Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2 + -транспортирующая система митохондрий дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Са2 + -транспортирующая система митохондрий дрожжей"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи УДК 577.352.4

БАЖЕНОВА Елена Николаевна

Са2+ —ТРАНСПОРТИРУЮЩАЯ СИСТЕМА МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1989

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Института биохимии им. А. Н. Баха АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук Р. А. Звягильская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Л. А. Окороков доктор биологических наук М. С. Крицкий

Ведущая организация: Институт микробиологии АН СССР.

Защита диссертации состоится « ъ^^Т^&^г г.

в ./Рчасов на заседании Специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2).

' С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан » г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

М. И. Молчанов

■"¡г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. зигв

.-^Актуальность теш. Широко известна высокая физиологичес-

кальция» В высших зукариотических организмах при его участии осуществляется ряд клеточных процессов - сокращение, деление, биосинтез, секреция /Carafoli, Crompton, 1978/. Необходимый уровень кальция в цитоплазме поддерживается за счет связывания его специфическими белками, а также депони- • ровання во внутриклеточных органеллах (плазматическом ретику-луме, вакуолях, митохоцдриях) в результате функционирования мембранных Са^+~транспортирущих систем / Carafoli, 19В?; Evans,1988/.

Регуляторная роль кальция была показана л для низших эука-риот - дрожжей. Кальций необходим для роста клеток /• Kovac, 1985/, влияет на течение клеточного цикла, почкование, инициацию половой конъюгации /Ohsumi, Anraku, 1935; Saavedra-Molina et al, 1983/. Обеспечение дрожжевой клетки Са2+ осуществляется за счет энергозависимого поступления его из внешней среда / Roamans et ai, 1979/. Наличие системы активного транспорта ионов кальция /Окороков и др., 1988/ и высокая емкость позволили отвести вакуолярной системе роль главного внутриклеточного пула катиона / Eiiam et al, 1985а/. Показана также ее суще ственная роль в поддержании гомеостаза Са^+ в цитозоле дрожжевой клетки / Eiiam et al, 1985ь/. Вклад эндоплазматического ре-тикулума как Са^-депонирующего пула в дрожжах пока не оценен. Аналогичная функция митохоццрий дрояжей, в отличие от животных, вообще никогда не обсувдалась, поскольку ранними исследованиями было показано, что митохондрии дрожжей не имеют системы энергозависимого поглощения кальция с высоким сродством

/Carafoli et al, 1970; Subllc, Kolarov, 1970; Balcavage et al 1973 /. Однако в нашей лаборатории была показана возмож-

ность сопряженных митохондрий дрожжей Endorayces magnusii поглощать ионы кальция из среды инкубации энергозависимым спо-зобом /Звягильская и др., 1983/.

Целью настоящей работы явилось подробное исследование

-транспортирующей системы митохондрий дрожжей End.

magnusii.

При этом предусматривалось решение следующих задач:

•- исследование кинетических свойств Са^-транспортирую-щей системы митохондрий дрожжей;

- изучение влияния природных модуляторов ( Mg2+ и полиамидов) на характеристики Са -транспортирующей системы митоход-дрий дрсетей;

- оценка физиологического значения системы активного транспорта кальция митохондриями дрожжей;

- идентификация в дрожжевых митохондриях компонента, ответственного за Са^-трансшртиругащую активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено исследование Са -транспортирующей системы дрсшсешх организмов. Показано, что транспорт Са + осуществляется за счет электрохимического градиента ионов водорода, генерируемого на внутренней митохондриальной мембране, по механизму унийорта.-, .;-Описаны качественные ж количественные характеристики, их особенности по сравнению с митохондриями животных и растений. Выявлена высокая катионная специфичность Са^-транспортирущей системы митохондрий дрожжей. Обнаружено ингибирующее действие Hg* на свойства транспортирующей системы (снижение максимальной скорости поглощения кальция и сродства системы к иону). Доказано, что в митохондриях дрожжей, в отличие.от митохондрий сердца, отсутствует система энергозависимого высокоэффективного транспорта ионов магния.

Впервые исследовано влияние природных полиаминов (спермина, спермидина, путресцина и кадаверина) на Са^+-транспортируто-щую систему дрожжевых митохондрий. Показано, что в присутствии спермина в концентрациях,близких к физиологическим, повышается сродство транспортной системы к кальцию, увеличивается начальная скорость его поглощения, достигается более полное исчерпание иона из среды инкубации. Спермидин был менее эффективен, а путресцин и кадаверин не проявляли регулирующего действия. Впервые было обнаружено также, что в дрожжевой клетке, в отличие от. животной, отсутствует регуляция интенсивности окислительного метаболизма -за счет изменения градиента концентрации иона кальция в цатозсде, Изоцитратдегадрогеназа, 2-оксоглутаратдегццрогеназа и шруватдещцрогеназа митохондрий дрожжей End. magnusii не является Са -зависимыми ферментами. Иммуноферментными методами в дрожжевых митохондриях выявлен компонент, аналогичный Са^+-транс

нормирующему гликопротенду митохондрий сердца бшса,и оценено его содержание в дрояшзвых митохондриях.

