Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2+-транспортирующая система митохондрий дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Са2+-транспортирующая система митохондрий дрожжей"

г:: од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А Н. БАХА

Нз правах рукописи УДК 577.352.4

ДЕРЯБИНА Юлия Ивановна

Са2*' -ТРАНСПОРТИРУЮЩАЯ СИСТЕМА МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ

3.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 13Э7г.

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор P.A. Звягильская

доктор биологических наук Л.С. Ягужинский кандидат биологических наук . В.И. Мельгунов

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики

РАН

Защита диссертации состоится " в^СЛ^Л—_^^ 1997 г.

в ^^часоо на заседании диссертационного совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А Н. Баха РАН (117071, Москва,

Ленинский проспект, 33, корп. 2) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1) Автореферат разослан ' у лт1 г

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что ионы кальция обладают высокой физиологической активностью. Они выполняют роль вторичного мессенджера so многих важнейших клеточных процессах - цитокинезе [Hepler, 1994], секреции [Elferink et at., 1993; Brunner, 1995], делении, сокращении [Rizzutto et al„ 1994), фотосинтезе [Семин, Чуркина, 1992]. Концентрация цитоплазматического свободного Са1' в животных клетках в состоянии покоя поддерживается на низком уровне, 0.04 - 0.1 шМ, в результате связывания катиона специфическими лиганда-ми, а также депонирования во внутриклеточных пулах (зндоплазматическом ретикулуме, вакуолях. митохондриях) в ходе функционирования мембранных Са2'-транспортирующих систем [Heizman, 1992; Toescu eta!., 1993; Gunteret al., 1994]. Известно, что внешние воздействия на клетку вызывают увеличение концентрации свободного Са2* в цитоплазме и включение мито-хондриальной Саг*-транспоргируюцеи системы. При этом происходит увеличение концентрации свободного кальция в матриксё митохондрий, активация ряда митохондриальных Саг*-ззвисимых ферментов (пируватдегидрогеназы, 2-оксоглутаратдегидрогеназы, НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы, пирофосфотазы, АТФ-синтазы) и, в конечном счете, стимуляция дыхания и окислительного фосфорилирования [McCormack, Denton, 1994).

Описана регуляторная роль ионов Саг* и в клетках низших эукариот - дрожжей. Используя fura-2 в качестве Са2*-чувсгтвительного зоцца, введенного в клетки Saccharomyces cerevisiae методом электропорации, Анраку и созвт. [lida et at., 1990J, удалось показать, что в клетках дрожжей концентрация свободного Са2* а цитоплазме в норме составляет 0.1 мкМ при общем содержании ионов Са2* в клетке 1.6 мМ. В последнее время получены данные о том, что в дрожжевых клетках кальций необходим для действия половых гормонов у Saccharomyces cerevisiae [lida et al., 1990] и инициации мицелиального роста у диморфных видов дрожжей [Jeckson, Heath,1993).

Таким образом, общая концепция о роли цитоплазматического свободного Са1' в качестве вторичного посредника при регуляции важнейших клеточных процессов, в настоящее время получила дополнительное экспериментальное подтверждение при изучении дрожжевых клеток. Поступление ионов Саг* в дрожжевую клетку осуществляется за счет энергозависимого поглощения из внешней среды [Romans et al., 1979]. Полагают, что главным внутриклеточным пулом катиона являются вакуоли, обладающие системой активной транслокации Саг* и высокой емкостью [Окороков и др., 1988; Eitam et al., 1985]. Роль эндоплазматического ретикулума как Са^-секвестрирующего пупа неизвестна. Долгое время считали, что и митохондрии не мо-. гут участвовать в регуляции концентрации Са" в цитоплазме, поскольку характеризуются низким сродством к катиону и слабой транспортирующей способностью [Carafoli et al., 1970; Subik, Kolarov, 1970; Balcavage et al., 1973]. Однако, а нашей лаборатории в начале 80-х годов была показана Са2*-транспортирующая способность митохондрий дрожжей Endomyces magnusii { Vmex=1000 нмоль/мин мг белка), хотя ее сродство к ионам Саг* оставалось низким (К„=1 SO - 180 мкМ) [Зэягильскэя и др., 1983; Лейкин и др., 1987J. Позже было продемонстриро-

вано, что кинетические свойства системы транспорта Са2* митохондрий Е. тадпизИ изменяются в присутствии микромолярных (физиологически*) концентраций полиаминов - спермина и спермидина [ХМуакоуа е1 а1., 1990; 1993].

Целью настоящей работы служило систематическое исследование свойств Саг'-транспортирующей системы митохондрий дрожжей Е. тздпизи.

При этом предусматривалось решение следующих задач:

- детальное изучение возможности регуляции системы транспорта Са2* природными модуляторами (АДФ, НАДН, ионами Са2*);

- исследование специфических и неспецифических путей выхода ионов кальция из Са2*-нагруженных митохондрий;

- оценка физиологической значимости системы активного транспорта Саг" митохондрий дрожжей.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые продемонстрирована возможность регуляции Саг*-транспортирующей системы дрожжевых митохондрий природными модуляторами - АДФ, НАДН, ионами Са'*. Обнаружено, что в присутствии АДФ в концентрациях, близких к физиологическим, происходит существенное возрастание скорости транспортного процесса и увеличение сродства системы транспорта к кальцию. Продемонстрировано, что попизмин спермин потенциирует стимулирующий эффект АДФ и способствует практически полному поглощению катиона из инкубационной среды. Аналогичные данные получены и по влиянию предварительной инкубации митохондриальной суспензии с экзогенным НАДН. Продемонстрировано, что Са"-транспортирующая система митохондрий £. тадпи$И может регулироваться внутримитохондриаль-ным НАД'/НАДН-отношением. Показано, что ионы Са3*, наряду с АДФ, НАДН и спермином, также являются эффективными положительными модуляторами Саг*-транспортируюицей системы митохондрий дрожжей. Обнаружено, что совместное влияние всех изученных эффекторов (АДФ, НАДН, спермина и ионов Са1*) приводит к значительной активации скорости транспорта катиона и полному поглощению всего добавленного кальция, даже при введении в среду инкубации митохондрий 0.5 мМ Мдг*, 5 мМ ЫаС1 и 100 мМ КС1, т.е. в среде, имитирующей ионный состав цитоплазмы.

Впервые исследован путь независимого от поглощения выхода Св2* из нагруженных митохондрий, идентифицированный как электронейтральный Ыа*-независимый выход Са:*, подобный таковому митохондрий млекопитающих Проведен ингибиторный анализ, изучены кинетические параметры и природа этого процесса. Показано, что в митохондриях дрожжей £ тадпизи, в отличие от митохондрий животных, не функционирует путь неспецифического выхода Саг* за счет образования Са2'-зэвисимой мембранной поры.

Впервые обнаружено, что в дрожжевых митохондриях, подобно митохондриям млекопитающих, существует регуляция интенсивности окислительного метаболизма посредством изменения активности Саг*-чувсгвительных дегидрогеназ. Двумя независимыми методами показано, что матриксная НАД-завйсимая изоцитратдегвдрогеназа активируется в присутствии 0.3 мкМ Саг*. При этом происходит увеличение скорости реакции и уменьшение К,» НАД-идг для ОЬ-изоцитрата. Обсуждается вопрос о роли Саг*-транслортирующей системы митохондрий £ тадпи$И в регуляции митохондриального и клеточного дыхания.

Результаты настоящей диссертационной работы дополняют полученные к настоящему времени данные о свойствах митохондриальных Саг*-транслортирующих систем животных и растений. Высокая чувствительность системы транспорта Саг* к природным модуляторам позволяет использовать ее в качестве перспективной модели для поиска других возможных эффекторов и плодотворного исследования механизмов организации и функционирования Саг*-транслортирующих систем митохондрий. Предложены доказательства, что эффективно функционирующая система энергозависимой транслокзции Саг* в митохондриях дрожжей играет важную роль в регуляции окислительного метаболизма 8 клетке.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международных конференциях: "Yeast genetics and molecular biology" (Lisboa. Portugal); "Frontiers of mitochondrial research" (Albany, USA); 'European Bioenerge'ics Conference" (Louvain-Neuve, Belgium).

Публикации По материалам диссертации опубликовано пять работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования,' изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и включает 35 рисунков. Слисок литературы насчитывает 282 наименования.

Автор удостоен стипендии имени члена-корреслондента Российской Академии наук, профессора В.Л. Кретовича.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект В исследованиях использовали дрожжи Endomyces magriusii, штамм ВКМ У-261, полученный из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Дрожжи выращивали а качалочных колбах емкостью 760 мл (объем среды 100 мл) при перемешивании в строго контролируемых условиях (температура 28-30°С; скорость вращения мешалки 220 об/мин) на полусинтетической среде {Звягильская и др., 1974]. В качестве основного источника углерода использовали 0.6% глицерин. Биомассу собирали на стадии замедленного роста (10-12 г на 1 л).

Препаративные методы Митохондрии выделяли ло методу Маюси и Пойтона (МсКее, Poyton, 1984), модифицированному в нашей лаборатории для дрожжей Е magnusü. Метод включал получение сферопластов и выделение из них митохондрий разрушением осмотическим шоком. Клетки суспендировали в 50 мМ трис-НС!-буфере, рН 8.9 (из расчета 1 г сырой массы в 10 мл буфера), который содержал 10 мМ дитиотреитол, и инкубировали при комнатной температуре 28-30 мин, затем обрабатывали хеликазой - комплексом логических ферментов из виноградной улитки Xetix pomatía L. (из расчета 50 мг на 1 г клеток) и ин-.

* S»

кубировали при мягком перемешивании при 28°С в течение 15-20 мин. вереде, содержащей 1 М ксилит или 1 М сорбит; 50 мМ цитрат-фосфатный буфер, рН 5.8-6.0, 50 мМ ОДТА. Образование сферопластов контролировали по уменьшению оптической плотности суспензии при 590 над при 20-кратном разведении водой. Образующиеся сферопласты подвергали лизису в гомогенизаторе "BOUNCE" в течение 2 мин в среде выделения, содержащей 0.4 М маннит; 10

мМ трис-НС1-буфер, рН 7.2; 0.5 мМ ЭДТА; 0.5 мМ ЭГТА; 0.5%-ный БСА\ из расчета 20 мл среды на 5 г биомассы с последующим переводом лизата в изоосмотическую среду (0.6 M маннит; 10 мМ трис-НС1-6уфер, рН 7.2, 0.5 мМ ЭДТА; 0.5 мМ ЭГТА; 0.5%-ный БСА). Ми-тохоидриальную фракцию осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 мин и промывали средой, содержащей 0.6 M маннит; 10 мМ трис-НС!-буфер, рН 7.2; 0.5%-ный БСА. Выход митохондрий составлял в среднем 1-2 мг белка на 1 г сырой биомассы. Все операции по выделению митохондрий проводили при 0-4°С.

Аналитические методы Потребление кислорода митохондриями определяли полярографическим методом, используя полярогрзф LP-7 и ячейку (рабочий объем 1.0 мл) конструкции Шольца и Островского [1965]. Среда инкубации митохондрий при определении фосфорилирующей активности содержала следующие компоненты. 0.6 M маннит; 2 мМ трис-фосфат, рН 6.5-6.6; 2 мМ ЭДТА; 4-20 мМ субстрат окисления; 0.25-0.4 мМ АДФ. Расчет скорости дыхания митохондрий производили, как описано в работе Шольца и Островского ¡1965]; величин дыхательного контроля и АДФ/О - по методу Чанса [Chance, Williams, 1965).

Поглощение ионов кальция митохондриями регистрировали слектрофото-метрически (спектрофотометр HITACHI-557) по поглощению метаплохромного индикатора мурексида [Scarpa, 1972J в двуволновом режиме при 540-507 нм. Среда инкубации митохондрий содержала; 0.6 M маннит; 2 мМ трис-фосфат; 10 мМ трис-НС(-буфер, рН 7.4; 50 мМ мурексцд; 20 мМ пируват; 5 мМ малат.

Динамику набухания знергизованных митохондрий при поглощении ионов кальция регистрировали по уменьшению оптической плотности митохондриапьной суспензии при 546 нм (спектрофотометр HtTACHt-557), Среда инкубации содержала 0.4 M маннит; 0.1 ЬА КС(; 2 мМ трис-фосфат, рН 7.4; 20 мМ пируват; 5 мМ малат.

Динамику набухания деэнергизоаанных митохондрий определяли по методу Ха-лестрапа [Connem, Halestrap, 1994; Woocffield et al., 1996]. Для этого митохондрии в течение одной минуты инкубировали в среде, содержащей 0.4 M маннит; 0.1 M KCI; 20 мМ трис-ацетат, рН 7.4; антимицин А (8 мкг/ мг белка); 2 мкМ А 23187. После этого к митохондриапьной суспензии добавляли Са2* (100-500 мкМ). Через минуту вносили индуцирующие агенты и следили за уменьшением оптической плотности митохондриапьной суспензии при 546 нм (спектрофотометр НГГАСН1-557).

Активность матриксной НАД-зависииой изоцитратдегидрогеназы определяли двумя независимыми методами: по увеличению скорости дыхания; по выделению НАДН митохондриапьной суспензией при окислении DL-изоцитрата по методу Спейтера [Slater et al., 1964]. В качестве медиатора использовали феназииметасупьфат, а конечного акцептора восстановительных эквивалентов - ДХФИФ2 (30-50 мкг/ мл), Х=600 нм. Среда инкубации содержала: 50 мМ Hepes, рИ 7.2; 5 мМ

1 БСА- бычий сывороточный альбумин;

2 ДХФИФ - дихпорфенолиндофенол;

ДМНТА3; 0-10 мМ изоцитрат, 1 мМ MgClj, 1 мМ НАД*, 1 иМ АДФ При расчете активности фермента (нмоль/мин мг-белка) использовали величину миллимопярной экстинкции ДХФИФ к = 21 мМ • см

Определение митохондриапьного белка производили по методу Брэдфорд [Bradford, 1976) с кумасси G-250. Для построения калибровочных кривых в качестве стандарта использовали препарат бычьего сывороточного альбумина высокой степени чистоты.

Все растворы готовили на бидистиллированной деионизированной воде (при сопротивлении 15 МОм/см). Дополнительную очистку сред инкубации от кальция и других катионов осуществляли с.катионообменными смолами Dowex-50 и Chelex-100.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Влияние АДФ на свойства Са!<-транспортирующей системы митохондрий

Endomyces magnusit. В исследованиях, проведенных ранее в нашей лаборатории, было показано, что система транспорта Ca" митохондрий дрожжей эффективно модулируется полиаминами - естественными компонентами каждой эукариотической клетки [Votyakova et а!.. 1990; 1993]. Было отмечено, что в присутствии низких, близких к физиологическим, концентраций спермина происходит возрастание начальной скорости поглощения катиона и увеличение сродства системы транспорта к Саг*, выражающееся в полном поглощении из среды инкубации всего добавленного к митохондриям кальция и поддержании концентрации внемитохондриального кальция на низком уровне. В связи с этим представлял интерес систематический поиск других природных модуляторов Са2*-транслортирующей системы митохондрий дрожжей.

