Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica

Ковалёва, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica"

□Ü3484452

На правах рукописи

Ковалёва Мария Владимировна

ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA

LIPO LYTIC А

Специальность 03.00.04 - «биохимия»

2 6 НОЯ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2009

003484452

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор P.A. Звягильская Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г.Д. Миронова доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан Ведущая организация: НИИ физико-химической

биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «_» декабря 2009 г. в «_» часов на заседании диссертационного

совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ стр. 1 Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования последнего десятилетия привели к осознанию того, что митохондрии, по крайней мере, в клетках высших эукариот, помимо их известной роли в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в индукции апоптоза. Изучению апоптоза придается большое значение, так как этот процесс является важнейшей составляющей процессов онтогенеза, морфогенеза, противоопухолевой и противовирусной защиты организма. В ряде случаев, напротив, он лежит в основе патогенетических механизмов, как это происходит при септическом шоке, инфаркте миокарда, инсульте, нейродегенеративных заболеваниях и т.д.

До недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь многоклеточным организмам, обладающим способностью к цитологической дифференцировке. Первое указание на возможность клеточной смерти дрожжей по механизму, напоминающему апоптоз, пришло из экспериментов, в которых животные про- или анти-апоптотические белки были гетерологически экспрессированы в дрожжах S. cerevisiae и изучено их влияние на клеточную физиологию (Priault, М. et.al., 2003). В этих опытах дрожжевые клетки либо умирали, демонстрируя набор физиологических маркеров апоптоза, либо избегали смерти, в зависимости от присутствия про- или анти-апоптотических белков. В дальнейшем в геноме различных видов дрожжей были обнаружены эндогенные гены-гомологи факторов апоптоза человека и животных. В 2002 г. в дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован и первый белок, участвующий в эффекторной стадии апоптоза у дрожжей - метакаспаза-1 (Madeo, F. et. al., 2002) (Ycalp) - цистеиновая протеаза, функционально аналогичная митохондриальным каспазам животных.

С тех пор были получены многочисленные доказательства смерти дрожжевых клеток (в основном, S. cerevisiae) по механизму апоптоза как в ответ на внешние стимулы или повреждения клеточных структур, так и в результате репликативного или хронологического старения (Laun, Р. et. al., 2006,2008; Herker, Е. et. al., 2004). При этом наряду с метакаспазой-1 в них доказано участие белков-гомологов факторов апоптоза человека: HtrA2 (Fahrenkrog, В. et. al., 2004), AIF и AMID (Wissing, S. et. al., 2004); Dnmlp (Fannjiang, Y. et. al., 2004), ответственного за дробление митохондрий человека, цитохрома с (Ludovico, Р. et. al., 2002; Silva, R.D. et. al., 2005), эндонуклеазы G (Büttner, S. et. al., 2007; Cymerman, I.A. et. al., 2008), Rho5 GTPa3bi (при апоптозе, запускаемом активными формами кислорода) (Singh, К. et. al., 2008) и пока единственного известного антиапоптотического фактора Birlp (Owsianowski, Е. et. al., 2008).

Совокупность этих данных можно рассматривать как веское указание на то, что программа апоптоза дрожжей и животных может иметь общие элементы. Особая роль митохондрий в системе выбора клетки между жизнью и смертью определяется тем, что они являются и основными генераторами активных форм кислорода в клетке, а их межмембранное пространство служит депо проапоптотических факторов. При повреждении внешней мембраны проапоптотические факторы выходят из митохондрий в цитоплазму, запускают и усиливают каскад реакций, приводящий в конечном итоге к гибели клетки. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов в цитоплазму. Один из них включает активацию, конформационную перестройку и интеграцию во внешнюю мембрану митохондрий проапоптотического белка Вах, члена семейства белков Вс1-2. Другим способом является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия пор.

В случае митохондрий дрожжей вопрос о механизмах выхода апоптотических факторов из митохондрий в цитоплазму изучен недостаточно. Твердо установлено лишь, что геном дрожжей не содержит генов белков семейства Вс1-2. Данные же относительно возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий фрагментарны и противоречивы.

Поэтому данная работа направлена на поиск и изучение способов (как ранее найденных в митохондрий животных, так и новых) индукции неспецифической проницаемости во внутренней митохондриальной мембране дрожжей. В качестве объекта исследования использовали дрожжи Уаггом/1а Цро1уИса, облигатные аэробы, содержащие полностью компетентную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического сопряжения и хорошо-структурированные кристы, поэтому являющиеся лучшей альтернативой более традиционному объекту изучения механизмов апоптоза у одноклеточных - митохондриям дрожжей 5ассЬаготусе$ сегеу'шае.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось систематическое исследование возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей К Иро1уНса, определение условий индукции проницаемости и изучение её регуляции. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать противоречивые литературные данные о существовании неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей.

2. Исследовать возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной

мембраны классического типа (Са2+-фосфат-зависимый, циклоспорин А-чувствительный механизм).

3. Изучить существование в митохондриях дрожжей У. lipofytica иных механизмов индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны:

а) циклоспорин А-нечувствительного, индуцируемого низкими концентрациями

Са2+ и жирными кислотами;

б) запускаемого окислительным стрессом;

в) АТР-зависимого К+-специфичного ионного канала. Научная новнзна и практическая значимость работы.

Впервые на систематической основе исследована возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Y. lipofytica. Показано, что в исследованных митохондриях не индуцируется Са2+-фосфат-зависимая, циклоспорин-чувствительная пора; пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipofytica без образования мегаканала. Обнаружен лишь АТР-зависимый К+-канал, "животного" типа, специфически открываемый добавлением АТР.

Результаты настоящей диссертационной работы дополняют полученные к настоящему времени данные о возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей и её регуляции, и позволяют приблизиться к пониманию того, каким образом дрожжевые митохондрии могут принимать участие в процессе апоптоза. Обнаруженное нами впервые сходство (митоКатр) митохондрий животных и дрожжей Y. lipofytica позволяет рассматривать разработанную нами модель в качестве перспективной для изучения регуляции и структуры митохондриального К+-канала, которому в настоящее время отводится важная роль в защите сердечной мышцы от последствий ишемии.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (1-3 июня 2006, Москва, РФ); 14-й и 15-й Европейских Биоэнергетических Конференциях (ЕВЕС) (22 - 27 июля 2006, Москва, РФ); 32-ом, 33-м и 34-м FEBS Конгрессах (7-13 июля 2007, Вена, Австрия; 200В, Афины, Греция; 4-9 июля 2009, Прага, Чешская Республика); 24-й конференции «Дрожжевой транспорт и энергетика» (2006, 31 августа - 3 сентября, Прага, Чешская Республика); 2-м Съезде микологов России с международным участием "Современная микология в России" (11 - 15

мая 2008, Москва, РФ).

Публикации. По материалам диссертационной работы имеется 1 публикация в J. Bioenerg. Biomembr., международном рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК РФ для защиты по специальности «биохимия», а также 9 тезисов докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на_страницах

машинописного текста, содержит _ рисунков и _ таблиц. Список цитируемой

литературы включает_наименований, в том числе_на иностранных языках.

Сокращения, принятые в тексте.

МитоК+АТр - АТР-зависимый К+-канал митохондрий животных; mPTP - (mitochondrial permeability transition, pore) - неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны; ДЧ' - электрический трансмембранный потенциал; ЭГТА -этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый 3(]mp)-n',n',n',n'-TeTpayKcycHafl кислота; Р„ -неорганический фосфат; КЦХФ - карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон; ЕТН129 -специфический кальциевый ионофор; БСАм- бычий сывороточный альбумин, свободный от примеси жирных кислот; ТЕАС1 - тетраэтиламмоний хлорид; 5-HD - 5-гидроксидекановая кислота.

Объект ц методы исследования

Организм и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Yarrowia. lipolytica (Wick.) van der Walt and Arx, полученные из эпифитной микрофлоры листьев пустынных растений (пустыня Негев, Израиль) и идентифицированные на основании совокупности морфологических, физиологических, биохимических, хемотаксономических характеристик и молекулярно-генетического анализа как анаморфа У. lipolytica (Zvyagilskaya, R, et. al., 2001). Клетки выращивали на 750-мл колбах Эрленмейера (рабочий объем - 100 мл) при 28 °С на роторной качалке (220 об/мин) на полусинтетической среде (Андреищева, Е.Н., et. al., 1997), содержавшей в качестве источника углерода и энергии 1%-ый сукцинат.

Выделение митохондрий осуществляли по методу, разработанному в нашей лаборатории и описанному ранее (Zvyagilskaya, R.A. et. al., 2004) с небольшими модификациями. Полученные митохондриальные препараты были полностью активны в течение, по крайней мере, 4 ч после выделения при хранении на льду.

Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке (рабочий объём 1 мл) с закрытым кислородным электродом типа Кларка. Основная среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 - 7,4, 20 мМ пируват, 5 мМ малат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл).

Потенциал, генерируемый на внутренней митохондрнальной мембране, регистрировали на спектрофотометре Beckman coulter DU-650, используя двуволновой режим (511 - 533 нм) с сафранином О в качестве потенциал-зависимого зонда (Akerman, К.Е.О., and Wikstrom, M.K.F., 1976). Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 - 7,3, 20 мМ пируват и 5 мМ малат или 20 мМ сукцинат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл).

Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония), по уменьшению оптической плотности митохондриальной суспензии при 540 нм.

Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд (Bradford, М.М., 1976) с БСА в качестве стандарта.

Результаты и их обсуждение

Митохондрии дрожжей К lipolytica лишены «классической» Са2+-зависимой, циклоспорин А-чувствителыюй поры

В работе использовали прочно-сопряженные митохондриальные препараты, выделенные из дрожжей Y. lipolytica. Они сохраняли регуляцию метаболического состояния, окисляли добавленные субстраты с высокими скоростями, высокими (порядка 4) величинами дыхательного контроля и величинами ADP/O, близкими к теоретически ожидаемым. Митохондриальные препараты в присутствии экзогенных субстратов поддерживали неизменным Д\|/ в течение длительного времени (10 - 15 мин) и не набухали даже в гипотонической среде. Отсутствие набухания не было связано со структурными ограничениями, поскольку добавление аламетицина (который при встраивании в мембраны, образует поры диаметром 1 нм, способные пропускать низкомолекулярные вещества) вызывало высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий. Выделенные препараты митохондрий удовлетворяли и другим известным критериям физиологической интактности.