Результаты настоящей работы дополняют данные о свойствах ранее описанных Са"^"-транспоргирущюс систем митохондрий животных и растений. Они доказывают, что система митохондриального активного поглощения иона кальция'присуща не только высшим, но и низшим одноклеточным эукаряотам.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1985); Н Всесоюзной Межуниверситетской конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985); Всесоюзном стялозиуые "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Цувдино, 1986). •

Публикации. По материалам диссертации опубликовано кесть работ, две работы сдана в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на №2. страницах машинописного текста и включает ^ таблиц* 2С рисунков, список литературы из наименова-

ний работ.

МАТЕРИАЛЫ И ЖГОДЫ ИССВДОВАНИЯ

Объект. В работе использовали дрожжи ЕгкХошусез п^пиви птамм ВКМ 7-261, полученные из коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР. Дрожжи вы-ралрвали в ферментере в строго контролируемых условиях (рН 5,7-5,9; температура 28-30°С; скорость вращения мешалки 250 об/дан; интенсивность аэрации 1,5-1,7 л воздуха в мин. на [ л среды) или в качалочяых колбах емкостью 750 мл (объем среда [00 мл) на полусинтетической среде/ Звяшльская и др., 1974/. . 3 качестве основного источника углерода использовали 0,6$ глицерин. Биомассу собирали на стадии зале дленного роста (10-13.г 1а I л).

Препаративные методы. Митохондрии выделяли по методу, разработанному в нашей лаборатории с использованием проточного растирающего дезинтегратора /Звягильская и др., 1974/, или по гетоду Макки и Пойтона /МсКее, Роу-Ьсда, 1984/, модафицировда-юму наш. Метод включал получение сферопластов и выделение [з них митохондрий осмотическим шоком. Клетки суспендировали в >0 мМ трис-НС1 буфере, рН 8,6-8,8, содержащем 10 мМ датиотреи-

тел (из расчета I г сырых клеток б 10 мл буфера), инкубировали при комнатной температуре в течение 25-30 мин, затем обрабатывали хеликазой - комплексом лирических ферментов из виноградной улитки Helix pomatia (50 мг хелтеазы на I г сырой биомассы) в течение 20-25 мин при 30°С в среде, содержащей 1,4 M ксилит, 50 мМ цитратно-фосфатный буфер, pH 5,7-5,9, 50 мМ ЭДТА. Процесс образования сферопластов контролировали под световым микроскопом и по снижению оптической плотности при 590 нм при 20-кратном разведении суспензии водой. Далее сферопласты подвергали лизису в течение 2 мин при 0°С в среде, содержащей 0,4 M маннит, 10 мМ НЕРЕs , pH 7,4-7,5, I мМ ЭДТА, 0,5$ бычий сывороточный альбумин, с последующим переводом лизата в изоосмотическуто среду (0,6 M маннит, 10 мГЛ hepes , pH 7,4-7,5, I мМ ЭДТА, 0,5% бычий сывороточный альбумин). Митохондрии промывали средой, содержащей 0,6. M маннит, 10 мМ hepes , pH 7,2, 0,5$ бычий сывороточный альбумин. Выход митохондрий составлял 1-2 мг на 1г сырых клеток.

Аналитические методы. Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом /Шольц, Островский, 1965/.Среда инкубации митоховдрий при определении фосфорилирущей активности содержала 0,6 M маннит, 2 мМ трио-фосфатный буфер, pH 6,5, 2 мМ ЭДТА, 0,25-0,35 м!Л АДФ, 4-20 мМ субстрат окисления. Величины дыхательного контроля и АДФ/0 рассчитывали по методу Чанса / chance, Williams, 1956/. Среда инкубации митохондрий при определении зависимости скорости дыхания от концентрации кальция и разобщителя содержала: 0,3 M маннит, 10 мМ HEPES , pH 7,4-7,5, 2 ыМ трис-фосфат, 16 мМ пируват, 4 мМ ма-лат.'

Поглощение ионов кажьцая регистрировали спектрофотометри-чески (спектрофотометр Hitachi-557 ) по поглощению мурексида / Scarpa, 1972/ ИЛИ арсеназо III / Scarpa, 1979/ в двуволновом режиме при 540-507 нм или 665-685 нм, соответственно. Среда инкубации митохондрий содержала 0,3 M маннит, 10 мМ hepes , pH 7,4-7,5, о0-75 мкМ мурексид или 50мкМ арсеназо Ш. Дополнительно (где указано) вносили 2 мМ трис-фосфат или 20 мМ трис-ацетаг.

Изменения мембранного потенциала митохондрий контролировали по поглощению сафранина / Bashfora, Smith, 1979/ в двуволновом ресшле при 555-523 нм.

Динамику набухания митохондрий при поглощении Са2+ регистрировали по снижению оптической плотности суспензии при 546 им.

Активности дегидрогеназ определяли по методу Слейтера / Slater et ai, 1964/. В качестве медиатора использовали фена-зинметасулъфат (50 мкг/ш), а конечного акцептора восстановительных эквивалентов - дихлорфенолиндо^енол (ДХЖФ, 30-50 мяг/мл), А = 600 нм. Среда инкубации содержала при определении изоцитрат-дегадрогеназной активности: 50 мМ hepes , рН 7,2, 10 мМ изоцкт-рат, I мМ MgCl2 , I т НАД4" (НАД^"), I мМ ДДФ; 2-оксоглута-ратдегадрогеназной активности: 50 мМ hepes , рН 7,2, 4 мМ оксо-глутарат, I ыМ MgCi2 , I мМ НАД*", I мМ тиашнпирофосфат,0,25 мМ КоА. При расчете активностей ферментов (нмоль/мин*мг белка) использовали величину коэффициента шллшолярной экстинкции ДШЮ £=21 иТ^см-1.

