Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств и функции Ca2+-атвивируемого канала митохондрий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлов, Евгений Владимирович, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

ПАВЛОВ Евгений Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И ФУНКЦИИ Са2+- АКТИВИРУЕМОГО КАНАЛА

МИТОХОНДРИЙ

03.00.02.- биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Миронова Г. Д, кандидат биологических наук Лазарева А. В.

ПУЩИНО -1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.-----------------4

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.------------------------------------8

1.1. Роль митохондрий в регуляции уровня клеточного кальция. ---------------------------------------------8

1 .2.Митохондриальные системы транспорта кальция.---------------------------------------------------9

1.3. МитохондриальнаяСа2+-акшвируемаянеселекшвнаяпора.----------------------------------------13

1.3.1. Факторы, влияющие на открытие поры.---14

1.3.2. Молекулярные механизмы функционирования поры.--------------24

1.3.3. Физиологическая роль поры.-----33

1.4. Фазовые переходы липидных мембран.-----------------------------------------------------------------------38

1.5. Осцилляции концентрации внутриклеточного кальция в электюневозбудимых клетках.-----42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.---45

2.1. Метод выделения митохондрий из печени крыс.-------------------------------------------------------45

2.2. Определение митохондриального белка.--------------------------------------------------------------46

2.3. Метод этанольной экстракции.-------------------------------------------------------------------------46

2.4. Экстракция липидов по методу Фолча.-------------------------------------------------------------------47

2.5. Очистка гидрофобного экстракта на колонке с кремниевой кислотой.------------------------47

2.6. Методика проведения аналитической и препаративной тонкослойной хроматографии.-------48

2.7. Методика изучения Са2+- связывающих свойств вещества.----------------------------------------48

2.8. Изучение ион- транспортирующих свойств.---------------------------------------------------------49

2.9. Получение митохондрий в различных функциональных состояниях.------------------------------50

2. Ю.Методы изучения химической структуры вещества.---------------------------------------------------51

2.11. Анализ активности маркерных ферментов.----------------------------------------------------------51

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ---------------53

3.1. Выделение и очистка Са2+-связываюгцего, ион- транспортирующего вещества из внутренней мембраны митохондрий.----------------------------------------------------------------------------------------53

3.2. Изучение химической структуры вещества----------------------------------------------------------------57

3.3. Изучение Са^-связывающих свойств вещества.-------------------------------------------------63

3.4. Изучение ион-транспортирующих свойств вещества.---------------------------------------------------68

3.5. Выяснение возможной функциональной роли изучаемого вещества в митохондриях.--------70

3.6. Эффект колебаний проводимости БЛМ, модифицированной суммарным гидрофобным экстрактом.-----------------------------------------------------------------------------------------72

ЗАКЛЮЧЕНИЕ____________________________________________________76

ВЫВОДЫ.---80

ЛИТЕРАТУРА.-------------------82

ВВЕДЕНИЕ.

Ионы кальция, как известно, участвуют в регуляции жизненно важных процессов, происходящих в клетке. Уровень кальция в цитоплазме контролируется работой Са2+-транспортирующих систем, локализованных в плазматической мембране и в мембранах клеточных органелл. Митохондрии, например, способны аккумулировать избыточный кальций цитоплазмы, что, в свою очередь, активирует Са2+- чувствительные ферменты их матрикса.

В митохондриях существует, по крайней мере, четыре системы транспорта кальция. Поглощение кальция энергизованными митохондриями происходит электрофоретически через, так называемый, кальциевый унипортер, работа которого ингибируется рутениевым красным. Выход кальция из митохондрий осуществляется, в зависимости от ткани, двумя различными антипортерами. Ма+/Са2+ антипортер присутствует в мозге, сердце и других возбудимых тканях и, в меньшей с тепени, в печени, тогда как Н+/Са2+ обменник обнаружен в печени, легких, почках и гладких мышцах. В последнее время большое внимание уделяется изучению митохондриальной Са2+-зависимой неселективной поры, которая ингибируется циклоспорином А. Полагают, что она может участвовать в быстром выбросе кальция из митохондрий, а также белков, инициирующих апоптоз. Открытие поры связано, как правило, с увеличением концентрации кальция в митохондриях и защелачиванием их матрикса.

Несмотря на то, что параметры функционирования митохондриальных систем транспорта кальция детально охарактеризованы, молекулярный механизм их работы до конца не

выяснен. В настоящее время во многих лабораториях ведутся интенсивные исследования по выяснению структурной организации этих систем. В нашей лаборатории был выделен комплекс, состоящий из гликопротеида с молекулярной массой 40 кДа и пептида с молекулярной массой 2 кДа, который обладал способностью увеличивать проводимость бислойной липидной мембраны по механизму, чувствительному к рутениевому красному. (Mironova et al. 1982, 1994). Тот факт, что антитела к этому комплексу ингибировали в митохондриях чувствительный к рутениевому красному транспорт кальция, указывает на его принадлежность к системе Са2+-унипортера. (Mironova et al. 1994) Другая Са2+-транспортирующая система, функционирующая в митохондриях как Ыа+/Са2+-обменник, была выделена в лаборатории Гарлида в виде белка с молекулярной массой около 110 кДа (Garlid et al. 1992).

Особый интерес представляет выяснение природы и

молекулярных механизмов функционирования митохондриальной Са2+-индуцируемой неселективной поры. Актуальность данной проблемы связана с тем, что пора может играть ключевую роль в целом ряде физиологических и патологических процессов, происходящих в клетке и в митохондриях. Так показано, что пора может принимать участие в процессе гибели клеток, вызванном гипоксией или ишемическим повреждением, (Crompton, 1990) а также в процессе апоптоза (Mercep et al., 1989). Предполагается, что пора может открываться и при физиологических условиях в том случае, если необходим быстрый выброс избытка кальция или других компонентов из матрикса митохондрий (Gunter et al., 1990). Несмотря на то, что существует несколько предположений относительно того, какие структуры ответственны за формирование неселективных каналов

проводимости при повышении концентрации кальция в митохондриях, ответ на этот вопрос до сих пор не получен.

Целью настоящей работы было: выделение, очистка и изучение свойств низкомолекулярного гидрофобного каналообразующего компонента внутренней мембраны митохондрий , а также выяснение его возможной роли в формировании в митохондриях Са2+-активируемой неселективной поры.

В диссертации были поставлены и решены следующие задачи:

1. Выделить и очистить компонент внутренней мембраны митохондрий, способный образовывать в бислойной липидной мембране (БЛМ) Са2+-активируемые каналы проводимости.

2. Провести физико-химический анализ структуры каналообразующего вещества.

3. Изучить ион-транспортирующие свойства вещества путем его реконструкции в бислойную липидную мембрану.

4. Измерить параметры связывания кальция изучаемым веществом.

5. В экспериментах на интактных митохондриях исследовать влияние специфического ингибитора митохондриальной поры циклоспорина А на активность Са2+-связывающего каналообразующего компонента.

Научная новизна работы.

Впервые из внутренней мембраны митохондрий выделен низкомолекулярный гидрофобный компонент, обладающий высоким сродством к кальцию и способный в присутствии ионов кальция формировать в бислойной липидной мембране каналы проводимости. Приведены доказательства его участия в формировании в митохондриях Са2+-индуцируемой, циклоспорин А - чувствительной неселективной поры.

Научно-практическое значение работы.

Полученные данные развивают? представления о механизме митохондриальной Са2+-индуцируемой неселективной проницаемости. Результаты могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, а в дальнейшем найти применение в медицинских приложениях при разработке фармакологических препаратов, поскольку в настоящее время показано, что открытие поры происходит при патологиях, например таких как ишемия миокарда и окислительный стресс. Открытие поры играет так же ключевую роль в процессе апоптоза клеток.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Роль митохондрий в регуляции уровня клеточного кальция.

Ионы кальция играют важную роль в регуляции активности целого ряда ферментных систем, включая системы, ответственные за мышечное сокращение, передачу нервного импульса, свертывание крови и многие другие. Способность кальция регулировать внутриклеточные процессы обеспечивается прежде всего наличием высокого концентрационного градиента между цитоплазмой, где концентрация кальция в покое поддерживается на субмикромолярном уровне (О'БоЬе^у et а1., 1980; ЕаЫа1:о, 1981), и межклеточной жидкостью, концентрация кальция в которой равна 10~3 М, а также между цитоплазмой и внутриклеточными органеллами. Наличие такого высокого градиента позволяет ионам кальция играть роль внутриклеточного мессенджера, поскольку в ответ на внешнее гормональное воздействие концентрация кальция в клетке может увеличиваться на один-два порядка (В1аскшоге et а1., 1982; Иазшиззеп et а1.,1983), активируя при этом различные клеточные процессы.

Концентрация внутриклеточного кальция регулируется немембранными Са2+-связывающими белками, а также различными мембранными Са2+-транспортирующими системами. Примерами Са2+-связывающих белков могут служить: тропонин С, парвальбумин и кальмодулин. Однако, основную роль в регуляции концентрации кальция игают специфические Са2+-транспортирующие системы различных мембран. Такие системы были обнаружены в плазматической мембране, эндоплазматическом ретикулуме и в митохондриях. Эти системы различаются по своей афинности к кальцию и скорости транспорта, и следовательно, по видимому

различна их роль в поддержании физиологических, а также в развитии патологических состояний клетки.

Долгое время считалось, что митохондрии играют очень важную роль в регуляции уровня цитоплазматического кальция, однако позже было показано, что афинность Са2+-транспортирующих систем митохондрий к кальцию (1 мкМ) (Nicholls, 1978), а также скорость, с которой они способны транспортировать кальций, гораздо ниже, чем у подобных систем эндоплазматического ретикулума. В то же время митохондрии способны накапливать гораздо большие количества кальция, чем эндоплазматический ретикулум (Richter, 1992). Таким образом, вполне вероятно, что митохондрии способны снижать уровень цитоплазматического кальция в тех случаях, когда его концентрация достигает уровня при котором начинают работать их Са2+-транспортирующие системы. В этом случае митохондрии могут выполнять защитную функцию при повышении уровня кальция в клетке, например в тех случаях, когда активность Са2+-АТФазы клеточной мембраны снижена из-за недостатка АТФ (Farber, 1982). С другой стороны, способность митохондрий аккумулировать кальций при повышении его концентрации в цитоплазме играет важную роль в активации ряда митохондриальных Са2+-чувствительных ферментов, а именно: пируватдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы и

оксоглутаратдегидрогеназы, что, в свою очередь, приводит к активации дыхательной цепи и к увеличению синтеза АТФ (McCormack et al. 1990).

1.2.Митохондриальные системы транспорта кальция.

В митохондриях существует, по крайней мере, четыре системы транспорта кальция. Вход кальция осуществляется

электрофоретически по механизму унипортера (Rottenberg et al., 1974). Выход кальция из митохондрий происходит электронейтрально и связан с функционированием таких систем, как Na+/Ca2+ и Н+/Са2+ обменники (Puskin et al., 1976). Четвертая система связана с быстрым выбросом кальция из митохондрий, происходящим при определенных условиях в результате активации Са2+-чувствительной поры.

Способность митохондрий накапливать кальций связана с наличием на их внутренней мембране электрохимического градиента протонов. Градиент протонов поддерживается работой дыхательной цепи (Mitchell, 1966), а также зависит от активности митохондриальной Н+-АТФазы. То что протонный градиент является движущей силой входа кальция подтверждается тем фактом, что в знергизованных митохондриях вход кальция предотвращается ингибиторами дыхательной цепи, но не олигомицином - ингибитором Н+-АТФазы (Lehnindger et al.,1967). В то же время, в условиях, когда выброс протонов происходит за счет гидролиза АТФ вход кальция может быть заингибирован ингибиторами Н+-АТФазы, но не ингибиторами дыхательной цепи (Lehnindger et al.,1967). На основании этих экспериментов был сделан вывод, что вход кальция в митохондрии не происходит ни по механизму обменника, ни по механизму симпорта, а осуществляется электрофоретически за счет работы унипортера(Scarpa et al., 1970). Установлено, что работа унипортера ингибируется магнием (Scarpa et al., 1973) и активируется спермином (Allshire et al., 1985). Также был обнаружен специфический ингибитор унипортера - поликатион рутениевый красный (Mela, 1969, Puskin et al., 1976). За работу кальциевого унипортера в митохондриях, по видимому, ответственней комплекс, состоящий из гликопротеида с

молекулярной массой 40 кДа и пептида с молекулярной массой 2 кДа. Этот комплекс был ранее выделен в нашей лаборатории и было показано, что его кальций транспортирующая активность ингибируется рутениевым красным, а так же полученными к нему специфическими антителами. (Миронова и др.,1989, Saris et al. 1993) .

В митохондриях существует две различные системы выхода кальция: Ыа+-зависимая и Ыа+-независимая. Активность той или иной системы зависит от ткани, из которой были выделены митохондрии. Ыа+-зависимая система функционирует в основном в митохондриях сердца, мозга и скелетных мышц (Crompton st al., 1977, Murphy et al., 1988). Она представляет из себя Ca2+/nNa+-обменник. Выход кальция происходит с ¥маКС равной 18 нмоль Са2+/ мг белка в минуту при 25°С (Crompton et al. 1978). Скорость выхода кальция имеет сигмоидальную зависимость от концентрации натрия. Ингибиторами Ыа+-зависимого выхода кальция являются ионы магния (Clark et al.,1980), марганца (Gunter et al., 1989), трифторперазин (Hayat et al.f 1985), липофильные катионы (Wingrove et al., 1986), а также высокие концентрации внешнего кальция (Hayat et al., 1982). Внешний кальций в концентрации 0.70 мкМ снижает скорость работы обменника в два раза и полностью ингибирует при концентрации большей 2 мкМ (Hayat et al., 1987). Это ингибирование носит частично неконкурентный характер с коэффициентом Хилла для кальция равным 2 (Hayat et al., 1982). Ингибирующий эффект магния, по-видимому, связан с его способностью взаимодействовать с местами связывания ответственными за работу обменника. Эффект магния снижается в присутствии АТФ и АДФ (Hayat et al., 1987). Система, ответственная за работу Са2+/Ыа+-обменника, была выделена в

лаборатории Гарлида в виде белка с молекулярной массой 110 кДа (Li et al., 1992).

Ыа+-независимая система выхода кальция обнаружена в митохндриях печени, почек, легких и гладких мышц (Crompton et al., 1977, Roiser et al., 1981). Ее функционирование связано с работой Са2+/пН+-обменника, однако стехиометрия обмена в настоящее время не выяснена. Существуют данные, согласно которым стехиометрия обмена в большой степени зависит от pH среды (Gunter et al., 1983). Скорость выхода имеет сигмоидальную зависимость от концентрации

внутримитохондриального кальция (Wingrove et al.,1986). При отсутствии внешних активаторов Умакс этой системы равна 18 нмоль Са2+/мг белка в минуту при Км для кальция равном 8.4 ммоль/мг белка(Wingrove et al.,1986). Ыа+-независимый выход кальция ингибируется ионами сурьмы (Saris et al.,1983) и марганца (Gunter et al., 1989), разобщителями (Ligeti et al., 1984), липофильными катионами (Wingrove et al.,1986), а также ионофором лазалоцидом А (Da Silva et al., 1984) при концентрациях, недостаточных для индуцирования им проводимости. Следует отметить, что большинство ингбиторов Na+-независимого транспорта кальция действуют в концентрациях гораздо больших, чем те, в которых они способны ингибировать Ма+-зависимый транспорт (Gunter et al., 1990). Молекулярные механизмы функционирования данной системы в настоящее время не установлены.

Кроме перечисленных выше систем транспорта кальция, в

митохондриях существует четвертая система, связанная с быстрым

2+ 0

выбросом кальция, в результате активации Ca -зависимои неселективной поры. При открытии поры наблюдается падение

мембранного потенциала и быстрый выход из матрикса митохондрий кальция, а также других компонентов с молекулярными массами до 1200 Да (Haworth et al., 1979). Специфическим ингибитором поры является циклоспорин A (Crompton et al., 1988, Broekemeier et al., 1989). Кроме того, открытие поры регулируется целым рядом веществ. Несмотя на то, что в настоящее время существует несколько гипотез, касающихся того, какие вещества ответственны за формирование поры, ответ на этот вопрос до сих пор не получен. Считается, что помимо регуляции уровня клеточного и митохондриального кальция пора может принимать участие в развитии ряда патологий, таких, например, как ишемическое повреждение и окислительный стресс (Halestrap, 1994). Отк