Среди широкого числа возможных эффекторов митохондриальной системы транспорта Саг* а первую очередь мы остановили наш выбор на адениновых нуклеотидах, принимая во внимание их неоспоримую важность в регуляции всех энергозависимых процессов в клетке и универсальность действия во всех эукариотических организмах. В ходе исследований было показано, что аккумуляция ионов Ca" митохондриями дрожжей £ magnusii ускорялась в присутствии 25 мкМ АДФ (рис. 1А, кривая 2). Действие АДФ было специфичным (другие исследованное моно,- ди- и тринуклеотиды - АМФ, сАМФ, ГМФ, ГДФ.ИДФ, АТФ, ГТФ - не оказывали существенного влияния на скорость транспорта Ca2* дрожжевыми митохондриями). В присутствии АДФ типичная сигмоидапьная зависимость начальной скорости транспорта Саг* митохондриями от концентрации катиона в инкубационной среде (Рис.1А, кривая 1) превращалась в близкую к гиперболической (Рис.1А, кривая 2). Улучшались и "буферные" свойства митохондрий, т.е. их способность поддерживать более низкую концентрацию внемитохондриального Саг" (Рис. 1 Б, кривая 2).

Стимулирующий эффект АДФ проявлялся при очень низких концентрациях нуклеотида, на пооядок меньших, чем а аналогичных экспериментах на митохондриях животных тканей [Rotteoberg, Marbach, 1989; 1990] - максимальное активирующее действие наблюдалось при 510 мкМ адф, полумаксимальный эффект достигался при концентрации АДФ, равной 3 мкМ.

5 ДМНтд - диметилнитрилотриуксусная кислота;

Вычисленная нами величина константы Михаэлиса (К,„) оказалась близка Кт для АДФ при его связывании с высокоаффинными сайтами на транспоказе адениноеых нукпеотидоа (ТАН) в митохондриях млекопитающих (Vignais, 1976; Klingenberg, 1989].

Активирующее влияние нуклеотида потенциировалось спермином. Присутствие 25 мкМ спермина вызывало значительное увеличение начальной скорости транспорта относительно низких (50-100 мкМ) концентраций катиона, однако, было почти неэффективно при

Рис. 1. Влияние АДФ на начальную скорость транспорта ионов Ca2t митохондриями E.magnusii (V„ ) (А) и равновесную концентрацию ионов Caв инкубационной среде <lCa!*sJ) (Б). 1 • контроль; 2- в присутствии 25 мкМ АДФ; 3- в присутствии 25 мкМ АДФ и 25 мкМ спермина. Состав среды инкубации: 0.6 М маннит; 2 мМ трис-фосфат, pH 7.4; 20 мМ пируват; 5 мМ манат; 50 мкМ мурексид; 0.5 мг митохондри-ального белка.

использовании более высоких концентраций Ca" (рис. 1А, кривая 3). Совместное влияние АДФ и спермина способствовало таюке еще большему увеличению сродства системы к кальцию, что выражалось в полном поглощении всего добавленного к митохондриям катиона из среды инкубации до уровня, сопоставимого с нижним пределом чувствительности определения концентрации свободного Саг* с помощью мурексидной техники (рис.1 Б, кривая 3).

Эффект АДФ был нечувствителен к действию цс А4 - мощного и специфического ингибитора Саг+-зависимой мембранной поры [Broekemeier, Pfeiffer, 1995], что позволило исключить эффект АДФ как ингибитора неспецифического выхода Ca2' [Kowaltovsky, 1996], однако, полностью предотвращался в присутствии низких концентраций Атр5 - конкурентного ингибитора TAH6 [Klingenberg, 1989] (рис.2).

Полученные нами результаты дали основание предположить, что стимуляция посредством АДФ транспорта Ca2* в митохондриях дрожжей, так же, как и в митохондриях животных

4 цс А - циклоспорин А;

5 Атр - атрактидозид;

6 ТАН-транслоказа адениноеых нуклеотидов;

(Ca2*], мкМ

[Ca2*], мкМ

тканей [Rottenberg, Marbach, 1989; 1990], обусловлена функционированием ТАН во внутренней мембране митохондрий и осуществляется за счет фиксации АДФ/АТФ-транслортера в "М"-положении, что приводит к существенному изменению электрического заряда внутренней ми-тохондриальной мембраны в месте локализации ТАН и, возможно, облегчает диффузию положительно заряженного Ca2* с молекулы унипортера в матриксное пространство [Rottenberg, Marbach. 1989; 1990]. Не исключена, однако, и возможность непосредственного действия

Рис. 2. Влияние АДФ, Amp цсА на начальную скорость поглощения (Va) 100 мкМ Саг* митохондриями Е. magnusii. Где указано, добавлены 25 мкМ АДФ, 33 мкМ Amp, 0.25 мШ цсА. Состав среды инкубации, как в подписи к рис. 1.

2. Влияние экзогенного НАДН на свойства Са2*-транспортирующей системы митохондрий дрожжей Endomyces magnusii.

Из литературных данных хорошо известно, что важнейшим фактором, контролирующим поглощение ионов Ca2* и их. удержание митохондриями, является окислительно-восстановительный статус эндогенных ПН' [Lehninger et al., 1978; Schweizer et al., 1993; Schweizer, Richter, 1996].

До сих пор, в исследованиях, проведенных на митохондриях животных, влияние редокс-состояния внутримитохондриальных ПН на систему транспорта Саг' изучалось с использованием агентов, вызывающих их окисление и гидролиз. Однако, при этом часто имела место индукция неспецифической мембранной проницаемости [Lehninger et al., 1978; Hofstetter et al., 1981]. сопровождающаяся нарушениями мембранной интакгности и неконтролируемым выходом ионов Саг*\

Митохондрии дрожжей предоставляю^ уникальную возможность применения принципиально нового подхода к изучению роли редокс-состояния эндогенных ПН в поглощении и удержании митохондриями значительных количеств Ca2* - исследования влияния редокс-состояния ПН на митохондриапьные функции путем дозированного увеличения отношения НАДН/НАД* в результате индукции обратного переноса электронов. Известно, что митохондрии дрожжей, а отличие ■ от митохондрий животных, эффективно окисляют экзогенный НАДН (Звягипьская и др.. 1982} посредством дегцдрогеназы, локализованной на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий [Звягипьская, Котельникова, 1991). Ранее было показано, что в

АДФ на унипортер.

§

<0 400

U 2

- 300

я X

1 200 2

i 100i

о

5

х. О

контроль +Атр +цсА +АДФ Атр+АДФ цеА+АДФ

7 ПН-пиридиновые нуклеотиды;

митохондриях клеток Е. тадпизИ, выращенных на глицерине, экзогенный НДДН, является одним из наиболее эффективно окисляемых субстратов, [Звягильская и др., 19811 и наиболее мощным индуктором обратного переноса электронов [Звягильская и др.. 1982]. Было обнаружено также, что степень восстановленное™ митохондриальных пиридиновых нуклеотидов может быть существенно увеличена яри кратковременной преинкубации митохондрий с НАДН, а результате индукции обратного переноса электронов [Звягильская и др., 1982).

Рис. 3. Влияние предварительной инкубации иитохондриапьной суспензии с 4 иМ НАДН на начальную скорость транспорта ионов Са2' (Ус) (А) и на равновесную концентрацию ионов Са" ({Саг'$ф в инкубационной среде (Б). 1 - контроль; 2 - мито-хондриальную суспензию предварительно инкубировали в течение 0.5-1.0 шн с 4 Ш НАДН.

Для изучения влияния степени восстановленности ПН на скорость транспорта Саг*дрожжевыми митохондриями, аликвоту митохондриальной суспензии инкубировали в течение 0.5 - 1.0 мин с 4 мМ НАДН с последующим 50 - 100-кратным разведением концентрации НАДН до уровня ниже величины Кп для НДДН НАДН-дегидрогеназы, что исключало влияние НАДН как дополнительного субстрата дыхания и позволяло исследовать непосредственно зависимость кинетических параметров транспорта Са2* митохондриями от степени восстановленности ПН.

Как видно из рис. 3, инкубация митохондрий с НАДН значительно (в 4-5 раз) ускоряла поглощение Саг* митохондриями. При этом было отмечено лишь умеренное улучшение их буферных свойств. Мы полагаем, что, вероятно, в митохондриях дрожжей НАДН может воздействовать на транспорт Са2* опосредованно, через окислительно-восстановительное состояние глутатиона и БН-групп белков [Ье Оиос, |_е биос, 1982; 1989], хотя не исключено и его прямое взаимодействие с переносчиком. 3. Аллостерическзя регуляция системы транспорта Са2' митохондрий Епйотусез тадпизИ ионами кальция.

В числе других возможных модуляторов системы транспорта Саг* наше внимание при-

[Са2*], мкМ

[Са2*], мкМ

влекли сами ионы кальция. Стимулирующий эффект низких концентраций катиона был продемонстрирован в исследованиях Крёнера, проведенных на митохондриях животных [Kroner, 1986а; 1986b). 8 свою очередь в ходе наших экспериментов нами был отмечен неожиданный феномен: митохондрии, характеризующиеся очень высокими показателями параметров солря-

Рис. 4. Влияние предварительной инкубации митохондриальной суспензии с 20 мкМ Са'* на начальную скорость транспорта Мо (А) и на равновесную концентрацию ионов Са" ([Ca'*stJ) в инкубационной среде (Б). 1 - контроль; 2 -после предварительной одноминутной инкубации митохондрий с 20 мкМ Са2'. Состав среды инкубации как в подписи к рис. 2.

жени.я, проявляли подчас чрезвычайно низкую активность в поглощении Саг*. Мы сделали предположение, что это явление может быть следствием того, что высокая степень интактности митохондриальной мембраны препятствует утечкам Са2* из матрикса, которые, возможно, имеют место in vivo, и предотвращает естественную аллостерическую активацию Са2*-переносчика в этих условиях.

Совокупность литературных данных и наблюдений, проведенных нами, создала предпосылки для детального изучения возможности активации Са2*-переносчика митохондрий дрожжей ионами Са2* и побудила нас систематически исследовать этот феномен. В ходе экспериментов мы обнаружили, что при последовательном добавлении к митохондриям нескольких порций Са2*, каждая последующая порция катиона поглощалась с более высокой скоростью и более полно, чем предыдущая. Контрольные эксперименты, поставленные с учетом истинных концентраций Са2* в инкубационной среде после поглощения, позволили сделать заключение об активации Саг*-транспортирующей системы митохондрий дрожжей в- ходе поглощения первой порции катиона.

Кратковременная преинкубация митохондрий с ионами Са2* влияла и на кинетические параметры Са2*-транспортирующей системы. Как видно из рис. 4, минутная преинкубация ми-тохонлриальной суспензии с 20 мкМ Са2* ускоряла поглощение относительно невысоких (50 и

100 мкМ) концентраций Са2*; при использовании более высоких концентраций катиона эффективность предобработки митохондрий с 20 мкМ Са2* прогрессивно уменьшалась. Активация унилортера сопровождалась трансформацией кривой зависимости скорости транспорта Са2* от концентрации катиона в среде из сигмоидальной в почти гиперболическую, что свидетельствовало об уменьшении величины К„ переносчика для Са". Интересно отметить, что преин-

Puc.S . Влияние предварительной инкубации митохондриальной суспензии с 20 мхМ Саг* и совместного действия 25 шМ АДФ, 25 мкМ спермина и предварительной обработки митохондриальной суспензии в течение 1 мин с 4 мМ НАДН и 20 мкМ Са" на начальную скорость транспорта (V0 ) (А) и на равновесную концентрацию ионов Са" фа"я}) в инкубационной среде (В). 1 - контроль; 2-е присутствии 25 иШ АДФ, 25 мкМ спермина и после предварительной одноминутной инкубации митохондриальной суспензии с4мМ НАДН и 20 мкМ Са*; 3 -условия как указано для 2, но среда инкубации была дополнена 0.5 мММд5 мМ NaC! и 100ШКС1.

кубация митохондрий с 20 мкМ Ca2t обеспечивала практически полное поглощение катиона из инкубационной среды (Рис. 4Б, кривая 2) в результате существенного Са2+.

Мы полагаем, что Са2+-транспоргирукицая система дрожжевых митохондрий может активироваться ионами кальция в ходе их взаимодействия с Са2*-переносчиком. Возможно, внутренняя мембрана дрожжевых митохондрий, подобно мембране митохондрий животных, содержит специфические сайты, ответственные за регуляцию транспортного процесса по ал-лостерическому механизму [Лейкин, Гонсальвес, 1936; Kroner, 1986а; 1986b; 1987).

Таким образом, в ходе наших исследований мы обнаружили, что Са2*-транспортирующая система митохондрий дрожжей может подвергаться эффективной регуляции посредством природных эффекторов - АДФ, спермина, экзогенного НАДН, ионов Са2*. При этом каждый из изученных нами модуляторов придавал системе транспорта кальция специфические новые свойства. В связи с этим нам представилось интересным исследовать совместное влияние всех обсужденных выше агентов на Са^-транспортирующие свойства митохон-

дрий. Как представлено на рис. 5, добавленные вместе, изученные физиологические эффекторы - АДФ, спермин, НАДН, ионы Са" - обеспечивали чрезвычайно высокие скорости поглощения катиона и придавали митохондриям свойство поддерживать концентрацию внемито-хондриального Са" на очень низком уровне, сопоставимом с нижним пределом определения концентрации свободного Са" с помощью мурехсидной техники. Следует подчеркнуть, что высокие скорости поглощения ионов Са2* и высокая "буферная" способность митохондрий сохранялись в присутствии указанных эффекторов даже при введении в среду инкубации митохондрий 0.5 мМ Мд2*, 5 мМ NaCf и 100 мМ KCI, т.е. в среде, имитирующей ионный состав цитоплазмы (Рис. 5А и Б, кривые 3).

Таким образом, было показано, что совместное действие всех изученных физиологических эффекторов придает митохондриям способность не только поглощать ионы Са2* из инкубационной среды с высокими скоростями, но и поддерживать низкий уровень свободного вне-митохондриального кальция, что, как мы полагаем, позволяет поставить вопрос об участии Са"-транспортирующей системы в регуляции матриксной концентрации катиона, и, как следствие, внутримитохондриальных Саг*-зависимых процессов.

4. Пути выхода ионов Са1* из Са1*- нагруженных митохондрий дрожжей Endomyces

magnusil.

Как было отмечено выше, в ходе изучения влияния природных модуляторов - спермина, АДФ, НАДН, ионов Са" - на систему транспорта кальция митохондрий дрожжей нами было обнаружено, что под действием этих агентов происходило существенное изменение ее кинетических свойств. Эти данные опровергли принятую в литературе точку зрения, что система транспорта Са" дрожжевых митохондрий характеризуется низкой транспортирующей способностью и скорее всего не имеет физиологического значения [Carafoli et al., 1970; Balcavage et al., 1973]. Среди широкого числа литературных данных нет указаний на существование в митохондриях дрожжей системы независимого выхода ионов кальция, которая, наряду с системой поглощения Са", участвует в регуляции потоков катиона через внутреннюю мито-хондриальную мембрану. Поэтому следующим этапом наших исследований явилось изучение механизмов специфического и неспецифического выхода ионов Са" из нагруженных митохондрий.

В соответствии с данными ряда авторов [Zoccarato, Nicholls, 1982; Rizzuto et al., 1987; RottenberQ, Marbach, 1990 ], фосфат-ион, входящий в качестве проникающего аниона в состав используемой в наших экспериментах среды инкубации, является ингибитором независимых путей выхода Са", уменьшая концентрацию свободного матриксного кальция (вследствие образования нерастворимого комплекса с катионом) ниже величин, необходимых для индукции путей выхода. Исходя из этого, эксперименты, посвященные исследованию механизмов выхода Са" из дрожжевых митохондрий, проводились на средах инкубации, содержащих вместо фосфата ацетат в качестве проникающего аниона, комплекс которого с Са" растворим и не влияет на активность путей независимого выхода [Zoccarato, Nicholls, 1982; Rizzuto et al., 1987].

Результаты опытов показали, что в присутствии 20 мМ ацетата происходил самопроизвольный выход Ca2* из нагруженных кальцием митохондрий, демонстрирующий широкую зависимость от величины Саг*-нагрузки. После поглощения 75% добавленного к митохондриям кальция происходил спонтанный выход иона. Добавление Са2*-ионофора А 23187 приводило к освобождению дополнительной порции катиона, что свидетельствовало о матриксной локализации накопленного Ca2*. Скорость выхода кальция линейно увеличивалась с еозрас-

Рис. 6. Зависимость скорости выхода ионов Ca2* от Са**-нагрузки митохондрий Е. magnusii. Состав среды инкубации: 0.6 М маннит; 20 мМ трис-ацетат, pH 7.4; 20 Ш пируват; 5 мМ малаш; 50 икМ му-рексид; 0.5 мг митохондриального белка.

танием Са2*-нагрузки митохондрий в диапазоне всех используемых нами концентраций Ca2* (рис. 6).

Как известно, индукцию независимых путей освобождения Ca2* из митохондриального матрикса проводят в присутствии PK8 - специфического ингибитора поглощения Саг* с целью исключить участие унипортера в изучаемом явлении [Rizzuto et at., 1987; Igbavboa, Pfeiffer, 1988; Rottenberg, Marbach, 1990 J. Однако, в исследуемом нами феномене выход происходил спонтанно, без необходимости блокирования унипорта для индукции независимых путей освобождения кальция. Поэтому ин-гибирование Са2*-переносчика в ходе наших экспериментов могло служить тестом на проявление обращенной активности унипортера. Ранее в исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, было отмечено [Баженова, 1989], что Са2*-транспортирующая система митохондрий дрожжей Е magnusii не ингибироаалась PK, даже при использовании высоких концентраций этого агента, поэтому использование этого ингибитора в наших экспериментах исключалось. Известно, что Са2*-транспортирующая система митохондрий животных, помимо PK, конкурентно ингибируется ионами лантана и лантанидами [Reed, Bygrave, 1974J. Поэтому мы предприняли попытку изучения эффекта ионов La3* и на систему электрогенного поглощения Ca2*, и на выход катиона. Результаты опытов показали, что ионы лантана ингибировали транспорт Ca2* на среде, содержащей ацетат, с Kj, равной 25 мкМ (вычислена в координатах Диксона). Полное ингибирование накопления Ca2* наблюдалось при 400 мкМ La3* (рис.7А). Исследование эффекта лантана на выход Ca2* показало, что этот процесс также блокировался ионами La3*, однако, кинетика этого ингибирования отличалась от таковой поглощения Ca2* {рис.

100 200 300 400 500 600 Саг+-нагрузка, нмоль на 1 мг белка

8 РК-рутений красный

7Б). Для полного блокирования выхода требовалась в 2 раза меньшая концентрация лантана, чем для полного ингибирования Са2*-унипорта. Различная чувствительность путей поглощения

Рис. 7. Влияние ионов !-а~" на поглощение (А) и выход Са" (Б) из митохондрий Е. тадпияи. Состав среды инкубации как в подписи к рис. 6. п выхода к ингибитору свидетельствует о независимом от поглощения пути освобождения Са2' из матрикса. На основании этих результатов мы заключили, что выход Са2*, наблюдаемый в этих условиях, не является следствием обращенной активности Са3'-унипортера и связан, возможно, с функционированием других путей выхода Са2*.

Выход Са2* не проявлял высокой чувствительности к цс А, что послужило доказательством того, что освобождение Са2*, наблюдаемое в этих условиях, не связано с развитием неспецифической проницаемости, вызванной высокими концентрациями Саг*.

Из данных литературы известно, что в митохондриях животных тканей функционируют два основных специфических пути освобождения Са2* из Са2*-нагруженных митохондрий: ^-зависимый и ^'-независимый [СиМег е1 а1., 1994}. Поэтому, учитывая эти данные, на следующем этапе наших исследований мы провели серию экспериментов по изучению чувствительности процесса выхода Са2* к ионам №*- Однако, 20 мМ !МаС1 не вызывал стимуляции скорости выхода Са2* из митохондрий дрожжей. Эти результаты позволили нам сделать заключение об отсутствии, либо чрезвычайно слабой выраженности компонента Ма*-зависимого пути в выходе Са2*из нагруженных митохондрий £. тадпивЯ.

Итак, в наших исследованиях было показано, что спонтанный выход Са2*, наблюдаемый в присутствии ацетата, не связан: 1) с проявлением обращенной активности Са2*-унипортера (различная степень чувствительности выхода и поглощения Са7* к лантану); 2) с индукцией неспецифической мембранной поры (отсутствие чувствительности к цс А); 3) с функционированием ^'-зависимого пути (отсутствие стимуляции выхода в присутствии ионов №*). На осно-

вании вышеизложенных экспериментальных фактов мы сделали предположение о том, что описываемый выход Са2* может быть №*-независимым путем освобождения ионов Сзг\ либо

Рис. 8. Влияние ионов Млг* (А) и Мд2' (Б) на выход ионов Са2' из митохондрий Е. magnusii. Состав среды инкубации как в подписи к рис. 6. аналогом этого пути у митохондрий дрожжей. Известно, что Na*- независимый путь выхода характеризуется рядом свойств - высокой чувствительностью к ионам некоторых металлов [Gunter, Pfeiffer, 1990], тетрафенил-фосфоний-иону [Gunter et al., 1994], К*-ионофорам [Rottenberg, Marbach, 1990], а также природным модуляторам [Rottenberg, Marbach, 1990]. Исследованию этих свойств выхода Са2* из митохондрий Е. magnusii мы посвятили следующий этап нашей работы.

Мы обнаружили, что освобождение Са2* из митохондриального матрик-са ингибируется ионами Мп2* и Мд2* (рис. 8А и В соответственно). 1.5 мМ Мд2* вызывал полное ингибирование выхода Са2* (рис. 8А) , в то время как 200 мкМ Мп'* оказывал лишь 80%-ый ингибирующий эффект (рис. 8Б). Эти результаты нашли согласование с данными некоторых авторов, свидетельствующими, что ионы Мп2* [Gunter et al.,1989] и Mg2* [Lukacs, Fonyo, 1985; Rizzuto et al.,1987] являются ингибиторами Na*-независимого пути выхода Са2* из митохондрий широкого числа тканей млекопитающих.

Дальнейшие исследования показали, что активация выхода Са2* происходила в присутствии 25 мкМ спермина и в условиях гипотонии (не показано). При этом выход Са2* терял линейный характер и приобретал форму спонтанного освобождения катиона, который имеет место, например, в присутствии Са2*-ионофора А 23187. Эти данные обнаружили еще одно сходство выхода Са2* из дрожжевых митохондрий и №а*-неэависимого пути выхода катиона из митохондрий животных [Nichitta, Williamson, 1984; Rizzuto et al., 1987].

В настоящее время наиболее известным и специфическим ингибитором Na*- независимого пути выхода Са2*, как известно, является ТФФ*9 [Wingrove, Gunter, 1986; Gunter,

9 ТФФ*- теграфенилфосфоний

Pfeiffer, 1990]. Проверка влияния ТФФ' на процесс выхода Саг* из митохондрий дрожжей показала ингибирующее действие этого агента. Полумаксимапьный эффект наблюдался при 1 8 мкМ ТФФ* (К, вычислена в координатах Диксона). Максимальное ингибирующее действие оказывал 9-10 мкМ ТФФ*. Вычисленная нами ^оказалась близка к таковой, полученной на митохондрия* печени [Pfeiffer, 1990]. Ингибирование выхода в присутствии ТФФ* явилось еще одним аргументом в пользу выдвинутого нами предположения о сходстве и, возможно, идентичности наблюдаемого нами освобождения Ca2* и Na'-незааисимого пути выхода.

______________1 Рис. 9. Влияние ТФФ* на выход Ca1'

из митохондрий Е magnusii. Состав среды инкубации как в подписи к рис. б.

Таким образом, свойства выхода Саг*, наблюдаемого в наших экспериментах, нашли значительное сходство с Na'-незэвисимым путем выхода митохондрий млекопитающих. Скорость этого выхода, однако, была существенно выше величин, доложенных в литературе - 20-

8 10 [ТФФ+], мкИ

25 нмоль/мин на 1 мг б елка при Саг'-нагрузке 20Q нмоль на 1мг белка, в то время как Роттен-берг и Марбах [Rottenberg. Marbach, 1990] доложили о величине 10 нмоль/мин на 1 мг белка при той же нагрузке катиона.

Механизмы ^'-независимого выхода Саг* в последнее время подвергаются широкой дискуссии в литературе. Исследования одних авторов показали, что этот путь электронейтрален и опосредуется пассивным Са2*/Н*- обменником [Brand, 1985; Rottenberg, Marbach, 1990], а движущей силой этого процесса, как полагают, является ДрН-составляющая мембранного потенциала. Другие авторы предложили гипотезу активного механизма выхода, движущей силой которого является A'f [Gunter et al., 1983; 1991]. С целью выяснения механизмов выхода Ca'* из нагруженных митохондрий мы провели ингибиторный анализ с использованием разобщителя окислительного фосфорилирования СССР"1 и К*-иоиофоров нигерицина и валиноми-цина. Результаты исследований показали, что добавка СССР ингибировала скорость выхода на 30%. Поскольку СССР элиминирует A'F на митохондриальной мембране, можно предположить, что выход Ca5* имеет электрогенную природу. Однако, неполный характер ингиби-рования свидетельствует о том, что значительная доля освобождения катиона ЛЧ>- нечувствительна. В дальнейших опытах мы обнаружили, что выход Саг* полностью ингибировался нигерицином и активировался (в 2 раза) валиномицином. Чтобы усилить эффекты К*-ионофоров, среда инкубации, используемая в этих экспериментах, была дополнена соответ-

10 СССР - карбонилцианид-м-хпорфенилгидразон;

ственно 0.5 мМ и 4 мМ КС1. Известно, что нигерицин и валиномицин являются ионофорами К*. Добавка нигерицина к митохондриям, дышащим в КС1-среде, уравновешивает градиенты К* и Н* на мембране и обращает часть ДрН в ДЧ', уменьшая его величину, в то время как валиномицин увеличивает этот параметр [Николе, 1985]. Таким образом, мы получили, что уменьшение йрН приводит к полному блокированию выхода Са2*, что согласуется с механизмом пассивного Са27Н*-обмена, постулированного большинством авторов.

Совокупность этих данных дает основания заключить, что основная доля выхода Са2* из нагруженных митохондрий дрожжей имеет электронейтральную природу. Однако, незначительный ингибирующий эффект субмикромолярных концентраций разобщителя на освобождение Са2' позволяет предположить, что некоторый компонент активной транслокации может также иметь место в этом случае. Возможно, выход Са2', постулируемый нами как №*-независимый, может функционировать и по активному (злекгрогеккому) механизму, и по пассивному (алектронейтральному) в зависимости от физиологических условий.

Итак, впервые в митохондриях дрожжей £. тадпизи, наряду с системой энергозависимого поглощения Са2*, была обнаружена активно функционирующая система выхода катиона, которая ингибировалась ионами лантана, марганца, магния, и ТФФ* и активировалась спермином. Мы полагаем, что выход Са2*, наблюдаемый в условиях наших экспериментов, является специфическим Ма*-независимым путем освобождения катиона из митохондрий, и механизм этого процесса может определяться как пассивный Саг*УпН*-обыен.

Известно, что увеличение матриксного содержания Са2* в сочетании с различными триг-герными факторами (окислительный стресс, деэнергмзация, истощение по адениновым нуклеотцдам) и веществами-индукторами (Ф„", БН-реагенты, разобщители, ингибиторы ТАН, оксалоацетат и др.) индуцирует неслецифическую проницаемость во внутренней мембране митохондрий, следствием которой является падение ДЧ* и неконтролируемый выход ионов Са2* [вигиег е! а1„ 1994]. Это явление рассматривается в настоящее время как неспецифический путь выхода Са2*, функционирующий при высоких нагрузках кальция на митохондрии. Известно. что неселективная мембранная пора является феноменом, присущим только митохондриям из животных тканей. В связи с этим нам представилось интересным детально исследовать возможность возникновения Са2*-зависимой неспецифической проницаемости в митохондриях дрожжей.

Одним из основных признаков неспецифической проницаемости, как известно, является высокоамплитудное набухание митохондрий, связанное с неконтролируемым поступлением в матриксное пространство Сахаров и осмотически активных ионов, а, следовательно, и воды. Поэтому для исследования явления неспецифической поры в митохондриях дрожжей мы провели мониторинг изменения митохондриального объема в присутствии раз- личных концентраций Са2* в сочетании с триггерными агентами - Ф„, СССР, оксапоацетатом, М-ЭМ12, Атр.

" Ф„- неорганический фосфат;

12 (Ч-ЭМ- М-этилмалеимид;

Исследования показали, что митохондрии Е. magnusii не подвергались высокоамплитудному набуханию 8 присутствии широкого диапазона нагрузок Са2* (200-1 ООО нмоль/ мг белка) и всех упомянутых индуцирующих агентов, широко известных в качестве индукторов неспецифической проницаемости в митохондриях животных [Chavez, Osornio, 1988, Broekemeier е! al., 1989; Lapidus, Sokolove, 1993; Bernard! et a!., 1993; Lapidus, Sokolove, 1994; Petronilli et al., 1994].

Основываясь на последних данных, указывающих, что энергизованные митохондрии менее чувствительны к возникновению Са2*-зависимой поры, чем деэнергизованные [Connern, Halestrap, 1994; Woodfield et al., 1996], мы проверили эффекты индуцирующих агентов на митохондриях, деэнергизованных по модели Хапесграла [Woodfield et al., 1996] (подробнее см. "Объект и методы исследования"). Однако, и в этом случае не наблюдалось признаков нарушения мембранной проницаемости и набухания митохондрий высокой амплитуды.

На основании полученных данных, мы заключили, что энергизованные и деэнергизован-ные митохондрии дрожжей Е. magnusii, в отличие от митохондрий животных, не подвергаются неспецифической мембранной проницаемости в условиях ее индукции триггерными агентами и высокими концентрациями Са2*.

Таким образом, в ходе наших исследований впервые было показано, что в исследуемых условиях а митохондриях дрожжей В. magnusii не функционирует неспецифический путь выхода Са2* вследствие мембранных пертурбаций, вызванных образованием Са2*-зависимой неселективной мембранной поры.

5.Физиологическая значимость системы транспорта Са^митохондрий дрожжей

Endomyces magnusii

Широко известно, что система транспорта Са2* митохондрий животных принимает участие в регуляции окислительного метаболизма посредством модуляции активностей трех ключевых Са2*-чувствительных дегидрогеназ цикла Кребса - пируватдегидрогеназы, 2-оксоглутаратдегидрогеназы и НАД-зааисимой изоцитратдегидрогеназы [Rutter, Denton, 1988; McCormack, Denton, 1990; 1994]. В митохондриях растений и беспозвоночных животных существование такого механизма отрицается [McCormack, Denton, 1981; 198SJ. Поскольку в митохондриях дрожжей Е. magnusii найдена и детально охарактеризована Саг*-транспортирующая система, осуществляющая не только поглощение ионов Са2*, но и их освобождение из митохондрий, нам представилось интересным исследовать возможность участия системы транслокации катиона в регуляции внутримитохондриального Са2* и окислительного метаболизма в дрожжевых митохондриях.С этой целью мы исследовали влияние варьирующих концентраций ионов Са2* в среде (от 109 М до 10fl М) на окислительную активность митохондрий дрожжей на примере НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-идг)*.

" Эта часть работы выполнена под руководством проф. Х.Крёнера (Институт физиологической химии II. Университет г. Дюссельдорфа.

20

Рис. 11. Зависимость скорости поглощения кислорода (А) и скорости образования НАДН (Б) митохондриями Е. magnusii при окислении DL-изоцитрата от концентрации Ca1" в среде инкубации; 1-контроль; 2-е отсутствие АДФ; 3-е отсутствие Mg2*; 4-в отсутствие НАД*. Состав среды инкубации см. в разделе "Объект и методы исследования".

Активность НАД-идг измерялась двумя независимыми методами - определением скорости поглощения кислорода и скорости образования НАДН в митохондриальной суспензии при окислении DL-изоцитрата. Известно, что активация фермента ионами кальция происходит при очень низких концентрациях катиона, поэтому эксперименты по изучению феномена Са2*-чувствительности НАД-идг проводились в присутствии Саг*-буфера ДМНТА. Как видно из рис. 11, скорость поглощения кислорода митохондриями Е. magnusii при окислении DL-изоцитрата проявляла широкую зависимость от концентрации Ca2* а среде инкубации. Полумаксимальная активация НАД-идг' происходила в присутствии 0.1 мкМ Ca2* (рис. 11 А), максимальный стимулирующий эффект оказывал 0.3 мкМ Саг* - скорость поглощения кислорода увеличивалась в 1.7 раза. Дальнейшее возрастание концентрации Ca2* не приводило к увеличению скорости дыхания митохондрий. Эффект Ca2* уменьшался в отсутствие коферментов НАД-идг АДФ (рис. 11А, кривая 2), НАД* (рис. 11 А, кривая 4) и ионов Мдг* (рис. 11А, кривая 3). Аналогичные результаты были получены в ходе изучения скорости образования НАДН при окислении DL-изоцитрата (рис. 11 Б).

Исследование влияния Саг* на скорость окисления DL-изоцитрата митохондриями Е. magnusii показало, что в присутствии 0.3 мкМ кальция происходит не только существенное

увеличение скорости реакции, но и уменьшение К», НАД-идг для изоцитрата (рис. 12, 13). Причем эффект Са" проявлялся и при насыщающих концентрациях субстрата.

Рис. 12. Зависимость скорости поглощения кислорода митохондриями Е. magnusii от концентрации DL-изоцитрата в среде инкубации ¡А); а координатах Лаинуивера-Берка(Б). 1-контроль; 2-е присутствии 0.3 мкМ Са". Состав среды инкубации см. в разделе "Объект и методы исследования".

Кинетический анализ кривых в координатах Лаинуиаера-Берка продемонстрировал, что Кт уменьшалась от 2. 1 мМ до 1.4 мЫ (метод измерения скорости поглощения кислорода) (рис. 12) и от 2.22 мМ до 1. 54 иМ (метод измерения скорости образования НАДН) (рис. 13). В контрольных экспериментах было показано, что ионы Са2' ие активировали окисление сукцината митохондриями.

Таким образом, результаты наших опытов показали, что НАД-зависимая изо-цитратдегидрогеназа активируется в присутствии ионов Са2*. Вычисленная нами Ко,5 для Са2*, равная = 0.1мкМ, близка к аналогичным величинам, доложенным для Са2*-чувствительных дегидрогеназ митохондрий животных -0.1 - 10 мкМ [McConmack, Denton, 1984; 1990; McCormack et al„ 1988]. Обнаружение Ca2*-чувствительности НАД-идг митохондрий дрожжей £ magnusii позволяет сделать предположение, что Са2*-транспортирующая система дрожжевых митохондрий, подобно системе транспорта Са2* митохондрий млекопитающих, может участвовать в регуляции окислительного метаболизма посредством модуляции концентрации внутриммтохондриального Са2*. По мнению Дентона и Маккормака [McCormack, Denton, 1990; 1994] Са2*-регуляция трех ключевых дегидрогеназ позволяет осуществлять стимуляцию окислительного метаболизма без существенного изменения отношений АДФ/АТФ и НАДН/НАД*. которые, как известно, играют ключевую роль в тонкой регуляции клеточного дыхания. Вероятно, в митохондриях дрожжей может иметь место подобный механизм модуляции окислительного метаболизма. Обнаружение Са2*-чуествмтельности двух других дегидрогеназ (пируватдегидрогеназы и 2-оксоглутара-тдегидрогеназы) позволило бы более конкретно ответить на этот вопрос. Отметим лишь, что в

* 6 8 10 [ОЦ-изоцитрат], мМ

настоящее время НАД-идг митохондрий дрожжей Е. тадпмИ является единственной Са2*-чувствительной дегидрогеназой цикла Кребса, обнаруженной в клетках низших эукариот.

Рис. 13. Зависимость скорости образования НАДН митохондриями Е. тадпизП от концентрации Р^изоцитрата в среде инкубации (А); в координатах Паинуивера-Берка (Б). 1-контроль; 2-е присутствии 0.3 мкМ Сз". Состав среды инкубации см. в разделе "Объект и методы исследования".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что Са1'-транспортирующая система дрожжевых митохондрий активировалась очень низкими (физиологическими) концентрациями АДФ. Напомним, что активирующий эффект спермина и ионов Са2* на систему транспорта ионов Са2* митохондриями Е. тадпиэй также достигался при добавлении низких концентраций эффекторов (10-25 мкМ). Высокая чувствительность дрожжевой Са2'-транспортирующей системы к действию физиологических эффекторов позволяет рассматривать ее в качестве перспективной модепи при поиске других возможных модуляторов Са2*-транспорта в митохондриях. Совместное действие исследованных нами физиологических эффекторов - спермина, АДФ, НАДН и ионов Са2*, придающее дрожжевым митохондриям способность с очень высокими скоростями транспортировать ионы Са2* и поддерживать низкую концентрацию внемитохондриального Са2* (на уровне нижнего предела чувствительности использованных методов определения концентрации свободного катиона), а также Са2* -чувствитепьность НАД-зависимой изоцитрат-дегмдрогеназы, могуг обеспечивать важную роль митохондрий Е. тадпизп в кратковременной регуляции митохондриального и клеточного дыхания, аналогично тому, как это постулируется для митохондрий животных. Следует подчеркнуть, что дрожжи Е тадпизп были и остаются единственным видом дрожжей, митохондрии которых обладают эффективной, регулируемой системой транспорта ионов Са2*, обладающей не только системой поглощения, но и системой специфического выхода накопленного Са2*. Мы склонны связывать это свойство с особенностями энергетического обмена дрожжей Е. тадпи&И и постулировать существование тесной взаимосвязи между способностью митохондрий транспортировать ионы Са2* и структурной организацией дыхательной цепи (функционированием комплекса 1 в дыхательной цепи и от-

10 15

[РЦ-изоцитрат]-1, М-5

сутствмем альтернативных путей окисления), обеспечивающей поддержание высокого отношения НАДН/НАД.

На рис. 14 представлена схема, обобщающая результаты нашей работы по изучению организации Са2*-транспортирующей системы митохондрий дрожжей Е тадпизи. Увеличение концентрации катиона в цитозоле приводит к активации пути поступления Са2* в митохондрии -электрофоретического Саг,-унипортера (1). Увеличение матриксного содержания катиона приводит к активации системы выхода Сэ2* - электронейтрального Са2*/пН*-переносчика (2). Совместное функционирование этих транспортных систем приводит к установлению определенного уровня свободного Са2* в митохондриальном матриксе, необходимого для активации Са!*-чувствительных энзимов (НАД-зависимой изоцитрагдегидрогеназы). В свою очередь, стимуляция Са2*-зависимых дешдрогеназ цикла Кребса приводит к увеличению образования НАДН, являющегося, как известно, главным субстратом дыхательной цепи, и активации окислительного фосфорилирования и митохондриального дыхания. Таким образом, на основании полученных нами результатов, в рамках предложенной схемы (рис. 14) можно предположить, что в клетках низших эукариот - дрожжей - ионы Са2* могут играть роль вторичного мессенджера в передаче сигнала из цитозолыюго пространства в ттохондриальный матрикс, и участвовать в осуществлении так называемого "внешнего" контроля окислительного метаболизма [МсСогшаск, Оеп!ол, 1994], и ключевую роль в этом процессе играет Са2*-транспортирующая система митохондрий.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано стимулирующее действие физиологических концентраций АДФ на систему транспорта Са2* митохондрий дрожжей Епс/отусез тэдпиБ». Показано, что в присутствии АДФ происходит существенное увеличение скорости поглощения катиона и возрастает сродство системы к Са2*. Максисмальный эффект нуклеотида наблюдается при 10-15 мкМ АДФ с К„, около 3 мкМ. Природный полиамин спермин потенциирует активирующий эффект АДФ и способствует наиболее полному поглощению всего добавленного Са2*.

2. Продемонстрировано, что Са2*-транспортирующая система специфически активируется экзогенным НАДН. Предварительная инкубация суспензии митохондрий с НАДН приводит к значительному увеличению скорости транспорта Са2* и умеренному возрастанию сродства системы к катиону.

3. Показано, что ионы Са2*, наряду с АДФ и НАДН, также являются эффективными положительными модуляторами системы транспорта Са2*. Предварительная инкубация митохондри-альной суспензии с 20 мкМ Са'* обусловливает увеличение буферных свойств и придает митохондриям способность к наиболее полному поглощению Са!* из среды исследования.

4. Совместное действие всех исследованных физиологических эффекторов обусловливает чрезвычайно высокие скорости транспорта Са2* и определяет способность митохондрий под-

Рис. 14. Схема Са2*-транспортирующей системы внутренней мембраны митохондрий дрожжей Е. тадпивИ и ее модуляторы. Условные обозначений: 1 - Са2*-унипортер; 2 - Са!*/пН*-обменник; 3 - Фн/пН'-симпортер; НАД-идг - НАД-зависимая изоцитрат-дегидрогеназа; пдг-пируватдвгидрогеназа;'2-огдг - 2-оксоглутаратдегидрогеназа; ВММ - внутренняя митохондризльная мембрана; ММ - митохондриальный метрике. Значком © обозначена активация, значком Э - ингибирование.

держивать концентрацию Са2* на очень низком уровне, сопоставимом с нижним пределом чувствительности используемого метода.

5. Обнаружено, что матриксная НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа активируется в присутствии субмикромолярных концентраций кальция с полумаксимальным эффектом при 100 нМ Са2*. При этом происходит увеличение скорости ферментативной реакции и уменьшение Кт фермента для изоцитрата.

6. В митохондриях дрожжей обнаружена система выхода Са2*, ингибирующаяся ТФФ* с К, около 2 мкМ. Предполагается, что исследованная система является ^'-независимым путем освобождения Са2*, осуществляемым электронейтральным Са2* /пН*- обменником.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Zvjagilskaya R., BazhenovaE., Deryabiria Yu. (1995) The Са2*-transport system of yeast mitochondria as affected by physiological effectors. Yeast, V. 11, sp. issue, Abstracts 17 th Int. Conf. on Yeast genetics and molecular biology. P.S469, (Lisboa, Portugual).

2. Дерябина Ю.И., Баженова E.H., Звягильская P.A. (1996) Регуляция транспорта ионов кальция митохондрий дрожжей Endomyces rnagnusii. Биохимия, Т.61, N 9, С. 1704-1713.

3. Zvyagilskaya R.A., Bazhenova E.N., Deryabina Yu. I. (1996) Yeast mitochondria offer a fertile field for evaluating Ca2*-transport as affected by physiological modulators. Biochim. Biophys. Acta, V. 9, sp. issue. Abstracts of 9 th EBEC. P. 1S3.

4. Zvyagilskaya R., Bazhenova E., Deryabina Yu. (1996) The Ca2*-transport system of yeast mitochondria: properties, regulation and possible physiological implication. Abstracts of Albany Conference (Frontiers of mitochondrial research), P. 1.

5. Баженова E.H., Дерябина Ю.И., Звягильская PA (1997) Стимулирующее действие АДФ на систему транспорта ионов кальция митохондрий дрожжей. ДАН РАН, Т.353, N 4, С.1-3.