Содержание Са2+ в митохондриях и среде инкубации определяли на пламенном абсорбционном спектрофотометре Hitachi 170-10. Цля этого митохондрии быстро отделяли от среды центрифугированием (при 13000 об/ман в течение 10 мин). Образин сжигали в му-Цельной печи (500°С); осадки растворяли в 2 М НСЮ^ и анализировали на содержание Са^4".

Электрофорез шгаохондриальных белков проводили в 16$ поли-жриламвдном геле в буферной системе, предложенной Лшмли 1 Laemmli, 1970/ в присутствии 8 М мочевины при напряжении [00 в в течение 17 часов в вертикальных пластинах 18*13 см три толщине геля 0,8 ш.

Иммуноблот- и иммунодот-анализ проводили по методу Тов-5ин /Towbin, ffoгdon, 1984/. В качестве сорбента использовали штроцеллюлозше пластины с диаметром пер 0,45 мкм. Иммуноком-шексы обнаруживали с помощью диагностических антител против ммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой.

Белок в митохонадзиальных препаратах определяли по методу >рэдфорд / Bradford, 1976/ с кумасси G-250. Для построения :алибровочных кривых использовали бычий сывороточный альбумин.

Все растворы готовили на бидистиллйрованной деионизован-:ой воде (при сопротивлении более 15 МОм/см). Дополнительную |Чист1су сред инкубации от кальция проводили с кагионообменными молами Cbelex 100 И Dowex 50.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВАНШ I. Свойства кальций транспортирующей системы митохондрий

дрощсей End. magnusii. Независимыми методами (по набуханию митохондрий, измерению количества кальция в митохондриальных осадках и среде инкубации на пламенном абсорбционном спектрофотометре, спектрофотометричес-кой регистрацией поглощения мурексида) показано, что митохондрии способны транспортировать кальций. Накопление иона происходит в магриксе митохоццрий и зависит от энергии окисления субстратов дыхания (рис.1, кривая I). В их отсутствии (кривая 2) или при добавлении ингибитора дыхательной цепи - антимицина А (кривая 3) поглощения ионов кальция не происходит. Накопленный митохондриями кальций выходит под действием Са -ионофора A23I87 (кривая 4). Во всех случаях добавление молярного избытка ЭГГА, связывающего внемитохондриальный кальций, приводит к восстановлению исходного значения светопоглощешя мурексида в суспензии митохондрий.

Са2Т 100 мкМ ЭГТА.200 мкМ ЭГТА,200 мкМ

Рис Д. Спектрофотометрическая регистрация поглощения ионов Сал'+ в суспензии штоховдрий End. magnusii. Состав среда инкубации: 0,3 Ы маннит, 2 мГЛ трис-фосйат, 10 ыГЛ he?es , рН 7,4, 16 мМ пируват, 4 Ш ыалат, 75 мкМ мурексид, митохондриалышй белок 0,5 иг/мл, объем ячейки I мл. I - контроль; 2 - отсутствуют субстраты окисления; 3 - в присутствии актимицина А, 4 мкг/мг белка; 4 - добавлен A23I87, 2 мкМ.

Энергозависишй характер поглощения кальция дрожжевыми митохондриями проявляется и в том, что при аккумуляции имеет место обратимое снижение мембранного потенциала ( д у ), генерируемого при работе дыхательной цепи.Транспорт Са"+ митохондриями

• 7.

сопровождается стимуляцией дыхания (рис.2), что указывает на электрогешгый характер поглощения иона, хотя имеются и отличия от Са -поглощающей системы кивотных митохондрий. На рис.2 представлена зависимость скорости поглощения кислорода- в суспензии митохондрий End. magnusii or концентрации разобщителя хлоркарбонилцианидфенилщцразона (ХКФ) (кривая I) и ионов кальция (кривая 2). Видно, что стимуляция дыхания выявляется только при концентрациях Са2+ выше 100 мкМ. При насыщающих концентрациях Са (500 1лкМ и выше) достигается двухкратная стимуляция дыхания, что меньше, чем в митохондриях животных, и меньше по сравнению с максимальной активностью дыхательной цепи, измеренной в присутствии разобщителя (см.кривую 1). Это означает , что в исследованном диапазоне концентраций ионов кальция скорость его поглощения дрожжевыми митохондриями не лимитирована скоростью переноса электронов в дыхательной цепи и отражает активность транспортной системы.

Рис.2. Зависимость скорости дыхания митохондрий End. magnusii от концентрации разобщителя ХКФ (I),Са2+(2) в среде инкубации. Состав среды инкубации: 0,3 М маннит, 2 мМ трис-фосфат, 10 мМ HEJES , рН 7,4, 16 мМ пиру-ват, 4 мМ малат, митохондриаль-ный белок 0,5 мг/мд, объем ячейки I мл.

Как известно, в митохондриях животных накопление кальция происходит по механизму унипорта, а в митохондриях растений транспорт Са^4" строго зависит от присутствия фосфата и происходит, вероятно, в симпор-ге с ним. Поглощение ионов кальция митохондриями дрожжей, как 5ыло установлено нами, не зависит от проникающих анионов. Скорости поглощения кальция в среде с фосфатом и без него практи-1ески не отличаются, что позволяет сделать вывод о транспорте

Концентрация ХКФ,мкМ • 0,5 1,0

-1-г-

Концентрация Са2+, мкМ

Ca по механизму унипорта.

