Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих

Холмухамедов, Эхсон Лукманович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих"

На правах рукописи

ХОЛМУХАМЕДОВ Эхсон Лукманович

Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания

клеток млекопитающих

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУЩИНО 2008

003446827

Работа выполнена Институт Теоретической и Экспериментальной

Биофизики РАН, Пущино Российская Федерация Университет Северной Каролины, Чапел Хил США (University of North Carolina at Chapel Hill, NC USA)

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук,

Профессор Виноградов Андрей Дмитриевич

Доктор медицинских наук

Профессор Маевский Евгений Ильич

Доктор биологических наук

Профессор Зоров Дмитрий Борисович

Ведущая организация

Институт Биофизики Клетки РАН

Защита диссертации состоится " 17 " сентября 2008 г в " 15-30 " часов на заседании совета Д 002 093 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, г Пущино Московской обл , ул Институтская, 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке ПНЦБИ РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, 3

Автореферат разослан 15 08 2008 г

Ученый секретарь ,

диссертационного совета ^//гг ^

кандидат физ-мат наук Панина Н Ф

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Митохондрии являются важнейшими внутриклеточными структурами, выполняющими значительную роль в функционировании клеток млекопитающих в нормальных условиях и в развитии патологических процессов Развитие большинства патологических процессов, в частности аноксии, ишемии, геморрагического шока и окисления этанола сопровождается нарушениями нормального функционирования митохондрий и глобальной потерей митохондриальных функций Это выражается в неспособности митохондрий поддерживать электрохимический градиент ионов водорода на внутренней мембране, с потерей способности эффективно осуществлять окислительное фосфорилирование, производство АТФ и сбалансированный митохондриальный Са2* ионный гомеостаз, несмотря на наличие кислорода, и субстратов окисления Изучение роли митохондрий в жизнедеятельности клеток млекопитающих осложнено множественностью функций выполняемых митохондриями и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между митохондриями и остальными внутриклеточными структурами Многочисленные экспериментальные данные указывают на то, что митохондрии являются первичными мишенями патологических воздействий, которые в большинстве случаев обусловлены нарушениями внутриклеточного Са2* гомеостаза Кроме хорошо известной роли митохондрий как основного производителя АТФ, универсальной внутриклеточной энергетической "валюты", митохондрии также принимают непосредственное участие в регуляции свободной концентрации клеточного Са2\ исполняя роль внутриклеточного кальциевого депо с низким сродством, которое, однако, по своей емкости намного превосходит емкости эндо - и/или саркоплазматического ретикулумов В нормальной, покоящейся клетке, митохондрии, окруженные цитоплазмой с низкой концентрацией ионов Са2*, находятся в стационарном состоянии умеренного покоя, так как концентрация свободного Са2* существенно ниже сродства митохондриальной Са2* транспортирующей системы митохондрий Однако при переходных процессах концентрация ионов Са2* в цитоплазме значительно возрастает, в особенности в областях, заключенных между эндоплазматическим ретикулумом и собственно митохондриями Вследствие этого митохондрии оказываются окруженными высокой концентрацией свободных ионов Са2\ что способствует накоплению значительных количеств ионов Са2* в матриксе В этих условиях количество и концентрация ионов Са2* в матриксе митохондрий оказывается достаточным для индукции изменений состояния митохондрий увеличению производства АТФ, генерации кислородных радикалов, активации неспецифической поры в мембране митохондрий, набуханию и разрыву внешней мембраны митохондрий Т о митохондриальный транспорт Са2*, в зависимости от количества накопленного Са2*, определяет судьбу клеток млекопитающих от нормального функционирования до программируемой или некротической, клеточной гибели При ишемическом повреждении сердечной мышцы, эта способность митохондрий накапливать и освобождать ионы Са2* определяет степень пост-ишемического повреждения сердечной мышцы В период ишемии, когда из-за закупорки коронарных сосудов подача кислорода и метаболитов к клеткам сердечной мышцы ограничена, активность митохондриальной дыхательной цепи подавлена и митохондриальная мембрана деполяризована При этом накопления ионов Са2* в митохондриях не происходит и никаких внешних проявлений повреждений тканей не наблюдается Наиболее резкие нарушения структуры и функции митохондрий и клеток наблюдаются после восстановления потока свежей крови через закупоренные коронарные сосуды, что приводит к подаче кислорода и метаболитов к

ишемической ткани и удалению продуктов метаболизма По-видимому, поступление кислорода к анаэробным митохондриям с высоким уровнем восстановленности участников дыхательной цепи и переноса электронов, сопровождающееся быстрым восстановлением митохондриального мембранного потенциала, приводит к значительному и интенсивному накоплению ионов Са2+ в матрикс Повреждающее действие избыточного накопления ионов Са2* усиливается в условиях повышенного окислительного стресса, которое наблюдается при окислении многих ксенобиотиков, включая окисление этанола, в клетках печени Различные патологические условия, приводящие к повреждению митохондриальных функций, то обусловлены избыточным накоплением ионов Са2* в митохондриях, которое приводит к открыванию неспецифической поры и потере важнейших митохондриальных функций Следовательно, для понимания механизмов токсического действия ионов Са2+ на функции митохондрий, необходимо исследовать динамику этих ионов в клетках и определить взаимодействие этих ионов с митохондриями на различных уровнях - на изолированных митохондриях, на клеточных культурах и на целом органе Такой подход позволит нам понять следующее а) роль и участие митохондрий в поддержании нормальной жизнедеятельности клеток млекопитающих, б) роль митохондрий в определении динамики свободной концентрации цитоплазматических ионов Са2+, в) изучить механизм защитной роли и необходимости «умеренной» деполяризации митохондрий в пост-ишемическом периоде восстановления кровотока/перфузии в сердечной мышце и г) продемонстрировать, что нормальный обмен метаболитами между митохондриями и клеткой, является необходимым условием защиты от токсического действия ксенобиотиков, путем уменьшения Са2* стресса Т о изучение роли транспорта ионов Са2+ в митохондриях тканей сердца и печени позволит выявить факторы, которые являются определяющими в нарушениях митохондриальных функций при развитии различных патологических процессов, и использовать полученные данные для разработки методологических и терапевтических подходов для защиты этих органов Эти исследования позволят также произвести разработку методологических подходов направленных на уменьшение последствий ишемического и /или алкогольного повреждения тканей сердца и печени, а также к последующему лечению следствий ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени

Цель работы 1 Выяснить последствия взаимодействия ионов Са2+ с основными митохондриальными функциями и определить факторы, активирующие неспецифическую Са2+-зависимую пору во внутренней мембране митохондрий 2 Разработать математическую модель митохондриального ионного транспорта, основанную на регуляции проницаемости внутренней мембраны митохондрий Са2<-зависимой порой, которая активируется потоками ионов Н\ Са2*, К*, объемом матрикса, а также митохондриальным мембранным потенциалом 3 Получить экспериментальные доказательства участия энергозависимого транспорта Са2* в митохондриях в определении внутриклеточной динамики свободных ионов Са2*, включая генерацию, распространение и синхронизацию волн свободной концентрации Са2+ ионов в цитоплазме 4 На ишемической модели изолированного сердца крысы, определить роль митохондриального транспорта Са2* в механизме пост-ишемического повреждения сердечной мышцы 5 Выявить митохондриальный механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, таких как диазоксид и пинацидил, известных как фармакологические активаторы АТФ-зависимых К* каналов (Кдтф) плазматической мембраны 6 На модели изолированных гепатоцитов крыс, подтвердить нашу гипотезу о том, что причиной глобальной потери митохондриальных

функций при отравлении печени алкоголем, является закрывание пориновых каналов 7 Разработать подходы к экспериментальному измерению проницаемости пориновых каналов во внешней мембране интактных митохондрий внутри клетки без их выделения из гепатоцитов 8 Определить какой из продуктов окисления этанола (ЫАОН, кислородные радикалы, ацетальдегид и/или ацетат) играет существенную роль в механизме закрывания и способствует закрыванию митохондриальных пориновых каналов 9 Исследовать роль закрывания пориновых каналов и уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий к водорастворимым метаболитам, вовлеченным в митохондриальные стадии синтеза мочевины в печени 10 Используя 13С-ЯМР спектроскопию определить влияние этанола и закрывания пориновых каналов на митохондриальный метаболизм глицина и серина, являющегося составной частью системы синтеза и обмена метильных групп в гепатоцитах 11 Определить эффект закрывания пориновых каналов на цитотоксичность лекарственных препаратов на примере адафостина, известного адафостина, известного противоопухолевого препарата

Научная новизна работы Впервые разработана полная теоретическая модель энергозависимого транспорта ионов в митохондриях с учетом активации Са2*-зависимой неспецифической поры, которая воспроизводит все экспериментально наблюдаемые режимы ионного транспорта, включая колебания ионных потоков Впервые показано, в эксперименте и на модели, наличие Са2+-индуцированного выброса Са2* в митохондриях, нового явления, лежащего в основе «возбудимости» митохондриальной популяции Получены экспериментальные данные о синхронизирующей роли энергозависимого митохондриального транспорта Са2* на амплитуду и скорость распространения концентрационных волн ионов Са2* в цитоплазме живых клеток Установлено, что энергозависимый транспорт Са2+, а также Са2*-индуцированный выброс Са2* в митохондриях является составной частью механизма усиления внутриклеточных Са2* сигналов, необходимого для генерации, поддержания и синхронизации распространяющихся волн свободного Са2+ в цитоплазме клеток Исследован механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, диазоксида и пинацидила, известных активаторов АТФ-зависимых К* каналов (Кдтф) плазматической мембраны В работе впервые экспериментально доказано, что оба этих агента обладают протонофорными свойствами, благодаря которым эти соединения способствуют переносу заряженных ионов водорода (Н*) через гидрофобную фазу, будь то бислойная мембрана или гидрофобный растворитель Эти новые представления, позволили нам предположить, а затем впервые экспериментально продемонстрировать противоишемическое, защитное действие 2,4-динитрофенола, известного классического разобщителя окислительного фосфорилирования Нами впервые показано, что подобно диазоксиду и пинацидилу, 2,4-динитрофенол обладает выраженным противоишемическим защитным действием В настоящей работе впервые продемонстрировано изменение проницаемости пориновых каналов внешней мембраны митохондрий гепатоцитов крысы, вызванное окислением этанола Проницаемость пориновых каналов, являющихся единственными «воротами» обмена митохондриальных водорастворимых субстратов, была оценена в прямом эксперименте с помощью флуоресцентно-меченных молекул декстрана с молекулярным весом 3,000 Да, способных диффундировать только через открытые пориновые каналы Кроме того впервые продемонстрировано, что закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий гепатоцитов при окислении этанола ингибирует синтез мочевины и митохондриальный путь обмена метильных групп На изолированных митохондриях

печени крыс показано, что закрывание пориновых каналов приводит к окислительному стрессу, обусловленному подавлением диффузии супероксид анионов из межмембранного пространства На культуре клеток мышиных фибробластов показано, что закрывание или нокаутирование пориновых каналов приводит к повышению чувствительности клеток к адафостину, противоопухолевому препарату, с митохондриальным механизмом токсического действия Показано, что повышение цитотоксического действия адафостина выражающееся в ускорении апоптоза (программируемой клеточной гибели), обусловлено окислительным стрессом и усилением повреждающего действия ионов Са2+ на митохондрии Полученные в настоящей работе данные позволяют предполагать, что закрывание митохондриальных пориновых каналов в любых клетках млекопитающих будет сопровождаться усилением окислительного стресса и цитотоксического действия лекарственных препаратов В работе впервые продемонстрировано, что отсутствие пориновых каналов в мембране митохондрий приводит к многократному повышению чувствительности клеток млекопитающих к фармакологическим препаратам, вызывающим клеточную гибель по механизму апоптоза, обусловленную прямой активацией митохондриального пути апоптоза или же косвенно, через индукцию Са2+ стресса, который активирует митохондриальный апоптоз Полученные в настоящей работе экспериментальные данные указывают на ведущую роль пориновых каналов в регуляции основных митохондриальных функций, таких как синтез АТФ, энергозависимый транспорт ионов Са2+ и сенситизация митохондриального апоптоза Ценность полученных в настоящей работе данных заключается также в том, что они открывают раннее неизвестные возможности для повышения эффективности лечения человеческих опухолей путем совместного использования традиционных лекарственных препаратов с блокаторами пориновых каналов во внешней мембране митохондрий

Практическое значение работы Результаты проделанной работы могут быть использованы при разработке новых подходов к изучению и мониторингу динамических режимов свободной концентрации Са2+ ионов в клетках млекопитающих в норме и при различных патологических состояниях Неизвестные раннее и продемонстрированные в настоящей работе протонофорные свойства фармакологических препаратов, известных активаторов плазматических АТФ-зависимых К* каналов, открывают новые перспективы для поиска и/или синтеза новых противо-ишемических препаратов, которые будут обеспечивать защиту митохондрий сердца против ишемического повреждения по механизму специфической и «умеренной» деполяризации Наши наблюдения, сделанные на сердце крысы, могут быть взяты в качестве экспериментальной модели для разработки подходов для дизайна и изготовления, новых более эффективных противо-ишемических фармакологических препаратов, с протонофорным механизмом действия Усиление повреждающего действия ионов Са2* на митохондрии при блокировании пориновых каналов, представляет новую экспериментальную модель для разработки фармакологических препаратов, прицельно направленных на закрывание пориновых каналов во внутриклеточных митохондриях Такой подход является принципиально новым, основанным на оригинальной концепции о том, что закрывание пориновых каналов в митохондриях клеток млекопитающих повышает чувствительность клеток к фармакологическим препаратам Полученные в настоящей работе данные, открывают путь для принципиально нового подхода к повышению эффективности фармакологического действия противоопухолевых лекарственных препаратов путем их совместного использования с веществами, которые закрывают пориновые каналы во внешней

мембране митохондрий Такой оригинальный подход будет стимулировать разработку и поиск новых более эффективных протоколов лечения, основанных на одновременном использовании блокаторов пориновых каналов в качестве стимулирующих адъювантов, с известными противоопухолевыми агентами

Апробация работы Результаты работы были доложены на Советских, Российских, Международных Конференциях и Съездах, в том числе на ежегодных Международных Съездах Научных Обществ США Биофизическом, Экспериментальной и Клеточной Биологии, Биологии Клетки, Токсикологии, Клинической и Экспериментальной Биологии, Кардиологической Ассоциации Кроме того результаты были представлены на Митингах и Конференциях в Польше, Германии, Италии, Чехословакии, Болгарии

Публикации По результатам диссертационной работы опубликовано более 80 научных работ в отечественных и зарубежных научных журналах и сборниках, более 50 тезисов, и сделано более 30 научных докладов в России и за рубежом

Структура диссертации Диссертация состоит из Введения, Обзора Литературы, Материалов и Методов, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка избранных работ соискателя и списка основных публикаций, цитируемых в работе Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста и содержит 46 Рисунков Список литературы включает 246 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препарат изолированных митохондрий Во всех экспериментах препараты интактных митохондрий были получены стандартными методами дифференциального центрифугирования из тканей сердца и/или печени крыс Sprague-Dawley, анестезированных пентобарбиталом (50-75 мг/кг живого веса), так как это было описано раннее (Холмухамедов и др, 1980, 1983, Holmuhamedov et al, 1994, 1998,1999)

Параметры изолированных митохондрий Митохондриальные ионные потоки и скорость поглощения кислорода, исследовались с помощью многоканальной компьютеризованной установки для одновременной регистрации концентрации жизненно важных ионов и кислорода, используя ионоселективные Ca2t, К+, Н+ и ТРР+ электроды и кислородный датчик закрытого типа (Холмухамедов и др, 1980, 1983, Holmuhamedov et al, 1994, 1998,1999) Сбор, хранение и обработка данных проводилась с помощью программы Bioquest (Holmuhamedov et al, 1995) Перенос меченых протонов (3Н) через гидрофобную среду Для определения потока ионов тГ катализируемого диазоксидом, пинацидилом и/или 2,4-ДНФ-ом мы использовали классическую ячейку Прессмана (Pressman et al, 1966), наполненную хлороформом, в котором растворялись испытуемые соединения в концентрациях, указанных в подписи к рисункам В отдельных экспериментах перенос протона измерялся по наведению потенциала Нернста на бислойной мембране, разделяющей два отсека с заданными концентрациями ионов водорода (Holmuhamedov et al, 2004) Ишемическое и пост-ишемическое повреждение сердечной мышцы изучали, используя ретроградную перфузию выделенного сердца крысы по методике Лангендорфа Степень ишемического повреждения определяли по захвату флуоресцентной краски (пропидиум иодида), а также по изменению систолического и диастолического давлений, которое измерялось с помощью наполненного водой

баллончика, вставленного в левое предсердие, как описано (Dzeja et al, 2002, Holmuhamedov et al, 2004)

Культивирование клеток Первичная культура неонатальных кардиомиоцитов была получена путем коллагеназной обработки кусочков сердца новорожденных крысят (Holmuhamedov et al, 1999, 2002) Первичная культура гепатоцитов была получена из печени взрослых крыс (Sprague-Dawley, 250-300 г) после ферментативного «переваривания» перфузируемой печени (Nieminen et al, 1996, Theruvath et al, 2007) Для конфокальной микроскопии клетки культивировались в чашках Петри со стеклянным, прозрачным дном для непосредственного получения оптического изображения клеток (Lemasters & Holmuhamedov, 2006, Theruvath et al, 2007) «Перфорирование» плазматической мембраны выделенных гепатоцитов Для получения доступа к внутриклеточным митохондриям, выделенные и/или культивированные на стекле клетки печени, обрабатывались детергентом дигитонином или бактериальным белком стрептолизином О, для образования пор в плазматической мембране (Bhakdi et al, 2002) Для конфокальной микроскопии и исследования внутриклеточного распределения флуоресцентного декстрана, мембраны клеток разрушались механически с помощью стеклянной микропипетки, которая проводилась через клетки (Lemasters & Holmuhamedov, 2006)

Измерение Ферментативных активностей Активности цитоплазматических ферментов лактат-, алкоголь-, альдегид- дегидрогеназ, NADH-оксидоредуктазы, а также аденипат киназы, гексокиназы, ксантиноксидазы и пероксидазы проводилось с помощью флуоресцентных или люминесцентных методов

Измерение проницаемости митохондриальных поринов Внутриклеточное распределение флуоресцентных зондов проводилось с помощью конфокального флуоресцентного лазерного сканирующего микроскопа (Carl Zeiss LSM 510), используя соответствующие флуоресцентные красители, так как это было описано раннее (Lemasters & Holmuhamedov, 2006)

Статистический анализ Полученные экспериментальные данные анализировались по методу Студента, а также используя анализ переменных (ANOVA) Данные на всех экспериментальных зависимостях выражены как среднее ± средняя ошибка, показано также число повторов Представлены только результаты экспериментов попавших в доверительный интервал 95%

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После их открытия в 1949 году, митохондрии на протяжении 60 с лишним лет активно изучаются во многих лабораториях мира Несмотря на десятки тысяч работ посвященных митохондриям, их роль в жизнедеятельности клетки и участие в регуляции внутриклеточных процессов все еще остается загадкой Наблюдения последних лет показали, что кроме их основной функции как генератора внутриклеточной АТФ в ходе окислительного фосфорилирования, митохондрии также активно вовлечены в сложную сеть внутриклеточной регуляции жизни клетки от обмена специфическими метаболитами, образующимися исключительно в матриксе митохондрий до освобождения апоптогенных факторов, инициирующих клеточную гибель Наиболее широко известным фактором, определяющим характер и способ взаимодействия между митохондриями и клеткой, является свободная концентрация ионов цитоплазматического Са2+ На примере выделенных митохондрий мы покажем, как осуществляется регуляция проницаемости внутренней мембраны митохондрий ионами Са2*, как дисбаланс в транспорте ионов кальция в митохондриях транслируется

в необратимые повреждения сократительной функции миокарда, а закрывание анионных каналов во внешней мембране проводит к окислительному стрессу, усилению повреждающего действия ионов Са2\ проявляющегося в ускоренном набухании матрикса, разрывам во внешней мембране митохондрий и высвобождению цитохрома С, и других апоптогенных факторов Настоящая работа разделена на три Главы, каждая из которых представляет экспериментальные данные по одной теме Глава 1 посвящена описанию особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях и их определяющей роли в регуляции динамики внутриклеточных Са2+ волн В Главе 2 мы представим и обсудим данные о повреждении митохондриальных функций в ишемическом сердце, о способах защиты миокарда от ишемического повреждения и о роли митохондрий в восстановлении сократительной активности сердца после длительной ишемии Глава 3 целиком посвящена регуляторной роли пориновых каналов во внешней мембране митохондрий для нормальной жизнедеятельности митохондрий и клетки, а также их значение в механизме токсического действия этанола Мы покажем, что окисление этанола способствует закрыванию пориновых каналов, которое сопровождается повышением чувствительности митохондрий к ионам Са2\ которое проявляется в активации Са2+-зависимых неспецифических пор во внутренней мембране митохондрий, набуханию и потере метаболических функций

Глава 1

Митохондрии в регуляции внутриклеточной динамики ионов Са2*

Явление колебаний ионных потоков в изолированных митохондриях известно уже более 40 лет Начиная с первых работ (Pressman et al , 1964, Lardy et al , Carafoli et al, 1965, Chance et al , 1966, Packer et al 1969) до настоящего времени обнаружено и опубликовано более 13 различных режимов (Packer et al , 1979, Холмухамедов и др , 1980) Открытие колебаний в митохондриях было связано с синтезом новых антибиотиков и их способностью индуцировать транспорт ионов одновалентных щелочных металлов через биологические мембраны Колебания ионных потоков и объема митохондрий были обнаружены случайно при исследовании влияния целого ряда синтетических антибиотиков на энергетику изолированных митохондрий В 1964-1966 гг было показано, что колебания объема и потоков ионов калия, натрия или цезия в митохондриях наблюдаются в присутствии любых антибиотиков изменяющих проницаемость мембране митохондрий к одновалентным ионам (Pressman et al , 1964, Lardy et al , Chance & Yoshioka, 1966, Packer et al 1969) В этой связи необходимо отметить работы Ленинджера и Карафоли 1965 года, где они показали, что даже в отсутствии антибиотиков или обработки митохондрий ЭДТА, единичное добавление к энергизованным митохондриям пульса ионов кальция также сопровождается колебаниями потоков H и кальция В своих пионерских работах Packer с соавторами показали, что наличие антибиотиков не является необходимым для запуска колебаний, и что участие дыхательной цепи и ее сложных регуляторных механизмов также не является необходимым для колебаний, которые наблюдаются также в митохондриях энергизованных за счет гидролиза добавленного АТФ (Mustafa & Packer, 1969) Самые долговременные колебания ионов водорода и калия были обнаружены в митохондриях, обработанных валиномицином, ионофором с очень высокой селективностью к ионам К+ (Chance & Yoshioka, 1966) Другим важным шагом в понимании этих колебаний были работы Карафоли Ленинджера (5) и более поздняя работа Ташмухамедова и Гагельганса (Ташмухамедов & Гагельганс, 1971) в которых было продемонстрировано участие двухвалентных

ионов (Са2+ или Эг2+) в колебаниях Таким образом, к началу наших исследований было предложено множество различных моделей генерации этих колебаний, которые, несмотря на некоторые различия, тем не менее, помогли прояснить общую картину событий, ведущих к возникновению колебаний, которую кратко можно сформулировать следующим образом

1 Митохондрии в присутствии субстратов окисления и кислорода, накапливают одновалентные положительно заряженные ионы калия, а также и Са2+, всегда имеющиеся в наличии в цитоплазме клеток или в среде инкубации

2 В результате накопления ионов калия и Са2+ в митохондрии, матрикс набухает и защелачивается Эти факторы "запускают" Са2+-зависимые перестройки во внутренней мембране митохондрий сопровождающиеся открыванием неспецифической поры

3 В эту открывшуюся пору малые ионы матрикса, ионы водорода, калия, Са2* и другие перетекают по своим градиентам и способствуют деполяризации мембраны, уменьшению объема матрикса и сокращению внутренней мембраны митохондрий одновременно сзакислением матрикса и уменьшением концентрации Са2+

4 В результате «к Са2+-зависимые» перестройки мембраны релаксируют назад в нормальное состояние и неспецифическая пора закрывается

5 Закрытие поры способствует медленной диффузии субстратов в митохондрии, активации дыхательной цепи (или АТФазы) и восстановлению мембранного потенциала митохондрий

6 Восстановление мембранного потенциала сопровождается новым циклом накопления ионов калия и Са2+ в митохондрии, выбросом ионов водорода дыхательной цепью и защелачиванием матрикса, которое завершается активацией «Са2+-зависимой» перестройки мембраны, открыванием неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий и следующим циклом колебаний ионных потоков и объема митохондрий Все эти этапы генерации колебаний, подтвержденные экспериментально, позволили нам формализовать процесс колебаний в форме математической модели (Селиванов и др 1998, РокМко е! а1, 2006)

1 Математическая модель колебаний ионных потоков и объема митохондрий Диаграмма всех ионных потоков через внутреннюю, сопрягающую митохондриальную мембрану, так как она использована в нашей модели, показана на Рис 1 (РокМко е( а1, 2006) Все процессы, которые

рассмотрены на этой диаграмме, являются

энергозависимыми, и потоки указанных ионов используют энергию, запасенную в форме электрохимического градиента (Дрн) ионов водорода на внутренней мембране митохондрий Эта энергия состоит из двух компонент электрического поля (ДФт) на внутренней мембране, энергия которого поддерживает перенос заряженных ионов и частиц, и градиента концентрации ионов

№.. с1и/2г

он/р „

Рисунок 1 Диаграмма ионных потоков в митохондриях

водорода (ДрН), энергия которого используется для переноса незаряженных липидорастворимых частиц по градиенту их концентрации Наша модель состоит из 5 независимых модулей описывающих потоки ионов, а также состояние поры Модуль #

12 3 4 5 6 7 Tim» ти

Un» mn Tima mn

Рисунок 2 Состояние Рисунок 3 Состояние Рисунок 4 Состяние

митохондрий с закрытой порой - митохондрий с колеблющейся митохондрий с открытой порой -колебаний нет порой-колебания есть колебаний нет

1 Потоки протонов, дыхательная цепь, пассивные "утечки" (Н leak), электронейтральный обмен Н+, Са2\ К\ и фосфата (Са/2Н, К/Н, Р/ОН, РТР), Модуль #

2 Потоки Са2+ (Юнипортер,Са2+/2Н\ РТР) Модуль # 3 Потоки К+ (Юнипортер, К+/Н\ РТР) Модуль # 4 Потоки анионов фосфата (Р/ОН) и субстратов (А2-) и РТР Модуль # 5 Митохондриальная пора Этот модуль описывает регулировку состояния РТР ионами Са2\ рН и п потенциалом мембраны Эта модель имеет множество решений, и анализ модели оказал, что в зависимости от количества ионов Са2\ добавленного в систему всего имеется три основных режима транспорта, как показано на Рисунке 2 Режим #1 Нагрузка митохондрий малым количеством ионов Са2+, которое не достигает порогового значения концентрации Ca2t, при которой пора активируется Следовательно, пора остается закрытой и весь добавленный Ca2t накапливается в матриксе без последствий (Рис 2) Режим #2 Нагрузка митохондрий промежуточными количествами ионов Ca2t При этом пора будет циклически открываться, и закрываться, порождая колебания Са2\ Н+, К\ потенциала и объема митохондрий (Рис 3) Режим #3 Нагрузка митохондрий большими количествами ионов Са2+ (Рис 4) Эти количества ионов Са2* вызывают постоянную активацию поры При этих условиях пора остается постоянно открытой, и все малые ионы распределяются по своим градиентам и выходят из матрикса (Рис 4) Таким образом, математическая модель, регуляции состояния поры ионами Ca2t, Н+ и мембранного потенциала, продемонстрировала все возможные режимы транспорта ионов Са2+, Н\ К* в митохондриях В хорошем соответствии с экспериментальными данными, опубликованными ранее (Ichas et al, 1994) математическая модель также описывала явление митохондриального Са2+-индуцированного выброса накопленного Са2+ из матрикса, которое объясняет синхронизирующую роль митохондриального транспорта Ca2t в целых клетках

2 Роль митохондрий в определении свободной концентрации Са2+ в клетках Динамика концентрации внутриклеточного Са2+ имеет существенное значение для нормальной жизнедеятельности клеток (Berndge, 1999, Clapham, 1999) До недавнего

времени существовало мнение, что участие митохондрий в Са2+ гомеостазе клетки ограничено Са2+-зависимой активацией матриксных ферментов, которое транслируется в усиленное производство АТФ (McCormack & Denton, 1980, 1991). Однако недавние исследования показали, что митохондрии напрямую участвуют в Ca2t гомеостазе клетки путем накопления и освобождения ионов Са2+ (Rizzuto et al, 1992, 1994; 2000; Ichas et al., 1994,1995). Ha рисунке 5 показано, что ингибирование Са2+- активируемой поры в клетках асцитной карциномы подавляет АТФ -индуцированные изменения Са2+ в цитоплазме. Ингибирование дыхательной цепи митохондрий антимицином А, подавляет амплитуду АТФ-индуцированного Са2+сигнала в 3-5 раз (Рис. 5, Б).

3. Синхронизирующая роль митохондрий в клетках. Ранее мы продемонстрировали, что изолированные митохондрии, в матриксе которых находится определенное количество ионов Са2+, обладают способностью освобождать эти накопленные ионы Са2+ под действием дополнительного внешнего импульса Ca2t (Holmuhamedov et al., 1980,1998). Эта способность митохондрий усиливать

концентрацию Са2+ в суспензии за счет высвобождения внутренних запасов Са2+, которую мы назвали «Са2+-зависимый выброс Са2+ из митохондрий» (Ichas et al,

1994) оказалось явлением, существенным для понимания роли митохондриального транспорта Са2+ ионов в регуляции динамики Са2+ в цитоплазме (Jouaville et al.,

1995). Исходя из этих идей и выделенные клетки ооцитов лягушки, мы показали, что характер и динамика Са2+ волн в цитоплазме ооцитов зависит от состояния дыхательной цепи митохондрий. Дополнительная инъекция субстратов окисления вызывает синхронизацию волн свободного Са2\ и наоборот, ингибирование дыхательной цепи ротеноном, специфическим ядом, который подавляет дыхание митохондрий, разрушает синхронность распространения Са2+ волн, и возрождает исходный «хаос» (Рис. 6). Т.о. энергизация митохондрий является необходимым условием поддержания в клетках усиления и синхронизации волн концентрации свободного кальция в цитоплазме

0.56- 0.56-

^ 0.42- Control t\ 2 0421 ItejiMCysA а ^Control h

О 0.28- til Ъ 0'28" 2 HM PS

0.14- j\L 0.14- i \

0- t V- 0; ATP 20 sec t - ATP 25 mM

25 цМ

Рисунок 5. АТФ-индуцированные Са2+

спайки в асцитной карциноме Эрлиха.

Рисунок 6. Энергизация митохондрий синхронизует Са2+ волны в ооците: а конфокальные изображения инозитол-3-фосфат-индуцированных волн Са2+; Ь Поперечное сечение волн в выбранной плоскости, с Колебания концентрации Са2+; с7, е и ^ ротенон разрушает синхронное распространение Са2+-волн.

ооцитов лягушки (ч1оиауП1е е( а1., 1995). Возникновение волн Са2* в цитоплазме ооцитов лягушки, как и во многих других клетках, было индуцировано хорошо известным

внутриклеточным стимулятором инозитол-1,4,5-трифосфатом, который вызывает

высвобождение ионов Са2+ из ретикулума, и таким образом инициирует генерацию в цитоплазме яйцеклеток распространяющихся кальциевых волн (ЬесЫейег & С1арИат, 1995,1996). Особенностью этих волн является то, что при сталкивании они взаимно аннигилируют и исчезают, порождая "хаос" и разрывы волны (ЬесЫеКег & ОарИат, 1995,1996). Данные показанные на Рис. 6 и 7 иллюстрируют, что потенциал-зависимое накопление Са2+ в митохондриях является основным фактором регулирующим и синхронизирующим инозитол-зависимую

генерацию Са2+ волн. Полученные данные указывают на физиологическое значение транспорта ионов Са2+ в митохондриях, как системы активной регуляции динамики ионов Са2+, важнейшего участника внутриклеточной сигнализации.

Рисунок 7. Антимицин разрушает (а), а энергизация митохондрий аскорбиновой кислотой с ТМПД восстанавливает и упорядочивает (синхронизует) Са2+ волны в цитоплазме ооцита (Ь,с).

Таким образом, в настоящей работе продемонстрировано, что усиление амплитуды внутриклеточных волн концентрации свободных ионов Са2+, а также их пространственная синхронизация, находится под контролем митохондриальной системы энергозависимого транспорта ионов Са2+, осуществляющей накопление этих ионов в матриксе и освобождение их в цитоплазму клеток.

Глава 2

Митохондрии в механизме ишемического повреждения сердечной мышцы

Ионы калия являются главным ионным компонентом не только цитоплазмы, но и митохондриального матрикса. Направление электрического поля на внутренней мембране митохондрий, благоприятствует транспорту ионов калия из цитоплазмы в матрикс. Таким образом, наличие любых «^-селективных каналов, включая АТФ-зависимых, во внутренней мембране митохондрий, будет сопровождаться изменениями митохондриального объема и регуляцией состояния Са -зависимой неспецифической поры. В настоящей работе мы рассмотрим механизм действия диазоксида и пинацидила, соединений, которые известны как активаторы К+-селективной проницаемости во внутренней мембране митохондрий, т.н. АТФ-зависимых К+ каналов, на митохондрии.

1. Диазоксид и пинацидил уменьшают мембранный потенииал митохондрий. Для

понимания механизма защитного действия этих агентов, необходимо специально

11 X

3 О 203 i

^ 6-<i

пин

n1iioo-2 s b

< s

¡J о

I 3 Рисунок 8

о и f) "1 z J

и о

я "л

z J

u и I >3

и и и у z 3 I 3

Диазоксид и пинацидил сохраняют свое действие на митохондриальное дыхание мембранный потенциал и синтез АТФ при замене ионов К+. в среде инкубации на ионы и/или

отметить, что, несмотря на общепринятое мнение о механизме работы этих соединений как активаторов плазматических АТФ-зависимых Кдтф К+ (Кдтф) каналов, модуляция митохондриальных функций диазоксидом или пинацидилом не требовало присутствия во внешней среде ионов К+ (Рис. 8). Замена ионов К+ на ионы Na+ или Li+ не изменило эффекта этих агентов на митохондриальное дыхание (Рис. 8А), мембранный потенциал (Рис. 8Б) или производство АТФ (Рис. 8В). Более того, все эффекты этих агентов на митохондрии, были подобны тем, которые вызывал 2,4-динитрофенол, известный разобщитель окислительного фосфорилирования. Все три агента, 2,4-ДНФ, диазоксид и пинацидил увеличивали дыхание и потребление кислорода покоящимися митохондриями, вызывали деполяризацию мембраны и снижали мембранный потенциал митохондрий, а также подавляли синтез АТФ, независимо от присутствия ионов К+ в среде инкубации (Рис. 8).

Мембранный потенциал митохондрий, окисляющих сукцинат, оцененный с помощью тертафенилфосфониевого электрода был около 180 ± 15 mV (Рис. 9) и пинацидил, активатор Кдтф каналов, вызывал деполяризацию митохондрий. В среднем, пинацидил (100 рМ), уменьшает мембранный потенциал митохондрий на 24 ± 9 mV (Рис. 9Б, показан Пинацидил только, Holmuhamedov et al., 1998). Деполяризующая способность этого агента зависела от концентрации препарата. На Рис. 9А & Б показано, что пинацидил не только снижает мембранный потенциал, но также продлевает время, которое требуется митохондриям для фосфорилирования всей добавленной АДФ (Рис. 9А-В). Таким образом, пинацидил (и диазоксид) ингибируют скорость синтеза АТФ в митохондриях, причем, как будет показано ниже, эффект этих агентов не зависит от наличия в среде инкубации калиевых ионов.

О 90 180 270 360 Время фосфорилирования

Рисунок 9. Эффект пинацидила на АДФ-зависимую деполяризацию митохондрий: А - Пинацидил (100 рМ) удлиняет АДФ-зависимую (250 рМ) циклическую деполяризацию митохондрий (1мг/мл). Б Концентрационная зависимость деполяризации митохондрий пинацидилом. В - Пинацидил (100 рМ) ингибирует синтез АТФ в изолированных митохондриях.

2 Диазоксид и пинаиидил подавляют транспорт Са2* в митохондриях Расстройства митохондриальных функций вследствие ишемического повреждения сердца, в основном связаны с избыточным накоплением Са2* в митохондриях (Ferrari, 1989, Liu et al, 2000) Среди многочисленных гипотез защиты митохондрий от ишемического повреждения в сердце, предположение о вовлеченности и роли АТФ-зависимых К* (Кдтф) каналов как защитного фактора получило наибольшее

распространение (Gross,

1996,1998, Liu et al, 2000) В своих исследованиях мы отдавали преимущество диазоксид и пинацидилу, активаторам АТФ-зависимых калиевых каналов, которые, как было показано, являются наиболее

специфическим в отношении митохондрий (Gross, 1998, Liu продемонстрировали на митохондриях из мышцы левого желудочка, что оба исследованных активатора Кдтф каналов, диазоксид и пинацидил, несмотря на то, что эти соединения, хотя и имеют различную химическую структуру, тем не менее, одинаково эффективно подавляют энергозависимое накопление Са2* в митохондриях (Рис 10) Концентрации активаторов Кдтф, которые снижают скорость накопления Са2*, на 50% были 65рМ (диазоксид) и 128рМ (пинацидил), соответственно (Holmuhamedov et al, 1998,1999) Аналогичным образом, и диазоксид и пинацидил способствуют освобождению ионов Са2\ предварительно накопленных в митохондриях (Рис 11) Необходимо отметить, что концентрации диазоксида и пинацидила, индуцирующие 50% увеличение скорости выброса ионов Са2* из митохондрий были 96 рМ и 132 рМ,

, и были близки к тем, которые использовались для защиты сердца от ишемического повреждения (Рис 11) Таким образом, действие известных активаторов плазматических АТФ-зависимых калиевых (КАТФ) каналов, диазоксида и/или пинацидила на митохондриальные функции является их способность вызывать снижение мембранного потенциала митохондрий, которое приводит к снижения скорости накопления добавленных ионов Са2* в матриксе, а также к активации процессов, приводящих к освобождению накопленных ионов Са2* из митохондрий

Время, с Диазоксид, М

Рисунок 10 Активаторы Кдтф каналов ингибирукл транспорт Са2* в митохондриях А - Диазоксид и пинацидил (вставка) подавляют накопления Са2* в суспензии митохондрий (1мг/мл), Б - Дозовая зависимость ингибирования накопления Са2*

е! а!, 2001, вагМ, 2001) Мы впервые

для диазоксида и пинацидила, соответственно

Рисунок 11 Активаторы Кдтф каналов индуцируют освобождение ионов Са2* из митохондрий А-Выход Са2* из митохондрий (1мг/мл) в присутствии диазоксида (100 рМ) или пинацидила (вставка) Б-Дозовая зависимость выхода Са2* от концентрации диазоксида (вставка пинацидил)

3 Диазоксид и пинаиидил индуцируют циклоспорин А зависимый выход Са2* из митохондрий К митохондриям, инкубированным в присутствии Са2* ионов (100 иМ). кислорода и субстратов окисления после достижения стационарной концентрации кальция был добавлен диазоксид или пинацидил (Рис 12А и 12Б) Добавление этих агентов к митохондриям вызывало немедленный и интенсивный выход ионов Са2* из матрикса Одновременная регистрация мембранного потенциала митохондрий демонстрирует, что выход ионов Са2+ совпадает с деполяризацией и падением мембранного потенциала митохондрий (Рис 12А, Диазо или 12Б, Пин) Циклоспорин А, специфический ингибитор Са2+-зависимых перестроек и открывания неспецифических водных пор в мембране митохондрий (Bernardi, 1999, Crompton, 1999) предотвращал выход Са2*, но не деполяризацию митохондрий (Рис 12, нижняя панель) В отсутствии

и присутствии циклоспорина А, диазоксид вызывал деполяризацию митохондрий на 15 ± 4 mV (п=20) и 18+6 mV (п=7, р<0 05), соответственно Аналогично, пинацидил деполяризовал митохондриальную мембрану на 20 ± 5 mV (п=6) и 23 ± 3 mV (п=6), в отсутствии и присутствии циклоспорина А, соответственно (р<0 05) Таким образом, действие диазоксида или пинацидила на выброс Са2+ из митохондрий обусловлено деполяризацией мембраны митохондрий активацией Са2+-зависимой циклоспорин-чувствительной поры (или пор)

4 Диазоксид и пинаиидил деполяризуют внутриклеточные митохондрии в кардиомиоиитах Как было показано выше, активаторы Кдтф каналов деполяризуют выделенные митохондрии, таким образом, указывая на то, что защитное действие этих активаторов против ишемии может быть обусловлено понижением мембранного потенциала и электродвижущей силы, необходимой для того, чтобы поддерживать энергозависимый транспорт Са2+ в митохондриях Для оценки изменения мембранного потенциала митохондрий внутри клеток, мы нагрузили культивированные кардиомиоциты, выращенные на стекле, тетраметилродамином (ТМРМ), флуоресцентным красителем с потенциал-зависимой краской, который специфически накапливается в матриксе и отражает мембранный потенциал митохондрий (Nieminen et al, 1998, (Holmuhamedov et al, 1998)) Действие диазоксида (пинацидила), активаторов Кдтф каналов на мембранный потенциал митохондрий в культуре клеток кардиомиоцитов, изучалось по изменению флуоресценции ТМРМ, в митохондриях при помощи лазерного конфокального микроскопа Изображения клеток (Рис 13) были получены с помощью микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss) В среднем, флуоресценция TMRM уменьшилась от 175 ± 9 произвольных единиц в контрольных клетках, до 115 ± 11 единиц после добавления диазоксида к этим клеткам (N=24), Обработка культуры клеток кардиомиоцитов, (5-HD) 5-гидроксидеканоевой кислотой, блокатором Кдтф

s ^ lOOl

rr 10,

о н

> в 160

э-< 190

Диазо

ЦисА

Ьпшшшшшшшвшш+ЦисА , . , ЦисА

f~~ +Цис А 1 1

2 loch

6 < -

Яш

ЦисА

) +ЦисА

•ЦисА ' +Цис А

Время, с

Рисунок 12 Ингибирование Са2+-зависимой циклоспорин-чувствительной поры снимает эффект диазоксида и пинацидила на выход Са из митохондрий, но не подавляет деполяризации мембраны митохондрий этими агентами

каналов (Garlid 1996) не влияло на уровень флуоресценции TMRM (168±20, Рис. 13А&В). Однако если клетки до добавления диазоксида предварительно обрабатывались 300 рМ 5-HD, то диазоксид вызывал значительное подавление уровня флуоресценции TMRM, которое уменьшалось со 168±20 условных единиц до 155 + 7 единиц, указывая на деполяризацию митохондрий 5-HD (Рис. 13Б). Таким образом, приведенные в настоящей работе данные указывают на то, что диазоксид (или пинацидил), активаторы плазматических АТФ-зависимых К+ (Кдтф) каналов также на самом деле деполяризуют митохондрии (Рис. 13А) и эффект диазоксида (или пинацидила) может быть частично

предотвращен в присутствии 5-HD, известного блокатора

+ FCCP

+ 51ТО + Диазо

Рисунок 13. Диазоксид внутриклеточные митохондрии диазоксида предотвращается 5-ДК, блокатором действия диазоксида (Б). Разобщитель, РССР (ЮОпМ) полностью деполяризовал митохондрии.

деполяризует (А). Эффект

плазматических АТФ-зависимых калиевых (Кдтф) каналов (Рис. 13Б).

5. Диазоксид и пинацидил уменьшают содержание Са в митохондриях

изолированных кардиомиоцитов. калиевых каналов диазоксида и интактных клеток сердца. Клетки, выделенные из сердечной мышцы новорожденных крысят, были посеяны на поверхности покровных стеклах, которые были покрыты коллагеном из хвоста крысы. После 18-20 часов инкубации при 37°С, 95%02/5%С02, эти клетки нагружали КИос1-2АМ (10 рМ), Са2+-чувствительным красителем,

который специфически в матриксе митохондрий и отражает уровень кальция в них (1етаз1егз е! а1., 1998; Но1ти11атес1оу е! а!., 1998,1999). Обработка этих клеток диазоксидом (30 рМ) снижает уровень флуоресценции РЬос!-2 в кардиомиоцитах, свидетельствуя о понижении содержания Са2+ в митохондриях (Рис. 14А). В присутствии 5-НО это понижение флуоресценции диазоксидом

Далее мы исследовали влияние активаторов пинацидила, на уровень Са2+ в митохондриях

+ 51ГО + Диазо + РССР

Рисунок 14. Диазоксид уменьшает содержание Са2+ в митохондриях сердца (А) и этот эффект преотвращается 5-ДК, блокатором действия диазоксида (Б), а РССР - вызывает полную потерю Са2+ из митохондрий.

уменьшается (Рис 14Б) Аналогичные данные были получены при обработке клеток пинацидилом (не показано) Подавление выброса Са2 из митохондрий в присутствии циклоспорина А, блокатора и селективного ингибитора Са2+-индуцированного изменения проницаемости внутренней мембраны, которое никак не связано с транспортом калия в митохондриях указывает на то, что диазоксид и/или пинацидил на самом деле могут менять митохондриальный Са2 гомеостаз и уменьшать количество накопленного Са2 как в норме так и при патологии, например при выходе из ишемии Мы предполагаем, что эффект диазоксида (и пинацидила) вызван деполяризацией внутренней мембраны митохондрий, уменьшением накопления ионов Са2+ из-за активации выброса Са2+ при подавленном накоплении этих ионов (Но1ти11атес1оу е( а1, 1998, 1999) В заключение, диазоксид и пинацидил ограничивают накопление Са2+ в митохондриях и этот эффект не зависит от присутствия ионов К* в среде инкубации В изолированных сердечных митохондриях диазоксид и пинацидил уменьшили скорость накопления Са2+ в митохондриальный матрикс и концентрации, которые подавляли скорость накопления на 50%, были 65 рМ и 128 рМ, соответственно Эти концентрации близки к тем, которые обеспечивают защиту от ишемии Необходимо отметить, что на всех этапах накопления Са2\ оба агента деполяризовали митохондриальную мембрану, таким образом, уменьшая поток потенциал зависимого транспорта Са2+ И диазоксид и пинацидил активировали выход накопленных ионов Са2* из митохондрий, причем скорость выхода зависела от концентрации этих агентов Процесс индукции выхода накопленного Са2* полностью подавлялся циклоспорином А, указывая на участие Са2+-зависимой поры, ассоциированной с перестройками в мембране митохондрий и открытием большой неспецифической поры

Таким образом, удаление ионов калия из среды инкубации и изоосмотическая замена их ионами натрия, лития или неионными заместителями (маннитолом или сахарозой) полностью подавляло влияние диазоксида и/или пинацидила на митохондриальный транспорт Са2*, но не влияло на деполяризацию внутренней мембраны

6 Молекулярный механизм действия диазоксида и пинацидила в митохондриях Выше мы показали, что действие известных активаторов Катф каналов на митохондрии заключается в деполяризации митохондрий и уменьшении уровня Са2+ обмена в митохондриях (Рис 10-11) Более того, этот эффект диазоксида и пинацидила наблюдался при полном отсутствии К* ионов, что свидетельствует о том, что деполяризация митохондрий этими агентами не зависит от присутствия ионов К+ (Но1тиЬатес1оу е( а1, 1999) Мы показали, что эти два структурно различных агента, диазоксид и пинацидил, обладают одним общим свойством - они оба являются слабыми протонофорами (Но1тиЬатес1оу е1 а1, 2004) Оба агента активируют дыхание энергизованных митохондрий, деполяризуют митохондрии и уменьшают эффективность окислительного фосфорилирования, то демонстрируя типичные свойства разобщителей митохондриального окислительного фосфорилирования (Рис 9) Мы далее экспериментально проверили протонофорные свойства диазоксида и пинацидила, используя классическую ячейку Прессмана, а также на бислойной мембране (Но1тиЬатес)оу е( а1, 2004) Диазоксид (100 рМ) и пинацидил (100 рМ) существенно ускорили поток тритиевой метки 3Н через слой хлороформа от 2 ± 2 3Н/час/см2 в контроле до 10 ± 2 и 13 ± 2 3Н/час/см2, соответственно (Рис 15, А и Б) Добавление диазоксида или пинацидила к бислойной мембране, разделяющей отсеки с 10х кратным градиентом ионов Н+ (но не ионов К+), сопровождалось появлением электрического потенциала в 52 6 ± 0 2 и 51 5 ± 0 1 мВ, соответственно (Рис 15В,

Но1ти11атеск)у е1 а1, 2004) Эти значения близки к теоретическому потенциалу реверсирования 56 2 мВ, рассчитанному исходя из использованного градиента Н+ (рН 7 02 против 7 98, Рис 15В) Этот потенциал был специфическим по отношению к ионам водорода и не наблюдался в условиях, когда градиент ионов Н* отсутствовал

А_

X +3Н it X Зн

X +'н

X >н

-4—

„= (RT/nF) log(H+c[/irMJ Иллюстрация протонофорных свойств диазоксида и пинацидила А -

К ДЗПИНДНФ

Рисунок 15

Схема определения переноса протонов через слой хлороформа, Б - Значения потоков протонов в отсутствии (К) и присутствии диазоксида (ДЗ), пинацидила (ПИН) или 2,4-динитрофенола (ДНФ), В - Схема определения протонофорной активности агентов на бислойной мембране Детали экспериментов в тексте

Отсутствие белков любой природы в этих экспериментах, а также неспособность диазоксида или пинацидила создать электрический потенциал при наличии градиента ионов К*, свидетельствует о том, что эти соединения специфически катализируют перенос протонов через липидную фазу, т е обладают протонофорными свойствами Основываясь на обнаруженном нами свойстве диазоксида и пинацидила, мы предсказали и экспериментально продемонстрировали кардиозащитное действие 2,4-динитрофенола, классического разобщителя окислительного фосфорилирования с протонофорным механизмом действия Следовательно, механизм противоишемического защитного действия диазоксида и пинацидила, наряду с активацией плазматических КАТФ каналов, может включать также и слабое разобщение митохондрий

Таким образом, диазоксид и пинацидил, химические агенты с различной химической структурой и свойствами, объединены тем, что оба обладают выраженными протонофорными свойствами и способны специфически переносить положительно заряженные ионы водорода (протоны) через гидрофобную фазу

Глава 3

Митохондриальные пориновые каналы в механизме токсического действия

этанола

Биохимические следствия окисления этанола в печени включают подавление синтеза АТФ, скомпрометированное окисление длинноцепочечных жирных кислот, увеличенное образование кислородных радикалов и окисление липидов (Thurman et al, 1997, Cunningham et al, 1996,1998, Lemasters & Holmuhamedov, 2006) Этанол также вызывает в печени гиперметаболическую реакцию, которая характеризуется

стремительным увеличением метаболизма спирта, почти удвоением митохондриального дыхания и разобщением окислительного фосфорилирования (Thurman et al, 1986) Нормальный митохондриальный метаболизм требует непрерывного обмена субстратов между клеткой и митохондриальным матриксом При прохождении в митохондрии и обратно эти соединения должны пересечь две мембраны - внешнюю и внутреннюю Если обмен через внутреннюю мембрану катализируется специфическими обменниками, то обмен всех водорастворимых метаболитов через внешнюю мембрану происходит через пориновые каналы, или т н voltage dependent anion channels (VDAC), потенциал-зависимых анионных каналы, расположенные во внешней мембране (Colombini, 2004) Таким образом, проводимость этих каналов может быть очень важным звеном в цепи глобальной регулировки митохондриального метаболизма Мы предположили, что глобальное нарушение митохондриального метаболизма в гепатоцитах окисляющих этанол, обусловлено уменьшением потоков метаболитов через внешнюю мембрану митохондрий из-за закрытия VDAC каналов (Lemasters & Holmuhamedov 2004) Полученные нами данные, которые представлены ниже, подтверждают наше предположение о закрытии пориновых каналов в митохондриях гепатоцитов окисляющих этанол

1 Селективное увеличение проницаемости плазматической и митохондоиальной внешней мембран Для получения доступа к внутриклеточным митохондриям для

Дигитонин 0 8 80

Цит с 100 нг

1 10 100 Дигитонин, (цМ)

Рисунок 16 Выход цитоплазматических и митохондриальных маркеров из гепатоцитов при титровании суспензии гепатоцитов дигитонином А, Увеличение числа дырявых клеток (ТБ) и выход лактат дегидрогеназы (ЛДГ) и аденилат киназы (АК), Б, Выход цитохрома С из клеток, обработанных дигитонином, ММолекулярные маркеры, 0, 8 и 80 дигитонин в цМ, Цит С -100 нг цитохрома С

измерения митохондриальных функций, мы использовали обработку дигитонином, неионным детергентом, который образует большие поры в плазматической мембране клеток и внешней мембране митохондрий - мембранах с высоким содержанием холестерина Механизм порообразования заключается в "вымывании" холестерина детергентом (НаскепЬгоск а1, 1968) В других экспериментах, мы использовали Стерптолизин О (СЛО), бактериальный белок, который работает по схожему с дигитонином механизму, с той разницей, что размеры пор могут быть оттитрованы и излишки СЛО легко удаляются из инкубационной среды (ВЬакЬ| е1 а1, 2002) И,

наконец, мы разработали и применили другой метод разрушения плазматической мембраны клеток в культуре с помощью стеклянной микропипетки Хотя этот метод применим только к одиночным клеткам, его преимущество заключается в том, что он не использует химические соединения и исключает возможные неспецифические эффекты При обработке дигитонином (Рис 16А) первыми через мембрану проходят малые молекулы трипанового голубого с молекулярным весом 668 Да (ТГ), затем более крупные молекулы аденилат киназы 40 кДа) и только после этого размеры пор достаточно велики чтобы пропускать большие молекулы лактат дегидригеназы {- 140 кДа) Клеточная аденилат киназа освобождается из клеток двумя приблизительно равными пулами первый пул (-55%) выходит из клеток при низкой концентрации дигитонина, достигает плато при концентрации дигитонина ~ 20 рМ и сопровождается одновременным входом трипанового голубого, подтверждая таким образом, что первый пул представлен цитоплазматической АК-азой (Рис 16А) Второй пул AK-азы, ~ 45% от общего содержания AK-азы в гепатоцитах, высвобождается при более высоких концентрациях детергента и достигает плато при - 100 рМ дигитонина Необходимо отметить, что выход второго пула AK-азы сопровождается также выходом цитохрома С, что свидетельствует о том, что при этих концентрациях дигитонина, детергент достигает и разрушает внешнюю мембрану митохондрий (Рис 16Б)

2 Нарушение барьерных свойств плазматической мембране не влияет на функциональные характеристики митохондрий Основные функции митохондрий такие как окисление сукцината, пирувата, глутамата, ß -оксибутирата и связанная с этим генерация мембранного потенциала, фосфорилирование добавленной АДФ и транспорт ионов кальция сохраняются в изолированных гепатоцитах, чья плазматическая мембрана "продырявлена" либо обработкой дигитонином, СЛО или же простым механическим разрывом плазматической мембраны клеток с помощью микропипетки На рис 17 показан типичный интактный гепатоцит, в котором все митохондрии помечены т vivo тетраметилродамином, краской с потенциал зависимой флуоресценцией Эта краска специфически накапливается в энергизованных митохондриях и светится ярко-красным цветом, а при деполяризации и потере мембранного потенциала флуоресценция уменьшается и исчезает (Nieminen et al, 1998) На конфокальных изображениях гепатоцитов, нагруженных ТМРМ внутриклеточные митохондрии видны как ярко-красные органеллы (Рис 17А, Интактные), расположенные вокруг темного ядра Интенсивность этой красной флуоресценции соответствует уровню мембранного потенциала митохондрий и чем выше потенциал, тем ярче выглядят митохондрии Обработка клеток дигитонином 8 рМ, когда более 95% клеток становятся ТБ - положительными, приводит к значительному снижению флуоресценции митохондрий, указывая на падение мембранного потенциала Деполяризация, то не обусловлена потерей красителя ТМРМ из цитоплазмы и изменением градиента этой краски на мембране митохондрий, а видимо происходит вследствие разбавления и потери цитозольных субстратов из клеток, через поры, которые образует дигитонин (Рис 17А, Диг) Несмотря на повреждение плазматической мембраны и потерю цитоплазмы, митохондрии сохраняют способность полностью восстанавливать в клетке мембранный потенциал (уровень флуоресценции) в присутствии добавленного сукцината (5 мМ) Как показано, добавление сукцината к клеткам в этих условиях вызывает быстрое восстановление флуоресценции (Рис 17А, Сукцинат) На этом рисунке показано (Рис 17Б), что в гепатоцитах плазматическая мембрана которых «продырявлена» дигитонином, дыхание митохондрии остается чувствительным к действию ДНФ, демонстрируя, таким образом, что обработка дигитонином не нарушает целостности дыхательной

цепи. На рисунке 17Б показана как изменяется концентрация растворенного кислорода в суспензии гепатоцитов, которые инкубируются в среде содержащей 5 мМ сукцината и 1 мМ ЭГТА.

При внесении клеток в среду инкубации, дыхание клеток составляет 7 ± 2 нмолей Ог/мин/106 клеток. Дальнейшее добавление к клеткам разобщителя ДНФ (в отсутствии дигитонина) лишь незначительно увеличивает скорость дыхания до 14 ± 3 нмолей

Гепатоциты

Дигитонин

Малонат

Дигитонин,

0 1 2 3 4 5 6 Время, мин

Рисунок 17. Обработка клеток дигитонином не влияет на потенциал и внутриклеточных митохондрий. А, Конфокальные изображения гепатоцитов (Интактные) и после обработки дигитонином, сукцинатом, и ДНФ. Б, концентрации кислорода в суспензии после обработки разобщителем дигитонином и малонатом. В, Эффект дигитонина и ДНФ на дыхание клеток.

Ог/мин/ 10е клеток. Однако при последующей обработке этих гепатоцитов малыми дозами дигитонина (8 рМ) происходит значительное увеличение скорости дыхания клеток и потребления кислорода до 110 ± 9 нмолей Ог/мин/ 106 клеток (Рис. 17В, ДИГ 8), демонстрируя что добавленный сукцинат теперь достигает митохондрий. Это заключение подтверждается тем, что добавление малоната, ингибитора митохондриальной сукцинат дегидрогеназы, полностью подавляет потребление кислорода клетками, демонстрируя, что в присутствии дигитонина плазматическая мембрана клеток не препятствует диффузии этих водорастворимых молекул к митохондриям. Стимулирование дыхания контрольных гепатоцитов мало зависело от концентрации дигитонина и при концентрации дигитонина 8-10 цМ, достигало плато (Рис. 17Б, см. вставку), указывая, что дыхательная цепь митохондрий в дигитонин

обработанных клетках сохраняет полностью свою активность Аналогичные данные были получены с пируватом, глутаматом или (В - окисбудтиратом

Таким образом, изменяя концентрацию дигитонина или Стрептолизина О можно селективно увеличивать проницаемость плазматической или внешней мембраны внутриклеточных митохондрий к водорастворимым молекулам разного молекулярного веса

3 Ингибиторный анализ влияния блокаторов пориновых каналов на основные митохондриальные функции Регуляторная роль каналов поринов на окислительное фосфорилирование была показана, используя эффект лолианиона Коенига (ПАК), известного ингибитора этих каналов (Colombini et al , 1987) на АДФ-стимулированное дыхание гепатоцитов обработанных дигитонином Как показано на Рис 18А, КПА заблокировал ДНФ-стимулированное дыхание клеток, обработанных низкими

Ф s

со

се

ДНФ

ь ф

100 -

Рисунок 18 Влияния полианиона Коенига (ПАК) на дыхание "дырявых" гепатоцитов А, Добавление полианиона ингибирует ДНФ-стимулированное дыхание при низких дозах дигитонина (ДИГ 8), которое достигает значений, близких к контрольным при высоких дозах дигитонина (ДИГ 80) Б, Этот же эффект ПАК сохраняется и для АДФ -стимулированного дыхания клеток Высокие дозы дигитонина уменьшают ингибирующее действие ПАК_

концентрациями дигитонина (8 рМ) на 33% и это ингибирование было почти полностью устранено при добавлении к клеткам высокой концентрации дигитонина (80 рМ) Подобным образом, ПАК также заблокировал АДФ-стимулированное дыхание изолированных гепатоцитов, обработанных дигитонином на 41%, и аналогично, увеличение концентрации дигитонина (80 рМ) снова сняло это ингибирование (Рис 18Б) Полученные нами данные свидетельствуют о том, что небольшие концентрации дигитонина достаточны для образования пор в плазматической мембране клеток, но явно не достаточны для того чтобы достигнуть и изменить проницаемость внешней мембраны митохондрий Однако высокие концентрации дигитонина (80 рМ и выше) способны достигнуть митохондрии и образовать поры во внешней мембране для АДФ, АТФ и неорганического фосфата

Таким образом, закрытие пориновых каналов и последующее подавление главных митохондриальных функций может быть восстановлено при создании альтернативных пор, например обработкой дигитонином, которые позволят обмен субстратами в обход закрытых пориновых каналов

4 Этанол подавляет метаболизм митохондрий в гепатоцитах Инкубация изолированных гепатоцитов с этанолом подавляет скорости ДНФ - и/или АДФ -зависимого потребления кислорода в гепатоцитах с плазматической мембраной, которая «продырявлена» дигитонином (Рис 19) Изолированные гепатоциты были инкубированы в культуральной среде с 50 мМ этанола в течении 60 минут, отмыты в среде без этанола, отцентрифугованы и суспендированы в среде внутриклеточного состава и хранились на льду Дыхание интактных гепатоцитов после обработки этанолом значительное ускорилось и стало 23 ± 2 нмолей 02/мин/106 по сравнению с 12 + 2 нмолями Ог/мин/ 106 клеток Малые концентрации дигитонина увеличили АДФ-стимулированное дыхание контрольных гепатоцитов более чем в 6 раз, от 12 ± 2 до 78 ± 4 нмолей Ог/мин/ 106 клеток до 98 ± 4 нмолей Ог/мин/ 106 клеток, то время как дыхание клеток, обработанных этанолом возросло чуть больше чем в 2 раза, от 23 ± 2

Рисунок 19 Дигитонин восстановливает дыхание гепатоцитов заингибированное этанолом А, Дыхание контрольных клеток (2 х 106клеток/мл) в присутствии сукцината (5 мМ) и АДФ (500 рМ) после добавления дигитонина (ДИГ 8) и (ДИГ 80) Б, Дыхание клеток обработанных этанолом (60 минут, 37°С) в тех же условиях, что и выше 5 рМ сукцината, 500 рМ АДФ после добавления дигитонина (ДИГ 8) и (ДИГ 80)

до 57 + 4 нмолей 02/мин/ 106 клеток (Рис 19А, ДИГ 8) Совершенно другая картина наблюдается при обработке тех и других гепатоцитов высокими концентрациями дигитонина Если при увеличении концентрации дигитонина скорость АДФ - зависимого дыхания митохондрий в контрольных гепатоцитах изменилась всего на 5% и достигла 82 ± 6 нмолей Ог/мин/ 106 клеток, то эта же концентрация дигитонина увеличила скорость АДФ - зависимого дыхания этанольных гепатоцитов почти в два раза и достигла 77 ± 4 нмолей Ог/мин/ 106 клеток вместо 57 ± 4 нмолей Ог/мин/ 106 клеток и дыхание этанольных клеток, обработанных высокими концентрациями дигитонина, возросло и достигло уровня близкого к дыханию контрольных клеток (Рис 19А, Диг 80) Таким образом, проницаемость пориновых каналов в мембране митохондрий, которая

обуславливает снижение скорости дыхания митохондрий в клетках, обработанных этанолом, восстанавливается в присутствии дигитонина. В тех же клетках, обработка

Рисунок 20. Дигитонин восстанавливает доступность АК в гепатоцитах. А, Активность цитоплазматической АК-азы в контрольных и этанольных клетках. Б, Активность митохондриальной АК-азы, остающейся связанной с гепатоцитами после обработки низкими (ДИГ 8) и высокими (ДИГ 80) дозами дигитонина.

этанолом не приводит к заметным изменениям в активности цитоплазматической АК, которая остается на уровне 50% от общей активности АК (Рис. 20). Однако подобная обработка клеток этанолом существенно уменьшила активность АК, которая осталась связанной с «дырявыми» клетками. В «дырявых» гепатоцитах активность АК, которая осаждается вместе с клетками после обработки малыми дозами дигитонина, уменьшилась от 48% в контрольных клетках до 24% в клетках обработанных этанолом (Рис. 20Б, Диг 8). Последующая обработка гепатоцитов высокими дозами дигитонина почти полностью восстановила измеряемую активность АК, которая достигла 49% от контроля (Рис. 20Б, Диг 80).

5. Внутриклеточное распределение флуоресцентно-меченного декстрана для оценки состояния пориновых каналов во внешней мембране митохондрий. Для отслеживания состояния пориновых каналов мы предложили и разработали новый метод, основанный на прямом отслеживании внутриклеточного распределения флуоресцентной метки с использованием флуоресцентной конфокальной лазерной микроскопии. Для маркировки внутриклеточных митохондрий и облегчения визуального контроля над внутриклеточным распределением декстрана в «продырявленных» клетках, исходные целые гепатоциты (до обработки дигитонином) были проинкубированы с MitoTracker Green (МТГ) зеленой флуоресцентной краской, которая специфически накапливается в митохондриях и окрашивает их в характерный зеленый цвет (Рис. 21А). В качестве флуоресцентного зонда для отслеживания статуса пориновых каналов мы использовали молекулы декстрана, размером 3,000 Да, к которым ковалентно пришиты флуоресцентные молекулы красителя,

Клетки

Этанол

тетраметилродамина, и таким образом позволяя измерять внутриклеточное флуоресцентной красной метки с помощью конфокальной микроскопии. Как отмечалось выше, молекулы с размером меньше 5 кДа могут свободно проходить через открытые пориновые каналы во внешней мембране митохондрий (Со1отЫт, 2004). На рис. 21 показан протокол разрыва мембраны клеток и конфокальные картинки внутриклеточного распределения флуоресцентной краски размером 3 кДа.

Молекулы декстрана, которые после ковалентной сшивки с флуоресцентным ТМРМ

имеют молекулярный вес около 3,000 Да могут свободно диффундировать через открытые пориновые каналы, в то время как размер поры в закрытом состоянии не достаточен для прохождения этих молекул. Подробная схема этих экспериментов и

механическое разрушение плазматической мембраны гепатоцитов, которое

обеспечивает вход молекул декстрана в цитоплазму, показана на рисунке 21. Микропипетка опускается до того уровня, когда она соприкасается с мембраной гепатоцитов на стекле и после этого "протягивается" через все соседние клетки так, чтобы механически разорвать те клетки, которые находились на пути стеклянной пипетки. После механического разрыва клеточной мембраны и получения доступа к цитоплазме и митохондриям (Рис. 21А), пипетка убиралась, и среда инкубации была заменена на другую, содержащую

красную флуоресцентную метку Ро-Декс. На изображении, показанном на Рис. 21 Б, зеленые митохондрии в клетках отчетливо видны на ярком фоне красной флуоресценции. Видно, что краска Ро-Декс, пронизывает цитоплазму и в пермеабилизованных клетках флуоресценция обнаруживается внутри клеток в цитоплазме, ядре, а также внутриклеточных структурах (Рис. 21 Б). Несмотря на повреждение плазматической мембраны клеток, митохондрии (зеленая флуоресценция) сохраняют характерную и типичную для печеночных клеток форму и структуру. Митохондрии, которые видны как зеленые органеллы, окруженные красной флуоресценцией пронизывающей всю цитоплазму (Рис. 21 Б) оказываются также

Рисунок 21. Схема механического разрушения плазматической мембраны гепатоцитов и внутриклеточного распределения молекул декстрана (РоДек). Клетки с митохондриями (А, зеленая флуоресценция, МТС), рассечены микропипеткой (А, разрезы показаны белой стрелкой) и инкубированы декстраном (Б, красная флуоресценция, РоДек). В отмытых клетках (В) красная и зеленая флуоресценции полностью перекрываются (Г, Д и Е), свидетельствуя о том, что молекулы декстрана захвачены в межмембранное пространство митохондрий._

местом накопления и красной флуоресценции (Рис. 21В). После 2 минут инкубации, для того чтобы позволить молекулам декстрана проникнуть в доступные внутриклеточные отсеки, доступные для молекул размером 3 кДа, включая также, и межмембранное пространство митохондрий, в клетках, обработанных ДИДС'ом, ингибитором пориновых каналов, чтобы предотвратить выход молекул декстрана из межмембранного пространства. Затем несвязанные молекулы декстрана отмывались, и изображение клеток анализировалось при большем увеличении. После отмывки клеток, красная флуоресценция исчезла везде за исключением ядра и митохондрий. При более высоком увеличении (Рис. 21 Г, 21Д и 21Е), видно, что красная и зеленая флуоресценция внутри клеток локализуются в одном и том же пространстве Отчетливо видно, что обе краски, и красная и зеленая, обнаруживаются только в зоне митохондрий (Рис. 21). Кроме того, флуоресценция иногда видна в области ограниченной клеточным ядром, а также локализуется внутри маленьких ярких красных структур, которые появляются в клетках после инкубации с флуоресцентным декстраном, но не являются митохондриями, так как они не показывают никакой ассоциации с зелеными митохондриями (Рис. 21 и Рис. 22). По-видимому, это или лизосомы, или эндосомы или аутофагосомы (Ьегт^егэ & Но1тиИатес1оу, 2005).

Мембрана клеток может быть «повреждена» одним из двух независимых методов: либо с помощью микропипетки или же после обработки дигитонином (Рис. 22). Данные, полученные с помощью микропипетки или дигитонина и конфокальной микроскопии, подтверждают, что эти данные не отличаются друг от друга и молекулы декстрана (ЗкДа) попадают в пространстве между двумя митохондриальными мембранами, только через открытые пориновые

каналы (Рис. 22). При наличии "разрывов" в мембране гепатоцитов, красные метки - молекулы декстрана могут свободно проникать в цитоплазму, и заполнять весь доступный внутриклеточный объем, окрашивая его красный цвет. Для наших целей существенным является то, что молекулы декстрана могут проникнуть внутрь в свободное пространство между двумя мембранами митохондрий только через открытые пориновые

каналы во внешней мембране митохондрий (Рис. 22). Ингибирование пориновых каналов ДИДС, перед тем как к клеткам

ДИГИТОНИН |

кшт ЯШвк Ш ~ *п МТГ+РоДекс

ПИПЕТКА

мтг щ МТГ+РоДекс шш уШВЬг -яШ Отбыть С РЮБ

Рисунок 22. Накопление флуоресцентного декстрана (Ро-Дек) в митохондриях гепатоцитов после удаления барьера плазматической мембраны либо дигитонином (ДИГИТОНИН) либо механическим повреждением микропипеткой (ПИПЕТКА). Митохондрии (МТЭ, зеленая флуоресценция), которая сохраняется после обработки дигитонином или повреждения пипеткой. В отмытых от РоДек клетках, красная флуоресценция остается только в митохондриях.

были добавлены ЗкДа молекулы декстрана, существенно снизило флуоресценцию, которая была ассоциирована с митохондриями, таким образом, свидетельствуя о том, что краска проходит через пориновые каналы (Рис. 22). Интересно, что красные молекулы родамин- декстрана накапливаются также и в изолированных митохондриях (Рис. 23). Выделенные митохондрии были иммобилизованы на обыкновенном

Рисунок 23. Накопление РД (красная флуоресценция) в изолированных митохондриях, меченных зеленой флуоресцентной краской. Иммобилизованные митохондрии инкубировались вместе с РД и после блокирования пориновых каналов, несвязанные молекулы РД отмывались.

покровном стекле, предварительно покрытым коллагеном из хвоста крысы, были покрашены зеленой митохондриальной флуоресцентной краской (МКоТгаскегСгееп, МТГ), чтобы их можно было различить на фоне красной флуоресценции молекул декстрана на конфокальных картинках (Рис. 23А). При добавлении ТМРМ-декстран большая часть митохондрий набирала эту красную флуоресценцию в пространство ограниченное зеленым. Это отчетливо видно на конфокальных изображениях митохондрий, которые были получены после блокирования пориновых каналов ДИДС'ом и отмывки не связавшегося ТМРМ-декстрана из окружающей среды (Рис. 23Б). Зеленые митохондрии демонстрируют удержание красной флуоресценции внутри зеленого контура, свидетельствуя о то, что молекулы декстрана могут проникать во внешнее пространство митохондрий, и там где интенсивности этих двух флуоресценций совпадают, митохондрии окрашены в желтый цвет (Рис. 23В). Если пориновые каналы заблокировать ДИДС'ом до обработки митохондрий молекулами декстрана, то химическое ингибирование пориновых каналов также предотвращает накопление красной флуоресценции в митохондриях. Таким образом, используя конфокальную флуоресцентную микроскопию, стало возможным непосредственно отслеживать статус пориновых каналов по прохождению флуоресцентной метки размером 3 кДа через внешнюю мембрану митохондрий и накопление ее в межмембранном пространстве как внутриклеточных, так и изолированных митохондрий.

6. Этанол ограничивает диффузию флуоресцентного декстрана в межмембранное пространство митохондрий. Обработка гепатоцитов этанолом и последующее разрушение плазматической мембраны клеток не изменило морфологию и внешний вид митохондрий в клетках. Однако предварительная обработка выделенных гепатоцитов этанолом сопровождалась закрытием пориновых каналов,

которое привело к значительному уменьшению интенсивности красной флуоресценции ассоциированной с зелеными митохондриями вследствие подавления "захвата" и удержания красных молекул декстрана в митохондриях (Рис.24). Обработка клеток

Рисунок 24. Этанол закрывает пориновые каналы митохондрий. А, Интенсивность красной флуоресценции в гепатоцитах (Контроль) была значительно подавлена после обработки этанолом (Этанол) или ДИДСом, блокатором пориновых каналов (ДИДС). Б, Интенсивности красной флуоресценции молекул декстрана, ассоциированной с митохондриями (зеленая флуоресценция).

этанолом или ДИДС, химическим ингибитором пориновых каналов, не изменила внешний вид митохондрий (Рис. 24А, зеленые изображения), однако значительно снизило интенсивность красной флуоресценции, связанной с митохондриями (Рис. 24Б), и оба воздействия, этанол (или ДИДС), уменьшили красную флуоресценцию декстрана (35% и 56%, соответственно) (Рис. 24Б). Предварительная обработка клеток ДИДС, химическим ингибитором пориновых каналов, также снизило флуоресценцию молекул декстрана в зонах, ассоциированных с мито-хондриальным матриксом в гепатоцитах. Результаты этих экспериментов находится в хорошем соответствии с биохимическими данными, представленными в этой работе. В подтверждение, нашей гипотезы, окисление этанола изолированными клетками печени крыс, сопровождается закрытием пориновых каналов во внешней мембране митохондрий, что приводит к ограничению и уменьшению потоков флуоресцентных молекул декстрана, АТФ и АДФ из внешней среды в митохондрии.

Таким образом, ограничение потока метаболитов через внешнюю мембрану митохондрий в результате закрытия пориновых каналов может приводить к глобальной потере митохондриями их специфических функций.

7. Этанол подавляет активацию дыхания гепатоцитов, в ходе синтеза мочевины. Синтез мочевины, важнейшего пути обмена азота, который требует больших энергетических затрат и у млекопитающих локализован исключительно в

Рисунок 25. А - Иллюстрация роли митохондрий в синтезе мочевины. Б - Этанол подавляет дыхание гепатоцитов, обусловленное синтезом мочевины.

|юо

а>

14 28 42 56 70 Время (мин)

печени (Nissim, 2008). Две энергозависимые реакции цикла мочевины: синтез карбамоилфосфата и затем производство цитруллина из орнитина протекают в матриксе митохондрий (Рис. 25А). Синтез мочевины в культуре клеток печени сопровождается ростом потребления АТФ, которое требует увеличения активности окислительного метаболизма митохондрий и, таким образом, приводит к активации дыхания гепатоцитов (Рис. 25). Как и ожидалось, закрывание каналов поринов во внешней мембране митохондрий гепатоцитов окисляющих этанол, снижает потребность в производстве АТФ и приводит к подавлению активации дыхания субстратами синтеза мочевины (Рис. 25Б). Эффект этанола зависит от концентрации спирта и чувствителен к действию олигомицина, специфического ингибитора синтеза АТФ в митохондриях (данные не показаны). Подавление синтеза мочевины (и следовательно, дыхания гепатоцитов) этанолом частично обращалось ингибиторами метаболизма этого спирта в клетках печени: 4-метилпиразолом, аминобензотриазолом и цианамидом, указывая на то, что для проявления наблюдаемых эффектов, необходим метаболизм этанола. В настоящее время ведутся исследования по выявлению того, какой из метаболитов окисления этанола участвует в закрывании пориновых каналов.

8. Этанол подавляет митохондоиальный путь обмена мет ильных групп в гепатоцитах. В клетках млекопитающих производство метильных групп осуществляется двумя независимыми путями, локализованными в цитоплазме и матриксе митохондрий (Appling, 1991). Так как транспорт всех водорастворимых метаболитов в митохондриях протекает с участием пориновых каналов, далее мы изучали эффект этанола на реакции синтеза серина из глицина в цитоплазме и митохондриях (Рис. 26А). В интактных клетках печени млекопитающих молекулы глицина транспортируются в цитоплазму вместе с ионами натрия, и далее

подвергаются энзиматическому расщеплению цитоплазматическим ферментом глицин гидроксиметил трансферазой с образованием изотопомеров серина, специфических для цитоплазмы (Рис. 26Б). Кроме того, молекулы глицина транспортируются в матриксе, где расщепляются до аммиака и бикарбонат аниона, а освободившаяся метильная группа, которая конденсируется с другой молекулой глицина, образует набор изотопомеров серина, характерный для митохондрий (Рис. 26Б). Эти изотопомеры имеют различающиеся ЯМР спектры и могут быть количественно оценены в экстрактах клеток метаболизирующих 13С-меченный глицин. Для мониторинга синтеза метильных групп мы выбрали подход, который основан на том, что ЯМР-спектроскопия позволяет различать сериновые ,3С-изотопомеры (Pasternak et al., 1992). Типичный ЯМР спектр экстракта клеток печени метаболизирующих 13С-

Митохондрия 3"С Цитоплазма 213С

Контроль Этанол, 100 мМ Цистеамин, 100 цМ

61 60 59 58 57

Химический сдвиг

Рисунок 26. А - Иллюстрация роли митохондрий в обмене и синтезе метильных групп. Б - Подавление этанолом митохондриального синтеза серина из глицина в культуре гепатоцитов (1ЭС-ЯМР спектроскопия).

глицин показан Рис. 26Б, Контроль. На спектре можно четко различить два триплета: один, с химическим сдвигом - 61, что соответствует атому углерода в положении 3 в молекуле 313С-серина, который синтезируется исключительно в митохондриях, (митохондриальный триплет) и другой, с химическим сдвигом - 57 (213С-серин), который синтезируется исключительно в цитоплазме клеток (Pasternak et al.,1994;Dickson et al., 2005). Здесь мы использовали соотношению этих пиков в триплетах для оценки состояния и активности митохондриального и цитоплазматического путей синтеза серинов. Добавление этанола (Рис. 26Б) снизило пики триплета 313С-серина (митохондриальный путь) оставив практически без изменения пики триплета 213С-серина (цитоплазматический путь). Цистеамин, известный ингибитор митохондриального синтеза серина полностью подавил митохондриальный пик, оставив почти без изменения цитоплазматический 213С-серин (Рис. 26Б).

9. Закрывание пориновых каналов приводит к увеличению окислительного стресса в митохондриях. Кроме подавления транспорта метаболитов, закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий, также будет препятствовать

свободному обмену супероксид радикалов через внешнюю мембрану. Эти радикалы

О 800

5 700

® 600

5 500 3"

о 400 с;

о 300 LZ

200

Рисунок 27. Экспериментальная модель для изучения действия закрывания пориновых каналов на функции митохондрий. Отслеживание открывания Са2+-индуцированное открывание неспецифической поры в митохондриях (МРТ) по изменению светорассеяния. Циклоспорин А (1рМ) полностью предотвращает изменение набухания митохондрий, индуцированное ионами Са2+.

образуются при работе дыхательной цепи митохондрий на внешней стороне внутренней мембраны и могут покинуть межмембранное пространство только через открытые пориновые каналы (Madesh & Hajnoczky, 2001).

Таким образом, закрывание этих каналов должно приводить к избыточному росту и накоплению кислородных радикалов в митохондриях и окислительному стрессу (Tikunov et al„ 2008). Следовательно, закрывание пориновых каналов в изолированных митохондриях приведет к ускоренной активации Са2+-зависимой поры. Эффект закрывания пориновых

каналов на митохондрии, оценивали по способности ионов Ca2t вызывать открывание неспецифических пор во внутренней мембране митохондрий, которое мы измеряли по изменению поглощения и набуханию (Рис. 27). Время от момента накопления ионов Са2+ до набухания митохондрий зависит от количества добавленного Са2+ и ускоряется при его увеличении (Рис. 27). Закрывание пориновых каналов путем обработки митохондрий G3139 (Genta, USA), ингибитором пориновых каналов (Tan et а!., 2007) значительно ускоряла открывание неспецифической поры, что приводило к ускоренному набуханию и изменению оптической плотности суспензии (Рис. 28А). Эффект G3139 полностью снимался антиоксидантами (не показано), указывая, что закрывание пориновых каналов сопровождается ростом окислительного стресса в митохондриях. Прямые измерения

"None -Ca24 50 рМ -Ca24100 рМ -Ca2* 100 рМ

-Ca2* 150 рМ .Ca2' 200 рМ

-Ca2* 250 рМ

-Ca2* 250 рМ+ ЦикА

Рисунок 28. А-С3139 (5 рМ, 5 мин) блокатор пориновых каналов ускоряет Са2+-зависимую, циклоспорин А чувствительную пору и увеличивает уровень супероксид радикалов в митохондриях (Б). Эффект С3139 обращается дигитонином (Т|'кипоу е! а!., 2008).

содержания супероксид радикалов в митохондриях с помощью красной флуоресцентной метки дигидрооксиэтидина (Рис. 28Б) подтвердили, что уровень супероксид радикалов в митохондриях при закрытии пориновых каналов возрастает, и что последующая обработка митохондрий дигитонином способствует уменьшению окислительного стресса (Рис. 28Б). Это обусловлено тем, что дигитонин за счет образования пор во внешней мембране митохондрий облегчает диффузию анионов из межмембранного пространства (Becker et а!., 1980).

Таким образом, закрывание пориновых каналов в функционально активных митохондриях приводит к окислительному стрессу из-за избыточного накопления супероксид анионов в межмембранном пространстве митохондрий. Супероксид анионы продолжают производиться дыхательной цепью, но уже не могут покинуть митохондрии через закрытые пориновые каналы.

10. Нокаут пориновых каналов в культуре клеток увеличивает токсичность анти-опухолевых препаратов. Митохондриальный окислительный стресс является составным компонентом действия многих анти-опухолевых препаратов (Son et at., 2007). Из предварительных данных о том, что закрывание пориновых каналов усиливает окислительный стресс в митохондриях, мы. сделали вывод о том, что ограничение проницаемости внешней мембраны митохондрий путем химического блокирования или генетического нокаута пориновых каналов можно существенно повысить эффективность лекарственных препаратов, направленных на уничтожение раковых клеток путем активации митохондриального апоптоза. Для количественной оценки активации апоптоза в фибробластах из эмбрионов мыши (ФЭМ) антиопухолевым препаратом адафостином (5 рМ) мы выбрали определение числа апоптозных ядер в культуре фибробластов мыши (Рис. 29), а также измерение ферментативной активности каспазы 3, которая является типичным индикатором апоптоза и тесно связана с клеточной гибелью (Рис. 30). В интактных клетках, ядра выглядят как диффузно окрашенные структуры, типичные для нормальных ядер (Рис.29А). Обработка клеток адафостином приводит к появлению ядерной морфологии, которая характерна для клеточной гибели (Рис. 29Б). При этом наблюдается типичная для апоптозной гибели конденсация ядерного материала (Рис. 29Б). Удаление из этих клеток одной из изоформ пориновых каналов (изоформы порин-1) путем нокаутирования гена порин-1, сопровождается повышением чувствительности клеток к действию адафостина. Эти изменения морфологии ядер характерные для апоптозной

Рисунок 29. Флуоресцентные изображения ядер фибробластов мыши окрашенных красителем йодистым пропидием до (А) и после 6 часовой обработки (Б) адафостином (5 рМ). Клетки обрабатывались метанолом и затем раствором йодистого пропидия (30 рг/мл,)в фосфатном буфере 30 мин при комнатной температуре.

гибели клеток были более чувствительны к клеткам с нокаутированным пориновым каналом Клетки фибробластов, в которых генетически нокаутирован один из изомеров поринового канала (порин-1) при обработке адафостином продемонстрировали значительное усиление чувствительности к адафостину, препарату, который специфически индуцирует митохондриальный апоптоз (Son el al, 2007) В нокаутированных клетках, в которых полностью отсутствует белок порин-1, за 6 часов инкубации с адафостином активность каспазы 3 была увеличена почти в 50 раз в нокаутированных клетках по сравнению с контролем (Рис ЗОА) Это свидетельствует о том, что отсутствие функциональных пориновых каналов в клетках увеличивает цитотоксичность лекарственных препаратов в десятки раз Морфологическое исследование ядер нормальных и нокаутированных фибробластов, подтвердило, что в клетках с нокаутированным пориновым каналом, количество апоптозных ядер значительно превосходит число апоптозных ядер в клетках с нормальной экспрессией этого белка (Рис ЗОБ) Таким образом, нокаутирование поринового белка в митохондриях, сопровождается значительным повышением чувствительности клеток к лекарственному препарату, который действует через активацию митохондриального пути апоптозной гибели, подтверждая нашу гипотезу о том, что уменьшение проницаемости внешней мембраны митохондрий химическим блокированием имеющихся пориновых каналов или генетическим нокаутом

Таким образом, биохимические и биофизические данные, приведенные в настоящей работе, подтверждают правильность нашей гипотезы о том, что закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий лежит в основе глобальных нарушений функции митохондрий Закрывание пориновых каналов, которое также препятствует свободной диффузии супероксид анионов из межмембранного пространства, приводит к накоплению этих радикалов в митохондриях, окислительному стрессу и повышению чувствительности клеток млекопитающих к цитотоксическим агентам, в том числе и к анти-опухолевым препаратам

ВЫВОДЫ

1 Состояние Са2*-зависимой неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий определяется количеством ионов Са2\ наколенных в матриксе Малые количества Са2* не в состоянии открыть пору, а большие количества Са индуцируют состоянию с постоянно-открытой порой В большом диапазоне промежуточных концентраций ионов CaZt наблюдаются колебания состояния этой поры между открытым и закрытым состояниями

2 Показано, что изолированные митохондрии обладают новым свойством, которое мы назвали «митохондриальный Са2+-индуцированный выброс Са2+» Высвобождение ионов Са2+, предварительно накопленных в матриксе митохондрий, приводит к значительному увеличению концентрации внемитохондриальных ионов Са2* Эта способность митохондрий к автокаталитическому увеличению концентрации Са2+ в среде инкубации лежит в основе нового явления, а именно, возникновению и распространению самоподдерживающихся Са2* волн в пространственно-распределенной суспензии изолированных и энергизованных митохондрий

3 В невозбудимых живых клетках «Са2*-индуцированный выброс Са2+ из митохондрий» приводит к тому, что энергозависимый митохондриальный транспорт Ca2t оказывается

основным внутриклеточным элементом, определяющим синхронизацию, высокую амплитуду и скорость распространения Са2+ сигналов в цитоплазме Таким образом, энергозависимый транспорт Са в митохондриях регулирует динамику концентрации свободных ионов Са2+ в цитоплазме клеток Кроме непосредственного влияния на амплитуду Са2* сигналов в цитоплазме клеток, митохондриальный транспорт Са2* определяет синхронность концентрационных Са2+ волн в цитоплазме клеток

5 Ишемическое повреждение сердечной мышцы, в первую очередь, проявляется в повреждении митохондриальных функций и действие множества анти-ишемических фармакологических препаратов направлено на защиту митохондрий Мы впервые показали, что анти-ишемические широко известные препараты, диазоксида и пинацидила, обладают выраженными протонофорными свойствами и, что в основе их защитного действия, лежит их способность к «слабому» разобщению митохондрий В подтверждение, мы впервые экспериментально продемонстрировали анти-ишемическое действие 2,4-динитрофенола, классического митохондриального разобщителя протонного типа, который, подобно диазоксиду и пинацидилу, значительно уменьшил ишемическое повреждение миокарда

6 Токсическое действие этанола в печени вызывает глобальную потерю митохондриальных функций Мы впервые показали, что это обусловлено закрытием пориновых каналов во внешней мембране митохондрий Закрытие пориновых каналов и сопутствующее увеличение производства ЫАЭН, увеличение мембранного потенциала митохондрий и окислительный стресс, сопровождается повышенным повреждающим действием ионов Са2+ на митохондрии

7 Показано, что механизм повреждающего действия закрытых пориновых каналов заключается в повышении уровня супероксид радикалов в митохондриях вследствие уменьшения проводимости пориновых каналов во внешней мембране и уменьшения истока супероксид радикалов из межмембранного пространства митохондрий Таким образом, закрывание пориновых каналов приводит к возрастанию окислительного стресса, и таким образом повышает чувствительность митохондрий к повреждающему действию ионов Са2+

8 Обнаруженное в настоящей работе увеличение окислительного стресса, приводящее к повышению чувствительности митохондрий к ионам Са2+ при закрывании пориновых каналов, было использовано как способ повышения поражающего действия цитотоксических препаратов В предварительных экспериментах мы продемонстрировали, что обработка клеток млекопитающих ингибиторами пориновых каналов, а также при генетическом удалении этих каналов, снижает эффективную токсическую дозу адафостина, известного противоопухолевого препарата, в десятки раз В настоящее время проводится дальнейшее исследование эндогенных механизмов регуляции пориновых каналов митохондрий

Список работ холмухамедова Э Л опубликованных по теме диссертации

1 Dzeja РР, Bast Р, Ozean С, Valverde A, Holmuhamedov EL, Van Wylen DGL, Terzic A Targeting nucleotide-requiring enzymes Implications for diazoxide-induced cardioprotection Am J Physiol 2002, 284 H1048-H1056

2 Dzeja PP, Bortolon R, Perez-Terzic C, Holmuhamedov EL, Terzic A Energetic communication between mitochondria and nucleus directed by catalyzed phosphotransfer Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99 10156-10161

3 Dzeja PP, Holmuhamedov EL, Ozcan C, Pucar D, Jahangir A, Terzic A Mitochondria Getaway for cytoprotection Circ Res 2001, 89 744-746

4 Evtodienko YV, Zinchenko VP, Holmuhamedov EL, Gylkhandanyan AV, Zhabotinsky AM The stoichiometry of ion fluxes during Sr2t-induced oscillations in mitochondria Biochim Biophys Acta 1980, 589 157-161

5 Globus RK, Holmuhamedov EL, Lull JC, Lopez V, Doty SB, Moursi A, Damsky C Fibronectin is a survival factor for differentiated osteoblasts J Cell Sci 1998, 111 13851393

6 He T, Peterson TE, Holmuhamedov EL, Terzic A, Caplice NM, Oberley LW, Katusic ZS Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase Arterioscler Thromb Vase Biol 2004 24 2021-2027

7 Hetrick EM, Shin JH, Stasko NA, Johnson CB, Wespe DA, Holmuhamedov E, Schoenfisch MH Bactericidal Efficacy of Nitric Oxide-Releasing Silica Nanoparticles ACS Nano 2008 2 235-246

8 Holmuhamedov EL, Bacon JA, Ulrich RG Nucleotide-induced calcium transient and plasma membrane calcium permeability in Chang Human Liver Cells Biochem Mol Biol Intern 1995, 35 595-604

9 Holmuhamedov EL, Evtodienko YuV Spatial structures in mitochondrial suspension induced by cation efflux FEBS Lett 1986, 195 339-343

10 Holmuhamedov EL, Jahangir A, Bienengraeber M, Lewis L, Terzic A Deletion of mtDNA Disrupts the Function, but not the Biogenesis of Mitochondria Mitochondrion, 2003, 3 13-19

11 Holmuhamedov EL, Jahangir A, Oberlin A, Komarov A, Colombini M, Terzic A Potassium channel openers are uncoupling protonophores implication in cardioprotection FEBS Lett 2004,568 167-170

12 Holmuhamedov EL, Jovanovic S, Dzeja P, Jovanovic A, Terzic A Mitochondrial ATP-sensitive channels modulate cardiac mitochondrial functions Am J Physiol 1998, 275 H1567-H1576

13 Holmuhamedov EL, Kholmukhamedova GL, Baimuradov TB Non-cholinergic toxicity of organophosphates in mammals Interaction of ethaphos with mitochondrial functions J Appl Toxicol 1996, 16 475-481

14 Holmuhamedov EL, Lewis L, Bienengraeber M, Holmuhamedova M, Jahangir A, Terzic A Suppression of human tumor cell proliferation through mitochondrial targeting FASEB J, 2002, 16 1010-1016

15 Holmuhamedov EL, Ozcan C, Jahangir A, Terzic A Restoration of Ca2+-inhibited oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria by mitochondrial Ca2+ unloading Mol Cell Biochem 2001, 220 135-140

16 Holmuhamedov EL, Sadykov YH, Teplova W Oscillation of ion fluxes in mammalian erythrocytes Mechanism of oscillation Eur J Biochem 1988, 166 723-726

17 Holmuhamedov EL, Oberlin A, Short K, Nair S, Terzic A, Jahangir A (2002) Differential responsiveness of cardiac subsarcolemmal and mterfibrillar mitochondria to Ca2+ injury and diazoxide Mayo Clin Proc 77 46-54

18 Holmuhamedov EL, Teplova W, Chukhlova EA, Evtodienko YuV, Ulrich RG Strontium excitability of the inner mitochondrial membrane Regenerative Strontium-induced Strontium releases Biochem Mol Biol Intern 1995, 36 39-49

19 Holmuhamedov EL, Wang L, Terzic A ATP-sensitive K+ channel openers prevent Ca2+ overload in rat cardiac mitochondria J Physiol (London) 1999, 519 347-360

20 Holmuhamedov EL Oscillating dissipative structures in mitochondrial suspensions Eur J Biochem 1986, 158 543-546

21 Ichas F, Jouaville LS, Sidash S, Mazat J-P, Holmuhamedov EL Mitochondrial calcium spiking a transduction mechanism based on calcium-induced permeability transition involved in cell calcium signaling FEBS Lett 1994, 348 211-215

22 Ichas F, Jouaville LS, Sidash S, Mazat J-P, Holmuhamedov EL Mitochondrial calcium spiking The physiological face of permeability transition? Modern Trends in Bio-Thermo Kinetics 1994, 3 159-162

23 Jahangir A, Ozean C, Holmuhamedov EL, Terzic A Increased calcium vulnerability of senescent cardiac mitochondria Protective role for mitochondrial potassium channel opener Mech Ageing Develop 2001, 122 1073-1086

24 Jouaville LS, Ichas F, Holmuhamedov EL, Camacho P, Lechleiter JD Synchronization of calcium waves by mitochondrial substrates in Xenopus I Oocytes Nature 1995, 377 438-441

25 Le SB, Hailer MK, Buhrow S, Wang Q, Flatten K, Pediaditakis P, Bible KC, Lewis LD, Sausville EA, Pang YP, Ames MM, Lemasters JJ, Holmuhamedov EL, Kaufmann SH Inhibition of mitochondrial respiration as a source of adaphostin-induced reactive oxygen species and cytotoxicity J Biol Chem 2007 Jan 9, [Epub ahead of print]

26 Le SB, Holmuhamedov EL, Narayanan VL, Sausville EA, Kaufmann SH Adaphostin and other anticancer drugs quench the fluorescence of mitochondrial potential probes Cell Death Differ 2006, 13 151-159

27 Lemasters JJ, Holmuhamedov EL Voltage-Dependent Anion Channel (VDAC) As Mitochondrial Governator - Thinking Outside the Box Biochim Biophys Acta 2006, 1762 181-190

28 Maglova LM, Holmuhamedov EL, Zinchenko VP, Evtodienko YV Induction of 2H+/Me2* exchange in rat-liver mitochondria Eur J Biochem 1982, 128 159-161

29 Ozean C, Jahangir A, Holmuhamedov EL, Terzic A Diazoxide protects mitochondria from anoxic injury Implications for myopreservation J Thorac Cardiovasc Surg 2001, 121 298-306

30 Pokhilko AV, Ataullakhanov Fl, Holmuhamedov EL Mathematical model of mitochondrial ionic homeostasis Three modes of Ca2t transport J Theor Biol 2006, 243 152-169

31 Preston CC, Oberlin AS, Holmuhamedov EL, Gupta A, Sagar S, Khazi Syed RH, Siddiqui S, Raghavakaimal S, Terzic A, Jahangir A Aging-Induced Alterations in Gene Transcripts and Functional Activity of Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Complexes in the Heart, Mechanisms of Ageing and Development 2008 129 304-312

32 Sadykov YH, Holmuhamedov EL, Evtodienko YV Effect of pH and proton buffer on oscillations of ion fluxes in rat erythrocytes Eur J Biochem 1984, 143 369-371

33 Selivanov VA, Ichas F, Holmuhamedov EL, Jouaville LS, Evtodienko YuV, Mazat J-P A model of mitochondrial Ca-induced Ca release simulating the Ca oscillations and spikes generated by mitochondria Biophys Chem 1998, 72 111-121

34 Stasko NA, Johnson CB, Schoenfisch MH, Johnson TA, Holmuhamedov EL Cytotoxicity of polypropylenimine dendrimer conjugates on cultured endothelial cells Biomacromolecules 2007 8 3853-3859

35 Terzic A, Dzeja P P, Holmuhamedov EL Mitochondrial Katp Channels Probing Molecular Identity and Pharmacology J Mol Cell Cardiol 2000, 32 1911-1915

36 Theruvath TP, Zhong Z, Pediaditakis P, Ramshesh VK, Currin RT, Tikunov A, Holmuhamedov E, Lemasters JJ Minocycline and N-methyl-4-isoleucine cyclosporin

(NIM811) mitigate storage/reperfusion injury after rat liver transplantation through suppression of the mitochondrial permeability transition Hepatology 2008 47 236-246

37 Ulrich RG, Bacon JA, Cramer CT, Petrella DK, Sun EL, Meglasson MD, Holmuhamedov EL Disruption of mitochondrial activities in rabbit and human hepatocytes by a quinoxalinone anxiolytic and its carboxylic acid metabolite Toxicology 1998,131 33-47

38 Wiswedel I, Barnstorf U, Augustin W, Holmuhamedov EL, Medvedev B, Evtodienko Y Involvement of periodic deacylation-acylation cycle of mitochondrial phospholipids during Sr^-induced oscillatory ion transport in rat liver mitochondria Biochim Biophys Acta 1982, 688 597-604

39 Гольдштейн БН, Холмухамедов ЭЛ, Иванова АН, Фурман ГА Ионофор-индуцированные колебания в эритроцитах Кинетическая модель Мол Биол 1987, 21 132-139

40 Теплова ВВ, Евтодиенко ЮВ, Холмухамедов ЕЛ, Сергиенко НГ, Гончаров НВ Эффект флуороцитрата на поглощение кислорода и транспорт в митохондриях печени Цитология 1992, 34 71-75

41 Теплова ВВ, Сидаш СС, Евтодиенко ЮВ, Холмухамедов ЭЛ Характер и механизм изменений содержания АТФ в митохондриях в ходе колебаний ионных потоков Биохимия 1991, 56 1975-1983

42 Холмухамедов ЭЛ, Зинченко ВП, Евтодиенко ЮВ Автоколебания ионных потоков и редокс состояния дыхательной цепи в митохондриях Биофизика 1980, 25 124128

43 Холмухамедов ЭЛ, Селиванов ВА, Ким ЮВ Математическая модель колебаний ионных потоков в эритроцитах млекопитающих Биофизика 1990, 35 373-377

44 Холмухамедов ЭЛ, Семенова ГА, Зинченко ВП, Евтодиенко ЮВ, Кондрашова МН Обратимые изменения объема митохондрий в ходе колебаний ионных потоков между митохондриями и средой Цитология 1982, 24 1024-1027

45 Холмухамедов ЭЛ, Чухлова ЭА Эффект ионов двухвалентных металлов на колебания ионных потоков в митохондриях печени крыс Укр Биох Ж 1985 57 43-49

46 Чухлова ЭА, Садыков ЮХ, Холмухамедов ЭЛ, Гренадер АК Эффект тримекалина, аймалина, стеноприла и хлорацизина на колебания потоков в митохондриях печени крыс Укр Биох Журнал 1984, 56 207-210

Заказ № 17/0К/08 Подписано в неча!ь 12 08 2008 Тираж 100 экз Уел ил 2 25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778 22-20 ((^ 11 ии>м> с/г ¡и , е-тт1 ифз@с{г / и

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Холмухамедов, Эхсон Лукманович

СПИСОК НАИБОЛЕЕ УПОТРЕБИТЕЛЬНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 Энергозависимый транспорт ионов Са2+ в митохондриях

Глава 2 Митохондриальный механизм действия диазоксида и пинацидила

Глава 3 Роль пориновых каналов в регуляции функций митохондрий

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

• Получение препарата изолированных митохондрий

• Измерение характеристик изолированных митохондрий

• Измерение переноса меченых протонов (3Н) через хлороформ

• Характеристики ишемического повреждения сердечной мышцы

• Культивирование клеток

• «Пермеабилизация» плазматической мембраны гепатоцитов

• Измерение ферментативных активностей

• Измерение проницаемости внешней мембраны митохондрий

• Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ

ЧАСТЬ 1 МИТОХОНДРИИ В РЕГУЛЯЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ

1.1 Общие принципы и особенности транспорта Са2+ в митохондриях

1.1.1 Колебания ионных потоков в митохондриях

1.1.2 Математическая модель колебаний ионных потоков в митохондриях

1.2 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са

1.2.1 Возбудимость внутренней мембраны митохондрий ионами Са2+

1.2.2 Волны сокращения-набухания в неперемешиваемом слое митохондрий

1.3 Участие митохондрий во внутриклеточной Са2+ сигнализации

1.3.1 Участие митохондрий в регуляции концентрации Са2+ в клетках

1.3.2 Участие митохондрии в синхронизации Са2+ волн в клетке.

1.3.3 Зависимость амплитуды Са2+ волны от состояния митохондрий

1.3.4 Восстановление амплитуды и синхронности Са2+ волн 49 Заключение

ЧАСТЬ 2 МИТОХОНДРИИ В МЕХАНИЗМЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

2.1 Влияние диазоксида и пинацидила на функции митохондрий

2.1.1 Деполяризующее действие активаторов КАтф каналов на митохондрии

2.1.2 Действие диазоксида и пинацидила на дыхание митохондрий

2.1.3 Действие диазоксида и пинацидила на синтез АТФ в митохондриях

2.2 Влияние диазоксида и пинацидила на транспорт Са2* в митохондриях

2.2.1 Диазоксид и пинацидил подавляют накопления Са2+ в митохондриях

2.2.2 Диазоксид и пинацидил усиливают выход ионов Са2+ из митохондрий

2.2.3 Действие диазоксида и пинацидила на Са2+-зависимое открывание поры

2.2.4 Зависимость действия диазоксида и пинацидила от ионов 1С в среде

2.2.5 АТФ и/или АДФ ингибируют эффект диазоксида и пинацидила

2.3 Влияние диазоксида и пинацидила на митохондриальныймембранный потенциал и содержание Са2+ в кардиомиоцитах

2.3.1 Диазоксид и пинацидил деполяризуют митохондрии в кардиомиоцитах

2.3.2 Диазоксид и пинацидил снижают митохондриальный Са2+ в клетках

2.4 протонофорный механизм действия активаторов Катф каналов

2.4.1 Общие закономерности действия диазоксида, пинацидила и 2,4-ДНФ на митохондриальные дыхание, мембранный потенциал и синтез АТФ

2.4.2 Диазоксид, пинацидил и ДНФ переносят Н* через гидрофобную фазу

2.4.3 Разобщение митохондрий уменьшает ишемическое повреждение 74 Заключение

ЧАСТЬ 3 РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В ФИЗИОЛОГИИ МИТОХОНДРИЙ

3.1 Окисление этанола закрывает пориновые каналы в внешней мембране митохондрий печени

3.1.1 Действие этанола и продуктов его окисления на основные функции митохондрий

3.1.2 "Пермеабилизация" клеточной и внешней митохондриальной мембран

3.1.3 Дигитонин обращает эффект ингибирования пориновых каналов

3.1.4 Окисление этанола закрывает пориновые каналы

3.1.5 Оценка пориновых каналов с помощью конфокальной микроскопии

3.1.6 Прохождение флуоресцентных молекул 3 кДа декстрана в межмембранное пространство

3.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в первичной культуре гепатоцитов крысы

3.2.1 Участие митохондрий в реакциях цикла мочевины

3.2.2 Окисление этанола подавляет синтез мочевины в гепатоцитах

3.2.3 Действие ингибиторов окисления этанола на синтез мочевины

3.2.4 Действие ингибиторов PI3 киназы и аденозин-А1 рецепторов на синтез мочевины

3.3 Этанол подавляет обмен метильных групп в гепатоцитах крысы

3.3.1 Митохондриальная система метаболизма глицина

3.3.2 Ядерная магнитная спектроскопия 13С изотопомеров серина

3.3.3 Окисление этанола подавляет митохондриальный синтез серина 106 Заключение

ЧАСТЬ 4 РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В ФИЗИОЛОГИИ КЛЕТОК

4.1 Закрывание пориновых каналов увеличивает чувствительность клеток к программируемой клеточной гибели (апоптозу)

4.1.1 Закрывание пориновых каналов активирует МРТ пору

4.1.2 Закрывание пориновых каналов индуцирует окислительный стресс

4.1.3 Гдиетический нокаут белков-поринов увеличивает чувствительность клеток к адафостину

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих"

Митохондрии активно изучаются во многих лабораториях мира на протяжении 60 с лишним лет после их открытия в 1949 году. Несмотря на десятки тысяч работ, посвященных исследованию митохондриальных функций, роль митохондрий в жизнедеятельности клетки и их участие в регуляции внутриклеточных процессов все еще остаются не выясненными. Митохондрии являются важнейшими внутриклеточными структурами, выполняющими значительную роль не только в функционировании клеток млекопитающих в нормальных условиях, но и в различных патологических процессах. Развитие большинства патологических процессов, в частности, аноксии, ишемии, геморрагического шока и окисления этанола сопровождается нарушениями нормального функционирования митохондрий и глобальной потерей митохондриальных функций. Митохондрий теряют способность поддерживать электрохимический градиент ионов водорода на внутренней мембране, эффективно осуществлять окислительное фосфорилирование, производство АТФ и сбалансированный митохондриальный Са2+ ионный гомеостаз, несмотря на наличие кислорода и субстратов окисления [1-11]. Получено множество экспериментальных данных, указывающих на то, что митохондрии являются первичными мишенями различных патологических воздействий [9; 12-17]. В большинстве случаев эти воздействия обусловлены нарушениями внутриклеточного Са2+ гомеостаза [16-23]. Изучение роли митохондрий в жизнедеятельности клеток млекопитающих осложнено множественностью выполняемых митохондриями функций и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между митохондриями и остальными внутриклеточными структурами. Кроме хорошо известной роли митохондрий, как основного производителя АТФ, универсальной внутриклеточной энергетической "валюты", митохондрии принимают непосредственное участие в регуляции концентрации свободного Са2+ в цитоплазме клеток в качестве кальциевого депо с низким сродством, которое, однако, по своей ёмкости намного превосходит ёмкости эндо - и/или саркоплазматического ретикулумов. В покоящейся клетке митохондрии окружены цитоплазмой с низкой концентрацией ионов Са2+ (10"7-10"8 М) и находятся в стационарном состоянии покоя, так как концентрация свободного Са2+ существенно ниже сродства Са2+-транспортирующей системы митохондрий (10"5-10"3 М), [16-18; 20, 21, 24-35].

Однако, в переходных процессах, когда концентрация ионов Са2+ в цитоплазме значительно возрастает, (особенно в областях между эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями) высокие концентрации свободных ионов Са2+ способствуют накоплению некоторых количеств Са2+ в матриксе митохондрий (10" 3-10"2 М) [25; 32; 35; 36]. В этих условиях небольших нагрузок концентрация ионов Са2+ в матриксе митохондрий достигает значений достаточных для воздействия на состояния митохондрий, в частности, способствует увеличению производства АТФ [20; 21; 33; 34]. Однако, дальнейшее увеличение концентрации ионов Са2+ в матриксе митохондрий приводит к увеличению генерации кислородных радикалов, к активации неспецифической поры в мембране митохондрий, набуханию и разрыву внешней мембраны митохондрий с потерей митохондриальных функций [6; 10; 15-17; 19; 25; 34; 37-39]. Таким образом, митохондриальный транспорт Са2+ в зависимости от количества накопленного Са2+ определяет судьбу клеток млекопитающих от нормального функционирования до программируемой или некротической клеточной гибели. При ишемическом повреждении сердечной мышцы эта способность митохондрий накапливать и освобождать ионы Са2+ определяет степень пост-ишемического повреждения сердечной мышцы. В период ишемии, когда из-за закупорки коронарных сосудов подача кислорода и метаболитов к клеткам сердечной мышцы ограничена, активность митохондриальной дыхательной цепи снижена и митохондриальная мембрана в значительной мере деполяризована. При этом накопления ионов Са2+ в митохондриях не происходит, и никаких внешних проявлений повреждений тканей не наблюдается. Наиболее значительные нарушения структуры и функции митохондрий наблюдаются при восстановлении потока свежей крови через закупоренные коронарные сосуды, которое приводит к подаче кислорода и метаболитов к ишемической ткани и удалению продуктов метаболизма [3; 6; 1517; 20; 25; 33; 34; 36]. По-видимому, поступление кислорода к анаэробным митохондриям с высоким уровнем восстановленности комплексов дыхательной цепи, сопровождающееся быстрым восстановлением митохондриального мембранного потенциала, является причиной интенсивного накопления значительного количества ионов Са2+ в матриксе митохондрий [40-44]. Повреждающее действие избыточного накопления ионов Са2+ усиливается в условиях повышенного окислительного стресса, например, при окислении многих ксенобиотиков, включая окисление этанола в клетках печени. Различные патологические условия, приводящие к повреждению митохондриальных функций, таким образом, обусловлены избыточным накоплением ионов Са2+ в митохондриях, которое приводит к открыванию неспецифической поры и потере важнейших митохондриальных функций [2-4; 6; 14-17; 45]. Однако, механизмы, с помощью которых ионы Са2+ приводят к нарушению митохондриальных функций, до конца не выяснены. Для их понимания необходимо исследовать динамику взаимодействия этих ионов с митохондриями на различных уровнях - в изолированных митохондриях, клеточных культурах и в целом органе.

При развитии патологических состояний, в том числе и при алкогольной интоксикации, проницаемость внешней митохондриальной мембраны может меняться, приводя к нарушениям нормального функционирования митохондрий. Существенную роль в поддержании нормального обмена метаболитов между цитоплазмой и митохондриями выполняют каналы во внешней мембране митохондрий, образованные пориновыми белками. Любые нарушения этого обмена приведут к существенным нарушениям метаболизма клеток, особенно в тех процессах, которые невозможны без участия митохондрий. Однако, роль пориновых каналов в индукции и развитии алкогольной интоксикации до сих пор остается не выясненной.

Таким образом, целями настоящей работы являются:

1. Определение участия и роли митохондриального транспорта ионов Са2+ в поддержании нормальной жизнедеятельности клеток млекопитающих.

2. Исследование степени участия митохондрий в регуляции концентрации свободных ионов Са2+ в цитоплазме.

3. Изучение роли митохондриальной компоненты в механизмах ишемического повреждения и противоишемического защитного действия диазоксида и пинацидила, активаторов плазматических АТФ-зависимых калиевых каналов.

4. Определение необходимости «умеренной» деполяризации митохондрий в постишемическом периоде для восстановления механической активности сердечной мышцы.

5. Определение механизма токсического действия этанола на метаболизм митохондрий в интактных клетках.

6. Исследование последствий закрывания пориновых каналов на жизнедеятельность и жизнеспособность клеток млекопитающих.

В связи с этими целями в настоящей работе будут решаться следующие задачи: 1. Выяснить последствия взаимодействия ионов Са2+ с основными митохондриальными функциями и определить факторы, активирующие неспецифическую Са2+-зависимую MPT пору во внутренней мембране митохондрий.

2. Используя теоретический подход и математическую модель митохондриального ионного транспорта, основанную на регуляции проницаемости внутренней мембраны митохондрий Са2+-зависимой порой, получить количественное описание энергозависимых потоков ионов в митохондриях.

3. Получить экспериментальные доказательства участия энергозависимого митохондриального транспорта Са2+ в определении внутриклеточной динамики свободных ионов Са2+, включая генерацию, распространение и синхронизацию Са2+ волн в цитоплазме.

4. Выявить митохондриальный механизм защитного действия противоишемических фармакологических агентов, таких как диазоксид и пинацидил, известных фармакологических активаторов АТФ-зависимых К+ каналов (Катф) плазматической мембраны. На ишемической модели изолированного сердца крысы, определить роль транспорта Са2+ в митохондрии в механизме ишемического повреждения сердечной мышцы.

5. На модели изолированных гепатоцитов крыс, проверить нашу гипотезу о том, что возможной причиной глобальной потери митохондриальных функций при отравлении печени алкоголем является закрывание пориновых каналов во внешней митохондриальной мембране.

6. Разработать подходы к экспериментальному измерению проницаемости пориновых каналов во внешней мембране митохондрий внутри интактных клеток без их выделения из гепатоцитов. Определить какой из продуктов окисления этанола (NADH, кислородные радикалы, ацетальдегид и/или ацетат) играет существенную роль в механизме закрывания и способствует закрыванию митохондриальных пориновых каналов.

7. Исследовать роль закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны в гепатоцитах, окисляющих этанол на основные функции печени - синтез мочевины, а также производство и обмен метильных групп в гепатоцитах.

8. Исследовать эффект закрытия пориновых каналов и уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий на Са2+-индуцированное открывание неспецифической поры и высокоамплитудного набухания и определить механизм повреждающего действия закрытых пориновых каналов на функции интактных митохондрий. 9. Определить влияние закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны на цитотоксичность лекарственных препаратов на примере противоопухолевого агента адафостина.

Проведенное в настоящей работе изучение особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях тканей сердца и печени позволит выявить факторы, которые являются определяющими в нарушениях митохондриальных функций при развитии различных патологических процессов, и использовать полученные данные для разработки методологических и терапевтических подходов для защиты этих органов. Полученные в работе данные могут быть использованы для разработки методологических и терапевтических подходов, направленных на уменьшение последствий ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени, а также для разработки и изготовления, новых более эффективных фармакологических препаратов для лечения ишемического и/или алкогольного повреждения тканей сердца и печени.

Настоящая работа разделена на четыре Части, в каждой из которых рассмариваются экспериментальные данные по одной теме. Часть 1 посвящена описанию особенностей транспорта ионов Са2+ в митохондриях и их определяющей роли в регуляции динамики внутриклеточных Са2+ волн. В Части 2 представлены данные о повреждении митохондриальных функций в ишемическом сердце, о способах защиты миокарда от ишемического повреждения и о роли митохондрий в восстановлении сократительной активности сердца после длительной ишемии. Часть 3 посвящена обсуждению регуляторной роли пориновых каналов во внешней мембране митохондрий в нормальной жизнедеятельности митохондрий и клеток, а также их значению в токсическом действии этанола. В Части 4 представлены данные об ускорении программируемой клеточной гибели индуцированной адафостином, препаратом с противоопухолевым действием, при генетическом удалении (нокауте) белков поринов в митохондриях клеток эмбриональных фибробластов мышей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ЭНЕРГОЗАВИСИМЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ Са2+ В МИТОХОНДРИЯХ

Транспорт ионов Са2+ в митохондриях, обнаруженный в ранние 60-е годы, был одним из первых процессов, экспериментальные исследования которого положили начало изучению энергозависимого транспорта ионов в митохондриях [18; 24; 46-49]. Приблизиться к выяснению механизма и определению движущих сил транспорта ионов Са2+ позволила хемоосмотическая гипотеза Митчелла [5053], которая однозначно предсказывала потенциал- зависимый транспорт и накопление одно- и двухвалентных ионов в матриксе митохондрий [18; 32; 36; 54; 55]. Важнейшие доказательства гипотезы Митчелла о генерации электрохимического градиента ионов водорода в дыхательной цепи митохондрий были получены с помощью естественных и искусственно синтезированных соединений [50; 51; 56-60]. Эти агенты получили общее название ионофоров по их способности переносить заряженные ионы одновалентных щелочных металлов через биологические и фосфолипидные мембраны [61-68]. Именно с использованием ионофоров связано открытие сложных колебательных динамических режимов транспорта ионов в изолированных митохондриях [66; 6976]. Колебания ионных потоков и объема митохондрий были обнаружены при исследовании влияния ряда синтетических антибиотиков ионофоров на энергетику изолированных митохондрий [64-66; 68; 70; 71; 73; 74; 76-78]. Начиная с первых работ Pressman с соавторами [46; 66; 69; 70; 72; 74] до настоящего времени обнаружено и опубликовано более 13 различных режимов колебаний ионных потоков в митохондриях [74; 75; 78-81]. В 1964-1966 гг. было показано, что колебания объема митохондрий и потоков ионов калия, натрия или цезия наблюдаются в присутствии любых антибиотиков, изменяющих проницаемость мембраны митохондрий к одновалентным ионам [62; 66; 68; 76-78]. В дальнейшем Packer с соавторами показали, что наличие антибиотиков не является необходимым для запуска колебаний [69; 70; 73-75]. Кроме того было обнаружено, что участие дыхательной цепи с ее сложными регуляторными механизмами также не является необходимым для возникновения колебаний, которые наблюдаются и в митохондриях, энергизованных за счет гидролиза добавленного АТФ [70; 73; 74]. Эти авторы показали, что обработка митохондрий EDTA, которая связывает ионы Мд2+, увеличивает проницаемость внутренней мембраны для щелочноземельных ионов - Na+, К+, Rb+ или Cs+ [70; 75]. В этой связи необходимо отметить работы

Ленинджера и Карафоли 1965 года, в которых было показано, что даже в отсутствии антибиотиков или обработки митохондрий ЭДТА, единичной импульсной добавки ионов кальция к энергизованным митохондриям, достаточно для возникновения колебаний потоков ионов Н+ и Са2+ [82; 83]. Самые длительные колебания ионов водорода и калия были обнаружены в митохондриях, обработанных валиномицином, ионофором с очень высокой селективностью к ионам К+ [76]. Другим важным шагом в понимании этих колебаний стали работы Ташмухамедова и Гагельганса [77] и Евтодиенко с соавторами [78-80; 84; 85], в которых было продемонстрировано участие в колебаниях двухвалентных ионов (Са2+ или Sr2+). Таким образом, исследование колебаний ионных потоков в изолированных митохондриях позволило обнаружить участие в них ионов Са2+ и подойти к пониманию роли этих ионов в генерации колебаний [77-79; 82-85]. Однако, несмотря на то, что явление колебаний ионных потоков в изолированных митохондриях известно уже более 40 лет, и к началу наших исследований было предложено множество различных моделей генерации этих колебаний, их детального анализа и выделения общих закономерностей и событий, ведущих к возникновению колебаний, сделано не было. Анализ литературных и ранее полученных собственных данных позволил нам создать общую картину событий, ведущих к возникновению колебаний: (1) Митохондрии в присутствии субстратов окисления и кислорода, накапливают одновалентные К+, а также ионы Са2+, всегда имеющиеся в цитоплазме клеток или в среде инкубации. (2) В результате накопления ионов К+ и Са2+ в митохондрии, их матрикс набухает и защелачивается. Эти факторы "запускают" Са2+-зависимые перестройки во внутренней мембране митохондрий сопровождающиеся открыванием неспецифической поры. (3) В эту открывшуюся пору небольшие ионы матрикса, ионы водорода, калия, Са2+ и другие перетекают по своим градиентам и способствуют деполяризации мембраны, уменьшению объема матрикса и сокращению внутренней мембраны митохондрий одновременно с закислением матрикса и уменьшением концентрации Са2+. (4) В результате «Са2+-зависимые» перестройки мембраны релаксируют назад в нормальное состояние и неспецифическая пора закрывается. (5) Закрытие поры способствует медленной диффузии субстратов в митохондрии, активации дыхательной цепи (или Н+-АТФазы) и восстановлению мембранного потенциала митохондрий. (6) Восстановление мембранного потенциала сопровождается новым циклом накопления ионов калия и Са2+ в митохондрии, выбросом ионов водорода дыхательной цепью и защелачиванием матрикса, которое завершается активацией «Са2+-зависимой» перестройки мембраны, открыванием неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий и следующим циклом колебаний ионных потоков и объема митохондрий. Все эти этапы генерации колебаний, подтвержденные экспериментально, позволили нам создать математическую модель процесса колебаний ионных потоков и объема в митохондриях. Таким образом, в конце 80-х началу 90-х годов основные черты процесса колебаний ионных потоков в митохондриях и необходимость участия в колебаниях ионов кальция были выявлены, однако полного понимания самого механизма и физиологической роли/необходимости в этих колебаниях не было. Участие ионов кальция в этих колебаниях указывало на возможную физиологическую важность процесса колебаний в целом. Однако в эти годы предположение о возможности регуляции концентрации свободного Са2+ в цитозоле митохондриями не выдержало экспериментальной проверки. Участие митохондрий в регуляции внутриклеточной концентрации Са2+ было опровергнуто экспериментами Ленинджера с коллегами [86]. Эти авторы экспериментально определили вклад эндоплазматического ретикулума и митохондрий в поддержании концентрации свободного кальция в пермеабилизованных гепатоцитах печени крысы и показали, что митохондрии связывают намного больше кальция, чем эндоплазматический ретикулум, хотя и с гораздо меньшим сродством. На этом основании был сделан вывод о том, что концентрация свободного кальция в цитоплазме определяется эндоплазматической кальциевой АТФ-азой, а не митохондриями [86]. Эти данные были первой экспериментальной проверкой участия митохондрий в регуляции внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и были настолько убедительными, что на десятилетия затормозили понимание истинной роли кальция в регуляции функций митохондрий в клетках млекопитающих. До середины 70-х годов все работы по изучению роли митохондрий в клетках были сосредоточены на выяснении особенностей и деталей механизма окислительного фосфорилирования [8; 24; 36; 50; 51; 56]. До недавнего времени считалось, что участие митохондрий в Са2+ гомеостазе клетки ограничено Са2+-зависимой активацией матриксных ферментов, которое транслируется в усиленное производство АТФ [20; 21; 33; 34]. Дальнейшее развитие представлений о регуляторной роли ионов Са2+ в жизнедеятельности митохондрий были получены в работах Hunter & Haworth

87-91]. Было установлено, что транспорт ионов кальция в изолированных митохондриях происходит в две фазы. Первая фаза - это энергозависимое накопление добавленных ионов в матриксе митохондрий, стимуляция дыхания и выброс протонов из матрикса. Во второй фазе, накопленные ионы кальция начинают выходить из матрикса и, через некоторое время, наблюдается быстрое увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий, обратный захват ионов водорода и высвобождение из матрикса ионов К+. Эти авторы впервые продемонстрировали, что активное, энергозависимое накопление ионов Са2+ в митохондриях сопровождается драматическими изменениями как морфологии, так и функций митохондрий, спонтанными структурными перестройками во внутренней и внешней мембранах и, что особенно важно, приводит к изменению проницаемости внутренней мембраны митохондрий к водорастворимым молекулам размером <1500 Да и высокоамплитудному набуханию матрикса вследствие открывания большой неспецифической поры во внутренней мембране и коллоидоосмотического увеличения объема матрикса [19; 25; 54; 87-94]. Вначале оставшееся незамеченным, это явление Са2+-зависимого увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий и высокоамплитудного набухания с освобождением факторов, определяющих судьбы клеток, послужило толчком к тысячам работ, в которых изучаются молекулярная структура этой неспецифической поры и механизм(ы) ее открывания [19; 34; 88; 92; 93]. Дальнейшие исследования показали, что накопление ионов Са2+ в матриксе митохондрий является необходимым условием изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий к водорастворимым молекулам, которое приводит к высвобождению из матрикса не только накопленных ионов кальция, но также и всех малых ионов (калия, водорода), приводя к равновесию их концентраций [19; 87; 89; 90; 93]. С помощью электронной микроскопии было обнаружено, что наблюдаемое изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрии сопровождается изменением структуру и морфологии митохондрий. Это явление было названо "Са2+-induced mitochondrial permeability transition (MPT)", а изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрий, которое связано с открыванием поры, получило название "permeability transition роге (РТР)" [19; 87; 89; 90; 93]. В дальнейшем мы будем использовать эту аббревиатуру, без перевода на русский язык, как получившую всеобщее признание. В дальнейшем явление МРТ и открывание поры было обнаружено и в живых клетках, что указывало на новое физиологическое значение транспорта ионов Са2+ в митохондриях [25; 33; 34; 45]. В настоящее время можно с уверенностью сказать, что поддержание низкого уровня внутриклеточного Са2+ имеет существенное значение для нормальной жизнедеятельности клеток. Большое число внутриклеточных процессов зависит от концентрации и динамики свободных ионов кальция [95-98]. В возбудимых клетках изменение концентрации свободных ионов Са2+ в цитозоле обусловлено входом кальция из среды через кальциевые каналы плазматической мембраны, которые открываются в ответ на внешний стимул [95-98]. Наиболее существенную роль во внутриклеточной кальциевой сигнализации в таких клетках играет Са2+-индуцированный выброс Са2+ из ретикулума [99]. В основной массе невозбудимых клеток увеличение концентрации внутриклеточного кальция обусловлено его освобождением из ретикулума. Установлено, что в ответ на связывание лиганда (гормоны, аминокислоты, нуклеотиды и т.п.) с рецептором на плазматической мембране, в ходе сложных и многоступенчатых биохимических реакций происходит высвобождение внутриклеточной сигнальной молекулы инозитол-3-фосфата, который после связывания с соответствующим рецептором на мембране ретикулума, способствует открыванию каналов и высвобождению накопленных ионов Са2+ [95; 96; 100; 101]. В настоящее время установлено, что митохондрии принимают непосредственное участие в Са2+ гомеостазе клетки путем накопления и освобождения ионов Са2+ [96; 101-105]. Непосредственное участие митохондрий в регуляции внутриклеточной концентрации кальция в невозбудимых клетках было продемонстрировано в асцитных клетках карциномы Эрлиха [102; 103]. В ходе многолетних исследований было показано, что открывание митохондриальной МРТ поры является ключевым механизмом в определении судьбы клеток млекопитающих. При помощи этого механизма митохондрии и клетки регулируют свои взаимоотношения посредством ионов Са2+, универсального внутриклеточного мессенджера многих внутриклеточных процессов, таких как программируемая клеточная гибель, гибель клеток при ишемии, окислительном стрессе и многих других процессах [25; 33; 34; 45]. Существенным для понимания роли митохондриального транспорта ионов Са2+ в регуляции динамики Са2+ в цитоплазме является выяснение синхронизующей роли митохондрий. В настоящей работе исследована роль митохондрий в регуляции уровня свободного Са2+ в клетках и впервые представлены экспериментальные доказательства участия энергозависимого митохондриального транспорта ионов Са2+ в определении внутриклеточной динамики свободных ионов Са2+, включая генерацию, распространение и синхронизацию Са2+ волн в цитоплазме.

Таким образом, накопленные на сегодняшний день экспериментальные данные указывают на ведущую роль ионов Са2+ в регуляции главнейших митохондриальных функций, таких как окислительное фосфорилирование, окисление жирных кислот, метаболизм аминокислот, синтез мочевины и освобождение апоптогенных факторов из межмембранного пространства. Особенно большое значение приобретает система митохондриального транспорта ионов Са2+ в регуляции жизни и смерти клеток млекопитающих чрез индукцию неспецифической поры и инициации, так называемого внутреннего пути запуска цепи реакций, ведущих к активации запрограммированной клеточной гибели. Постишемическое повреждение сердечной мышцы является наиболее известным патологическим состоянием, при котором в первую очередь и более всего страдают митохондрии. Нарушения Са2+ метаболизма в митохондриях в ходе ишемии, особенно в период ре-перфузии, сопровождаются активацией (или открыванием) неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий, потерей малых и больших ионов из матрикса, набуханием и разрывом внешней мембраны. В результате этих событий митохондрия превращается из органеллы, которая способствует жизнеобеспечению клеток путем синтеза АТФ и предотвращения инициации апоптозной гибели клеток, во внутриклеточную структуру с диаметрально противоположными свойствами. Митохондрии, после активации Са2+-зависимой неспецифической поры, «превращаются» в центры потребления АТФ, производства губительных кислородных радикалов и факторов, способствующих запуску клеточной гибели. В настоящее время интенсивно исследуется роль митохондрий в апоптозе и участие митохондриальной компоненты в механизмах ишемического повреждения. Эти исследования очень важны для поиска агентов, способных эффективно препятствовать ишемическому повреждению сердечной мышцы. В следующей главе будет рассмотрен один из многих путей химической защиты митохондрий (и сердечной мышцы) от ишемического повреждения.

ГЛАВА 2. МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ДИАЗОКСИДА И

ПИНАЦИДИЛА

Поиск путей химической защиты митохондрий (и сердечной мышцы) от ишемического повреждения привел к обнаружению во внутренней мембране митохондрий АТФ-зависимых К+-селективных каналов, которые регулируют митохондриальный объем и состояния Са2+-зависимой неспецифической поры. Основной функциональной особенностью митохондрий, которая принципиально отличает их от других внутриклеточных органелл, является наличие трансмембранного электрического потенциала на внутренней мембране [9; 24; 5052; 56; 106]. В результате этого объем митохондрий, ограниченный внутренней мембраной, оказывается заряженным отрицательно, что создает благоприятные условия для создания электрического поля, обеспечивающего электрофоретическое однонаправленное накопление катионов в матриксе [9; 28; 54-56; 107; 108]. Ионы калия, составляющие по концентрации основную массу катионов цитоплазмы, являются также и основным катионом митохондриального матрикса [54; 55; 109]. Кроме того, митохондрии это единственные внутриклеточные структуры, имеющие две отдельные мембраны [110-113]. Внешняя мембрана служит механическим и функциональным разделительным барьером между межмембранным пространством и цитоплазмой, а внутренняя мембрана обеспечивает селективный транспорт метаболитов в митохондриальный матрикс без нарушения проницаемости [114-117]. В Главе 1 отмечено, что основной движущей силой окислительного фосфорилирования и транспорта ионов в митохондриях является градиент электрохимического потенциала ионов водорода, который создается при векторном переносе протонов из матрикса в окружающую среду, сопряженном с работой дыхательной цепи и окислением митохондриальных субстратов [24; 50-52; 56; 118; 119]. Такой однонаправленный перенос заряженных ионов из матрикса сопровождается созданием на внутренней мембране митохондрий концентрационного градиента электрохимического потенциала ионов водорода (A|Jh), который состоит из двух компонент: разности электрических потенциалов между внутренней и внешней сторонами внутренней мембраны (АФМ) и градиента ионов водорода (ДрН) на этой же мембране [51; 56]. Таким образом, энергия, запасенная в виде этих двух компонент градиента электрохимического потенциала ионов водорода (A|Jh) на внутренней мембране, которая получила название «протон движущей силы» [9;

50; 51; 56], создается при работе дыхательной цепи митохондрий и является единственной движущей силой транспорта ионов и синтеза АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования [9; 51; 52; 56; 118]. Наличие градиента электрохимического потенциала ионов водорода (Д|Лн) в митохондриях является обязательной и неотъемлемой частью нормально функционирующей митохондрии в клетке. Направление электрического поля (АФМ) этого градиента благоприятствует как транспорту положительно заряженных ионов, в том числе и калия, из цитоплазмы в матрикс митохондрий [9; 49-52; 56; 64; 106; 118], так и выбросу отрицательно заряженных анионов [120-123]. Направление концентрационной компоненты (ДрН) способствует накоплению в матриксе митохондрий жирорастворимых и нейтральных слабых кислот из среды инкубации по градиенту концентрации их протонированных форм [9; 49; 52; 53; 55; 64; 118]. Таким образом, в нормально функционирующих митохондриях, направление электрической компоненты способствует накоплению положительно заряженных частиц (ионы кальция, калия, аммония) и выбросу отрицательно заряженных анионов хлора, субстратов, при наличии во внутренней мембране митохондрий соответствующих проницаемостей. Одновременно в матриксе митохондрий будут накапливаться анионы, перенесенные по градиенту концентрации их нейтральных форм, определяемом компонентой (АрН). Транспорт ионов в митохондрии будет сопровождаться движением осмотической воды и изменением объема матрикса митохондрий, что, в свою очередь, сопровождается изменением метаболического состояния митохондрий [112; 113; 124; 125]. Таким образом, регуляция проницаемости внутренней мембраны митохондрий может служить эффективным механизмом метаболического контроля состояния митохондрий [112; 113; 124]. Сравнительно недавно было показано, что плазматическая мембрана многих клеток (инсулин секретирующих бета клеток, кардиомиоцитов, гепатоцитов, клеток мозга, почек и некоторых других клеток) содержит селективные калиевые каналы, состояние которых регулируется цитоплазматической концентрацией АТФ [126130]. Для этих каналов было показано, что при достаточных концентрациях АТФ, близких к цитоплазматической, они закрываются и демонстрируют низкую проницаемость, а при уменьшении концентрации АТФ открываются и переходят в состояние с высокой проводимостью [131-134]. Вскоре после их открытия была высказана гипотеза о том, что Кдтф каналы плазматической мембраны сердечных клеток могут быть дополнительным источником энергии в пост ишемической сердечной мышце [130; 135; 136]. Предполагалось, что дополнительная калиевая проводимость в плазматической мембране ишемических кардиомиоцитов, будет способствовать поддержанию высокого мембранного потенциала на плазматической мембране за счет выхода ионов калия из цитоплазмы и освобождения энергии, запасенной в градиенте ионов калия. Таким образом, вытекание ионов калия по градиенту концентрации из клеток в среду инкубации через открывшиеся в плазматической мембране Кдтф каналы, будет сопровождаться дополнительной поляризацией плазматической мембраны, которая предотвратит открывание в ней потенциал- зависимых Са2+ каналов [137140]. Предполагалось, что низкий уровень АТФ в клетках в период ишемии будет способствовать открыванию АТФ-зависимых калиевых каналов плазматической мембраны компенсируя таким образом снижение активности АТФ зависимой Na/K помпы, обеспечивающей и поддерживающей потенциал на плазматической мембране клеток [141-145]. В этих условиях, активация и открывание дополнительных калиевых каналов в плазматической мембране и вытекание положительных ионов калия из клеток приведет к восстановлению мембранного потенциала на клеточной мембране, который будет способствовать восстановлению исходной низкой концентрации ионов К+, Na+ и Са2+ в цитозоле клеток [138-140]. Таким образом, роль Кдтф каналов плазматической мембраны в клетках сводиться к поддержанию нормального мембранного потенциала на плазматической мембране за счет использования градиента ионов калия в условиях низкой концентрации доступного АТФ. Подобные условия наблюдаются при многих патологиях, включая ишемические условия. Отсюда понятен интерес исследователей и клиницистов к химическим агентам, которые могут открывать или блокировать АТФ зависимые калиевые каналы плазматической мембраны [132; 138-140; 145]. Эти агенты разной химической структуры имеют общее свойство повышать проводимость АТФ-зависимых калиевых каналов плазматической мембраны в отсутствии АТФ [130; 138; 140; 146; 147]. Однако, многочисленные данные указывали на то, что защитный эффект этих агентов не всегда коррелировал со степенью сокращения потенциала действия [140; 148150]. Это позволило предположить наличие в клетках других мишеней и мест действия этих агентов, отличных от плазматических Кдтф каналов [149-153]. Первые работы, в которых обсуждается возможность наличия АТФ - зависимых калиевых каналов во внутренней мембране митохондрий были опубликованы в 1991 японскими исследователями [154]. Опубликованная в следующем году работа, в которой была использовала реконструкция калиевых каналов из спиртового экстракта митохондрий сердца в бислойную фосфолипидную мембрану, подтвердила наличие АТФ-зависимых калиевых каналов в спиртовом экстракте из митохондрий сердца [152; 153; 155; 156]. Свое дальнейшее развитие эти представления получили в серии работ, посвященных исследованию действия целого рядя различных химических соединений, снижающих ишемическое повреждение сердечной мышцы путем защиты митохондрий [122; 135; 148; 151; 152; 155-164]. Среди многочисленных гипотез защиты митохондрий от ишемического повреждения, предположение о вовлечении АТФ-зависимых К+ каналов (К^атф) и роли активаторов К+атф каналов в противоишемическом защитном действии получило наибольшее распространение [137-139; 162]. Наиболее специфическими среди известных активаторов К+-селективной проницаемости во внутренней мембране митохондрий являются диазоксид и пинацидил, [138; 161; 165]. Было показано, что эти химические агенты способны эффективно препятствовать ишемическому повреждению сердечной мышцы. Однако, изучение действия активаторов Кдтф каналов на митохондриях было ограничено методическими подходами, среди которых самым распространенным долгое время оставалось измерение светопропускания суспензии выделенных митохондрий [121; 122; 135; 151]. Авторами этих работ было обнаружено, что под воздействием целого ряда фармакологических препаратов, которые активируют Кдтф каналы плазматических мембран, наблюдается изменение оптической плотности суспензии митохондрий, характерное для набухания матрикса [121; 122; 135; 151; 157]. Однако, эти наблюдения Гарлида с соавторами об изменении объема митохондрий и развитии набухания под действием диазоксида и/или пинацидила были подвергнуты критике [166-169]. Были высказаны замечания о том, что оптические методы оценки объема митохондрий отражают также и изменение «прозрачности» внутренней мембраны митохондрий, которое может быть вызвано перестройками в ней, и может быть неверно интерпретировано как «набухание» митохондрий, что не вполне корректно [166; 167]. Необходимо отметить, что все эти работы имели описательный характер и основывались исключительно на наблюдениях действия диазоксида, пинацидила или других фармакологических агентов, активирующих плазматические Кдтф каналы, на изменение светопропускания суспензии выделенных митохондрий [135; 152; 153; 155; 156]. Природа и свойства митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов обсуждаются уже более 20 лет, однако до сих пор еще никому не удалось выделить, идентифицировать или очистить составляющие их белки. Несмотря на огромный интерес к этим каналам, исследователям так и не удалось идентифицировать и/или выделить белки/соединения, ответственные за наблюдаемые эффекты диазоксида или пинацидила, и вопрос о существовании этих АТФ-зависимых калиевых каналов в митохондриальной мембране до сих пор остается предметом многочисленных дебатов [125; 166; 167; 170-172]. Ко всеобщему разочарованию, накопление новых данных не только не подтверждает наличие АТФ-зависимых калиевых каналов в мембране митохондрий, но напротив все более и более убеждает исследователей в том, что таких каналов в мембране митохондрий может и не быть, а все наблюдаемые эффекты обусловлены фармакологическими свойствами используемых соединений [166-170].

Таким образом, роль митохондриальной компоненты в механизмах ишемического повреждения и противоишемического защитного действия активаторов плазматических АТФ-зависимых калиевых (Кдтф) каналов до сих пор остается не выясненной. Среди наиболее эффективных противоишемических агентов, оказывающих свое защитное действие на сердечную мышцу через уменьшение повреждения митохондриальных функций, являются диазоксид и пинацидил. Однако, несмотря на огромное количество работ, посвященных экспериментальному исследованию защитного действия диазоксида и пинацидила, механизм их действия на митохондрии до сих пор не известен. В настоящей работе были проанализированы наиболее характерные изменения митохондриальных параметров, которые могут наблюдаться согласно предложенному механизму активации калиевых каналов во внутренней мембране митохондрий. Если предполагаемое действие этих соединений заключается в увеличении К+ проницаемости внутренней мембраны митохондрий, то независимо от природы этой проводимости оба агента будут вызывать одновременно деполяризацию энергизованных митохондрий, активацию дыхания и подавление фосфорилирования добавленной АДФ, в присутствии ионов К+ в среде инкубации. Эти эффекты химической активации калиевых каналов должны быть подобны эффектам, которые наблюдаются в присутствии валиномицина, специфического калиевого ионофора [52; 173; 174]. Все предсказанные последствия действия на митохондрии диазоксида, пинацидила или валиномицина подтверждаются экспериментально только при одном условии - при наличии в среде инкубации ионов калия [165; 170-172]. Подобная гипотеза легко проверяется экспериментально - все эффекты соединений, увеличивающих калиевую проницаемость внутренней мембраны митохондрий, должны исчезнуть при удалении К+ ионов из среды инкубации.

В связи с этим, одной из задач настоящей работы являлось выявление механизма защитного действия противоишемических фармакологических агентов, таких как диазоксид и пинацидил, известных как фармакологические активаторы АТФ-зависимых К+ каналов (Катф) плазматической мембраны. Наши предварительные исследования показали, что удаление ионов калия из среды инкубации полностью предотвращает эффект валиномицина, но не диазоксида и пинацидила [165; 170-172], указывая на то, что действие диазоксида и пинацидила могут иметь другой механизм. Основываясь на гипотезе Митчелла можно предположить, что изменение митохондриальных функций под действием диазоксида и/или пинацидила могут быть также следствием транспорта любых положительно заряженных ионов (например, ионов водорода). В серии целенаправленных экспериментов мы получили неопровержимые данные о том, что диазоксид и пинацидил обладают выраженными протонофорными свойствами. На основании полученных данных, мы предложили альтернативный механизм действия этих соединений на митохондрии, который заключается в том, что оба агента оказывают защитное действие, которое обусловлено их протонофорными свойствами. Мы предположили, что они действуют как слабые протонофоры и оказывают действие схожее с тем, которое оказывает 2,4-динитрофенол, классический разобщитель митохондрий, и защитное действие диазоксида и пинацидила обусловлено их способностью к умеренному разобщению митохондрий. В связи с этим, одной из задач настоящей работы являлась демонстрация необходимости «умеренной» деполяризации митохондрий в пост-ишемическом периоде для восстановления механической активности сердечной мышцы. Кроме того, важно было исследовать влияние этих соединений на транспорт кальция как в изолированных митохондриях, так и в митохондриях внутри интактных клеток, а на ишемической модели изолированного сердца крысы определить роль митохондриального транспорта Са2+ в механизме пост-ишемического повреждения сердечной мышцы.

ГЛАВА 3. РОЛЬ ПОРИНОВЫХ КАНАЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ

Митохондриальный метаболизм требует непрерывного обмена субстратами между цитоплазмой и митохондриальным матриксом. Для нормального обмена эти метаболиты должны пересечь две митохондриальные мембраны. Транспорт метаболитов через внутреннюю мембрану осуществляется множеством специфических транспортных белков и достаточно хорошо изучен. Основная масса митохондриальных субстратов попадает в митохондриальный матрикс при помощи специализированных переносчиков-транспортеров, локализованных во внутренней мембране митохондрий [9; 17; 48; 55; 114; 175]. К их числу относятся гидрофильные молекулы субстратов окислительного фосфорилирования (пируват, оксалоацетат, малат, сукцинат, АТФ, АДФ, неорганический фосфат), субстраты цикла мочевины, реакций синтеза и обмена метильных групп, а также ферменты, локализованные в матриксе митохондрий. Все субстраты, необходимые для синтеза митохондриальных белков, которые кодируются митохондриальной ДНК, также поступают из цитоплазмы в митохондрии с помощью переносчиков [176-182]. Все эти реакции переноса являются энергозависимыми, так как осуществляются против градиента концентраций митохондриальных метаболитов, и, следовательно, для их поддержания требуется энергия. Роль такого универсального источника энергии в митохондриях выполняет градиент электрохимического потенциала ионов водорода, который, как уже упоминалось выше, имеет две составляющие -электрическую АФМ и концентрационную АрН [9; 53; 56; 118]. Если транспорт заряженных частиц и ионов использует энергию электрического поля, то градиент концентрации ионов водорода на внутренней мембране используется для поддержания реакций обмена, сопряженных с противоположным переносом ионов водорода и заряженной частицы [9; 56; 114; 118]. С другой стороны, все эти водорастворимые митохондриальные субстраты, прежде чем достигнуть переносчиков, локализованных- во внутренней мембране митохондрий, должны каким-то образом пересечь внешнюю митохондриальную мембрану и попасть в пространство между двумя мембранами, откуда переносчики смогут их транспортировать в матрикс митохондрий. До недавнего времени считалось, что внешняя мембрана митохондрий служит своего рода механической оболочкой, призванной поддерживать складчатую структуру митохондриальных крист и противостоять их неограниченному осмотическому набуханию [110; 111; 125; 183].

Однако, исследования последних лет выявили наличие во внешней мембране митохондрий белков, способных образовывать каналы при реконструкции их в искусственные фосфолипидные мембраны [184-190]. В самых первых работах эти белки получили название поринов, но позже, когда были продемонстрированы характеристики и свойства этих каналов, их стали называть потенциал зависимыми анионными каналами (voltage dependent anion channels, VDAC) [191-196]. Было установлено, что белки порины внешней митохондриальной мембраны формируют водяные поры диаметром приблизительно 3 nm, которые позволяют прохождить водорастворимым молекулам размером до 5 kDa [185-189; 191; 192]. Таким образом, после открытия пориновых каналов ранние представления о том, что внешняя мембрана митохондрий свободно проницаема для малых ионов, подверглись значительной переработке. Более того, было высказано предположение о том, что для слаженной работы митохондриального и клеточного метаболизмов необходима тонкая регуляция обмена метаболитами между митохондриями и цитоплазмой, а эти каналы являются тем механизмом, который обеспечивает эту регуляцию [184; 185; 188; 189]. В связи с этим, в настоящее время ведутся интенсивные исследования эндогенных механизмов регуляции проницаемости пориновых каналов и внешней мембраны митохондрий внутри интактных клеток. Результаты последних работ продемонстрировали, что в некоторых условиях проницаемость внешней мембраны митохондрий уменьшается, что свидетельствует о закрывании пориновых каналов и блокировании обмена метаболитов внутри неповрежденных клеток [185; 186; 188; 189; 197; 198]. Было высказано предположение, что в самом начале развития апоптоза эти каналы закрываются, и митохондрии в этих условиях не в состоянии эффективно фосфорилировать АДФ и поставлять АТФ для нужд клетки из-за нарушения переноса этих метаболитов и дыхательных субстратов через закрытые пориновые каналы [197-201]. Можно предположить, что закрывание пориновых каналов будет приводить к блокированию и других биохимических процессов, протекающих исключительно в митохондриях и нуждающихся в участии ферментных систем, локализованных в матриксе митохондрий, таких как синтез мочевины [202] и производство метильных групп в митохондриях, через трансметилирование глицина в системе его расщепления [203; 204]. Таким образом, каналы во внешней мембране митохондрий, образованные пориновыми белками, выполняют существенную роль в поддержании нормального обмена метаболитов между цитоплазмой и митохондриями. Любые нарушения этого обмена приведут к существенным нарушениям метаболизма клеток, особенно в тех процессах, которые невозможны без участия митохондрий, катализирующих синтез мочевины, обмен метильных групп и синтез АТФ. Закрывание пориновых каналов в гепатоцитах, приводящее к блокированию свободного обмена между цитоплазмой и митохондриальным матриксом АТФ, цитруллина и орнитина, субстратов синтеза мочевины, приведет и к нарушению производства мочевины.

Окисление этанола в печени приводит к значительным биохимическим изменениям, которые включают подавление синтеза АТФ, нарушение окисления длинноцепочечных жирных кислот, увеличенное образование кислородных радикалов и перекисное окисление липидов [4; 37; 201; 205; 206]. Кроме того этанол вызывает в печени гиперметаболическую реакцию, которая характеризуется стремительным увеличением метаболизма спирта, почти удвоением митохондриального дыхания и разобщением окислительного фосфорилирования [207; 208]. Нарушение митохондриальных функций в печени является самым первым проявлением острой алкогольной интоксикации. В настоящее время накапливается все больше данных о том, что гепатотоксичность этанола в первую очередь обусловлена потерей митохондриальных функций, приводящей к значительным нарушениям во всем клеточном метаболизме [202; 209]. Проницаемость внешней митохондриальной мембраны может меняться при развитии патологических состояний, в том числе и при алкогольной интоксикации, и это может быть связано с изменением проводимости пориновых каналов. Однако, роль пориновых каналов в индукции и развитии алкогольной интоксикации до сих пор остается не выясненной. Мы предположили, что нарушение митохондриального метаболизма в гепатоцитах, окисляющих этанол, обусловлено уменьшением потоков метаболитов через внешнюю мембрану митохондрий из-за закрытия пориновых каналов [170; 201]. В связи с этим в настоящей работе для проверки нашей гипотезы о том, что причиной глобальной потери митохондриальных функций при отравлении печени алкоголем, является закрывание пориновых каналов во внешней митохондриальной мембране, предполагается исследовать, как закрывание пориновых каналов внешней мембраны митохондрий влияет на основные функции митохондрий и на функции целых клеток печени, окисляющих этанол, таких как синтез мочевины, производство и обмен метильных групп. Для решения этой задачи необходимо было разработать подходы и методы экспериментального измерения проницаемости пориновых каналов во внешней мембране митохондрий внутри интактных клеток без их выделения из гепатоцитов. Для выяснения механизма алкогольной интоксикации и роли в ней пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны, необходимо определить какие из продуктов окисления этанола (NADH, кислородные радикалы, ацетальдегид и/или ацетат) способствуют закрыванию митохондриальных пориновых каналов. Кроме того, для выяснения механизма повреждающего действия закрытых пориновых каналов на функции митохондрий необходимо исследовать влияние закрытия пориновых каналов и уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий на Са2+-индуцированное открывание неспецифической поры и высокоамплитудного набухания митохондрий. Эти исследования позволят понять не только влияние окисления этанола на основные функции митохондрий, но и выявить роль пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны в регуляции внутриклеточных процессов жизнедеятельности гепатоцитов, таких как синтез и обмен метильных групп. Очевидно, что знание биохимических механизмов, приводящих к нарушению функций печени, позволит разработать и найти фармакологический препарат-антидот, которой сможет препятствовать закрыванию пориновых каналов, или даже открывать закрытые каналы, способствуя, таким образом, восстановлению нормального функционирования митохондрий в печени алкоголиков. Таким образом, изучение свойств пориновых каналов в контексте их вовлеченности в процессы алкогольной интоксикации, и создание платформы для поиска лекарственных препаратов для лечения заболеваний печени, связанных с алкогольным отравлением, представляется крайне актуальной задачей. Блокирование пориновых каналов, может способствовать также увеличению окислительного стресса и повреждающего действия ионов Са2+ на митохондрии. Разработка фармакологических препаратов, прицельно направленных на закрывание пориновых каналов в митохондриях, является принципиально новым подходом, основанным на оригинальной концепции о том, что закрывание пориновых каналов в митохондриях клеток млекопитающих повышает чувствительность клеток к фармакологическим препаратам. В связи с этим, в настоящей работе также ставиться задача выяснения влияние закрывания пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны на цитотоксичность лекарственных препаратов на примере адафостина, известного противоопухолевого агента. Полученные в настоящей работе данные, открывают путь для принципиально нового подхода к повышению эффективности фармакологического действия противоопухолевых лекарственных препаратов путем их совместного использования с веществами, которые закрывают пориновые каналы во внешней мембране митохондрий. Такой оригинальный подход будет стимулировать разработку и поиск новых более эффективных протоколов лечения, основанных на одновременном использовании блокаторов пориновых каналов в качестве стимулирующих адъювантов, с известными противоопухолевыми агентами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Детальное описание методик и протоколов опубликовано в оригинальных работах автора. Здесь приведено только их краткое описание)

Получение препарата изолированных митохондрий. Во всех экспериментах препараты интактных митохондрий были получены из тканей сердца и/или печени анестезированных пентобарбиталом (50-75 мг/кг живого веса) крыс Sprague-Dawley, стандартными методами дифференциального центрифугирования как это было описано раннее [78; 80; 171; 172; 210].

Измерение характеристик изолированных митохондрий. Митохондриальные ионные потоки и скорость поглощения кислорода регистрировали с помощью Са2+-, К+-, Н+-, ТРР+- ионоселективных электродов и кислородного датчика закрытого типа [78; 80; 171; 172; 210-212]. Одновременное измерение концентрации жизненно важных ионов и кислорода проводилось на многоканальной установке с компьютерной регистрацией и обработкой экспериментальных данных, с помощью разработанной нами программы Bioquest [104; 213; 214].

Измерение переноса меченых протонов (3Н) через гидрофобную среду. Для определения потока ионов 3Н+ через гидрофобную фазу мы использовали классическую ячейку Прессмана [62; 63; 215], наполненную хлороформом, в котором растворялись исследуемые соединения (диазоксид, пинацидил и/или 2,4-динитрофенол) в концентрациях, указанных в подписи к рисункам. В параллельных экспериментах мы также оценивали перенос протонов через бислойную фосфолипидную мембрану по величине разности электрических потенциалов, возникающих на «черной» мембране, разделяющей два отсека с заданными концентрациями ионов водорода [170].

Характеристики ишемического повреждения сердечной мышцы изучали, используя ретроградную перфузию выделенного сердца крысы по методике Лангендорфа [170; 216]. Степень ишемического повреждения ткани сердца определяли с помощью флуоресцентной микроскопии тонких серийных срезов по проникновению флуоресцентной краски (йодистого пропидия) через плазматическую мембрану. Функциональные характеристики ишемического сердца определяли по изменению систолического и диастолического давлений до и после ишемии, которые измерялись с помощью наполненного водой баллончика, вставленного в левое предсердие, как было описано раннее [170; 217; 218].

Культивирование клеток. Первичная культура неонатальных кардиомиоцитов была получена путем коллагеназной обработки мелко-нарезанных кусочков сердца новорожденных крысят [172; 218]. Первичная культура гепатоцитов была получена из печени взрослых крыс (Sprague-Dawley, 250-300 г) после ферментативной обработки перфузируемой печени, так как описано [199; 201; 219]. Для получения оптического изображения клеток с помощью традиционной или конфокальной микроскопии, клетки выращивались соответственно на отдельных предметных стеклах или в чашках Петри со стеклянным дном, покрытым коллагеном из хвоста крысы для получения оптического изображения клеток в инвертированном микроскопе [172; 199; 219].

Пермеабилизация» плазматической мембраны выделенных гепатоцитов. Для получения доступа к митохондриям внутри интактных клеток, выделенные и/или культивированные на стекле клетки печени обрабатывались детергентом дигитонином или бактериальным белком стрептолизином О, которые образуют поры в биологических мембранах, содержащих холестерол [220; 221]. В отдельных случаях, когда использование химических агентов было не желательно, исследования внутриклеточного распределения флуоресцентных молекул декстрана проводились на клетках, мембрана которых разрушалась механически с помощью микроманипулятора со стеклянной микропипеткой, укрепленного на столике конфокального микроскопа [199; 201].

Измерение ферментативных активностей. Активности цитоплазматических ферментов: лактат- (ЛДГ), алкоголь- (АПД), альдегид-(АЦЛД) дегидрогеназы, NADH-оксидоредуктазы, а также аденилат киназы (АК), гексокиназы (ГК), ксантиноксидазы, пероксидазы и каспазы-3, определяли с помощью флуоресцентных или люминесцентных методов, используя стандартные флуоресцентные или люминесцентные киты, купленные в Sigma Chemicals (St.

Lois, МО). Экспериментальные детали этих биохимических протоколов приведены в работах автора [171; 172; 199; 201; 218; 222; 223].

Измерение проницаемости внешней мембраны митохондрий. Из-за отсутствия адекватных методов измерения проницаемости внешней митохондриальной мембраны нами были разработаны оригинальные методы для оценки проницаемости внешней мембраны митохондрий и состояния пориновых каналов. Во-первых, была оценена активность митохондриальной аденилат киназы (АК), которая определялась в присутствии карбоксиатрактилозида и олигомицина, селективных ингибиторов митохондриальной АТФ синтетазы, как в интакгных, так и в пермеабилизованных клетках печени [199; 201]. Были оценены также скорости АДФ - или ДНФ - стимулированного дыхания митохондрий, которые определялись с помощью закрытого кислородного электрода в присутствии аденозин пентафосфата, специфического ингибитора АК [171; 172; 218]. Кроме того нами был разработан флуоресцентный метод определения проницаемости внешней мембраны митохондрий по входу в межмембранное пространство флуоресцентной метки размером 3000 Да. Для этого был использован декстран, соответствующего молекулярного веса, ковалентно связанный с флуоресцентным красителем, так как это было описано раннее [199; 201]. Внутриклеточное распределение флуоресцентных зондов регистрировалось с помощью конфокального флуоресцентного лазерного сканирующего микроскопа (Carl Zeiss LSM 510) [199; 201].

Статистический анализ. Полученные экспериментальные данные анализировались по методу Стьюдента, а также с помощью анализа переменных (ANOVA). Данные на всех экспериментальных зависимостях выражены как среднее ± средняя ошибка, достоверность измерения (р), а также число повторов. В настоящей работе представлены только результаты экспериментов, попавших в доверительный интервал 95% (р<0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Холмухамедов, Эхсон Лукманович

выводы

1. Состояние Са2+-зависимой неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий определяется количеством ионов Са2+, накопленных в матриксе. Малые количества Са2+ не способны открыть пору, а большие количества Са2+ индуцируют состояние с постоянно-открытой порой. В большом диапазоне промежуточных концентраций ионов Са2+ наблюдаются колебания между открытым и закрытым состояниями этой поры. Митохондрии способны к автокаталитическому увеличению концентрации Са2+ в суспензии митохондрий за счет высвобождения ионов Са2+ из матрикса, демонстрируя «митохондриальный Са2+-индуцированный выброс Са2+». Это свойство выделенных митохондрий лежит в основе нового явления - возникновения и распространения, самоподдерживающихся Са2+ волн в пространственно распределенной суспензии изолированных и энергизованных митохондрий.

2. Разработана математическая модель энергозависимого ионного транспорта в митохондриях, в основе которой лежит обратимое Са2+-зависимое изменение проницаемости внутренней мембраны и «митохондриальный Са2+-индуцированный выброс Са2+». Модель находится в хорошем соответствии с имеющимися экспериментальными данными и описывает все экспериментально наблюдаемые режимы транспорта ионов в митохондриях, включая колебания концентрации К+, Н+ и Са2+, а также изменения объема и мембранного потенциала.

3. В невозбудимых живых клетках «митохондриальный Са2+-индуцированный выброс Са2+ из митохондрий» приводит к тому, что энергозависимый митохондриальный транспорт Са2+ оказывается основным внутриклеточным процессом, определяющим синхронизацию, высокую амплитуду и скорость распространения Са2+ сигналов/волн в цитоплазме. Таким образом, энергозависимый транспорт Са2+ в митохондриях регулирует не только динамику изменения концентрации свободных ионов Са2+ в цитоплазме клеток, но также определяет синхронизацию концентрационных Са2+ волн в цитоплазме клеток и состояние митохондриального метаболизма.

4. Ишемическое повреждение сердечной мышцы проявляется в повреждении митохондриальных функций, и действие противоишемических фармакологических препаратов направлено на защиту митохондрий. Мы впервые показали, что диазоксид и пинацидил, известные противоишемические агенты, обладают выраженными протонофорными свойствами, и эта их особенность лежит в основе их защитного действия. Вывод о том, что «умеренное разобщение» обладает противоишемическим действием, подтверждается впервые полученными нами экспериментальными доказательствами того, что 2,4-динитрофенол, классический митохондриальный разобщитель протонного типа, также как диазоксид и пинацидил, значительно уменьшал ишемическое повреждение миокарда.

5. Токсическое действие этанола в печени вызывает глобальную потерю митохондриальных функций. Впервые показано, что это обусловлено закрытием пориновых каналов во внешней мембране митохондрий. Окисление этанола и сопутствующее увеличение производства NADH, одновременно с закрытием пориновых каналов, увеличением мембранного потенциала митохондрий и возрастанием окислительного стресса, сопровождаются увеличением повреждающего действия ионов Са2+ и потерей основных митохондриальных функций.

6. Разработанные в настоящей работе новые методы определения проницаемости внешней мембраны внутриклеточных митохондрий с помощью конфокальной микроскопии, позволили произвести количественную оценку степени закрывания пориновых каналов при окислении этанола. Из продуктов окисления этанола (NADH, кислородные радикалы, ацетат и ацетальдегид) ни один не обладал выраженным ингибирующим действием на проводимость пориновых каналов, указывая, таким образом, на то, что окисление этанола активирует независимый эндогенный механизм регуляции проницаемости пориновых каналов.

7. Окисление этанола в культуре гепатоцитов сопровождается подавлением синтеза мочевины и снижением скорости потребления кислорода. Ингибирующий эффект этанола частично восстанавливается при подавлении активности алкоголь и ацетальдегид дегидрогеназы, указывая на то, что метаболизм этанола необходим для проявления ингибирующего действия.

8. Механизм повреждающего действия закрытых пориновых каналов заключается в повышении уровня супероксид радикалов в митохондриях вследствие уменьшения выхода супероксид радикалов из межмембранного пространства митохондрий с закрытыми пориновыми каналами. Таким образом, закрывание пориновых каналов приводит к увеличению окислительного стресса, что повышает чувствительность митохондрий к повреждающему действию ионов Са2+.

9. Обнаруженное в настоящей работе увеличение окислительного стресса, приводящее к повышению чувствительности митохондрий и повреждающему действию ионов Са2+ при закрывании пориновых каналов, было использовано как способ повышения эффективности действия цитотоксических препаратов. Продемонстрировано, что обработка клеток млекопитающих ингибиторами пориновых каналов, а также при генетическом удалении этих каналов, снижает эффективную токсическую дозу адафостина, известного противоопухолевого препарата, в десятки раз. В настоящее время проводится дальнейшее исследование эндогенных механизмов регуляции пориновых каналов митохондрий.

Заключение

1. Закрывание пориновых каналов, которое препятствует свободной диффузии супероксид анионов из межмембранного пространства и сопровождается накоплением этих радикалов в митохондриях, приводит к окислительному стрессу и повреждению митохондрий.

2. Генетическое удаление одного из пориновых белков, Порин-1, увеличивает чувствительность фибробластов к противоопухолевым препаратам через акгвацию апотозной гибели.

3. Цитотоксичность адафостина, противоопухолевого лекарственного препарата с митохондриальным механизмом действия, увеличивается в десятки раз в нокаутных по порину фибробластах, свидетельствуя о том, что отсутствие или ингибирование пориновых каналов во внешней митохондриальной мембране усиливает противоопухолевую эффективность лекарственных препаратов.

Таким образом, закрывание пориновых каналов во внешней мембране митохондрий, препятствует выходу супероксид аниона, сопровождается увеличением его концентрации в митохондриях и вызывает в них окислительный стресс, что приводит к увеличению чувствительности клеток к лекарственным препартам с митохондриальным механизмом действия.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Холмухамедов, Эхсон Лукманович, Пущино

1. S.K. Bandyopadhyay, and A. Dutta, Mitochondrial hepatopathies. J Assoc

2. Physicians India 53 (2005) 973-8.

3. A. Cahill, C.C. Cunningham, M. Adachi, H. Ishii, S.M. Bailey, B. Fromenty, and A.

4. Davies, Effects of alcohol and oxidative stress on liver pathology: the role of the mitochondrion. Alcohol Clin Exp.Res 26 (2002) 907-915.

5. M. Christophe, and S. Nicolas, Mitochondria: a target for neuroprotectiveinterventions in cerebral ischemia-reperfusion. Curr Pharm Des 12 (2006) 73957.

6. C.C. Cunningham, and S.M. Bailey, Ethanol consumption and liver mitochondriafunction. Biol.Signals Recept. 10 (2001) 271-282.

7. L.F. Di, and P. Bernardi, Mitochondrial function and myocardial aging. A criticalanalysis of the role of permeability transition. Cardiovasc Res 66 (2005) 222-232.

8. L.F. Di, M. Canton, R. Menabo, G. Dodoni, and P. Bernardi, Mitochondria andreperfusion injury. The role of permeability transition. Basic Res Cardiol. 982003) 235-241.

9. L.F. Di, M. Canton, R. Menabo, N. Kaludercic, and P. Bernardi, Mitochondria andcardioprotection. Heart Fail.Rev. 12 (2007) 249-260.

10. M. Saraste, Oxidative phosphorylation at the fin de siecle. Science 283 (1999) 14881493.

11. V.P. Skulachev, Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmeddeath of organelles, cells and organisms. Mol Aspects Med 20 (1999) 139-84.

12. H.H. Szeto, Mitochondria-targeted cytoprotective peptides for ischemia-reperfusioninjury. Antioxid Redox Signal 10 (2008) 601-19.

13. A. Szewczyk, and L. Wojtczak, Mitochondria as a pharmacological target.

14. Pharmacol Rev 54 (2002) 101-27.

15. D.C. Wallace, A mitochondrial paradigm for degenerative diseases and ageing.

16. Novartis Found Symp 235 (2001) 247-63; discussion 263-6.

17. M. Huttemann, I. Lee, A. Pecinova, P. Pecina, K. Przyklenk, and J.W. Doan,

18. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr (2008).

19. E.J. Lesnefsky, S. Moghaddas, B. Tandler, J. Kerner, and C.L. Hoppel,

20. Mitochondrial dysfunction in cardiac disease: ischemia-reperfusion, aging, and heart failure. J Mol Cell Cardiol 33 (2001) 1065-89.

21. D.B. Zorov, Mitochondrial damage as a source of diseases and aging: a strategy ofhow to fight these. Biochim Biophys Acta 1275 (1996) 10-5.

22. M.R. Duchen, Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes 53 Suppl 12004) S96-102.

23. M.R. Duchen, Mitochondria in health and disease: perspectives on a newmitochondrial biology. Mol Aspects Med 25 (2004) 365-451.

24. D.G. Nicholls, Mitochondria and calcium signaling. Cell Calcium 38 (2005) 311-7.

25. P. Bernardi, and M. Forte, The mitochondrial permeability transition pore.

26. Novartis.Found.Symp. 287 (2007) 157-164.

27. R.M. Denton, and J.G. McCormack, On the role of the calcium transport cycle inheart and other mammalian mitochondria. FEBS Lett 119 (1980) 1-8.

28. R.M. Denton, and J.G. McCormack, The role of calcium in the regulation ofmitochondrial metabolism. Biochem Soc Trans 8 (1980) 266-8.

29. M.P. Mattson, Mechanism of neuronal degeneration and preventative approaches:quickening the pace of AD research. Neurobiol Aging 15 Suppl 2 (1994) S121-5.

30. M.P. Mattson, Calcium and neuronal injury in Alzheimer's disease. Contributions ofbeta-amyloid precursor protein mismetabolism, free radicals, and metabolic compromise. Ann N Y Acad Sci 747 (1994) 50-76.

31. D.G. Nicholls, Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to littlegrey cells. Biochim Biophys Acta 1777 (2008) 550-6.

32. P. Bernardi, and A. Rasola, Calcium and cell death: the mitochondrial connection.

33. Subcell.Biochem. 45 (2007) 481-506.

34. G.A. Rutter, Moving Ca2+ from the endoplasmic reticulum to mitochondria: isspatial intimacy enough? Biochem Soc Trans 34 (2006) 351-5.

35. G.A. Rutter, T. Tsuboi, and M.A. Ravier, Ca2+ microdomains and the control ofinsulin secretion. Cell Calcium 40 (2006) 539-551.

36. K.K. Gunter, and Т.Е. Gunter, Transport of calcium by mitochondria. J Bioenerg

37. Biomembr 26 (1994) 471-85.

38. Т.Е. Gunter, L. Buntinas, G.C. Sparagna, and K.K. Gunter, The interaction ofmitochondria with pulses of calcium. Biofactors 8 (1998) 205-7.

39. Т.Е. Gunter, K.K. Gunter, S.S. Sheu, and C.E. Gavin, Mitochondrial calciumtransport: physiological and pathological relevance. Am J Physiol 267 (1994) C313-39.

40. Т.Е. Gunter, and D.R. Pfeiffer, Mechanisms by which mitochondria transportcalcium. Am J Physiol 258 (1990) C755-86.

41. Т.Е. Gunter, D.I. Yule, K.K. Gunter, R.A. Eliseev, and J.D. Salter, Calcium andmitochondria. FEBS Lett 567 (2004) 96-102.

42. J.G. McCormack, R.L. Daniel, N.J. Osbaldeston, G.A. Rutter, and R.M. Denton,

43. Mitochondrial Ca2+ transport and the role of matrix Ca2+ in mammalian tissues. Biochem.Soc.Trans. 20 (1992) 153-159.

44. J.G. McCormack, and R.M. Denton, Mitochondrial Ca2+ transport and the role ofintramitochondrial Ca2+ in the regulation of energy metabolism. Dev.Neurosci. 15 (1993) 165-173.

45. G. Hajnoczky, G. Csordas, S. Das, C. Garcia-Perez, M. Saotome, R.S. Sinha, and

46. M. Yi, Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium 40 (2006) 553560.

47. N.E. Saris, and E. Carafoli, A historical review of cellular calcium handling, withemphasis on mitochondria. Biochemistry (Mosc) 70 (2005) 187-94.

48. S.M. Bailey, and C.C. Cunningham, Contribution of mitochondria to oxidative stressassociated with alcoholic liver disease. Free Radic Biol Med 32 (2002) 11-6.

49. D.B. Zorov, N.K. Isaev, E.Y. Plotnikov, L.D. Zorova, E.V. Stelmashook, A.K.

50. Vasileva, A.A. Arkhangelskaya, and T.G. Khrjapenkova, The mitochondrion as janus bifrons. Biochemistry (Mosc.) 72 (2007) 1115-1126.

51. D.B. Zorov, M. Juhaszova, and S.J. Sollott, Mitochondrial ROS-induced ROSrelease: an update and review. Biochim.Biophys.Acta 1757 (2006) 509-517.

52. E. Murphy, and C. Steenbergen, Ion transport and energetics during cell death andprotection. Physiology (Bethesda) 23 (2008) 115-23.

53. E. Murphy, and C. Steenbergen, Mechanisms underlying acute protection fromcardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol Rev 88 (2008) 581-609.

54. C. Steenbergen, T.A. Fralix, and E. Murphy, Role of increased cytosolic freecalcium concentration in myocardial ischemic injury. Basic Res Cardiol 88 (1993) 456-70.

55. C. Steenbergen, E. Murphy, L. Levy, and R.E. London, Elevation in cytosolic freecalcium concentration early in myocardial ischemia in perfused rat heart. Circ Res 60(1987) 700-7.

56. С. Steenbergen, Е. Murphy, J.A. Watts, and R.E. London, Correlation betweencytosolic free calcium, contracture, ATP, and irreversible ischemic injury in perfused rat heart. Circ Res 66 (1990) 135-46.

57. A. Rasola, and P. Bernardi, The mitochondrial permeability transition pore and itsinvolvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (2007) 815833.

58. E. Carafoli, R.L. Gamble, and A.L. Lehninger, On the maximum stoichiometry ofenergy-linked Ca++ accumulation during electron transport in rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 21 (1965) 215-20.

59. E. Carafoli, S. Weiland, and A.L. Lehninger, Active Accumulation of Sr2+ by Rat1.ver Mitochondria. I. General Features. Biochim Biophys Acta 97 (1965) 88-98.

60. Z. Drahota, E. Carafoli, C.S. Rossi, R.L. Gamble, and A.L. Lehninger, The Steady

61. State Maintenance of Accumulated Ca++ in Rat Liver Mitochondria. J Biol Chem 240 (1965)2712-20.

62. B.B. Алабовский, Кобрин, В.И., Участие митохондрий в регуляции трансмембранных потоков Са2+ в клетках миокарда. Усп. Физиол. Наук 16 (1985) 3-20.

63. P. Mitchell, Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Biol Rev Camb Philos Soc 41 (1966) 445-502.

64. P. Mitchell, and J. Moyle, Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.1. Nature 213 (1967) 137-9.

65. В.П. Скулачев, Механизм окислительного фосфорилирования и основныепринципы биоенергетики. Усп Совр Биол 77 (1974) 125-54.

66. В.П. Скулачев, Энергия, метаболиты, кислород и транспорт электронов вбиологических мембранах. Усп. Совр.Биол. 88 (1979) 163-180.

67. P. Bernardi, Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, andpermeability transition. Physiol Rev. 79 (1999) 1127-1155.

68. J.J. Diwan, Mitochondrial transport of K+ and Mg2+. Biochim Biophys Acta 8951987) 155-65.

69. P. Mitchell, Vectorial chemistry and the molecular mechanics of chemiosmoticcoupling: power transmission by proticity. Biochem Soc Trans 4 (1976) 399-430.

70. S. Chalmers, and D.G. Nicholls, The relationship between free and total calciumconcentrations in the matrix of liver and brain mitochondria. J Biol Chem 278 (2003) 19062-70.

71. D.G. Nicholls, and S. Chalmers, The integration of mitochondrial calcium transportand storage. J Bioenerg Biomembr 36 (2004) 277-81.

72. D.G. Nicholls, S. Vesce, L. Kirk, and S. Chalmers, Interactions betweenmitochondrial bioenergetics and cytoplasmic calcium in cultured cerebellar granule cells. Cell Calcium 34 (2003) 407-24.

73. E.A. Либерман, Топалы, В.П., Цофина, Л.М., Ясайтис, А.А., Скулачев, В.П. ,

74. Ионный транспорт и электрический потенциал митохондриальной мембраны. Биохимия 34 (1969) 1083-1087.

75. B.C. Pressman, Biological applications of ionophores. Annu Rev Biochem 451976) 501-30.

76. B.C. Pressman, and M. Fahim, Pharmacology and toxicology of the monovalentcarboxylic ionophores. Annu Rev Pharmacol Toxicol 22 (1982) 465-90.

77. B.C. Pressman, Induced active transport of ions in mitochondria. Proc Natl Acad

78. Sci U S A 53 (1965) 1076-83.

79. A.E. Шаму, Херрман, T.P., Естественные ионофоры и их роль в транспортеионов через мембраны. Усп. Соврем. Биологии 91 (1981) 350-365.

80. S.N. Graven, Н.А. Lardy, D. Johnson, and A. Rutter, Antibiotics as tools formetabolic studies. V. Effect of nonactin, monactin, dinactin, and trinactin onoxidative phosphorylation and adenosine triphosphatase induction. Biochemistry 5 (1966) 1729-35.

81. S.N. Graven, H.A. Lardy, and A. Rutter, Antibiotics as tools for metabolic studies.

82. VI. Damped oscillatory swelling of mitochondria induced by nonactin, monactin, dinactin, and trinactin. Biochemistry 5 (1966) 1735-42.

83. S.N. Graven, H.A. Lardy, and O.S. Estrada, Antibiotics as tools for metabolicstudies. 8. Effect of nonactin homologs on alkali metal cation transport and rate of respiration in mitochondria. Biochemistry 6 (1967) 365-71.

84. H.A. Lardy, S.N. Graven, and S. Estrada, Specific induction and inhibition of cationand anion transport in mitochondria. Fed Proc 26 (1967) 1355-60.

85. M.G. Mustafa, K. Utsumi, and L. Packer, Damped oscillatory control ofmitochondrial respiration and volume. Biochem Biophys Res Commun 24 (1966) 381-5.

86. L. Packer, R. Utsumi, and M.G. Mustafa, Oscillatory states of mitochondria. 1.

87. Electron and energy transfer pathways. Arch Biochem Biophys 117 (1966) 38193.

88. D.W. Deamer, K. Utsumi, and L. Packer, Oscillatory states of mitochondria. 3.

89. Ultrastructure of trapped conformational states. Arch Biochem Biophys 121 (1967) 641-51.

90. K. Utsumi, and L. Packer, Oscillatory states of mitochondria. II. Factors controllingperiod and amplitude. Arch Biochem Biophys 120 (1967) 404-12.

91. V.D. Gooch, and L. Packer, Adenine nucleotide control of heart mitochondrialoscillations. Biochim Biophys Acta 245 (1971) 17-20.

92. V.D. Gooch, and L. Packer, Oscillatory systems in mitochondria. Biochim Biophys1. Acta 346 (1974) 245-60.

93. V.D. Gooch, and L. Packer, Oscillatory states of mitochondria. Studies on theoscillatory mechanism of liver and heart mitochondria. Arch Biochem Biophys 163 (1974) 759-68.

94. B. Chance, and T. Yoshioka, Sustained oscillations of ionic constituents ofmitochondria. Arch Biochem Biophys 117 (1966) 451-65.

95. Б.А. Ташмухамедов, Гагельганс, A.M., Колебательный характер выхода Н+ измитохондрий в ходе накопления стронция. Биофизика 15 (1970)443-446.

96. Э.Л. Холмухамедов, Зинченко, В.П., Евтодиенко, Ю.В., Автоколебания ионныхпотоков и редокс состояния дыхательной цепи митохондрий Биофизика 25 (1980) 124-128.

97. Y.V. Evtodienko, Sustained oscillations of transmembrane Ca2+ fluxes inmitochondria and their possible biological significance. Membr Cell Biol 14 (2000) 1-17.

98. Э.Л. Холмухамедов, Семенова, Г.А., Зинченко, В.П., Евтодиенко, Ю.В.,

99. Кондрашова, М.Н., Обратимые изменения обьема выделенных митохондрий в ходе колебаний ионных потоков между митохондриями и средой инкубации. Цитология 24 (1982) 1024-1027.

100. М. Marhl, D. Noble, and Е. Roux, Modeling of molecular and cellular mechanismsinvolved in Ca2+ signal encoding in airway myocytes. Cell Biochem Biophys 46 (2006) 285-302.

101. E. Carafoli, R.L. Gamble, and A.L. Lehninger, K+-dependent rebounds andoscillations in respiration-linked movements of CA++ and H+ in rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 21 (1965)488-93.

102. E. Carafoli, R.L. Gamble, and A.L. Lehninger, Rebounds and oscillations inrespiration-linked movements of Ca++ and H+ in rat liver mitochondria. J Biol Chem 241 (1966) 2644-52.

103. Y.V. Evtodienko, V.P. Zinchenko, E.L. Holmuhamedov, A.V. Gylkhandanyan, and

104. A.M. Zhabotinsky, The stoichiometry of ion fluxes during Sr2+-induced oscillations in mitochondria. Biochim Biophys Acta 589 (1980) 157-61.

105. A.V. Gylkhandanyan, Y.V. Evtodienko, A.M. Zhabotinsky, and M.N. Kondrashova,

106. Continuous Sr2+-induced oscillations of the ionic fluxes in mitochondria. FEBS Lett 66 (1976)44-7.

107. G.L. Becker, G. Fiskum, and A.L. Lehninger, Regulation of free Ca2+ by livermitochondria and endoplasmic reticulum. J Biol Chem 255 (1980) 9009-12.

108. R.A. Haworth, and D.R. Hunter, The Ca2+-induced membrane transition inmitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys 1951979) 460-7.

109. R.A. Haworth, and D.R. Hunter, Control of the mitochondrial permeability transitionpore by high-affinity ADP binding at the ADP/ATP translocase in permeabilized mitochondria. J Bioenerg Biomembr 32 (2000) 91-6.

110. D.R. Hunter, and R.A. Haworth, The Ca2+-induced membrane transition inmitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys 195 (1979) 453-9.

111. D.R. Hunter, and R.A. Haworth, The Ca2+-induced membrane transition inmitochondria. III. Transitional Ca2+ release. Arch Biochem Biophys 195 (1979) 468-77.

112. D.R. Hunter, H. Komai, R.A. Haworth, M.D. Jackson, and H.A. Berkoff, Comparisonof Ca2+, Sr2+, and Mn2+ fluxes in mitochondria of the perfused rat heart. Circ Res 47 (1980) 721-7.

113. M. Crompton, The mitochondrial permeability transition pore and its role in celldeath. Biochem J 341 ( Pt 2) (1999) 233-49.

114. M. Crompton, S. Virji, V. Doyle, N. Johnson, and J.M. Ward, The mitochondrialpermeability transition pore. Biochem Soc Symp 66 (1999) 167-79.

115. D.G. Nicholls, and M. Crompton, Mitochondrial calcium transport. FEBS Lett 1111980) 261-8.

116. H.L. Roderick, and S.J. Cook, Ca2+ signalling checkpoints in cancer: remodelling

117. Ca2+ for cancer cell proliferation and survival. Nat Rev Cancer 8 (2008) 361-75.

118. R. Rizzuto, and T. Pozzan, Microdomains of intracellular Ca2+: moleculardeterminants and functional consequences. Physiol Rev 86 (2006) 369-408.

119. G. Szabadkai, and M.R. Duchen, Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.

120. Physiology (Bethesda) 23 (2008) 84-94.

121. A.V. Gordeeva, R.A. Zvyagilskaya, and Y.A. Labas, Cross-talk between reactiveoxygen species and calcium in living cells. Biochemistry (Mosc) 68 (2003) 107780.

122. A. Fabiato, Two kinds of calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmicreticulum of skinned cardiac cells. Adv Exp Med Biol 311 (1992) 245-62.

123. T. Pozzan, R. Rizzuto, P. Volpe, and J. Meldolesi, Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiol Rev 74 (1994) 595-636.

124. R. Rizzuto, M. Brini, M. Murgia, and T. Pozzan, Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science 262(1993) 744-7.

125. F. Ichas, L.S. Jouaville, S.S. Sidash, J.P. Mazat, and E.L. Holmuhamedov, Mitochondrial calcium spiking: a transduction mechanism based on calcium-induced permeability transition involved in cell calcium signalling. FEBS Lett 348 (1994)211-5.

126. F. Ichas, L.S. Jouaville, S.S. Sidash, J.P. Mazat, and E.L. Holmuhamedov, Mitochondrial calcium spiking: The physiological face of permeability transition? . Modern Trends in Bio-Thermo Kinetics 3 (1994) 159-162.

127. L.S. Jouaville, F. Ichas, E.L. Holmuhamedov, P. Camacho, and J.D. Lechleiter, Synchronization of calcium waves by mitochondrial substrates in Xenopus laevis oocytes. Nature 377 (1995) 438-41.

128. R. Rizzuto, A.W. Simpson, M. Brini, and T. Pozzan, Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature 358 (1992) 325-7.

129. V.P. Skulachev, Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Biosci.Rep. 17 (1997) 347-366.

130. J.B. Chappell, and A.R. Crofts, Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of1.olated Liver Mitochondria. Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J 95 (1965) 378-86.

131. A.L. Lehninger, E. Carafoli, and C.S. Rossi, Energy-linked ion movements in mitochondrial systems. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 29 (1967) 259-320.

132. E. Carafoli, C.S. Rossi, and A.L. Lehninger, Cation and Anion Balance During Active Accumulation of Ca++ and Mg++ by Isolated Mitochondria. J Biol Chem 239 (1964) 3055-61.

133. Н.Д. Озернюк, Регуляция митохондриального деления. Усп. Совр. Виол. 86 (1978) 227-239.

134. М. Steinert, The ultrastructure of mitochondria. Proc R Soc Lond В Biol Sci 1731969) 63-70.

135. A.P. Halestrap, The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria invivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. Biochim Biophys Acta 973 (1989) 355-82.

136. A.P. Halestrap, Regulation of mitochondrial metabolism through changes in matrixvolume. Biochem Soc Trans 22 (1994) 522-9.

137. F. Palmieri, F. Bisaccia, L. Capobianco, V. Dolce, G. Fiermonte, V. lacobazzi, C.1.diveri, and L. Palmieri, Mitochondrial metabolite transporters. Biochim Biophys Acta 1275(1996) 127-32.

138. F. Palmieri, G. Prezioso, and E. Quagliariello, Mechanism of action of antibiotics,ion transporters, on the distribution of respiratory substrates between the intra-and extra-mitochondrial compartment. Boll Soc Ital Biol Sper 46 (1970) 121-5.

139. J.D. McGivan, and J.B. Chappell, The transport of metabolites across the mitochondrial membranes. Biochem J 127 (1972) 54P-56P.

140. M.H. Кондрашова, Структурно-кинетическая организация цикла трикарбоновых кислот в активно функционирующих митохондриях. Биофизика 34 (1989) 450-458.

141. V.P. Skulachev, Membrane electricity as a convertible energy currency for the cell.

142. Can J Biochem 58 (1980) 161-75.

143. E.A. Либерман, A.M. Арзуманян, M.A. Владимирова, and Л.М. Цофина, Разность потенциалов на субклеточных мембранах. 1. Химиосмотический и химиоэлектрический механизмы генерации. Биофизика 21 (1976)469-75.

144. A.D. Beavis, and M.F. Powers, On the regulation of the mitochondrial inner membrane anion channel by magnesium and protons. J Biol Chem 264 (1989) 17148-55.

145. A.D. Beavis, and A.E. Vercesi, Anion uniport in plant mitochondria is mediated bya Mg(2+)-insensitive inner membrane anion channel. J Biol Chem 267 (1992) 3079-87.

146. K.D. Garlid, and A.D. Beavis, Evidence for the existence of an inner membrane anion channel in mitochondria. Biochim Biophys Acta 853 (1986) 187-204.

147. K. Terashima, A. Takeuchi, N. Sarai, S. Matsuoka, E.B. Shim, C.H. Leem, and A.

148. Noma, Modelling CI- homeostasis and volume regulation of the cardiac cell. Philos Transact A Math Phys Eng Sci 364 (2006) 1245-65.

149. A.P. Halestrap, Р.Т. Quinlan, D.E. Whipps, and A.E. Armston, Regulation of themitochondrial matrix volume in vivo and in vitro. The role of calcium. Biochem J 236(1986) 779-87.

150. A. Kaasik, D. Safiulina, A. Zharkovsky, and V. Veksler, Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol Cell Physiol 292 (2007) C157-63.

151. L. Aguilar-Bryan, J.P.t. Clement, G. Gonzalez, K. Kunjilwar, A. Babenko, and J.

152. Bryan, Toward understanding the assembly and structure of KATP channels. Physiol Rev 78 (1998) 227-45.

153. L. Aguilar-Bryan, J.P.t. Clement, and D.A. Nelson, Sulfonylurea receptors and ATP-sensitive potassium ion channels. Methods Enzymol 292 (1998) 732-44.

154. S. Misler, and G. Giebisch, ATP-sensitive potassium channels in physiology, pathophysiology, and pharmacology. Curr Opin Nephrol Hypertens 1 (1992) 2133.

155. M. Schwanstecher, C. Schwanstecher, F. Chudziak, U. Panten, J.P.t. Clement, G.

156. Gonzalez, L. Aguilar-Bryan, and J. Bryan, ATP-sensitive potassium channels. Methods Enzymol 294 (1999) 445-58.

157. J.A. Auchampach, G.J. Grover, and G.J. Gross, Blockade of ischaemic preconditioning in dogs by the novel ATP dependent potassium channel antagonist sodium 5-hydroxydecanoate. Cardiovasc Res 26 (1992) 1054-62.

158. A. Jahangir, A. Terzic, and Y. Kurachi, Intracellular acidification and ADP enhancenicorandil induction of ATP sensitive potassium channel current in cardiomyocytes. Cardiovasc Res 28 (1994) 831-5.

159. A. Terzic, A. Jahangir, and Y. Kurachi, Cardiac ATP-sensitive K+ channels: regulation by intracellular nucleotides and K+ channel-opening drugs. Am J Physiol 269 (1995) C525-45.

160. A. Terzic, A. Jahangir, and Y. Kurachi, HOE-234, a second generation K+ channelopener, antagonizes the ATP-dependent gating of cardiac ATP-sensitive K+ channels. J Pharmacol Exp Ther 268 (1994) 818-25.

161. M. Yamada, A. Terzic, I. Findlay, A. Jahangir, W.K. Shen, and Y. Kurachi, YM934,a novel K+ channel opener, activates ATP-sensitive K+ channels in cardiac myocytes. J Pharmacol Exp Ther 267 (1993) 1544-9.

162. E.R. Gross, A.K. Hsu, and G.J. Gross, Delayed cardioprotection afforded by the glycogen synthase kinase 3 inhibitor SB-216763 occurs via a KATP- and MPTP-dependent mechanism at reperfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol 294 (2008) H1497-500.

163. G.J. Gross, and J.A. Auchampach, Role of ATP dependent potassium channels inmyocardial ischaemia. Cardiovasc Res 26 (1992) 1011-6.

164. G.J. Gross, and J.A. Auchampach, Blockade of ATP-sensitive potassium channelsprevents myocardial preconditioning in dogs. Circ Res 70 (1992) 223-33.

165. G.J. Grover, Pharmacology of ATP-sensitive potassium channel (KATP) openersin models of myocardial ischemia and reperfusion. Can J Physiol Pharmacol 75 (1997) 309-15.

166. A.E. Alekseev, P.A. Brady, and A. Terzic, Ligand-insensitive state of cardiac ATPsensitive K+ channels. Basis for channel opening. J Gen Physiol 111 (1998) 38194.

167. A.E. Alekseev, L.A. Gomez, L.A. Aleksandrova, P.A. Brady, and A. Terzic, Opening of cardiac sarcolemmal KATP channels by dinitrophenol separate from metabolic inhibition. J Membr Biol 157 (1997) 203-14.

168. P.A. Brady, A.E. Alekseev, and A. Terzic, Operative condition-dependent response of cardiac ATP-sensitive K+ channels toward sulfonylureas. Circ Res 82 (1998) 272-8.

169. P.A. Brady, S. Zhang, J.R. Lopez, A. Jovanovic, A.E. Alekseev, and A. Terzic, Dual effect of glyburide, an antagonist of KATP channels, on metabolic inhibition-induced Ca2+ loading in cardiomyocytes. Eur J Pharmacol 308 (1996) 343-9.

170. L.V. Zingman, A.E. Alekseev, D.M. Hodgson-Zingman, and A. Terzic, ATP-sensitive potassium channels: metabolic sensing and cardioprotection. J Appl Physiol 103 (2007) 1888-93.

171. J.A. Auchampach, and G.J. Gross, Reduction in myocardial infarct size by thenew potassium channel opener bimakalim. J Cardiovasc Pharmacol 23 (1994) 554-61.

172. J.A. Auchampach, M. Maruyama, I. Cavero, and G.J. Gross, Pharmacological evidence for a role of ATP-dependent potassium channels in myocardial stunning. Circulation 86 (1992) 311-9.

173. G.J. Grover, A.J. D'Alonzo, K.D. Garlid, R. Bajgar, N.J. Lodge, P.G. Sleph, R.B.

174. G.J. Grover, A.J. D'Alonzo, T. Hess, P.G. Sleph, and R.B. Darbenzio, Glyburidereversible cardioprotective effect of BMS-180448 is independent of action potential shortening. Cardiovasc Res 30 (1995) 731-8.

175. G.J. Grover, A.J. D'Alonzo, C.S. Parham, and R.B. Darbenzio, Cardioprotection with the KATP opener cromakalim is not correlated with ischemic myocardial action potential duration. J Cardiovasc Pharmacol 26 (1995) 145-52.

176. K.D. Garlid, P. Paucek, V. Yarov-Yarovoy, X. Sun, and P.A. Schindler, The mitochondrial KATP channel as a receptor for potassium channel openers. J Biol Chem 271 (1996) 8796-9.

177. P. Paucek, G. Mironova, F. Mahdi, A.D. Beavis, G. Woldegiorgis, and K.D. Garlid,

178. Reconstitution and partial purification of the glibenclamide-sensitive, ATP-dependent K+ channel from rat liver and beef heart mitochondria. J Biol Chem 267(1992) 26062-9.

179. I. Inoue, H. Nagase, K. Kishi, and T. Higuti, ATP-sensitive K+ channel in the mitochondrial inner membrane. Nature 352 (1991) 244-7.

180. G.D. Mironova, E.V. Kachaeeva, I.B. Krylova, O.M. Rodionova, M.I. Balina, N.R.

181. Evdokimova, and N.S. Sapronov, Mitochondrial ATP-dependent potassiumchannel. 2. The role of the channel in protection of the heart against ischemia. Vestn Ross Akad Med Nauk (2007) 44-50.

182. E.A. Belyaeva, A. Szewczyk, B. Mikolajek, M.J. Nalecz, and L. Wojtczak, Demonstration of glibenclamide-sensitive K+ fluxes in rat liver mitochondria. Biochem Mol Biol Int 31 (1993)493-500.

183. R. Ferrari, P. Pedersini, M. Bongrazio, G. Gaia, P. Bernocchi, F. Di Lisa, and O. Visioli, Mitochondrial energy production and cation control in myocardial ischaemia and reperfusion. Basic Res Cardiol 88 (1993) 495-512.

184. T. Grimmsmann, and I. Rustenbeck, Direct effects of diazoxide on mitochondria inpancreatic B-cells and on isolated liver mitochondria. Br J Pharmacol 123 (1998) 781-8.

185. H. Ни, T. Sato, J. Seharaseyon, Y. Liu, D.C. Johns, B. O'Rourke, and E. Marban,

186. Pharmacological and histochemical distinctions between molecularly defined sarcolemmal KATP channels and native cardiac mitochondrial KATP channels. Mol Pharmacol 55 (1999) 1000-5.

187. Y. Liu, T. Sato, B. O'Rourke, and E. Marban, Mitochondrial ATP-dependent potassium channels: novel effectors of cardioprotection? Circulation 97 (1998) 2463-9.

188. Y. Liu, T. Sato, J. Seharaseyon, A. Szewczyk, B. O'Rourke, and E. Marban, Mitochondrial ATP-dependent potassium channels. Viable candidate effectors of ischemic preconditioning. Ann N Y Acad Sci 874 (1999) 27-37.

189. C. Ozcan, M. Bienengraeber, P.P. Dzeja, and A. Terzic, Potassium channel openers protect cardiac mitochondria by attenuating oxidant stress at reoxygenation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 282 (2002) H531-9.

190. C. Ozcan, E.L. Holmuhamedov, A. Jahangir, and A. Terzic, Diazoxide protects mitochondria from anoxic injury: implications for myopreservation. J Thorac Cardiovasc Surg 121 (2001)298-306.

191. A.J. Kowaltowski, S. Seetharaman, P. Paucek, and K.D. Garlid, Bioenergetic consequences of opening the ATP-sensitive K(+) channel of heart mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280 (2001) H649-57.

192. M. Das, J.E. Parker, and A.P. Halestrap, Matrix volume measurements challengethe existence of diazoxide/glibencamide-sensitive KATP channels in rat mitochondria. J Physiol 547 (2003) 893-902.

193. P. Bednarczyk, G.D. Barker, and A.P. Halestrap, Determination of the rate of K(+)movement through potassium channels in isolated rat heart and liver mitochondria. Biochim Biophys Acta 1777 (2008) 540-8.

194. A. Varadi, A. Grant, M. McCormack, T. Nicolson, M. Magistri, K.J. Mitchell, A.P.

195. Halestrap, H. Yuan, B. Schwappach, and G.A. Rutter, Intracellular ATP-sensitive K+ channels in mouse pancreatic beta cells: against a role in organelle cation homeostasis. Diabetologia 49 (2006) 1567-77.

196. J. Minners, L. Lacerda, D.M. Yellon, L.H. Opie, C.J. McLeod, and M.N. Sack, Diazoxide-induced respiratory inhibition a putative mitochondrial K(ATP) channel independent mechanism of pharmacological preconditioning. Mol Cell Biochem 294 (2007) 11-8.

197. E.L. Holmuhamedov, A. Jahangir, A. Oberlin, A. Komarov, M. Colombini, and A. Terzic, Potassium channel openers are uncoupling protonophores: implication in cardioprotection. FEBS Lett 568 (2004) 167-70.

198. E.L. Holmuhamedov, S. Jovanovic, P.P. Dzeja, A. Jovanovic, and A. Terzic, Mitochondrial ATP-sensitive K+ channels modulate cardiac mitochondrial function. Am J Physiol 275 (1998) H1567-76.

199. E.L. Holmuhamedov, L. Wang, and A. Terzic, ATP-sensitive K+ channel openersprevent Ca2+ overload in rat cardiac mitochondria. J Physiol 519 Pt 2 (1999) 347-60.

200. G.F. Azzone, and S. Massari, Active transport and binding in mitochondria. Biochim Biophys Acta 301 (1973) 195-226.

201. H. Tedeschi, Old and new data, new issues: the mitochondrial DeltaPsi. Biochim

202. Biophys Acta 1709 (2005) 195-202.

203. C.S. Rossi, E. Carafoli, and A.L. Lehninger, Active ion transport by mitochondria.

204. Protoplasma 63 (1967) 90-4.

205. D. Mokranjac, and W. Neupert, Protein import into isolated mitochondria. Methods

206. Mol Biol 372 (2007) 277-86.

207. D. Mokranjac, and W. Neupert, Thirty years of protein translocation into mitochondria: Unexpectedly complex and still puzzling. Biochim Biophys Acta (2008).

208. J. Satrustegui, B. Pardo, and A. Del Arco, Mitochondrial transporters as novel targets for intracellular calcium signaling. Physiol Rev 87 (2007) 29-67.

209. S. Cavero, A. Vozza, A. del Arco, L. Palmieri, A. Villa, E. Blanco, M.J. Runswick,

210. J.E. Walker, S. Cerdan, F. Palmieri, and J. Satrustegui, Identification and metabolic role of the mitochondrial aspartate-glutamate transporter in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol 50 (2003) 1257-69.

211. V. Dolce, G. Fiermonte, M.J. Runswick, F. Palmieri, and J.E. Walker, The humanmitochondrial deoxynucleotide carrier and its role in the toxicity of nucleoside antivirals. Proc Natl Acad Sci U S A 98 (2001) 2284-8.

212. G. Fiermonte, V. Dolce, L. Palmieri, M. Ventura, M.J. Runswick, F. Palmieri, and

213. J.E. Walker, Identification of the human mitochondrial oxodicarboxylate carrier. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, tissue distribution, and chromosomal location. J Biol Chem 276 (2001) 8225-30.

214. L. Palmieri, M.J. Runswick, G. Fiermonte, J.E. Walker, and F. Palmieri, Yeast mitochondrial carriers: bacterial expression, biochemical identification and metabolic significance. J Bioenerg Biomembr 32 (2000) 67-77.

215. В.Ю. Поляков, Сухомлинова, М.Ю., Фаис, Д., Слияние, фрагментация и деление митохондрий. Биохимия 68 (2003) 838-849.

216. М. Colombini, Regulation of the mitochondrial outer membrane channel, VDAC. J

217. Bioenerg Biomembr 19 (1987) 309-20.

218. M. Colombini, VDAC: the channel at the interface between mitochondria and thecytosol. Mol Cell Biochem 256-257 (2004) 107-15.

219. M. Colombini, Measurement of VDAC permeability in intact mitochondria and inreconstituted systems. Methods Cell Biol 80 (2007) 241-60.

220. M. Colombini, E. Blachly-Dyson, and M. Forte, VDAC, a channel in the outer mitochondrial membrane. Ion Channels 4 (1996) 169-202.

221. V. Shoshan-Barmatz, and D. Gincel, The voltage-dependent anion channel: characterization, modulation, and role in mitochondrial function in cell life and death. Cell Biochem Biophys 39 (2003) 279-92.

222. V. Shoshan-Barmatz, A. Israelson, D. Brdiczka, and S.S. Sheu, The voltage-dependent anion channel (VDAC): function in intracellular signalling, cell life and cell death. Curr Pharm Des 12 (2006) 2249-70.

223. M. Forte, and P. Bernardi, Genetic dissection of the permeability transition pore. J

224. Bioenerg.Biomembr. 37 (2005) 121-128.

225. R. Benz, Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes. CRC Crit Rev1. Biochem 19(1985) 145-90.

226. R. Benz, Biophysical properties of porin pores from mitochondrial outer membraneof eukaryotic cells. Experientia 46 (1990) 131-7.

227. R. Benz, Permeation of hydrophiiic solutes through mitochondrial outer membranes: review on mitochondrial porins. Biochim Biophys Acta 1197 (1994) 167-96.

228. R. Benz, A. Schmid, and M. Dihanich, Pores from mitochondrial outer membranesof yeast and a porin-deficient yeast mutant: a comparison. J Bioenerg Biomembr 21 (1989)439-50.

229. M. Colombini, Purification of VDAC (voltage-dependent anion-selective channel) from rat liver mitochondria. J Membr Biol 74 (1983) 115-21.

230. S.J. Schein, M. Colombini, and A. Finkelstein, Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from Paramecium mitochondria. J Membr Biol 30 (1976) 99-120.

231. M.G. Vander Heiden, N.S. Chandel, X.X. Li, P.T. Schumacker, M. Colombini, and

232. C.B. Thompson, Outer mitochondrial membrane permeability can regulate coupled respiration and cell survival. Proc Natl Acad Sci U S A 97 (2000) 466671.

233. J.J. Lemasters, and E. Holmuhamedov, Voltage-dependent anion channel (VDAC)as mitochondrial governator-thinking outside the box. Biochim Biophys Acta 1762 (2006) 181-90.

234. H. Schwertz, J.M. Carter, M. Abdudureheman, M. Russ, U. Buerke, A. Schlitt, U.

235. Muller-Werdan, R. Prondzinsky, K. Werdan, and M. Buerke, Myocardial ischemia/reperfusion causes VDAC phosphorylation which is reduced by cardioprotection with a p38 MAP kinase inhibitor. Proteomics 7 (2007) 4579-88.

236. E.L. Holmuhamedov, and J.J. Lemasters, Ethanol exposure decreases mitochondrial outer membrane permeability in cultured rat hepatocytes. Arch Biochem Biophys (2008) accepted for publication.

237. S.M. Morris, Jr., Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism. Annu Rev Nutr. 22 (2002) 87-105.

238. G. Kikuchi, and K. Hiraga, The mitochondrial glycine cleavage system. Unique features of the glycine decarboxylation. Mol Cell Biochem 45 (1982) 137-49.

239. G. Kikuchi, Y. Motokawa, T. Yoshida, and K. Hiraga, Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia. Proc Jpn Acad Ser В Phys Biol Sci 84 (2008) 246-63.

240. S.M. Bailey, E.C. Pietsch, and C.C. Cunningham, Ethanol stimulates the production of reactive oxygen species at mitochondrial complexes I and III. Free Radic Biol Med 27 (1999) 891-900.

241. T. Yuki, and R.G. Thurman, Mechanism of the swift increase in alcohol metabolism ("SIAM") in the rat. Adv Exp Med Biol 132 (1980) 689-95.

242. R.G. Thurman, B.U. Bradford, and E. Glassman, The swift increase in alcohol metabolism (SIAM) in four inbred strains of mice. Pharmacol Biochem Behav 18 Suppl 1 (1983) 171-5.

243. R.G. Thurman, I. Cheren, D. Forman, J.A. Ewing, and E. Glassman, Swift increase in alcohol metabolism in humans. Alcohol Clin Exp Res 13 (1989) 5726.

244. S.M. Bailey, G. Robinson, A. Pinner, L. Chamlee, E. Ulasova, M. Pompilius, G.P.

245. Page, D. Chhieng, N. Jhala, A. Landar, K.K. Kharbanda, S. Ballinger, and V. Darley-Usmar, S-adenosylmethionine prevents chronic alcohol-induced mitochondrial dysfunction in the rat liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 291 (2006) G857-67.

246. E.L. Holmuhamedov, С. Ozcan, A. Jahangir, and A. Terzic, Restoration of Ca2+inhibited oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria by mitochondrial Ca2+ unloading. Mol Cell Biochem 220 (2001) 135-40.

247. Ю.В. Евтодиенко, Теплова, В.В., Сидаш, С.С., Войтчак, П., Перераспределение Са2+ ионов в клетках асцитной карциномы Эрлиха под действием дезоксиглюкозы и ингибиторов внутриклеточных Са2+-транспортирующих систем. Биохимия 60 (1995) 1336-1343.

248. Ю.В. Евтодиенко, Теплова, В.В., Биологическиая роль и мехнизмы реализации эффекта Кребтри в быстро пролиферируюьих клетках. Рольионов Са2+. Биохимия 61 (1996) 1995-2004.

249. E.L. Holmuhamedov, J.A. Bacon, and R.G. Ulrich, Nucleotides-induced cytosoliccalcium transient and plasma membrane permeability in Chang human liver cells. Biochem Mol Biol Int 35 (1995) 595-604.

250. E.L. Holmuhamedov, V.V. Teplova, E.A. Chukhlova, Y.V. Evtodienko, and R.G. Ulrich, Strontium excitability of the inner mitochondrial membrane: regenerative strontium-induced strontium release. Biochem Mol Biol Int 36 (1995) 39-49.

251. B.C. Pressman, E.J. Harris, W.S. Jagger, and J.H. Johnson, Antibiotic-mediated transport of alkali ions across lipid barriers. Proc Natl Acad Sci U S A 58 (1967) 1949-56.

252. M. Skrzypiec-Spring, B. Grotthus, A. Szelag, and R. Schulz, Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods 55 (2007) 113-26.

253. P.P. Dzeja, P. Bast, C. Ozcan, A. Valverde, E.L. Holmuhamedov, D.G. Van Wylen, and A. Terzic, Targeting nucleotide-requiring enzymes: implications for diazoxide-induced cardioprotection. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284 (2003) H1048-56.

254. P.P. Dzeja, R. Bortolon, C. Perez-Terzic, E.L. Holmuhamedov, and A. Terzic, Energetic communication between mitochondria and nucleus directed by catalyzed phosphotransfer. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (2002) 10156-61.

255. A.L. Nieminen, T.G. Petrie, J.J. Lemasters, and W.R. Selman, Cyclosporin A delays mitochondrial depolarization induced by N-methyl-D-aspartate in cortical neurons: evidence of the mitochondrial permeability transition. Neuroscience 75 (1996) 993-7.

256. B.S. Walev I, Hofmann F, Djonder N, Valeva A, Aktories K, Bhakdi S. , Delivery ofproteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A 98 (2001).

257. S. Bhakdi, Weller, U., Walev, .I, Martin, E., Jonas, D., Palmer, M., A guide to theuse of pore-forming toxins for controlled permeabilization of cell membranes. . Med Microbiol Immunol 182 (1993).

258. A. Tikunov, C.B. Johnson, P. Pediaditakis, J.M. Macdonald, J.J. Lemasters, and

259. E.L. Holmuhamedov, Closure of VDAC impedes the transport of superoxide anions across the outer mitochondrial membrane, causes oxidative stress and accelerates Ca2+-induced MPT. Arch Biochem Biophys submitted (2008).

260. A.V. Pokhilko, F.I. Ataullakhanov, and E.L. Holmuhamedov, Mathematical modelof mitochondrial ionic homeostasis: three modes of Ca2+ transport. J Theor Biol 243 (2006) 152-69.

261. V.A. Selivanov, F. Ichas, E.L. Holmuhamedov, L.S. Jouaville, Y.V. Evtodienko, and J.P. Mazat, A model of mitochondrial Ca(2+)-induced Ca2+ release simulating the Ca2+ oscillations and spikes generated by mitochondria. Biophys Chem 72 (1998)111-21.

262. S.G. McLaughlin, and J.P. Dilger, Transport of protons across membranes by weak acids. Physiol Rev 60 (1980) 825-63.

263. L. Missiaen, C.W. Taylor, and M.J. Berridge, Spontaneous calcium release frominositol trisphosphate-sensitive calcium stores. Nature 352 (1991) 241-4.

264. L. Missiaen, C.W. Taylor, and M.J. Berridge, Luminal Ca2+ promoting spontaneous Ca2+ release from inositol trisphosphate-sensitive stores in rat hepatocytes. J Physiol 455 (1992) 623-40.

265. W. Liang, Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using aclassic paper by Fabiato. Adv Physiol Educ 32 (2008) 1-10.

266. A. Fabiato, Calcium-induced release of calcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum. Am J Physiol 245 (1983) C1-14.

267. A.N. Zaikin, and A.M. Zhabotinsky, Concentration wave propagation in two-dimensional liquid-phase self-oscillating system. Nature 225 (1970) 535-537.

268. A.M. Zhabotinsky, and A.N. Zaikin, Autowave processes in a distributed chemicalsystem. J Theor Biol 40 (1973) 45-61.

269. A.H. Заикин, and Ю.М. Кокоз, Нестабильность и распространение волн возбуждения в модели каталитической реакции. Биофизика 22 (1977) 113116.

270. А.Н. Заикин, and Т.Я. Морозова, Распространение импульса в активной одномерной среде с триггерными неоднородностями. Биофизика Биофизика 24 (1979) 124-128.

271. Э.Л. Холмухамедов, Зг2+-индуцированные колебания и пространственно-временная организация изолированных митохондрий. Сборник трудов Института Биологической Физики АН СССР (1983).

272. E.L. Holmuhamedov, Oscillating dissipative structures in mitochondrial suspensions. Eur J Biochem 158 (1986) 543-6.

273. E.L. Holmuhamedov, and V. Evtodienko Yu, Spatial structures in mitochondrial suspension induced by cation efflux. FEBS Lett 195 (1986) 339-43.

274. R.E. Bucheimer, and J. Linden, Purinergic regulation of epithelial transport. J Physiol 555 (2004)311-21.

275. J. Lechleiter, S. Girard, E. Peralta, and D. Clapham, Spiral calcium wave propagation and annihilation in Xenopus laevis oocytes. Science 252 (1991) 1236.

276. J.D. Lechleiter, and D.E. Clapham, Molecular mechanisms of intracellular calciumexcitability in X. laevis oocytes. Cell 69 (1992) 283-94.

277. J.D. Lechleiter, and D.E. Clapham, Spiral waves and intracellular calcium signalling. J Physiol Paris 86 (1992) 123-8.

278. V. Petronilli, D. Pietrobon, M. Zoratti, and G.F. Azzone, Free energy coupling between H+-generating and H+-consuming pumps. Ratio between output and input forces. Eur J Biochem 155 (1986) 423-31.

279. E.L. Holmuhamedov, G.L. Kholmukhamedova, and T.B. Baimuradov, Non-cholinergic toxicity of organophosphates in mammals. Interaction of ethaphos with mitochondrial functions. J Appl Toxicol 16 (1996) 475-481.

280. В. Chance, and G.R. Williams, The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv Enzymol Relat Subj Biochem 17 (1956) 65-134.

281. G.J. Gross, J.A. Auchampach, M. Maruyama, D.C. Warltier, and G.M. Pieper, Cardioprotective effects of nicorandil. J Cardiovasc Pharmacol 20 Suppl 3 (1992) S22-8.

282. M. Jaburek, V. Yarov-Yarovoy, P. Paucek, and K.D. Garlid, State-dependent inhibition of the mitochondrial KATP channel by glyburide and 5-hydroxydecanoate. J Biol Chem 273 (1998) 13578-82.

283. V. Yarov-Yarovoy, P. Paucek, M. Jaburek, and K.D. Garlid, The nucleotide regulatory sites on the mitochondrial KATP channel face the cytosol. Biochim Biophys Acta 1321 (1997) 128-36.

284. J.J. Lemasters, and V.K. Ramshesh, Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol 80 (2007) 283-95.

285. B. Ehrenberg, V. Montana, M.D. Wei, J.P. Wuskell, and L.M. Loew, Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophys J 53 (1988) 785-94.

286. G. Schafer, C. Wegener, R. Portenhauser, and D. Bojanovski, Diazoxide, an inhibitor of succinate oxidation. Biochem Pharmacol 18 (1969) 2678-81.

287. D.O. Levitskii, and V.P. Skulachev, Effects of penetrating synthetic ions on the respiration of mitochondria and submitochondrial particles. Mol Biol 6 (1972) 26772.

288. V.P. Skulachev, Solution of the problem of energy coupling in terms of chemiosmotic theory. J Bioenerg 3 (1972) 25-38.

289. P.P. Dzeja, P. Bast, D. Pucar, B. Wieringa, and A. Terzic, Defective metabolic signaling in adenylate kinase AK1 gene knock-out hearts compromises postishemic coronary reflow. J Biol Chem 282 (2007) 31366-72.

290. B.U. Bradford, H. Kono, F. Isayama, O. Kosyk, M.D. Wheeler, Т.Е. Akiyama, L.

291. Bleye, K.W. Krausz, F.J. Gonzalez, D.R. Koop, and I. Rusyn, Cytochrome P450 CYP2E1, but not nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, is required for ethanol-induced oxidative DNA damage in rodent liver. Hepatology 41 (2005) 336-44.

292. Y. Dai, J. Rashba-Step, and A.I. Cederbaum, Stable expression of human cytochrome P4502E1 in HepG2 cells: characterization of catalytic activities and production of reactive oxygen intermediates. Biochemistry 32 (1993) 6928-37.

293. F.J. Gonzalez, Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress:studies with CYP2E1. Mutat Res 569 (2005) 101-10.

294. S. Stewart, D. Jones, and C.P. Day, Alcoholic liver disease: new insights into mechanisms and preventative strategies. Trends Mol Med 7 (2001)408-13.

295. T.L. Freeman, D.J. Tuma, G.M. Thiele, L.W. Klassen, S. Worrall, O. Niemela, S.

296. Parkkila, P.W. Emery, and V.R. Preedy, Recent advances in alcohol-induced adduct formation. Alcohol Clin Exp Res 29 (2005) 1310-6.

297. G.M. Thiele, L.W. Klassen, and D.J. Tuma, Formation and immunological properties of aldehyde-derived protein adducts following alcohol consumption. Methods Mol Biol 447 (2008) 235-57.

298. Y. Kurokawa, H. Takenaka, M. Sumida, К. Oka, M. Hamada, and S.A. Kuby, Multiforms of mammalian adenylate kinase and its monoclonal antibody against AK1. Enzyme 43 (1990) 57-71.

299. J.J. Lemasters, D.R. Trollinger, T. Qian, W.E. Cascio, and H. Ohata, Confocal imaging of Ca2+, pH, electrical potential, and membrane permeability in single living cells. Methods Enzymol 302 (1999) 341-58.

300. D.R. Trollinger, W.E. Cascio, and J.J. Lemasters, Selective loading of Rhod 2 intomitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys Res Commun 236 (1997) 73842.

301. D.R. Trollinger, W.E. Cascio, and J.J. Lemasters, Mitochondrial calcium transientsin adult rabbit cardiac myocytes: inhibition by ruthenium red and artifacts caused by lysosomal loading of Ca(2+)-indicating fluorophores. Biophys J 79 (2000) 3950.

302. M. Colombini, C.L. Yeung, J. Tung, and T. Konig, The mitochondrial outer membrane channel, VDAC, is regulated by a synthetic polyanion. Biochim Biophys Acta 905 (1987) 279-86.

303. P.P. Cohen, The ornithine-urea cycle: biosynthesis and regulation of carbamyl phosphate synthetase I and ornithine transcarbamylase. Curr Top Cell Regul 18 (1981) 1-19.

304. V. Rubio, Structure-function studies in carbamoyl phosphate synthetases. Biochem Soc Trans 21 (1993) 198-202.

305. Y. Wakabayashi, Tissue-selective expression of enzymes of arginine synthesis.

306. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 1 (1998) 335-9.

307. J.T. Brosnan, M.E. Brosnan, R. Charron, and I. Nissim, A mass isotopomer studyof urea and glutamine synthesis from 15N-labeled ammonia in the perfused rat liver. J Biol Chem 271 (1996) 16199-207.

308. R.K. Porter, Mammalian mitochondrial inner membrane cationic and neutral aminoacid carriers. Biochim Biophys Acta 1459 (2000) 356-62.

309. L. Palmieri, F.M. Lasorsa, A. Vozza, G. Agrimi, G. Fiermonte, M.J. Runswick, J.E.

310. Walker, and F. Palmieri, Identification and functions of new transporters in yeast mitochondria. Biochim Biophys Acta 1459 (2000) 363-9.

311. C. Czerny, C.C. Beeson, T.G. Baker, E.L. Holmuhamedov, and J.J. Lemasters,

312. C. Czerny, C.C. Beeson, T.G. Baker, E.L. Holmuhamedov, and J.J. Lemasters,

313. Ethanol Suppression of Ureagenesis by Hepatocytes: Partial Reversal by Inhibitors of Alcohol Dehydrogenase (ADH) and Cytochrome P450 (2E1). Abstracts 2008 RSA/ISBRA Joint Meeting 353 (2008) 99A

314. V.R. Preedy, D.W. Crabb, J. Farres, and P.W. Emery, Alcoholic myopathy andacetaldehyde. Novartis Found Symp 285 (2007) 158-77; discussion 177-82, 1989.

315. M. Apte, J. McCarroll, R. Pirola, and J. Wilson, Pancreatic MAP kinase pathwaysand acetaldehyde. Novartis Found Symp 285 (2007) 200-11; discussion 211-6.

316. M.A. Bogoyevitch, and P.G. Arthur, Inhibitors of c-Jun N-terminal kinases: JuNKno more? Biochim Biophys Acta 1784 (2008) 76-93.

317. M.A. Bogoyevitch, and D.P. Fairlie, A new paradigm for protein kinase inhibition:blocking phosphorylation without directly targeting ATP binding. Drug Discov Today 12 (2007) 622-33.

318. M.A. Bogoyevitch, D.C. Ng, N.W. Court, K.A. Draper, A. Dhillon, and L. Abas, Intact mitochondrial electron transport function is essential for signalling by hydrogen peroxide in cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol 32 (2000) 1469-80.

319. A.M. Diehl, Effect of ethanol on tumor necrosis factor signaling during liver regeneration. Clin Biochem 32 (1999) 571-8.

320. B.J. Kim, S.W. Ryu, and B.J. Song, JNK- and p38 kinase-mediated phosphorylation of Bax leads to its activation and mitochondrial translocation and to apoptosis of human hepatoma HepG2 cells. J Biol Chem 281 (2006) 2125665.

321. J. Banerjee, and S. Ghosh, Phosphorylation of rat brain mitochondrial voltage-dependent anion as a potential tool to control leakage of cytochrome c. J Neurochem 98 (2006) 670-6.

322. A.K. Bera, and S. Ghosh, Dual mode of gating of voltage-dependent anion channel as revealed by phosphorylation. J Struct Biol 135 (2001) 67-72.

323. A.K. Bera, S. Ghosh, and S. Das, Mitochondrial VDAC can be phosphorylated bycyclic AMP-dependent protein kinase. Biochem Biophys Res Commun 209 (1995)213-7.

324. U. Maurer, C. Charvet, A.S. Wagman, E. Dejardin, and D.R. Green, Glycogen synthase kinase-3 regulates mitochondrial outer membrane permeabilization and apoptosis by destabilization of MCL-1. Mol Cell 21 (2006) 749-60.

325. J. Coates, M.J. Sheehan, and P. Strong, 1,3-Dipropyl-8-cyclopentyl xanthine (DPCPX): a useful tool for pharmacologists and physiologists? Gen Pharmacol 25(1994) 387-94.

326. S. Ahmad, A. Ahmad, and C.W. White, Purinergic signaling and kinase activationfor survival in pulmonary oxidative stress and disease. Free Radic Biol Med 41 (2006) 29-40.

327. D.R. Appling, Compartmentation of folate-mediated one-carbon metabolism in eukaryotes. Faseb J 5 (1991) 2645-51.

328. G.J. Cowin, D.A. Willgoss, J. Bartley, and Z.H. Endre, Serine isotopmer analysisby 13C-NMR defines glycine-serine interconversion in situ in the renal proximal tubule. Biochim Biophys Acta 1310 (1996) 32-40.

329. P.C. Nicholas, D. Kim, F.T. Crews, and J.M. Macdonald, Proton nuclear magneticresonance spectroscopic determination of ethanol-induced formation of ethyl glucuronide in liver. Anal Biochem 358 (2006) 185-91.

330. P.C. Nicholas, D. Kim, F.T. Crews, and J.M. Macdonald, 1H NMR-based metabolomic analysis of liver, serum, and brain following ethanol administration in rats. Chem Res Toxicol 21 (2008) 408-20.

331. J.B. Scheer, A.D. Mackey, and J.F. Gregory, 3rd, Activities of hepatic cytosolicand mitochondrial forms of serine hydroxymethyltransferase and hepatic glycine concentration are affected by vitamin B-6 intake in rats. J Nutr 135 (2005) 233-8.

332. L.B. Pasternack, D.A. Laude, Jr., and D.R. Appling, Whole-cell detection by 13C

333. NMR of metabolic flux through the C1-tetrahydrofolate synthase/serine hydroxymethyltransferase enzyme system and effect of antifolate exposure in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry 33 (1994) 7166-73.

334. L.B. Pasternack, D.A. Laude, Jr., and D.R. Appling, 13C NMR analysis of intercompartmental flow of one-carbon units into choline and purines in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry 33 (1994) 74-82.

335. C.P. Baines, R.A. Kaiser, T. Sheiko, W.J. Craigen, and J.D. Molkentin, Voltagedependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat Cell Biol 9 (2007) 550-5.

336. D. Han, F. Antunes, R. Canali, D. Rettori, and E. Cadenas, Voltage-dependent anion channels control the release of the superoxide anion from mitochondria to cytosol. J Biol Chem 278 (2003) 5557-63.

337. G. Kroemer, and J. Pouyssegur, Tumor cell metabolism: cancer's Achilles' heel.

338. Cancer Cell 13 (2008) 472-82.

339. W.J. Craigen, and B.H. Graham, Genetic strategies for dissecting mammalian and

340. Drosophila voltage-dependent anion channel functions. J Bioenerg Biomembr 40 (2008) 207-12.

341. B.H. Graham, and W.J. Craigen, Genetic approaches to analyzing mitochondrial outer membrane permeability. CurrTop Dev Biol 59 (2004) 87-118.

342. B.H. Graham, and W.J. Craigen, Mitochondrial voltage-dependent anion channelgene family in Drosophila melanogaster: complex patterns of evolution, genomic organization, and developmental expression. Mol Genet Metab 85 (2005) 30817.

343. M.J. Sampson, R.S. Lovell, and W.J. Craigen, Isolation, characterization, and mapping of two mouse mitochondrial voltage-dependent anion channel isoforms. Genomics 33 (1996) 283-8.

344. M.J. Sampson, R.S. Lovell, and W.J. Craigen, The murine voltage-dependent anion channel gene family. Conserved structure and function. J Biol Chem 272 (1997) 18966-73.

345. M.J. Sampson, R.S. Lovell, D.B. Davison, and W.J. Craigen, A novel mouse mitochondrial voltage-dependent anion channel gene localizes to chromosome 8. Genomics 36 (1996) 192-6.

346. A. Boveris, and B. Chance, The mitochondrial generation of hydrogen peroxide.

347. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J 134 (1973) 70716.

348. A. Boveris, N. Oshino, and B. Chance, The cellular production of hydrogen peroxide. Biochem J 128 (1972) 617-30.

349. E. Cadenas, and K.J. Davies, Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic Biol Med 29 (2000) 222-30.

350. J.F. Turrens, Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol 5522003) 335-44.

351. S.B. Le, M.K. Hailer, S. Buhrow, Q. Wang, K. Flatten, P. Pediaditakis, K.C. Bible,

352. D. Lewis, E.A. Sausville, Y.P. Pang, M.M. Ames, J.J. Lemasters, E.L. Holmuhamedov, and S.H. Kaufmann, Inhibition of mitochondrial respiration as a source of adaphostin-induced reactive oxygen species and cytotoxicity. J Biol Chem 282 (2007) 8860-72.

353. S.B. Le, E.L. Holmuhamedov, V.L. Narayanan, E.A. Sausville, and S.H. Kaufmann, Adaphostin and other anticancer drugs quench the fluorescence of mitochondrial potential probes. Cell Death Differ 13 (2006) 151-9.

354. M. Madesh, and G. Hajnoczky, VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome с release. J Cell Biol 155 (2001) 1003-15.

355. J.A. Call, S.G. Eckhardt, and D.R. Camidge, Targeted manipulation of apoptosisin cancer treatment. Lancet Oncol 9 (2008) 1002-11.

356. M. Johansson, and J.L. Persson, Cancer therapy: targeting cell cycle regulators. Anticancer Agents Med Chem 8 (2008) 723-31.

357. R. Kalyn, Overview of targeted therapies in oncology. J Oncol Pharm Pract 13 (2007) 199-205.

358. E. Ortega, R.M. Marti, A. Yeramian, A. Sorolla, X. Dolcet, D. Llobet, L. Abal, M.

359. Santacana, J. Pallares, A. Llombart-Cussac, and X. Matias-Guiu, Targeted therapies in gynecologic cancers and melanoma. Semin Diagn Pathol 25 (2008) 262-73.

360. Y. Yamada, and H. Harashima, Mitochondrial drug delivery systems for macromolecule and their therapeutic application to mitochondrial diseases. Adv Drug Deliv Rev 60 (2008) 1439-62.

361. W. Tan, J.C. Lai, P. Miller, C.A. Stein, and M. Colombini, Phosphorothioate oligonucleotides reduce mitochondrial outer membrane permeability to ADP. Am J Physiol Cell Physiol 292 (2007) C1388-97.

362. W. Tan, Y.H. Loke, C.A. Stein, P. Miller, and M. Colombini, Phosphorothioate oligonucleotides block the VDAC channel. Biophys J 93 (2007) 1184-91.

363. J.C. Lai, B.D. Brown, A.M. Voskresenskiy, S. Vonhoff, S. Klussman, W. Tan, M.

364. Colombini, R. Weeratna, P. Miller, L. Benimetskaya, and C.A. Stein, Comparison of d-g3139 and its enantiomer L-g3139 in melanoma cells demonstrates minimal in vitro but dramatic in vivo chiral dependency. Mol Ther 15 (2007) 270-8.

365. J.C. Lai, W. Tan, L. Benimetskaya, P. Miller, M. Colombini, and C.A. Stein, A pharmacologic target of G3139 in melanoma cells may be the mitochondrial VDAC. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 7494-9.

366. J. Chandra, J. Tracy, D. Loegering, K. Flatten, S. Verstovsek, M. Beran, M. Gorre,

367. Z. Estrov, N. Donato, M. Talpaz, C. Sawyers, K. Bhalla, J. Karp, E. Sausville, and S.H. Kaufmann, Adaphostin-induced oxidative stress overcomes BCR/ABL mutation-dependent and -independent imatinib resistance. Blood 107 (2006) 2501-6.

368. T.D. Shanafelt, Y.K. Lee, N.D. Bone, A.K. Strege, V.L. Narayanan, E.A. Sausville,

369. S.M. Geyer, S.H. Kaufmann, and N.E. Kay, Adaphostin-induced apoptosis in CLL В cells is associated with induction of oxidative stress and exhibits synergy with fludarabine. Blood 105 (2005) 2099-106.

370. C. Yu, L.M. Bruzek, X.W. Meng, G.J. Gores, C.A. Carter, S.H. Kaufmann, and A.A. Adjei, The role of Mcl-1 downregulation in the proapoptotic activity of the multikinase inhibitor BAY 43-9006. Oncogene 24 (2005) 6861-9.

371. S. Mazumder, D. Plesca, and A. Almasan, Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis. Methods Mol Biol 414 (2008) 13-21.

372. S.H. MacKenzie, and A.C. Clark, Targeting cell death in tumors by activating caspases. Curr Cancer Drug Targets 8 (2008) 98-109.

373. L.R. Motadi, N.L. Misso, Z. Dlamini, and K.D. Bhoola, Molecular genetics and mechanisms of apoptosis in carcinomas of the lung and pleura: therapeutic targets. Int Immunopharmacol 7 (2007) 1934-47.

374. L. Galluzzi, C. Brenner, E. Morselli, Z. Touat, and G. Kroemer, Viral control of mitochondrial apoptosis. PLoS Pathog 4 (2008) e1000018.

375. B. Levine, S. Sinha, and G. Kroemer, Bcl-2 family members: dual regulators of apoptosis and autophagy. Autophagy 4 (2008) 600-6.

376. E. Schwarz, and W. Neupert, Mitochondrial protein import: mechanisms, components and energetics. Biochim Biophys Acta 1187 (1994) 270-4.

377. F. Moro, К. Okamoto, M. Donzeau, W. Neupert, and M. Brunner, Mitochondrial protein import: molecular basis of the ATP-dependent interaction of MtHsp70 with Tim44. J Biol Chem 277 (2002) 6874-80.

378. S.A. Paschen, and W. Neupert, Protein import into mitochondria. IUBMB Life 522001) 101-12.

379. J.M. Herrmann, and W. Neupert, What fuels polypeptide translocation? An energetical view on mitochondrial protein sorting. Biochim Biophys Acta 1459 (2000) 331-8.

380. N. Pfanner, and W. Neupert, A mitochondrial machinery for membrane translocation of precursor proteins. Biochem Soc Trans 18 (1990) 513-5.

381. B. Westermann, and W. Neupert, Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 16 (2000) 1421-7.

382. H. Brooks, B. Lebleu, and E. Vives, Tat peptide-mediated cellular delivery: back tobasics. Adv Drug Deliv Rev 57 (2005) 559-77.

383. K. Watson, and R.J. Edwards, HIV-1-trans-activating (Tat) protein: both a targetand a tool in therapeutic approaches. Biochem Pharmacol 58 (1999) 1521-8.

384. S.M. Bailey, V.B. Patel, T.A. Young, K. Asayama, and C.C. Cunningham, Chronicethanol consumption alters the glutathione/glutathione peroxidase-1 system and protein oxidation status in rat liver. Alcohol Clin Exp Res 25 (2001) 726-33.

385. S.R. Schwarze, A. Ho, A. Vocero-Akbani, and S.F. Dowdy, In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285 (1999) 1569-72.

386. Y. Yang, J. Ma, Z. Song, and M. Wu, HIV-1 TAT-mediated protein transductionand subcellular localization using novel expression vectors. FEBS Lett 532 (2002) 36-44.

387. F.J. Mendoza, P.S. Espino, K.L. Cann, N. Bristow, K. McCrea, and M. Los, Antitumor chemotherapy utilizing peptide-based approaches-apoptotic pathways, kinases, and proteasome as targets. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 53 (2005) 47-60.

388. СПИСОК ИЗБРАННЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ

389. Dzeja РР, Bast Р, Ozcan С, Valverde A, Holmuhamedov EL, Van Wylen DGL, Terzic A. Targeting nucleotide-requiring enzymes: Implications for diazoxide-induced cardioprotection. Am J Physiol 2002, 284:H1048-H1056.

390. Dzeja PP, Bortolon R, Perez-Terzic C, Holmuhamedov EL, Terzic A. Energetic communication between mitochondria and nucleus directed by catalyzed phosphotransfer. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:10156-10161.

391. Dzeja PP, Holmuhamedov EL, Ozcan C, Pucar D, Jahangir A, Terzic A. Mitochondria: Getaway for cytoprotection. Circ Res 2001, 89:744-746.

392. Evtodienko YV, Zinchenko VP, Holmuhamedov EL, Gylkhandanyan AV, Zhabotinsky AM. The stoichiometry of ion fluxes during Sr^-induced oscillations in mitochondria. Biochim Biophys Acta 1980, 589:157-161.

393. Globus RK, Holmuhamedov EL, Lull JC, Lopez V, Doty SB, Moursi A, Damsky C. Fibronectin is a survival factor for differentiated osteoblasts. J Cell Sci 1998, 111:1385-1393.

394. Hetrick EM, Shin JH, Stasko NA, Johnson CB, Wespe DA, Holmuhamedov E, Schoenfisch MH. Bactericidal Efficacy of Nitric Oxide-Releasing Silica Nanoparticles. ACS Nano. 2008 2:235-246.

395. Holmuhamedov E, Lemasters JJ. Ethanol exposure decreases mitochondrial outer membrane permeability in cultured rat hepatocytes. Arch Biochem Biophys. 2008 Nov 11. Epub ahead of print.

396. Holmuhamedov EL, Bacon JA, Ulrich RG. Nucleotide-induced calcium transient and plasma membrane calcium permeability in Chang Human Liver Cells. Biochem Mol Biol Intern 1995, 35:595-604.

397. Holmuhamedov EL, Evtodienko YuV. Spatial structures in mitochondrial suspension induced by cation efflux. FEBS Lett 1986, 195:339-343.

398. Holmuhamedov EL, Jahangir A, Bienengraeber M, Lewis L, Terzic A. Deletion of mtDNA disrupts the function, but not biogenesis of mitochondria. Mitochondrion, 2003, 3:13-19.

399. Holmuhamedov EL, Jahangir A, Oberlin A, Komarov A, Colombini M, Terzic A. Potassium channel openers are uncoupling protonophores: implication in cardioprotection. FEBS Lett. 2004, 568:167-170.

400. Holmuhamedov EL, Jovanovic S, Dzeja P, Jovanovic A, Terzic A. Mitochondrial ATP-sensitive channels modulate cardiac mitochondrial functions. Am J Physiol 1998, 275:H1567-H1576.

401. Holmuhamedov EL, Kholmukhamedova GL, Baimuradov ТВ. Non-cholinergic toxicity of organophosphates in mammals. Interaction of ethaphos with mitochondrial functions. J Appl Toxicol 1996, 16:475-481.

402. Holmuhamedov EL, Lewis L, Bienengraeber M, Holmuhamedova M, Jahangir A, Terzic A. Suppression of human tumor cell proliferation through mitochondrial targeting. FASEB J, 2002, 16:1010-1016.

403. Holmuhamedov EL, Ozcan C, Jahangir A, Terzic A. Restoration of Ca2+-inhibited oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria by mitochondrial Ca2+ unloading. Mol Cell Biochem 2001, 220:135-140.

404. Holmuhamedov EL, Sadykov YH, Teplova W. Oscillation of ion fluxes in mammalian erythrocytes: Mechanism of oscillation. Eur J Biochem 1988, 166:723-726.

405. Holmuhamedov EL, Oberlin A, Short K, Nair S, Terzic A, Jahangir A (2002) Differential responsiveness of cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria to Ca2+ injury and diazoxide. Mayo Clin Proc 77:46-54.

406. Holmuhamedov EL, Teplova W, Chukhlova EA, Evtodienko YuV, Ulrich RG. Strontium excitability of the inner mitochondrial membrane. Regenerative Strontium-induced Strontium releases. Biochem Mol Biol Intern 1995, 36:39-49.

407. Holmuhamedov EL, Wang L, Terzic A. ATP-sensitive K+ channel openers prevent Ca2+ overload in rat cardiac mitochondria. J Physiol (London) 1999, 519:347-360.

408. Holmuhamedov EL. Oscillating dissipative structures in mitochondrial suspensions. Eur J Biochem 1986, 158:543-546.

409. Ichas F, Jouaville LS, Sidash S, Mazat J-P, Holmuhamedov EL. Mitochondrial calcium spiking a transduction mechanism based on calcium-induced permeability transition involved in cell calcium signaling. FEBS Lett 1994, 348:211-215.

410. Ichas F, Jouaville LS, Sidash S, Mazat J-P, Holmuhamedov EL. Mitochondrial calcium spiking: The physiological face of permeability transition? Modern Trends in Bio-Thermo Kinetics 1994, 3:159-162.

411. Jahangir A, Ozcan C, Holmuhamedov EL, Terzic A. Increased calcium vulnerability of senescent cardiac mitochondria: Protective role for mitochondrial potassium channel opener. Mech Ageing Develop 2001, 122:1073-1086.

412. Jouaville LS, Ichas F, Holmuhamedov EL, Camacho P, Lechleiter JD. Synchronization of calcium waves by mitochondrial substrates in Xenopus I. Oocytes. Nature 1995, 377:438-441.

413. Le SB, Holmuhamedov EL, Narayanan VL, Sausville EA, Kaufmann SH. Adaphostin and other anticancer drugs quench the fluorescence of mitochondrial potential probes. Cell Death Differ. 2006, 13:151-159.

414. Lemasters JJ, Holmuhamedov EL. Voltage-Dependent Anion Channel (VDAC) As Mitochondrial Governator Thinking Outside the Box. Biochim Biophys Acta 2006, 1762:181-190.

415. Maglova LM, Holmuhamedov EL, Zinchenko VP, Evtodienko YV. Induction of 2H+/Mez+ exchange in rat-liver mitochondria. Eur J Biochem 1982, 128:159-161.

416. Ozcan C, Jahangir A, Holmuhamedov EL, Terzic A. Diazoxide protects mitochondria from anoxic injury: Implications for myopreservation. J Thorac Cardiovasc Surg 2001, 121:298-306.

417. Pokhilko AV, Ataullakhanov Fl, Holmuhamedov EL. Mathematical model of mitochondrial ionic homeostasis: Three modes of Ca2+ transport. J Theor Biol 2006, 243:152-169.

418. Sadykov YH, Holmuhamedov EL, Evtodienko YV. Effect of pH and proton buffer on oscillations of ion fluxes in rat erythrocytes. Eur J Biochem 1984, 143:369-371.

419. Selivanov VA, Ichas F, Holmuhamedov EL, Jouaville LS, Evtodienko YuV, Mazat J-P. A model of mitochondrial Ca-induced Ca release simulating the Ca oscillations and spikes generated by mitochondria. Biophys Chem 1998, 72:111-121.

420. Stasko NA, Johnson CB, Schoenfisch MH, Johnson ТА, Holmuhamedov EL. Cytotoxicity of polypropylenimine dendrimer conjugates on cultured endothelial cells. Biomacromolecules. 2007 8:3853-3859.

421. Terzic A, Dzeja P.P, Holmuhamedov EL. Mitochondrial KAtp Channels: Probing Molecular Identity and Pharmacology. J Mol Cell Cardiol 2000, 32:1911-1915.

422. Ulrich RG, Bacon JA, Cramer CT, Petrella DK, Sun EL, Meglasson MD, Holmuhamedov EL. Disruption of mitochondrial activities in rabbit and human hepatocytes by a quinoxalinone anxiolytic and its carboxylic acid metabolite. Toxicology 1998, 131:33-47.

423. Гольдштейн БН, Холмухамедов ЭЛ, Иванова АН, Фурман ГА. Ионофор-индуцированные колебания в эритроцитах. Кинетическая модель. Мол Биол 1987, 21:132-139.

424. Теплова ВВ, Евтодиенко ЮВ, Холмухамедов ЕЛ, Сергиенко НГ, Гончаров НВ. Эффект флуороцитрата на поглощение кислорода и транспорт в митохондриях печени. Цитология 1992, 34:71-75.

425. Теплова ВВ, Сидаш СС, Евтодиенко ЮВ, Холмухамедов ЭЛ. Характер и механизм изменений содержания АТФ в митохондриях в ходе колебаний ионных потоков. Биохимия 1991, 56:1975-1983.

426. Холмухамедов ЭЛ, Зинченко ВП, Евтодиенко ЮВ. Автоколебания ионных потоков и редокс состояния дыхательной цепи в митохондриях. Биофизика 1980, 25:124-128.

427. Холмухамедов ЭЛ, Селиванов ВА, Ким ЮВ. Математическая модель колебаний ионных потоков в эритроцитах млекопитающих. Биофизика 1990, 35:373-377.

428. Холмухамедов ЭЛ, Семенова ГА, Зинченко ВП, Евтодиенко ЮВ, Кондрашова МН. Обратимые изменения объема митохондрий в ходе колебаний ионных потоков между митохондриями и средой. Цитология 1982, 24:1024-1027.

429. Холмухамедов ЭЛ, Чухлова ЭА. Эффект ионов двухвалентных металлов на колебания ионных потоков в митохондриях печени крыс. Укр Биох Ж 1985 57:4349.

430. Чухлова ЭА, Садыков ЮХ, Холмухамедов ЭЛ, Гренадер АК. Эффект тримекалина, аймалина, стеноприла и хлорацизина на колебания потоков в митохондриях печени крыс. Укр Биох Журнал 1984, 56:207-210.

Информация о работе

Холмухамедов, Эхсон Лукманович
доктора биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль митохондрий в обеспечении нормальной жизнедеятельности и выживания клеток млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы