внутриклеточных органелл (СубЛЗ, цитохром Р450 редуктаза, белки семейства ЫОХ и многие другие). Метод применим для исследования различных биологических объектов: гомогенаты, изолированные органеллы, клетки, срезы тканей.

Метод регистрации супероксид-аниона с помощью хемилюминесцентного красителя MCLA становится все более популярен у исследователей. В ходе работы обнаружено, что соединения, содержащие двухвалентную серу, способны взаимодействовать с окисленной формой MCLA и снижать люминесценцию, не оказывая влияния на уровень супероксид-аниона. Этот эффект нужно учитывать при всех исследованиях с помощью MCLA.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на конференциях: «Экспериментальная и теоретическая биофизика» г. Пущино 2011, 2012, 2013, 2014гг., «Молодёжная наука и современность» г. Курск 2011г., VII Сибирский Съезд Физиологов, г. Красноярск 2012г., 3rd World Congress on Targeting Mitochondria, r. Берлин 2012г., «Симбиоз-Россия 2013» г. Иркутск 2013г. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, включенных в список ВАК.

Crpyicrypa и объем диссертации.

Диссертационная работа содержит введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 37 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 267 источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работу проводили на культурах клеток (НЕр-2, HL 60, Colo 320 HSR, U251MG), выделенных макрофагах и нейтрофилах, гомогенатах печени и почек, интактных митохондриях и срезах тканей.

Нейтрофилы выделяли из крови крыс с применением сочетания гипотонической обработки и центрифугирования в градиенте фекол-урографин (Siemsen D.W., 2007).

Макрофаги выделяли из брюшной полости крыс после их активации путем инъекции зимозана (Zhang X., 2008).

Кардиомиоциты выделяли из сердец крыс путем разрушения ткани проназой и коллагеназой (Yang B.C., 1999).

Гомогеиаты печени н почек получали путем измельчения ткани в изотонической сахарозно-маннитольной среде с последующей очисткой от ядер центрифугированием (8 мин * 600g).

Митохондрии (rat liver mitochondria, RLM) выделяли из печени самцов крыс стандартным методом дифференциального центрифугирования (Johnson, 1967). Повреждение внешней митохондриальной мембраны моделировали аламетицином.

Оценку количества повреждённых митохондрий проводили путем сравнивания скорости восстановления, добавленного цитохрома с с условно интактными митохондриями и полностью пермеабилизованными.

Количество белка в полученных препаратах митохондрий и гомогенатов определяли биуретовым методом (Walker J., 1994).

Срезы мозга крыс толщиной 150 мкм делали перпендикулярные оси головного мозга с помощью вибротома Leica VT1200S (Leica).

Уровень супероксид-аниона измеряли по СОД-зависимой хемилюминесценции высокоселективного и чувствительного зонда 2-метил-6-(р-метоксифенил) -3,7-дигидроксиимидазол [1,2-а]пиразин-3-он (MCLA) в концентрации 10-20 цМ (Kambayashi Y., 2003).

Скорость продукции гидропероксида измеряли флуоресцентными зондами 2',7'-дихрорфлуоресцеин диацетатом (DCFDA) (LeBel С. Р., 1990) и Amplex Red (Perschke Н., 1961) по накоплению флуоресцирующих продуктов.

Набухание митохондрий определяли по светорассеянию с помощью прибора Сагу 100 Scan spectrophotometer (Varian Australia Piy LTD, Australia) при длине волны 540 нм.

Для регистрации потребления кислорода, изменения трансмембранного потенциала митохондрий использовали термостатируемую ячейку со встроенным ионоселективным электродом (ТРР+) и электродом Кларка для измерения кислорода в среде (Teplova V. V., 2005).

Окисление добавленного НАДН регистрировали по интенсивности флуоресценции (Ex 340/Ет 460^480 нм), а также по уменьшению абсорбции при длине волны 340 нм.

Восстановление эндогенного и экзогенного цитохрома с регистрировали по увеличению абсорбции при длине волны 550 нм относительно таковой при 540 нм. Для оценки степени восстановленное™ цитохрома bs измеряли абсорбцию при 559 и 575 нм соответственно (Nikiforova А. В., 2014).

Восстановление люцигенина регистрировали по уменьшению абсорбции при длине волны 368 нм и по накоплению флуоресцентного восстановленного продукта ДБА (Ех 488нм/Еш 513нм).

Флуоресцентная микроскопия использовалась для оценки клеточных культур и срезов мозга, применяли конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 (Leica, Германия).

Статистическая обработка

Результаты исследований представлены в виде среднего ± ш, где m - стандартная ошибка среднего. Достоверность отличия выборок экспериментальных данных, а также средних значений, оценивали с помощью критерия Уилкоксона для выборок с

попарно связанными вариантами либо критерия Уитни-Манна для независимых выборок. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторах (п>3).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Разработка методов оценки активности НАДН-завнсимых редуктаз, ответственных за восстановление ксенобнотнков во внешних отделах митохондрий

Для измерения НАДН оксидоредуктазной активности существует три принципиальных возможности: 1) регистрация окисления доноров электронов (НАДН), 2) регистрация восстановления акцепторов и 3) регистрация образования АФК, если акцептор способен автоокисляться. Каждый подход имеет свои особенности и ограничения. Поэтому мы исследовали применимость данных подходов для изучения активности редуктаз ксенобиотиков внешних отделов митохондрий в различных биологических системах.

Обычно оценку активности НАДН оксидоредуктаз проводят по окислению НАДН флуориметрическим или спектрофотометрическим методами. Однако спектры поглощения НАДН перекрываются со спектрами различных акцепторов и ингибиторов, использованных в работе. Повреждение митохондрий восстановленными акцепторами вызывало набухание митохондрий и окисление эндогенного НАДН, что искажало результаты эксперимента. Кроме того, флуоресцентные характеристики НАДН и некоторых акцепторов не аддитивно менялись при смешивании. Поэтому спектральные методы регистрации окисления НАДН не могут быть основными методами регистрации НАДН оксидоредуктазной активности, поэтому, возникла необходимость разработки нового метода.

1.1. Разработка метода определения активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по восстановлению люцнгенина до диметнлбиакрндена (ДБА)

Разработка метода для изолированных митохондрий. Для оценки активности НАДН оксидоредуктаз с помощью акцептора необходимо подобрать соединение. Основные требования к акцептору - это, во-первых, резкое различие измеряемых характеристик окисленной и восстановленной форм. Во-вторых, акцептор должен быть специфичным по отношению к НАДН оксидоредуктазам внешних отделов митохондрий или его свойства должны позволять вычленять сигнал этих систем из общего сигнала митохондрий и клеток. В-третьих, метод регистрации восстановленного акцептора не должен «конфликтовать» со способами оценки других митохондриальных показателей.

В нашей работе мы применили люцигенин в качестве акцептора НАДН оксидоредуктаз. Как показано на рис. 1А, инкубация митохондриальной суспензии в течение 30 мин в стандартной среде, содержащей Ant А (1 мкг/мл), НАДН, Люц и

NaCN, приводила к тому, что интенсивность флуоресценции (500-560 им) при возбуждении при 430 и 488 нм возрастала в ~ 4-5 и 50 раз соответственно (кривые 2, 2а и 3, За). Максимум эмиссии смещался с ~505нм к 511-513 нм. В спектре возбуждения (кривая 1а) (эмиссия 520 нм) появлялся пик при длине волны> 450 нм. Эти изменения свидетельствуют о накоплении в митохондриальной суспензии продукта двухэлектронного восстановления Люц водонерастворимого флуоресцирующего диметилбиакридена (ДБА). В отсутствие НАДН накопления ДБА не происходило (не показано).

Важно, что добавление цианида к гомогенату печени, инкубируемому в стандартной среде, содержащей Ant А (1 мкг/мл), НАДН и Люц (рис. 1Б, кривая 2), приводило к резкому ускорению снижения концентрации Люц (Азбв) в среде. Этот эффект в дальнейшем позволил разработать специфичный метод определения активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий.

ц 1500

4 мин

350 400 450 500 НМ

550 600 650

Рис. 1. Накопление ДБА (А) н снижение концентрации люцигеннна (Б) в ЛЬМ, вызванное добавлением 1 мМ А. Спектры возбуждения (1, 1а) и эмиссии (2, 2а и 3,

За) митохондриальных суспензий сразу после добавления цианида (1-3) и через 30 мин инкубации (1а-3а) в среде с Лп(А и НАДН. Б. Люцигенин (Люц2+), митохондрии (ЯЬМ).

Поскольку Люц близок по структуре к флавинам, его восстановление в митохондриях и клетках может осуществляться различными оксидоредуктазами. Чтобы решить проблему селективности, мы исследовали вклад различных НАДН оксидоредуктаз митохондрий и клеток в образование ДБА в различных условиях.

Сравнивая НАДН-зависимое восстановление люцигенина до ДБА в интактных и пермеабилизованных аламетицином митохондриях, а также используя ингибиторы комплекса I дыхательной цепи (ДЦ) ротенон и МРР+, мы установили, что скорость восстановления люцигенина НАДН дегидрогеназами матрикса и внутренней мембраны составляет не более 30% от скорости восстановления во внешних отделах. Следовательно, в интактных митохондриях эта скорость близка к нулю.

Исследование вклада оксидоредуктаз микросом и цитозоля в образование ДБА (Таблица 1) показало, что они способны восстанавливать люцигенин до ДБА, однако

цианид не оказывает влияния на это восстановление. В Таблице 1 представлены данные по накоплению ДБА в различных препаратах митохондрий (гомогенат, грубая цитозольная фракция (Микросомьп), микросомальная фракция (Микросомыг), грубая митохондриальная фракция (RLMo) и RLM отмытых 1 и 3 раза (RLM1.3)) в присутствии или отсутствии НАДН и ингибиторов дыхательной цепи. Как видно из данных таблицы, в отсутствии НАДН накопление ДБА в суспензиях, содержащих активные по дыханию RLM (Люц) и RLM с блокированной дыхательной цепью (Люц+AntA+NaCN) было минимальным во всех препаратах. НАДН-зависимое накопление ДБА в микросомальной фракции в присутствии одного Ant А и Ant А в комбинации с NaCN было практически одинаковым. Во фракциях RLM накопление ДБА в присутствии обоих ингибиторов было существенно выше, чем в присутствии одного Ant А, и доля Ant А-зависимого накопления ДБА снижалась с повышением степени очистки митохондриального препарата. В RLM3, содержащих лишь незначительное количество микросом, она составляло около 10% от накопления в присутствии обоих ингибиторов. Пересчет накопления ДБА на количество белка во фракциях показал, что митохондрии вносят основной вклад в двухэлектронное восстановление Люц (см. табл. 1). Полученные данные показывают, что цианид достаточно специфично активирует продукцию ДБА НАДН оксидоредуктазой внешних отделов митохондрий, но не другими оксидоредуктазами. Механизм активации связан с блокированием одноэлектронного окисления катион-радикала Люц цитохром с оксидазой.

Таблица 1. Накопление ДБА в препаратах митохондрий в различных условиях инкубации

Условия инкубации Накопление ДБА, % (УЕ/мг белка/ч)

Гомогенат Микросомьп Микросомы: RLMo RLMi RLM3

Люц 0.62 ±0.91 0.56 ±0.25 1.16±3.6 0.67 ± 0.32 1.84 ± 1.56 0.64 ±0.15

+AntA+NaCN ND 0.4 ± 0.08 ND ND ND 0.7 ±0.12

+АтА+НАДН 29.4 ± 6.0 22.0 ± 7.3 102 ± 17 44 ± 12.5 29.3 ±4.8 11.6 ±0.7

+AntA+NaCN +НАДН 100 (317 ± 57) 100 (178 ±23) 100 (30.6 ±8) 100 (730 ± 74) 100 (751 ±65) 100 (789 ±45)

Примечания: УЕ - условные единицы флуоресценции. 100% увеличение флуоресценции соответствует числу УЕ/мг белка/ч в скобках;

Механизмы восстановления люцигенина в клетке могут быть представлены схемой на рис. 2.

Рис. 2. Схема возможных механизмов образования ДВА через восстановление люцигенина различными НАД(Ф)Н оксидоредуктазами клеточных компартментов.

Luc2+ - люцигенин, Luc2* - катион радикал люцигенина, ДБА - диметилбиакриден, NOR -НАД(Ф)Н оксидоредуктазы, ё - электрон, I, III, IV -комплексы дыхательной цепи, с2+ и с3+ ферро- и феррицитохром с, соответственно, АФК-активные формы кислорода, AntA -антимицин A, CN - NaCN.

Таким образом, использование люцигенина в качестве акцептора НАДН оксидоредуктазы внешней мембраны митохондрий в присутствии антимицина А и цианида позволяет оценивать активность НАДН оксидоредуктазы внешней мембраны митохондрий в выделенных интактных митохондриях и гомогенатах.

Разработка метода для пермеабилизоеанных клеток. В работе исследовали

применимость разработанного способа для оценки активности НАДН оксидоредуктаз

внешних мембран митохондрий в пермеабилизоеанных и интактных клетках.

Использование Люц и ингибиторов ДЦ позволяет оценить вклад не только НАДН

оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий, но и других систем двухэлектронного

восстановления Люц в интактных и пермеабилизоеанных клетках. На рис. ЗА

приведены характерные кривые распределения пермеабилизованных клеток НЕр-2 по

интенсивности флуоресценции ДБА (Ех 488/Еш 510-560 nm) (FL1 проточного

флуориметра) при добавлении НАДН и указанных ингибиторов. На рис. ЗБ показаны

данные по люцигенин-редуктазной активности различных оксидоредуктаз в клетках

линий HL 60, Colo 320 HSR, НЕр-2 и U251 MG. Расчет активности проводили по

медианам распределения клеток. Количество ДБА, произведенного НАДН

оксидоредуктазой ОММ, определяли по разности между общим количеством

накопленного ДБА (Люц+АгИА+СМ+НАДН) и ДБА, произведенного

микросомальными и цитозольными оксидоредуктазами (Люц+АтА+НАДН).

Продукция ДБА в отсутствие НАДН отражает активность дыхательной цепи RLM с

высоким ДЧ'т (Люц) или активность цитозольных НАДН-независимых систем

(Люц+AntA+CN). Полученные данные могут быть использованы для исследования

роли НАДН оксидоредуктазы внешних отделов митохондрий в различных физиологических и патологических процессах, а также для оценки вклада этой системы в цитотоксический эффект некоторых ксенобиотиков. Метод может применяться для оценки НАДН оксидоредуктаз цитозоля и микросом в клетках.

Рис 3. Стандартные кривые распределения клеток НЕр-2 по флуоресценции ДБА (А) и данные по Люц-редуктазной активности клеточных оксидоредуктаз в различных клеточных линиях (Б). А. Образцы инкубировали с Люц (+Люц), Ant А (АА), НАДН и NaCN (CN). Б. Люц-редуктазная активность дыхательной цепи (ДЦ), НАДН-зависимых цитозольных ферментов (НАДН-цитозоль) и НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий (НАДН-ОММ), НАДН- и НАДФН-независимые системы (НАД(Ф)Н-незав) оценивали, как описано в тексте.

Анализ локализации продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии. Использование Люц в качестве акцептора с добавлением внутриклеточных маркеров позволяет не только определить активность НАДН оксидоредуктаз, но и их локализацию в клетке. На рис. 4 представлены микрофотографии флуоресценции пермеабилизованных клеток НЕр-2, обработанных митотрекером красным (MTR. митохондриальный маркер) и люцигенином в присутствии НАДН, NaCN и Ant А. Видно, что НАДН оксидоредуктазная активность локализуется в митохондриях.

Таким образом, использование специфических маркеров клеточных органелл позволяет с помощью представленного метода определить локализацию НАДН оксидоредуктазной активности в клетках.

ДБА MTR Совмещение

J. -j> -.

Л - -ч ' % * n.

Рис. 4. Визуализация активности НАДН оксидоредуктаз в пермеабилизованных клетках линии НЕр-2.

Применение разработанного метода для изучения НАДН оксидоредуктазной активности в клетках на срезах мозга. Описанный выше метод позволяет определять активность НАДН оксидоредуктаз на срезах мозга и других тканях, оценить гетерогенность НАДН оксидоредуктазной активности в тканях. Оксидоредуктазная активность была рассмотрена на срезах гиппокампа, пермеабилизованных дигитонином, проинкубированных с Люц, НАДН и MTR. Как следует из рис. 5, САЗ-пирамидальные нейроны отличаются от окружающих клеток и структур яркой флуоресценцией ДБА, что говорит о высокой активности НАДН оксидоредуктаз. Таким образом, НАДН-зависимое восстановление Люц до флуоресцентного ДБА является удобным экспресс-методом для анализа и определения локализации НАДН оксидоредуктазной активности на срезах тканей.

ДБА MTR Совмещение

i ^ -к Л \ ФТ

■ " * ' ' ' - .. - г •• ;Ч ' — ~ а* - • ■ - - ' У. - х ... j •;■'•, f. -- "V „ Â

Рие. 5. Визуализация участков с высокой НАДН оксидоредуктазной активностью на срезах гиппокампа мозга крысы пермеабилизованных дигитонином.

Применение разработанного метода для анализа активности НАДФН оксидаз фагоцитов (N0X2) и клеток почек (NOX4). Мы изучили применимость разработанного метода для анализа активности различных НАДФН оксидаз семейства NOX. Активность измеряли в фагоцитирующих клетках и почечной ткани, для которых характерна высокая экспрессия NOX2 и NOX4 (RenOx) соответственно. Важно, что NOX4 активна в виде гетеродимера с p22pliox, тогда как NOX2 для активации требует ассоциации с p22phox, p67phox, p47phox, p40phox и Rae. Нами обнаружено, что образование ДБА в гомогенатах почек коррелирует с активностью NOX4 и подавляется ее специфическими ингибиторами (не показано). Напротив, как показано на рис. 6, повышение оксидазной активности NOX2 (образование Ог"*, MCLA) коррелирует со снижением продукции ДБА. По-видимому, это связано с ограниченной проницаемостью Люц к центру связывания собранного комплекса активной NOX2. Следовательно, по накоплению ДБА можно судить о соотношении активной/неактивной NOX2 в фагоцитах.

стимуляция зимозаном 3

Control РМА1 РМА2 РМДЗ РМА4 РМА5

время, МИН

Рис 6. Эффект ингибиторов NOX на продукцию супероксид-аниона (А,) и образование ДБА (Б) в макрофагах. А Стрелки с цифрами означают точки взятия клеток для оценки накопления в них ДБА (результаты на панели Б). Активатор N0X2- форбол 12-миристат13 ацетат (РМА). Люминесценцию и флуоресценцию (Ex/Em 485/525 нм) измеряли при 37°С.

Таким образом, разработан метод, который позволяет оценивать активность

разнообразных НАД(Ф)Н оксидоредуктаз в различных системах: гомогенатах тканей, выделенных митохондриях, в живых и пермеабилизованных клетках, а также в срезах тканей. Использование специфических ингибиторов редуктаз и флуоресцентных маркеров клеточных компартментов позволяет определить местоположение НАД(Ф)Н оксидоредуктазной активности и связать ее с известными ферментами.

1.2. Серосодержащие соединення препятствуют измерению уровня Ог*" с помощью MCLA

Активность НАДН оксидоредуктаз можно измерять по генерации О2*" автоокисляющимися акцепторами в присутствии MCLA. Однако нами было обнаружено, что хемилюминесценция MCLA подавляется серосодержащими соединениями, что может быть не связано с их антиоксидантными свойствами. Этот

момент принципиален для работы, так как в числе исследуемых соединений (акцепторов и предполагаемых ингибиторов НАДН оксидоредуктазной системы) многие содержат серу. Поэтому было проведено детальное исследование влияния серосодержащих соединений на хемилюминесценцию МСЬА для правильной интерпретации получаемых результатов.

Мы предположили, что серосодержащие соединения способны подавлять хемилюминесценцию МСЬА не за счет реакции с 02*" (не как антиоксидант), а за счет реакции с окси-МСЬА, который является возбужденным продуктом окисления МСЬА супероксид-анионом.

Рис. 7. Амплитуды н кинетики хемилюминесценции MCLA в системе ксантин/ксантиноксидазы в присутствии СОД и изохинолинов. Стандартная среда инкубации содержала 3 рМ MCLA, 300 рМ ксантина, ксантиноксидазу (0,16 ед./мл) и (где указано) 20 рМ IQ1, 500 рМ IQ2, 20 рМ IQ3, 125 рМ IQ4, и СОД (50 ед/мл).

Для проверки этого предположения мы изучили эффект известного скавенджера 02*", супероксиддисмутазы (СОД) и нескольких синтетических изохинолинов пиримидина (рис. 7) на уровень и кинетику хемилюминесценции MCLA в системе ксантин/ксантиноксидазы. Пиримидиновые изохинолины отличаются друг от друга наличием в положении R1 атома серы или атома кислорода. В IQ3 и IQ4 содержатся фенил-гидроксильные группы (R2 и R3), которые позволяют проявлять антиоксидантные свойства. В IQ1 и IQ2 эти группы были метилированы для подавления антиоксидантных свойств. Такой набор пиримидиновых изохинолинов помогает отличить подавление хемилюминесценции MCLA за счет антиоксидантного эффекта (реакция с 02*~) от реакции с окси-MCLA (эффект тушения) (рис. 7). Мы также проверили эффект некоторых серосодержащих соединений, используемых в биохимии, клеточной биологии и в нашей работе (Таблица 2).

Хемилюминесценция MCLA появляется при переходе окси-MCLA из возбужденного состояния в основное. Очевидно, что и истинные антиоксиданты,

Время, мин

которые реагируют с супероксид-анионом, и «тушители», которые реагируют с возбужденным окси-МСЬА, будут уменьшать уровень хемилюминесценции МСЬА. При этом общее количество испускаемых квантов (интеграл хемилюминесценции) в присутствии истинных антиоксидантов не изменяется, так как антиоксиданты, связывая супероксид-анион, уменьшают скорость окисления молекул МСЬА и лишь увеличивают продолжительность хемилюминесценции МСЬА в условиях значительного избытка Ог*" относительно количества МСЬА. И наоборот, «тушители» подавляют световое излучение окси-МСЬА, но не останавливают окисление МСЬА. Таким образом, интеграл хемилюминесценции МСЬА уменьшается (Нозака в., 2005).

В таблице 2 представлены концентрации соединений и СОД, вызывающие 50% и 90% уменьшения хемилюминесценции МСЬА (ЬвСзо и Ь8С%) в системе ксантин/ксантиноксидазы, и относительное изменение интеграла хемилюминесценции в присутствии соединений при ЬЗСзо (|ь5С5о) и ЬБСад (квсзд). Эффект соединений при концентрациях, вызывающих Ь8С5о на активность ксантиноксидазы (активность ХО), также показан.

Таблица 2. Эффект серосодержащих соединений на максимум и интеграл люминесценции МСЬА, а также на активность ксантиноксидазы.

Соединение LSC50 LSC90 J lsc50 J lsc90 Активность

(цМ/У.Е.) (рМ/ У.Е.) (%) (%) XO (%)

SOD 1,47 ±0,06 85,5 ± 12,5 104,7 ±3,5 98,4 ±4,2 101 ± 1,8

IQ1 4,13 ± 1,28 53,3 ±4,3 49,2 ±3,1 9,6 ± 2,3 95,4 ±2,2

IQ2 »1000 »1000 101 ±4,4* 101 ±4,4* -

IQ3 12,7 ± 1,4 69,2 ± 5,7 40,8 ± 4,3 12,4 ±3,2 98,6 ±4,3

1Q4 105 ±5,3 > 1000 81,6 ±7,2 <25 102 ±3,1

a-Lipoic acid 44,4 ± 4,8 603 ± 110 54,6 ± 5,0 13,8 ±3,7 99,1 ± 1,0

Dihydrolipoic acid 49,8 ± 4,2 1342±170 65,6 ±4,5 15,1 ±2,2 108 ±5,3

GSH 219 ± 22 2595 ± 92 63,9 ±3,3 21,9 ±3,6 89,9 ± 7,0

GSSG 2653 ±301 8135 ±290 102,7 ±4,8 49,1 ±5,5 96,5 ±6,7

A-Acctyl-I.-cysteine 1923 ±223 11115 ±1576 73,8 ± 6,2 - 97,3 ±2,4

DTNB 1542 ±230 >4500 52,3 ± 3,7 < 15 NM

Diazoxide >5000 »5000 99 ±5,2* 99 ± 5,2* -

DIDS 22,7 ± 5,0 320 ±36 51,1 ±2,8 10,6 ± 1.0 90 ± 4,5

Biotin 1623 ±258 5896 ±328 68,6 ± 4,8 - NM

PTU 7,8 ± 2,4 262 ± 67 50,4 ± 0,9 10,2 ± 1,3 98,7 ±4,8

Помимо пиримидиновых изохинолинов наиболее эффективно подавляли хемилюминесценцию МСЬА соединения, содержащие в своем составе тиокарбамоильную группу, РТи и ОШ8, а также тиолсодержащие соединения ц-[.А,

DHLA, и GSH. PTU, DIDS и тиолсодержащие вещества a-LA и DTNB проявляли свойства истинных «тушителей». GSH, DHLA, биотин и Ы-ацетил-Ь-цистеин подавляли хемилюминесценцию MCLA за счет «тушения» и, в меньшей степени, своих антиоксидантных свойств.

Представленные данные показывают, что при исследовании продукции Ог*" с помощью MCLA серосодержащие соединения могут оказаться «тушителями» зонда, а не антиоксидантами. Измерение уровня и интеграла хемилюминесценции MCLA в ксантин/ксантиноксидазной системе поможет отличить истинные антиоксиданты от «тушителей» люминесценции. Эти данные мы в дальнейшем учитывали при интерпретации результатов, полученных с применением MCLA.

2. НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохоидрий индуцируют тРТР путем восстановления ксенобитиков. Роль АФК и радикалов ксенобиотиков

Из данных литературы известно, что НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохондрий в присутствии некоторых ксенобиотиков и НАДН способна продуцировать АФК с высокой скоростью. Известно также, что АФК являются индуктором тРТР. Мы изучили эффект ряда ксенобиотиков и лекарственных препаратов на уровень АФК в митохондриях и скорость открывания тРТР.

На рис. 8 показана продукция супероксид-аниона и гидропероксида интактными митохондриями в присутствии ксенобиотиков с добавлением и без добавления НАДН. Видно, что в присутствии ксенобиотиков продукция Ог*" и пероксида многократно увеличивается при добавлении НАДН, и при этом только менадион способен инициировать значительную продукцию АФК без НАДН. Паракват, как и другие ксенобиотики со стандартным редокс-потенциалом < -300 мВ (арсеназо III, доксорубицин, даунорубицин (не показано)), активируется в основном внутренними дегидрогеназами, так как после добавления НАДН не увеличивается продукция ни Ог*", ни гидропероксида. На рис. 9 показано открытие тРТР (набухание митохондрий) в присутствии внешнего НАДН и ксенобиотиков. Установлено, что менадион сам вызывает открытие шРТР, а НАДН лишь незначительно усиливает эффект. Напротив, слабый собственный эффект люцигенина и нитрофурантоина (не показано) сильно усиливался в присутствии внешнего НАДН. Важно, что ферменты антиоксидантной системы и условия аноксии не предотвращали набухание митохондрий при добавлении ксенобиотиков и НАДН (рис. 9, панель Б).

Представленные в работе результаты указывают на то, что НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохондрий восстанавливает ксенобиотики до радикалов, причем последние не только усиливают продукцию АФК, но и индуцируют тРТР непосредственно. При этом АФК, образующиеся во внешних отделах, слабо влияют на формирование тРТР. Учитывая перенос электронов,

описанный на рис. 2, можно заключить, что цитохром с межмембранного пространства играет важную роль в предотвращении окислительного повреждения митохондрий посредством АФК и радикалов ксенобиотиков, генерируемых НАДН редуктазой внешних отделов митохондрий.

А ?

* 4x10

о 3x10!

S 2x10

Ш X S

I 1x105

-НАДН Менадион

Нитро Люц

- i > ■

< 3x10'

0 £

1 2x10'

Паракват « 1x1Q«

Концентрация акцептора, мкМ

+НАДН

Менадион Л.

' \ т

/ ^ /' Люц»

- ■

HtjTpo

Паракват

1 10 100 1000 Концентрация акцептора, мкМ

-НАДН Менадион.■'

К 8000

Люц

Параква£ <

+НАДН

* ■

Менадион/

Нитр|

Люц

1 10 100 1000 Концентрация акцептора, мкМ

Паракват

- --» »-.ij*

^Базовый уровень

1 10 100 1000 Концентрация акцептора, мкМ

Рис. 8. Продукция Оз'" (А и Б) и пероксида водорода (В и Г) НАДН оксндоредуктазой внешних отделов митохондрий и внутренними дегндрогеиазамн митохондрий в присутствии редокс-актнвных ксенобиотиков интактными митохондриями. Люцигенин (Люц), нитрофурантоин (Нитро).

Рис. 9. Эффект НАДН на набухание митохондрий в присутствии люцнгеннна и менаднона. Митохондрии (0,5 mg/ml) добавляли в стандартную среду инкубации,

содержащую 250 цМ НАДН, 5 тМ глутамат и 5 шМ малат, непосредственно перед началом измерения. Добавлены 100 цМ люцигенин (Люц), 25 цМ менадион (Мен), 250 цМ CaCh (положительный контроль индукции шРТР), СОД 30 U/мл, каталаза 100 U/мл. Представлены стандартные кривые одного из, как минимум, трех экспериментов.

Таким образом, НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохондрий в

присутствии ксенобиотиков со стандартным редокс-потенциалом более -270 мВ способна усиливать продукцию АФК и ускорять открывания шРТР посредством прямого действия радикалов ксенобиотиков на редокс-сенсоры шРТР.

3. Идентификация природы НАДН-зависимой редуктазы редокс-активных соединений и ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий

Согласно проведенным нами теоретическим исследованиям, на роль НАДН-зависимой оксидоредуктазы, ответственной за активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий, могут претендовать, в основном, три оксидоредуктазы: обсуждаемая в литературе ротенон-чувствительная НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохондрий кардиомиоцитов, потенциал-зависимый анионный канал (VDAC 1) и цитохром bs оксидоредуктаза изоформа 3 (Cy6jR3).

Проверка гипотезы о существовании ротенон-чувствительной НАДН оксидоредуктазной активности во внешних отделах митохондрий сердца. Тканеспецифичная НАДН оксидоредуктаза сердца способна по литературным данным окислять цитозольный НАДН и при этом многократно увеличивать потребление кислорода (Nohl Н., 1996). Мы проверили существование этой оксидоредуктазы с использованием щадящей модели — кардиомиоцитов, пермеабилизованных дигитонином. Согласно нашим данным, добавки НАДН и НАДФН не стимулировали потребление кислорода. Этот результат указывает на то, что описанная в литературе тканеспецифичная НАДН оксидоредуктаза внешних отделов сердечных митохондрий, по-видимому, является артефактом, связанным с процедурой выделения митохондрий из плотной ткани.

Зависимость НАДН оксидоредуктазной активности внешней мембраны

митохондрий от ионной силы раствора указывает на то, что эта активность

определяется CybsR3, но не VDAC1. Основными кандидатами на роль НАДН

оксидоредуктазы внешней мембраны митохондрий являются VDAC1 и CyfoR3.

Активность данных систем зависит от ионных взаимодействий. VDAC1 обладает

анионной специфичностью, это дает основание предполагать, что по мере увеличения

ионной силы (от 0 до нормальных значений в 150 мМ) будет увеличиваться доступ

катионных акцепторов к активным центрам VDAC1. Поэтому, если VDAC1 является

НАДН оксидоредуктазой, следует ожидать увеличения восстановления катионных

акцепторов с увеличением ионной силы среды. С другой стороны, ионные

взаимодействия важны для функционирования Cy6jR3, в частности, для связывания

НАДН и передачи гидрид-иона на ФАД, для формирования, полностью

восстановленного флавина (ФАДН-). Поэтому для CyfoR3 при увеличении ионной

силы следует ожидать ослабления взаимодействия катионных акцепторов с ферментом и снижение НАДН редуктазной активности. Как видно из представленных данных, восстановление нейтрального акцептора менадиона практически не зависело от ионной силы среды, восстановление анионного акцептора нитрофурантоина увеличивалось с увеличением ионной силы среды, а восстановление катионных акцепторов люцигенина и параквата значительно снижалось с увеличением ионной силы.

Ионная сила среды, мОсМ

Рис. 10. Эффект иониой силы раствора на уровень Ог*", генерируемого НАДН оксидоредуктазами внешних отделов митохондрий в присутствии катионных, анионных и нейтральных акцепторов.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что НАДН оксидоредуктазная активность внешней мембраны митохондрий определяется ферментом СубЛЗ, но не \Т)АС1.

Специфические антитела к СуЬ<;1{3 подавляют НАДН оксидоредуктазную активность во внешних отделах митохондрий. Мы исследовали влияние антител к УОАС (изоформам 1-3) и к СубЖЗ на Люц-зависимое окисление НАДН и продукцию Оз*", а также на НАДН-зависимое восстановление добавленного цитохрома с в суспензии интактных митохондрий.

Антитела к УЭАС имели аффинность к участку 185-197 аминокислотной последовательности, общему для всех изоформ. Антитела к СубЖЗ были двух

§ Окисление НАДН Продукция 02 Восстановление цит С 1 _25 цМ Люц_ 50 цМ СуЮ

1_100 цМ ЦАРН_,

Рис. 11. Эффект специфических антител к \Т) \С (изоформам 1-3) и к СуАзКЗ на НАДН оксидоредуктазную активность внешних отделов митохондрий.

типов: первые были афинны к Ы-концевому участку (остатки 1-60) (Н-60), вторые - к аминокислотной последовательности, расположенной в середине цепи (остатки 150200). Рис. 11 показывает, что только антитела к Ы-концевому эпитопу СубЛЗ существенно подавляли все измеряемые НАДН-зависимые активности. Относительно низкая эффективность антител к внутренним эпитопам Суб^-ИЗ, предположительно, может объясняться низкой доступностью данных участков.

Приведенные данные указывают на то, что НАДН оксидоредуктазная активность внешних отделов митохондрий определяется СубЖЗ, а не УОАС1. Характер действия ингибиторов СуЬ^ИЗ и блокаторов УОА С указывает, что НАДН оксидоредуктазная активность внешней мембраны митохондрий определяется СуЬ^ЯЗ, но не УОА СI. Рис. 12 демонстрирует эффекты блокаторов УОАС и ингибиторов Суб^ЯЗ на продукцию АФК НАДН оксидоредуктазой внешних отделов изолированных митохондрий в присутствии Люц и нитрофурантоина. Как видно из рис. 12, специфичные блокаторы УОАС 03139 и эрастин (отдельно или в комбинации) в концентрациях, достаточных для блокирования проницаемости УБАС, а также декстран, имели минимальный эффект на продукцию Ог*" (А, В) и гидропероксида (Б, Г) в присутствии Люц и нитрофурантоина. Напротив, ингибиторы СубзЯЗ (Эбселен. р,С1-меркурий бензоат. мерсалиловая кислота, РТЧ) сильно подавляли генерацию АФК. Среди блокаторов УОАС только ЭШ8 подавлял люцигенин-зависимую продукцию АФК, что ожидаемо, поскольку ОГО8 неселективный 8Н-агент.

Люц + НАДН

Интеграл люминесценции NICLA, усл. ед.

Quercetin 20 Ebselen 100 Ebselen 20 pCIMB 100 pCIMB 10 Mersalyl 100] PTU 4.51 Dextran 3001 DIDS 350] DIDS 100] G+E| Erastin 51 G313951 Control I

0 2 4 6 8 10 12 14 Продукция H202, нмол

Рис. 12. Эффект блокаторов VDAC 1 и ингибиторов СуШ на продукцию О2*" и гидроперокснда НАДН оксидоредуктазой внешних отделов митохондрий в присутствии люцигенина (Люц) или ннтрофурантонна (Нитро). Продукция Н2О2 митохондриями (0,4 мг. белка/мл) измерялась в течение 15 мин. с помощью Amplex Red. Обведены ингибиторы CyfoR3. Концентрации всех ингибиторов, кроме PTU, указаны в jiM, PTU - в мМ.

По многочисленным данным НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохондрий способна восстанавливать цитохром с. Эффект ингибиторов на НАДН-зависимое антимицин А-нечувствительное восстановление цитохрома с, представлено на рис.13.

Эбселен 100 Эбселен 20 Кверц 20 Мерсал 1000 Мерсал 200 pCIMB 400 pCIMB 200 pCIMB 100 PTU 18 PTU 9 PTU 4.5 DIDS 350 DIDS 100 Декстр 600 Декстр 300 G+Э Эрастин 5 G3139 5 G3139 1 НАДН

Скорость восстановления цитохрома с,

Рис. 13. Эффект блокаторов УОАС и ингибиторов Су^ИЗ на восстановление цитохрома с. Концентрации всех ингибиторов, кроме РТЫ, указаны в цМ, РТи - в мМ. <Ю + Э» - 5 цМ 03139 + 5 \хМ Эрастин. Скорость восстановления цитохрома с 172 ±19,6 нмол

цитохром с в минуту на мг белка соответствует 100%. Звездочки показывают, что для полного подавления потребовался инкубационный период.

Представленные результаты указывают, что G3139 и эрастин не имеют эффекта на восстановление иитохрома с, а ингибиторы Cy6jR3 эффективно подавляют НАДН-зависимое восстановление цитохрома с.

Полученные данные подтверждают определяющую роль CyfoR3 как основной НАДН редуктазы внешней мембраны митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков.

НАДН оксидоредуктазная активность внешней мембраны митохондрий не связана с VDAC1, поскольку блокаторы VDAC1 не влияют на окисление НАДН в присутствии акцепторов. Так как НАДН-связывающий сайт VDAC1 находится в просвете канала (Baker М.А., 2004), блокаторы VDAC1 должны ингибировать окисление НАДН, вызванное редокс-активными соединениями, если VDAC1 отвечает за этот процесс. Как показано на рис. 14, G3139 и эрастин в блокирующих концентрациях не способны ингибировать окисление НАДН в суспензии митохондрий в присутствии люцигенина и нитрофурантоина (ДЦ митохондрий была ингибирована антимицином А и миксотиазолом).

Таким образом, отсутствие ингибиторного эффекта комбинации G3139 и эрастина в концентрациях, соответствующих полной блокировке доступа субстратов и акцепторов к активному центру VDAC 1, говорит о том, что VDAC1 не участвует в восстановлении редокс-активных соединений.

Рис. 14. Эффект блокаторов УИАС (С 3139 и Эрастина (в+Э)) на окисление внешнего НАДН, обусловленное редокс-актнвными соединениями в суспензии митохондрий. Числа над кривыми — скорость окисления, добавленного НАДН (нмоль/мин). Представлены графики одного из трех независимых экспериментов.

Динамика окислительно-восстановительного состояния эндогенных

цитохромов в присутствии акцепторов, ингибиторов СуЬ^ЯЗ и блокаторов

УОАС1 указывает на участие СуЬ^ЯЗ в восстановлении ксенобиотиков. Мы

НАДН Нитрофурантоин

о ■ч-

о <

изучили динамику окислительно-восстановительного состояния эндогенных цитохромов (цитохрома Ьз внешней мембраны и цитохрома с межмембранного пространства) в процессе окисления внешнего НАДН и восстановления акцептора, для исследования механизма восстановления ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий, а также для определения фермента, отвечающего за этот процесс. Использовали нитрофурантоин, так как он не образует нерастворимые продукты, как люцигенин (рис. 15).

Как следует из рис. 15, добавление НАДН вызывало восстановление эндогенного цитохрома Ьз (панель А). Добавление нитрофурантоина вызывало быстрое СОД-нечувствительное восстановление цитохрома с. Эндогенные цитохром с и Ьз окислялись сразу после окисления НАДН.

Ингибиторы СубЖЗ (добавлены перед измерениями) оказывали различное влияние на редокс-состояние эндогенного цитохрома Ьз (панель Б): мерсалиловая кислота ускоряла окисление, рС1МВ и остальные ингибиторы (не показано) замедляют окисление цитохрома 6.5. Важно, что эффект ингибиторов на восстановление цитохромов Ьз и с был одинаковым. Следовательно, нитрофурантоин и цитохром 1>5 внешней мембраны митохондрий получают электроны из одного источника.

Специфичные блокаторы УЭАС1 - 03139 и эрастин не оказывали какого-либо эффекта на восстановление цитохрома Ьз или его нитрофурантоин-зависимое окисление. Уменьшение восстановления цитохрома с указывает, что УЭАС является главным путем через внешнюю мембрану митохондрий для радикалов редокс-активных соединений, генерируемых НАДН оксидоредуктазой внешних отделов митохондрий.

Время, мин. Время, мин.

Рис. 15. Эффект ингибиторов СубЖЗ и блокаторов У1)\С 1 на НАДН - и нитрофурантоин - зависимое изменение редокс-состояний внутренних цитохромов Ьз и

с. Нитрофурантоин (Нитро), мерсалиловая кислота (мерсал),рС1-меркурийбензоат (рСЬМБ).

Таким образом, представленные данные однозначно показывают, что УЭАС1 не участвует в восстановлении ксенобиотиков, а СубзЯЗ является основной НАДН—

зависимой редуктазой редокс-активных соединений во внешней мембране митохондрий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проделанной работы разработан метод регистрации активности НАДН оксидоредуктазы внешних отделов митохондрий, основанный на восстановлении люцигенина до водонерастворимого флуоресцирующего продукта ДВА. Продемонстрированы возможности данного метода на различных объектах и для других ферментных систем.

Впервые показана способность серосодержащих соединений «тушить» люминесценцию MCLA, что критично при исследовании продукции Ог*" в системах, включающих в себя серосодержащие соединения. Предложен способ, позволяющий оценить свойства веществ как антиоксидантов, и как «тушителей» хемилюмннесценции.

В работе протестированы способности ряда ксенобиотиков вызывать продукцию О2*" и формирование тРТР в митохондриях в присутствии НАДН. Среди исследуемых соединений, вещества со стандартным редокс-потенциалом более -270 мВ способны усиливать продукцию АФК и ускорять открывание тРТР посредством прямого действия радикалов ксенобиотиков на редокс-сенсоры шРТР.

В данной работе впервые идентифицирована НАДН-зависимая система, отвечающая за активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий. Данной системой является Cy6jR3. Этот результат очень важен, так как до сих пор механизм побочных действий некоторых ксенобиотиков был неизвестен, поэтому было невозможно искать способы предотвращения побочных эффектов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод измерения активности и определения локализации различных НАД(Ф)Н-оксидоредуктаз в субклеточных структурах, клетках и срезах тканей, основанный на восстановлении люцигенина до флуоресцирующего продукта диметилбиакридена.

2. Выявлены границы применения зонда на супероксид-анион MCLA, в частности, установлено, что серосодержащие соединения обладают способностью «тушить» хемилюминесценцию MCLA, не оказывая при этом антиоксидантного действия.

3. НАДН оксидоредуктаза внешних отделов митохондрий способна восстанавливать ксенобиотики до их радикалов, которые непосредственно вызывают открывание тРТР, а также усиливают продукцию АФК.

4. Цитохром bs редуктаза (Cy6jR3) ответственна за НАДН-зависимое восстановление ксенобиотиков во внешней мембране митохондрий. Цитохром с

является скавенджером радикалов ксенобиотиков, оказывая, тем самым, протекторное действие.

Работа выполнена при поддержке Грантов правительства РФ (проект № 14.Z50.31.0028) и РФФИ (№14-04-01664-а), с использованием оборудован ия ЦКП ИТЭБ РАН.

Список публикации по теме диссертации.

1. Kruglov A. G., Nikiforova А. В., Shatalin Y. V., Shubina V. V., Fisyuk A. S., Akatov V. S. Sulfur-containing compounds quench 3,7-dihydro-2-methyl-6-(4-methoxyphenyl)imidazol[l,2-a]pyrazine-3-one chemiluminescence: Discrimination between true antioxidants and quenchers using xanthine oxidase // Anal Biochem. 2010. V. 406(2). P. 230-232.

2. Nikiforova А. В., Fadeev R. S., Kruglov A. G. Rapid fluorescent visualization of multiple NAD(P)H oxidoreductases in homogenate, permeabilized cells, and tissue slices // Anal Biochem. 2013. V. 440(2). P. 189-96.

3. Nikiforova А. В., Saris N. E., Kruglov A. G. External mitochondrial NADH-dependent reductase of redox cyclers: VDAC1 or CybsR3? // Free Radic Biol Med. 2014. V. 74. P. 74-84.

Тезисы докладов:

1. Kruglov A.G., Nikiforova A.B., and Fadeev R.S. (Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS, Russian Federation) Fluorescent visualization of NAD(P)H oxidoreductase activity in the outer mitochondrial membrane and in cytosol on acute tissue slices. Biochim Biophys Acta Suppl Vol 1797 2010 (EBEC Abstract Book 15P.13 p. 127)

2. Круглое А.Г., Никифорова А.Б. "Экспериментальная и теоретическая биофизика 2009" Метод оценки активности НАД(Ф)Н оксидоредуктаз внешней мембраны митохондрий в интактных и пермебилизованных клетках» 20-21 октября 2009, сборник работ молодых учёных ИТЭБ РАН

3. И. В. Матлахова, А.Б. Никифорова (научный руководитель - к.б.н., доц. А.Г. Круглое) (Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Путинский государственный университет) «Измерение уровня супероксид-аниона в биологических системах с использованием MCLA. Эффект серосодержащих соединений на регистрируемую хемилюминесценцию», Всероссийская научная конференция с международным участием «Дни биохимии в СПбГМУ» 2011, Санкт-Петербург, 13-15 марта 2011.

4. Никифорова А.Б., «Влияние агматина на физиологические параметры сердечных митохондрий крыс» Учреждение российской академии наук институт теоретической экспериментальной биофизики РАН, 20-21 октября 2011 года, «Экспериментальная и теоретическая биофизика 41», Пущино 2011.

5. Круглое А.Г., Соловьева М.Е., Никифорова А.Б., Кудрявцев А.А., Лавровская В.П., Теплова В.В. (Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, Путинский Государственный Университет) Оценка активности НАДН оксидоредуктаз внешней мембраны митохондрий в ннтактных и пермеабилизованных клетках методом проточной цитофлуориметрии. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, 2-4 июня 2009 г. Сборник статей том 2, с. 515-520.

6. Круглое. А. Г., Никифорова А. Б. «Эффект серосодержащих соединений на регистрируемую хемилюминесценцию при измерении уровня супероксид-аниона в биологических системах с использованием MCLA». Материалы 76-й Всероссийской научной

конференции студентов и молодых ученых с международным участием: «МОЛОДЁЖНАЯ НАУКА И СОВРЕМЕННОСТЬ», Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Центрально-черноземный научный центр РАМН российская академия естественных наук, 19-20 апреля 2011 года, г. Курск.

7. Никифорова А.Б., Фадеев P.C., Круглов А.Г. «Флуоресцентная визуализация активности НАД(Ф)Н-зависимых редуктаз ксенобиотиков в компартментах клеток мозга на тонких острых срезах», VIII Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2-12 июня 2012.

8. Никифорова А.Б., Круглов А.Г. «Визуализиция НАД(Ф)Н-зависимых редуктаз в различных отделах клеток на тонких срезах мозга по накоплению флуоресцентного красителя», VII Сибирский Съезд Физиологов, г. Красноярск, 27-29 июня 2012.

9. Круглов А.Г., Никифорова А.Б., Евдокимова К.Г. «Идентификация митохондриальных НАДН-зависимых редуктаз ксенобиотиков», международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», г. Пущино, 22-24 октября 2012г.

10. Nikiforova A.B., Saris N.-E.L., Kruglov A.G. «The nature of the external mitochondrial NADH-dependent reductase of xenobiotics», 3rd World Congress on Targeting Mitochondria, г. Берлин, Германия, 8-9 ноября 2012.

11. Nikiforova A.B., Kruglov A.G. «Identification mitochondrial NADH-dependent reductase of xenobiotics», VI Всероссийский с международным участием конгресс молодых ученных-биологов «Симбиоз-Россия 2013», 19-23 августа 2013, г. Иркутск.

12. Никифорова А.Б., Круглов А.Г. «Метод визуализации различных НАД(Ф)Н оксидоредуктаз клекти: в гомогенате, клеточных линиях и тонких срезах тканей», Экспериментальная и теоретическая биофизика ' 13, 21-23 октября 2013, г. Пущино.

13. Никифорова А.Б., Круглов А.Г. «НАДН-зависимая редуктаза редокс-активных соединений внешних отделов митохондрий: цитохром bj редуктаза (R3) или VDAC 1. «Экспериментальная и теоретическая биофизика ' 14», 27-30 октября 2014, г. Пущино.

Список сокращений: AntA - антимицин А

Cyb5R3 - цитохром bs редуктаза изоформа 3 DCFDA - 2', 7'дихлорфлуоресцеин диацетат GSH - восстановленный глутатион GSSG — окисленный глутатион Luc, Люц - люцигенин

MCLA - 3,7-дигидро -2-метил-6-(4-

метоксифенил)имидазол[1,2-а]пиразин-3-один

тРТР - Са-зависимая неспецифическая

митохондриальная пора

ОММ - внешняя мембрана митохондрий

RLM - митохондрии печени крысы

Rot, Рот - ротенон

VDAC 1 - potential-dependent anion channel 1, потенциал-зависимый анионный канал изоформа 1

ДК - дыхательный контроль

ДЦ - дыхательная цепь митохондрий

МРР+ - l-methyl-4-phenylpyridinium ion

Подписано в печать 20.04.2015г. Печать лазерная