Активность Ca -транспортирующей системы митохондрий дрожжей, также как у животных и растений, зависит от концентрации ионов кальция в среде инкубации. Кривая зависимости начальной скорости, поглощения кальция от его концентрации в. среде инкубации имеет сишоидальную форму (рис.3, кривая А) . Концентрациям иона до 70 мкМ соответствует участок очень малого изменения скорости поглощения в диапазоне от 100 до 300 мкМ зависи-

мость линейна, свыше 400 мкМ она остается неизменной. Сигмоидаль-ный характер кривой не позволяет линеаризовать ее в координатах двойных обратных величин по Лайнуиверу-Бэрку. Она трансформируется в гиперболу в координатах v от[СаР (кривая Б), линеаризация которой позволяет оценить насыщающую скорость транспортной системы т=670 нмоль/шн'мг белка. Это сопоставимо с митохондриями ЖИВОТНЫХ / Vinogradov, Scarpa, .1973/, насекомых / Wohrlab 1974/ и выше, чем у митохондрий растений / Mar-tins et al, 1986/, амеб / Domka-Popelc, Miohejda, 1980/. ПолуМЗКСИ-мальная эффективная концентрация кальция составляет 180 мкМ, что значительно выше, чем у других исследованных митохондрий Cl—150 мкМ в зависимости от тканевой и видовой принадлежности).

Ситаоидальный характер зависимости скорости.поглощения Са2+ от его концентрации в среде определяет особенности Са2*-транспортирущей систеш дрожжевых митохондрий. Скорость поглощения иона от момента его добавления до завершения аккумуляции не остается постоянной.'По мере исчерпания ионов кальция из среды и приближения его концентраций-к.пороговым, происходит ее снижение. В результате этого время достижения равновесной концентрации ионов кальция дая митохондрий дрожжей в 2-3 раза выше,чем для митохондрий животных и зависит от концентрации добавленного иона. s

4 . о.

Особенность Ca транспортирующей систеш дрожжевых митохондрий по сравнению с митохондриями животных и растений состоит и в том,что они не способны поглощать весь добавленный кальций и поддерживать строго определенную его концентрацию в среде. Добавление проникающих анионов не .меняет существенно емкости митохондрий. В условиях in vitro количество поглощенного митохондриями кальция зависит от его концентрации в среде инкубации. При низких (до 70 мкМ) концентрациях добавленного катиона ыитокощцш аккумулируют только его половину, в диапазоне от

3d ' 700

о aJ

s -S 500

О) ,

. I

I S 300

и 3

л л

S § IOD

о s p< Щ

« ■ Q о .y

600 400 200

200 400 600 - [Ca2+] .10? M

3 r.v-I.I0:

r/fCa^^-IoifT2

4 6

0 10 20 30 [Ca2+]2-I08, Ы2

_ 2+

Еис.З. Зависимость начальной скорости поглощения Са т

( V ) митохондриями End. magnasii от концентрации Са2+ в среде инкубавди в координатах v / [Са3*] (А) и ' v / [Са2+] 2 (Б). Состав среды инкубации, как в подписи к рис.1.

100 до 200 мкМ - около 3/4, а при насыщающих концентрациях -4/5. Интересно отметить, что эта закономерность коррелирует с характером зависимости начальной скорости поглощения иона от его концентрации в среде.

Далее, в отличие от митохондрий животных Са -транспортирующая система драяшзй имеет высокую катионную специфичность -Sr2+ , За2+, Ми2'1" транспортируются с заметными скоростями только при концентрациях вше 2 мМ. ,

Наконец, наиболее существенным принципиальным отличием Са -транспортирующей системы митохондрий дрожжей является отсутствие чувствительности к действию рутениевого красного, который, как полагали ранее, является специфическим ингабитором кальциевого унипортера митохондрий.

Таким образом, для митохондрий дрсшжей End. magnusii показана система энергозависимого электрогенного транспорта каль- . ция по механизму унипорта с высокой насыщающей скоростью, невысоким кажущимся сродством к иону и связанными с этим особенное-

тями: неспособностью л полному исчерпанию добавленного катиона и поддержанию строго определенной его концентрации в среде, а также завышенным временем достижения равновесной концентрации.

2. Влитие ионов магния на свойства Са^+-транснорти-рующей системы дрожжевых митохондрий

В связи с вышеизложенными фактами представляло интерес изучение влияния природных эндогенных модуляторов на свойства Са2*-транспортирующей системы митохондрий дрожжей. Одним из важных в этом отношении факторов является магний /иа-ьтап, 1984/. Содержание его в цитоплазме дрожкей Епа. таениви составляет 10-17 мМ /Личко, 1981/. Однако, прежде всего необходимо было выяснить, способны ли дрожжевые митохондрии транспортировать энер-гоздвисимым способом ионы магния и, если да, то каков механизм транспорта. Как показано на рис.4, кривая А, при добавлении ионов магния к митохондриям Епа.таетви в 4-ом метаболическом состоянии по Чансу имеет место стимуляция дыхания, сменяющаяся спонтанным выходом в 4-е состояние. Степень активации дыхания зависит от концентрации иона в среде, кривая имеет гиперболический характер и достигает насыщения при 2 мМ концентрации ионов магния. Стимулирующее влияние магния проявлялось только после прохождения митохондриями цикла фосфорилирования и не наблюдалось при добавлении магния до ДЦФ (рис.4, кривая Б). Применение специфических ингибиторов %2+-зависимых митохондриаль-ных ферментов (аденилагюшазы и АТФазы) - диаденозинпентафосфа-та ХАр5А) и олигомнщша, показало, что стимулирующее влияние магния на скорость дыхания связано с активацией этих ферментов и, следовательно, митохондрии дрожжей не обладают, эффективной энергозависимой системой транспорта ионов магния (рис.4, кривые В и Г) .

, Наш было найдено, что введение ионов магния в среду инкубации приводит к уменьшению начальной скорости транспорта кальция. Максимальный эффект достигается уже в присутствии 2 мМ %2+. На рис.5 показано влияние 2 мМ ме2+на характер зависимости начальной скорости поглощения кальция от его концентрации в среде. На транспорт низких (до 100 мкМ), близких к физиологическим концентраций Са^+, присутствие щ2+ не влияет (рис.5, . кривая 2). В диапазоне же концентраций Са-24 от 160 до 300 мкМ начальная скорость транспорта в присутствии 2 мМ Нв2+ .

Рис.4. Полярографическая регистрация скорости дыхания митохондрий End. aagnusii . Состав среда инкубации, 0,6 М маннит, 2 иМ трис-фосфат, 10 мм нврез, рН 6,5, 16 ьй! пиртват, 4 мМ малат.Стрелками указано добавление:, мх - 0,3 мг митохондряального белка; • I - Ар5А,40 мкМ; Л - олигомидан, 13 мкг/мг белка. Цифры у .кривых - скорость поглощения кислорода, нг-атом/мин'мг белка

+ NJ

и я

ф

EJ О

S

о и .

к ч о 2 о

Р. о м э

600

400

200

/

Г/

А

г /

7 *

.к

100 300 500 Концентрация Ca2t мкМ

Рис.5. Зависимость начальной скорости поглощения Са2+

МИТОХОНДРИЯМИ End.magnu.sii ОТ

концентрации Са2+ в среде инкубации в отсутствии и^2"*" (I), в присутствии 2 мМ ' (2).

Состав среды инкубации, как в подписи к рис.1.

уменьшается в 2 раза. При этом насыщающая скорость Са^+-транслор-тирущей системы снижается от 570 до 440 нмоль/мин'мг белка, а полумаксимальная эффективная концентрация кальция повышается, от 190 до 260 мкМ. Характер кинетической кривой'изменений не претерпевает.

Присутствие Mg2+ увеличивает время достижения равновесной концентрации кальция между митохондриями и средой. Степень его влияния на этот параметр зависит от концентрации ионов кальция в среде, количественно коррелирует со степенью торможения'на-чальлой скорости транслокации катиона. На уровень равновесной концентрации Са2+ присутствие Mg2+ практически не влияет.

Таким образом, показано ингибиругацее влияние Mg2+ на транспорт высоких (выше 100 мкМ) концентраций ионов кальция дрожжевыми митохондриями (снижение начальных и насыщающей скоростей транслокации,кажущегося сродства системы к катиону). "Ухудшение" кинетических параметров Са^+-транспортирующей системы дрожжевых митохондрий в присутствии 2 Ш Mg2+ не связано с процессом деэнергизацки митохондрий. Напротив, нами было показано, что добавление 2 Ш Mg2+ в среду инкубации митохондрий способствует снижению скорости дыхания в контролируемом состоянии, а также снижению скорости дыхания после аккумуляции добавленного кальция, что может быть интерпретировано как указание на стабилизацию в присутствии ионов магния митохоццриальной мембраны, снижение ее протонной проводимости.

р,

3. Влияние полиаминов на свойства Са -транспортирующей системы дрожжевых митохондрий 2+

Среди других модуляторов Са -транспорта наше внимание привлекли полиамины - интермедиаты обмена основных аминокислот, универсальные компоненты любой эукариотической клетки, в том числе и дрожжевой / с aim et ai, 1978/. Содержание полиаминов в дрожжевой клетке составляет 0,3-2 мкмоль на I г сырого веса /таЪог, Tabor, 1985/, что сопоставимо с их содержанием в клетках высших организмов /Kroner, 1938/.

В контрольных экспериментах нами было показано, что полиамины - спермин и спершдин, не меняют электрогенный характер транспорта ионов кальция митохондриями дрожжей, но оказывают существенное влияние на кинетические параметры Са^+-транспортирую-щей системы. Выше отмечалось (см.раздел I), что митохондрии

дрожжей поддерживают градиент ионов Са , зависящий от исходной концентрации добавленного иона. Введение спермина меняет эту характеристику. На рис.6 представлено влияние спермина на поглощение 100 мкМ Са2"1" митохондриями End. mgnuaii . Видно, что, в соответствии с ранее представленными данными, митохондрии аккумулировали чуть более половины добавленного кальция (рис.6,А). Введение 100 мкМ спермина приводят к дополнительному поглощению иона, практически до полного исчерпания его из среды инкубации. Присутствие 100 мкМ спермина в среде инкубации вызывает более полную аккумуляцию добавленного Са2+" и установление значительно более низкой равновесной его концентрации (рис.6,Б). *

Рис.6. Влияние спермина на поглощение Са2+ митохондриями Ena. magnusii. Спермин введен на 2 мин. эгта,200л»кМ инкубации (А), спермин присутствует в среде инкубации (Б). Состав среды инкубации, как в подписи к рис.1.

Со*100л«М

»V

540-Sßf

мин

540-50Г

Спермин увеличивает и начальную скорость по-'глощения Са2+ митохондриями. Степень влияния за-, висит от исходной концентрации кальция и полиамина. Действие спермина наиболее эффективно в диапа--. зоне низких (до 100 мкМ) концентраций Са24". Так, в присутствии 25-100 мкМ спермина наблюдается 4-кратное увеличение на-:альной скорости транспорта ионов кальция (рис.7, кривая I). Сле-ует отметить, что это значительно более низкие концентрации полимина по сравнению с теш, которые вызывают аналогичный эффект на итоховдриях печени И мозга крыс / Lanzen e*t al, 1986; Jeaeen t а1» 1987/. Сперыидин вызывает 4-кратное увеличение начальной

«VW»«

400 г

I ¡™lf „ **

о о I

° Й I

g< S J_,_,_,-L_

ё о 100 200 300 400

Концентрация полиаминов, мкМ

2+

Рис.7. Зависимость начальной скорости поглощения Са митохондриями End. magnusii от концентрации полиашнов в среде инкубации. Концентрация Са^+ в среде инкубации 100 мкМ. Митохондрии инкубировали в присутствии спермина (I), спермидина (2). Состав среды инкубации, как в подписи к рис.1

2+

скорости поглощения Са ■дрожжевыми митохондриями только при концентрации 100 мкМ и выше (рис.7, кривая 2).

Б присутствии 25-100 мкМ спермина отмечается также трехкратное снижение полумаксимальной эффективной концентрации кальция (Kq 5=60 мкМ) Срис.8). При этом начальный участок концентрационной 'зависимости начальной скорости поглощения ионов кальция (до 100 мк!Л) трансформируется из сигмоидального в гиперболический (рис.8, кривая 2). В этом случае степень влияния спермина на начальную скорость транспорта тем выше, чем ниже концентрация добавленного катиона и ближе ее уровень к физиологическому . В этом диапазоне концентраций происходит не только изменение начальной скорости транслокации Са2+ - она 'становится по стоянной в течение всего промежутка времени - от добавления каль ция до установления его равновесной концентрации. Равновесная концентрация устанавливается быстрее в 2-3,5 раза.

Наблюдаемые нами эффекты не связаны с действием полиаминов

на энергетические параметры митохондрий. В контрольных опытах било показано, что во всем диапазоне исследованных концентраций спермин и спермидин не влияют на скорость дыхания митохондрий в контролируемом и активном состояниях, на величины АДФ/0 - показателя эффективности окислительного фосфорилирования, на дыхательный контроль - показатель степени сопряженности дыхания и фосфорилирования митохондриальной мембраны. Вероятно, действие полиаминов направлено непосредственно на Са^-транспортируглую систему дрожжевых митохондрий.

Таким образом, показано, что при регулирующем действии концентраций полиаминов, близких к физиологическим, повышается сродство транспортной системы к кальцию, достигается более полное его исчерпание из среды, устанавливается уровень равновесной концентрации, не зависящий от концентрации добавленного катиона, близкий уровню свободной концентрации кальция в дрожжевой клетке (рис.9, кривая 2); в области низких концентраций иона (до 100 мкМ) существенно увеличивается начальная скорость аккумуляции кальция и снижается время достижения равновесной его концентрации. Все эти эффекты позволяют вновь поставить вопрос об участии митохондрий в поддержании Са^+ гомеостаза в клетках дрожжей.

Концентрация Са2+, мкМ

Рис.8. Зависимость начальной скорости поглощения

митохондриями End. magnusii от концентрации Са2+ в среде инкубация в отсутствии сперминаЦ) и в присутствии 75 мкМ спермина (2). Состав среды инкубации, как в подписи к рис.1

I

к о ьг

я + » ¡им о а)

а> о т _

о м

И «

а £

р-. р. ь М о я

80

40 -

-х-*---*

0 200 400

Концентрация Са2+, мкМ

Рис.9. Зависимость уровня равновесной концентрации в суспензии штохондржй Епй. ¡ааепиаН от исходной концентрации в среде инкубации. Мигохоадряи инкубировали в отсутствии сперминаСГ) и в присутствия 75 мкМ спермина (2). Состав среды инкубации, как в подписи к рис.1

4. Са -транспортирующая система дрожжевых митохондрий и активности матриксных дегидрогеназ

р 1

Показано участие транспортной системы Са в регуляции гормонами окислительного метаболизма для митохондрий позвоночных животных. В митохондриях растений этот механизм не найден / мсСогшаск, Беп-ьоп., 1988, 1981/. Представляло интерес выяснить, принимает ли описанная рами мигохондриальная система транслокацю ионов кальция участие в регуляции окислительной, активности дрожжевых митохондрий. С этой целью была измерена скорость поглощения кислорода митохондриями дрожжей при окислении дирувата, изо-цитрата, 2-окссглутарага и сукцината (в качестве контроля) при варьировании концентрации Са в среде от Ю-9 до 10 М. Как уже указывалось,/система транспорта имеет невысокое кажущееся сродство к катиону, поэтому для достижения заданной концентрации Са^+ в митбхощриальном матринсе все измерения проводили в присутствии Са^+-ионофора А23187.

Результаты исследований показали, что скорости окисления каждого из субстратов в указанном диапазоне концентраций кальция в среде оставались практически неизменными. Кроме того, в •

контрольных экспериментах определяли активности изоцитратдег/дро-геназы, 2-оксоглутаратдегвдрогеназн и сукцинатдегддрогеназы и показали, что активности этих ферментов не зависят от изменения концентрации ионов кальция. Таким образом, полученные результаты

ПОЗВОЛЯЮТ ЗакЛЮЧИТЬ, ЧТО В МИТОХОНДРИЯХ ДрОЯЯеЙ End. magnuaii

в отличие от митохондрий животных, три матряксные дегидрогеназы (изоцитрат-, 2-оксоглутарат- и пируватдегидрогеназа) не являются Са^+-зависимыки ферментами. Вероятнее всего, уровень окислительного метаболизма я продукции АТФ в дрожжевой клетке регулируется основны механизмом - отношением АТФ/АДФ в митохондриальном мат-риксе.

5. Идентификация компонента, ответственного за транслокацию Са^+ в митоховдриях дрожжей

Как уже было указано выше, описанная нами система транспорта дрожжевыми митохондриями имеет ряд общих черт с аналогичной системой митохондрий животных, в частности, электрогенный характер транспорта по механизму унипорта, близкие насыщающие скорости транспорта ионов, сходные природные модуляторы. Прин-дашальное отличие заключалось в нечувствительности процесса к шещтфическому ингибитору унипортера-рутениевому красному. В свя-¡и с этим представлялось важным идентифицировать компонент, ответ-:твенный за транслокацию катиона. Было проведено иммунохимическое ^следование митохондрий дрожжей. Для этого использовали антите-:а, полученные на высокоочищенный Са2+-транспортирующнй гликопро-еид из митохондрий сердца быка (м.м. 40 кД), который на искус-твенных•бислойннх лизщцных мембранах формирует селективные для альция каналы проводимости, чувствительные к рутениевому крас-ощ.

Методом иммуноблотгянта показано, что дрожжевые митохондрии >держат компонент, аналогичный Са2+-транспортирующему гликопро-звду митохондрий сердца быка (м.м.~ 40 нД). Используя метод мунодота, рассчитали относительное количественное содержание :ого компонента, оно составило 6,4$ от общего митохонцриально-I белка, что в 3 раза выше, чем в митохондриях сердца и в 6 раз ше, чем в митохондриях печени крысы. Вероятно, этим и можно ъяснить высокие скорости транспорта кальщя дрожжевыми мито-ндриями.

та часть работы выполнена под руководством д.б.н.Т.Д.Мироновой лаборатории энергообеспечения физиологических функций Института офизики АН ссср;

Танки o6pasoui, полученные данные позволяют предположить, что трат локация ионов кальция в митоховдриальной мембране дрожжей End. magna.sii осуществляется компонентом, подобным Са^+-транспор-тирующаму г.татопротеиду из митоховдрий сердца быка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведанные исследования показали, что митохондрии дрожжей En.;:, magnusii шлевт энергозависимую систему транслокации кальция, при этом насыщающие скорости ее сопоставимы со'скоростями аналогичной системы митохондрий животных, л выше, чем у растений и одноклеточных беспозвоночных. Активность ушаортера определяется концентрацией кальция в среде. Концентрационная зависимость имеет спгмоидальный характер и достигает насыщения при значительных (300-400 шь\0 концентрациях Са^+. Кажущееся сродство системы к кальцию невысокое - Kq ^^200 мжМ,значительно ниже, чем у Са^+-транспортирующей системы митохондрий животных, но сопоставимо с системами транспорта Са^+ митохондрий насекомых, беспозвоночных и некоторых растений.

Взаимоотношение между поглощением кальция и стимуляцией дыхания в дрожжевых митохондриях отличается от описанного для ми- -тохоццрий животных. Так, поглощение низких (до 100 мкМ) концентраций кальция вообще не влияет на скорость дыхания митохоццрий, а минимальная насыщающая концентрация его не вызывает максимальной стимуляции дыхания. Аналогичный случай описан только для митохондрий летательных мышц мухи / ;voh.rlab, 1974/. Невысокое кажущееся сродство транспортирующей системы к кальцию обусловливает ряд ее особенностей. Во-первых, происходит торможение скорости аккумуляции Са^+ по мере его поглощения и снижения концентрации в среде и возрастает время достижения равновесной концентрации. Во-вторых, митохондрии не способны поглощать весь добавленный кальций и поддерживать низкий, строго определенный уровень его в среде.

Найдено, что описанные свойства Са^+-транспортирувщей системы могут изменяться под влиянием природных модуляторов транспортирующей системы - ионов магния и полиаминов. Ионы магния, с одной стороны, снижают повреждающее действие кальция на мембрану и увеличивают степень ее янтактности. С другой стороны, при концентрациях кальция свыше 100 мкМ,они оказывают ингиби-

рующее действие на свойства системы транслокацги снижая

насыщающую и начальные скорости транслокации Са2+, кажущееся српдстзо систеш к катиону, увеличивая время достижения равновесной концентрации. Однако, в отличие от митохондрий животных и растений, %2+ не влияет на уровень равновесной концентращгг Следует отметить, что митохондрии дрожжей ке обладают независимым электрогенным путем транспорта ионов магния.

Полиамины (спермин и спермидин) повышают кажущееся сродство Са^+-транспортирующей системы к катиону, увеличивают начальные скорости поглощения низких (близких к физиологическим) концентраций кальция - до 100 мкМ, обусловливают более полное поглощение добавленного Са^"1" митохондриями. В их присутствии митохондрии поддерживают определенный уровень кальция в среде, близкий к уровню его свободной концентрации в цитоплазме дрожжевой клетки I Eilam et al, 1985b/.

Митохондриям животных и растений отводят роль временных ;епо кальция, т.к. они характеризуются относительно невысоким сродством транслокатора к кальцию по сравнению с другими Са^+-?ранспортирующши системами клетки. Можно было предположить,что штохондрии дрожжей in vivo выполняют аналогичную функцию, од-¡ако, существенное изменение кинетических свойств Са^+-транспор-'ирующей системы митохондрий в присутствии спермина, а также ношение буферной способности митохондрий (т.е. способности под-.ерживать низкий внемитоховдриальный уровень сопоставимый

физиологическими его концентрациями в цитоплазме), позволяют новь поставить вопрос об их участии (наряду с Са^+-транспорти-угацей системой вакуолей я Са -связывающими белками) в поддер-ании гомеостаза ионов кальция в .дрожжевой клетке. Напомним, что анее такая постановка вопроса полностью исключалась, поскольку

о i

ринималось, что Са -транспортирующая система дрожжевых мято- . звдрий с ее низким кажущимся сродством и чрезвычайно низкой ак-явностыо к катиону не может иметь физиологического значения Carafoli et al, 1970; Balcavage et al,1973/.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено исследование свойств Са2+-транспортирую-щей .системы дрожжевых митохондрий. Показано, что транспорт кальция зависит от энергии окисления субстратов дыхания, является электро-геннта процессом и происходит по механизму ушшорта. Поглощение Са2+ сопровождается стимуляцией дыхания и обратимым снижением мембранного потенциала.

2. Определенк кинетические параметры Са^-транспортирующей системы: насыщающая скорость составляет около 700 нмоль/мин'мг белка, полумак.сиыЕльная эффективная концентрация кальция - около

200 мкМ; емкость митохондрии достигает 1400 нмоль Са2+/мг белка. Невысокое кажуп'.эеся сродство системы к кальцию обусловливает неполное исчерпание катиона из среды, ториожение скорости его аккумуляции по мере поглощения, увеличение времени достижения равновесной концентрации.

3. Впервые исследовано влияние природных модуляторов Са2+-транспортирующей систеш (магния и полиаминов) на ее кинетические параметры. Показано, что магний проявляет ингибирующее действие на транспорт нефизиологических (свыше 100 мкМ) концентраций кальция: снижаются насыщающая и начальные скорости поглощения Са2+, кажущееся сродство систеш к Са2+, увеличивается время достижения равновесной концентрации Са2+.

Полиамины (спермин и спермвдин) выполняют роль положительных модуляторов: в их присутствии увеличиваются начальные скорости поглощения физиологических (до 100 мхЫ) концентраций кальция, повышается кажущееся сродство системы к Са2+, снижается время достижения равновесной концентрации кальция, проявляется способность митохондрий поддерживать определенный уровень кальция в среде, близкий к уровню его свободной концентрации в цитозоле дрожжевой клетки.

' 4. Идентифицирован компонент, аналогичный Са2+-гранспорти-рувдему гликопрогевду из митохондрий сердца быка. Это дает основание предположить общность молекулярной структуры транслокатора кальция в митохондриях высших и низших эукариот.

5. На основании полученных данных выдвинуто предположение об участии дрожжевых митохондрий в поддержании гомеостаза кальция в клэтке дрожжей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вотякова Т. В., Баженова Е. Н. Регуляция ионами магния активности митохондриальных ферментов, участвующих в метаболизме АТФ. — Материалы московской конференции молодых ученых «Современные то-блемы биохимии и физико-химической биологии». М., 1985, ч. 1, с. 91—92.

2. Вотякова Т. В., Баженова Е. Н. Некоторые особенности Са2+— транспортирующей системы дрожжей Endomyces magnusii.— Труды IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки. Тбилиси, 1985, ч. 1, с. 138—140.

3. Баженова Е. Н., Вотякова Т. В., Звягильская Р. А., Лейкин Ю. Н. О транспорте двухвалентных катионов в митохондрии Endomyces magnusii.— Всесоюзный симпозиум «Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена». Тез. докл.—Пущино, 1986.—с. 46—47.

4. Лейкин Ю. Н., Вотякова Т. В., Баженова Е. Н., Звягильская Р. А, Котельникова А. В. Взаимодействие ионов Са2+ с митохондриями дрожжей Endomyces magnusii. — Биохимия, 1987, т. 52, вып. 4, с. 676—682.

5. Звягильская Р. А., Вотякова Т. В., Баженова Е. Н. О способности митохондрий дрожжей транспортировать ионы магния. — Микробиология, 1987, т. 56, вып. 4, с. 543—548.

6. R. A. Zvjagilskaya, Т. V. Votyakova, Е. N. Bazhenova, Т. V. Kaverin-ькауа. Kinetic properties of Ca2+-transporting system of yeast mitochondria. Absir. Symposium on «Molecular organisation of biological structures». Moscow. 1989. P.

Подписано к печати 28.04.89 Т-01789 Формат бОХЭО1/^

Объем п. л. 1,25 Уч.-изд. л. 1,25 Печать офсетная

Бум. тип. № 2 Тираж 100 экз. Заказ 609

Типографии АгроНИИТЭИПП