В соответствии с задачами исследования, мы исследовали чувствительность митохондрий У. lipolytica к факторам, вызывающим образование классической тРТР в

митохондриях животных. Об образовании пор(ы) судили, как это принято в литературе, по совокупности двух параметров - снижению мембранного потенциала (Л\|/) и высокоамплитудному набуханию митохондрий.

Прежде всего, мы нашли, что прочно-сопряженные митохондрии У. Иро1уИса лишены природной системы транспорта Са2+. Они не транспортировали Са2+ даже в присутствии спермина, ЛБР, КАБЫ, которые существенно улучшают кинетические параметры кальциевого унипортера в митохондриях животных. Митохондрии У. Иро1уИса оказались устойчивыми к действию повышенных концентраций Са2+, даже в присутствии микромолярных концентраций ЭГТА (Рис. 1), добавляемых к митохондриям животных для предотвращения обратимой активности Са2+ унипортера и тем самым для достижения высокой [Са2*] в митохондриальном матриксе, необходимой для открытия тРТР.

ю 2

Са Са" Са КЦХФ

0 16 300 мкМ 300 мкМ 400 мкМ 25 нМ

0.120.080.040.00 -0.04-

ЭГТА 25 мкМ

Мтх

—I—

100

Ри

2мМ

200

300 Время, сек

400

500

600

Рис. 1. Влияние Са2+ на мембранный потенциал митохондрий дрожжей У. Иро1уЧса. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ ТпБ-фосфатный буфер рН 7,3 - 7,4,20 мМ Тго-пируват, 5 мМ Тш-малат, 20 мкМ сафранин О, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. Где указано, добавлены ЭГТА, неорганический фосфат (Р„) и КЦХФ.

Поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали специфический кальциевый ионофор ЕТН129, который, встраиваясь в мембраны, образует селективный Са2+ канал. Сам ионофор ЕТН129 не влиял на скорость поглощения кислорода дрожжевыми митохондриями,

величину мембранного потенциала и набухание органелл. При одновременном добавлении к митохондриям У. Иро1уНса ионофора и умеренных концентраций Са2+ наблюдалось ускорение дыхания в «состоянии 4» до максимально возможного уровня, наблюдаемого в присутствии разобщителя КЦХФ и существенное снижение мембранного потенциала (Рис. 2), свидетельствовавшие о разобщение окисления и фосфорилирования, деполяризации мембраны и об индукции в этих условиях футильного Са2+-цикла, вероятнее всего, в результате активации Са2+/Н+-обмена.

Са2* ЕТН ЭГТА КЦХФ

1мМ 10 мкМ 1 мМ 25 нМ

Время, сек

Рис. 2. Влияние Са2+, ЕТН 129 (ЕТН), Ы-ацетилцистеипа (И-Ац), Р„ и ЭГТА на генерацию мембранного потенциала митохондриями У. Иро1уЧса. Состав среды инкубации как на рис. 1. Где указано, добавлен КЦФХ.

Снижение мембранного потенциала, вызываемое одновременным добавлением к митохондриям У. Нро1уИса Са2+ и ЕТН129, не было чувствительно к действию водорастворимого антиоксиданта Ы-ацетилцистеина (Ь[-Ац) и частично восстанавливалось добавлением неорганического фосфата (Рис. 2), индуктора тРТР в митохондриях животных. Са2+-ЕТН -зависимое снижение мембранного потенциала не было чувствительно и к действию циклоспорина А (ЦсА), АБР и - ингибиторам классической ЦсА-зависимой поры

животных. Дрожжевые митохондрии не набухали в присутствии ЕТН 129 и увеличивающихся концентраций Са2+ (Рис. 3). Отсутствие набухания не было связано со структурными

ограничениями, поскольку в присутствии антибиотика аламетицина наблюдалось высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий.

Время, сек

Рис. 3. Влияние Са2+, Рн, ЕТН129 (ЕТН) и аламецитина (Алам) на набухание митохондрий У. Иро1уНса. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Тш-фосфатный буфер рН 7,2 - 7,4, 20 мМ Тпэ-пируват, 5 мМ Тпэ-малат, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. (1) - контроль, митохондрии в среде инкубации; (2) - где указано, добавлены ЕТН 129, Са2+ и Р„; (3)- аламетицин.

Совокупность полученных данных позволила сделать вывод, что митохондрии дрожжей У. Про!уПса лишены классической Са2+-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры. Более того, неорганический фосфат, стимулирующий открытие Са2+-зависимой поры в митохондриях животных, в дрожжевых митохондриях вызывал частичное восстановление мембранного потенциала.

В митохондриях дрожжей К lipolytica не индуцируется Са2+/пальмитат-зависимая пора

Из литературных данных известно (Sultan, A., and Sokolove, P., 2001; Mironova, G.D., et. al., 2001), что низкие концентрации Са2+ и насыщенных жирных кислот (пальмитата или стеарата) индуцировали в митохондриях животных открытие небелковой поры, характеризующейся нечувствительностью к циклоспорину А и неорганическому фосфату, отсутствием селективности для ионов дивалентных металлов, большей чувствительностью к Са2+ по сравнению с классической Са2+/Р„-зависимой порой, и способностью спонтанно закрываться. На дрожжевых митохондриях исследования такого рода не проводились, в том числе не было изучено влияние на них жирных кислот.

Мы нашли, что: 1) пальмитиновая кислота (а также стеариновая и пентадекановая) не может использоваться митохондриями У. lipolytica в качестве субстрата окисления, скорость дыхания в присутствии 50 мкМ пальмитата практически не отличалась от скорости дыхания на эндогенном субстрате (Рис. 4, кривая 1). 2) Как и в митохондриях животных (Mironova, et al. 2001; Sultan and Sokolove, 2001), насыщенные жирные кислоты являются разобщителями -добавление их в низких (микромолярных) концентрациях к митохондриям, окисляющим пируват + малат или сукцинат, стимулировало дыхание в «состоянии 4» (Рис. 4, кривая 2) и снижало мембранный потенциал. Более того, атрактилозид, ингибитор транслоказы адениновых нуклеотидов, снимал (Рис. 4, кривая 3) и предотвращал стимуляцию дыхания, вызванную добавлением насыщенной жирной кислоты.

Следовательно, в митохондриях У. lipolytica, как и в митохондриях животных, насыщенные жирные кислоты транспортируются через транслоказу адениновых нуклеотидов. Однако, в отличие от митохондрий животных, добавление Са2+ к митохондриям дрожжей, обработанным насыщенными жирными кислотами, не вызывало дополнительных изменений в энергетических параметрах. Лишь в присутствии Са2+ ионофора ЕТН129 имело место дополнительное снижение мембранного потенциала (Рис. 5), которое, как мы видели ранее, было вызвано, по всей вероятности, активацией Са2+/Н+-обмена, зависимое от эндогенных жирных кислот, поскольку полностью снималось добавлением БСА (Рис. 5). ЭГТА, хелатор Са2+, снимал дополнительное снижение мембранного потенциала, вызванное Са2+ и ЕТН129. Инкубация митохондрий с Са2+ и пальмитиновой кислотой не вызывала высокоамплитудного набухания митохондрий ни в отсутствие, ни в присутствии ЕТН129.

3 о Е о с

700 600 500 400 300 200 100 0

Мтх

Пальм 50 мкМ

Мтх

ПК+М Пальм 20 мМ 50 мкМ

Атр 60 мкМ

Ч . ч"

2 3

Время, мин

Рис. 4. Влияние пальмитиновой кислоты (Пальм) и атрактилозида (Атр) на дыхание митохондрий дрожжей У. Иро1уИса. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Тпэ-фосфатный буфер рН 7,2 - 7,4, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ Тпв-пируват, 5 мМ Тпв-малат, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. (1) - митохондрии в среде без субстрата дыхания, где указано, добавлены пальмитиновая кислота (Пальм); (2) - пируват + малат (ПК+М), пальмитиновая кислота; (3) - пируват + малат, пальмитиновая кислота и атрактилозид (Атр).

Следовательно, митохондрии дрожжей У. Про1уИса лишены поры, зависимой от насыщенных жирных кислот и Са2+. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий, без образования мегаканала. Таким образом, мы нашли, что в митохондриях У. \ipolytica не индуцируется Са2+-зависимая пора даже в присутствии Са2+-ионофора ЕТН129, обеспечивающего поглощение митхондриями значительных количеств Са2+.

Прооксндаиты вызывают лишь снижение мембранного потенциала, но не образование мегаканала.

По данным Ко\уако\Уз1а е1 а1. (2001), сферопласты сегеуи/«е дикого типа были устойчивы к высоким концентрациям Са2+, Р„ или /-бутилпероксида, однако мембранный

потенциал снижался в присутствии высоких (0,5 мМ) концентраций Са2+ и гидрофобного дитиолсвязывающего агента фениларсеноксида (ФАО). Это дало основание авторам утверждать, что в митохондриях сегеушаё может индуцироваться Са2+-зависимая пора. Однако в работе отсутствовали контроли - как действуют прооксиданты без добавления Са2+ и происходит ли набухание митохондрий или выход локализованных в митохондриях соединений.

КЦХФ 25 нМ

600

Рис. 5. Влияние пальмитата (Пальм), ЕТН129 (ЕТН), Са2+ и бычьего сывороточного альбумина, свободного от жирных кислот (БСА), на генерацию мембранного потенциала митохондриями дрожжей У. Иро1уНса. Состав среды инкубации см. рис. 1. Где указано, добавлен КЦХФ.

В качестве первого шага в работе было исследовано влияние прооксидантов на энергетические параметры митохондрий. В качестве прооксидантов использовали: фениларзиноксид (гидрофобный бифункциональный ЭН-агент), менадион (гидрофильный монофункциональный БН-агент), оксалоацетат (окислитель эндогенного пула ЫАОП) и некоторые другие прооксиданты (например, диамид).

Было найдено, что прооксиданты по-разному действовали на скорость дыхания дрожжевых митохондрий. Диамид в концентрации до 50 мМ и оксалоацетат в концентрациях 5-15 мМ не влияли на скорость дыхания, а также мембранный потенциал митохондрий.

Пальм БСА

Время, сек.

Менадион вызывал разобщение митохондрий, его "разобщающее" действие частично снижалось или предотвращалось водорастворимым антиоксидантом М-ацетилцистеином. Фениларсиноксид ингибировал дыхание митохондрий, причем тем больше, чем выше была его концентрация.

Было исследовано влияние прооксидантов на мембранный потенциал митохондрий. Оксалоацетат, как указано выше, не вызывал снижения мембранного потенциала в концентрациях 15-20 мМ при окислении митохондриями сукцината или пирувата + малата. Менадион и фениларсиноксид, напротив, снижали мембранный потенциал, генерируемый дрожжевыми митохондриями при окислении сукцината или пирувата + малата, однако концентрации, вызывающие деполяризацию мембраны, были по крайней мере на порядок выше тех, которые оказывали аналогичный эффект на митохондрии животных.

Для того чтобы избежать заметного разобщения или ингибирующего действия на дыхание, мы эмпирически подобрали такую комбинацию прооксидантов (менадиона, фениларзиноксида и оксалоацетата), которые вместе, но уже в относительно низких концентрациях, вызывали деполяризацию дрожжевых митохондрий (Рис. 6).

ФАО 30 мкМ

Время, сек

Рис. 6. Совместное действие фениларсиноксида (ФАО), менадиона (Мен) и оксалоацетата (ОА) на величину мембранного потенциала митохондрий дрожжей У. Иро1уИса «Ресопрягающий» эффект Ы-Ацетилцистсина (Ы-Ац). Среда инкубации как на рис. 1. Где указано, добавлен КЦХФ.

Было обнаружено, что деполяризация мембраны, вызванная добавлением одного или нескольких прооксидантов, полностью снималась или предотвращалась N-ацетилцистеином и АТР (Рис. 6 и 7) и частично восстановленным глутатионом (не показано). "Ресопрягающее" действие АТР было специфичным, поскольку снималось карбоксиатрактилозидом, ингибитором транслоказы адениновых нуклеотидов, а также Mg2+. Другие использованные нуклеотиды оказывали частичный "ресопрягающий" эффект (Рис. 7).

Мен 30 мкМ од з Мм КЦХФ 25 нМ

Время, сек

Рис. 7. «Ресопрягающий» эффект (1) - АТР, (2) - ADP, (3) - GTP на деполяризацию мембраны митохондрий У. lipolytica, вызванную совместным действием фениларсиноксида (ФАО), менадиона (Мен) и оксалоацетата (OA). Среда инкубации см. рис. 1. Где указано, добавлены: олигомицин (Олиго) ко всем, кроме АТР - (1), N-Ацетилцистеин (N-Ац) и КЦХФ.

Было исследовано совместное действие прооксидантов и кальция (в присутствии ЕТН129) на митохондрии дрожжей У. lipolytica. Наблюдалась незначительная стимуляция или ингибирование дыхания митохондрий (в зависимости от используемого прооксиданта), а также связанная с этим деполяризация мембраны. Прооксиданты, порознь, или в комбинации друг с другом, или с Са2+ и ЕТН129, не вызывали высокоамплитудного набухания дрожжевых митохондрий.

Таким образом, в митохондриях дрожжей У. lipolytica прооксиданты порознь или в комбинации друг с другом и Са2+ вызывали снижение мембранного потенциала, но не образование мегаканала

В митохондриях Y. lipolytica обнаружен К+-капал, закрываемый при добавлении АТР

В митохондриях S. cerevisiae была обнаружена неспецифическая пора (названная также YMUC - yeast mitochondrial unspecific channel - дрожжевым митохондриальным неспецифическим каналом), открываемая, в противоположность мигоК+атр каналу митохондрий животных, в ответ на добавление АТР и закрываемая при дефиците АТР. YMUC имеет, по-видимому, те же размеры, что и тРТР животных, и активен in situ (Manon S. et. al., 1998). Поэтому мы попытались установить, содержат ли прочно-сопряженные митохондрии дрожжей У. lipolytica канал такого типа. Однако, мы обнаружили, что добавление 2 мМ АТР, вызывавшее высокоамплитудное набухание митохондрий S. cerevisiae (Jung, D.W., et al, 1997), не вызывало набухания митохондрий дрожжей У. lipolytica, напротив, имело место ингибирование спонтанного набухания органелл (Рис. 8, кривая 2). Отсутствие АТР-индуцируемого набухания не было связано со структурными ограничениями, так как добавление каналоформера аламетицина (Рис. 8, кривая 3) или калиевого ионофора валиномицина (Рис. 9, кривые 1 и 2) приводило к высокоамплитудному (максимально возможному) набуханию митохондрий. Это наблюдение побудило нас подробнее исследовать влияние АТР на набухание митохондрий У. lipolytica.

Набухание имело место в KCl-среде (Рис. 9, кривая 1) и ингибировалось добавлением АТР (Рис. 9, кривая 2) с величиной (Ьо), равной 48 мкМ. Ингибирующий эффект АТР частично предотвращался неорганическим фосфатом (Р„) (Рис. 9, кривая 4) и Mg2+ (Рис. 9, кривая 3). В присутствии этих реагентов величина I50 для АТР увеличивалась соответственно до 0,4 и 1,8 мМ.

Атрактилозид - ингибитор транслоказы адениновых нуклеотидов и олигомицин -ингибитор синтеза АТР частично предотвращали ингибирующий эффект АТР, причем атрактилозид в большей степени, чем олигомицин, что позволяет предположить, что АТР действует главным образом с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны. Амплитуда набухания в KCl-среде была наибольшей при pH 7,5 (она была сопоставима с амплитудой набухания, вызываемой добавлением аламетицина) и уменьшалась примерно на

25-27% при снижении величины pH до 6,4.

а X

0.34'

0.32.

0.30

0.28

' 0.26-

0.24

АТР 2 мМ I I I

-Г——

Апам * 2,6 мкг/мл *

0 50 100 150 200 250 ^ 300

Время, сек

Рис. 8. Влияние АТР (2) и аламетицина (Алам) (3) на набухание митохондрий У. lipolytica в среде [Jung et al., 1997], содержащей 230 мМ маннит, 70 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES (К+), pH 7,3, 25 мкМ ЭГТА, 0,5 мг/мл БСА, 10 мкг/мл олигомицина, 0,5 мг/мл митохондриального белка. (1) - митохондрии в среде инкубации.

Для того чтобы выяснить, селективен ли канал для ионов калия, мы исследовали набухание митохондрий У. lipolytica в присутствии эквимолярных концентраций хлоридов К+, Na+, Li+, ТЕА+, Tris. Амплитуда набухания дрожжевых митохондрий была максимальной в 0,2 М КС1 (принята за 100%) и составляла примерно 50% от максимальной в NaCl- и LiCl-средах, 25% - в Tris-HCl-среде и около 10-15% в ТЕА-С1-среде. Таким образом, можно утверждать, что АТР ингибировал пору (канал), индуцируемую главным образом моновалентными катионами, преимущественно К+.

Данные, полученные при измерении набухания, получили подтверждение и при регистрации мембранного потенциала. Добавление к слегка гипотонической среде 50 мМ КС1 вызывало снижение мембранного потенциала, последующее добавление АТР способствовало восстановлению величины мембранного потенциала до исходного значения. Концентрация АТР, вызывающая полумаксимальный ресопрягающий эффект, составляла 13,2 мкМ, что хорошо согласуется с данными по ингибирующему действию АТР на набухание

митохондрий в KCl-среде. Незначительные различия могут быть связаны с разными условиями инкубации. В присутствии Mg2+, деполяризация мембраны, индуцируемая добавлением 50 мМ KCl, не менялась, но АТР восстанавливал мембранный потенциал лишь частично. Магний в концентрации 2 мМ увеличивал концентрацию ATP (I50 = 174 мкМ), необходимую для полумаксимального ингибирования деполяризации мембраны, вызванной добавлением KCl. Атрактилозид, как и в случае измерения набухания митохондрий, частично ингибировал ресопрягающий эффект АТР.

KCl 50 мМ АТР 1 мМ КЦХФ 25 нМ

т-■-1-■-1-'-1---1-1-1

0 100 200 300 400 500 600 Время, сек

Рис. 9. Влияние KCl и АТР (1) на мембранный потенциал, генерируемый митохондриями Y. lipolytica.Среда инкубации: 0,5 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, pH 7,3 - 7,4, 20 мМ Tris-сукцинат, 20 мкМ сафранин О, митохондриальный белок (Мтх) 0,5 мг/мл. (2) - в среду инкубации добавлен 2 мМ Mg2+; где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.

"Ресопрягающий" эффект АТР строго зависел от концентрации добавленного KCl: чем выше была концентрация добавленного к митохондриям KCl, тем более высокие концентрации АТР были необходимы для реполяризации мембраны. В присутствии физиологической концентрации KCl, равной 100 мМ, концентрация АТР, вызывающая полное ресопряжение, составляла 300 мкМ. Концентрации маннита и KCl были подобраны таким образом, чтобы вместе они составляли изоосмотический раствор.

Далее было исследовано влияние АТР на набухание митохондрий в KCl-среде в зависимости от степени энергизации митохондрий. Для этого подобрали концентрации разобщителя КЦХФ, снижающие мембранный потенциал, но еще не вызывающие дополнительного набухания митохондрий. Было выяснено, что снижение мембранного потенциала под действием разобщителя даже на 10% от максимальной величины (измеренной в отсутствии разобщителя) требовало существенно более высоких, уже не физиологических концентраций АТР для ингибирования набухания митохондрий в KCl-среде. Это означает, что АТР-зависимое ингибирование набухания митохондрий (т. е. закрытие канала или поры) - это энергозависимый процесс.

Таким образом, нами впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен АТР-зависимый К+-канал, закрывемый добавлением АТР и названный нами по аналогии с АТР-зависимым К+-каналом митохондрий животных - УмитоКдтр.

Поскольку действие АТР на дрожжевые митохондрии было очень сходным с тем, что было описано для митохондрий животных (Миронова и др. 2004), нашим следующим шагом было систематическое исследование влияния на дрожжевые митохондрии веществ, известных как регуляторы митоКатр.

Диазоксид, один из самых известных открывателей митоКатр митохондрий животных, в низких (микромолярных) концентрациях не влиял на величину мембранного потенциала дрожжевых митохондрий, но при этом индуцировал высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в KCl-среде, дополненной 1 мМ АТР (С50 = 20 мкМ). GTP, GDP и UDP (в присутствии 5-HD), другие известные открыватели митоКатр митохондрий животных, внесенные после добавления АТР, вызывали повторную деполяризацию мембраны и набухание митохондрий в KCl-среде, дополненной 1 мМ АТР. Кромакалим, активатор митоК+атр митохондрий животных, в низких концентрациях (до 5 мкМ) индуцировал высоко амплитудное набухание дрожжевых митохондрий в KCl-среде, содержащей 1 мМ АТР, а в более высоких концентрациях амплитуда набухания уменьшалась. Добавление 5-HD (5-гидроксидекановой кислоты), ингибитора митоКатр, приводило к уменьшению амплитуды спонтанного набухания дрожжевых митохондрий в KCl-среде. Максимальный эффект 5-HD достигался в концентрациях 50 мкМ и 5 мМ.

Таким образом, в митохондриях У. lipolytica нами впервые обнаружен АТР-зависимый К+-канал, закрываемый, как и в митохондриях животных, при добавлении АТР. Ингибирующий эффект АТР частично снимался Mg2+ неорганическим фосфатом. 5-HD также ингибировала активность канала. Диазоксид, кромакалим, UDP, GDP и GTP, а также

подщелачивание среды и снижение мембранного потенциала активировали УмитоК+АТР канал в митохондриях У. lipolytica. Поскольку использованные нами вещества, известные как регуляторы митоКатр, действовали на митохондрии дрожжей У. lipolytica так же, как и на митохондрии животных (открыватели митоКатр открывали и УмитоК+АТр, а закрыватели митоКатр закрывали и УмитоК\тр) и примерно в тех же концентрациях, можно заключить, что нам впервые удалось обнаружить в дрожжевых митохондриях митоКатр "животного типа", ингибируемый АТР. Более того, на основании проведенного ингибиторного анализа можно утверждать, что митоКатр дрожжей У. lipolytica содержит не только компоненты, образующие К+-канал, но и сенсор АТР.

Поскольку принимается, что концентрация цитоплазматического АТР составляет примерно 1 мМ (большинство АТР-зависимых ферментов имеют величину Км для АТР, лежащую именно в этом диапазоне), это означает что в "нормальных условиях" АТР-зависимый К+-канал митохондрий У. lipolytica, а возможно и других дрожжей аэробного типа обмена, ингибируемый микромолярными концентрациями АТР, должен находиться в закрытом состоянии. Однако, поскольку нами было найдено, что ингибирующий эффект АТР частично снимался Mg2+ и неорганическим фосфатом, можно предположить, что в физиологических условиях (при внутриклеточных концентрациях Mg2+ и Р„, равных примерно 5-10 мМ), АТР может реально выступать в качестве возможного модулятора АТР-зависимого К+-канала. Резкое снижение внутриклеточной концентрации АТР (ниже критического уровня) под действием разных неблагоприятных факторов может служить сигналом для открытия канала и, в конечном итоге, для запуска каскада реакций, ведущих к апоптозу. У факультативных анаэробов снижение внутриклеточного уровня АТР, напротив, будет способствовать закрытию канала, тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный - митохондриальный способ запасания энергии.

Выводы

1. Митохондрии У. lipolytica лишены Са2+-фосфат-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры. В присутствие кальциевого ионофора Са2+ вызывал значительную деполяризацию мембраны, за счет, вероятно, активации Са2+/Н+-обмена, без образования мегаканала.

2. В митохондриях дрожжей У. lipolytica не индуцируется пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий.

3. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий У. lipolytica без образования мегаканала.

4. Впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен АТР-ингибируемый калиевый канал, функционально сходный с аналогичным каналом митохондрий животных: канал содержит не только канальную субъединицу, но и сенсор АТР. Предполагается участие обнаруженного нами канала в запуске апоптоза дрожжевых клеток.

Список публикаций

Статья в рецензируемых журналах:

Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva Т.А., Zyl'kova M.V., Ural'skaya L.A., Popova K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. (2009) Induction of a non-specific permeability transition in mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts. J Bioenere. Biomembr. 41(3):239-249.

Тезисы докладов:

1. Ковалёва M.B., Суханова Е.И., Зылькова М.В., Романовская М.А. (2006) Окислительный стресс и индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica. Труды Всероссийской конференции молодых ученых "Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты", Москва, 1-3 июня, стр. 173-174.

2. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Ural'skaya L.A., Guseva E.S. and Zvyagilskaya R.A. (2006) Prooxidant-induced low-conductance channel in mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC, Moscow, 21-26 July Short Reports, suppl. V. 14, p. 332.

3. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I. (2006). An mPTP-like pore in yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, Nth EBEC, Moscow, 21-26 July Short Reports, suppl. V. 14, p. 336.

4. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Uralskaya L.A., Guseva E.S. (2006) Mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast does not undergo a typical permeability transition (mPTP). Prooxidans induced only a low-conductance channel for H+. 24th Small Meeting on Yeast Transport and Energetics. August 31- September 3, Program and Abstracts, p. 38A.

5. Kovaleva M.V. and Zvyagilskaya R.A. (2007) ATP opens a pore in Saccharomyces cerevisiae mitochondria, but closes in Yarrowia lipolytica mitochondria. The FEBSJ., Abstracts of 33th FEBS Congress «Molecular Machines ", 7-12 July 2007, Vienna, Austria, 274 (1); p. 124.

6. Zvyagilskaya R.A., Zyl'kova M.V., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2008) Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly regulated. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC Shoort Reports, S32.

7. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2009) Pathways for

release of apoptotic factors from yeast mitochondria. The FEBSJ. Abstracts of 34th FEBS Congress "life's Molecular Interactions ", 4-9 July 2009, Prague, Czech Republic, P4-143, p. 229

8. M.V. Zylkova, E.I. Sukhanova, T.A. Trendeleva, M.V. Kovaleva, R.A. Zvyagilskaya. (2008) More on permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria. Abstr. Bari Intern. Symposium on "Mitochondrial physiology and pathology" IUBMB Sympos. SI. Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB, Athens (28 Jun - 3 Jul), SC2.38.

9. Зылькова M.B., Ковалева M.B., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А., Звягнльская Р.А. (2008) Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий. Труды 2-го Съезда микологов России с международным участием "Современная микология в России", т.2, с. 127-128.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, д.37А Тираж 100 экз. Подписано в печать 11.11.09 Заказ № 3800

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалёва, Мария Владимировна

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Апоптоз

Глава 2. Неспецифическая Са2+-зависимая проницаемость митохондрий 12 животных

Глава 2.1. Са2+-зависимая, циклоспорин А-чувствптельная пора

Глава 2.2. Са2+-зависнмая циклоспорин А-нечувствительная пора, 14 индуцируемая жирными кислотами

Глава 2.3. Неспецифическая проницаемость митохондрий дрожжей

Глава 2.4. Влияние жирных кислот на дрожжевые митохондрии

Глава 3. Окислительный стресс. Прооксиданты. Антиоксиданты.

Глава 3.1. Окислительный стресс

Глава 3.2. Активные формы кислорода

Глава 3.3. Источники АФК в митохондриях

Глава 3.4. Митохондрпальпые системы удаления АФК

Глава 3.5. Проницаемость митохондрий животных в условиях 30 окислительного стресса

Глава 3.6. Окислительный стресс в клетках дрожжей

Глава 4. Митохондриальный АТР-чувствительный калиевый капал

Глава 4.1. Системы транспорта калия в митохондриях животных

Глава 4.2. Системы транспорта калия в митохондриях растений

Глава 4.3. Системы транспорта калия в митохондриях дрожжей

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. Материалы и методы исследования

Глава 1.1. Реагенты

Глава 1.2. Организм

Глава 1.3. Условия выращивания

Глава 1.4. Выделение митохондрий из дрожжей У. lipolytica

Глава 1.5. Выделение митохондрий печени крысы

Глава 1.6. Аналитические методы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. В митохондриях дрожжей К lipolytics не индуцируется 47 «классическая» Са2+-зависимая, циклоспорин А-чувствительная пора

Глава 2. В митохондриях дрожжей Y. lipolytica не индуцируется 57 Са2+/пальмитат-зависимая пора

Глава 3. Изучение влияния прооксидантов на митохондрии дрожжей 62 Y. lipolytica

Глава 4. Митохондриальный АТР-зависимый калиевый канал в 78 митохондриях дрожжей Y. lipolytica

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica"

До недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь многоклеточным организмам, обладающим способностью к цитологической дифференцировке. Первое указание на возможность клеточной смерти дрожжей по механизму, напоминающему апоптоз, пришло из экспериментов, в которых животные про- или анти-апоптотические белки были гетерологически экспрессированы в дрожжах S. cerevisiae и изучено их влияние на клеточную физиологию (Priault et al., 2003). В этих опытах дрожжевые клетки либо умирали, демонстрируя набор физиологических маркеров апоптоза, либо избегали смерти, в зависимости от присутствия про- или анти-апоптотических белков. В дальнейшем в геноме различных видов дрожжей были обнаружены эндогенные гены-гомологи факторов апоптоза человека и животных. В 2002 г. в дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован и первый белок, участвующий в эффекторной стадии апоптоза у дрожжей - метакаспаза-1 (Madeo et al., 2002) (Ycalp) - цистеиновая протеаза, функционально аналогичная митохондриальным каспазам животных.

С тех пор были получены многочисленные доказательства смерти дрожжевых клеток (в основном, S. cerevisiae) по механизму апоптоза как в ответ на внешние стимулы или повреждения клеточных структур, так и в результате репликативного или хронологического старения (Laun et al., 2006, 2008; Herker et al., 2004). При этом наряду с метакаспазой-1 в них доказано участие белков-гомологов факторов апоптоза человека: HtrA2 (Fahrenkrog et al., 2004), AIF и AMID (Wissing et al., 2004); Dnmlp (Fannjiang et al., 2004), ответственного за дробление митохондрий человека, цитохрома с (Ludovico et al., 2002; Silva et. al., 2005), эндонуклеазы G (Biittner et al., 2007; Cymerman et al., 2008), Rho5 вТРазы (при апоптозе, запускаемом активными формами кислорода) (Singh et al.,

2008) и пока единственного известного антиапоптотического фактора Birlp (Owsianowski et al., 2008).

Совокупность этих данных можно рассматривать как веское указание на то, что программа апоптоза дрожжей и животных может иметь общие элементы. Особая роль митохондрий в системе выбора клетки между жизнью и смертью определяется тем, что они являются и основными генераторами активных форм кислорода в клетке, а их межмембранное пространство служит депо проапоптотических факторов. При повреждении внешней мембраны проапоптотические факторы выходят из митохондрий в цитоплазму, запускают и усиливают каскад реакций, приводящий в конечном итоге к гибели клетки. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов в цитоплазму. Один из них включает активацию, конформационнуго перестройку и интеграцию во внешнюю мембрану митохондрий проапоптотического белка Вах, члена семейства белков Вс1-2. Другим способом является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия пор.

Поэтому данная работа направлена на поиск и изучение способов (как ранее найденных в митохондрий животных, так и новых) индукции неспецифической проницаемости во внутренней митохондриальной мембране дрожжей. В качестве объекта исследования использовали дрожжи Yarrowia lipolytica, облигатные аэробы, содержащие полностью компетентную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического сопряжения и хорошо-структурированные кристы, поэтому являющиеся лучшей альтернативой более традиционному объекту изучения механизмов апоптоза у одноклеточных - митохондриям дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось систематическое исследование возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Y. lipolytica, определение условий индукции проницаемости и изучение её регуляции.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны классического типа (Са2+-фосфат-зависимый, циклоспорин А-чувствительный механизм).

2. Изучить существование в митохондриях дрожжей Y. lipolytica иных механизмов индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны: а. циклоспорин А-нечувствительного, индуцируемого низкими концентрациями Са2+ и жирными кислотами; б. запускаемого окислительным стрессом; в. АТР-зависимого К+-специфичного ионного канала. Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые на систематической основе исследована возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Y. lipolytica. Показано, что в исследованных митохондриях не индуцируется Са2+-фосфат-зависимая, циклоспорин-чувствительная пора; пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipolytica без образования мегаканала. Обнаружен лишь АТР-зависимый К+-канал, "животного" типа, специфически закрываемый добавлением АТР.

Результаты настоящей диссертационной работы дополняют получепные к настоящему времени данные о возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей и её регуляции, и позволяют приблизиться к пониманию того, каким образом дрожжевые митохондрии могут принимать участие в процессе апоптоза. Обнаруженное нами впервые сходство (митоКатр) митохондрий животных и дрожжей Y. lipolytica позволяет рассматривать разработанную нами модель в качестве перспективной для изучения регуляции и структуры митохондриального К+-канала, которому в настоящее время отводится важная роль в защите сердечной мышцы от последствий ишемии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковалёва, Мария Владимировна

Выводы

1. Митохондрии Y. lipolytica лишены Са2+-фосфат-зависимой, циклоспорин-чувствительной поры. В присутствии кальциевого ионофора Са2+ вызывал значительную деполяризацию мембраны, за счет, вероятно, активации Са2+/Н+-обмена, без образования мегаканала.

2. В митохондриях дрожжей Y. lipolytica не индуцируется пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий.

3. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipolytica без образования мегаканала.

4. Впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен АТР-ингибируемый калиевый канал, функционально сходный с аналогичным каналом митохондрий животных. Предполагается участие обнаруженного нами канала в запуске апоптоза дрожжевых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью стандартных тестов (измерения величины мембранного потенц скорости дыхания, набухания) на систематической основе была иг.г.педпт=ь—-и ття возможность индукции неспецифической проницаемости внутренней митохондрий дрожжей Y. lipolytica.

Была изучена возможность индукции «классической» Са2+-зависи::гч^ш: ой циклоспорин А-чувствительной поры в митохондриях дрожжей при использовалг-^пги-г м классических индукторов поры - высоких концентраций Са2+ и Рн. Показано, чте> в присутствии даже высоких и нсфизиологических концентраций Са2+ и концентраций Рн (от 0,2 до 2 мМ) не наблюдалось изменения величины мембрани<^игг>х~о потенциала дрожжей Y. lipolytica и высокоамплитудного набухания митохондрий, i этом отсутствие набухания не было связано со структурными ограничен митохондрий дрожжей Y. lipolytica.

В присутствии специфического Са2+ ионофора ЕТН129, который, ! * >ти встраивании в мембраны образует Са2+-канал, Са2+ и х ц таюкс не индуциров «—гjrxn образования мегаканала в митохондрии дрожжей Y. lipolytica. Имела место ли^гшь деполяризация мембраны (снижение мембранного потенциала) за счет, нерпя l ■ - i с~>, активации Са2+/Н+-антипорта, зависимого от эндогенных жирных кислот. Tabczzz^^ivi образом, митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены классической Са2+-зависим: циклоспорин А-чувствительной поры.

Была исследована возможность индукции митохондрии дрожжей Y. lipolyz^f^^a циклоспорин поры, нечувствительной к действию циклоспорина А, открываем о ъ-пп в митохондриях животных при одновременном добавлении низких концентраций Са"2" и жирных кислот. Найдено, что жирные кислоты вызывали разобщение митохондригКпг, а добавленные вместе с Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора ЕТН 129) не индуциров^:zrx:и образования мегаканал.

Таким образом, исследованные дрожжевые митохондрии оказались устойчивь»г zrr^tn к действию высоких концентраций Са2+. Мы полагаем, что это общее свойств— дрожжевых митохондрий. Причины устойчивости к Са2+ остаются предмет^ <r—>zvi дальнейших исследований. Но несомненно, что проницаемость внутренг^^г z^ziZ митохондриальной мембраны дрожжей по-другому регулируется по сравнению* с митохондриями животных и не связана с системой транспорта Са2+.

С помощью стандартных тестов (измерение величины мембранного потенциала, скорости дыхания, набухания), была изучена возможность индукции поры в дрожжевых митохондриях в условиях окислительного стресса и ее регуляция. Нам удалось эмпирически подобрать комбинацию прооксидантов (менадиона, фениларсиноксида и оксалоацетата), которые снижали мембранный потенциал, действуя в относительно низких концентрациях, исключающих их ингибирующее влияние на скорость окисления. Было показано, что в митохондриях дрожжей Y. lipolytica прооксиданты снижали мембранный потенциал, но не вызывали образования мегаканала (высокоамплитудного набухания митохондрий). Добавленные порознь прооксиданты снижали мембранный потенциал в концентрациях, намного превосходящих те, которые вызывали аналогичный эффект на митохондриях печени. Предполагается, что устойчивость митохондрий к окислительному стрессу может быть связана с наличием в дрожжевых митохондриях высокоэффективной антиоксидантной защиты. Снижение мембранного потенцала, вызванное прооксидантами, предотвращалось добавлением антиоксидантов, а также АТР, в меньшей степени - других нуклеотидов. Интересно, что ресопрягающее действие АТР проявлялось и в тех случаях (например, при добавлении высоких концентраций фениларсиноксида), когда классический водорастворимый антиоксидант N-ацетилцистеин был "бессилен". Ресопрягающее действие АТР снималось и предотвращалось Mg2+ и карбоксиатрактилозидом, ингибитором транслоказы адениновых нуклеотидов. В основе ресопрягающего действия АТР может быть либо включение второго генератора мембранного потенциала (митохондрии дрожжей могут генерировать потенциал как за счет окисления субстрата при работе дыхательной цепи, так и за счет энергии гидролиза АТР), либо снятие ингибирующего действия прооксидантов на транслоказу адениновых нуклеотидов.

В митохондриях Y. lipolytica был обнаружен К+-канал "животного типа", ингибируемый АТР. Более того, на основании проведенного ингибиторного анализа можно утверждать, что митоКдтр дрожжей Y. lipolytica содержит не только компоненты, образующие К+-канал, но и сенсор АТР. Следует подчеркнуть, что дрожжи Y. lipolytica являются единственным видом дрожжей, в митохондриях которых найден АТР-зависимый калиевый канал «животного» типа. Высказано предположение о том, что в физиологических условиях АТР может выступать в качестве модулятора АТР-зависимого К+-канала. Резкое снижение внутриклеточной концентрации АТР (ниже критического уровня) под действием разных неблагоприятных факторов в клетках дрожжей-аэробов, включая Y. lipolytica, может служить сигналом для открытия канала и, в конечном итоге, для запуска каскада реакций, ведущих к апоптозу. У факультативных анаэробов снижение внутриклеточного уровня АТР, напротив, будет способствовать закрытию канала, тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный - митохондриальный способ запасания энергии. В дальнейшем предстоит показать возможность выхода апоптогенных факторов из межмембранного пространства митохондрий при открытии АТР-зависимого К+-канала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалёва, Мария Владимировна, Москва

1. Akerman К.Е., Wikstrom М.К. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett. 68, 191-197.

2. Almeida В., Buttner S., Ohlmeier S., Silva A., Mesquita A., Sampaio-Marques В., Osorio N.S., Kollau A., Mayer В., Leao C., Laranjinha J., Rodrigues F., Madeo F., Ludovico, P. (2007) NO-mediated apoptosis in yeasts. J. Cell Sci., 120, 3279-3288.

3. Balcavage W.X., Lyoyd J.L., Mattoon J.R., Ohnishi T. and Scarpa A. (1973) Cation movements and respiratory response in yeast mitochondria treated with high Ca2' concentrations. Biochim. Biophys. Acta 305, 41—51.

4. Bazhenova E.N., Deryabina Y.I., Eriksson O., Zvyagilskaya R.A., Saris N.E. (1998a) Characterization of a high capacity calcium transport system in mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. J. Biol. Chem, 20, 273, 4372-4377.

5. Bazhenova E.N., Saris N-E., Pentilla Т., Zvyagilskaya R.A. (1998). Stimulation of the mitochondrial calcium uniporter by hypotonicity and ruthenium red. Biochim. Biophys. Acta, 1371, 96-100.

6. Bednarczyk P., Dolovy K., Szewczyk A. (2005). Matrix Mg2+ regulates mitochondrial ATP-dependent potassium channel from heart. FEBS. 579: 1625-1632.

7. Belizario J.E., Alves J., Occhiucci J.M., Garay-Malpartida M., Sesso A. (2007) A mechanistic view of mitochondrial death decision pores. Braz .J. Med. Biol. Res. 40, 101124.

8. Bernardi P., Rrauskopf A., Basso E., Petronilli V., Blachly-Dyson E., Di Lisa F., Forte M.A. (2006) The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target. FEBS J. 273,2077-2099.

9. Berrisford J.M., Sazanov L.A. (2009) Structural basis for the mechanism of respiratory complex I. J. Biol. Chem. 284, 29773-29783.

10. Bienert G.P., Moller A.L., Kristiansen K.A., Schulz A., Moller I.M., Schjoerring J.K., Jahn T.P. (2007) Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. J. Biol. Chem., 282, 1183-1192.

11. Blagovi В., Rupci J., Mesari M., Man V. (2005) Lipid analysis of the plasma membrane and mitochondria of brewer's yeast. Folia Microbiol (Praha), 50, 24-30.

12. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

13. Bradshaw P.C., Jung D.W., Pfeiffer D.R. (2001) Free Fatty Acids Activate a Vigorous Ca2+:2H+ Antiport Activity inYeast Mitochondria. J. Biol. Chem., 276, 40502-40509.

14. Branco M.R., Marinho H.S., Cyrne L., Antunes F. (2004) Decrease of H2O2 plasma membrane permeability during adaptation to H2O2 in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 279, 6501-6506.

15. Biittner S., Eisenberg Т., Carmona-Gutierrez D., Ruli D., Knauer H., Ruckenstuhl C., Sigrist C., Wissing S., ICollroser M., Frohlich K.U., Sigrist S., Madeo F. (2007) Endonuclease G regulates budding yeast life and death. Mol. Cell. 26, 233-246.

16. Carafoli E. (1987) Intracellular calcium homeostasis. Ann. Rev. Biochem., 56, 395-433

17. Castrejon V., Pena A., Uribe S. (2002). Closure of the yeast mitochondria unspecific channel (YMUC) unmasks a Mg2+ and quinine sensitive K+ uptake pathway in Saccharomyces cerevisiae. J.Bioener.g Biomembr., 34, 299-306.

18. Chinta S.J., Rane A., Yadava N., Andersen J.K., Nicholls D.G., Polster B.M. (2009) Reactive oxygen species regulation by AIF- and complex I-depleted brain mitochondria. Free Radic. Biol. Med., 46, 939-947.

19. Circu M.L., and Aw T.Y. Gluthatione and apoptosis. (2008) Free Radic. Res., 1, 1-18.

20. Colin J., Garibal J., Mignotte В., Guenal, I. (2009) The mitochondrial TOM complex modulates bax-induced apoptosis in Drosophila. Biochem. Biophys. Res. Commun., 379, 931-943.

21. Costa A.D., Quinlan C.L., Andrukhiv A. (2006). The direct physiological effects of mitoK(ATP) opening on heart mitochondria. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 290: 406-415.

22. Cymerman I.A., Chung I., Beckmann B.M., Bujnicki J.M., Meiss G. (2008) EXOG, a novel paralog of Endonuclease G in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res. 36, 1369-79.

23. Dahlem YA, Wolf G, Siemen D, Horn TF. (2006). Combined modulation of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel and the permeability transition pore causes prolongation of the biphasic calcium dynamics. Cell Calcium., 39, 387-400.

24. DePablo M., Susin S., Jacotot E., Larocette, Costantini P., Ravagnan L., Zamzani N., and Kroemer G. (1999) Palmitate induces apoptosis via a direct effect on mitochondria. Apoptosis, 4, 81-87.

25. Deryabina Y.I., Bazhenova E.N., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A., (2001) Ca(2+) efflux in mitochondria from the yeast Endomyces magnusii. J. Bio.l Chem., 276, 47801-47806.

26. Eisenberg, Т., Buttner, S., and Kroemer, G. (2007) The mitochondrial pathway in yeast apoptosis. Apoptosis, 12, 1011-1023.

27. Fabrizio P., Longo V.D. 2008 Chronological aging-induced apoptosis in yeast. , 1783,1280-1285.

28. Facundo HT, de Paula JG, Kowaltowski A J. (2007). Mitochondrial ATP-sensitive K+ channels are redox-sensitive pathways that control reactive oxygen species production. Free Radic Biol Med., Apr 1; 42(7): 1039-1048.

29. Fahrenkrog В., Sauder U., Aebi U. (2004) The S. cerevisiae HtrA-like protein Nmal 1 lp is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis. J. Cell. Sci 117, 115-126.

30. Fannjiang Y., Cheng W.C., Lee S.J., Qi В., Pevsner J., McCaffery J.M., Hill R.B., Basanez G., Hardwick J. M. (2004) Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast. Genes Dev. 18, 2785-2797.

31. Folmer V., Pedroso N., Matias A.C., Lopes S.C., Antunes F., Cyrne L., Marinho H.S. (2008) H2O2 induces rapid biophysical and permeability changes in the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1141-1147.

32. Fujii J., Ikeda, Y. (2002) Advances in our understanding of peroxiredoxin, a multifunctional, mammalian redox protein. Redox. Rep., 1, 123-130;

33. Galkin A., Brandt U. (2005) Superoxide radical formation by pure complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica. J. Biol. Chem., 280, 30129-30135.

34. Gao, W., Pu, Y., Luo, K.Q., and Chang, D.C. (2001) Temporal relationship between cytochrome с release and mitochondrial swelling during UV-induced apoptosis in living HeLa cells. J. Cell Sci., 114, 2855-2862.

35. Gardner P.R. (2002) Aconitase: sensitive target and measure of superoxide. Methods Enzymol., 349, 9-23.

36. Garlid K.D., Paucek P. (2001). The mitochondrial potassium cycle. IUBMB Life, 52: 153158.

37. Garlid K.D., Paucek P. (2003b). Mitochondrial potassium transport: the K+ cycle. Biochim. Biophys. Acta, 1606: 23-41.

38. Garrido E.O., Grant C.M. (2002) Role of thioredoxins in the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress induced by hydroperoxides. Mol. Microbio.l, 43, 993-1003.

39. Gateau-Roesch O., Pavlov E., Lazareva A.V., Limarenko E.A., Levrat C., Saris N.E., Louisot P., Mironova G.D. (2000) Calcium-binding properties of the mitochondrial channel-forming hydrophobic component. J. Bioenerg. Biomembr., 32, 105-110.

40. Gogvadze V., Robertson J.D., Enoksson M., Zhivotovsky В., Orrenius S. (2004) Mitochondrial cytochrome с release may occur by volume-dependent mechanisms not involving permeability transition. Biochem. J., 378, 213-217.

41. Grigoriev S., Skarga Y.Y., Mironova G.D., Marinov B.S. (1999). Regulation of mitochondrial Кдтр channel by redox agents. Biochim. Biophys. Acta., 1410(1): 91-96.

42. Grover G., Garlid K. (2000). ATP-sensitive potassium channels: a review of their cardioprotective pharmacology. J.Mol.Cell Cardiol., 32: 677-695.

43. Grover GJ, Sleph PG, Dzwonczyk S. (1992). Role of myocardial ATP-sensitive potassium channels in mediating preconditioning in the dog heart and their possible interaction with adenosine Al-receptors. Circulation, Oct; 86(4): 1310-6.

44. Guerin В., Bunoust O., Rouqueys V., Rigoulet M. (1994) ATP-induced Unspecific Channel in Yeast Mitochondria . J. Biol. Chem., 269, 25406-25410.

45. Guo J., Lemire B.D. (2004) The ubiquinone-binding site of the Saccharomyces cerevisiae succinate-ubiquinone oxidoreductase is a source of superoxide. J. Biol. Chem. 278, 4762947635.

46. Gutierrez-Aguilar M, Perez-Vazquez V, Bunoust O, Manon S, Rigoulet M, Uribe S. 2007. In yeast, Ca2+ and octylguanidine interact with porin (VDAC) preventing the mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta.

47. Halestrap A.P. (2009a) What is the mitochondrial permeability transition pore? J. Mol. Cell. Cardiol. 46, 821-831.

48. Halestrap A.P. (2009b) Mitochondrial calcium in health and disease. Biochim. Biophy.s Acta. 1787, 1289-1290.

49. Halestrap AP, Pasdois P. (2009) The role of the mitochondrial permeability transition pore in heart disease. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1402-1411.

50. Han D., Canali R., Rettori D., Kaplowitz, N. (2003) Effect of glutathione depletion on sites and topology of superoxide and hydrogen peroxide production in mitochondria. Mol. Pharmacol., 64, 1136-1144.

51. Hanada M., Aime-Sempe C., Sato Т., Reed, J.C. (1995) Structure-function analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270, 11962-11969.

52. Herker E., Jungwirth H., Lehmann K.A., Maldener C., Frohlich K.U., Wissing S., Buttner S., Fehr M., Sigrist S., Madeo F. (2004) Chronological aging leads yto apoptosis in yeasts. J. Cell Biol.,. 164, 501-507.

53. Imai, H., and Nakagawa, Y. (2003) Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells. Free Radic. Biol. Med., 34, 145-169.

54. Inoue I., Nagase H., Kishi K. & Higuti T. (1991). ATP-sensitive K+ channel in the mitochondrial inner membrane. Nature, 352: 244-247.

55. Johansson C., Lillig, C.H., Holmgren, A. (2004) Human mitochondrial glutaredoxin reduces S-glutathionylated proteins with high affinity accepting electrons from either glutathione or thioredoxin reductase. J. Biol. Chem., 279, 7537-7543.

56. Jung D.W., Bradshaw P.C., Pfeiffer D.R. (1997). Properties of a cyclosporin-insensitive permeability transition pore in yeast mitochondria. J Biol Chem. 272, 21104-21112.

57. Kerscher S, Drose S, Zwicker K, Zickermann V, Brandt U (2002) Yarrowia lipolytica, a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. Biochim Biophys Acta. 1555, 8391.

58. Kerscher S, Kashani-Poor N, Zwicker K, Zickermann V, Brandt U (2001) Exploring the catalytic core of complex I by Yarrowia lipolytica yeast genetics. J. Bioenerg. Biomembr., 33, 187-196.

59. Kirsch M., De Groot, H. (2001) NAD(P)H, a directly operating antioxidant? FASEB. J., 15, 1569-1574.

60. Kong J., and Rablcin S. (2000) Palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A. Biochim. Biophys. Acta, 1485,45-55.

61. Korshunov, S.S., Krasnikov, B.F., Pereverzev, M.O., and Skulachev, V.P. (1999) The antioxidant functions of cytochrome c. FEBSLettt., 462, 192-198.

62. Kowaltowski A.J., Castilho R.F., Vercesi A.E. (2001). Mitochondrial permeability transition and oxidative stress. FEBS Letters, 495, 12-15.

63. Kowaltowski A.J., Vercesi A.E., Rhee S.G., Netto L.E. (2000). Catalases and thioredoxin peroxidase protect Saccharomyces cerevisiae against Ca2+-induced mitochondrial membrane permeabilization and cell death. FEBS Lett. 473, 177-82.

64. Kushnareva YE and Sokolove PM (2000). Prooxidants open both the mitochondrial permeability transition pore and a low-conductance channel in the inner mitochondrial membrane. Arch. Biochem.Biophys, 376, 377-388.

65. Lambert A.J., Brand M.D. (2004) Superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) depends on the pH gradient across the mitochondrial inner membrane. Biochem. J., 382, 511-517.

66. Laun P., Heeren G., Rinnerthaler M., Rid R., Kossler S., Koller L., Breitenbach M.(2008) Senescence and apoptosis in yeast mother cell-specific aging and in higher cells: a short review .Biochim. Biophys. Acta. 1783, 1328-1334.

67. Laun P., Rinnerthaler M., Bogengruber E., Heeren G., Breitenbach M. (2006) Yeast as a model for chronological and reproductive aging a comparison. Exp. Gerontol. 41, 12081212.

68. Leung A.W., Varanyuwatana P., Halestrap A.P. (2008b) The mitochondrial phosphate carrier interacts with cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition. J. Biol. Chem. 283, 26312-23.

69. Leung, A.W., and Halestrap, A.P. (2008a) Recent progress in elucidating the molecular mechanism of the mitochondrial permeability transition pore. Biochim. Biophys. Acta, 1777, 946-952.

70. Linnane A.W., Kios M., Vitetta L. (2007) Coenzyme Q(10)~its role as a prooxidant in the formation of superoxide anion/hydrogen peroxide and the regulation of the metabolome. Mitochondrion, 1, Supp 1: S51-61.

71. Listenberger L., Ory D., and Schaffer J. (2001) Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway. J. Biol. Chem., 276, 14890-14895.

72. Lohret T.A., Kinnally K.W. (1995). Multiple Conductance Channel Activity of Wild-Type and Voltage-Dependent Anion-Selective Channel (VDAC)-Less Yeast Mitochondria. Biophys. Jl, 68, 2299-2309.

73. Low С. P., Shui G„ Liew L.P., Buttner S., Madeo,F„ Dawes I.W., Wenk,M.R., Yang, H. (2008) Caspase-dependent and -independent lipotoxic cell-death pathways in fission yeast. J. Cell Sci., 121,2671-2684.

74. Lucken-Ardjomande, S., Montessuit, S., and Martinou, J.C. (2008) Contributions to Baxinsertion and oligomerization of lipids of the mitochondrial outer membrane. Cell Death Differ., 15, 923-937.

75. Ludovico P., Rodrigues F., Almeida A., Silva M. Т., Barrientos A., Corte-Real M. (2002) Cytochrome с release and mitochondria involvement in programmed cell death induccd by acetic acid in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell. 13, 2598-2606.

76. Lushchak O.V., Lushchak V.I.(2008) Catalasc modifies yeast Saccharomyces cerevisiae response towards S-nitrosoglutathione-induced stress. Redox Rep. 13, 283-291.

77. Madeo F., Frolich E., Frohlich, K.U. (1997) A yeast mutant showing diagnostic markers of early and late apoptosis. J. Cell Biol., 139, 729-734.

78. Madeo F., Hcrker E., Maldener C., Wissing S., Liichelt S., Herlan M., Fehr M., Lauber K., Sigrist S.J., Wesselborg S., Frohlich K.U. (2002) A caspase-rclated protease regulates apoptosis in yeast.Mol Cell., 9, 911-917.

79. Madzak C., Gaillardin C., Beclcerich J.M. (2004) Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J. Biotechnol., 109, 63-81.

80. Manon S., Chaudhuri В., Guerin M. (1997). Release of cytochrome с and decrease of cytochrome с oxidase in Bax-expressing yeast cells, and prevention of these effects by coexpression of Bcl-xL. FEBS Lett. 415, 29-32.

81. Manon S„ Guerin M. (1997). The ATP-induced K+ -transport pathway of yeast mitochondria may function as an uncoupling pathway. Biochim. Biophy.s Acta., 1318, 31721.

82. Manon S., Guerin M. (1998) Investigation of the yeast mitochondrial unselective channel in intact and permeabilized spheroplasts. Biochem. Mol. Biol. Int., 44, 565-575.

83. Manon S., Roucou X., Guerin M., Rigoulet M., Guerin В (1998) Characterization of the yeast mitochondria unselective channel: a counterpart to the mammalian permeability transition pore? J. Bioener.g Biomembr., 30, 419-29.

84. Manon S., Roucou X., Rigoulet M., Guerin M. (1995). Stimulation of oxidative phosphorylation by electrophoretic K+ entry associated to electroneutral K+/H+ exchange in yeast mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1231, 282-8.

85. Miranda-Vizuete A., Damdimopoulos A.E., Spyrou G., (2000) The mitochondrial thioredoxin system. Antioxid Redox Signal. 2, 801-810.

86. Mironova G.D., Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V., Gritsenko E.N., Khodorov B.I., Saris N.E. (2007b) Mitochondrial Ca2+ cycle mediated by the palmitate-activated cyclosporine A-insensitive pore. J. Bioenerg. Biomembr., 39, 167-174.

87. Mironova G.D., Skarga Yu.Yu., Grigoriev S.M., Negoda A.E., Kolomytkin O.V., Marinov B.S. (1999). Reconstitution of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel into bilayer lipid membrane. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 157-161.

88. Mirzaei H., Regnier F. (2007) Identification of yeast oxidized proteins: chromatographic top-down approach for identification of carbonylated, fragmented and cross-linked proteins in yeast. J. Chromatogr. A. 1141, 22-31.

89. Miwa S., Brand M.D. (2003) Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31, 1300-1301.

90. Monteiro G., Kowaltowski A.J., Barros M.H., Nettoa L.E.S. 2004. Glutathione and thioredoxin peroxidases mediate susceptibility of yeast mitochondria to Ca2+-induced damage. Arch. Biochem. Biophys., 425: 14—24.

91. Moye-Rowley W.S. (2000) Transcription factors regulating the response to oxidative stress in yeast. Antioxid Redox Signal. 4, 123-40.

92. Nakae Y., Kwok W.M., Bosnjak Z.J., Jiang M.T. (2003). Isoflurane activates rat mitochondrial ATP-sensitive K+ channels reconstituted in lipid bilayers. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 284: 1865-1871.

93. Nazarko T.Y., Farre J.C., Subramani S. (2009) Peroxisome size provides insights into the function of autophagy-related proteins. Mol. Biol Cell. 20, 3828-39.

94. Ohnishi S.T., Ohnishi Т., Muranaka S. (2005). A possible site of superoxide generation in the complex I segment of rat heart mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 37, 1-15.

95. Owsianowski E., Walter D., Fahrenkrog B. (2008) Negative regulation of apoptosis in yeast. Biochim, Biophy.s Acta. 1783, 1303-1310.

96. Palkova Z., Vachova L., Gaskova D., Kucerova H. Synchronous plasma membrane electrochemical potential oscillations during yeast colony development and aging. Mol. Membr. Biol. 2009 26, 228-235.

97. Parihar A., Vaccaro P., Ghafourifar P. (2008) Nitric oxide irreversibly inhibits cytochrome oxidase at low oxygen concentrations: evidence for inverse oxygen concentration-dependent peroxynitrite formation. IUBMB Life. 60, 64-67.

98. Parrella E., Longo V.D. (2008) The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods, 46, 256-62.

99. Pastore, D., Stoppelli, M.C., Di Fonzo, N. and Passarella, S. (1999) The existence of the K+channel in plant mitochondria. J. Biol. Chem., 274, 26683-26690.

100. Penzo D, Tagliapietra C, Colonna R, Petronilli V, Bernardi P. 2002. Effects of fatty acids on mitochondria: implications for cell death. Biochim. Biophys. Acta, 1555, 160— 165.

101. Pereira C., Camougrand N., Manon .S, Sousa M.J., Corte-Real M. (2007) ADP/ATP carrier is required for mitochondrial outer membrane permeabilization and cytochrome с release in yeast apoptosis. Molecul. Microbiol., 66, 571-582.

102. Perrone, G.G., Tan, S.X., and Dawes, I.W. (2008) Reactive oxygen species and yeasy apoptosis. Biochim. Biophys. Acta, 1783, 1354-1368.

103. Petrussa, E., Casolo, V., Braidot, E., Chiandussi, E., Macri, F. and Vianello., A. (2001) Cyclosporin A induces the opening of a potassium-selective channel in higher plant mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 33, 107-117.

104. Polcic P, Sabova' L and Kolarov J, (1997) Fatty acids induced uncoupling of Saccharomyces cerevisiae mitochondria requires an intact ADP/ATP carrier. FEBS Lett. 412,207-210.

105. Priault M., Camougrand N., Kinnally K.W., Vallette F.M., Manon S. (2003) Yeast as a tool to study Bax/mitochondrial interactions in cell death. FEMS Yeast Res. 4, 15-27.

106. Prieto S„ Bouillaud F. and Rial E. (1995) The mechanism for the ATP-induced uncoupling of respiration in mitochondria of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J., 307, 657-661.

107. Rebrin I., Sohal R.S. (2008) Pro-oxidant shift in glutathione redox state during aging. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1545-1552.

108. Rebrin, I., Kamzalov, S., Sohal, R.S. (2003) Effects of age and caloric restriction on glutathione redox state in mice. Free Radic. Biol. Med., 35, 626-635.

109. Roucou X., Manon S., Guerin M. (1995). ATP opens an electrophoretic potassium transport pathway in respiring yeast mitochondria. FEBS Lett., 364, 61-64.

110. Roucou X., Manon S., Guerin M. (1997). Modulation of the electrophoretic ATP-induced K+-transport in yeast mitochondria by delta pH. Biochem. Mo.I Bio.I Int., 43, 5361.

111. Ruy F.,Vercesi A.E., Andrade P.B.M., Bianconi M.L., Chaimovich H., Kowaltowski A.J. (2004) A Highly Active ATP-Insensitive K+ Import Pathway in Plant Mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 36,195-202.

112. Schmitt M.J. and Reiter, J. (2008) Viral induced yeast apoptosis. Biochim. Biophys. Acta, 1783, 1413-1417.

113. Severin F.F., Meer M.V., Smirnova E.A., Knorre D.A., Skulachev, V.P. (2008) Natural causes of programmed death of yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1783, 1350-1353.

114. Sheridan C., Delivani P., Cullen S.P., Martin S.J. (2008) Bax- or Bak-induced mitochondrial fission can be uncoupled from cytochrome С release. Mol. Cell. 31, 570-85.

115. Silva R.D., Sotoca R., Johansson В., Ludovico P., Sansonetty F., Silva M.T., Peinado J.M., Corte- Real M. (2005) Hyperosmotic stress induces metacaspase- and mitochondria-dependent apoptosis in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol. 58, 824-834.

116. Singh K., ICang P.J., Park H.O. (2008) The Rho5 GTPase is necessary for oxidant-induced cell death in budding yeast. Proc, Natl, Acad, Sci U S A. 105, 1522-1527.

117. Skulachev V.P. (2001) NAD(P)+ decomposition and antioxidant defense of the cell. FEBS Lett., 492, 1-3.

118. Sparagna G., Hickson-Bick D., Buja L., and McMillin J. (2000) A metabolic role for mitochondria in palmitate-iinduced cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 279, 2124-2132.

119. Srivastava S, Chan C, (2007) Hydrogen peroxide and hydroxyl radicals mediate palmitate-induced cytotoxicity to hepatoma cells: relation to mitochondrial permeability transition. Free Radio Res, 41, 8-49.

120. Starkov A.A, Fiskum G., Chinopoulos C., Lorenzo B.J., Browne S.E., Patel M.S., Beal M.F.(2004) Mitochondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex generates reactive oxygen species. J. Neurosci. 24, 779-788.

121. Starkov A.A., Fiskum G. (2003) Regulation of brain mitochondrial H202 production by membrane potential and NAD(P)H redox state. J. Neurochem., 86, 1101-1107.

122. Stasyk O.V., Nazarko T.Y., Sibirny A.A. (2008) Methods of plate pexophagy monitoring and positive selection for ATG gene cloning in yeasts. Methods Enzymol. 45, 229-39.

123. Sultan A., and Sokolove P. (2001a) Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane. Arch. Biochem. Biophys., 386, 3151.

124. Sultan A., and Sokolove P. (2001b) Free fatty acid effects on mitochondrial permeability: an overview. Arch. Biochem. Biophys., 386, 52-61.

125. Szeto S.S., Reinke S.N., Sykes B.D., Lemire B.D.(2007) Ubiquinone-binding site mutations in the Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase generate superoxide and lead to the accumulation of succinate. J. Biol. Chem., 282, 27518-27526.

126. Szewczyk A. (1996) The. ATP-regulated K+ channel in mitochondria: Five years after its discovery. Acta Bioch.Polonica, 43, 713-719.

127. Titorenko V.I., Rachubinski R.A. (2009) Spatiotemporal dynamics of the ER-derived peroxisomal endomembrane system. Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 27, 191-244.

128. Toninello A., Salvi M., Schweizer M., Richter C. (2004) Menadione induces a low conductance state of the mitochondrial inner membrane sensitive to bongkrekic acid. Free Radic Biol Med., 37, 1073-1080.

129. Tretter L.A., Adam-Vizi V. (2004) Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J. Neurosci., 24, 7771-7778.

130. Turrens, J.F. (2003) Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol., 552, 335-344.

131. Vachova L., Kucerova H., Devaux F., Ulehlova M., Palkova Z. (2009) Metabolic diversification of cells during the development of yeast colonies. Environ Microbiol. 11, 494-504.

132. Votyakova T.V., Bazhenova E.N., Zvyagil'skaya R.A. (1990). Polyamines improve Ca2+ transport system of the yeast mitochondria. FEBS Lett. 261, 139-141.

133. Votyakova T.V., Bazhenova E.N., Zvyagil'skaya R.A. (1993). Regulation of the yeast mitochondrial Ca2+ uptake by polyamines and Mg2+. J. Bioenerg. Biomembr. 25, 569-574.

134. Wang E., Erdahl W.L., Hamidinia S.A., Chapman C.J., Taylor R.W., feiffer D.R. (2001) Transport Properties of the Calcium Ionophore ETH-129. Biophy. J., 81, 32753284.

135. Webb J.S., Givskov M., Kjelleberg, S. (2003) Bacterial biofilms: prokaryotic adventures in multicellularity. Curr. Opin. Microbiol., 6, 578-585.

136. Wieckowski M., Brdiczka D., and Wojtczak L. (2000) Long-chain fatty acids opening of the reconstituted mitochondrial permeability transition pore. FEBS Lett., 484, 61-64.

137. Wood, Z.A., Schroder, E., Robin Harris, J., and Poole, L.B. (2003) Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem. Sci., 28, 32-40.

138. Zorov D.B., Juhaszova M., Yaniv Y., Nuss H.B., Wang S., Sollott S.J. (2009) Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc Res. 83, 213-25.

139. Zvyagilskaya R. A., Parkhomenko O.A., Gordeeva A.V., Deryabina Y.I., Persson B.L. (2004). Bioenergetics of Yarrowia lipolytica cells grown at alkaline conditions. Biosci Reports, 24, 117-125.

140. Zvyagilskaya R. A., Parkhomenko O.A., Gordeeva A.V., Deryabina Y.I., Persson B.L. 2004. Bioenergetics of Yarrowia lipolytica cells grown at alkaline conditions. Biosci Reports, 24, 117-125.

141. Zvyagilskaya R. Persson B. L. (2003) Dual regulation of proton- and sodium- coupled phosphate transport systems in the yeast Yarrowia lipolytica by phosphate and extracellular pH. IUBMB Life 55 (3): 151-154.

142. Zvyagilskaya R., Andreishcheva E., Soares I.M.I., Khozin I., Berhe A., Persson B.L. (2001a). Isolation and characterization of a novel leaf-inhabiting osmo-, salt, and alkali-tolerant Yarrowia lipolytica strain. J. Basic Microbiol. 41, 283-303.

143. Zvyagilskaya R.A., Parchomenko O.A., Persson B.L. (2000) Two systems for phosphate uptake in Yarrowia lipolytica cells grown under alkaline conditions. IUBMB Life, 50, 151-155.

144. Андреев А. Ю., Кушнарева Ю. E., Старков A. A. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондооиях. Биохимия, 70, 246-264.

145. Андреищева Е.Н., Соарес М.И.М., Звягильская Р.А. 1997. Энергетический обмен дрожжей Candida (Yarrowia) lipolytica в норме и при солевом стрессе. Физиол. раст. 44, 657 664.

146. Баженова Е.Н., Дерябина Ю.И., Звягильская Р.А. (1997) Стимулирующее действие АДФ на систему транспорта ионов кальция митохондрий дрожжей. ДАН СССР, 353, 1-3.

147. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2005) Возможный механизм образования и регуляции пальмитат-индуцированной циклоспорин А-нечувствительной поры. Биохимия, 70, 815-821.

148. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2008) Роль митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой поры в пальмитат-индуцированном апоптозе. Биофизика, 53, 967-971.

149. Гесслер Н.Н., Аверьянов А.А., Белозерская Т.А. (2007) Активные формы кислорода в регуляции отногенеза грибов. Биохимия, 72, 1342-1365.

150. Грабельных О.И. (2005) Энергетические функции митохондрий растений в стрессовых условиях. J. Stress Physio & Biochemistry, 1, 37-54.

151. Дерябина Ю.И., Исакова Е.П., Шурубор Е.И., Звягильская Р.А. (2004) Кальций-зависимая неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны не индуцируется в митохондриях дрожжей Endomyces magnusii. Биохимияб, 69, 1261- 1270.

152. Дерябина Ю.И., Звягильская Р.А. (2000) Са2+-транспортирующая система митохондрий дрожжей Endomyces magnusii-. независимые пути для поглощения и выхода иона. Биохимия, 65, 607-1611.

153. Звягильская Р.А. и Котельникова А.В. (1991) Структура и функциональная активность дрожжевых митохондрий (монография). М.:ВИНИТИ, сер. Биол. Хим. 36, 172 сс.

154. Звягильская Р.А., Лейкин Ю.Н., Кожокару Н.Л., Котельникова А.В. (1983) Транспорт ионов кальция дрожжевыми митохондриями. ДАН СССР, 269, 12381240.

155. Звягильская Р.А., Перссон Б. Л. (2004). Новый алкалотолерантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica -перспективная модель для изучения свойств и регуляции Na зависимых переносчиков фосфата у дрожжей (обзор). Биохимия, 69, 1613-1621.

156. Зоров Д.Б., Исаев Н.К.,. Плотников Е.Ю, Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.А.,. Хряпенкова Т.Г. (2007) Митохондрия как многоликий Янусю Биохимия, 72, 1115-1126.

157. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. (2007) Митохондриальный глутатион, Биохимия, 72, 856-866.

158. Кушнарева Ю. Е., Старков А. А. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия, 70, 246-264.

159. Лейкин Ю.Н., Вотякова Т.В., Баженова Е.Н., Звягильская Р.А., Котельникова А.В. (1987) Взаимодействие ионов кальция с митохондриями дрожжей Endomyces magnusii. Биохимия, 52, 676-682.

160. Лущак В.И. (2010) Окислительный стресс в дрожжах. Биохимия, 74 (в печати)

161. Миронова Г.Д., Качаева Е.В., Копылов А.Т. (2007). Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал. I. Структура канала, механизм его функционирования и регуляция. Вестник РАМН, 2, 44-50.

162. Мохова Е.Н., Хайлова JI.C. (2005) Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот. Биохимия, 70,

Информация о работе

Ковалёва, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалёва, Мария Владимировна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковалёва, Мария Владимировна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалёва, Мария Владимировна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия