Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии

Солодовникова, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии"

На правах рукописи

Солодовникова Ирина Михайловна

Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии.

специальность 03 00 25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

□ОЗ 17*723 1

003177231

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А Н Белозерского, МГУ им. М В Ломоносова.

Научные руководители

доктор биологических наук, Бакеева Л.Б.

доктор биологических наук, профессор, Ягужинский Л.С.

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор,

Капелько В.И, рук лаб

экспериментальной патологии сердца, Инст. эксп. кардиол, Рос кардиол науч.-произв компл., Фед агентство Росмедгехнологий

доктор биологических наук, профессор, Мошков Д.А, зав. лаб ультраструктуры нейрона, Инст. теор. и эксп биофиз. РАН.

Ведущая организация: Институт морфологии человека,

г.Москва.

Защита состоится " 18" декабря 2007 г. в 15 30 часов на заседании Диссертационного Совета Б 501.00152 при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу. 119899, Москва, Ленинские Горы, д 1, корп 12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова

Автореферат разослан '44" ноября 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета У__

Кандидат биолошческих наук Е Н Калистрагова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вопросы взаимосвязи структуры и функции митохондрий постоянно находятся в центре внимания широкого круга исследователей В последние годы произошли и происходят революционные события в митохондриологии В традиционные представления о роли митохондрий в клетке внесены существенные коррективы Еще сравнительно недавно наши представления о митохондриях сводились только как к энергетическим станциям клетки, где роль митохондрий в развитии патологии ограничивалась нарушением энергообеспечения, и исключительно с этих позиций рассматривались все ультраструктурные преобразования митохондрий, в то время как многие ультраструктурные состояния митохондрий невозможно объяснить в свете таких представлений В настоящее время основным компонентом в развитии многих патологий считается окислительный стресс Термин «окислительный стресс» не имеет на сегодня четкого определения, он используется для широкого круга разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих как повышенную внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК), так и окислительное повреждение клетки Как известно, ткань миокарда является одним из активных потребителей кислорода Снижение уровня кислорода - гипоксия вызывает значительные нарушения структуры и функции миокарда Наиболее чувствительными к гипоксии структурами клетки являются митохондрии, поэтому большой интерес представляет изучение состояния митохондрий в этих условиях Кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации приводит не только к нарушению энергетики клетки, но и резко изменяет скорость генерации АФК митохондриями Не смотря на огромное количество работ и неослабевающий интерес, на протяжении всего времени изучения ультраструктуры митохондрий, к состоянию этих органелл в условиях гипоксии, нехватка фактических данных пока еще не позволяет составить полное представление о действии гипоксии на состояние митохондрий и прежде всего в ткани миокарда, где повреждающее действие гипоксии имеет место при многих патологиях миокарда

Цель работы состояла в изучении морфофункциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов при длительном действии гипоксии Был применен специальный экспериментальный подход исследование проводили на кусочках изолированного миокарда, инкубированных при 20°С в условиях длительной гипоксии начиная с 6 ч и далее через каждые 12 ч, в течение 3-х суток Были поставлены следующие задачи исследования

1 Исследовать особенности ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии,

2 Исследовать динамику изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда в течение 72 ч инкубации ткани в условиях гипоксии, начиная с 6 часов и далее через каждые 12 часов,

3 Изучить функциональные особенности митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч гипоксии на изолированных митохондриях, а так же непосредственно in situ методом электронно-микроскопической гистохимии на выявление функциональной активности цитохром с-оксидазы

Научная новизна. Определены основные ультраструктурные признаки ткани миокарда на модели изолированных кусочков ткани миокарда в условиях безкислородной среды, при которых сохраняется нативность ультраструктуры кардиомиоцитов и дыхательная активность митохондрий в течение 3-х суток Впервые описана динамика возникновения популяции мелких электронно-плотных митохондрий, располагающихся внутри митохондрий основной популяции -«митохондрий внутри митохондрий» Впервые исследованы особенности специфических для условий гипоксии перестроек внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов геометрически упорядоченных ячеистых структур Показано, что эти структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны изменяют свою морфологию при добавлении в среду инкубации АДФ, а также полностью исчезают при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М сахарозе Изучены функциональные изменения системы окислительного фосфорилирования митохондрий во времени при глубокой длительной гипоксии кардиомиоцитов Впервые удалось получить кластеры митохондрий, объединенные межмитохондриальными контактами во фракциях Показана функциональная активность цитохром с-оксидазы в мелких, электронно-плотных митохондриях при полном или частичном отсутствии таковой в митохондриях основной популяции Впервые обнаружена поразительная стабильность и получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов при гистохимическом исследовании экспериментальной ткани на цитохром с - оксидазную активность

Практическая ценность работы. Предложенная в настоящей работе экспериментальная система исследования действия гипоксии может использоваться для изучения механизмов нарушения тканей сердца при тяжелых поражениях миокарда Установленные в работе закономерности изменений

структуры митохондриального аппарата кардиомицитов также могут быть использованы при изучении и интерпретации ультраструктуры митохондрий при действии гипоксии в различных исследованиях клеток и тканей Полученные данные углубляют фундаментальные знания о действии гипоксии на ультраструктуру митохондриального аппарата

Апробация работы. Материалы работы были представлены на II Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология)», (Москва, 2002), Международной конференции "Митохондрии в патологии" (Пущино, 2003), 1-й Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), FEBS Congress (Варшава,2004), Ш Съезде биофизиков России (Воронеж 2004), Международной

конференции "Митохондрии в патологии" (Пущино, 2005), XXI Российской

конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), 14 European Bioenergetics Conference ЕВЕС, Moscow State University (Moscow, 2006), International Small-Angle Scattering Workshop is devoted to Yu M Ostanevich, (Dubna,2006), Первой Всероссийской школе-семинаре (Современные достижения бионаноскопии) физ-фак МГУ (Москва, 2007), Sixth National Conference on Application of X-ray, Synchrotron Radiation, Neutrons and Electrons for Material Characterization, (Москва, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Список литературы" Работа изложена на 103 страницах, включает 47 рисунков, список литературы содержит 220 ссылок

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В исследовании по действию гипоксии на кардиомиоциты миокарда были использованы взрослые беспородные крысы массой 150-180 г Экспериментальная модель. Крыс (150-180 г) декапитировали, ткань желудочков извлекали, измельчали на фрагменты 2 мм в растворе буфера 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, ЮмМ Tns, рН 7 4 при 4"С Препарат ткани помещали в пластиковые пробирки и заливали тем же буфером, предварительно продутым азотом в течение 30 мин, в котором нарезалась ткань Образец быстро герметизировали и инкубировали при 20 °С начиная с 6 часов и до 72 часов Выделение фракций митохондрий. Митохондрии для измерения функциональной активности выделяли с помощью стандартного метода дифференциального центрифурирования в среде выделения 250 мМ сахароза, 250 мкМ ЭДТА, ЮмМ

Тт, рН 7 4, предварительно охлажденной до температуры 0°С Фракции осаждали ядерную при тяжелую -1700£, среднюю -10000£ и легкую -17000g Исследование функциональной активности митохондрий. Исследование проводили с помощью одновременной регистрации скорости поглощения кислорода электродом Кларка и мембранного потенциала митохондрий ТРР -селективным электродом («НИКО», Россия) Среда инкубации содержала 120 мМ КС1, 1мМ ЭДТА, ЮмМ Тш, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 0 5 мкМ тетрафенилфосфоний (ТРР), рН 7 4

Для электронно-микроскопического исследования была использована общепринятая классическая методика

Определение активности цитохром с - оксидазы в митохондриях нативной и экспериментальной ткани сердца проводили по методике, описанной Селигманом с соавт (8е1^шап е1 а1, 1968) Ткань миокарда фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в РВБ-буфере (0,15 ЫаС1/ 27 шМ КС1/ 12 гаМ МаН2Р04, рН 7,2) в течение 10 минут при 4°, затем ткань инкубировали в растворе 5 гт^ 3, 3'- диаминобензидина тетрагидрохлорида / 9 ш1 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4/ 1 т! каталазы (20^/ш1)/ 10 ггщ цитохрома с/ 750 mg сахарозы в течение 3 часов при 37°С Ткань отмывали в РВ8-буфере 1 час, дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия в буфере 1,5 ч и далее обрабатывали по стандартной методике для электронно-микроскопического исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Ультраструктура кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

Проведенное электронно-микроскопическое исследование состояния ткани кусочков изолированного миокарда, инкубированных 72 часа в гипоксии при 20°С показало, что в этих экспериментальных условиях в кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит На препаратах исследуемой ткани можно видеть расположенные рядами вдоль миофибрилл цепочки нативных по своей ультраструктуре митохондрий, объединенных межмитохондриальными контактами Наличие межмитохондриальных контактов показывает, что выбранные нами экспериментальные условия позволяют сохранить в исследуемой ткани объединенную митохондриальную систему - характерную ультраструктурную особенность нативной ткани миокарда

Однако обращает на себя внимание выраженная ультраструктурная гетерогенность популяции митохондрий: основную популяцию составляют электронно-светлые митохондрии с обводненным, просветленным матриксом, контрастными, хорошо выраженными мембранами, в тоже время в ткани можно видеть и митохондрии иной ультраструктуры: мелкие электронно-плотные органеллы с электронно-плотным матриксом, выраженным обводнённым межмембранным пространством. Электронно-плотные митохондрии значительно варьируют по размерам от чрезвычайно мелких, имеющих 2-3 кристы, до сопоставимых по размеру с основной массой митохондрий. Электронно-плотные митохондрии могут располагаться непосредственно среди миофибрилл, а так же в межмембранном пространстве более крупных электронно-светлых митохондрий, как правило, на периферии органеллы (фот. 1). Эта удивительная морфологическая особенность является

характерным ультраструктурным признаком исследуемой ткани.

В наших экспериментальных условиях мы также обнаружили изменения ультраструктуры митохондрий, хорошо известные в литературе для условий гипоксии. Это прежде всего большое количество септированных митохондрий, а также образование включений во внутрикристном пространстве, которые имеют вид электронно-плотного материала. Наряду с этими изменениями морфологии митохондрий мы обнаружили в нашей

Фот.1. Последовательные срезы митохондрии изолированной ткани миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии. В межмембранном пространстве расположена мелкая, электронно-плотная митохондрия.

экспериментальной ткани неизвестные ранее перестройки внутренней организации митохондрий. Так в отдельных митохондриях можно видеть участки повышенной электронной плотности, которые можно принять за мелкую, электронно-плотную

митохондрию.

Анализ этих структур при большом увеличении показывает, что это участки повышенной электронной плотности, в которых происходит образование внутренней митохондрии-альной мем-

___ _____________ ______ _____ браной упорядоченных структур в результате перехода ламел-лярной упаковки

Фот. 2 а, б. Локальная перестройка внутренней митохондриальной мембраны с образованием упорядоченной структуры: а-обзорпая фотография, б-при большем увеличении.

мембран соседних крист в трубчатую. На фот. 2 а, б видно, что внутренняя мембрана митохондрии образует электронно-плотную ячеистую структуру. Расположение ячеек упорядочено, хорошо различимы как бы узлы, в результате чего на поперечном сечении они имеют гексагональные очертания. Структура этих образований напоминает кристаллическую решетку. Различим плавный переход внутренней митохондриальной мембраны в эту структуру, поэтому данное образование не является изолированной самостоятельной структурой. Образования такого типа внутри митохондрий до настоящего времени в литературе не установлены. При изменении условий инкубации, добавлением в среду инкубации 0,1мМ АДФ, эти структурные образования резко меняют свою морфологию (фот. 3 а, б). На поперечном сечении это скопление треугольных структур, а при наклонном - это треугольные призмы, расположенные на одинаковом расстоянии и

параллельно друг другу (3, а). На в продольном сечении - это параллельно расположенные тяжи крист (фот. 3, б).

При этом утрачивается повышенная электронная плотность этого структурного образования. Такая ультраструктура митохондрий была описана Ревелом и соавт. для крикотироидной мышцы летучей мыши (схема В). Особенностью этих структурных образований является обратимость

перестроек внутренней митохондриальной мембраны. Как показали наши исследования, при выделении

митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М сахарозе эти структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны исчезают. Нам никогда не удавалось обнаружить эти структуры в изолированных митохонриях. Гипоксия является сильным стрессовым воздействием на клетку. Можно предположить, что наблюдаемые нами ультраструктурные изменения внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов также могут быть компенсаторной реакцией, обеспечивающей более высокую жизнеспособность митохондрий клетки в экстремальных условиях гипоксии.

Фот. 3 а, б. Ультраструктура локальных перестроек внутренней мембраны митохондрий при добавлении в срезу инкубации 0,1 мМ АДФ. В-схема ультраструктуры митохондрии по Revel J.P. etal., 1963.

2.Исследование функциональной активности митохондрий кусочков изолированной ткани миокарда, инкубированных в условиях длительной

гипоксии.

Обнаруженные нами в условиях экспериментально вызванной кислородной недостаточности изолированной ткани миокарда особенности ультраструктуры митохондрий неотделимы от функциональных процессов в ткани миокарда, лишенной кислорода Мы провели исследование функциональных особенностей митохондрий нашей экспериментальной ткани на суспензии изолированных митохондрий, а так же непосредственно in situ методом электронно-микроскопической гистохимии 2.1 Особенности системы окислительного фосфорилирования митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях длительной

гипоксии.

Был проведён ультраструктурный анализ полученных фракций "Тяжелая" (1700g) фракция наряду с миофибриллами, ядрами кардиомиоцитов содержала кластеры митохондрий, объединенные межмитохондриальными контактами Внутри отдельных митохондрий обнаруживались мелкие электронно-плотные митохондрии Митохондрии "средней" фракции (lOOOOg) имели ультраструктуру, характерную для митохондрий, изолированных в 0,25М сахарозе округлую форму, увеличенное межмембранное пространство, сжатый матрикс При электронно-микроскопическом исследовании "легкой" фракции (17000g) было выявлено, что эта фракция содержит мелкие электронно-плотные митохондрии, по своей ультраструктуре соответствующие электронно-плотным митохондриям, расположенным внутри более крупных электронно-светлых митохондрий Эти электронно-плотные митохондрии "легкой" фракции имели наружную и внутреннюю мембраны, а их средний диаметр составлял 0,15 мкм Так же в этой фракции обнаруживались мелкие набухшие митохондрии, набухание которых, очевидно, происходило из-за нарушения мембран во время процесса выделения

MltADP 200 uM

-i—i

ADP 250 MM

rot sue

I t

xADP SO цМ

•о

-300 fi

400 600 BOO

время(сек)_

Нами были проведены сравнительные исследования дыхательных характеристик митохондрий, выделенных на скорости 1000(^ из контрольной интактной ткани миокарда и из экспериментальной ткани "средней" фракции

митохондрий Так же параллельно с измерением скоростей дыхания измерялся мембранный потенциал (ДЧО экспериментальных и контрольных митохондрий Дыхательные характеристики контрольных митохондрий приведены на рис. 1 Скорости дыхания на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи, а так же увеличение скорости дыхания при добавлении АДФ и БССР соответствовали описанным в литературе данным для изолированных митохондрий контрольной ткани миокарда Исследование функции дыхательной системы митохондрий "средней" фракции, выделенных из экспериментальной ткани сердца показало, что максимальная скорость дыхания митохондрий на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи в течение 24 часов инкубации не снижается относительно скорости дыхания контрольных митохондрий (рис. 2, таблица 1) Таблица 1. Максимальные скорости дыхания митохондрий

Рис. 1 Дыхание (верхняя кривая) и мембранный потенциал (A4') (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из интактной ткани миокарда Добавки Mit- митохондрии, 0 5 мг белка, ADP -АДФ, rot -ротенон 1 мкМ, suc - сукцинат ЮмМ, FCCP - FCCP 0 2 мкМ, (глутамат и малат содержался в среде инкубации)

Препарат митохондрий Субстраты дыхания Скорость дыхания (нг ат О/ мг белка) <Х2> N

Контрольные митохондрии * глут +мал 124 22 4

сук +рот 127 25 4

Митохондрии, выделенные из ткани микарда, инкубированной 24 часа в гипоксии** глут +мал 120 26 3

сук +рот 128 25 3

Митохондрии, выделенные из ткани микарда, инкубированной 72 часа в гипоксии** глут +мал 5 5 3

сук +рот 120 30 3

<Х2> - среднеквадратичное отклонение, N - количество экспериментов, * - дыхание в состоянии 3 по Чансу, ** - дыхание не стимулируется разобщителем и АДФ

АЭР ЮОцМ

Го1 511С

I I

РССР

400 600 800

время(сек)

Рис. 2. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный потенциал (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях гипоксии в течение 24 часов Добавки см рисунок 1

При этом фосфорилирующая функция митохондрий экспериментальной ткани полностью нарушена добавление АДФ не стимулирует скорость дыхания,

мембранный потенциал (Д*Р) 5оо после добавления субстратов дыхания незначительно

400

з возрастает, но затем быстро ® спонтанно падает (рис. 2). 200 Сукцинатоксидазная

100 активность остается без о изменений даже через 72 часа инкубации экспериментальной ткани в условиях гипоксии Это показано на рис 3, где видно, что скорость дыхания митохондрий на субстрате второго комплекса (сукцинат) не падает по сравнению со скоростью дыхания

контрольных митохондрий Но уже через 72 часа инкубации ткани миокарда в гипоксии полностью подавляется

малатоксидазная активность митохондрий, т е после добавления субстратов первого комплекса (глутамат и малат) стимуляции дыхания не происходит (рисунок 3 таблица 1) Добавление АДФ не стимулирует скорости дыхания, мембранный потенциал (ДЧ') не возрастает

Результаты проведенных исследований показывают, что система окислительного фосфорилирования митохондрий экспериментальной ткани быстро разобщается в процессе инкубации ткани в условиях гипоксии стимуляция скорости дыхания при добавлении АДФ не происходит При этом функция дыхательной цепи сохраняется длительное время малатоксидазная активность

400 600 800

время(сек)

Рис. 3 Дыхание (верхняя кривая) и мембранный потенциал (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях гипоксии в течение 72 часов Добавки см рисунок 1, КСЫ- 1mMK.CN

регистрируется в течение 24 часов инкубации, а сукцинатоксидазная активность регистрируется в течение 72 часов инкубации

2.2 Выявление цитохром с оксидазной активности митохондрий изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

Исследования на митохондриях, изолированных из экспериментальной ткани, не позволяют получить полную функциональную характеристику всех морфологических типов гетерогенной популяции митохондрий Кроме того, приведенные выше функциональные характеристики митохондрий экспериментальной ткани отражают особенности функционирования суспензии изолированных митохондрий, в то время как огромный интерес представляет получение функциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов исследуемой экспериментальной ткани непосредственно in situ, без разрушения ткани Мы провели исследование на цитохром с оксидазную (ЦО) активность митохондрий кардиомиоцитов после 3 суток инкубации ткани в условиях гипоксии широко известным в литературе с 1968 г методом электронно-микроскопической гистохимии (Seligman et al, 1968, Novikoff and Goldfischer, 1969, Nonaka et al, 1989, Angermuller et al, 1998, Walker and Benzer, 2004) Метод основан на способности цитохрома с окислять 3,3х-диамин0бензидин (ДАБ) ДАБ проникает в межмембранное пространство митохондрий, но не идет в матрикс В комплексе IV (ЦО) дыхательной цепи митохондрий в первом шаге цитохромоксидазной реакции митохондрий происходит окисление ДАБ цитохромом с, что приводит к полимеризации ДАБ-а Полимеры вступают в реакцию с оксидом осмия, образуя осмиофильный осадок Продукт данной реакции, в отличие от методов, основанных на Nadi реакции имеет не капельную форму, а проявляется в виде мелкодисперсного осадка, который более точно выявляет цитохром с оксидазу в митохондриях, заполняя внутрикристное пространство и пространство между ограни-чивающими митохондрию наружной и внутренней мембранами, благодаря чему места активной работы цитохром с оксидазы четко видны на электронно-микроскопических препаратах На фот. 4 а электронно-микроскопическая картина митохондрии кардиомиоцита контрольной ткани на большом увеличении, полученная в результате проведения реакции на цитохром с оксидазную активность Видно, что внутрикристное пространство митохондрии контрольной ткани заполнено электронно-плотным осадком Так же электронно-плотный осадок присутствует между наружной и внутренней, ограничивающих митохондрию мембранами и во внутрикристном пространстве После длительного действия

ИНЕДВ гипоксии картина реакции резко меняется. На фот. 4 б четко видно, что внутри электронно-плотной митохондрии по всей длине мембран крист присутствует мелкодисперсный осадок, в то время как в основной митохондрии реакция на цитохром с - оксидазу

отсутствует (ЦО~). Сравнение картины реакции митохондрий контрольной ткани (фот. 4 а) и картины реакции митохондрий экспериментальной ткани, содержащей мелкую, электронно-плотную митохондрию (фот. 4 б), показывает локальную

сохранность цитохром с оксидазной актив-ности только лишь в мелкой электронно-плотной митохондрии, при I полном отсутствии цитохром с -оксидазной активности в основной митохондрии.

Характерной, удивительной особенностью наших экспериментальных условий является наличие в кардиомиоцитах значительного количества меж-

Фот. 4 а, б. Электронно-микроскопическая картина митохондрий после реакции на цитохром с-оксидазьгую активность: а - митохондрия кардиомиоцита контрольной ткани миокарда, б-митохондрия экспериментальной ткани.

оказалось, что в области межмитохондриальных ЦО+ реакция. В контрольной ткани в

митохондриальных контактов нативной структуры. При исследовании цитохром с-оксидазной активности в наших экспериментальных условиях контактов видна ярко выраженная отличие от экспериментальной

межмитохондриальные контакты нам наблюдать не удалось. По нашему мнению, это можно объяснить тем, что согласно использованной методике ткань инкубируется в течение 3 ч при температуре 37°С. В таких условиях межмитохондриальные контакты нативной ткани разрушаются (Тихова и др., 1988). Тем удивительнее являются результаты наших наблюдений многочисленных межмитохондриальных контактов в экспериментальной ткани, которая также инкубировалась 3 ч при температуре 37°С.

3 Динамика изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях гипоксии.

Чтобы выяснить, не является ли обнаруженное нами явление образования «митохондрий внутри

митохондрий» артефактом условий эксперимента, а также для выяснения ультраструктурного механизма возникновения необычной митохондриаль-ной популяции мы провели исследование состояния ультраструктуры ми-

тохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубируемых 72 ч в условиях гипоксии, через 6, и далее через каждые 12 ч. Через 6 ч инкубации кусочков изолированного миокарда в условиях гипоксии попу-

Фот. 5 а, б. Начальные стадии формирования митохондрии внутри митохондрии, а -появление электронно-прозрачной полости внутри митохондрии, б- перемещение участка матрикса, ограниченного внутренней митохондриальной мебраной, в межмембранное пространство.

ляция митохондрии кардиомиоцитов одинакова по своей ультраструктуре - это органеллы со сжатым, электронно-плотным матриксом, параллельно ориентированными кристами. Характерным ультраструктурным признаком митохондриальной популяции кардиомиоцитов на данное время инкубации являются необычные структурные образования внутри митохондрий. Первоначально в межмембранном пространстве митохондрий возникают незначительные по размеру (расположенные в пределах 1,5 - 2 серийных срезов) электронно-прозрачные замкнутые полости, диаметр которых составляет порядка 0.15 мкм (фот. 5 а, стрелка на рис. а). Далее в эту полость перемещается участок матрикса, ограниченный внутренней митохондриальной мембраной (фот. 5, б). Митохондрия на фот. 5, б, имеет обводненный матрикс, что позволяет детально анализировать организацию этой структуры внутри митохондрии. Стрелкой показано перемещение петлеобразной складки внутренней мембраны с

----примыкающим к

ней матриксом в полость, образованную внутренней митохондрии-альной мембраной. Далее происходит отшнуровывание этого участка матрикса, ограниченного внутренней митохондриальной мембраной. Нужно заметить, что на этой стадии вокруг полости об________ _ ____разуется электронно-плотный слой (фот. 5 а, показано стрел-

Фот. 6 а, б. Образование «митохондрии внутри митохондрии» на 12 ч инкубации ткани в условиях гипоксии: при малом (а) и большом (б) увеличении.

кой). Через 12 ч инкубации ткани миокарда при гипоксии наблюдается увеличение этих структур внутри митохондрий и формирование их мембранного содержимого (фот. 6, а, б). На большом увеличении видно, что эта структура уже имеет

ограничивающие мембраны (фот. 6 а, б). Также видно, что вновь образованная структура не связана с основной митохондрией, кристы митохондрии основной популяции как бы «обрываются», образуя замкнутую полость, окружающую вновь образующуюся структуру. Электронно-плотный слой вокруг этой структуры сохраняется. На данный срок инкубации во все большем количестве митохондрий происходит формирование этих структурных новообразований и в пределах одного среза можно видеть различные стадии этого процесса. То есть процесс формирования новых структур внутри митохондрий происходит не одномоментно во всех митохондриях, а постепенно затрагивает все новые органеллы.

На 24 ч инкубации в условиях гипоксии в ткани присутствует уже значительное число митохондрий, внутри которых можно наблюдать образование мелких, электронно-плотных струкур -предшественников

митохондрий. На этот срок инкубации ткани во вновь образованных структурах отчетливо видны концентрические, электронно-плотные мембраны с электронно-плотным матриксом между ними (фот. 7, а, б).

В течение двух последующих суток инкубации происходит обособление этих структур. Электронно-плотный слой, окружающий вновь формирующуюся структуру исчезает. В то же время, ко вторым суткам изменяется морфологическое состояние митохондрий основной популяции, внутри которых формируется новая структура.

Фот. 7 а, б. Образование «митохондрии внутри митохондрии» на 24 ч инкубации ткани в условиях гипоксии; при малом (а) и большом (б) увеличении.

Происходит обводнение матрикса митохондрий, митохондриальные мембраны становятся как бы лизированными На их фоне четко видно, что во вновь образованных структурах электронная плотность мембран соответствует плотности мембран митохондрий интактного миокарда

К третьим суткам инкубации в ткани присутствуют уже хорошо выраженные, структуры, названные нами как «митохондрии внутри митохондрии» (фот. 1).

Таким образом, проведенное нами исследование динамики ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации ткани в условиях гипоксии в течение 72 часов показывает, что условия гипоксии, очевидно являются сигналом к индукции процесса образования мелких электронно-плотных митохондрий Эти преобразования ультраструктуры митохондрий происходили на фоне практически не измененной общей структуры кардиомиоцитов, что указывает на отсутствие признаков некроза в наших экспериментальных условиях и, следовательно, можно сделать вывод о том, что обнаруженное нами явление образования "митохондрий внутри митохондрий" не является артефактом условий эксперимента

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученная нами на ультраструктурном уровне морфологическая картина изменений митохондриальной популяции кардиомиоцитов под действием гипоксии значительно отличается от имеющихся в литературе представлений В огромном количестве работ по изучению действия гипоксии на ультраструктуру миокарда, авторы единодушно отмечают однотипность изменений митохондрий, характерной реакцией которых, по их мнению, является набухание митохондрий, разрушение внутренней митохондриальной мембраны, а в далеко зашедших стадиях процесса -сохранение лишь наружной митохондриальной мембраны В то же время ряд авторов указывает, что наступающие под влиянием острой гипоксии изменения в ультраструктурной организации мышечных клеток сердца являются обратимыми (Саркисов, Втюрин, 1967)

Обнаруженные нами удивительные ультраструктурные изменения митохондрий кардиомиоцитов, в частности возникновение мелких электронно-плотных митохондрий в наших экспериментальных условиях сопоставимо с хорошо известным в литературе явлением образования промитохондрий в клетках дрожжей ЗассЬаготусеБ сегеушае в анаэробных условиях Возможно, что использованная в этих исследованиях фиксация перманганатом калия не позволила

авторам выявить или возможно вызывала нарушение деградирующих мембран митохондрий дрожжевых клеток, в результате чего был сделан вывод о наличии в клетках только мелких митохондрий с незначительным количеством крист и большого количества свободно расположенных мембран Т е, условия кислородной недостаточности очевидно являются сигналом к индукции процесса образования мелких электронно-плотных митохондрий Также можно предположить, что в наших экспериментальных условиях кислородной недостаточности ультраструктурная перестройка системы митохондриального ретикулума кардиомиоцитов - появление особых структурных образований «митохондрий внутри митохондрий» может быть обусловлена нарушением митохондриального метаболизма АФК генерации и удаления АФК митохондриям и

Четко выраженная функциональная активность цитохром с - оксидазы в электронно-плотных митохондриях, локализованных в межмембранном пространстве основной митохондрии, полностью утратившей функциональную активность, очевидно отражает стремление клетки выжить, сохранив в рабочем состоянии хотя бы часть митохондрии В то же время возможно, что деградация отдельных митохондрий основной популяции, сопровождающаяся появлением мелких электронно-плотных митохондрий - один из возможных механизмов митоптоза, направленного на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью

Ультраструктура межмитохондриальных контактов была описана уже давно (Бакеева и др, 1982) Использование классического метода обработки ткани миокарда коллоидным лантаном показало, что лантан откладывается избирательно в зоне межмитохондриальных контактов, но не сплошным слоем, а в виде упорядоченно расположенных электронно-плотных гранул, аналогично отложению в зоне вставочного диска, где он выявляет морфологию межклеточного контакта (Сударикова, 2000). Нам удалось показать, что в области межмитохондриальных контактов активно работает IV комплекс дыхательной цепи Полученный нами результат позволяет говорить о том, что в популяции митохондриальной ткани, находящейся в условиях длительного стресса, значительно увеличивается число активно работающих контактов между митохондриями, что приводит к объединенной, слаженной работе этих органелл в условиях тяжелого поражения кардиомиоцитов Мы предполагаем, что это является защитной мерой, направленной на выживание ткани в условиях стресса

выводы

1 Установлено, что в экспериментальных условиях инкубации изолированных кусочков миокарда при гипоксии в течение 72ч при 20°С в мышечных клетках миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит, ультраструктурные признаки некроза отсутствуют и сохраняется сукцинатоксидазная активность митохондрий

2 Впервые обнаружена неизвестная ранее локальная перестройка внутренней организации митохондрий с образованием трехмерно упорядоченных структур, возникающая в экспериментальной ткани миокарда наряду с хорошо известными в литературе для гипоксии изменениями ультраструктуры митохондрий внутрикристными включениями, септированными митохондриями Показано, что обнаруженные структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны обратимы - при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0 25 М сахарозе они исчезают

3 Показано, что в процессе инкубации изолированных кусочков миокарда в условиях гипоксии в кардиомиоцитах экспериментальной ткани возникает особая популяция мелких электронно-плотных митохондрий, локализованных в межмембранном пространстве крупных электронно-светлых митохондрий основной популяции этих органелл кардиомиоцитов

4 Установлено, что структурное образование «митохондрий внутри митохондрий» не является артефактом условий эксперимента - эти структуры сохраняются в процессе выделения митохондрий Популяция мелких электронно-плотных митохондрий может быть выделена как самостоятельная фракция

5 Обнаружено, что возникающие в митохондриях основной популяции кардиомиоцитов мелкие электронно-плотные митохондрии обнаруживают хорошо различимую цитохром с-оксидазную активность по всей длине образующихся крист, в то время как основная митохондрия, внутри которой формируется новая органелла, частично или полностью утрачивает цитохром с- оксидазную активность

6 Впервые был установлен и детально исследован процесс возникновения митохондрий внутри митохондрий в динамике

7 В кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда после длительного действия гипоксии обнаружены межмитохондриальные контакты нативной структуры, характеризующиеся повышенной стабильностью Межмитохондриальные контакты экспериментальной ткани, в отличие от

межмитохондриальных контактов контрольной ткани, сохраняют нативность при инкубации в течение 3 часов при температуре 37 °С

8 Впервые получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов методом электронно-микроскопической гистохимии Показано, что в структуре межмитохондриальных контактов четко выявляется цитохром с оксидазная активность

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Tonshin А А, Solodovnicova IМ , Saprunova V В , Bakeeva L Е , Yagujinsky L S Functional activity of mitochondria isolated from myocardium tissue after apoptosis induction by anoxia // Mitochondion 2002 Vol 1 No 6 P 529

2 Тоныпин A A, Сапрунова В Б Солодовникова И М Бакеева JIЕ Ягужинский JIС Функциональная активность и ультраструктура митохондрий, выделенных из апоптозной ткани сердца // Биохимия, 2003,68, 1070-1079

3 Сапрунова В Б, Солодовникова И М , Бакеева Л Е, Ягужинский J1 С Ультраструктура митохондриального аппарата кардиомиоцитов при апоптозе, индуцированном аноксией // Цитология 2003 V 45 Р 922-923

4 Солодовникова И М , Сапрунова В Б , Бакеева Л Е , Ягужинский Л С Динамика изменений ультраструктры митохондрий кардиомиоцитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях аноксии //Цитология 2006 48(10) 848-855

5 Т Н Муругова, В И Горделий, А И Куклин, И М Солодовникова. Л С Ягужинский Регистрация трёхмерно упорядоченных структур в интактных митохондриях с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов //Кристаллография 2007 V 52 Р 521-524

6 В Б Сапрунова, И М Солодовникова, Л Е Бакеева Выявление цитохром с оксидазной активности в митохондриях кардиомиоцитов изолированной ткани миокарда при длтельном действии гипоксии.// Цитология 2007 в печати

7 Тоныпин А А , Солодовникова И М , Сапрунова В Б , Бакеева Л Е , Ягужинский Л С Функциональная активность митохондрий, выделенных из ткани сердца, после индукции апоптоза в условиях аноксии // Тезисы докладов II Всероссийской конференции "Клинческие и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология) в сб "I всероссийский конгресс "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии" Материалы конгресса" Москва 16-19 октября 2002 г С 482

8 Солодовникова И М . Сапрунова В Б Бакеева Л Е, Ягужинский Л С Ультраструктура митохондриального аппарата кардиомиоцитов при апоптозе, индуцированном аноксией// Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пушино 2003 С 272-273

9 Solodovnikova 1М, Saprunova VB, Bakeeva LE, Tonshin AA, Yaguzhinsky LS, "BHT action on the dynamics of ultrastruetural changes of mitochondria in myocardium tissue after apoptosis induction by anoxia " Abstracts of FEBS Congress 2004, Blackwell Publishing, p 178

10 Бакеева Л E , Солодовникова И M , Сапрунова В Б Митохондрия внутри митохондрии (условия возникновения, динамика образования) // Тезисы докладов Ш Съезда биофизиков России Воронеж 24-29 июня 2004, С 396-397

11 Солодовникова И М, Сапрунова В Б Бакеева Л Е, Ягужинский Л С Новообразование митохондрий при апоптозе, подавление антиоксидантами Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пушино, 2005, Р 284

12 Солодовникова И М. Сапрунова В Б Бакеева ЛЕ, Ягужинский Л С Новообразование митохондрий в условиях аноксии динамика процесса и исследование функциональной активности Тезисы докладов на XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка), 2006, Р 271

13 T N Murugova, V I Gordeliy, A Kh Islamov, A I Kuklin, I M Solodovnikova. L S Yaguzhinsky Detection of three-dimensional structures of inner mitochondrial membrane under low-amplitude swelling by small angle neutron scattenng Biochim Biophys Acta, 2005 V 14 P

14 T N Murugova, V I Gordehy, A I Kuklin, AI Ivankov, 1 M Solodovnikova.VI Yurkov, L S Yaguzhinsky "Investigation of rat heart mitochondria by small angle neutron scattenng" // Thesis of International Small-Angle Scattenng Workshop is devoted to Yu M Ostanevich, 2006, p 45, Dubna, Russia

15 T H Муругова, В И Горделий, А И Куклин, А И Иваньков, И М Солодовникова. В И Юрков, Л С Ягужинский Изучение структуры митохондрий с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов Тезисы Первой Всероссийской школы-семинара (Современные достижения бионаноскопии) //Физ-фак МГУ Москва, 2007 стр 40-41

524-525

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Солодовникова, Ирина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Особенности ультраструктуры митохондрий.

2. Ультраструктура митохондрий кардиомиоцитов при моделирование гипоксических состояний миокарда

3. Ультраструктурные исследования миокарда при изучении роли апоптоза в развитии кардиоваскулярных повреждений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Ультраструктура кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

2. Исследование функциональной активности митохондрий кусочков изолированной ткани миокарда, инкубированных в условиях длительной гипоксии.

2.1.Особенности системы окислительного фосфорилирования митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях длительной гипоксии.

2.2.Выявление цитохром с-оксидазной активности митохондрий изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

3. Динамика изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях гипоксии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии"

Вопросы взаимосвязи структуры и функции митохондрий постоянно находятся в центре внимания широкого круга исследователей. В последние годы произошли и происходят революционные события в митохондриологии. В традиционные представления о роли митохондрий в клетке внесены существенные коррективы. Ещё сравнительно недавно наши представления о митохондриях сводились только как к энергетическим станциям клетки, где роль митохондрий в развитии патологии ограничивалась нарушением энергообеспечения, и исключительно с этих позиций рассматривались все ультраструктурные преобразования митохондрий, в то время как многие ультраструктурные состояния митохондрий невозможно объяснить в свете таких представлений. В настоящее время основным компонентом в развитии многих патологий считается окислительный стресс. Термин «окислительный стресс» не имеет на сегодня чёткого определения, он используется для широкого круга разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих как повышенную внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК), так и окислительное повреждение клетки. Как известно, ткань миокарда является одним из активных потребителей кислорода. Снижение уровня кислорода - гипоксия вызывает значительные нарушения структуры и функции миокарда. Наиболее чувствительными к гипоксии структурами клетки являются митохондрии, поэтому наибольший интерес представляет изучение состояния митохондрий. Кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации приводит не только к нарушению энергетики клетки, но и резко изменяет скорость генерации АФК митохондриями.

Не смотря на огромное количество работ и неослабевающий интерес, на протяжении всего времени изучения ультраструктуры митохондрий, к состоянию митохондрий в условиях гипоксии, нехватка фактических данных пока ещё не позволяет составить полное

Обзор литературы.

I Особенности ультраструктуры митохондрий.

Митохондрии являются доминирующими органеллами в мышечной ткани сердца. Наличие большого количества митохондрий в сердечной мышце связано с её способностью к непрерывной работе в течение всей жизни организма. Митохондрии как органеллы клетки были открыты в исследованиях в световом микроскопе в конце 19 в. Исследования внутренней организации митохондрий начались с работ Палада (Palade 1952, 1953, 1956) и Шостранда (Shöstrand, 1953, 1953а, 1953в, 1953с, 1954, 1956) установивших, что митохондрии во всех исследованных ими клетках позвоночных и беспозвоночных животных, а так же растений имеют сходную ультраструктурную организацию. Палад на основе трёхмерной реконструкции показал, что митохондрия состоит из системы двух замкнутых мембран. Внутренняя митохондриальная мембрана образует складки различной длины, направленные в полость митохондрии, которые являются неполными перегородками или внутренними гребнями. Палад назвал их термином "cristae mitochondriales". Основополагающим явилось заключение Палада о том, что митохондриальные мембраны образуют два пространства, две камеры. Пространство, ограниченное внутренней митохондриальной мембраной и заполненное электронно-плотным веществом, принято называть митохондриальным матриксом. Пространство между наружной и внутренней митохондриальной мембраной или межмембранное пространство на электронно-микроскопических фотографиях при обычных методах фиксации (глутаровым альдегидом с последующей фиксацией 0s04) оптически пустое, электронно-прозрачное. Пиз (Pease 1962), применив разработанную им методику фиксации формалином, обнаружил, что в межмембранном пространстве митохондрии содержится вещество белкового происхождения с такими же свойствами для различных металлических красителей, как и материал митохондриального матрикса. Боровягин, используя различные специальные методические подходы фиксации, так же показал наличие белка в межмембранном пространстве митохондрий (Боровягин В.Л.,1963; Borovjagin VL et al., 1973). Две митохондриальные мембраны -наружная и внутренняя, несмотря на значительные различия белкового и липидного состава, а так же функционального назначения, практически не различимы с точки зрения их ультраструктурных параметров (Erenster, 1969). Единственной отличительной чертой является наличие у внутренней митохондриальной мембраны характерных грибовидных структур, которые отсутствуют у препаратов наружной мембраны. Открытие этих грибовидных субъединиц принадлежит Фернандес-Морану (Fernandes-Moran 1962). Негативное окрашивание вывернутых субмитохондриальных частиц выявляет грибовидные выросты, которые состоят из трёх частей: 1) сферической или многогранной головки (80-100А диаметром), 2) цилиндрической ножки (около 50 А в длину и 30-40 А в ширину), 3) основания, располагающихся по всей поверхности мембраны. Как показал Ракер (Ракер Е., 1965), выросты исчезают после сильного механического перемешивания суспензий частиц, что сопровождается потерей способности синтезировать и расщеплять АТР, а также появлением в растворе сферических частиц размером в 9 нм и АТР-азной активности. Реконструкция этих сферических частиц с мембраной пузырьков возвращает им АТР-синтазную и АТР-азную активности. Из этих наблюдений Ракер сделал вывод о том, что выступы представляют собой каталитическую часть Н+- АТР-синтазы, т.е. фактор Fi. Впоследствии это заключение было подтверждено электронно-микроскопическим исследованием субмитохондриальных частиц, обработанных антителами к фактору Fi. После отщепления фактора F-i в мембране остаётся часть Н+ - АТР-синтазы, ответственная за перенос ионов Н+ (фактор Fo). А современные исследования показали, что АТФ-синтаза кроме трёх известных частей имеет ещё одну 4) четвёртую боковую часть в виде ноги, являющейся частью статора. Современные представления о трёхмерной структурно-функциональной организации грибовидных образований внутренней митохондриальной мембраны показаны на рис.1.

ADP+P| зРа

Рис. 1. Структура и функции АТР-синтазы. F^ (субъединицы азРзубе) и F0 (субъединицы аЬ2Сю-15) - два мотора, обменивающиеся энергией за счет вращательного взаимодействия. Субъединицы ротора (YEC10-15) [обозначены голубым цветом] заякорены в мембране. Субъединицы статора (аЬ2а3Ззб), обращены в цитоплазму [обозначены оранжевым и зеленым цветами]. В процессе синтеза АТР связанные ионы (оранжевые), переходя через Fo-мотор из периплазмы в цитоплазму, вызывают вращение и активацию Fi-мотора для синтеза ATP (по Dimroth et al., 2006).

Отличительной особенностью ультраструктуры митохондрий является характерная изменчивость их внутренней организации в ответ на самые различные воздействия физиологического и ингибиторного характера. В 70-х годах на основе результатов большого количества детальных исследований проблема взаимосвязи структуры и функции митохондрий считалась в основном выясненной. Основное внимание в этот период времени было сосредоточено на изучении причин и характера изменчивости внутренней организации митохондрий на изолированных митохондриях. С развитием этого направления электронно-микроскопического исследования митохондрий сторонники конформационной гипотезы сопряжения окисления и фосфорилирования связывали возможность решения основной проблемы биоэнергетики -выяснения механизма накопления энергии при переносе электронов.

При работе с изолированными митохондриями был обнаружен феномен "негативной" морфологической картины изолированных митохондрий по сравнению с митохондриями в ткани (Бакеева Л.Е. и соавт., 1972; Bakeeva et al, 1972). Сущность этого феномена заключается в том, что митохондрии, выделенные в изотонических растворах сахарозы или солей, по сравнению с митохондриями ткани характеризуются резко увеличенным объёмом межмембранного пространства и соответственно уменьшенным объёмом матрикса. Вернуть изолированным митохондриям соотношение объёмов матрикса и межмембранного пространства, характерное для митохондрий в ткани, оказалось возможным включением в среду выделения или среду инкубации высокомолекулярных соединений (поливинилпирролидон, сывороточный альбумин).

Было показано, что морфология изолированных митохондрий - это конфигурация и пространственное расположение внутренней мембраны, соотношение объёмов матрикса и межмембранного пространства. Общий объём митохондрии меняются в довольно широких пределах в ответ на изменения состава среды инкубации (Hackenbrock 1968; Green et al, 1966, 1968, 1969, 1971; Penniston J. et al., 1967; Wiiliams C.A., Green D.E., 1970; Бакеева Л.Е. и соавт., 1972). Основные факторы, влияющие на ультраструктуру изолированных митохондрий - субстраты окисления, проникающие ионы, ингибиторы окислительного фосфорилирования, тоничность среды инкубации. Стремление классифицировать морфологические изменения митохондрий в этих условиях позволил] сначала Хакенброку (Hackenbrock 1966, 1968, 1969) выделить основные конфигурационные состояния митохондрий на суспензии изолированных митохондрий печени, соответствующие состояниям дыхательной цепи по Чансу (Chance В. et al., 1955), а далее Грином (Green, 1968) была предложена классификация морфологического состояния изолированных митохондрий кардиомиоцитов, возникающих при различных функциональных нагрузках этих органелл. Грином впервые были введены в морфологию митохондрий понятия: энергизованное, деэнергизованное, агрегированное, ортодоксальное, твистованное (энергизованно-скрученное) состояния ультраструктуры митохондрий.

В результате бурного развития этих исследований, постоянно встречающиеся на электронно-микроскопических фотографиях незначительные по размеру округлые очертания изолированных митохондрий, сформировали представление о митохондриях как о мелких, не связанных друг с другом органеллах. Такое представление об общей морфологии митохондрий не смогли изменить даже первые электронно-микроскопические наблюдения гигантских митохондрий, сделанные на одноклеточных организмах: Euglena (Leedale, Buetow,

1970), Saccharomyces cerevisiae (Hoffman, Avers, 1973), Polytomella agilis (Burton, Moore, 1974), Chlorella fusca (Atkinson et al., 1974), Polytoma obtusum (Siu et al., 1976). Поэтому первоначально сложилось мнение, что протяженные гигантские митохондрии встречаются только в одноклеточных эукариотах. Последующими электронно-микроскопическими исследованиями ряда авторов гигантские митохондрии были обнаружены и в различных тканях многоклеточных животных: в печени взрослых крыс (Brandt et al., 1974), лимфоцитах мыши (Rancourt, 1975), в клетках проксимального и дистального отделов нефрона почки крысы (Bergeron et al., 1980).

В скелетной мышце была обнаружена сложноорганизованная пространственная система митохондрий, образованная гигантскими митохондриями (Бакеева и др., 1977; Kirkwood S.P. et al., 1986), объединёнными посредством специальных мембранных структур -межмитохондриальных контактов и определённая авторами (Бакеева и др., 1977) как митохондриальный ретикулум. Эти данные подтвердили гипотезу В.П. Скулачёва о существовании системы "внутриклеточных электрических проводов", объединяющих миллионы мембранных белков, генерирующих потенциал (ферментов дыхательной цепи и Н+-АТФаз) в единую энергопроизводящую систему клетки (Скулачёв, 1969; Skulachev,

1971). В соответствии с этой гипотезой электрическая разность потенциалов (мембранный потенциал Дф), которая создаётся за счёт работы встроенных в сопрягающую мембрану дыхательных ДрН-генераторов, может транспортироваться вдоль мембраны и расходоваться в других местах, где сосредоточены потребители ДрН (АТФ-синтазный комплекс). Система митохондриального ретикулума, по мнению В.П.Скулачёва, отвечает всем требованиям для того, чтобы осуществлять эффективную передачу энергии, и может претендовать на роль постулированных им "внутриклеточных электрических проводов".

Единая система митохондриального ретикулума так же присутствует и в сердечной мышце (Бакеева Л.Е. и соавт., 1982, Bakeeva а1., 1985). Если в скелетной мышце митохондрии представлены сложноразветвлёнными гигантскими формами, имеющими большую протяжённость, то в кардиомиоцитах митохондриальный ретикулум представлен большим количеством крупных митохондрий, соединённых между собой как в поперечном, так и в продольном направлениях (по отношению к миофибриллам) специальными мембранными контактными структурами - межмитохондриальными контактами.

Наряду с глубокими различиями в структурной организации митохондриального аппарата сердечной и скелетной мышц общая специфическая особенность хондриома этих тканей - объединение митохондрий в единую систему посредством межмитохондриальных контактов. Отличительная особенность митохондриального аппарата кардиомиоцитов - наличие огромного количества межмитохондриальных контактов (Бакеева и др., 1982). Межмитохондриальные контакты (или зоны соединения отдельных митохондрий) в кардиомиоцитах и скелетных мышцах имеют одинаковое строение. Методом серийных ультратонких срезов было показано, что в центральной части контакта внешние мембраны двух соседних митохондрий максимально сближены и как бы сливаются в одну. И наружные и внутренние митохондриальные мембраны в зоне контакта характеризуются повышенной электронной плотностью. Межмембранные пространства в зоне межмитохондриальных контактов так же выглядят более электронно-плотными, чем в других участках митохондрий, за счёт наличия в них электронно-плотного материала (рис.2).

Рис. 2. Структурная организация межмитохондриального контакта (по Бакеевой и др., 1982г.)

Проведённое этими авторами исследование структуры межмитохондриальных контактов методом замораживания - скалывания показало, что сколы области митохондриальных мембран, принимающих участие в образовании межмитохондриальных контактов, отличаются от сколов остальных участков митохондриальных мембран (Бакеева и др., 1985). Для этих участков мембран характерна "неправильная" поверхность разрыва: на поверхностях скола внутренняя митохондриальная мембрана всегда покрыта фрагментами наружной митохондриальной мембраны. Такой характер разрыва мембран в литературе объясняется наличием специальных контактов между мембранами в этих зонах (Knoll, Brdiczka, 1982; Klug et al., 1974). Кроме этого на сколах митохондриальных мембран были выявлены скопления внутримембранных глобулярных частиц в области межмитохондриальных контактов (Бакеева и др., 1985). Т.е. межмитохондриальный контакт не есть результат простого прилегания митохондрий, а представляет собой особым образом организованную мембранную контактную структуру.

Как было показано в работе Тиховой с соав. (Тихова и др., 1988) межмитохондриальные контакты в процессе выделения митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М сахарозе не сохраняются. Во фракциях митохондрий наблюдаются лишь отдельные простые прилегания между внешними мембранами двух близко расположенных митохондрий. Авторы предполагают, что одной из возможных причин исчезновения межмитохондриальных контактов в процессе выделения митохондрий является несбалансированное онкотическое давление по обе стороны наружной митохондриальной мембраны, приводящее к значительному обводнению межмембранного пространства и сжатию матрикса. Так, при добавлении в среду выделения митохондрий ПВП в концентрации 6 % во фракциях митохондрий авторам удалось наблюдать межмитохондриальные контакты нативной структуры. Однако количество таких межмитохондриальных контактов было незначительно.

В митохондриях печени, изолированных в 0,25 М сахарозе были обнаружены особые межмембранные контакты внутри митохондрий -локальные соединения, контакты наружной и внутренней митохондриальных мембран (Hackenbrock, 1968, 1975). На ультратонких срезах такие контакты представляют собой зоны слияния или близкого прилегания наружной и внутренней мембран митохондрии. По данным Хакенброка максимальный диаметр этих контактов 20 нм, на одну митохондрию диаметром 1мкм может приходиться до 115 таких контактов. При исследовании изменения структуры изолированных митохондрий печени при разных энергетических состояниях было обнаружено, что наличие контактов между наружной и внутренней митохондриальными мембранами определяется функциональным состоянием митохондрий (Knoll, Brdiczka, 1982). Количество этих контактов значительно больше в суспензии митохондрий в условиях фосфорилирования по сравнению с исходной суспензией только что выделенных митохондрий, а во фракции митохондрий, суспендированных в дистиллированной воде они отсутствуют. Хакенброк (Hackenbrock, 1975) предположил, что точки контактов наружной и внутренней митохондриальных мембран это не просто места плотного прилегания или близкого расположения митохондриальных мембран, а специальным образом организованные зоны мембранного контактирования, подобные межклеточным контактам. Он высказал гипотезу, что эти контакты могут быть устроены и функционировать подобно плотному межклеточному контакту, осуществляя транспорт различных метаболитов между цитоплазмой клетки и матриксом митохондрий. Хакенброк высказывает предположение, что в местах этих контактов могут быть локализованы атрактилозид- чувствительные АТФ -АДФ - специфические переносчики. В последствие иммунохимическими методами непосредственно было показано, что в местах контактов наружной и внутренней митохондриальных мембран происходит энергозависимый транспорт белков внутрь митохондрий (Schatz, 1979; Neupert, Schatz, 1981; Gasser et al., 1982; Schwaiger M. et al., 1987; Schulke et al., 1997). Авторы инкубировали изолированные митохондрии дрожжей с клеточным экстрактом, содержащим только что синтезированные радиоактивные белки. При этом, останавливая реакцию через разные промежутки времени, наблюдали с помощью авторадиографии, что митохондриальные белки, кодируемые ядерным геном, транспортируются через контакты наружной и внутренней митохондриальных мембран и избирательно включаются в митохондрии. Причём белки наружной и внутренней митохондриальных мембран, матрикса и межмембранного пространства находят свой путь к соответствующему компартменту митохондрии.

Таким образом, к настоящему времени накоплены обширные сведения об ультраструктурной организации митохондрий, сделана успешная попытка углубиться в область изучения закономерностей функциональных изменений ультраструктуры митохондрий, найдены факты первостепенной важности о состоянии ультраструктуры митохондрий при изменении их функционирования, но в то же время на фоне огромного количества исследований состояния ультраструктуры митохондрий при развитии патологических процессов, и прежде всего в сердечной мышце, нет единого представления о закономерностях и функциональном значении изменений ультраструктуры митохондрий при развитии патологий, обусловленных дефицитом кислорода.

II Ультраструктура митохондрий кардиомиоцитов при моделировании гипоксических состояний миокарда.

На протяжении всего периода ультраструктурного изучения митохондрий, проблема состояния ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов при экспериментально вызванной кислородной недостаточности, которая имеет место при инфаркте миокарда, привлекает большое внимание исследователей. Ещё в конце 50-х годов прошлого века началось электронно-микроскопическое изучение ишемической ткани миокарда. Для этого создавались специальные модели и использовались различные методические приёмы. В большинстве это модели гипоксии, вызванной различными причинами: нарушением венечного кровообращения, искусственно вызванной кровопотерей, помещение животных в камеру с пониженным атмосферным давлением, с пониженным содержанием 02 и т.д. К настоящему времени в литературе огромное количество работ, посвященных исследованию ультраструктурной организации кардиомиоцитов при моделировании этих состояний миокарда.

Наиболее широко распространено исследование миокарда при перевязывании коронарной артерии сердца от 2-3 минут до 10-12 суток по методу Джонса и Олсона (Johns L.P., Olson, 1954). В такой экспериментальной модели подопытным животным после анестезии вскрывают грудную клетку и перевязывают коронарную артерию. Ультраструктурные изменения ишемического миокарда на данной модели впервые были описаны Р.Брайентом и соавт. (R.Bryant et. al, 1958). Они проводили исследования на взрослых белых крысах, перевязывая им коронарную артерию, исследовали животных через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 24 и 48 часов. При электронно-микроскопических исследованиях авторы показали, что митохондрии во времени набухают. Кроме этого, было обнаружено появление уже через 2 часа в исследуемых кусочках ткани большого числа липидных тел, которые находились в тесном контакте с набухшими и вакуолизированными митохондриями и пузырьками эндоплазматического ретикулума. Авторы обращают внимание на тот факт, что ультраструктурные изменения митохондрий при ишемии происходят сравнительно быстрее, чем при автолизе. Кауфельд и Клионский (Caulfield, Klionsky, 1959) проводили исследования на аналогичной гипоксической модели и уже через 5 минут развития ишемии показали набухание митохондрий и конденсацию хроматина ядра. По мнению авторов нарушения ультраструктурной организации миокарда через 20 мин развития ишемии можно сравнить с нарушениями ультраструктурной организации мышечных волокон сердца соответствующей 2-м - 3-м часам автолиза. Другими авторами при таком экспериментальном подходе так же было показано набухание митохондрий уже через 5 минут после перевязки коронарной артерии левого желудочка сердца крысы: Саркисов и Втюрин (Саркисов и Втюрин, 1967), Jennings и соавт.( R.Jennings et al.,1957, R.Jennings et al.,1960, R.Jennings et al.,1965; Yanagja N., 1994).

Лихтиг и соавт. (C.Lichtig et. al, 1975a, 1975b) на биопсийном материале сердца свиньи показали набухание митохондрий, обусловленное ишемией. В этой модели была пережата коронарная артерия левого желудочка. Ткань миокарда исследовали после 5, 10, 15 и 20 мин ишемии. Уже через 10 мин ишемии внутри митохондрий наблюдалась дезориентация крист. Через 20 мин развивался отёк кардиомиоцитов, который приводил к набуханию митохондрий и нарушению характерной для кардиомиоцитов пространственной организации митохондриального аппарата: митохондрии располагались произвольно на значительном расстоянии друг от друга.

Большой интерес представляют работы Чена с соавт. (C.Chen et al., 1996; C.Chen et al., 1997a, 1997b; C.Chen et al., 2000; Lai T. et al., 2000), получивших иные ответы ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов на условия аноксии. С.Чен с соавт. (C.Chen et al., 1996) исследовали модель перфузируемого сердца свиньи, в котором в течение 24 часов создавался стеноз коронарной артерии, а затем проводилась реперфузия в течение 7-28 дней. В миокарде левого желудочка встречались кардиомиоциты, в которых атрофичные миофибриллы располагались по периферии клетки. Митохондрии в этих кардиомиоцитах имели более мелкие размеры, чем митохондрии в неповреждённых кардиомиоцитах и содержали многочисленные кристы. Такие кардиомиоциты обычно были окружены неповреждёнными клетками.

Отдельно необходимо остановиться на подробных исследованиях ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов ишемически повреждённой ткани миокарда, проводимых с 1957 г. Р. Дженнингсом (R.Jennings et al.,1957, R.Jennings et al.,1960, R.Jennings et al.,1965, P.Herdson et al., 1965, R.Jennings et al.,1969, R.Jennings et al.,1972, D.Whalen et al.,1974, R. Kloner et. al, 1974, Tanaka M. et al, 1991; R.Jennings, 1988; R.Jennings, 1991). Исследования выполнялись на сердце собак, перед вскрытием грудной клетки животным делали анестезию, проводили искусственную вентиляцию лёгких. Далее перевязывалась коронарная артерия левого желудочка. Изучалось несколько вариантов воздействия гипоксии на сердечную мышцу: 1) 40 мин и 60 мин ишемии, 2) 40 мин ишемии и 2, 5, 10, 20 мин реперфузии, 3) 15 мин ишемии и 2 мин реперфузии и 4) прооперированные контрольные животные без перевязки артерии. Ультраструктура митохондрий менялась в зависимости от условий экспериментов. Через 40 мин ишемии часть митохондрий была набухшая с увеличенным разреженным матриксом. Другая часть митохондрий оказалась разрушенной. Через 60 мин гипоксии митохондрии уже содержали аморфные плотные тела. По литературным данным появление аморфных тел является неоспоримым доказательством необратимости повреждения. После 40 мин ишемии была проведена 2-х минутная реперфузия, и авторы наблюдали появление гранулярных и аморфных внутримитохондриальных плотных тел в пределах одной и той же митохондрии. Через 5 мин реперфузии гранулярные плотные тела были более выражены, чем через 2 мин. Через 20 мин реперфузии большие гранулярные плотные внутримитохондриальные тела частично или полностью были окружены мембранами крист.

Интересные данные об изменении ультраструктуры митохондрий в перфузированном сердце собаки при шунтировании лёгочной артерии были получены Котмейером и Витом (С. Kottmeier, М. Wheat, 1966). Электронно-микроскопические исследования проводились на биопсийных кусочках из левого желудочка сердца. Через 60 мин шунтирования при нормотермии в популяции митохондрий встречались дегенеративные митохондрии с просветлённым матриксом и фрагментацией крист. Через 90 мин шунтирования при гипотермии 20°С уже все митохондрии имели просветлённый матрикс и фрагментацию крист. После 120 мин гипотермии при 20°С митохондрии набухали очень сильно. В условиях, когда авторы пережимали аорту в течение 90 мин при нормотермии, а затем в течение 30 мин возобновляли кровоток, митохондрии приобретали сферическую форму, в них происходило просветление матрикса таким образом, что митохондрии приобретали вид мячей для гольфа. Наблюдалась перестройка крист, соответствующая по терминологии Грина твистованному (энергизованно-скрученному) состоянию ультраструктуры митохондрий.

Распространёнными являются модели гипоксии на изолированном сердце. Одним из примеров таких работ можно привести работу Р. Олсона и соавт. (К.О^оп е! а1, 1971) на изолированном сердце белых крыс, перфузированном по обычной методике Лангендорфа (1апдепс1ог1Т О., 1895). В работе были использованы две газовые смеси: сначала подавалась Ог-95% и С02-5%, которая затем была заменена на 1Ч2-95% и С02-5% для индукции аноксии в ткани. Температура поддерживалась 37°С. Электронно-микроскопические исследования проводились на маленьких кусочках ткани правого желудочка сердца через 3 и 7 мин после действия аноксии. По сравнению с нормальной тканью миокарда в ткани, подвергшейся аноксии митохондрии незначительно меняли свою ультраструктуру: через 3 мин регистрировалось набухание и, как считают авторы, более мелкие соседние митохондрии сливались друг с другом. Через 7 мин аноксии продолжалось набухание митохондрий и, по мнению авторов, появлялись гигантские митохондрии с фрагментированными и "плавающими" кристами. Однако в этих электронно-микроскопических исследованиях не были использованы методики серийных ультратонких срезов, которые бы позволили более точно охарактеризовать произошедшие изменения ультраструктуры митохондрий.

В работах В.Кешкемети и соавт. (КесэЬкетей V., Ва1одИ I., 1995; 2000) были получены аналогичные результаты по действию гипоксии/реоксигенации на ультраструктуру ткани изолированного перфузированного сердца свиньи. Сначала подавался буфер Кребса-Хензеляйта (Krebs Н., Henseleit К., 1932), содержащий газовую смесь, состоящую из 02-95% и С02-5%, а затем в течение 30 мин создавалась аноксия: раствор Кребса уже содержал N2-90% и С02-Ю%. Затем в течение 30 мин проводилась реоксигенация. При исследовании ультраструктуры кардиомиоцитов был обнаружен отёк клеток, митохондрии были набухшими, в них была хорошо различима фрагментация крист. Несколько иные данные по состоянию ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов при действии аноксии были получены Джанотте с соавт. (С.Ganóte et al., 1975), которые исследовали действие аноксии на изолированное перфузированное сердце белых крыс. Изолированные сердца перфузировались при 37 °С 1) с 02 в течение 120 мин - контроль, 2) с N2-95% и С02-5% - в течение 30, 60 и 90 мин, 3) с N2 - 30, 35, 40, 45, 50 и 55 мин вместе с 02 перфузией в течение 120 мин. Кардиомиоциты перфузированного сердца в кислородной среде имели нормальную ультраструктуру. После действия аноксии ультраструктура кардиомиоцитов, в том числе и митохондрий заметно менялась. Через 30 мин аноксии митохондрии выглядели менее плотными, становились немного набухшими по сравнению с контролем. Через 60 мин аноксической перфузии ядерный хроматин конденсировался, оставляя светлые пространства в нуклеоплазме. Митохондрии ёщё более набухали, плотность матрикса снижалась, гранулы в матриксе не выявлялись. Встречались отдельные митохондрии, содержащие аморфные уплотнения в матриксе. Через 90 мин аноксии конденсация ядерного хроматина была более выражена, обнаруживалось больше митохондрий, содержащих аморфные уплотнения. После непродолжительной реоксигенации (3 мин) митохондрии ещё заметнее набухали, аморфные уплотнения встречались во многих митохондриях. Хроматин ядра конденсировался сильнее. Если реоксигенация проводилась более длительное время (70, 80, 85 мин), то повреждения в митохондриях становились более заметными. На фоне набухания митохондрий появлялось больше аморфных уплотнений в матриксе, которые имели гораздо большие размеры. Так^же в матриксе митохондрий обнаруживались различные гранулярные включения, такие как кольцевые (округлые или овальные) гранулярные плотные тела, в которых центральные участки выглядели пятнистыми с очень маленькими электронно-плотными гранулами. Образование гранулярных плотных тел кольцевидного типа, по мнению авторов, связано с накоплением фосфата кальция. Авторы так, же отмечают появление в митохондриях локальных участков крист с электронно-плотным материалом во внутрикристном пространстве, который имеет вид двойных линий, а так же описывают появление паракристаллических структур в отдельных кристах.

В работах Н.Лосева и соавт. (Н.И.Лосев и соавт., 1982; Н.И. Лосев и соавт., 1988) подробно исследовано состояние миокарда при моделировании гипоксии на целом организме путём понижения содержания 02 во вдыхаемом воздухе. Эти авторы показали, что пребывание кроликов в газовой среде с содержанием Ог 8-10% сопровождалось гиперфункцией сердца. По данным цитохимических исследований отмечалось неравномерное выпадение гранул диформазана в саркоплазме кардиомиоцитов в реакциях на сукцинатдегидрогеназу (СДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г-6-ФДГ), ЫАРН и ЫАОРН и снижение их активности до 80-85% от контрольного уровня. При электронно-микроскопическом исследовании миокарда авторы отмечали во многих митохондриях увеличение количества крист, но наряду с этим образование крупных одноконтурных вакуолей, занимающих 1/3 органеллы. Кроме этого авторы описывают возникновение гигантских митохондрий. В некоторых кардиомиоцитах, по наблюдению авторов, митохондрии образовывали скопления различной величины, эти митохондрии содержали много крист, плотный матрикс, но и имели крупные очаги "гомогенизации" структуры митохондрий. Так же встречались митохондрии с полностью разрушенными кристами.

Наряду с нормобарической гипоксией эти авторы так же исследовали животных в условиях гипобарической гипоксии, когда имитировался "подъём на высоту" в барокамере. "Подъём" крыс в барокамере на высоту 7000 м (ориентировочно 8% Ог) и пребывание в течение 5 мин не приводило к грубым нарушениям плазмы крови, а так же форм ЭКГ. Однако цитофотометрическое исследование установило снижение активности СДГ до 90%, ИАОН и МАЭРН до 87% от контрольного уровня при одновременном увеличении активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и Г-6-ФДГ до 110% от нормы. При электронно-микроскопическом исследовании миокарда авторы обнаружили различные варианты морфологического состояния кардиомиоцитов. Большинство кардиомиоцитов сохраняло нормальную структуру, во многих митохондриях, сохраняющих овальную форму, наблюдались небольшие очаги деструкции крист с "вымыванием" матрикса. А так же в незначительно набухших митохондриях авторы описывают крупные участки деструкции крист с вымыванием матрикса. Часто в этих участках образовывались вакуоли и происходило разрушение наружных мембран. Встречались кардиомиоциты с выраженным сокращением миофибрилл. В таких мышечных клетках митохондрии выглядели набухшими, матрикс электронно-прозрачным, большинство крист было фрагментировано. В ядрах наблюдалась незначительная маргинация хроматина.

Для получения тяжёлой и крайне тяжёлой гипоксии авторы использовали газовые смеси с 5 и 3,5% 02 в Ы2 или подъём на высоту 11000 м. Высота 10000 - 11000 м ориентировочно соответствует 5,4-4,4% 02. В условиях тяжёлой гипобарической гипоксии, вызванной подъёмом на высоту 11000м в барокамере, у крыс быстро снижалась двигательная активность, нарушалось внешнее дыхание, возникали судороги. При исследовании активности окислительно-восстановительных ферментов ткани миокарда было достоверно показано возрастание активности СДГ до 110%, ЛДГ - до 113%, Г-6-ФДГ до 137%, МАРН до 106% и МАЭРН до 105%. При электронно-микроскопическом исследовании значительно большие изменения отмечались в миокарде правого желудочка сердца. Митохондрии располагались в основном группами, были набухшими, матрикс большинства из них просветлён, кристы фрагментированы. Вместе с, тем встречались митохондрии с большим количеством крист. В миокарде левого желудочка набухшие митохондрии располагались в виде скоплений различной величины, матрикс немного просветлён, фрагментация крист выражена незначительно, во многих митохондриях количество крист было увеличено.

Аналогичные данные были получены в работах Сулкина Н. и Сулкина П. (Sulkin N., Sulkin P., 1965), Поша (Poche, Hausamen, 1965; Poche, 1969), Хаусамена и Поша (1965), которые исследовали действие "высокогорной" гипоксии на миокарде животных, помещённых в барокамеру с атмосферным давлением, соответствующим высоте от 10000 м до 13000 м над уровнем моря. Все изменения ультраструктурной организации митохондрий кардиомиоцитов соответствовали описанным в предыдущих работах (набухание митохондрий, просветление матрикса и разрушение крист).

В литературе имеется ряд исследований гипоксии миокарда на модели постгеморрагической гипертензии, вызванной кровопотерей -циркуляторный тип гипоксии (Martin AM Jr et al., 1964; Iyengar S.R.K., 1972; 1973; Хитров и соавт., 1972; Н.И.Лосев и соавт., 1982). Н.Лосевым и соавт. (Н.И.Лосев и соавт., 1982) исследован миокард кроликов после умеренной кровопотери - снижение общего объёма крови в среднем на 20% (15 мл/кг). Цитофотометрическое исследование ткани миокарда установило достоверное снижение активности СДГ до 90%, NADH до 34% и NADPH до 79%, рост активности ЛДГ-до 115%, Г-6-ФДГ до 105%. При электронно-микроскопическом исследовании было показано, что митохондрии набухали, матрикс был умеренно просветлён, многие кристы дугообразной формы, фрагментированы, между фрагментами крист авторы описали анастомозы. У многих митохондрий наблюдалось увеличение количества крист, однако встречались и полностью гомогенизированные митохондрии. Уменьшение объёма крови в среднем на 40% (30 мг/кг) приводило к ослаблению сократительной функции сердца кроликов. Морфологические изменения в миокарде кроликов при тяжёлой кровопотере принципиально были такими же. Цитофотометрическое исследование окислительно-восстановительных ферментов выявило продолжающееся снижение активности СДГ до 85% от исходного уровня, однако происходило увеличение активности NADH до 55% и NADPH до 130%, нарастание активности ЛДГ - до 135%, Г-6-ФДГ до 115%. При электронно-микроскопическом исследовании было показано, что митохондрии находились в состоянии незначительного набухания, многие сохраняли овальную форму, матрикс органелл был просветлён, кристы частично фрагментированы. Обнаруживалось много "гомогенизированных митохондрий", а так-—же митохондрий с увеличенным количеством крист.

При использовании данной модели на собаках в работах Хитрова и соавт. (Хитров и соавт., 1972) были получены аналогичные результаты. В результате кровопотери 30% всей крови через 15 мин развивались аналогичные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов: митохондрии были набухшими, матрикс просветлён, кристы частично фрагментированы, в ядрах наблюдалась маргинация хроматина.

В то же время по данным Мартина с соавт. (Martin АМ Jr et al., 1964, Hackel DB., Martin AM Jr., et al., 1964) гипоксия, вызванная геморрагическим шоком, вызывала нарушения ультраструктурной организации миокарда, по своему характеру несколько отличные от описанных выше. В повреждённых мышечных волокнах наблюдалось сильное сокращение саркомеров, соседних с вставочными дисками. Митохондрии перемещались из зоны повреждения в соседние области мышечных волокон, но резких изменений в ультраструктурной организации митохондрий и ядер авторы не обнаружили.

В ряде работ моделируется гипоксия сердца введением в организм животного веществ различного действия. Так Н. Лосевым и соавт. (Н.И.Лосев и соавт., 1982) было проведено исследование действия гипоксии, вызванной введением в организм животных нитрита натрия, который является метгемоглобинообразователем. Крысам вещество вводилось подкожно в дозе 4мг/кг (умеренная доза) и 10 мг/кг (высокая доза). Животных исследовали через 1,5 часа после введения доз нитрита натрия. При цитофотометрическом исследовании определялось снижение активности СДГ до 60% от исходного уровня, возрастание активности ЛДГ-до 148%, происходило увеличение активности NADH до 153% и Г-6-ФДГ и NADPH до 197%, При электронно-микроскопическом анализе при умеренной дозе нитрита натрия в кардиомиоцитах авторы описывают небольшой отёк саркоплазмы, митохондрии в состоянии незначительного набухания с просветлённым матриксом, кристы умеренно фрагментированы, в ядрах отмечалась маргинация хроматина.

При высокой дозе нитрита натрия в кардиомиоцитах встречались крупные гомогенные участки, в которых группировались разрушенные митохондрии, но большинство митохондрий сохраняли овальную форму или незначительно набухали, была выраженная деструкция крист, в ядрах - маргинация хроматина.

Hatt и Moravec (Р. Hatt, D. Moravec, 1971) показали развитие аноксических изменений в митохондриях кардиомиоцитов через 5 мин ишемии на изолированном перфузированном сердце кролика при перевязывании коронарной артерии. На изолированных перфузированных сердцах собак, на коронарные артерии которых была наложена лигатура Д.Шапером и соавт. (J.Schaper, et al., 1979) было показано, что уже после короткого периода ишемии в митохондриях кардиомиоцитов происходили те же изменения ультраструктуры: набухание, просветление матрикса, дезориентация крист. Отмечены так же ультраструктурные изменения в ядрах, находящихся в зоне ишемии, которые были описаны выше - наблюдалась агрегация хроматина и сосредоточивание его у периферии ядер: Саркисов, Втюрин (Саркисов, Втюрин, 1967), Глаголева, Чечулин (Глаголева, Чечулин, 1968), Хитров, Пауков (Хитров, Пауков, 1972), Лосев и соавт. (Лосев и соавт., 1982); Edoute Y. et al.(Edoute Y. et al., 1981). Эти изменения становились ещё более заметными после 20 минут и 40 минут развития ишемии.

Ряд авторов проводили длительные эксперименты по искусственно созданному стенозу устья аорты. Волленбергер и Шульц (Wollenberger, Schulze, 1961; Wollenberger et al., 1963, 1966, 1971,) через 6 месяцев эксперимента в левом желудочке сердца собак наблюдали набухание митохондрий и саркоплазматического ретикулума. Через 2 года набухание митохондрий было ещё более резко выражено, ширина пучков миофибрилл увеличилась в 5 раз. Те же изменения в кардиомиоцитах наблюдал Ф.З.Меерсон (Meerson F.Z., 1969; Ф.З.Меерсон, 1984). Автор предположил, что при постоянной гипоксии и, как следствие, развитии гипертрофии сердца изменяется соотношение объёма митохондрий к миофибриллам за счёт уменьшения массы митохондрий почти на 20%. По мнению авторов, следствием этого является снижение потребления кислорода и синтеза макроэргических фосфатов на 50-60% , что приводит к сердечной недостаточности.

Особо необходимо остановиться на работах В.В.Глаголевой и Ю.С.Чечулина (В.В.Глаголева, Ю.С.Чечулин, 1968) по изучению ультраструктурной организации миокарда при экспериментальном инфаркте, вызванном нарушением венечного кровообращения. Эти работы выполнены ещё в 60-х годах прошедшего столетия. Однако, в настоящее время результаты этих исследований не только представляют большой интерес, но и остаются чрезвычайно актуальными. Выявленная авторами динамика изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов при действии гипоксии суммируется в приводимых схемах (рис.3, 4). Эти схемы так же могут быть наглядной иллюстрацией существующих в литературе представлений об ультраструктуре митохондрий кардиомиоцитов при гипоксии, которые были рассмотрены нами выше. Как следует из всех рассмотренных нами работ наиболее типичными изменениями ультраструктурной организации митохондрий в условиях гипоксии являются различные формы набухания митохондрий. В.В.Глаголева и Ю.С.Чечулин описали и другие формы изменения ультраструктуры митохондрий.

Рис. 3. Схема возможных изменений ультраструктурной организации митохондрий при экспериментальной гипоксии, (по В.В.Глаголевой и Ю.С.Чечулину, 1968г.)

На рис. 3 показаны изменения ультраструктуры митохондрий миокарда, обнаруженные этими авторами при экспериментальном нарушении коронарного кровообращения. Характерно набухание митохондрий, которое сопровождается увеличением объёма митохондрий, разрушением или дезориентацией крист показано на рис. 3 А, Б. Набухание может захватывать как всю органеллу (Б), так и её часть, структурно проявляясь в образовании вакуолей в центре или по периферии митохондрий (А). В ряде случаев по данным авторов набухание митохондрий приводит к образованию их гигантских форм, окружённых одинарной мембраной и содержащих в сильно просветлённом матриксе лишь обрывки двойных мембран крист (В). Набухание митохондрий и образование в их матриксе крупных вакуолей является, по мнению авторов, наиболее часто встречающимися формами изменения ультраструктурной организации митохондрий, возможно, представляющими собой различные стадии единого процесса набухания. Набухание митохондрий приводит к разрывам их наружных мембран и к полному разрушению этих клеточных органелл. На месте митохондрий в цитоплазме повреждённых миокардиальных клеток остаются скопления обрывков крист и наружных митохондриальных мембран (Г). Значительно реже набухание митохондрий сопровождается образованием множественных мелких вакуолей в районе крист (Д). По мнению авторов развитие процесса набухания приводит к потере двуконтурности наружной митохондриальной мембраны и скоплению в просветлённом матриксе митохондрий кольчатых структур, представляющих собой обрывки митохондриальных крист (Е). В некоторых миокардиальных клетках авторы описали изменение ультраструктурной организации митохондрий по типу образования ими миелиноподобных телец (Ж). Изменение ультраструктурной организации митохондрий миокардиальных клеток, сопровождающееся повреждением наружной митохондриальной мембраны часто происходит вследствие отложения в их матриксе плотных осмиофильных гранул, состоящих из более мелких субъединиц (3). В.В.Глаголевой и Ю.С.Чечулиным также приводится схематическое сопоставление соотношения основных типов изменения ультраструктурной организации мышечных волокон миокарда и динамики изменений ультраструктуры митохондрий при экспериментальной гипоксии (рис.4).

Рис. 4. Схема изменений ультраструктурной организации миофибрилл и динамика изменений ультраструктуры митохондрий миокарда при экспериментальной гипоксии (по В.В.Глаголевой и Ю.С.Чечулину, 1968г).

В работах современных авторов показана возможность предотвращения разрушительного действия гипоксии рядом веществ, обладающих кардиопротекторными свойствами. Так, Р.Голфетти с соавт. (Р.воКеШ а1., 2002) изучали действие кардиопротекторов, таких как ацетаминофен, на сердце свиньи. Ацетаминофен добавлялся в питьевую воду животных в течение 10 дней. После проведения опыта исследования ультраструкгуры и функций миокарда проводились на изолированном перфузированном сердце при действии ишемии в течение 10 и 20 мин, которая создавалась коронарной окклюзией, и 40 мин реперфузии. В контрольной группе митохондрии приобретали округлую форму, наблюдалось их набухание. В группе с ацетаминофеном ультраструктура митохондрий значительно отличалась: митохондрии не были набухшими, имели удлинённую форму, были плотно упакованы.

П. Жаи и соавт. (Р.1Ьа\ а1., 2000) на модели ишемии/реперфузии на изолированном перфузированном сердце крыс показали кардиопротекторные свойства эстрогена. Полная ишемия создавалась пережатием коронарной артерии на 30 мин, затем в течение 120 мин производилась реперфузия. Авторами были исследованы изменения ультраструктуры и функции миокарда крыс-самок контрольной группы и крыс-самок с удалёнными яичниками. Кардиомиоциты левого желудочка контрольной группы крыс содержали немного набухшие митохондрии, так же наблюдался отёк саркоплазмы. А в кардиомиоцитах крыс с удалёнными яичниками авторы наблюдали сильное набухание митохондрий, увеличение размеров, ошаривание и деструкцию крист. В некоторых митохондриях были видны аморфные матриксные гранулы. Наблюдался сильный отёк саркоплазмы. В ходе эксперимента крысам с удалёнными яичниками подкожно вводилась капсула с 17[3-эстрадиолом. После его воздействия ультраструктура кардиомиоцитов крыс изменилась: митохондрии имели немного анормальную форму, но сохраняли нормальный матрикс и упорядоченность крист. Авторы сделали вывод о более сильном воздействии гипоксии на ультраструктуру и функции миокарда крыс, не вырабатывающих эстроген, и кардиопротекторных свойствах эстрогена при ишемическом повреждении миокарда.

Таким образом, можно видеть, что в литературе многочисленные авторы экспериментальных исследований гипоксических состояний миокарда чаще всего обращают внимание на набухание митохондрий, в результате чего в литературе общепринята точка зрения, что набухание митохондрий - это основная характерная реакция клетки на дефицит кислорода.

Ill Ультраструктурные исследования миокарда при изучении роли апоптоза в развитии кардиоваскулярных повреждений.

В настоящее время к изучению действия аноксии или гипоксии на ткань миокарда используются новые методические подходы и новые представления о функциональных процессах. Анализ литературы показывает сформировавшееся представление о том, что ведущим патогенетическим механизмом в происхождении морфофункциональных изменений миокарда при целом ряде патологических состояний, обусловленных гипоксией, является процесс апоптоза. Как известно, ишемия занимает ведущее место в развитии ряда сердечно-сосудистых заболеваний, и прежде всего инфаркта. Традиционно считалось, что поражение миокарда при инфаркте обусловлено некрозом кардиомиоцитов. В работах последних лет показано, что кардиомиоциты центральной области повреждения погибают в основном по типу некроза, однако клетки периферической области подвержены более продолжительной клеточной гибели -апоптозу (Herijgers Р. et al.,1998, Dispersyn GD et al.,1999, Borgers M. et al., 2000). Запуск апоптоза осуществляется процессами, сопутствующими реоксигенации после определённого периода аноксии (Скулачёв, 2000).

Термин "апоптоз" первоначально был использован при описании гибели клеток на периферии зоны центрального некроза, вызванного перевязкой портальной вены. Так Керр и соавт. (Kerr, 1971; Kerr, Wyllie, et al., 1972) наблюдал в динамике изменения паренхимы печени крысы после перевязки ветвей вены, снабжающей левую и среднюю доли. Уже через несколько часов в этих долях развился некроз. Паренхима печени, снабжавшаяся печёночной артерией, оставалась жизнеспособной. Хотя через несколько недель и в этой ткани уже наблюдались признаки клеточной смерти, но морфологически они сильно отличались от проявлений некроза: отсутствовали признаки воспаления, отдельные, диффузно расположенные гепатоциты превращались в мелкие цитоплазматические конгломераты ограниченные мембраной фрагменты клеток, содержащие отдельные органеллы, а так же фрагменты хроматина. Это явление получило название "shrinkage necrosis" - "сморщивающийся некроз". Дальнейшее изучение этого типа гибели клеток показало, что он противоположен митозу в регулировании объёма ткани. Так появился термин «апоптоз» -«отделение», «удаление», аналогичное опадению листьев с деревьев.

Апоптоз - это генетически регулируемая форма гибели клеток, которая позволяет устранить клетки в тот момент времени, когда они уже выполнили свою биологическую функцию или повреждены настолько серьёзно, что их деление может дать генетически дефектное потомство. По мнению В.П.Скулачёва «апоптоз для клетки - это деликатный способ уйти из жизни, когда она сделала своё дело. .Клетка аккуратно и поэтапно разбирает саму себя на составляющие её молекулы. .Это не имеет ничего общего с некрозом -непреднамеренной гибелью клетки, которая оборачивается бедой не только для неё самой, но и для ещё живых клеток - соседей по ткани. В противоположность апоптозу некроз не контролируется регуляторными системами клетки, что приводило бы к хаосу метаболических процессов и ничем не ограниченному разгулу литических ферментов» (Скулачёв В.П., 1996). Апоптоз в отличие от некроза, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, в основе которого лежит работа различных сигнальных путей.

В настоящее время установлено, что апоптоз сопровождается последовательностью характерных структурно-морфологических изменений клетки. Хорошо известны и подробно изучены морфологические признаки последовательных этапов развития апоптоза, которые на сегодня являются "золотым стандартом " для выявления апоптоза (Рыбакова, Гудкова, 2001). Эти морфологические критерии развития апоптоза в основном были установлены на тканевых культурах при исследовании апоптоза, вызванного разными индукторами. В экспериментах на клетках культуры тканей показано, что один из первых признаков развития апоптоза - выраженная конденсация (маргинация) хроматина. В дальнейшем происходит распад ядра, что совпадает со значительным видоизменением клетки.

Клетка образует протуберанцы, выпячивания, цитоплазма клетки как бы вскипает, это состояние клетки называют "блэббинг" или "пляска смерти" (dance macabre). Клетка буквально отшнуровывает, отбрасывает участки цитоплазмы с фрагментами ядра и органеллами, и, как следствие, распадается на апоптотические тельца.

Особое внимание при изучении состояния ультраструктуры клетки в условиях развития апоптоза уделяется вопросам ультраструктуры митохондрий, поскольку в настоящее время митохондрии рассматривают как главное звено процесса апоптоза независимо от механизмов его инициации (Desagher, Martinou, 2000). Электронно-микроскопическое исследование апоптоза, вызванного разными индукторами на различных тканевых культурах показало, что несмотря на значительные различия в картине ультраструктурных изменений общей морфологии клетки, определяющей морфологические варианты клеточной гибели, изменения ультраструктуры митохондриального аппарата происходят по общему плану, они стереотипны независимо от различных механизмов реализации апоптоза и различной природы клеток (Бакеева, 2003). Установлена череда закономерно повторяющихся структурно-морфологических изменений хондриома клеток культуры тканей при апоптозе. Прежде всего происходит распад пространственно ориентированной системы митохондриального ретикулума. Исчезают протяжённые митохондриальные филламенты. Возникающая в клетке популяция мелких, электронно-плотных митохондрий перемещается в зону ядра, что, видимо, связано с избирательной инактивацией кинезина - белка-мотора, который ответственен за центробежное движение внутриклеточных частиц, а белок динеин, движущий частицы к центру остаётся активным (De Vos, Goossens, et al., 1998, De Vos, Severin, et al., 2000). Предполагается, что расположенные около ядра митохондрии могут высвобождать фактор индукции апоптоза AIF, который запускает нуклеазу, атакующую ДНК и в некоторых случаях завершающей стадией центростремительного движения митохондрий к ядру при апоптозе возможно их проникновение в ядро (Skulachev et al., 2004). Так, при индукции апоптоза в клетках культуры HeLa фактором некроза опухоли (ТИР-а) был обнаружен феномен "внутриядерных митохондрий" (Вакееуа е! а1., 2002). Таким образом, присутствие митохондрий внутри ядра является одним из морфологических признаков апоптоза в клетке, возможно завершающей стадией центростремительного движения митохондрий к ядру, и может рассматриваться как способ доставки в нукпеоплазму белков-активаторов апоптоза типа А1Р и облегчение атаки митохондрий ядерными белками типа р53 и ТРЗ.

Изменения внутренней организации митохондрий, происходящие при развитии апоптоза не менее драматичны. Общепринято представление, что митохондрии при апоптозе "уплотняются": матрикс максимально конденсируется, кристы меняют конфигурацию - "ультраконденсация митохондрий". При этом остаётся неясным и постоянно дискутируется вопрос, каким образом происходит освобождение митохондриальных белков - индукторов апоптоза - в цитоплазму. При индукции апоптоза ТМР-а на клетках культуры Не1а удалось обнаружить кратковременную фазу набухания митохондрий перед входом клетки в "ЫеЬЫпд" и было высказано предположение, что это состояние митохондрий соответствует стадии открытия пор во внутренней мембране митохондрий и выходу в цитоплазму белков межмембранника (Бакеева, 2003, вкиНасИеу е1 а!., 2004).

Согласно литературным представлениям данный комплекс морфологических проявлений апоптоза, характерен лишь для одноядерных клеток, способных к пролиферации (Рыбакова, Гудкова, 2001). Кардиомиоциты имеют 1 или 2 ядра и, если вступают когда-нибудь в митоз, то делают это чрезвычайно редко (Румянцев, 1982; Ошагн е! а1., 1994). Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов при их гибели, по морфологическим признакам не совсем укладываются в существующие критерии апоптоза. В то же время в литературе работы по исследованию ультраструктуры миокарда при апоптотических повреждениях кардиоваскулярной системы единичны.

Одним из самых известных исследователей апоптоза в ткани миокарда в 90-е годы была Р. Готтлиб. Самая значимая и широко цитируемая работа по исследованию апоптоза в сердце при ишемии/реперфузии была выполнена Р.Готтлиб и соавт. в 1994г. (R.Gottlieb et at., 1994). Ишемия была создана перевязкой коронарной артерии изолированного сердца белых новозеландских кроликов. После 30 мин или 4,5 часов ишемии проводилась реперфузия в течение 4 - 4,5 часов. При исследовании ультраструктуры кардиомиоцитов после реперфузии в ядрах наблюдалась маргинация хроматина, митохондрии имели нормальные размеры, но в них были обнаружены электронно-плотные тела. Апоптозных тел в кардиомиоцитах обнаружено не было. В своих дальнейших исследованиях апоптоза, возникающего в миокарде при моделировании инфаркта Р.Готтлиб и соавт. (R.Gottlieb, 2000; D.Granville, 2002; R.Gottlieb, 2003; Gustafsson A et al., 2003; Gustafsson A. et al,: 2004; Logue, S. et al; 2005;), подчёркивая ключевую роль митохондрий в развитии процесса апоптоза, отмечали изменения ультраструктуры митохондрий и возникновение в матриксе митохондрий электронно-плотных тел.

В то же время М.Охно и соавт. (M.Ohno et al., 1998;) высказывают предположение, что так называемые «апоптозные» кардиомиоциты из области, пораженной при инфаркте, могут быть некротическими клетками с фрагментацией ДНК. В этих работах на основе изучения морфологических изменений, происходящих в кардиомиоцитах в зоне инфаркта, который искусственно моделировали перевязкой коронарной артерии на сердце японских кроликов было показано что на 30 мин ишемии и последующей 30 мин реперфузии, в кардиомиоцитах с апоптозной фрагментацией ДНК, ядерный хроматин располагается в виде глыбок разного размера по периферии ядра. В то же время кардиомиоциты характеризовались комплексом ультраструктурных параметров, характерных для некроза: набухание кардиомиоцитов, разрыв цитоплазматической мембраны, набухание и повреждение митохондрий. Авторы определяют обнаруженное ими состояние миокарда как "онкоз". Однако, эти данные не согласуются с общепринятым мнением, согласно которому основным процессом, приводящим к гибели кардиомиоцитов после острой ишемии сердца, является апоптоз (Maulik, Kagan, et al. 1998, Elsasser, Suzuki, et al. 2000).

В этой связи большой интерес представляют работы, Джеймса с соавт. на биопсийном материале синусного узла пациентов с синдромом удлиненного интервала Q-T (длинным Q-T интервалом на электрокардиограмме) (James, Terasaki, et al. 1993, James, 1994) . У исследованных больных были найдены морфологические изменения ткани синусного узла. В норме в клетках синусного узла митохондрии равномерно распределены среди миофибрилл. На один саркомер приходится в среднем по 1-3 митохондрии. При патологии синусного узла происходят значительные ультраструктурные изменения. Авторами были найдены большие скопления митохондрий в кардиомиоцитах. Скопления митохондрий располагались как между миофибриллами, так и объединялись в большие пулы. Митохондрии в этих скоплениях имели измененную ультраструктуру. Их форма не была округлой или овальной, как это бывает в кардиомиоцитах нативной ткани сердца, органеллы приобретали вид тонких, изогнутых тяжей. Такие митохондрии были меньших размеров, чем в норме; в некоторых клетках их размеры были чрезвычайно малы (около 0.1 цм), и характеризовались электронно-плотным матриксом. Эти необычные митохондрии не были набухшими, не содержали электронно-плотных или кристаллических включений. Изменения ультраструктуры популяции митохондрий кардиомиоцитов были названы авторами термином плеоморфический микромитохондриоз.

Авторами также были обнаружены среди кардиомиоцитов нормальной ультраструктуры дегенерирующие клетки. Дегенерирующие кардиомиоциты содержали фрагменты ядра, обломки органелл, в них наблюдалась разборка миофибрилл. Такие структурные образования соответствуют апоптозным телам, описанным для клеток при апоптозе. В исследованной авторами ткани не было найдено признаков воспаления. Исходя из полученных данных, авторы высказывают предположение, что обнаруженное ими явление - плеоморфный микромитохондриоз является проявлением ранних стадий развития апоптоза в кардиомиоцитах. Появление в ткани дегенерирующих, сжатых кардиомиоцитов с апоптозными телами, разобранными миофибриллами, дезинтеграцией ядра и конденсацией органелл, является более поздними фазами апоптоза.

Сходные данные были получены В.Г.Цыпленковой и Н.Н.Бескровновой при исследовании морфологии миокарда больных синдромом Вольфа-Паркинсона-Уайта, характеризующегося пароксизмальной наджелудочковой тахикардией, возникающей в результате кругового ритма в сердце из-за существования дополнительных предсердно-желудочковых соединений (Цыпленкова В., Бескровнова Н. 1999) . В миокарде этих больных были найдены множественные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов миокарда, названные авторами как «апоптотическая дегенерация». Прежде всего, авторы наиболее часто наблюдали изменения ультраструктуры ядер. Ядра имели неправильную форму, в них отмечалось неравномерное распределение хроматина с преимущественным его накоплением под нуклеолеммой. Авторами также были найдены скопления мелких электронно-плотных полиморфных митохондрий вблизи ядра и между фибриллами, что соответствует определению «митохондриоз». В то же время, в небольшой части клеток (7,7%) выявлялись деструктивные изменения митохондрий, выражающиеся в их набухании и редукции крист. По полюсам ядра или между миофибриллами в местах характерной локализации митохондрий авторы часто наблюдали липофусциновые гранулы. Все обнаруженные авторами ультраструктрные изменения трактуются как проявления ранних стадий развития апоптоза в миокарде больных с синдромом Вольфа-Паркинсона-Уайта (Цыпленкова, Бескровнова, 1999). Наряду с изменениями ядра и митохондрий, авторами были выявлены изменения саркоплазматического ретикулума, проявляющиеся в умеренном расширении его канальцев и цистерн. Авторы также обнаружили в кардиомиоцитах апоптотические тельца - признак конечных стадий апоптоза. Авторы предполагают, что при развитии заболевания в отдельных кардиомиоцитах происходит активация программируемой клеточной гибели - апоптоза. Задаваясь вопросом о причинах запуска апоптоза в кардиомиоцитах больных синдромом Вольфа-Паркинсона-Уайта, авторы приходят к выводу, что одной из основных причин могут являться изменения микроциркуляторного русла, обусловленные тахикардией. Следует отметить, что у больных с синдромом удлиненного интервала Q-T, исследование миокарда которых было описано выше (James, Terasaki, et al. 1993, James, 1994), также наблюдались жизнеугрожающие тахикардии. Соответствие ультраструктурных изменений кардиомиоцитов миокарда при двух различных заболеваниях может быть связано с одинаковыми причинами поражения миокарда. Очевидно, вследствие тахикардии происходят изменения мелких артерий и артериол. Авторы считают, что по-скольку кардиомиоциты практически все субстраты метаболизма, а также кислород получают из капилляров, поэтому можно предполагать, что деструктивные изменения кардиомиоцитов происходят вследствие развития гипоксии, вызванной уменьшением кровотока.

Л.А.Бокерия и соавт. (Л.А.Бокерия и соавт., 1995), проводили исследования морфологических изменений кардиомиоцитов у больных с различными нарушениями сердечного ритма. Ишемия миокарда вносит вклад в развитие нарушений сердечного ритма, наиболее ранние изменения при этом выявляются в субэндокардиальных отделах сердца. Однако в клинической практике Л.А.Бокерия было показано, что стойкие жизнеугрожающие аритмии формируются часто при различных некоронарогенных поражениях миокарда: кардиомиопатиях, миокардитах. У 5-ти исследованных больных наблюдалась правожелудочковая тахикардия (3), левожелудочковая тахикардия (1) или сложные нарушения ритма при синдроме Вольфа-Паркинсона-Уайта (1). При исследовании биопсийного материала в аритмогенных зонах всех пациентов наблюдались сходные ультраструктурные признаки. Около 10-15% кардиомиоцитов были лишены миофибрилл, в них обнаруживался значительный полиморфизм митохондрий с накоплением мелких форм. В этих кардиомиоцитах авторы отмечали очаги апоптотической дегенерации, ограниченные от основной клетки. Митохондрии в отдельных кардиомиоцитах были конденсированы, собраны в центральной части клетки, а атрофичные миофибриллы располагались по периферии клетки. В других кардиомиоцитах, наоборот, отмечалась значительная концентрация мелких митохондрий между миофибриллами по периферии. Как правило, преобладали полиморфные мелкие митохондрии, содержащие многочисленные кристы, без признаков отёка и деструкции. В ядрах кардиомиоцитов отмечалось неравномерное распределение хроматина и накопление его по краям ядра. На поздних стадиях апоптоза фрагменты ядерного вещества в совокупности с другими разрушенными структурами наблюдались в "апоптотических телах". Повреждённые участки, как правило, были ограничены от остальной части клетки мембраной, что характерно для апоптотической дегенерации.

При моделировании постоянной слабой гипоксии на миокарде собак В.Шаровым и соавт. (Sharov et at., 1996) были обнаружены апоптозные зоны старого инфаркта. В миокарде искусственно создавались повреждения, которые возникали после множественной внутрикоронарной эмболизации с микросферами (от 77 до 102 мкм в диаметре). Эта методика более подробно была описана в 1991 году в работе Гольдштейна (Sabbah N. et at., 1991). Коронарная микроэмболизация проводилась в течение 3-4 месяцев, далее проводились электронно-микроскопические исследования и TUNEL-тест (terminal Deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling), в основе которого лежит флуоресцентное мечение высвободившихся при деградации ДНК множественных З'-ОН концов (Harmon, Winterford, et а)., 1998). Ультраструктурные признаки апоптоза были обнаружены в левом желудочке всех сердец с хроническими повреждениями, вызванными внутрикоронарной эмболией. обнаруживались одинаковые ультраструктурные изменения в кардиомиоцитах. Были найдены ограниченные большим количеством коллагена зоны старого инфаркта, в которых отсутствовала воспалительная реакция. В типичных кардиомиоцитах, находящихся за пределами этой зоны старого инфаркта наблюдалось равномерное распределение ядерного хроматина, ядро сохраняло нормальную структуру. В самой зоне старого инфаркта в большинстве кардиомиоцитов была показана небольшая маргинация и группирование хроматина вдоль всей ядерной оболочки. Эти изменения в ядре, по мнению авторов, связаны с умеренной ишемией или гипоксией. В редких кардиомиоцитах было заметно уплотнение ядерного хроматина в резко ограниченную однородную плотную массу, которая примыкала к ядерной оболочке. Так же присутствовал и рыхлый ядерный хроматин. В этих клетках митохондрии и миофибриллы имели нормальную ультраструктуру, сарколемма казалась интактной. Соответственно ультраструктурным характеристикам апоптоза большинство этих клеток находится на ранней стадии развития апоптоза. Очень небольшое количество клеток имели типичную ультраструктуру для более поздней стадии апоптоза. В них показано сморщивание цитоплазмы, большое количество выпячиваний и инвагинаций сарколеммы (блеббинг). Ядро фрагментировалось, ядерный хроматин уплотнялся ещё в большей степени. На конечной стадии апоптоза наблюдалось поглощение апоптозных тел макрофагами. В этих телах нуклеолемма отсутствовала, а были видны только электронно-плотные резко очерченные фрагменты ядерного хроматина без ядерной оболочки и без других клеточных органелл. В этой фазе, по мнению авторов, нельзя судить о происхождении апоптозных тел, полагаясь только на электронно-микроскопические исследования. В исследуемых сердцах была проведена иммуногистохимическая реакция TUNEL, которая обозначила зоны старого инфаркта. В кардиомиоцитах этой зоны ядра с апоптозом и апоптозные тела выглядели иначе, чем неизменённые ядра. Наблюдалась ядерная фрагментация ДНК.

В работе Л.М. Непомнящих и соавт. экспериментально моделировалась антрациклиновая кардиомиопатия (регенераторно-пластическая недостаточность), вызываемая введением кардиотоксической дозы антрацикпинового антибиотика рубомицина (ЗОмг/кг) (Непомнящих, Лушникова, et al. 2001). Согласно современным представлениям, антибиотики антрацикпинового ряда вызывают развитие доззависимой кардиомиопатии и сердечной недостаточности (Konorev, Zhang, et al. 2000). с гибелью части кардиомиоцитов по типу апоптоза. Через трое суток после введения рубомицина, в миокарде «с возрастающей частотой начинали встречаться мозаично расположенные кардиомиоциты, в которых все митохондрии были увеличены, их матрикс просветлен, а кристы фрагментированы». В нормальном миокарде митохондрии объединены межмитохондриальными контактами в цепочки, образующие митохондриальный ретикулум. После введения рубомицина отсутствовала концентрация митохондрий вокруг ядра: митохондрии располагались в саркоплазме поодиночке. Авторы делают вывод, что полученные ими данные не совпадают с совокупностью изменений, принятых за морфологический «стандарт» апоптоза. Однако на основании литературных данных можно сделать вывод о фрагментации митохондриального ретикулума кардиомиоцитов, которая сопровождает процесс апоптоза.

Интересные данные были получены в исследованиях Ю.В.Судариковой и соавт. (Сударикова, et al. 1998). В этой работе авторы обнаружили в кардиомиоцитах больных при алкогольном поражении сердца значительные скопления липофусциновых гранул. Авторы доказали, что эти липофусциновые гранулы ограничены двумя мембранами и по своим параметрам соответствуют митохондриям, матрикс которых заполнен электронно-плотными гранулами. Липофусциновые гранулы были расположены рядами вдоль миофибрилл, где, как правило, обычно расположены митохондрии. Ю.В.Судариковой и соавт. был сделан вывод, что липофусциновые гранулы представляют собой митохондрии, в которых происходит накопление электронно-плотного содержимого, заполняющего все внутреннее пространство органеллы.

Как известно, при патологиях миокарда не весь миокард, а только небольшое число кардиомиоцитов подвергается поражению (Kajstura J., 1996). Обнаружить такой очаг поражения достаточно сложно. В этой связи перспективны исследования, проводимые на животных линии спонтанно-гипертензивных крыс (SHR, spontaneously hypertensive rats). У животных этой линии с возрастом развивается спонтанная гипертензия, причем этот признак передается по наследству. Из литературных данных известно, что у крыс линии SHR в возрасте от 4 недель в кардиомиоцитах индуцируется апоптоз. Число клеток, выполняющих программу клеточной гибели выходит на стационарный уровень к 16 неделе и достигает максимума к 64 неделе развития. Это было доказано исследованием электрофореза ДНК из клеток миокарда крыс линии SHR. Также обнаружено, что у животных этой линии снижено соотношение Bcl-2/Bax (Liu, Peng, et al. 2000). В миокарде таких животных, ввиду возникновения очагов апоптоза по всему объему миокарда, облегчен поиск кардиомиоцитов с индуцированной программой клеточной гибели. Исследование ультраструктуры кардиомиоцитов таких животных может выявить новые ультраструктурные признаки развития апоптоза в нативной ткани сердца.

Ультраструктурные исследования миокарда спонтанно-гипертензивных животных единичны (Li Z., et al., 1997, Liu, et al., 2000). Лиу с соавт. (Liu, et al., 2000) на крысах линии SHR, анализировали ультраструктуру клеток миокарда у животных в возрасте 16 недель. Авторы обнаружили такие морфологические признаки апоптоза, как сжатие ядра, маргинация и конденсация хроматина. Авторы называют одним из признаков апоптоза большие полости, найденные ими вокруг ядра.

Одним из подходов к изучению особенностей кардиомиоцитов при развитии апоптоза являются исследования на клетках культуры кардиомиоцитов. Сонг и соавт. (Song, Lu, et al. 2000) исследовали ультраструктуру клеток культуры неонатальных кардиомиоцитов после инкубации клеток в течение 24 часов с донором NO - S-нитрозо-М-ацетилпеницилламин (SNAP). В таких клетках были обнаружены признаки апоптоза, такие, как конденсация хроматина на периферии ядра, сжатие клетки.

Изюмо с соавт. (Haunstetter А. & Izumo S., 1998) исследовал индукцию апоптоза после повреждающего действия аноксии и реоксигенации, а также влияние на этот процесс ингибитора каспаз zVAD.fmk в концентрации 25 мМ/л (Kang, Haunstetter, et al. 2000). Работа выполнена на клетках культуры кардиомиоцитов взрослых животных. Условия гипоксии вызывали инкубацией клеток в среде, содержащей 5% С02 и 95% N2. Цитологическое исследование клеток выявило, что в норме культура кардиомиоцитов содержала 90% клеток удлиненной формы. После 18 часов действия реоксигенации, следующей за 6-ти часовой гипоксией, происходило «ошаривание» клеток. Число округлившихся клеток было значительно больше по сравнению с числом клеток округлой формы в контрольной группе клеток, инкубированных 24 часа в условиях нормоксии, а также в группе клеток, инкубированных 24 часа только в условиях гипоксии без реоксигенации. Ингибирование каспаз приводило к снижению числа клеток округлой формы в опыте с реоксигенацией. Методом иммуно-флюоресцентной окраски актина саркомеров и митохондрий было показано, что в процессе «ошаривания» кардиомиоцитов саркомеры и митохондрии распределяются по клетке неорганизованно, случайно. В то же время в большинстве клеток округлой формы, с краевыми протуберанцами - выпячиваниями (ЫеЬЫпд), митохондрии располагались на периферии клетки, а актин саркомеров - в центре. В этой же работе приводятся данные электронно-микроскопического исследования кардиомиоцитов. После действия аноксии/реоксигенации в клетках культуры кардиомиоцитов взрослых животных наблюдалась разборка миофибрилл, конденсация хроматина, что является типичными признаками апоптоза. Также авторы показали, что внутри протуберанцев (ЫеЬв) плазматической мембраны преобладали митохондрии. Так же и другими авторами на клетках культуры кардиомиоцитов взрослых животных после длительного действия аноксии (24 ч) без реоксигенации были найдены ультраструктурные признаки некроза: разрушение цитоплазматической мембраны, набухание ядра с диффузной конденсацией хроматина, активное образование вакуолей (Капд, Наипз1ейег, е! а1. 2000).

По мнению Тумановской Л. (Титапоуэ'ка 1. е1 а1., 2004) аноксия/реоксигенация неонатальных кардиомиоцитов крыс вызывает особый тип гибели клеток - аутофагическую клеточную смерть. На основе результатов своих экспериментов авторы указывают на необходимость исследования аутофагической клеточной смерти в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний.

Таким образом, в настоящее время в литературе в основе ишемических поражений миокарда рассматривается массовый апоптоз клеток, вызванный повреждающим действием аноксии или гипоксии. При этом для инфаркта известно, что массовый апоптоз клеток, приводящий к гибели организма, развивается не сразу после поражения ткани миокарда, а в виде вторичных реакций, отставленных во времени (Ашмарин, 1997). Относительно механизмов индукции апоптоза в литературе в ряде работ показано, что при таких поражениях сердца, как инфаркт миокарда и сердечная недостаточность, кардиомиоциты становятся источником продукции TNF-a (Irwin, Мак, et al. 1999; Habib, Springall, et al. 1996). TNF-a индуцирует апоптоз кардиомиоцитов через стимуляцию рецепторов TNF 1 типа (TNFR 1) (Haunstetten Izumo 1998; Meldrum, 1998). Wei Song и соавт. (Song, Lu, et al. 2000) предполагают, что TNF-a вызывает апоптоз в миокарде посредством индукции синтазы оксида азота (iNOS). ¡NOS является ферментом, синезирующим N0 из L-аргинина. N0 в клетке является одним из индукторов апоптоза.

Однако, следует отметить, что основное количество исследований функциональных характеристик апоптоза, вызванного аноксией, проводятся на изолированных митохондриях или на клетках культуры. А как известно, клетки культуры тканей, а так же изолированные митохондрии существенно отличаются по ультраструктуре, функциональным особенностям от кардиомиоцитов нативной ткани сердца. Точные причины индукции апоптоза в тканях миокарда до сих пор неизвестны. Одним из наиболее распространенных мнений, как уже отмечалось выше, относительно причин индукции апоптоза в миокарде после повреждающего действия аноксии является мнение, что не сама аноксия, а следующая за ней реоксигенация приводит к столь удручающим последствиям. Ф.Ваттерлейн и соавт. (F.Vetterlein et al., 2003), исследуя действие ишемии и реперфузии на сердце крысы, показали, что при создании реперфузии после ишемии необратимые изменения возникают в гораздо большей степени, чем после ишемии без реперфузии. По мнению В.П.Скулачева (Скулачев, 1999) повреждающий эффект АФК (активных форм кислорода) обусловлен прежде всего радикалом гидроксила с его чрезвычайно высокой реакционной способностью и положительным редокс-потенциалом (+1,35 В). Главный источник энергии ОН* в клетке - так называемая фетоновская реакция (Скулачев, 1999)

Н202 + Ре2+ -> ОН* + ОН" + Яе3+

При аноксии ионы Ре3+ могут восстанавливаться до ионов Ре2+. При реоксигенации ионы могут переноситься на образующуюся перекись водорода. Это может приводить к появлению в клетке ОН*. Клетка способна отслеживать уровень ОН*. Всплеск образования ОН* должен инициировать программу апоптоза в клетке - продуценте гидроксильных радикалов и ее ближайшем окружении. Массовая гибель клеток при реперфузии его кровью, утверждает автор, будет следствием реализации такого рода программы. Другой причиной эффекта реперфузии может быть увеличение уровня ксантиноксидазы (Скулачёв, 1999). Все эти предположения доказаны биохимическими экспериментами. Так, на изолированных митохондриях Слюсом и сотрудн. (51изе е! а1., 2000) наблюдалось резкое увеличение образования АФК при реоксигенации. В тех же условиях Танака и др.(Тапака,е! а1., 1994) описал открытие пор во внутренней мембране митохондрий, чувствительных к циклоспорину А.

В митохондриях содержится большое количество активных ферментов и коферментов - переносчиков электронов. Случайное взаимодействие этих переносчиков электронов с 02 может привести к одноэлектронному восстановлению 02 до 02". Организм стремится поставить под контроль этот процесс, но если это произошло, то не допустить образования ОН, которая является ещё более токсической формой АФК. В митохондриях существует несколько механизмов, устраняющих АФК, но если концентрация АФК продолжает нарастать, то принимаются более радикальные меры. Если не срабатывают и они, то митохондрия обрекается на самоликвидацию. В АТР/АЭР -антипортере, белке внутренней мембраны митохондрий происходит окисление БН-группы суэ-бб, что приводит к превращению этого переносчика адениннуклеотидов в неспецифический канал, проницаемый для любых веществ с массой менее 1,5 кОа (2огайу, БгаЬо, 1995; На^гар е! а!., 1997, Сопз!апйт а1., 2000). Открытие неспецифической поры ведёт к выравниванию градиентов всех низкомолекулярных веществ между митохондриями и внемитохондриальным пространством. После открытия неспецифической поры внутренняя мембрана становится проницаема для ионов К+ и С1-, которые в обычных условиях поддерживали осмотический баланс между матриксом и межмембранным пространством. Теперь осмотическое давление поддерживают только высокомолекулярные соединения (белки), а в матриксе их гораздо больше, чем в межмембраннике, поэтому вода стремится в матрикс, который в свою очередь набухает, мембраны крист расправляются, а наружная мембрана разрывается. При этом все белки, находящиеся в межмембранном пространстве выходят в цитозоль, в том числе и цитохром с. Гибель митохондрии, образующей избыток АФК, не требует никаких белков, кроме тех, которые находятся в самих митохондриях - АТР/АРР - антипортера и циклофилина. Если в митохондрии длительное время открыта неспецифическая пора, то такая митохондрия становится опасной для всей клетки в целом, и митохондрия самоуничтожается. Это явление было названо В.П.Скулачёвым (Скулачёв, 1994; ЭкЫасЬеу, 1998 а, Ь) «митоптозом».

Таким образом, если ещё сравнительно недавно наши представления о митохондриях сводились только как к энергетическим станциям клетки, где роль митохондрий в развитии патологий ограничивалась нарушением энергообеспечения и исключительно с этих позиций рассматривались все ультраструктурные преобразования митохондрий, то в настоящее время в центре внимания участие митохондрий в таких процессах, как развитие окислительного стресса, продукция АФК, внутриклеточная передача сигналов, выход из митохондрий в цитоплазму белков, вызывающих апоптоз.

В этой связи поиски новых экспериментальных моделей, новых методических подходов для изучения в ткани миокарда процессов, обусловленных аноксией чрезвычайно важны, так как известно, что при тяжёлых поражениях в миокарде регистрируется состояние аноксии.

К настоящему времени особенности ультраструктуры и функциональной характеристики митохондрий миокарда при длительном действии гипоксии детально не изучены.

Мы предположили, что на кусочках изолированной ткани миокарда при длительной инкубации в условиях гипоксии возможно провести всестороннее исследование митохондрий кардиомиоцитов.

Цельисследования состояла в изучении морфофункциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов при длительном действии гипоксии. Был применен специальный экспериментальный подход: исследование проводили на кусочках изолированного миокарда, инкубированных при 20°С в условиях длительной гипоксии начиная с 6 ч и далее через каждые 12 ч, в течение 3-х суток.

Были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать особенности ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии.

2. Исследовать динамику изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда в течение 72 ч инкубации ткани в условиях гипоксии, начиная с 6 часов и далее через каждые 12 часов.

3. Исследовать функциональные особенности митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч гипоксии на изолированных митохондриях, а так же непосредственно in situ методом электронно-микроскопической гистохимии на выявление функциональной активности цитохром с-оксидазы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Животные.

В исследовании по действию гипоксии на кардиомиоциты миокарда были использованы взрослые беспородные крысы массой 150-180 г.

2. Экспериментальная модель для исследования динамики процесса образования митохондрий внутри митохондрий в изолированной ткани миокарда в условиях гипоксии.

Взрослых крыс (150-180 г) декапитировали, ткань желудочков извлекали и быстро измельчали на фрагменты с линейными размерами порядка 1-3 мм в растворе буфера, содержащего 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, ЮмМ Tris, рН 7.4 при 4 °С. Препарат ткани помещали в пластиковые пробирки и заливали тем же буфером, предварительно продутым азотом в течение 30 мин, в котором нарезалась ткань. При продувке удалялось 70-90 % кислорода (количество оставшегося кислорода контролировалось с помощью электрода Кларка). Образец быстро герметизировали и инкубировали при 20 °С начиная с 6 часов и до 72 часов. При измерении эндогенной скорости дыхания фрагментов ткани в среде предварительно продутой азотом было показано, что время удаления остатков кислорода из среды составляет менее 3-х минут. После окончания инкубации проводилось измерение рН среды с помощью рН электрода.

3.Выделение фракций митохондрий.

Митохондрии для измерения функциональной активности выделяли с помощью стандартного метода дифференциального центрифурирования. Выделение проводили в холодной комнате при температуре 4°С. Ткань сердца помещали в среду выделения, содержащую 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, ЮмМ Tris, pH 7.4 при 4 °С, предварительно охлажденную до температуры 0°С, и инкубировали в течение 5 минут. Затем ткань измельчали ножницами и измельченные фрагменты разрушали в гомогенизаторе Поттера в среде выделения. Во время разрушения ткани гомогенизатор находился в емкости со льдом. Соотношение количества ткани к количеству среды гомогенизации было 1:10. Ядерную фракцию осаждали при 300g, из надосадочной жидкости последовательно осаждали тяжелую фракцию митохондрий при 1700g, среднюю фракцию - при 10000g и лёгкую - при 17000g. Центрифугирование проводили на центрифуге BECKMAN USA J2-21 в роторе JA-20; время центрифугирования для всех фракций - 20 минут. Каждую фракцию митохондрий ресуспензировали с 1 мл раствора 0.2% бычьего сывороточного альбумина, свободного от жирных кислот в течение двух минут, после этого суспензию доводили до объёма 30 мл средой выделения и переосаждали. Полученные суспензии митохондрий собирали и хранили в открытой стеклянной пробирке, помещённой в ёмкость со льдом. Измерения функциональной активности проводились в течение 1-2 часов после выделения митохондрий. Количество белка в суспензии митохондрий определяли биуретовым методом.

4. Исследование функциональной активности митохондрий.

Исследование функциональной активности митохондрий проводили с помощью одновременной регистрации скорости поглощения кислорода электродом Кларка и мембранного потенциала митохондрий ТРР - селективным электродом («НИКО», Россия). Среда инкубации содержала: 120 мМ KCI, 1мМ ЭДТА, ЮмМ Tris, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 0.5 мкМ тетрафенилфосфоний (ТРР), рН 7.4.

5. Обработка материала для электронно-микроскопического исследования.

Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в буфере, рН 7,4, в течение 2 ч при 4°; затем дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия в буфере в течение 1,5 ч и обезвоживали в растворах спиртов с возрастающей концентрацией спирта (70%-ный спирт был насыщен уранилацетатом). Материал заливали в эпоксидную смолу Эпон-812. Срезы делали на ультрамикротоме LKB-III. Срезы монтировали на бленды покрытые формваровой пленкой. Далее полученные препараты окрашивали свинцом по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полученные препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе HU-11B ("Hitachi", Япония).

6. Определение активности цитохром с - оксидазы в митохондриях нативной и экспериментальной ткани сердца.

Исследование активности ЦО проводили по методике, описанной Селигманом с соавт. (Seligman et al., 1968). Ткань миокарда фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в PBS-буфере (0,15 NaCI/ 27 mM KCI/12 тМ NaH2P04, рН 7,2) в течение 10 минут при 4°; затем ткань инкубировали в следующем растворе: 5 mg 3, 3 - диаминобензидина тетрагидрохлорида / 9 ml 0,05 М фосфатного

Результаты.

1. Ультраструктура митохондрий кардиомио-цитов изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

Проведённое электронно-микроскопическое исследование состояния ткани кусочков изолированного миокарда, инкубированных 72 часа в гипоксии при 20°С показало, что в этих экспериментальных условиях в кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит.

На фот. 1 электронно-микроскопическая фотография отдельного участка кардиомиоцита, где можно видеть расположенные рядами вдоль миофибрилл цепочки нативных по своей ультраструктуре митохондрий, объединённых межмитохондриальными контактами (межмитохондриальные контакты показаны стрелками). На фот. 2 объединение митохондрий в цепочку посредством межмитохондриальных контактов: стрелкой 1 показано наличие электронно-плотного материала в межмембранном пространстве контактирующих митохондрий; стрелка 2 показывает область непосредственного контактирования митохондрий. Наличие межмитохондриальных контактов показывает, что выбранные нами экспериментальные условия позволяют сохранить в исследуемой ткани объединённую митохондриальную систему - характерную ультраструктурную особенность нативной ткани миокарда. Однако, в этих экспериментальных условиях нами обнаружены значительные изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов. Прежде всего это хорошо известные в литературе изменения ультраструктуры митохондрий, характерные для условий гипоксии. Так, в препаратах нашей экспериментальной ткани мы обнаруживали большое количество септированных митохондрий (фот.З).

Другой морфологической особенностью митохондрий исследуемой ткани, также по литературным данным характерной для условий гипоксии, является образование включений во внутрикристном пространстве, которые имеют вид электронно-плотного материала (показано стрелками на фот. 4 и 5 а). На фот. 4 можно видеть, что поперечное сечение таких крист, расположенных рядом имеют вид скоплений гранул.

Наряду с этими, часто встречаемыми в литературе для условий гипоксии, изменениями морфологии митохондрий мы обнаружили в нашей экспериментальной ткани неизвестные ранее перестройки внутренней организации митохондрий.

Так, на небольших увеличениях в отдельных митохондриях можно видеть участки повышенной электронной плотности, которые можно принять за мелкую, электронно-плотную митохондрию (фот. 5 б, 6 а, б, в, г). Анализ этих структур при большем увеличении показывает, что это участки повышенной электронной плотности, в которых происходит образование внутренней митохондриальной мембраны упорядоченных структур в результате перехода ламеллярной упаковки мембран соседних крист в трубчатую.

На фот. 6 а, б представлены электронно-микроскопические фотографии двух последовательных ультратонких срезов на большом увеличении, на которых видно, что внутренняя мембрана митохондрий в этих электронно-плотных зонах образует электронно-плотную ячеистую структуру. Ячейки на поперечном сечении имеют гексагональную форму и незначительно отличаются по размеру. Стрелками показаны подобия узлов в этих структурах, в результате чего структура этих образований напоминает кристаллическую решетку. Также на фот. 6 б и г виден плавный переход внутренней митохондриальной мембраны в эту структуру. Это свидетельствует о том, что данное образование не является изолированной самостоятельной структурой. На фот. 5 б, по нашему мнению, начальная стадия возникновения этих структур. Можно видеть сближение мембран соседних крист и формирование на поперечном сечении гексагональной структуры, однако повышенная электронная плотность отсутствует. Образования такого типа внутри митохондрий до настоящего времени в литературе не установлены.

При изменении условий инкубации нашей экспериментальной ткани, когда в среду инкубации был добавлен 0,1 мМ АДФ, эти структурные образования резко меняют свою морфологию. Как видно на фот. 7 локальные перестройки внутренней митохондриальной мембраны на поперечном сечении приобрели вид треугольников, а на косом сечении они представляют собой треугольные призмы, расположенные на одинаковом расстоянии и параллельно друг другу (фот. 7 и 8). На продольном сечении такие перестройки внутренней мембраны выглядят как параллельно расположенные тяжи крист (фот.9). При этом утрачивается повышенная электронная плотность этого структурного образования. Схематически такая ультраструктура митохондрий показана на рис.5. Такая ультраструктура митохондрий была описана Ревелом и соавт. для крикотироидной мышцы летучей мыши.

Рис. 5. Схема ультраструктуры митохондрии крикотироидной мышцы летучей мыши с правильно расположенными трёхгранными призматическими кристами (по Revel J.P. etal., 1963).

Наряду с этим в нашей экспериментальной ткани обращает на себя внимание выраженная ультраструктурная гетерогенность популяции митохондрий: основную популяцию составляют электронно-светлые митохондрии с обводненным, просветленным матриксом, контрастными, хорошо выраженными мембранами, в то же время в ткани можно видеть и митохондрии иной ультраструктуры: мелкие электронно-плотные митохондрии с незначительно сжатым электронно-плотным матриксом, выраженным обводнённым межмембранным пространством (фот. 10). Электронно-плотные митохондрии значительно варьируют по размерам от чрезвычайно мелких, имеющих 2-3 кристы, до сопоставимых по размеру с основной массой митохондрий. Электронно-плотные митохондрии могут располагаться непосредственно среди миофибрилл, а так же в межмембранном пространстве более крупных электронно-светлых митохондрий. На фот. 11, 12 однозначно идентифицируется расположение электронно-плотной митохондрии внутри более крупной электронно-светлой митохондрии. Стрелками показаны и наружная и внутренняя мембраны основной митохондрии. Анализ ультратонких серийных срезов показывает, что электронно-плотные митохондрии действительно могут располагаться в межмембранном пространстве электронно-светлых митохондрий. Эта удивительная морфологическая особенность митохондрий является характерным ультраструктурным признаком исследуемой экспериментальной ткани.

Так, на фот. 13 а, б, в, г, д, е электронно-микроскопические фотографии последовательных срезов одной из необычных электронно-светлых митохондрий, внутри которой присутствует другая митохондрия электронно-плотной структуры. На срезах, показанных на фот. 13 а, 13 е митохондрии имеют обычную ультраструктуру. В то же время на последующих срезах фот. 13 6, в, ги13д можно видеть внутри основной митохондрии мелкую электронно-плотную митохондрию, которая располагается в пределах только четырёх серийных ультратонких срезов, в срединной части митохондрии. В то время, как основная электронно-светлая митохондрия присутствует на срезах до начала сечения электронно-плотной митохондрии и продолжается дальше. Из фот.13 следует, что диаметр такой электронно-плотной митохондрии составляет около 0.3 мкм, а толщина - 0,3 мкм, если считать, что, толщина одного среза около 700 А,. Электронно-плотные митохондрии, расположенные внутри других митохондрий, могут иметь разные параметры от чрезвычайно мелких (не более 0.06 мкм в диаметре) (фот. 13) до более крупных (фот. 11, 14, 15). Необходимо отметить, что расположенные в межмембранном пространстве электронно-плотные митохондрии чаще всего располагаются на периферии электронно-светлой митохондрии.

Таким образом, можно выделить основные ультраструктурные особенности (признаки) митохондрий кардиомиоцитов, характерные для исследуемой нами экспериментальной ткани:

1) Наличие межмитохондриальных контактов нативной ультраструктуры.

2) Образование септ в митохондриях.

3) Появление электронно-плотного материала во внутрикристном пространстве - внутрикристные включения.

4) Возникновение внутри митохондрий высокоупорядоченных структур.

5) Выраженная ультраструктурная гетерогенность митохондрий: две популяции митохондрий: электронно-светлые и электронно-плотные. Электронно-плотные митохондрии могут располагаться непосредственно среди миофибрилл, а так же в межмембранном пространстве более крупных электронно-светлых митохондрий.

Мы провели исследование функциональных особенностей митохондрий нашей экспериментальной ткани на суспензии изолированных митохондрий, а так же непосредственно in situ методом электронно-микроскопической гистохимии.

2.1 Особенности системы окислительного фосфорилирования митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях длительной гипоксии.

Для исследования функциональных характеристик митохондрий нашей экспериментальной ткани было проведено выделение из кусочков ткани миокарда, инкубированных в условиях гипоксии фракций митохондрий, осаждённых на различных скоростях дифференциального центрифугирования,. Были подобраны условия фракционирования, позволившие последовательным дифференциальным центрифугированием получить фракции митохондрий: "тяжёлую", осаждённую при скорости 1700д, "среднюю", осаждённую при ЮОООд и "лёгкую", осаждённую при 17000д. Содержание белка во фракциях составляло: в "тяжёлой"- 15-30 мг, "средней"- 2-4 мг, "лёгкой"- 0.5-1 мг. Был проведён ультраструктурный анализ полученных фракций. "Тяжёлая" фракция помимо миофибрилл и ядер содержала кластеры митохондрий, объединённые межмитохондриальными контактами (фот.16), а так же скопления митохондрий, внутри отдельных из них обнаруживались мелкие электронно-плотные митохондрии (фот. 17).

Ультраструктура "средней" фракции митохондрий, выделенных при ЮОООд из экспериментальной ткани миокарда представлена на электронно-микроскопической фотографии (фот. 18). Митохондрии данной фракции имели ультраструктуру, характерную для митохондрий, изолированных в 0,25М сахарозе: округлую форму, увеличенное межмембранное пространство, сжатый матрикс.

При электронно-микроскопическом исследовании "лёгкой" фракции (фот.19), осаждённой при 17000д было выявлено, что она содержит мелкие электронно-плотные митохондрии, по своей ультраструктуре совпадающие с электронно-плотными митохондриями, расположенными внутри более крупных электронно-светлых митохондрий из "тяжёлой" фракции, а так же субмитохондриальные частицы (СМЧ). Эти электронно-плотные митохондрии "лёгкой" фракции имели наружную и внутреннюю мембраны, а их средний диаметр составлял 0,15 мкм. Так же в этой фракции обнаруживались мелкие набухшие митохондрии, набухание которых, очевидно, происходило из-за нарушения мембран во время процесса выделения.

Нами были проведены сравнительные исследования дыхательных характеристик митохондрий, выделенных на скорости ЮОООд из контрольной интактной ткани миокарда и из экспериментальной ткани - "средней" фракции митохондрий. Так же параллельно с измерением скоростей дыхания измерялся мембранный потенциал (АТ) экспериментальных и контрольных митохондрий. Дыхательные характеристики контрольных митохондрий приведены на рис. 6. Скорости дыхания на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи, а так же увеличение скорости дыхания при добавлении АДФ и РССР соответствовали описанным в литературе данным для изолированных митохондрий контрольной ткани миокарда.

Таблица 1. Максимальные скорости дыхания митохондрий.

Препарат митохондрий Субстраты дыхания Скорость дыхания (нг ат О/ мг белка) <Х2> N

Контрольные глут. +мал. 124 22 4 митохондрии * сук.+рот. 127 25 4

Митохондрии, глут. +мал. 120 26 3 выделенные из ткани сук.+рот. 128 25 3 микарда, инкубированной в течение 24 часов в гипоксии**

Митохондрии, глут. +мал. 5 5 3 выделенные из ткани сук.+рот. 120 30 3 микарда, инкубированной в течение 72 часов в гипоксии**

Х2> - среднеквадратичное отклонение

М- количество экспериментов

- дыхание в состоянии 3 по Чансу

- дыхание не стимулируется разобщителем и АДФ

При этом фосфорилирующая функция митохондрий экспериментальной ткани полностью нарушена: добавление АДФ не стимулирует скорость дыхания, мембранный потенциал (АТ) после добавления субстратов дыхания незначительно возрастает, но затем быстро спонтанно падает (рис. 7). время(сек)

Рис. 7. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный потенциал (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях гипоксии в течение 24 часов. Добавки: см. рисунок 6.

Сукцинатоксидазная активность остаётся без изменений даже через 72 часа инкубации экспериментальной ткани в условиях гипоксии. Это показано на рис. 8, где видно, что скорость дыхания митохондрий на субстрате второго комплекса (сукцинат) не падает по сравнению со скоростью дыхания контрольных митохондрий. Но уже через 72 часа инкубации ткани миокарда в гипоксии полностью подавляется малатоксидазная активность митохондрий, т.е. после добавления субстратов первого комплекса (глутамат и малат) стимуляции дыхания не происходит (рисунок 8. таблица 1). Добавление АДФ не стимулирует скорости дыхания, мембранный потенциал (АЧ') не возрастает. время(сек)

Рис. 8. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный потенциал (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях гипоксии в течение 72 часов. Добавки см. рисунок 6, КСЫ - 1мМ КСМ.

Результаты проведённых исследований показывают, что система окислительного фосфорилирования митохондрий экспериментальной ткани быстро разобщается в процессе инкубации ткани в условиях гипоксии: стимуляция скорости дыхания при добавлении АДФ не происходит.

При этом функция дыхательной цепи сохраняется длительное время: малатоксидазная активность регистрируется в течение 24 часов инкубации, а сукцинатоксидазная активность регистрируется в течение 72 часов инкубации.

Как уже указывалось выше, нами была предпринята попытка получить фракцию мелких электронно-плотных митохондрий. Однако, полученные объёмы фракции не позволяли провести функциональные исследования этой группы митохондрий.

2.2 Выявление цитохром с-оксидазной активности митохондрий изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

Исследования на изолированных из экспериментальной ткани фракциях митохондрий не позволяют получить полную функциональную характеристику всех морфологических типов гетерогенной популяции митохондрий.

Кроме того, приведённые выше функциональные характеристики митохондрий экспериментальной ткани отражают особенности функционирования суспензии изолированных из ткани митохондрий, в то время как огромный интерес представляет получение функциональных характеристик гетерогенной популяции митохондрий кардиомиоцитов исследуемой экспериментальной ткани непосредственно in situ, без разрушения ткани.

Мы провели исследование на цитохром с - оксидазную (ЦО) активность митохондрий кардиомиоцитов после 3 суток инкубации ткани в условиях гипоксии широко известным в литературе с 1968 г методом электронно-микроскопической гистохимии (Seligman et al., 1968; Novikoff and Goldfischer, 1969; Nonaka et al., 1989; Angermuller et al., 1998; Walker and Benzer, 2004). Метод основан на способности цитохрома с окислять 3,3*-диаминобензидин (ДАБ). ДАБ проникает в межмембранное пространство митохондрий, но не идет в матрикс. В комплексе IV (ЦО) дыхательной цепи митохондрий в первом шаге цитохромоксидазной реакции митохондрий происходит окисление ДАБ цитохромом с, что приводит к полимеризации ДАБ-а. Полимеры вступают в реакцию с оксидом осмия, образуя осмиофильный осадок (схема 1). пространство между ограничивающими митохондрию наружной и внутренней мембранами, благодаря чему места активной работы цитохром с -оксидазы четко видны на электронно-микроскопических препаратах.

На фот. 20 электронно-микроскопическая картина участка кардиомиоцита контрольной ткани миокарда, полученная в результате проведения реакции на цитохром с - оксидазную активность. Видно, что внутрикристное пространство большинства митохондрий контрольной ткани заполнено электронно-плотным осадком. На фот. 22 - митохондрия кардиомиоцита контрольной ткани миокарда на большем увеличении. Можно видеть электронно-плотный осадок между наружной и внутренней, ограничивающими митохондрию мембранами и во внутрикристном пространстве.

После длительного действия гипоксии картина реакции резко меняется. На фот. 21, а - обзорная электронно-микроскопическая фотография участка кардиомиоцита изолированного кусочка ткани миокарда, инкубированного 72 часа в условиях гипоксии. Видна выраженная гетерогенность реакции в митохондриях. Митохондрии, имеющие электронно-плотный матрикс, проявляют хорошо выраженную цитохромоксидазную активность. Обводненные митохондрии, и, в частности, содержащие электронно-плотную митохондрию, частично или полностью лишены окраски на активность IV комплекса дыхательной цепи. В большинстве случаев, в таких митохондриях во внутрикристном, и в межмембранном пространстве осадок отсутствует (фот. 23). Однако вновь образованная при инкубации ткани в условиях гипоксии в межмембранном пространстве мелкая, электронно-плотная митохондрия всегда показывает выраженную реакцию на цитохром с - оксидазную активность (ЦО+). Детально картина цитохром с - оксидазной активности в мелкой, электронно-плотной митохондрии, расположенной в межмембранном пространстве более крупной, электронно-светлой показана на фот.23. При большем увеличении четко видно, что внутри электронно-плотной митохондрии по всей длине мембран крист присутствует мелкодисперсный осадок, в то время как в основной митохондрии реакция на цитохром с - оксидазу отсутствует (ЦО").

Сравнение картины реакции митохондрий контрольной ткани (фот. 20) и картины реакции митохондрий экспериментальной ткани, содержащей мелкую, электронно-плотную митохондрию (фот. 21), показывает локальную сохранность цитохром с - оксидазной активности только лишь в мелкой электронно-плотной митохондрии, при полном отсутствии цитохром с - оксидазной активности в основной митохондрии.

В экспериментальной ткани можно наблюдать различные стадии формирования новой структуры внутри электронно-светлой митохондрии. При этом вновь образующаяся структура всегда имеет положительную реакцию на цитохром с - оксидазную активность. На фот. 24 - электронно-микроскопическая фотография, на которой представлена одна из стадий образования мелкой электронно-плотной митохондрии, полученная при проведении реакции на цитохром с - оксидазную активность. На четырёх последовательных ультратонких срезах можно видеть одну из начальных стадий формирования новой митохондрии внутри более крупной митохондрии основной популяции. Видно, что основная митохондрия еще не полностью утратила свою функциональную активность. Внутрикристное пространство многих крист заполнено электронно-плотным осадком. В центре митохондрии расположена замкнутая полость, ограниченная мембраной, по всей поверхности которой можно видеть хорошо выраженный обильный слой мелкодисперсного осадка. Формирующиеся мембранные слои внутри этой структуры так же дают выраженную положительную реакцию на активность цитохром с - оксидазы. Т. е. образование новой мембранной структуры внутри митохондрии идет при активной цитохром с -оксидазе во вновь дифференцирующемся компартменте.

Как можно видеть из данных, приведённых в 1-ой главе, мелкие электронно-плотные митохондрии обнаруживаются не только в электронно-светлых огранеллах, но и в митохондриях, сохранивших определённый уровень электронной плотности. В таких митохондриях продукт реакции обнаруживается не только в мелких электронно-плотных митохондриях, но и в незначительном количестве в основных митохондриях. На фот. 25 представлена такая митохондрия основной популяции, в которой в незначительной степени выявляется продукт реакции, внутри которой находится мелкая электронно-плотная митохондрия со значительным проявлением реакции,

Как нами было показано ранее, удивительной особенностью наших экспериментальных условий является значительное количество межмитохондриальных контактов нативной структуры в кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда после длительного действия гипоксии. При исследовании цитохром с - оксидазной активности митохондрий кардиомиоцитов в наших экспериментальных условиях оказалось, что в области межмитохондриальных контактов видна ярко выраженная ЦО+ реакция. На фот. 26 - электронно-микроскопическая фотография распределения активности цитохромоксидазы в структуре межмитохондриальных контактов в ткани миокарда, инкубированной 72 ч в условиях гипоксии. На фотографии четко видно, что в области межмитохондриальных контактов пространство между наружной и внутренней митохондриальной мембранами ЦО\ в то время как в пространстве между ограничивающими данную митохондрию мембранами продукт реакции - мелкодисперсный осадок не выявляется. Но самое удивительное, что в участке непосредственного контактирования двух митохондрий четко выявляется цитохром с - оксидазная активность. В контрольной ткани в отличие от экспериментальной межмитохондриальные контакты нам наблюдать не удалось. По нашему мнению, это можно объяснить тем, что согласно использованной методике ткань инкубируется в течение 3 ч при температуре 37°С. В таких условиях межмитохондриальные контакты нативной ткани разрушаются (Тихова и др., 1988). Тем удивительнее являются результаты наших наблюдений многочисленных межмитохондриальных контактов в экспериментальной ткани, которая также инкубировалась 3 ч при температуре 37°С.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что межмитохондриальные контакты - это не только механическая интеграция митохондрий, а в наших экспериментальных условиях межмитохондриальные контакты осуществляют активную метаболическую кооперацию.

Чтобы выяснить, не является ли обнаруженное нами явление образования «митохондрий внутри митохондрий» артефактом условий эксперимента, а также для выяснения ультраструктурного механизма возникновения необычной митохондриальной популяции мы провели исследование состояния ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубируемых 72 часа в условиях гипоксии, через 6, и далее через каждые 12 ч.

Исследование ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубируемых в условиях гипоксии, были начаты с 6 ч инкубации ткани. На фот. 27, 28, 29 электронно-микроскопические фотографии участков изолированного миокарда, инкубированного 6 ч в условиях гипоксии. Популяция митохондрий одинакова по своей ультраструктуре - это органеллы со сжатым, электронно-плотным матриксом, параллельно ориентированными кристами. Характерным ультраструктурным признаком митохондриальной популяции кардиомиоцитов на данное время инкубации являются необычные структурные образования внутри митохондрий (на фот. 27, 28 показано стрелкой, 29). Детально особенности внутренней организации митохондрий через 6 ч инкубации в ткани миокарда в условиях гипоксии показаны на фот.

30, а, б. Первоначально в межмембранном пространстве митохондрий возникают незначительные по размеру (расположенные в пределах 1.5-2 серийных срезов) электронно-прозрачные замкнутые полости, диаметр которых составляет порядка 0.15 мкм (фот. 30 а, стрелка на рис. а). Далее, как видно на электронно-микроскопических фотографиях (фот. 31, а, б), в эту полость перемещается участок матрикса, ограниченный внутренней митохондриальной мебраной (фот. 31, б). Представленные на электронно-микроскопических фотографиях фот. 30, б, 31, а, б, 32 а, б, в, г) митохондрии имеют обводненный матрикс, что позволяет детально видеть организацию этих структур внутри митохондрии. Стрелкой показано перемещение петлеобразной складки внутренней мембраны с примыкающим к ней матриксом в полость, образованную внутренней митохондриальной мембраной. Необходимо отметить, что в одной митохондрии могут возникать начальные стадии образования нескольких таких структур (фот. 32 а, б, в, г). Далее происходит отшнуровывание этого участка матрикса, ограниченного внутренней митохондриальной мембраной. Нужно заметить, что на этой стадии вокруг полости образуется электронно-плотный слой (фот. 33 а, показано стрелкой). Это структурное образование далее развивается в новую митохондрию.

Так, через 12 ч инкубации ткани при гипоксии наблюдается увеличение этих структур внутри митохондрий и формирование их мембранного содержимого (фот. 33, а, б). На большом увеличении видно, что эта структура уже имеет ограничивающие мембраны (фот. 33, б). Также видно, что вновь образованная структура не связана с основной митохондрией, кристы митохондрии основной популяции как бы «обрываются», образуя замкнутую полость, окружающую вновь образующуюся структуру. Электронно-плотный слой вокруг этой структуры сохраняется. На данный срок инкубации во все большем количестве митохондрий происходит формирование этих структурных новообразований и в пределах одного среза можно видеть различные стадии этого процесса. То есть процесс формирования новых структур внутри митохондрий происходит не одномоментно во всех митохондриях, а постепенно затрагивает все новые органеллы.

На 24 ч инкубации в условиях гипоксии в ткани присутствует уже значительное число митохондрий, внутри которых можно наблюдать образование мелких, электронно-плотных структур -предшественников митохондрий. На этот срок инкубации ткани во вновь образованных структурах отчетливо видны концентрические, электронно-плотные мембраны с электронно-плотным матриксом между ними (фот. 34, а, б).

В дальнейшем, в течение двух последующих суток инкубации происходит обособление этих структур, в межмембранном пространстве идёт формирование крист (фот. 33, 34, 35). Электронно-плотный слой, окружающий вновь формирующуюся структуру исчезает. В то же время, ко вторым суткам изменяется морфологическое состояние митохондрий основной популяции, внутри которых формируется новая структура. Происходит обводнение матрикса митохондрий, митохондриальные мембраны становятся как бы лизированными. На их фоне четко видно, что во вновь образованных структурах электронная плотность мембран соответствует плотности мембран митохондрий интактного миокарда. Эти структуры всегда располагаются на краю митохондрии основной популяции. На этой фотографии (фот. 35 а, б) видно, что вновь образующаяся структура расположена внутри кристы, и можно видеть, как эта криста доходит до внутренней митохондриальной мембраны электронно-светлой митохондрии. На следующей фотографии (фот. 36 а, б) видно, что возможно процесс продвижения этой вновь образующейся структуры к краю митохондрии уже завершён. На фот. 37 а, б, в, г - ультратонкие серийные срезы, на которых можно видеть хорошо развитую систему крист во вновь образованной структуре.

К третьим суткам инкубации в ткани присутствуют уже хорошо выраженные, структуры, названные нами как «митохондрии внутри митохондрии». На фот. 38 - электронно-микроскопические фотографии последовательных ультратонких срезов такой митохондрии. Анализ серийных срезов показывает, что в межмембранном пространстве электронно-светлой митохондрии

Обсуждение результатов.

Результаты наших исследований показали, что длительное действие гипоксии (72часа) вызывает ультраструктурные изменения, сопровождающиеся нарушением функциональной активности митохондрий изолированных кусочков ткани миокарда. Как известно, кислород является одним из основных субстратов системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Поэтому длительное отсутствие кислорода должно вызывать прежде всего повреждение этой системы. В наших экспериментах в течение первых 24 часов инкубации ткани в митохондриях происходит разобщение системы окислительного фосфорилирования. Однако, функция дыхательной цепи сохраняется длительное время: малатоксидазная активность регистрируется через 24 ч инкубации, сукцинатоксидазная активность регистрируется через 72 ч инкубации, и цитохромоксидазная активность выявляется через 72 ч инкубации.

В этих условиях, на фоне отсутствия в экспериментальной ткани признаков некроза на ультраструктурном уровне и при хорошо выраженных характерных особенностях общей морфологии популяции митохондрий кардиомиоцитов (прежде всего наличия большого количества межмитохондриальных контактов нативной структуры), в кардиомиоцитах экспериментальной ткани возникает особая популяция мелких, электронно-плотных митохондрий, которые обнаруживаются не только среди миофибрилл, но и внутри более крупных митохондрий, составляющих основную популяцию митохондрий кардиомиоцитов.

Возникающие в митохондриях основной популяции кардиомиоцитов мелкие электронно-плотные митохондрии обнаруживают хорошо различимую цитохром с-оксидазную активность по всей длине образующихся крист, в то время как основная митохондрия, внутри которой формируется новая органелла, частично или полностью утрачивает цитохром с - оксидазную активность.

Это обнаруженное нами явление образования "митохондрий внутри митохондрий" не является артефактом условий эксперимента, поскольку популяция мелких электронно-плотных митохондрий может быть выделена как самостоятельная фракция при получении суспензии изолированных митохондрий экспериментальной ткани. Кроме того, нами был установлен и детально исследован процесс возникновения этих структур в динамике.

Выявленная в нашей работе структурно-морфологическая картина преобразования митохондриального аппарата кардиомиоцитов, обусловленная условиями гипоксии, значительно отличается от имеющихся в литературе представлений. Как следует из всех рассмотренных нами работ, в литературе как наиболее типичные изменения ультраструктурной организации митохондрий в условиях гипоксии, описаны различные формы набухания митохондрий. Точка зрения о том, что набухание митохондрий - это реакция клетки на дефицит кислорода утвердилась также и в области исследований патологии клетки (Авцын А., Шахламов В., 1979; Пауков B.C., Гавришин A.C., 1987, Фролов В.А. и соавт., 1989). Однако результаты исследований в наших экспериментальных условиях показали, что только после 24 часов действия гипоксии происходит "просветление" матрикса отдельных митохондрий, набухание, также лишь отдельных органелл, можно наблюдать начиная с 72 часов экспериментальных условий. Эти преобразования ультраструктуры митохондрий происходили на фоне практически не изменённой общей структуры кардиомиоцитов, что указывает на отсутствие признаков некроза в наших экспериментальных условиях и, следовательно, можно сделать вывод о физиологичности нашей модели.

Возникает вопрос, с чем связано возникновение такой популяции электронно-плотных митохондрий - с процессом развития дегенеративных изменений в клетке или с механизмом выживания клетки в экстремальных условиях. Наши данные сопоставимы с результатами работ Артюхиной и Саркисовой (1997) по острой гипоксии. У крыс, выживших после периода острой ишемии мозга (48 ч), наблюдалось постепенное восстановление двигательных реакций.

Этот процесс сопровождался появлением в клетках мозга большого числа мелких митохондрий, поэтому возможно, что в нашей модели возникновение мелких, электронно-плотных митохондрий внутри митохондрий основной популяции также отражает механизм выживания клетки. В пользу этого предположения говорит и другой факт. Основная популяция митохондрий с более светлым матриксом имеет бледные, менее электронно-плотные как бы лизированные мембраны, что может указывать на процесс деградации основной популяции митохондрий.

Влияние аноксии на структуру митохондриального аппарата подробно было изучено на дрожжевых клетках в рамках проблемы роли окислительного фосфорилирования в поддержании целостности митохондрий in vivo (Linnane et al., 1962; Мейсель и др., 1962; Мейсель и др., 1964; Wallace et al., 1968; Luzikov et al., 1971). Было показано, что переход дрожжей от аэробного роста к спиртовому брожению сопровождается деградацией митохондрий, однако в условиях аноксии никогда не наступает полное исчезновение митохондриальных структур, происходит возникновение особых митохондриальных структур - «промитохондрий». Впервые они были обнаружены Платтнером и Шатцом (Plattner, Schatz, 1969). Методом замораживания-скалывания на дрожжевых клетках S. cerevisiae было показано, что в условиях аноксии основная популяция митохондрий деградирует, но при этом возникает особая популяция мелких (0,2 -0,8 мкм), электронно-плотных митохондрий с хорошо выраженными кристами. По размерам, ультраструктуре и расположению крист «промитохондрии» соответствуют электронно-плотным митохондриям, обнаруженным нами при длительной инкубации кусочков миокарда в условиях гипоксии.

Образование «промитохондрий», а также «митохондрий внутри митохондрий» - это, очевидно, особый путь деградации митохондрий, отражающий имеющуюся в литературе точку зрения о том, что нормально метаболизирующая митохондрия никогда не деградирует как «целая единица, подвергаясь полной разборке митохондрии, доходящей до стадии полипептидов, глицерина, жирных кислот и т.д., а представляет собой "пластичную" структуру, в которой постоянно осуществляется деградация и обновление белковых, липидных и других компонентов» (Пузиков, 1980).

Также, необходимо отметить, что в наших экспериментальных условиях внутри митохондрий основной популяции кардиомиоцитов наряду с появлением мелких электронно-плотных митохондрий происходили перестройки пространственной организации внутренней мембраны. В митохондриях основной популяции практически в каждой органелле внутренняя мембрана образовывала необычную губчатую ячеистую структуру с ячейками одинаковой конфигурации. Как уже отмечалось выше, внутренние мембраны обводнённых митохондрий выглядели как бы лизированными. Однако в пределах ячеистой структуры, электронная плотность мембран соответствовала плотности мембран митохондрий в клетках интактного миокарда. Пространство между мембранами этого образования было заполнено электронно-плотным материалом матрикса, в то время как пространство остального матрикса митохондрий оставалось обводнённое, электронно-светлое. Основная характеристика этих структурных образований - обратимость перестроек внутренней митохондриальной мембраны. Как показали наши исследования, при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 M сахарозе эти структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны исчезают. Нам никогда не удавалось обнаружить эти структуры в изолированных митохондриях.

В литературе описаны отдельные примеры необычных перестроек внутренней мембраны митохондрий. Так, при действии на клетку различных стрессовых факторов - после длительного голодания у амёбы Chaos carolinensis ( Deng, Mieczkowski, 1998; Deng et al., 1999), в сетчатке глаза глубоководных рыб Galaxia platei, живущих в постоянной темноте, - происходят изменения внутренней структуры митохондрий с образованием внутренней митохондриальной мембраной трёхмерной периодической кубической структуры. Факторы, которые индуцируют образование структур такого типа до настоящего времени строго не установлены.

В нашей модели гипоксия является сильным стрессовым воздействием на клетку. Можно предположить, что наблюдаемые нами ультраструктурные изменения внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов также могут быть компенсаторной реакцией, обеспечивающей более высокую жизнеспособность митохондрий клетки в экстремальных условиях гипоксии.

Возникающие в условиях экспериментально вызванной кислородной недостаточности изолированной ткани миокарда ультраструктурные особенности митохондрий неотделимы от нарушений функциональных процессов в ткани миокарда, лишенной кислорода. Обширная литература по ультраструктурным, цитохимическим и биохимическим изменениям миокарда изобилует данными, свидетельствующими о том, что наряду с деструктивными процессами в поврежденном миокарде, как правило, протекают регенеративные процессы (Саркисов и Втюрин, 1967; Глаголева и Чечулин, 1968; Хитров Н.К., Пауков B.C., 1972; Саркисов, 1977; Авцын и Шахламов, 1979; Румянцев, 1982; Пауков B.C., Фролов В.А., 1982). П. П. Румянцев (1982) определяет желудочковые миоциты как в высшей степени пластичные клетки, способные к резкой активации биосинтезов и глубокой ультраструктурной реорганизации, включающей новообразование огромного числа специализированных структур и клеточных органелл. В работах Глаголевой и Чечулина (1968) описывается новообразование миофибрилл, митохондрий и других внутриклеточных структур в клетках миокарда в условиях экспериментальной ишемии. Авторы исследовали ультраструктурную организацию миокарда на различных стадиях экспериментальной ишемии. Было показано, что на 5 - 7 сутки после перевязки коронарной артерии в мышечных волокнах миокарда обнаруживаются кардиомиоциты, в которых присутствуют скопления мелких (0.5 - 1 мкм) митохондрий, содержащих большое число плотно упакованных крист. Как мы отмечали в обзоре литературы, аналогичные данные были получены и в более современных работах, выполненных на высоком методическом уровне (James et al., 1993; Jamesl., 1994). Рассмотренные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов в литературе трактуются как признаки внутриклеточной регенерации (Саркисов и Втюрин, 1967; Глаголева и Чечулин, 1968; Саркисов, 1977; Авцын и Шахламов, 1979; Румянцев, 1982). В литературе присутствует точка зрения, что в митохондриях ткани миокарда возможно не только воспроизведение новых митохондрий, но и реконструкция поврежденных органелл. Так, Демлинг с соавт. (Deimling et al., 1960) показали регенерацию крист с внутренней стороны наружной митохондриальной мембраны. Возможно, что эти авторы также наблюдали описанный нами процесс образования митохондрий внутри митохондрий, однако недостаточный методический уровень и низкая разрешающая способность электронных микроскопов тех лет не позволили авторам детально разобраться в обнаруженном ими явлении. Внутриклеточный регенеративный процесс был назван Глаголевой и Чечулиным (1968) частью «борьбы за существование», и эти авторы сделали вывод, что восстановление миокардиальных клеток происходит путем внутриклеточной регенерации, которая, по их мнению, является ультраструктурной основой восстановления нарушенной функции сердца.

Также ультраструктурной основой поддержания функционирования кардиомиоцитов на наш взгляд является и обнаруженная нами повышенная стабильность хорошо выраженных межмитохондриальных контактов в ткани миокарда в наших экспериментальных условиях. Ультраструктура межмитохондриальных контактов была описана уже давно (Бакеева и др., 1982). Использование классического метода обработки ткани миокарда коллоидным лантаном показало, что лантан откладывается избирательно в зоне межмитохондриальных контактов, но не сплошным слоем, а в виде упорядоченно расположенных электронно-плотных гранул, аналогично отложению в зоне вставочного диска, где он выявляет морфологию межклеточного контакта (Сударикова и соавт., 2000). Нам впервые удалось получить функциональную характеристику этой межмембранной контактной структуры методом электронно-микроскопической гистохимии, которая позволяет сделать вывод: межмитохондриальные контакты обеспечивают не только механическую интеграцию митохондрий, но и активную метаболическую кооперацию в наших экспериментальных условиях. Обнаруженная нами картина цитохром с - оксидазной активности в области межмитохондриальных контактов экспериментальной ткани свидетельствуют о развитии определённых межмитохондриальных взаимодействий, которые отражают, очевидно, возникновение более интенсивной функциональной связи между митохондриями в наших экспериментальных условиях. Эти результаты являются убедительным подтверждением данных об обеспечении межмитохондриальными контактами функциональной непрерывности митохондриальных мембран контактирующих митохондрий (Бакеева и др., 1977; Скулачев, 1989). Таким образом, нами получено еще одно подтверждение того, что межмитохондриальные контакты можно рассматривать как системообразующие элементы клеточной организации.

В литературе общепринята точка зрения, что условия гипоксии индуцируют апоптоз в кардиомиоцитах. Так, на клетках культуры кардиомиоцитов показана индукция апоптоза в бескислородных условиях (вио et а1., 2001, КиЬав^ак е! а1., 2002). Характерная особенность апоптоза кардиомиоцитов - отсутствие выхода цитохрома с из митохондрий.

Однако полученные нами ультраструктурные характеристики кардиомиоцитов не позволяют однозначно утверждать о наличии или отсутствии развития апоптоза в наших экспериментальных условиях. Прежде всего не регистрируется основной ультраструктурный признак апоптоза - маргинация хроматина, отсутствуют характерные зоны уплотнения в кардиомиоцитах, а так же отшнуровывания участков кардиомиоцитов - апоптотические тельца. И, наконец, данные нашего гистохимического исследования локализации цитохрома с выявляют действительную неоднородную картину утраты цитохрома с лишь отдельными митохондриями, которая начинается после 24 часов инкубации ткани и достигает максимума в наших экспериментальных условиях к 72 часам. Состояние ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов также не соответствует существующим морфологическим критериям апоптоза.

В то же время наши экспериментальные данные можно рассматривать с позиции развиваемых В.П. Скулачевым современных представлений о митоптозе (процессе самоликвидации митохондрий) (Skulachev, 1998; 1999; Скулачев, 1999; 2000; 2005; Skulachev et al., 2004;). По мнению В.П. Скулачева, явление самоуничтожения (апоптоза) необходимо рассматривать более широко, не только применительно к тканевой кинетике, но и на субклеточном уровне. В настоящее время очевидно, что митохондрии, подобно клеткам, располагают программой самоликвидации (митоптозом). Возможно, что обнаруженная в наших экспериментальных условиях деградация отдельных органелл исходной популяции митохондрий кардиомиоцитов, - один из механизмов митоптоза, направленного на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью, поскольку очевидно, что функции митоптоза не исчерпываются только лишь антиоксидантной защитой клетки.

Заключение.

Полученная нами на ультраструктурном уровне морфологическая картина изменений митохондриальной популяции кардиомиоцитов под действием гипоксии значительно отличается от имеющихся в литературе представлений. Не смотря на огромное количество работ по изучению действия гипоксии на ультраструктуру миокарда, авторы единодушно отмечают однотипность изменений митохондрий, характерной реакцией которых, по их мнению, является набухание митохондрий, разрушение внутренней митохондриальной мембраны, а в далеко зашедших стадиях процесса - сохранение лишь наружной митохондриальной мембраны. В то же время ряд авторов считают, что наступающие под влиянием острой гипоксии изменения в ультраструктурной организации мышечных клеток сердца являются обратимыми (Саркисов, Втюрин, 1967).

Обнаруженные нами удивительные ультраструктурные изменения кардиомиоцитов, обусловленные длительным действием гипоксии, не могут быть идентифицированы как результат развития апоптоза или некроза, ультраструктурные признаки, являющиеся морфологическими критериями развития этих процессов обнаружены нами не были. Напротив, обращает на себя вниманиепоразительная стабильность и функциональная характеристика межмитохондриальных контактов, в то время как во всех предыдущих исследованиях этих межмембранных контактных структур отмечалась чрезвычайная чувствительность межмитохондриальных контактов к различного рода воздействиям на клетку. Очевидно, что обнаруженные нами особенности межмитохондриальных контактов экспериментальной ткани убедительно свидетельствуют не только о наличии функционально единой митохондриальной системы в кардиомиоцитах, но и отражают возникновение более интенсивной функциональной связи между митохондриями в наших экспериментальных условиях, что можно было бы охарактеризовать, как часть «борьбы за существование», когда в условиях эксперимента мобилизуются регенераторные потенции ткани.

Возникновение мелких электронно-плотных митохондрий в наших экспериментальных условиях сопоставимо с хорошо известным в литературе явлением образования промитохондрий в клетках дрожжей БассЬаготусез сеге^мае в анаэробных условиях. Возможно, что использованная в этих исследованиях фиксация перманганатом калия не позволила выявить или возможно вызывала нарушение деградирующих мембран митохондрий дрожжевых клеток, в результате чего был сделан вывод о наличии в клетках только мелких митохондрий с незначительным количеством крист. Т.е., условия кислородной недостаточности очевидно являются сигналом к индукции процесса образования мелких электронно-плотных митохондрий. Вероятно, что ультраструктурная перестройка системы митохондриального ретикулума кардиомиоцитов - появление особых структурных образований митохондрий внутри митохондрий обусловлено нарушением митохондриального метаболизма АФК, а так же генерации и удаления АФК в наших экспериментальных условиях кислородной недостаточности.

Чётко выраженная функциональная активность цитохром с оксидазы в электронно-плотных митохондриях, локализованных в межмембранном пространстве основной митохондрии, полностью утратившей функциональную активность, указывает на стремление клетки выжить, сохранив в рабочем состоянии хотя бы часть митохондрии. В то же время очевидно, что деградация отдельных митохондрий основной популяции, сопровождающаяся появлением мелких электронно-плотных митохондрий - отражает один из возможных механизмов митоптоза, направленного на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью.

Выводы

1. Установлено, что в экспериментальных условиях инкубации изолированных кусочков миокарда при гипоксии в течение 72ч при 20°С в мышечных клетках миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит, ультраструктурные признаки некроза отсутствуют.

2. Впервые обнаружена неизвестная ранее локальная перестройка внутренней организации митохондрий с образованием трёхмерно упорядоченных структур, возникающая в экспериментальной ткани миокарда наряду с хорошо известными в литературе для гипоксии изменениями ультраструктуры митохондрий: внутрикристными включениями, септированными митохондриями. Показано, что обнаруженные структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны обротимы - при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0.25 М сахарозе они исчезают.

3. Показано, что в процессе инкубации изолированных кусочков миокарда в условиях гипоксии в кардиомиоцитах экспериментальной ткани возникает особая популяция мелких электронно-плотных митохондрий, локализованных в межмембранном пространстве крупных электронно-светлых митохондрий основной популяции этих органелл кардиомиоцитов.

4. Установлено, что структурное образование митохондрий внутри митохондрий не является артефактом условий эксперимента - эти структуры сохраняются в процессе выделения митохондрий. Популяция мелких электронно-плотных митохондрий может быть выделена как самостоятельная фракция.

5. Обнаружено, что возникающие в митохондриях основной популяции кардиомиоцитов мелкие электронно-плотные митохондрии обнаруживают хорошо различимую цитохром-с-оксидазную активность по всей длине образующихся крист, в то время как основная митохондрия, внутри которой формируется новая органелла, частично или полностью утрачивает цитохром-с-оксидазную активность.

6. Впервые был установлен и детально исследован процесс возникновения митохондрий внутри митохондрий в динамике.

7. Найдено присутствие значительного количества межмитохондриальных контактов нативной структуры, характеризующихся повышенной стабильностью, в кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда после длительного действия гипоксии. Межмитохондриальные контакты экспериментальной ткани, в отличие от межмитохондриальных контактов контрольной ткани, сохраняют нативность при инкубации в течение 3 часов при температуре 37 °С.

8. Впервые получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов методом электронно-микроскопической гистохимии. Показано, что в структуре межмитохондриальных контактов чётко выявляется цитохром с оксидазная активность.

9. Обнаруженное в экспериментальных условиях гипоксии образование неизвестного ранее структурного образования митохондрий внутри митохондрий возможно отражает особый путь деградации митохондрий - один из механизмов митоптоза, направленного на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью.

Список литературы.

Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки. // М.:Медицина - 1979. - 320С.

Амеченкова A.A., Бакеева Л.Е., Драчёв В.А., Зоров Д.Б., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. Митохондриальный электрический кабель. // Вест.Моск.ун-та. Сер. Биол. - 1986. - №3. - С.3-15.

Артюхина Н. И. & Саркисова К. Ю. Ультраструктурные изменения митохондрий в мозге у крыс с разным типом поведения как показатель тяжести ишемии мозга. // Доклады АН. - 1997. -Т.357. - С.839-843.

Ашмарин И. П. Элементы патологической физиологии и биохимии. // М: МГУ. -1997. - 238с.

Бакеева Л.Е., Ясайтис A.A., Изменения структуры митохондрий в ответ на функциональные воздействия.// Сб. Митохондрии. М.: Наука. 1972. С.56-64.

Бакеева Л.Е., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С., Митохондриальный ретикулум: строение и возможные функции внутриклеточных структур нового типа в мышечной ткани. II Вестн. Моск. ун-та. -1977.-№3.-С.23-38.

Бакеева Л.Е., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. Межмитохондриальные контакты кардиомиоцитов. // Цитология. -1982. - №2-С.161-166.

Бакеева Л.Е., Шевелёв Ф.Ф., Ченцов Ю.С., Скулачёв В.П. Изучение структуры межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов крыс методом замораживания-скалывания. // Биологич. Мембраны. - 1985. - Т.2. - №2. - С.133-143.

Бокерия Л.А., Бескровнова H.H., Цыпленкова В.Г., Голухова Е.З., Бескровнова Ф.В. Морфологический анализ аритмогенных и неаритмогенных зон субэндокардиальных отделов сердца у больных с нарушениями ритма. //Арх. Патол. - 1995. -№4:51-56.

Боровягин В.Л., Бирюзова В.И., Гилев В.П., Киселёв И.А., Тихоненко A.C., Ченцов Ю.С. Электронно-микроскопические методы исследования биологических объектов. // И.АН СССР -1963. -80С.

Глаголева В.В. Чечулин Ю.С. Ультраструктурная основа нарушения функции сердечной мышцы. // Атлас. М.: Наука. -1968.-73 с.

Кроленко, С. А., Рижамадзе, Н. А. Разрушение миофибрилл во время распространяющегося повреждения. III. Изолированные мышцы крысы.// Цитология. - 1979.Т.21. - Р. 1016-1020.

Лосев Н.И. Хитров Н.К. Патофизиология гипоксических состояний и адаптации организма к гипоксии. // М.:Мед. - 1982. 226С.

Лосев Н.И. Хитров Н.К., Грачёв C.B. Патология экстремальных состояний. //1 Мое. мед. ин-т им. И.М.Сеченова - 1988. 71 С.

Лузиков В.Н. Регуляция формирования митохондрий. // М.:Наука. -1980.-318с.

Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических поражений сердца. // М.: Наука - 1984. - 269С.

Мейсель M. Н., Бирюзова В. И., Волкова Т. М., Малатян M. Н., Медведева Г. А. Функциональная морфология и цитохимия митохондриального аппарата микроорганизмов. // В сб. Электронная и флуоресцентная микроскопия клетки. М.-Л., Наука: -1964.-1-15.

Мейсель M. Н., Медведева Г. А., Бирюзова В. И., Волкова Т. М. Сравнительное исследование микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток дрожжей Saccharomyces vini и Rhodotorulaglutinis. // Микробиология. XXXI, -1962.-6-1011.

Непомнящих Л.М., Е.Л. Лушникова, Д.Е. Семенов. Ультраструктурные изменения митохондрий в кардиомиоцитах при регенераторно-пластический недостаточности миокарда. // Бюлл. эксп. биол. и медиц. - 2001. - V.131. - Р. 218-222.

Пауков B.C., Фролов В.А. Элементы теории патологии сердца. М.:Мед. 1982. -270С.

Пауков B.C., Гавришин A.C. Новый тип адаптационной реакции -лабильное ассоциирование митохондрий кардиомиоцитов. // IV Всес. конф. по патол. клетки: тез. докл. - 1987.М., С.66.

Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. //Л: Наука. 1982. - 320 с.

Рыбакова М.Г., Гудкова А.Я. Апоптоз и заболевания сердца. // Цитология. - 2004. - V.46. - Р.389-394.

Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы // М.Мир, 1967.

Саркисов Д.С., Втюрин Б.В. Электронная микроскопия деструктивных и регенераторных внутриклеточных процессов. // М: Медицина. -1967. - 224 с.

Саркисов Д.С., Втюрин Б.В. Электронно-микроскопический анализ повышения выносливости сердца. М.:Медицина, 1969. - 170С.

Саркисов Д.С. Очерки по структурным основам гомеостаза. // М: Медицина. - 1977. - 349 с.

Серов В.В., Пауков B.C. Ультраструктурная патология. // Наука, 1975.431С.

Скулачёв В.П. Аккумуляция энергии в клетке. // М.: Наука, - 1969. -440С.

Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. // М: Наука. -1989.-564 с.

Скулачев В. П. Снижение внутриклеточной концентрации О 2 как особая функция дыхательной системы клетки. // Биохимия. -1994. - Т.59. - С.1910-1912.

Скулачев В. П. В своем межмембранном пространстве митохондрия таит "белок самоубийства", который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз. // Биохимия. - 1996. - Т.61. - С.2060-2063.-не берём

Скулачев В.П. Старение организма - особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое обоснование гипотезы Вейсмана. // Биохимия. -1997.-V.62: 1394-1399.

Скулачев В. П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма. //Биохимия. - 1999. - Т.64. - С.1679-1688.

Скулачев, В. П. Кислород и явление запрограммированной смерти. // Первое северинское чтение М: ИБМХ РАМН, - 2000. -47С.

Скулачев, В. П. Старение как атавистическая программа, которую можно попытаться отменить. Вестник РАН. - 2005. - 9 : 831-843.

Сударикова Ю. В., Бакеева Л. Е., & Цыпленкова В. Г. Деструктивные изменения митохондрий кардиомиоцитов человека при алкогольном поражении сердца. // Архив патологии. -1998.- N06.-С. 19-23.

Сударикова Ю. В. Ультраструктура митохондриального аппарата при алкогольной кардиомиопатии. // 2000. - Канд. дисс. - 270с.

Тихова М.Г., Л.Е. Бакеева, Ю.С. Ченцов. Изучение устойчивости межмитохондриальных контактов в процессе препаративного выделения митохондрий. // Биол. Мембраны. - 1988. -У.5. -Р.970-978.

Фролов В.А., Пухлянко В.П. Морфология митохондрий кардиомиоцита в норме и патологии. // М.: Изд. Ун-та др.нар. -1989. 141С.

Хитров Н.К., Пауков B.C. Адаптация сердца к гипоксии. М.:Медицина, 1972. 237С.

Цыпленкова В.Г., Бескровнова H.H. Морфология миокарда при синдроме Вольфа-Паркинсона-Уайта. //Архив патологии. - 1999,-V.6. - Р.13-18.

Angermuller S. Kunstle G, Tiegs G. Pre-apoptotic alterations in hepatocytes of TNFalpha-treated galactosamine-sensitized mice. // J. Histochem. Cytochem. - 1998. - V.46. - №10.-P.1175-1183.

Atkinson A.W., John P.C.L., Gunning B.E.S. The growth and division of the single mitochondrion and other organelles during the cell cycle of Chlorella, studied by quantitative stereology and three dimensional reconstruction. // Protoplasma. - 1974. - V.81. - P.77-109.

Bakeeva L. E., Chentsov Yu. S., Jasaitis A. A., & Skulachev V. P. The effect of oncotic pressure on heart muscle mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. - 1972. - V.275. - P.319-332.

Bakeeva L. E., Chentsov Yu. S., Skulachev V. P. Intermitochondrial contacts in myocardiocytes. // J. Mol. Cell Cardiol. - 1985. - V.15. -P.413-420.

Bergeron M., Guerette D., Forget J., Thiery G. Three- dimensional characteristics of the mitochondria of the rat nephron. // Kidney Int. -1980. -N/.17:175-186.

Borgers M, Voipio-Pulkki L, Izumo S. Apoptosis. // Cardiovasc Res. -2000. Feb;45(3):525-527.

Borovjagin VL., Ivanina TA., Moshkov DA. The ultrastructural organization of the protoreceptor membranes and the intradisc spaces of the vertebrate retina as revealed by various experimental treatments. Vision Res, 1973. V.13.№ 4.P.745-752.

Bryant R., Thomas W., O'Neal R. An Electron Microscopic Study of Myocardial Ischemia in the Rat. // Circ. Research. - 1958. -V.6(11):699-709.

Burton M.D., Moore J. The mitochondrion of the flagellate, Polytomella agilis // J. Ultrastr. Res. - 1974. - V.48. - P. 414-419.

Caulfield J., Klionsky B. Myocardial ischemia and early infarction: an electron microscopic study. // Am. J. Pathol. - 1959. - V.35.:489-523.

Chance B., Williams G.R. Respiratory Enzymes in Oxidative phosphorylation. III. The Steady State. II J. Biol. Chemistry. - 1955. -V.217.-P.409.

Chen C., Chen L., Fallon J., Ma L., Bow L„ Knibbs D., McKay R., Gillam L., Waters D. Functional and Structural Alterations With 24Hour Myocardial Hibernation and Recovery After Reperfusion. // Circulation. -1996. V.94.:507-516.

Chen C, Ma L, Linfert DR, Lai T, Fallon JT, Gillam LD, Waters DD, Tsongalis GJ. Myocardial cell death and apoptosis in hibernating myocardium. IIJ Am Coll Cardiol. - 1997a. - Nov 1;30(5):1407-12.

Chen C, Ma L, Dyckman W, Santos F, Lai T, Gillam LD, Waters DD. Left ventricular remodeling in myocardial hibernation. // Circulation. -1997b. - Nov.4;96(9Suppl):ll-46-50.

Chen C, Liu J, Hua D, Ma L, Lai T, Fallon JT, Knibbs D, Gillam L, Mangion J, Knight DR, Waters D. Impact of delayed reperfusion of myocardial hibernation on myocardial ultrastructure and function and their recoveries after reperfusion in a pig model of myocardial hibernation. // Cardiovasc PathoL-2000.-Mar-Apr;9(2):67-84.

Costantini P., A.S. Belzacq, H.L. Vieira, N. Larochette, M.A. de Pablo, N. Zamzami, S.A. Susin, C. Brenner, and G. Kroemer. Oxidation of a criticalthiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis. //Oncogene. - 2000. - V.19. - P.307-314.

Deimling O.V., Moelbert E., Duspiva F. Electron microscopic demonstration of a glucose-1-phosphate splitting enzyme in the myocardium of the albino rat. // Beitr. Pathol. Anat. - 1960. - V.123 : 127-143.

Deng Y., Marko M., Buttle K. F., Leith A., Mieczkowski M., & Mannella C. A. Cubic membrane structure in amoeba (Chaos carolinensis) mitochondria determined by electron microscopic tomography. //J. Struct. Biol. -1999. - V.127. - P.231-239.

Deng Y. & Mieczkowski M. Three-dimentional periodic cubic membrane structure in the mitochondria of amoebae Chaos carolinensis. // Protoplasma. - 1998. - V.203. - P. 16-25.

Desagher S., and J.-C. Martinou. Mitochondria as the central control point of apoptosis. // Cell Biology - 2000. - V.10:- P.369-377.

De Vos K., Goossens V., Boone E., Vercammen D., Vancompernolle K., Vandenabeele P., Haegeman G., Fiers W., Grooten J. The 55-kDa tumor necrosis factor receptor induces clustering of mitochondria through its membrane-proximal region. // J. Biol. Chem. - 1998. -V.273. - No. 16. - P.9673-9680.

De Vos K., Severin F., Van H., Vancompernolle K., Goossens V., Hyman A., Grooten J. Tumor necrosis factor induces hyperphosphorylation of kinesin light chain and inhibits kinesinmediated transport of mitochondria. // J. Cell Biol. -2000. - V.149. -P.1207-1214.

Di Lisa F., Menabo R., Canton M., & Petronilli V. The role of mitochondria in the salvage and the injury of the ischemic myocardium. //Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - V.1366. - P.69-78.

Dimroth P., C. von Ballmoos, and T. Meier. Catalytic and mechanical cycles in F-ATP synthases. // Fourth in the Cycles Review Series. -2006. - .EMBO Rep 7: 276-282.

Dispersyn GD, Ausma J, Thone F, Flameng W, Vanoverschelde JL, Allessie MA, Ramaekers FC, Borgers M. Cardiomyocyte remodelling during myocardial hibernation and atrial fibrillation: prelude to apoptosis. // Cardiovasc Res. - 1999. - V.43(4):947-57.

Edoute Y., Sanan D., Lochner A., Graney D., Kotze J. Effects of Propranolol on Myocardial Ultrasructure, Mitochondrial Function and High Energy Phosphates of Isolated Working Rat Hearts with Coronary Artery Ligation. // J. of Molec. And Cell. Cardiol. - 1981. -V. 13:619-639.

Elsasser A., K. Suzuki, and J. Schaper. Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure. // J. Mol. Cell Cardiol. - 2000. - 32: 711-724.

Erenster L., Kuylenstierns B. Structure, composition and function of mitochondrial membranes. In: Mitichondria. Structure and Function. London-New-York: Academic Press. -1969 - P.5.

Fernandez-Moran H. Cell-membrane ultrastructure low-temperature electron microscopy and X-ray diffraction studies of lipoprotein components in lamellar systems.//Circulations. - 1962.-V.26. - No.2. -P. 1039.

Fernandez-Moran H., Oda M.D.T., Blair P.V., Green D.E. A macromolecular repeating unit of mitochondrial structure and function. //J Cell Biol. 1964.-22(1).

Friedman I., Moravec J., Reichart E., Hatt P. Subacute myocardial hypoxia in the rat: An electron microscopic study of the left ventricular myocardium. //J. Mol. Cell Cardiol. - 1973. - V.5.125-132.

74. Ganóte C., Seabra-Gomes R., Nayler W., Jennings R. Irreversible Myocardial Injury in Anoxic Perfused Rat Hearts. //Am. J. of Pathol. -1975. - V.80(3).:419-438.

75. Gao C, Tsuchida N. Activation of caspases in p53-induced transactivation-independent apoptosis. // Jpn J Cancer Res. - 1999. -Feb;90(2): 180-187.

76. Gasser S.N. Imported mitochondrial proteins, cytochrome b2 and cytochrome ci, are processed in two steps. // Proc.Natl.Acad.Sei. USA. - 1982. - V.79. - P.267-271.

77. Golfetti R., Rork T., Merrill G. Chronically Administered Acetaminophen and the Ischemia/Reperfused Myocaedium. // Exp. Biol. Med. -2003. - V.228.:674-682.

78. Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA, Babior BM, Engler RL. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiornyocytes. // J Clin Invest. 1994. -V.94(4): 1621-8.

79. Gottlieb R. Role of mitochondria in apoptosis. // Crit. Rev. Eukar. Gene Expr. - 2000. - V.10(3-4):231-239.

80. Gottlieb R. Mitochondria and apoptosis. // Biol. Sign. Resept - 2001. - V. 10(3-4): 147-161.

81. Gottlieb R., Debatable contribution of mitochondrial swelling to cell swelling in ischemia. //J. Mol. Cell Cardiol. -2003. - V.35(7):749-759.

82. Granville D., Gottlieb R. Mitochondria: regulators of cell death and survival. // Sci. World J. - 2002. - V.11(2): 1569-1578.

83. Green D., Bachmann E., Allmann D., Perdue J. The Membrane System of the Mitochondrion. III. The Isolation and Properties of the Outer Membrane of Beef Neart Mitochondria. // Arch. Biochem. and Biophys. -1966.-V.115.: 172.

84. Green D., Asai J., Harris R., Penniston J. Conformational Basis of Energy Transformations in Membrane Systems. Ill Configurational Changes in the Mitochondrial Inner Membrane Indused by Changes in Functional States. // Arch. Biochem. and Biophys. - 1968. V.125. -P.684-705.

85. Green D., Baum H. Energy and the mitochondrion. New-York -London: Academic Press. - 1969.

Green D., Goung J. Energy transduction in Membrane Systems. // Amer. Scientist. - 1971. - V.59(1):92-100.

Gustafsson A., Gottlieb R. Mechanisms of apoptosis in the heart. // J. Clin. Immunol. - 2003. - V.23(6):447-459.

Habib F. M., Springall D. R., Davies G. J., Oakley C. M., Yacoub M. H., & Polak J. M. Tumour necrosis factor and inducible nitric oxide synthase in dilated cardiomyopathy. // Lancet. - 1996. - V.347. -P.1151-1155.

Hackenbrock C.R., Ultrastructural bases for mechanochemical changes in tightly coupled mitochondria. // Fed. Proc. - 1966. - V.25. - №2. - Part I. - P.414.

Hackenbrock C.R., Ultrastructural Bases for Metabolically Linked Mechanical Activity in Mitochondria.// J.Cell Biol. - 1968(a). - V.37. -№2 - P.345-369.

Hackenbrock C.R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. // Proc. Nat Acad Scien. - 1968(b). - 61(2):598-605.

Hackenbrock C.R., Caplan A.S. Ion Induced Ultrastructural Transformations in Isolated Mitochondria.//J Cell Biol. - 1969. - V.42. -P.221-233.

Hackenbrock C.R., Miller K.J. The distribution of anionic sites on the surface of mitochondrial membrane. // J.Cell Biol. - 1975. - V.65. -P.615-630.

Hackel DB., Martin AM Jr., Spach MS. Hemorrhagic shock in dogs. Relation of hemodynamic and metabolic changes to myocardial lesions. // Arch PathoL-1964.-Jun;77:575-81.

Halestrap A.P., K.Y. Woodfield, and C.P. Connern. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. // J. Biol. Chem. - 1997. -V. 272: 3346-3354.

Harmon B. V., Winterford C. M., O'Brien B. A., & Allan D. J. Morphological criteria for identifying apoptosis. // In Cell Biology: a Laboratory Handbook, Second Edition edited by Julio E. Celis. - CA Academic Press, San Diego, 1998. - P.327-340

97. Hatt P., Moravec D., Acute hypoxia of the myocardium, // Cardiol. -1971/72. -V.56:73-84.

98. Haunstetter A. & Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease. // Circ. Res. - 1998. - V.82, P.1111-1129.

99. Hausamen T., Poche R. [Ultrastructure of the myocardium in rats following single and repeated exposures to low atmospheric pressure] // Virch Arch Path Anat Physiol Klin Med. - 1965. - V.339:225-223.

100. Herdson P.B., Sommers H.M., Jennings R.B. A Comparative Study on the Fine Structure of Normal and Ischemic Dog Myocardium With Special Reference to Early Changes Following Temporary Occlusion of a Coronary Artery. // The Am. J. Path. - 1965. - V.46(367)

101. Herdson P.B., Kaltenbach J., Jennings R.B. Fine Structure and biochemical Changes in Dog Myocardium during autolysis. // Am. J. Pathol. - 1969. - V.57:539-557.

102. Herijgers P, Borgers M, Flameng W. The effect of brain death on cardiovascular function in rats. Part I. Is the heart damaged? // Cardiovasc Res. -1998,- V.38(1):98-106.

103. Hoffman H.P., Avers C., Mitochondrion of yeast ultrastructural evidence for one giant, branched organelle per cell.// Science. - 1973. - V.181. - P.749-750.

104. Hoffman H.P., Grigg G.W. An electron microscopic study of mitochondria formation.// Exp. Ceil Res. - 1958. - V.15. - No.1. -P118-131.

105. Iyengar S.R.K., Ramchand S., Charette E., Lynn R.B. An experimental study of subendocardial hemorrhagic necrosis after anoxic cardiac arrest. // Ann Thor Surg. - 1972. - V. 13:214-224.

106. Iyengar S.R.K., Iyengar C.K. S., Lynn R.B. Anoxic cardiac arrest: An experimental and clinical study of its effects. // J Thor Cardiovasc Surg. - 1973. - N/.66:722-730.

107. Irwin M. W., Mak S., Mann D. L., Qu R., Penninger J. M., Yan A., Dawood F., Wen, W. H., Shou, Z., & Liu, P. Tissue expression and immunolocalization of tumor necrosis factor-alpha in postinfarction dysfunctional myocardium. // Circulation. - 1999. - V.99. - P.1492-1498.

108. James T.N. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heart. From postnatal morphogenesis to paroxysmal arrhythmias. //Circulation. 1994. -V.90. -№1.-P.556-573.

109. James T.N., Terasaki F., Pavlovich E.R., and Vikhert A.M. Apoptosis and pleomorphic micromitochondriosis in the sinus nodes surgically excised from five patients with the long QT syndrome. // J. Lab. Clin. Med. - 1993. - V. 122 - №3.-P.309-323.

110. Jennings R., Kaltenbach J., Smetter G. Enzymatic changes in acute myocardial ischemic injury. //Arch Pathol. - 1957. - V.64:10-16.

111. Jennings R., Sommers H., Smyth G., Flack H., Linn H. Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog. //Arch. Pathol. - 1960. -V.70:68-78.

112. Jennings R. B., Baum J H., Herdson P.B. Fine Structural Changes in Myocardial Ischemic Injury. //Arch. Path. - 1965. - V.79(135).

113. Jennings R., Sommers H., Herdson P., Kaltenbach J. Ischemic injury of myocardium. //Ann. NY Acad. Sei. - 1969a. -V.156: 61-78.

114. Jennings R., Herdson P.,Sommers H. Structural and functional abnormalities in mitochondria isolated from ischaemia from ischaemic dog myocardium. // Lab Invest. - 1969b. -N/.20:548-557.

115. Jennings R., Ganóte C. Structural changes in myocardium during acute ischemia. // Circ. Res. - 1974. - N/.34-35:156-172.

116. Jennings RB, Reimer KA, Steenbergen C. Complete global myocardial ischemia in dogs. // Crit Care Med.-1988 Oct; 16(10):988-96.

117. Jennings RB, Reimer KA. The cell biology of acute myocardial ischemia. // Annu Rev Med. - 1991. -N/.42:225-246.

118. Johns N.P., Olson B.J. Experimental myocardial infarction. // Ann. Surg. - 1954. - V.140.:675

119. Kajstura J., Cheng W., Reiss K., Clark WA., Sonnenblick E., Krajewski S., Reed J., Olivetti G., Anversa P. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats. // Lab. Invest. - 1996. - V.74: 86-107.

120. Kang P. M., Haunstetter A., Aoki, H., Usheva A., & Izumo S. Morphological and molecular characterization of adult cardiomyocyte apoptosis during hypoxia and reoxygenation. // Circ. Res. - 2000. -V.87. - P.118-125.

121. Kecshkemeti V., Balogh I. Cardiac ultrastructural effect of platelet-activating factor and its antagonist BN 52021. // Exp.Toxic Pathol. -1995. N/.47:463-470.

122. Kecshkemeti V., Balogh I. The role of platelet-activating factor (PAF) antagonists and nitric oxide in cardiac actions of PAF. Electrophysiological and morphological study. // J. of Physiology and Pharmacology. - 2000. V.51(4):723-735.

123. Kerr, J. F. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. // J Pathol. - 1971. - V. 105. -No1. - P. 13-20.

124. Kerr, J. F., Winterford, C. M., & Harmon, B. V. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. // Cancer. - 1994. - V.73. -P.2013-2026.

125. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., & Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. // Br. J. Cancer. - 1972. - V.26. - No.4. - P.239-257.

126. Kirkwood S.P., Mann E.A., Brook G.A., Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. // Am J Physiol. - 1986. - V.251:C395-C402.

127. Kloner R., Ganóte C., Whalen D., Jennings R. Effect of Transient Period of Ischaemia on Myocardial Cells. II // Am. J. of Pathology. -1974. - V.74(3):399-413.

128. Kloner R., Fishbein M., Braunwald E., Maroko P. Effect of propranolol on mitochondrial morphology during acute myocardial ischaemia. // Am J of Cardiol. - 1978. - V.41.:880-886.

129. Kloner R., Fishbein M., Hore C., Maroko P. Early ischaemic ultrastructural and histochemical alterations in the myocardium of the rat following coronary artery occlusion. II Exp. Mol. Pathol. - 1979. -V.30.129-143.

130. Klug H. An extensive vacuolar system in the nuclei of malignant metanoma cells. //Acad. Sci. Hung. - 1974. - V.22. - P.321-326.

131. Knoll G., Brdiczka D., Changes in freeze-fractured mitochondrial membranes. Correlated to their energetic state. Dunamic Interactions of the boundary membranes. // Biochim.Biophys.Acta. - 1982. - V. 733.-P. 102-110.

132. Konorev, E. A., Zhang, H., Joseph, J., Kennedy, M. C., & Kalyanaraman, B. Bicarbonate exacerbates oxidative injury induced by antitumor antibiotic doxorubicin in cardiomyocytes. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. -2000. - T.279. - P2424-2430.

133. Kottmeier C., Wheat M. Ultrastructural evaluation of myocardial preservation during cardiopulmonary bypass: The mitochondrion. // J. of Thoracic and Cardiovascular Surgery. - 1966. - V.52.(6) - P.786-797.

134. Krebs H., Henseleit K. Untersuchungen über die Harnstoffbildung im Tierkörper. HZ. Physiol. Chem. - 1932. - V.210.:33-66.

135. Krug A. The extent of ischemic damage in the myocardium of the cat after permanent and temporary coronary occlusion. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 1970. - V.60:242-247.

136. Lai T, Fallon JT, Liu J, Mangion J, Gillam L, Waters D, Chen C. Reversibility and pathohistological basis of left ventricular remodeling in hibernating myocardium. // Cardiovasc.Pathol. - 2000. - Nov-Dec;9(6):323-35.

137. Langendorff O., Untersuchungen am uberlebender Saugertierherzen. // Pflugers Arch. Gesamte Physiol. Menschen Tiere. - 1895. V.61.(291-332)

138. Leedale G.F., Buetow D.E., Observations on the mitochondrial reticulum in living Euglena gracilis. // Citobiologie. - 1970. - V.1. -P. 195-202.

139. Lichtig C, Brooks H. Myocardial ultrastructure and contraction during short periods of experimental ischemia. // Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab. - 1975a. -V.6:423-30.

140. Lichtig C, Brooks H. Myocardial ultrastructure and function during progressive early ischemia in the intact heart. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 1975b.- Aug;70(2):309-15.

141. Linnane, A. W., Vitols, E., & Nowland, P. G. Studies on the origin of yeast mitochondria. //J. Cell Biol. -1962. - V.13. - P.345-350.

142. Li Z., Bing O., Robinson K., Lakatta E. Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat. //Am J Physiol. - 1997. -V.271.: H2313-H2319.

143. Liu, J. J., Peng, L., Bradley, C. J., Zulli, A., Shen, J., & Buxton, B. F. Increased apoptosis in the heart of genetic hypertension, associated with increased fibroblasts. // Cardiovasc. Res. - 2000. - V.45. - No3. -P.729-735.

144. Logue S., Gustafsson A., Samali A., Gottlieb R. Ischemia/reperfusion injury at the intersection with cell death. // J. Mol. Cell Cardiol. - 2005. - V.38(1):21-33.

145. Luzikov V., Zubatov A., Rainina E., Bakeeva L. E. Degradation and restoration of mitochondria upon deaeration of aerobically grown. // Biochim. Biophys. Acta. -1971. - 245: 321-334.

146. Martin Am Jr., Hackel DB., Kurtz Sm. The ultrastructure of zonal lesions of the myocardium in hemorrhagic shock. // Am J Pathol. -1964.-V.44(1): 127-40

147. Maulik, N., Kagan, V. E., Tyurin, V. A., & Das, D. K. Redistribution of phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine precedes reperfusion-induced apoptosis. //Am. J. Physiol. -1998. - V.274. -P242-248.

148. McCallister L., Munger B., Neely J. Electron microscopic observations and acid phosphatase activity in the ischemic rat heart. // J Mol Cell Cardiol. - 1977. - V.9:353-364.

149. McCallister L., Daiello D., Tyers G. Morphometric observations of the effect of normothermic ischemic arrest on dog myocardial ultrastructure. //J Mol Cell Cardiol. -1978, -V. 10:67-80.

150. McCallister L.,Trapukdi S., Neely J. Morphometric Observations on the Effects of Ischemia in the Isolated Perfused Rat Heart. // J of Mol Cell Cardiol. - 1979. -V. 11:619-630.

151. McKinney B. Pathology of the Cardiomyopathies. Butterworth & Co (Publishers) Ltd. -1974. - P.594.

152. Meerson F.Z. The myocardium in hyperfunction, hypertrophy and heart failure. // Circ Res. - 1969. - V.25:1-163.

153. Meldrum D. R. Tumor necrosis factor in the heart. // Am. J. Physiol. -1998. - V.274. - P.577-595.

154. Nediani C., Perna A.M., Liguori P., Formigili L., Ibba-Manneschi L., Racchi-Orlandini S., Florillo C., Rizzuti G., Nassi P. Beneficial effects of the 21-aminosteroid U74389g on the ischemia reperfusion damage in pig heat. // J Mol Cell Cardiol. - 1997. - V.29(10):2825-2835.

155. Neupert W., Schatz G. How proteins are transported into mitochondria. //Trends Biochem.Sci. - 1981. - V.6. - P.1-4.

156. Nonaka I., Koga Y., Ohtaki E., Yamamoto M. Tissue specificity in cytochrome c oxidase deficient myopathy. // J. Neurol. Sci. - 1989. -V.92.- №2.-P. 193-203.

157. Novikoff A.B., Goldfischer S. Visualization of peroxisomes (microbodies) and mitochondria with diaminobenzidine. // J. Histochem. Cytochem. - 1969,-V.17.- №10.-P.675-680.

158. Ohno, M., Takemura, G., Ohno, A., Misao, J., Hayakawa, Y., Minatoguchi, S., Fujiwara, T., & Fujiwara, H. "Apoptotic" myocytes in infarct area in rabbit hearts may be oncotic myocytes with DNA fragmentation: analysis by immunogold electron microscopy combined with In situ nick end-labeling. // Circulation . - 1998. - V.98. - No14. -P. 1422-1430.

159. Olson R., Dhalla N., Sun C. Changes in Energy Stores in the Hypoxic Heart. //Cardiology. - 1971. -V.56.:114-124.

160. Packer, L. Metabolic and structural states of mitochondria. I. Regulation by adenosin diphosphate. // J. Biol. Chem. - 1960. -V.235. - P.242-248.

161. Packer, L. Metabolic and structural states of mitochondria. II Regulation by phosphate. // J. Biol. Chem. -1961.- V.236. - P.214 220.

162. Packer, L. Metabolic and structural states of mitochondria. Ill Reversal of electron transport and mitochondrial swelling. // J. Biol Chem. - 1962. - V.237. - P.1327-1331.

163. Packer, L. Size and shape transformations correlated with oxidative phosphorylation in mitochondria. I. Swelling-shrinkade mechanisms in intact mitochondria. ll.Structural changes in mitochondrial membrane fragments.//J. Cell Biol. -1963,- V.18. - P.495-501.

164. Palade G.E. A study of fixation for electron microscopy. // J. Exp. Med.- 1952a. - V.95: 285-298.

165. Palade G.A., The fine structure of mitochondria. //Anat. Rec. - 1952b. — V.114. - P.427-452.

166. Palade, G.E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. //J. Histochem. Cytochem. - 1953. -V.1:188-211.

167. Palade G.A., Electron microscopy of mitochondria and other cytoplasmic structures. In Enzymes: units of biological structure and function. New-York: Acad. Press, Inc, 1956. P.181-215.

168. Panniston J., Harris R., Asai J., Green D. The Conformation Basis of Energy Transformations in Membrane Systems. I. Conformation Changes in Mitochondria. // Proc. N.A.S. Biochemistry. - 1967. -V.59(2):624-631.

169. Pease D.C., A unique structural component of mitochondrial crista. Electron Microscopy . New-York. - London. Acad. Press, -1962.- V.2.

170. Pease D.C. Demonstration of a highly ordered pattern upon a mitochondrial surface. // J. Cell Biol. -1962. -N/.15: 385-389.

171. Plattner, H. & Schatz, G. Promitochondria of anaerobically grown yeast. III. Morphology. II Biochemistry. -1969. - V.8. - P.339-343.

172. Poche R. , Hausamen TU. [On the effect of overdosage of persantin and low atmospheric pressure on myocardial ultrastructures in the rat] // Virchows Arch Pathol Anat Physiol Klin Med. - 1965. - Jun 1 ;339(3):234-44.

173. Poche R. Ultrastructure of heat muscle under pathological conditions. //Ann. of the New York Acad, of Sci. - 1969. - V.156.:34-47.

174. Pucheu S., Coudray C., Tresallet N., Favier A., De Leiris J. Effect of dietary antioxidant trace element supply on cardiac tolerant to ischemia-reperfusion in the rat. // J Mol Cell Cardiol. - 1995. -V.27(10):2303-2314.

175. Quaini F, Cigola E, Lagrasta C, Saccani G, Quaini E, Rossi C, Olivetti G, Anversa P. End-stage cardiac failure in humans is coupled with the induction of proliferating cell nuclear antigen and nuclear mitotic division in ventricular myocytes. // Cire Res. - 1994 - Dec;75(6):1050 1063.

176. Quiani F., Cigola E., Sala R., Andreoli A., Giordano G., Lagrasta C., Maestri R., Olivetti G. Apoptosis in the infarcted human heart. // BAM. -1996.-V.6:241-249.

177. Rancourt M.W., McKee A.P., Pollack W. Mitochondrial profile of a mammalian lymphocyte. //J Ultras Res. - 1975. - V.51.:418-424.

178. Revel J.P., Fawcett D.W., Philpott C.W. Observations of mitochondrial structure. Angular Configurations of the cristae. The Journal of Cell Biology. - 1963 - Vol.16. -187-195.

179. Ricci J., Gottlieb R., Green D. Caspase - mediated loss of mitochondrial function and generation of reactive oxygen species during apoptosis. II J. Cell Biol. -2003,-V.6;160(1):65-75.

180. Sabbah N., Sharov V., Riddle J., Kono T„ Lesch M., Goldstein S. Mitochondrial abnormalities in myocardium of dogs with chronic heart failure. //J Mol Cell Cardiol. - 1992. -V.24:1333-1347.

181. Schaper J., Mulch J., Winkler B., Schaper W. Ultrastructural, Functional, and Biochemical Criteria for Estimation of Reversibility of Ischemic injury: A Study on the Effects of Global Ischemia on the Isolated Dog Heart. // J. of Molec. And Cell. Cardiol. - 1979. V.11.521-541.

182. Schatz G. How mitochondria import proteins from the cytoplasm. // FEBS Lett. - 1979. - V. 103. - P.203-211.

183. Schulke N., Sepuri N.B., Pain D. In vivo zippering of inner and outer mitochondrial membranes by a stable translocation intermediate. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1997,- V.8. - №14,- P.7314-7319.

184. Schulze W., Wollenberger A. On the structure and histochemical localization of adenosine triphosphatase activity in the mitochondria and other cell elements of the myocardium. // Acta Biol Med Ger. -1963.-V. 11:918-928.

185. Schwaiger M., Herzog V., Neupert W. Characterization of Translocation contact sites involved in the import of mitochondrial proteins. // J. Cell Biol. - 1987. - V.105. - P.235-246.

186. Seligman, A.M., Karnovsky M.J., Wasserkrug H.L., Hanker J.S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). //J. Cell. Biol. -1968. - V.38.- №1.- P.1-14

187. Sharov V., Sabbah H., Kono T., Ali As., Shimoyama A., Lesch M., Goldstein S. Ultrastructural abnormalities of cardiomyocytes in border zone of old infarctions: studies in dogs with chronic heart failure. // FASEB J - 1993. - V.7:A112.

188. Sharov V., Sabbah H., Shimoyama A., Gousseva A., Lesch M., Goldstein S. Evidence of Cardiocytes Apoptosis in Myocardium of Dogs with Chronic Heart Failure. // Am J of Pathol. - 1996. -V.148(1):141-149.

189. Siu C.H., K.S. Chiang, and H. Swift. Characterization of cytoplasmic and nuclear genomes in the colorless alga Polytoma. V. Molecular structure and heterogenity of leucoplast DNA. // J. Mol. Biol. - 1975. -V.98(2): 369-391.

190. Sjostrandt F.S., Rhodin I. The Organization of the Cytoplasm of the Excretory Cells of the Mouse Panereas. // J Appl Phys. - 1953. -24;116.

191. Sjostrandt F.S. The ultrastructure of the Nerve Myelin Sheaths. // J Appl Phys. - 1953(a). - 24:117.

192. Sjostrand F.S. The ultrastructure of the inner segments of the retinal rods of the guinea pig eye as revealed by electron microscopy. // J. Cell Physiol. - 1953b. - V.42:45-70.

193. Sjostrandt F.S. Electron microscopy of mitochondria and cytoplasmic double membranes. // Nature. - 1953c. - V.171. - P.30-32.

194. Sjostrandt F.S. , Hanzon V. Membrane structures of cytoplasm and mitochondria in exocrine cells of mouse pancreas. // Exp Cell Res. -1954.-7;393-429.

195. Sjostrand F.S. A method to improve contrast in high resolution electron microscopy of ultrathin tissue sections. // Exp. Cell Res. -1956.-V. 10(3): 657-664.

196. Skulachev V.P, Energy transformation in the respiration chain. // Curr.Top.

Bioenerg, -1971. - V.4. - P.127-190.

197. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. // Biochim. Biophys. Acta -1998a. -1363: 100-124.

198. Skulachev, V. P. Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades. // FEBS Lett. - 1998b. - V.423. - P.275-280.

199. Skulachev V.P. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms. // Mol. Aspects Med. - 1999.-20(3): 139-184.

200. Skulachev V.P., L.E. Bakeeva, B.V. Chernyak, L.V. Domnina, A.A. Minin, O.Y. Pletjushkina, V.B. Saprunova, V.G. Tsyplenkova, J.M. Vasiliev, L.S. Yaguzhinsky, and D.B. Zorov. Thread-grain transition of mitochondrial reticulum as a step of mitoptosis and apoptosis. // Mol. Cell Biochem. - 2004. - V.256-257(1-2): 341-358.

201.Sommers HM., Jennings RB. Experimental acute myocardial infarction: histologic and histochemical studies of early myocardial infarcts indused by temporary or permanent occlusion of a coronary artery, // Lab. Invest. - 1964. - V.13: 1491-1503.

202. Song W., X. Lu, and Q. Feng. Tumor necrosis factor-alpha induces apoptosis via inducible nitric oxide synthase in neonatal mouse cardiomyocytes. // Cardiovasc. Res. - 2000. - 45: 595-602.

203. Sulkin N., Sulkin P. An electron microscopic study of the effects of chronic hypoxia on cardiac muscle, hepatic, and autonomic ganglion cells. // Lab. Invest. - 1965. - V.14.1523-1546.

204. Takemura, G., Takatsu, Y., Sakaguchi, H., & Fujiwara, H. Intranuclear mitochondria in human myocardial cells. // Pathol. Res. Pract. - 1997. - V.193. - P.305-311.

205. Tanaka M, Earnhardt RC, Murry CE, Richard VJ, Jennings RB, Reimer KA. Hypoxic reperfusion to remove ischaemic catabolites prior to arterial reperfusion does not limit the size of myocardial infarcts in dogs. II Cardiovasc. Res. -1991. - Jan;25(1):7-16.

206. Tanaka M., Ito H., Adachi S., Akimoto H., Nishikawa T., Kasajiama T., Marumo F., Hiroe M. Hypoxia induced apoptosis with enhanced expression of FAS antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cardyomyocytes. // Cirk. Res. - 1994. -V.75:426-433.

207. Tumanovs'ka L., Dosenco V., Nahibin VS., Makohon N., Moibenco O Apoptotic, autophagic, and oncotic death of cardiomyocytes in anoxia-reoxigenation. // Fiziol. Zh. - 2004. -V.50(2):11-18.

208. Vetterlein F., Schräder C., Volkmann R., Neckel M„ Ochs M„ Schmidt G., Hellige G. Extent of damage in ischemic, nonreperfused, and reperfused myocardium of anesthetized rats. // Am J Physiol Heart Circ Physiol - 2003. - V.285:H755-H765.

209. Walker D.W. and S. Benzer. Mitochondrial "swirls" induced by oxygen stress and in the Drosophila mutant hyperswirl. // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A - 2004. - V.101: 10290-10295.

210. Wallace, P. G. & Linnane, A. W. Oxygen-induced synthesis of yeast mitochondria.//Nature. - 1964.- V.201.- P.1191-1194.

211. Whalen D., Hamilton D., Ganóte C., Jennings R. Effect of a transient period of ischemia on myocardial cells. I Effect on cell volume regulation. // Am. J. of Pathol. - 1974. - V.74.:381-398.

212. Wiiliams C.A., Green D.E., Harris R.A., Caldwell M., Valdivia E. Conformationed basis of energy trancduction in membrane systems. VIII Configurational changes of mitochondria in situ and in vitro. // J Bioen. -1970. -1;70.

213. Wollenberger A., Schulze W. Mitochondrial alterations in the myocardium of dogs with aortic stenosis. // J Biophys Biochem Cytol. -1961.-V. 10:285-288.

214. Wollenberger A., Krause EG. Activation of alpha-glucan Phosphorylase and related metabolic changes in dog myocardium following arrest of blood flow. //Biochim.Biophys.Acta.-1963.-Feb. 12;67:337-40.

215. Wollenberger A, Kleitke B, Schulze W. [On the state of the mitochondria in the hypertrophic dog heart with gradually induced aortic stenosis] //Acta Biol.Med.Ger.-1966;17(3):334-42.

216. Wollenberger A., Onner K., Hinterberger U., Rabitzsch G„ Kleitke B. Myocardial Protein Synthesis in Acute Myocardial Hypoxia and Ischemia. II Cardiol. - 1971/72. - V.56:48-64.

217. Yanagja N. Ultrastructural and histochemical changes of mitochondria in global ischemiccardiac muscle of rat. // Cell Mol Biol. - 1994. -V.40(8):1151-1164.

218. Zamzami N., Marchetti P., Castedo M., Hirsch T., Susin S., Masse B., Kroemer G. Inhibitors of permeability transition interfere with the disruption of mitochondrial transmembrane potential during apoptosis. // FEBS Lett. - 1996a. - V.8(1):53-57.

219. Zamzami N., Su sin S., Marchetti P., Hirsch T., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. // Exp Med. - 1996b. -V. 183(4):1533-44.

220. Zhai P., Eurell T., Cooke P., Lubahn DB., Gross D. Myocardial ischemia-reperfusion injury in estrogen estrogen receptor-a knockout and wild-type mice. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2000a. V.278:H1640-H1647.

221. Zhai P., Eurell T., Cotthaus R., Jeffery E., Bahr J., Gross D. Effect of estrogen on global myocardial ischemia-reperfusion injury in female rats. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2000b. V.279.H2766-H2775.

222. Zoratti M. and I. Szabo. The mitochondrial permeability transition. // Biochim. Biophys. Acta - 1995. - V.1241(2): 139-176.

ИТ 1 »

Фот. 1. Электронно-микроскопическая фотография участка отдельного кардиомиоцита изолированного кусочка миокарда, инкубированного 72 часа в условиях гипоксии при

20°С. Стрелкой 1 показана митохондрия, локализованная внутри митохондрии основной популяции. Стрелками 2, 3 и 4 показаны межмитохондриальные контакты б

Фот. 3. Электронно-микроскопические фотографии митохондрий кусочка миокарда, инкубированного 72 ч в условиях гипоксии. Стрелками 1 на рис. а и б показаны септированные митохондрии. Стрелками 2 показаны межмитохондриальные контакты. Стрелка 3 показывает образование митохондрии внутри митохондрии.

-г

Фот. 5. Электронно-микроскопическая фотография митохондрий кусочка миокарда, инкубированного 72 ч в условиях гипоксии. На рис.а на поперечном сечении стрелками показаны включения во внутрикристном пространстве, На рис. б локальные зоны перестройки внутренней мембраны митохондрий, имеющие ячеистую структуру (стрелка).

0.3 мкм

Фот.

Электронно-микроскопическая фотография двух последовательных ультратонких срезов митохондрии (а и в) с локальной зоной перестройки внутренней мембраны, которая в этих электронно-плотных зонах образует электронно-плотную ячеистую структуру - на поперечном сечении ячеики имеют гексагональную форму и незначительно отличаются по размеру. На рис. б и г эти структуры представлены на большом увеличении

Фот. 10. Электронно-микроскопическая фотография участка кардиомиоцита изолированного кусочка миокарда, инкубированного 72 часа в условия гипоксии. Наблюдается ультраструктурная гетерогенность популяции митохондрий: основная популяция - это электронно-светлые митохондрии с обводненным, просветленным матриксом, с контрастными, хорошо выраженными мембранами и мелкие электронно-плотные митохондрии с незначительно сжатым электронно-плотным матриксом и выраженным обводнённым межмембранным пространством Стрелкой показана митохондрия, локализованная внутри митохондрии основной популяции. , V . У 1 - Л - ■

О.Змкм

Фот. 11. Электронно-микроскопическая фотография участка отдельного кардиомиоцита изолированного кусочка миокарда, инкубированного 72 часа в условия гипоксии. Стрелкой 1 показана митохондрия, локализованная внутри другой митохондрии. Стрелкой 2 показана наружная и стрелкой 3 внутренняя мембраны основной митохондрии.

Фот. 12. Электронно-микроскопическая фотография участка отдельного кардиомиоцита изолированного кусочка миокарда, инкубированного 72 часа в условия гипоксии. Стрелкой показана митохондрия, локализованная внутри другой митохондрии.

Фот

13.

Электронно-микроскопические фотографии

6-ти популяции, срезов митохондрии основной последовательных содержащей в межмембранном пространстве мелкую, электронно-плотную митохондрию.

Фот. 14. Электронно-микроскопические фотографии 3-х последовательных срезов митохондрии основной популяции с локализованной внутри электронно-плотной митохондрией.

Dot. 15. Электронно-микроскопические фотографии 6 последовательных срезов литохондрии основной популяции, содержащей в межмембранном пространстве мелкую, »лектронно-плотную митохондрию.

1 мкм

Фот. 17. Электронно-микроскопическая фотография фракции митохондрий, выделенной при 1700д

Фот. 18. Электронно-микроскопическая фотография суспензии митохондрий, выделенной из экспериментальной ткани при ЮОООд. Фракция содержит митохондрии, ультраструктура которых соответствует ультраструктуре митохондрий, выделенных в 0,25М сахарозе из нативной ткани сердца.

П V ; V* . ' ✓

Л* V

Л. V • т

Ж" 4

1%Я

Ч 1ВС < ▼

7 •

Г?" « Л«® . ТЦ Г . Л -ИГ I

ОI>ш й в4 ^ > ^ <эр ^

-у- едь ж

I*1 -Го- ■

•л ъ 7 лмс

Ч о

Л , ъ о 1 - - . ~ К / •

У* • * ? ^ сгЛ

Фот. 19. Электронно-микроскопическая фотография фракции митохондрий, выделенной при 17000 д. Фракция содержит мелкие, электронно-плотные митохондрии,. На большем увеличении (б) представлена электронно-плотная митохондрия. Четко видны наружная и внутренняя мембраны электронно-плотной

Фот. 20. Электронно-микроскопическая фотография участка отдельного кардиомиоцита контрольной ткани миокарда после проведения реакции на цитохром с - оксидазную активность а . б

Фот. 21 а, б. Электронно-микроскопические фотографии участка кардиомиоцита кусочка миокарда, инкубированного 72 ч в условиях гипоксии после проведения реакции на цитохром с - оксидазную активность: а - детальная картина цитохром с-оксидазной активности в мелкой, электронно-плотной митохондрии, расположенной в межмембранном пространстве более крупной, электронно-светлой; б - общий вид.

Фот. 23. Электронно-микроскопическая фотография электронно-плотной митохондрии, расположенной внутри обводненной митохондрии после проведения реакции на цитохром с - оксидазную активность.

24.

Электронно-микроскопические фотографии 4-х последовательных срезов

Фот. митохондрии, расположенной мелкой электронно-плотной центральной части обводненной митохондрии кардиомиоцита ткани миокарда, инкубированной в условиях гипоксии, после проведения реакции на цитохром с-оксидазную активность.

Фот. 26. Электронно-микроскопическая фотография распределения активности цитохром с - оксидазы в межмитохондриальном пространстве в ткани миокарда, инкубированной 72 ч в условиях гипоксии. Стрелкой показан участок непосредственного контактирования двух митохондрий.

0.3 мкм

Фот. 28. Электронно-микроскопические фотографии 3 последовательных срезов участка кардиомиоцита ткани миокарда, инкубированной 6 ч в условиях гипоксии. Необычное структурное образование внутри митохондрии показано стрелкой.

Фот. 29. Электронно-микроскопические фотографии 4 последовательных срезов необычного структурного образования внутри митохондрии кусочка миокарда, инкубированного в условиях гипоксии в течение 6 ч. Все митохондрии имеют сжатый, электронно-плотный матрикс и параллельно ориентированные кристы.

0.2 мкм

Фот. 31. Электронно-микроскопические фотографии митохондрий кардиомиоцитов изолированной ткани миокарда, инкубированной 6 ч в условиях гипоксии. Видно, что в митохондриях образуются электронно-прозрачные замкнутые полости, в которые перемещается участок матрикса, ограниченный внутренней митохондриальной мебраной. На рис. а и б показано стрелками.

Рот иитохондрии эазных стадия*

Фот. 33 а, б. Электронно-микроскопическая фотография участка кардиомиоцита изолированного кусочка ткани миокарда, инкубированного 12 ч в условиях гипоксии: а -стрелкой показана вновь формирующаяся структура в межмембранном пространстве; б - участок митохондрии, показанный стрелкой на рис. а, при большом увеличении. Стрелкой показаны концентрические слои мембран.

О.з мкм

Фот. 35 а, б. Электронно-микроскопическая фотография участка кардиомиоцита изолированного кусочка ткани миокарда инкубированного 12 ч в условиях гипоксии: а

- стрелкой показано формирование в обводненной митохондрии основной популяции структурного образования, показанного на большем увеличении на фот.

0.1 мкм

Фот изолированного стрелкой структурного

Фот. 37. Электронно-микроскопические фотографии 4 последовательных ультратонких срезов, на которых можно видеть хорошо развитую систему крист во вновь образованной структуре.

0.5 мкм

Фот. 38. Электронно-микроскопические фотографии ультратонких серийных срезов одной из митохондрий изолированной ткани миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии. Можно видеть, что электронно-светлая митохондрия содержит в межмембранном пространстве мелкую, электронно-плотную митохондрию.

Информация о работе

Солодовникова, Ирина Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы