Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование регуляторных и каталитических свойств митохондриальных моноаминоксидаз и структуры их эндогенного ингибитора трибулина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование регуляторных и каталитических свойств митохондриальных моноаминоксидаз и структуры их эндогенного ингибитора трибулина"

рГВ он

^РОССЙЙСКЛЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ химии

УДК 577.158.4: 612.015.3: C1C.-008.S31 На правах рукописи

МЕДВЕДЕВ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ И КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ МОНОАМИНОКСИДАЗ И СТРУКТУРЫ ИХ ЭНДОГЕННОГО ИНГИБИТОРА ТРИБУЛИНА

Биохимия 03.00.04

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК В ФОРМЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА

МОСКВА 1994

Работа выполнена в лаборатории биохимии аминов и других азотистых оснований Института биомедицинской химии РАМН

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук И.ССеверхша Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Л.Ф.Панчепко Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук К.С.Раевский

Ведущая организация - Университет Дружбы народов им. ПЛумумбы

Защита состоится " 6 " -Э^ЬЗу. 1994 г. в ЛС> часов на заседании специализированного СоЬеТа Д.001.10.01 в Институте биомедидинской химии РАМН по адресу. 119832 Москва, Погодинская ул., д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института биомедицинской химии РАМН но адресу: Москва, Погодинская ул, д.10.

Диссертация разослана "_"_ 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета Д.001.10.01 кандидат биологических наук

ТЛЛарионова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Моноаминоксидаза CMAOD Санин:кислород оксидоредуктаза Сдезами-нирующая!) Ссодержащая флавиЮ К. ф. 1.4.3.4} играет центральную роль в метаболизме биогенных аминов, многие из которых выполняют нейроне-диаторные функции в живых организмах (Blashko, 1974; Gorkin, 1983; Ore land, 1993Э. Изучение на протяжении более 60 лет принципов функционирования МАО позволило выявить важное значение этого фермента в развитии ряда нейро-психических расстройств (Sandler, Glover, 1988; Ore land, 1993) и создать новый класс лекарственных препаратов -антидепрессантов - ингибиторов МАО, третье поколение которых находит все более широкое применение в медицине СМашковский и др., 1983; Tipton et al., 1984; Burrows, Da Prada, 1989; Cesura et al., 1993).

Прогресс в понимании Фундаментальных свойств этого фермента за последнее время обязан следующим открытиям:

1. Окончательно доказано существование двух типов МАО СД и Б), различающихся не только по чувствительности к ацетиленовым ингибиторам хлоргилину и депренилу, соответственно CFowler et al., 1978). но и по первичной структуре полипептидных цепей CBach et al., 1988; Shih, 1993Э. Кодирование МАО А и МАО Б осуществляют разные гены, имеющие различную организацию промотерной области С Shi et al., 1990, 1992).

2. Встраивание вновь синтезированных молекул МАО во внешнюю мембрану митохондрий происходит в присутствии полипептида уёиквитина и является АТФ-зависимым процессом (Zhuang et al., 1988-1992), в котором 28-аминокислотный С-концевой фрагмент полипептидной цепи выполняет сигнальную функцию (Mitoma, Ito, 1992).

3. Обнаружено явление обратимого качественного изменения субстратной специфичности МАО как в опытах с высокоочшаенныии препаратами фермента, так и при стимуляции перекисного окисления липидов в биомембранах СГоркин и др., 1967-1985) или ферментативной оксигенации митохондриальных мембран (Wiesner et al., 1989).

4. Из тканей и биологических жидкостей млекопитающих выделен низкомолекулярный ингибитор МАО трибулин (Sandler, 1982). Установлено, что основным его компонентом , ответственным за торможение МАО Б, является изатин С2,3-диоксоиндолЭ (Glover et al., 1988).

5. Выявлена роль МАО Б в развитии паркинсонизма CSinger et al., 1987). Получены данные о том, что третичные амины - аналоги МПТП, МАО-зависимая биоактивация которого вызывает развитие паркинсо-

низиа, - являются более эффективными субстратани МАО, чем биогенные ионоамины (Krueger et al., 1992; Singer, Ramsay, 1993). 6. Показано, что ингибиторы МАО А обладают антидепрессивным эффектом СМашковский и др.,1983; Burrows, Da Prada, 1989), а ингибиторы МАО Б замедляют развитие паркинсонизма CLangston et al., 1984; Knoll, 19933.

Количество ежегодно публикуемых по МАО статей огромно и счет их оттисков уже ведется на килограммы (Sandler, Glover, 1988). Однако несмотря на большой междисциплинарный интерес исследователей к этому ферменту, многие вопросы, касающиеся механизмов функционирования, контроля субстратной специфичности, регуляторной роли и эндогенной регуляции МАО в норме и, особенно, при патологических состояниях еще ждут своего разрешения. Сильно отстает в этой плане уяснение роли МАО в регуляторных эффектах аминов, хотя результаты исследований подобного рода периодически появляются в отечественной (Кулинский и др., 1993) и международной (Sandri et al., 1990, Werner, Cohen, 1991) печати. Концепция модифицирования субстратной специфичности аминоксидаз (включая МАО), сформулированная В.З.Горкиным более двадцати лет назад, в настоящее время получила широкое признание (Kaiser et al., 1983; Tabor, 1985) и независимое экспериментальное подтверждение (Okada et al., 1980; Wiesner et al., 1989; Stevanato et al., 1989), но многие фундаментальные вопросы этого явления, особенно для МАО, все еще неясны. На фоне существенных достижений в области расшифровки первичной структуры и механизма встраивания МАО во внешнюю мембрану митохондрий более скромны успехи в идентификации структуры эндогенных регуляторов активности МАО.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование роли МАО в регуляторных эффектах биогенных аминов на функции митохондриальных ферментов, биомедицинского значения модифицирования каталитических свойств ИДО при эпилепсии и некоторых других' патологических состояниях, а также изучение компонентов эндогенного ингибитора МАО трибулина.

В основные задачи работы входило: 1 ) Охарактеризовать механизмы регуляторных эффектов биогенных аминов на функции митохондрий и роль МАО в путях их реализации. 2) Изучить роль мембран в процессе качественного модифицирования субстратной специфичности МАО. 3) Исследовать роль модификации каталитических свойств МАО в развитии некоторых патологических состояниях (эпилепсия, интоксикация паракватон).

4) Выделить, идентифицировать и охарактеризовать МАО-А-ингибиторный компонент трибулина. 5) Исследовать факторы, влияющие на метаболизм изатина, основного МАО-Б-ингибиторного компонента трибулина. Положения, выносимые на защиту,

1. Регуляторные эффекты биогенных аминов на функции митохондрий реализуются тремя основными механизмыми: (а) рецепторными, связанными с взаимодействием моноаминов с рецепторами плазматических мембран, образованием вторичных посредников (цАМФ), которые стимулируют активность митохондриальных ферментов путем изменения свойств внут— ренней мембраны; (б) метаболическими, обусловленными катализируемым МАО А я Б окислительным дезанинированием аминов и влиянием продуктов реакции (альдегиды) на активность мембраносвязанных ферментов митохондрий; (в) прямым взаимодействием аминов с мембранами митохондрий, влияющим на активность мембраносвязанных ферментов путем изменения поверхностного заряда мембран.

2. Изменение субстратной специфичности митохондриальных МАО (А) при стимуляции перекисного окисления in vitro или при некоторых патологических состояниях обусловлено изменением конформационного состояния фермента в мембране, характеризующегося повышением чувствительности к ограниченному протеолизу.

3. Модифицирование каталитических свойств МАО имеет важное значение в механизме интоксикации паракватом; введение антиоксидантов или восстановителей не только нормализует реакции дезаминирования, но и снижает смертность экспериментальных животных.

4. Изменение субстратной специфичности МАО (А) мозга является патогенетически важным элементом в механизме развития эпилептиформного судорожного припадка (в эксперименте). Предупреждение модифицирования каталитических свойств МАО А селективным ингибитором пиразидо-лом оказывает выраженное антиконвульсивное действие.

3. Эндогенный ингибитор трибулин состоит из нескольких компонентов, избирательно тормозящих МАО А и МАО Б. Зфиры индолуксусной и 4-гидроксифенилуксусной кислот, выделенные из суммарной фракции трибулина мочи человека, являются компонентами трибулина, ответственными эа селективное торможение МАО А.

б. Катаболизм изатина, МАО Б ингибиторного компонента трибулина, может происходить при участии ферментных систем, генерирующих супероксид-анион.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведен

систематический анализ механизмов регуляторных эффектов биогенных аминов на функции митохондриальных ферментов, реализация которых включает образование вторичных посредников (цАМФ) (рецепторные механизмы), окислительное дезаминирование моноаиинов при участии МАО А и Б (метаболические механизмы) или взаимодействие аминов с компонентами мембран (прямые механизмы). Показано, что модифицирование каталитических свойств МАО-А обусловлено конформационныи изменением фермента в мембране, сопровождающимся появлением чувствительности к ограниченному протеолизу. Это является общим свойством МАО-А при всех изученных патологических состояниях, характеризующихся изменением субстратной специфичности фермента. Предупреждение модифицирования каталитических свойств МАО-А селективным обратимым ингибитором, восстановителями или антиоксидантами оказывает выраженный терапевтический эффект. Впервые доказано существование МАО-А ингибитор-ного компонента трибулина, предложен способ его очистки и осуществлена идентификация химической структуры. Показана принципиальная возможность биологической деградации изатина при участии ферментов, генерирующих супероксид-анион.

Апробация работы. Результаты работы были доложены или представлены и обсуждены на 11 Всесоюзном симпозиуме по митохондриям (Пуиино, 1981 ), 4, 5, и 6 Всесоюзных симпозиумах по циклическим нуклеотидам (Минск, 1982; Рязань, 1985; Петрозаводск, 1988), 8 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР «Проблемы современной биохимии и биотехнологии» (Рига, 1985), Всесоюзном сиипозиуме «Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена» (Пущино, 1986), 5 Всесоюзной конференции «Физиология и биохимия иедиаторных процессов» (Москва, 1990), Организационном конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991 ), Семинаре отдела химической патологии при госпитале королевы Шарлотты (Лондон, 1992), Лондонском совещании по изатину (1993), Международном симпозиуме «Медико-биологические основы лечения и диагностики алкоголизма и наркоманий» (Москва, 1993), Конференции «Свободнорадикальные механизмы церебральных патологий: теоретические и практические аспекты проблемы» (Москва, 1993).

Вклад автора. Большинство экспериментальных данных, представленных в настоящей работе, получены автором лично. В работах, выполненных в соавторстве, автором определены направления исследования, постановка целей и задач эксперимента и обобщение результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. БИОГЕННЫЕ АМИНЫ И МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ МИТО-

ХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

1.1. Рецепторные эффекты биогенных аминов на функции митохондрий.

Первые данные о стимуляции катехоламинаии метаболических процессов в митохондриях получены в середине 70-х годов (Кулинский,

Труфанова, 1975; Garrison, Haynes, 1975). Позднее было установлено, 2 +

что катехоламины Ca -зависимым (при взаинодействии с сс^-адреноре-цепторани) или цАМФ-зависимым (при взаимодействии с /3-адренорецепто-рани) путями осуществляют множественный контроль митохондриальных функций (Кулинский и др., 1977-1987; Williamson et al., 1981; Taylor et al., 1983; McCormaek, Denton, 1985). Однако поиск конкретных механизмов реализации этих эффектов успехом не увенчался и появились даже представления о том, что сами эффекты гормонов являются артефактами (Siess et al., 1981).

Таблица 1

Влияние охлаждения крыс на активность ферментов нитохондрий

I

Орган Условия Ана- Трансгидрогеназа НАД-изоцитратдегидрогеназа опьгга при-

лин / - + - +

нмоль/мин на 1 мг белка

Печень Контроль 10, ,6+1.1 12, ,7+1, 5 6, 9+0, ,6 6, ,8+0,5

Охлаждение 18, ,4+2.2 11 , ,4+1. 0 9. 2+0, ,6 6, ,7+0.6

Р <0,01 >0,1 <0, ,05 >0.9

Сердце Контроль 22, , 3+1. 5 20, ,4+1 , 6 36, 6+3, ,0 38, ,7+2,4

Охлаждение 31, ,8+2,0 19, ,4+0, 6 49, 4+3, ,2 38, ,7+2.1

Р <0,01 >0, 8 <0, ,02 -

Мышцы Контроль 42, I 2 ±.4,5 46, , 2 ±6, 3 42. 0+2, ,4 45, ,8+5,5

Охлаждение 68, ,5+5,2 46, ,6+4. 3 60. 8+1 , ,0 43, ,4+6.4

Р <0.001 >0, 9 <0, ,01 >0,9

Различия в активности ферментов контрольных животных без анаприлн-на (-) и при его введении ( + ) стзтистически незначимы (р>0,3-0,7). В сериях по 7-11 опытов.

Инъекция физиологических доз адреналина, иэопропилнорадреналина, мобилизация эндогенных катехоламинов при охлаждении животных (Табл. 1) или инкубация с гомогенатами печени увеличивает (на 20- 60%) активность фермента внутренней мембраны - трансгидрогеназы СТГ, К. Ф. 1.6.1. 13 и матрикса - НАД-изоцитратдегидрогеназы СНАД-ИЦДГ; К. Ф. 1.1.1.413, не влияя на активность НАДФ-изоцитратдегидрогеназы цито-золя и митохондрий.

Обнаружение этих эффектов после солюбилизации митохондрий детергентом (1% раствор тритона Х-ЮО) свидетельствовало в пользу изменения каталитических свойств самих ферментов. Стимулируемое адреналином in vivo увеличение содержания цАМФ в ткани печени сопровождалось его накоплением и в мембранах митохондрий (с 0,30+0,06. пмоль/мг белка до 0,76±0,11 пмоль/мг белка, р<0,01). Антагонист а-адренорецепторов фентоламин не влиял, а антагонист /3-адренорецепторов пропранолол (анаприлин) предупреждал влияние катехоламинов на оба фермента .

Увеличение активности ТГ и НАД-ИЦДГ, наблюдаемое в динамике инкубации изолированных митохондрий с цАМФ (Табл. 2), свидетельству-- ^ пользу действительно стимулирующего влияния цАМФ на митохондрии, а не возросшей в присутствии цАМФ устойчивости этих орга-нелл к тепловой обработке (30°С). как этого можно было ожидать, исходя из представлений Siess et al.(1981), утверждавших, что эффекты гормонов являются артефактами, а цАМФ-зависимая активация митохондриальных функций, регистрируемая обычно как разница между контролем и опытом, на самом деле отражает возросшую под влиянием гормонов (и цАМФ) устойчивость митохондрий к процедуре выделения. Выраженность стимулирующего эффекта 1 мкМ цАМФ на оба фермента не зависела от концентрации митохондрий (в диапазоне от 1 до 20 мг белка/мл) в среде инкубации.

Обработка митохондрий трипсином, ограниченная внешней поверхностью внутренней мембраны, предупреждает влияние цАМФ на оба фермента. фракционирование митохондрий с помощью детергентов Сдигито-нина и лубролаЗ также сопровождается снижением эффекта цАМФ: при его инкубации с матриксом активность НАД-ИЦДГ не изменяется, а величина активации ТГ при инкубации внутренних мембран митохондрий вдвое ниже по сравнению с эффектом цАМФ на целостных митохондриях. Предварительный лизис органелл тритоном Х-100 приводит к исчезновению чувствительности обоих ферментов к цАМФ. Все это свидетельствовало об опосредованном характере действия цАМФ на активность исследуемых

ферментов.

Таблица 2

Динамика активации трансгидрогеназы и НАД-изоцитратдегидрогеназы при инкубации суспензии митохондрий с 1 мкМ цАМФ

Время Трансгидрогеназа НАД-изоцитратдегидрогненаза

мин -цАМФ +цАШ р -цАМФ +цАМФ р

нмоль/мин на 1 мг белка

О 9,4+1,0 9.8+1,2 >0,2 8,4+0,5 8,4+0,3

3 8.7+1,2 9,6+0,6 >0,2 8,6+1,1 9,2+1,1 <0.05

5 10,5+1,1 12,8+1,1* <0,01 8,3+0,2 10,5+0,5** <0,05

10 9,8+1,0 12,6+1,0* <0,001 8,7+0,6 11,3+0,9** <0,05

Значимость различий оценивали, используя критерий I Стьюдента для связанных выборок. Звездочками указаны различия с исходной активностью в неинкубированных митохондриях в каждом столбце: *р <0,05;

**р<0,01. В сериях по 3-8 опытов.

цАМФ-зависиная активация НАД-ИЦДГ при инъекции животным адреналина обнаруживается не только в солюбилизированных тритоном Х-100, но и в разрушенных ультразвуком митохондриях и митопластах С митохондрии, лишенные с помощью дигитонина внешних мембран и фракции межмембранного пространства}. Осаждение субмитохондриальных частиц (СМЧ) из озвученных митохондрий или митопластов приводит к исчезновению активации НАД-ИЦДГ в надосадке (Табл. 3).

При ультразвуковой разрушении митохондрий и последующем осаждении СМЧ при высокоскоростном центрифугировании вся активность НАД-ИЦДГ определяется в надосадочной жидкости. Осаждение СМЧ сопровождается увеличением не только удельной, но и общей активности фермента (+22+5%, р<0,05), что невозможно объяснить простым освобождением от балластных белков при центрифугировании. Изолированные СМЧ характеризуются противоположной по сравнению с интактными митохондриями ориентацией мембран С оцениваемой по влиянию экзогенного цито-хрома с на дыхание СМЧ}. Это свидетельствует в пользу того, что в обработанных ультразвуком митохондриях НАД-ИЦДГ взаимодействует с внутренней поверхностью внутренней мембраны.

С учетом приведенных данных проявление цАМФ-зависимой активации НАД-ИЦДГ катехоламинами, по-видимому, обусловлено присутствием ком-

Таблица 3

Влияние адреналина на активность НАД-изоцитратдегидрогеназы, измеренной при фракционировании митохондрий и китопластов, подвергнутых ультразвуковой обработке

Условия Активность НАД-изоцитратдегидрогеназы в: опыта Озвученном препарате 120000 й надосадке

нноль/мин на 1 иг белка

Митохондрии Контроль 6.2 ±.0,4 (13)

Адреналин 8,3 +0.7 (13)

р <0.01

Митопласты Контроль 7,5 +0,5 (9)

Адреналин 9,1 +0,5 (9)

р <0,05

10,3 +1,0 (5)

10,2 + 0,2 (5)

>0.9

12,1 +1,1 (8)

12,8 +1,3 (8) >0,6

В скобках указано количество опытов.

понентов мембран митохондрий, с которыми молекула фермента и взаимодействует. В СМЧ из печени активированных адреналином крыс обнаружены увеличение окисления НАДН (+44±?>С) и активация ТГ (30+8JC), свидетельствующие об изменении свойств самой внутренней мембраны при стимуляции катехоламинами митохондрий.

цАМФ-зависииая активация катехоламинами ТГ обнаруживается в солюбилизированных митохондриях, а также СМЧ, полученных после ультразвуковой обработки митохондрий и митопластов. Модификация внешней поверхности внутренней мембраны п-хлормеркурибензоатом (пХМБ) инги-бирует ТГ сильнее при стимуляции адреналином, чем в контроле (Табл. 4). В СМЧ печени, выделенных после инъекции адреналина, ТГ характеризуется повышенной чувствительностью к ингибированию дициклогексил-карбодиимидои, термической и протеолитической инактивации (Таблица 4). Субстраты реакции НАДФН и НАД+. индуцирующие различные конфориа-ционные состояния фермента во внутренней мембране (Blazyk et al., 1976; Fisher, Earle 1982, Yamaguchi et al., 1990), в большей степени изменяют чувствительность к указанным воздействиям активированной адреналином ТГ. Это, очевидно, свидетельствует о большей функциональной подвижности ТГ в неибране при активации катехоламинами.

Таблица 4

Ингибирование трансгидрогеназы пХМБ, ДЦКД, трипсином, термической обработкой и роль субстратов в чувствительности к этим воздействиям

Препарат и добавки в среду инкубации

Активность Трансгидрогеназы Контроль Адреналин р

Митохондрии

Без добавок 12, ,3 + 0, ,8 16, ,6 + 1 , ,2 <0, ,001

пХМБ 8, , 1 + 0, ,7 8, ,4 + 0, ,7 >0, , 9

пХМБ+гипотонический шок 5, ,0 + 0, ,5 4, ,6 + 0, ,2 >0, ,8

цистеин 12, ,9 + 0, ,9 15, .9 + 0, .8 <0, ,05

пХМБ, затем цистеин 11 , ,0 + 0, ,7 13, ,4 + 0, ,8 <0, ,05

из митохондрий

Без добавок 21 , ,8 + 1, ,9 28, ,4 + 2, ,1 <0, ,05

ДЦКД 7, 12 + 0, ,5 13, ,5 0, ,9 <0, ,001

ДЦКД + НАДФН 6, , 6 + 0, ,4 4, ,8 + 0, .6 <0, ,05

из митопластов

Без добавок 37, .8 + 2, ,6 59, ,0 + 3, .0 <0, ,001

Трипсин 29, ,1 + 2, ,3 33, ,6 + 3, .0 >0, ,2

Трипсин + НАД (0,2 нМ) 34, ,4 + 1, ,9 44, ,6 3, .0 <0, ,01

Трипсин + НАДФН (0,2 нМ) 25, .7 2, ,6 30, ,2 + 5, ,3 >0, ,4

из митопластов

Без добзвок 36, ,9 ± 2, ,0 54, ,2 + 2, ,2 <0, ,001

Термообработка 3, ,7 ± 0, .7 4, ,1 + 0, ,7 >0, ,8

Термообработка + НАД 3, ,3 + 1 , ,1 2, ,2 £ 1, ,1 >0, ,4

Термообработка + НАДФН 29, ,2 + 1 , ,5 40, ,2 + 2, ,6 <0, ,01

Условия эксперимента подробно описаны в (Медведев, 1987, 1994).

Мембранотропные соединения лидокаин и аминазин, влияющие как на свойства мембранных фосфолипидов, так и на ферменты их модифицирующие, при добавлении к суспензии митохондрий или при введении животным предупреждают влияние цАМФ при последующей инкубации с митохондриями. По-видимому, цАМФ-зависимая стимуляция ТГ катехоламинами обусловлена модификацией свойств самой внутренней мембраны митохондрий, в основе которой лежит изменение состояния и/или состава липид-ного компонента мембраны. Это приводит к увеличению подвижности молекулы фермента в мембране, повышению его каталитической активности и большей доступности к ингибиторным воздействиям.

1.2. МАО-зависимые эффекты биогенных аминов на митохондрии.

Идея о катализируемом МАО образовании веществ, имеющих собственную С отличную от моноаминовЗ биологическую активность, высказана давно ССогкЛп, 1966). Было показано, что ряд моноаминов тормозил активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и цитохромоксидазы СГоркин,

Кривченкова, 1971; Кривченкова, 1974}. Эффекты аминов воспроизводили альдегиды С продукты окислительного дезаминирования последних}. но не Н^О^ или аммиак. Ингибиторы МАО предупреждали влияние многих, но далеко не всех биогенных аминов и механизмы этих МАО-зависимых и МАО-независмых эффектов не были выяснены. Не был установлен и тип МАО, участвующий в реализации влияния аминов на ферментные системы нитохондрий- Обнаружение катализируемой МАО Б биоактивации МПТП С1-метил-4-фенил-тетрагидропиридина5 до нейротоксина МФП + Снетил-фе-нилпиридинияЗ, ингибиторное действие которого на митохондрии клеток стриапаллидарной системы во многом определяет развитие паркинсонизма С35.пйег et а1., 1987). стимулировало исследование роли МАО в регуляции энергетических Функций митохондрий и биогенными аминами.

Инкубация митохондрий печени крысы с З-метокситриптамином, серотонином, тирамином или фенилэтиламином тормозит активность не только ферментов внутренней мембраны митохондрий - СДГ и сукцинат-цитохром с-редуктазы - но и фермента внешней мембраны нитохондрий нечувствительной к ротенону НАДН-цит.с -редуктазы СТабл. 5Э. Предварительная обработка митохондрий смесью селективных ингибиторов МАО А и МАО Б Схлоргилина и депренила соответственной полностью предупреждала как дезаминирование биогенных аминов, так и индуцируемое ими торможение активности ферментов. При этом влияние 5-метоксииндолил-3-ацетальдегида - продукта окислительного дезаминирования 5-метокси-триптамина - было сохранено. МАО-зависимые эффекты биогенных анинов были сохранены после разведения инкубационной среды, переосаждения митохондрий из нее и Св случае СДГЭ после солюбилизации мембран тритоном Х-100.

По данным ингибиторного анализа, в условиях преинкубации с 0,1 икМ хлоргилином каталитическая активность МАО Б сохраняется практически полностью. В этом случае МАО-зависимые эффекты моноаминов убывали в следующей последовательности: тирании> фенилэтиламин> серото-нин. При селективном ингибировании МАО Б депренилои выраженность опосредованных МАО А эффектов моноанинов была следующей: серотонин > тирании > фенилэтиламин. С учетом рассчитанных концентраций продуктов, МАО-зависииые эффекты биогенных аминов на активность мембрано-связанных ферментов митохондрий определяются накоплением продуктов дезаминирования аминов Сальдегидной природьО, катализируемого обоини типами МАО (МАО А и Б). Выраженность эффекта определяется не только количеством образовавшихся альдегидов, но и структурой их радикалов,

а также чувствительностью ферментных систем к альдегидной регуляции.

Таблица 5

Влияние биогенных аминов на активность ферментов митохондрий

Амин Лреинкубация Дезаминирование Остаточная активность (%) хлор- депре- нмоль/30 мин на НАДН- сукцинат- СДГ гилин нил 1 мг белка цит. с-редуктаза

Серо-то-нин

280 +54,5 35,3+ 11,1 226 +48,6 0

54+5 89+6

57+0.3Г 47+5®

46+4 89+6

101 +7

94+7

20+3 75+3Е 17+2Г 89+8

Тира-мин

ФЭА

5-МТА -

5-МИ-альд.

420 + 61 , 4 231 +45,9 163 +25,1 2,4 + 1,2

179 +10,3 135 + 15,0 19,1+ 6.7 0

217 + 6,3 2,3 + 1,9

0 0

44+5Г 46+4Г 48+5°

50+7 Г 52+4Г 49+5Г

71+4Г 73+5® 62+5В

89+6 98+5 84+7

63+56 76+3В 73+5В

62+4® 73+3В 66+4В

91+За 94+1Э 94+5

98+3 104+8 100+2

71+76 74+5В 43+5®

95+8 101+8 105+13

59+6В 34+3Г 52+53

59+1Г 30+2Г 49±.7Г

Митохондрии преинкубировали с ингибиторами МАО хлоргилином и депре-нилом (0,1 мкМ) при комнатной температуре 30 мин. ФЭА - фенилэтил-амин; 5-МТА - 5-метокситриптамин; 5-МИ-альд. - 5-метоксииндолил-З-ацетальдегид. Буквами указана значимость различий с исходной активностью ферментов в митохондриях, инкубированных без аминов или альдегидов: а - р < 0,1; б - р < 0,05; в - р< 0,01; г - р <0,001.

1.3. МАО-независимые эффекты биогенных аминов.

Снижение активности исследуемых ферментов наблюдали и при добавлении аминов в среду измерения их активности, содержащую препараты митохондрий, преинкубированные с ингибиторами МАО. В указанном варианте эксперимента ингибиторным эффектом помимо моноаминов обладал и полиамин спермин, причем его действие проявлялось при более низких концентрациях. МАО-независимые эффекты снижались при разведении среды инкубации, а при солюбилизации мембран митохондрий тритоном Х-100 ингибирование СДГ исчезало совсем.

Важное значение целостности иитохондриальных мембран для проявления этих эффектов Спо крайней мере на СДГЗ указывало на то, что влияние аминов не обусловлено их пряным взаимодействием с молекулами исследуемых ферментов как считали раньше СКривченкова, 1974Э. Основные различия в структуре использованных аминов заключались в числе аминогрупп и С для индолил- и фенилалкиламиновЗ ионизируемых гидроксильных групп в ароматическом кольце (McEwen et al., 1969). Поскольку значения рКа для аминогрупп спермина и моноаминов варьируют от 8,90 до 11,56 С McEwen et al., 1869; Tabor, Tabor, 1984), очевидно, что в наших условиях Сбуферные растворы с pH 7,4-7,8 для разных ферментов} амины присутствовали в форме положительно заряженных ионов. Свойство заряженных молекул опосредованно влиять на активность иембрано-связанных ферментов обусловлено изменением поверхностного заряда нембран, лизис которых детергентам приводит к исчезновению этих эффектов CWojtczak, Ralez, 1979; Famulski et al.,1983),

Таким образом регуляция биогенными аминами функций митохондрий осуществляется опосредованными и прямыми механизмами. К первым относятся: СаЭ рецепторные механизмы, когда взаимодействие аминов с рецепторами плазматических мембран приводит к повышению содержания внутриклеточных посредников, которые действуя на митохондрии, в конечном счете изменяют (повышают) активность их ферментных систем; С63 метаболические механизмы, когда в ходе катализируемого МАО А и МАО Б дезаминирования биогенных аминов образуются биогенные альдегиды, изменяющие (ингибирующие) функции митохондрий, по-видимому, путем взаимодействия со свободными аминогруппами Смембранных} белков. К числу прямых механизмов относятся такие процессы, в ходе которых биогенные Сди- и полиЭамины непосредственно взаимодействуют с митохондриями, влияя на характер их функционирования посредством изменения поверхностного заряда мембран.

2. МОДИФИЦИРОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОНОАМИНОКСИДАЗ И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

Феномен качественного изменения субстратной специфичности мембраносвязанных МАО при стимуляции ПОЛ in vitro или при патологических состояниях организма, сопровождающихся накоплением продуктов ПОЛ был обнаружен давно (Gorkin et al., 1973-1985), воспроизведен в других лабораториях с использованием независимых подходов (Антипов и др., 1989; Wiesner et al., 1989). Молекулярной основой этого феномена, по данным экспериментов с высокоочищенныни МАО (Akopyan et al., 1971; Veryovkina et al., 1972; Moskvitina et al., 1976, Gorkin, 1983,1985), является окисление SH-групп фермента, однако сам механизм изменения субстратной специфичности окончательно не выяснен.

Сопоставление каталитических свойств МАО, модифицированных в мембраносвязанном и высокоочищенном состояниях выявило ряд различий, наиболее принципиальные из которых заключаются в следующем: СаЭ при изменении субстратной специфичности МАО in vivo или in vitro (в мембраносвязанном состоянии) «индуцированные^ активности как правило сопоставимы с активностью интактного фермента, измеренной с физиологическим субстратом; СбЭ «индуцированные» после очистки фермента активности МАО составляют не более 5-7У. от исходной (Gorkin, 19761983); СвЭ модификация каталитических свойств обнаружена у МАО, очищенных из тканей млекопитающих, которые содержат как обе формы фермента (печень крысы, Veryovkina et al., 1972; мозг быка, Moskvitina et al., 1976), так и преимущественно МАО Б (печень быка, Akopyan et al., 1971), а по данным ингибиторного анализа in vivo или in vitro изменение субстратной специфичности мембраносвязанных МАО предупреждают селективные ингибиторы МАО A (Goroshinsk&ya et al., 1977; Gorkin, 1979, 1985; Baumanis et al., 1981).

Это свидетельствовало в пользу важной роли самой мембраны в контроле и активности, и субстратной специфичности МАО.

2.1. Модифицирование мембраносвязанных моноаминоксидаз при стимуляции перекисного окисления липидов In vitro.

Стимуляция ПОЛ в мембранах митохондрий вызывает снижение активности МАО А и Б, сопровождающееся появлением качественно новых реакций дезаминирования,которые составляют 20- 50У. от скорости дезамини-рования серотонина в контроле. СТабл. 63

Таблица 6

Влияние индукторов ПОЛ на накопление налонового диальдегида (МДА) и дезанинирование анинов при инкубации с нитохондриями печени крысы

Добавки к среде Содержание Дезанинирование аминов

инкубации МДА Серотонин Глюкоэамин ФЭА

Без добавок

И-этилмалеимид 2+

Fe + аскорбат Fe ++ аскорбат + ДТТ

Ц-этилмалеииид, _ 2 +

Fe + аскорбат

100+4 100 + 1 243 + 9'

174 ±10Е

258 +18Е

в

б

100 + 6 73 + 4

72 + 6В

99+5

76 + 3

0 О

39 + 7Е

2+1 О

100 + 7 67 t 5 84+9

в

122 + 6е

51 + 3е

Результаты представлены в виде % по отношению к контрольным пробам,

инкубированным без добавок. После преинкубации с Н-этилмалеинидом.

митохондрии переосаждали, промывали в фосфатном буфере и инкубиро-2+

вали а Ге и аскорбатон. Дитиотрейтол (ДТТ) добавляли в среду инкубации вместе с индукторами ПОЛ. Остальные примечания как в Табл. 5.

Присутствие 1 м!1 дитиотрейтола мало влияет на выраженность ПОЛ Сво всяком случае на накопление малонового диальдегида), но полностью предупреждает ПОЛ-зависимое изменение каталитических свойств МАО СТабл. 63. 0,2 мМ Н-этилмалеимид (Н-ЭМ) ингибирует активность МАО А и Б на 25-30>:. Последующая стимуляция ПОЛ индуцирует дополнительное снижение только активности МАО Б, при этом появления глюкоз-аминдезаминазной активности не происходит.

Торможение индуцированных ПОЛ реакций дезаминирования исследованных азотсодержащих соединений селективнын ингибитором МАО А пира-зидолом (Рис. 1 ) согласуется с представлениями о вовлечении именно МАО А в процесс изменения субстратной специфичности (Gorkin, 1979, 1983, 1985). Избирательность эффекта пиразидола, как и его структурного аналога тетриндола (с циклогексильным заместителем в 8 положении кольца) обусловлена прочный, специфическим взаимодействием с активным центром МАО А, которое сохраняется даже после переосаждения митохондрий. Активность МАО Б мало чувствительна к этим ингибиторам.

Замещение метильной группы кольца пиразидола в 8 положении на элект-ронакцепторную нитрогруппу вызывает резкое снижение ингибиторного эффекта у этого производного только в отношении МАО А, практически не влияя на торможение активности МАО Б. % ЧЬ

(2) и глюкозамина (3 ) в контроле (А) и при стимуляции ПОЛ (В).

1/V 1/V10

Рис. 2. Кинетика дезаминлрования серотонина (1) и глюкозамина (2) при стимуляции ПОЛ (А) и ингибирование глюкозамином дезаминирования серотонина (В) в митохондриях печени крысы при стимуляции ПОЛ.

Кинетика дезаминирования серотонина и глюкозамина при стимуляции ПОЛ свидетельствует о том, что сродство МАО CAD индуцированному субстрату существенно ниже, чем к физиологическому субстрату МАО А (серотонину) СРис. 23. При этом глюкозамин (но не глюкоза) действо-

вал как неконкурентный ингибитор окисления серотонина. Отсутствие чисто конкурентных взаимоотношений между этими соединениями предполагает вовлечение дополнительного участка молекулы МАО во взаимодействие с «индуцированнымил субстратами.

Стимуляция ПОЛ помимо изменения каталитических свойств увеличивает протеолитическую инактивацию МАО; чувствительность модифицированной МАО А с глюкозамином в качестве субстрата к протеолизу значительно выше, чем активности МАО А и Б, измеряемые соответственно с серотонином и ФЗА СТабл. 73. Предварительная обработка митохондрий Н-ЭМ или добавление ДТТ вместе с индукторами ПОЛ предупреждала появление глюкозаминдезаминазной активности, но и снижала (ДТТ) (примерно в 1,2) ПОЛ-зависимое увеличение чувствительности к протеолитичес-кой инактивации МАО А (Табл. 7). В этих условиях эффект трипсина на МАО Б либо не изменялся (ДТТ), либо был несколько увеличен(Н-ЭМ).

Таблица 7

Влияние ПОЛ на чувствительность МАО к трипсинолизу

Условия опыта Остаточная активность (%) после инкубации с трипсином

МАО А МАО Б

50 мкг/мл 100 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл

Контроль ПОЛ П0Л+ И-ЭМ

Й-ЭМ, ПОЛ ПОЛ + ДТТ

96+7 64 + 6 13 + 1 62+4 65+2 77 12

*

87+3 54+1 8 + 5 67+3 59+3 67+6

105 + 11 65+3

*

51 + 73 +

88+2 56+3

50+3 60 +12

Результаты представлены в виде % исходной активности МАО А и Б в ин-тактных митохондриях с субстратом серотонином или ФЭА, соответственно. + - измерение активности с глюкозамином. Звездочкой указана значимость различий с эффектом ПОЛ.

Поскольку МАО является интегральным белком внешней мембраны митохондрий, его контакт с трипсином может происходить, главным образом, на границе раздела водной и мембраной фаз. Увеличение протеолитичес-кой инактивации, очевидно, отражает увеличение таких контактов между трипсином и МАО. С учетом более выраженной инактивации дезаминирова-ния глюкозамина и неконкурентном торможении им дезанинирования серотонина, это означает, что ПОЛ, способствуя окислению БН-групп, приводит к появлению такого конформационного (трипсинчувствительного)

состояния МАО А в мембране, при котором становится возможным взаимодействие фермента с "потенциальными" субстратами. Блокада БН-групп (или их восстановление) обеспечивают трипсинрезистентное состояние МАО А в мембране (даже в условиях стимуляции ПОЛ), при котором, очевидно, вызаимодействие фермента с "потенциальным" субстратом не происходит.

2.2. Модифицирование моноаминоксидаз при интоксикации паракватом.

Исследования механизмов МПТП-индуцированного паркинсонизма и терапевтического эффекта депренила при этом заболевании привлекли интерес к патогенетической роли окислительного стресса, характеризующегося избыточным образованием в организме активных форм кислорода. Ранее было установлено модифицирование каталитических свойств МАО при интоксикации кислородом (СогозЫпэкауа et а1.., 1977). Влияние эндогенного окислительного стресса на субстратную специфичность МАО изучено не было.

По современным представлениям механизм интоксикации паракватом обусловлен развитием окислительного стресса в органах мишенях (легких, головном мозге). Сначала паракват принимает электроны с флаво-протеина микросомальной НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы, а образующийся радикал параквата затем реагирует с кислородом с образованием супероксид-аниона (НаШмеИ, 1989).

Введение низких доз параквата (1 мг/кг) в течение 10 дней оказывает выраженное влияние на дезаминирование азотсодержзщлх соединений при инкубации с митохондриями мозга и легких крыс (Табл. 8). Помимо некоторого (на 17-40%) снижения скорости дезаминирования физиологических субстратов МАО (серотонина, триптамина, тирамина) происходило выраженное увеличение (или появление) качественно новых реакций дезаминирования глюкозамина, ГАМК, путресцина и лизина, свойственных модифицированной МАО (А). Существенное возрастание пут-ресцин-дезаминазной активности, по-видимому, особенно важно в легких если учесть, что именно путресцин блокирует активный транспорт параквата гранулярными пневмоцитами и, возможно, другими типами клеток легочной ткани (На1Ние11, 0и^ег1с1ёе, 1989).

Введение вместе с паракватом восстановителей тиосульфата и аскорбата или антиоксиданта дилудина не только нормализовало реакции дезаминирования в митохондриях органов-мишеней (легкие, мозг), но и уменьшало смертность животных при краткосрочном воздействии высокой дозы параквата (25 мг/кг в течение 3 дней) со 100%, до 60% (р<0,025).

Таблица 8

Влияние дилудина (ДЛ). аскорбата (АС) и тиосульфата (ТС) на дезами-нирование азотсодержащих соединений при интоксикации паракватон (ПР)

Соединение Группы экспериментальных животных

(орган) Контроль Паракват ПР + ДЛ ПР + АС ПР + ТС

нмоль/45 мин на 1 иг белка

А. Митохондрии легких

Серотонин 160 + 10 100^ 10Г 150 + 10 140 + 10 1501 20

Триптамин 130 + 20 90+ 106 120 + 10 120+ 10 120±. 10

Тирамин 180 + 20 150+ 10б 170+ 10 160 + 20 1701 20

Глюкозамин 70+ 10 160 + зог 120 + 10 110+ 10 110 + 20

ГАМК 130 + 10 330 + зог 180 + 10 170 + 20 1701 20

Путресцин 0 110+ 20Г 0 0 0

Ь~Лизин 0 100^ 20Г 0 0 0

Б. Митохондрии мозга

Серотонин 280 + 10 170+ юг 290 + 20 240+ 20 270 + 20

Триптамин 180±. 20 90£ 10Г 1601 20 150+ 20 140 + 10

Тирамин 330 + 10 200 + 10г 280 + 20 290+ 10 300+ 20

Глюкозамин 80 + 10 160+ 10Г 110 + 10 100+ 20 100 + 10

ГАМК 80+ 10 210+ юг 120+ 20 140+ 10 10+ 10

Путресцин 0 100+ юг 0 0 0

Ь-Лизин 0 80+ юг 0 0 0

Паракват (1 мг/кг, п.о. ), дилудин (40 иг/кг, п.о. ), аскорбат (100 мг/кг,п.о. ) и тиосульфат (500 мг/кг, в/в) вводили в течение 10 дней. Буквами указана значимость различий с контролем (как в Табл. 5).

Ь2,5% (р<0,025) и 89?;, соответственно. Последнее, по-видимому, свидетельствует в пользу того, что нарушение реакций дезаминирования моноаминов (и других азотсодержащих соединений) является патогенетически важным механизмом при интоксикации паракватом, а их нормализация способствует более благоприятному течению заболевания.

2.3. Роль моиоаминоксидаз в химических механизмах эпилепсии.

Стимуляция ПОЛ в во время развития эпилептиформной активности уже установлена СНикушкин, Крыжановский, 19873.

Аудиогенный судорожный припадок у крыс Крушинского-Молодкиной

СКМЗ характеризуется накоплением продуктов ПОЛ в синаптосомах и не-синаптических митохондриях больших полушарий мозга и низкой активностью МАО А Ссубстрат: серотонинЗ и МАО Б Ссубстрат: ФЭАЗ СТабл. 93. Соотношение скоростей дезаминирования насыщающих концентраций ГАМК:серотонин и глкжозаиин:серотонин, отражающее особенности субстратной специфичности МАО А, возрастает в синаптосомах от О и 0,01 до 2,62 и 1,08 соответственно, а в митохондриях от 0,06 и 0,07 до 2,10 и 1,03 соответственно.

Таблица 9

Дезаминирование азотистых соединений и содержание МДА в синаптосомах л митохондриях мозга крыс Крудшнского-Молодкиной (КМ) при зпилепти-формном судорожном припадке максимальной интенсивности

Условия опыта Содержа-

(группа животных) ние МДА

Дезаминирование Серотонин ФЭА ГАМК

Глюкозамин

Синалтосоны

Контроль (Еистар) 1.8+0,04 7,0^0,5 4,5+1,0

Припадок (КМ) 2,6+0.1 1,3+0,03 0,6+0,2

р <0,001 <0,001 <0,05

Митохондрии

Контроль (Вистар) 1,3+0,04 8,2+0,9 4,7+0,9

Припадок (КМ) 3,6+0,1 3,1+0,2 1,2+0,3

р <0,001 <0,01 <0.05

0 0.1+Р.1

3,4+0,2 1.4+0,1 <0.001 <0.001

0,5+0,2 0,6+0,2 6,5+0,1 3,2+0,2 <0,001 <0,001

Содержание МДА выражено в нмоль/мг белка. Дезаминирование - нмоль/ мин на 1 мг белка.

Сопоставление кинетики дезаминирования ГАМК и серотонина, катализируемого модифицированной МАО А митохондрий мозга крыс-эпилептиков, выявило более высокое сродство фермента к серотонину (каж. К =

01

0,33 нМ). чем к ГАМК (каж. К =1,67 мМ 3. ' т

Исследование кинетических свойств нитохондриальных МАО с

физиологическими субстратами показало, что величины кажущихся К для

м

МАО А и МАО Б, неразличимы у крыс Вистар и КМ, а основные изменения

обнаружены для V . Увеличение глюкозаииндезаминазной активности

шах . • 14

МАО САЗ и соотношения скоростей дезаминирования 0,1мМ С-глюкоз-1 4

амина: С-серотонина возрастало с усилениен интенсивности судорог (от 0,08 у крыс КМ в покое до 0,51 при аудиогеннои припадке иакси-

иальной интенсивности).

Активность МАО А и Б в митохондриях мозга крыс Вистар устойчива к ограниченному протеолизу СРис. 33. Инкубация митохондрий мозга крыс КМ после аудиогенного припадка максимальной интенсивности сопровождается более выраженной инактивацией МАО по сравнению с контролем. При использовании глюкозамина в качестве субстрата активность модифицированной МАО САЗ после обработки митохондрий трипсином ока-зывыается сниженной в еще большей мере, чем при дезаминировании физиологического субстрата серотонина.

% МАО-А | % МАО-В

МАО-А || % МАО-В

Рис. 3. Увеличение чувствительности МАО митохондрий мозга крыс при аудиогенной эпилепсии <1) и кроликов (II) при черепно-мозговой травме.

По-видимому, увеличение чувствительности к трипсинолизу является общин свойством модифицированных МАО-А независимо от фактора, провоцирующего это явление. Во всяком случае развитие патохимических сдвигов в головном мозге кроликов при черепно-мозговой травме сопровождается помимо стимуляции процессов ПОЛ (Демчук и др., 1993) модифицированием каталитических свойств МАО (Акопян, Промыслов, 1984) и увеличением их чувствительности к трипсинолизу.

Таким образом, приведенные результаты согласуются, с рассмотренными выше данными о том, что именно трипсинчувствительное конфор-мациснное состояние МАО А обуславливает появление качественно новых реакций дезаминирования.

Предварительное введение крысам селективного ингибитора МАО А пиразидола снижает интенсивность аудиогенных зпилептиформных судорог и удлиняет латентный период до их возникновения (Табл. 10).

Таблица 10

Влияние препаратов пиразидола на развитие аудиогенных зпилептиформ-ных судорожных припадков у крыс Крушинского-Молодкиной

Экспериментальная Число Доза Время пос- Лаг-период Интенсивность группа живот- ле введе- (сек) припадка

ных ния (мин) (Ус-1- баллы)

Интактные крысы КМ 29 -

Пиразидол 6 50

Пиразидол 6 50

Растворимый пиразидол 6 5

Растворимый пиразидол 5 50

Растворимый пиразидол 6 50

- 3, ,6+0,5 4.0

60 6, ,3+2,8 3.0

90 6, ,6+2.2 2.5

40 3, ,3+0.9 4,0

40 3, ,8+0,9 4,0

90 6, ,7+0.в6 1 ,5

Доза препаратов, которые вводили внутрибрюшинно в растворе диметил-сульфоксида, выражены в мг/кг. Введение растворителя интактным крысам не влияло на интенсивность припадка.

Оптимальная доза препарата предотвращает появление ГАМК-дезами-назной активности и усиливает торможение серотонин-дезаминазной активности МАО А при аудиогенной провокации эпилептиформного припадка (Табл. 11).

Таблица 11

Влияние предварительной инъекции пиразидола (50 иг/кг. в/Бр за 90 мин) на катализируемое митохондриальными МАО мозга крыс Крушинского-Молодкиной (КМ) дезаминирование азотистых соединений

Зксперименталь- Пиразидол Дезаминирование

ная групп Серотонин ГАМК ФЗА

Крысы Вистар - 7,6+1.0 0,5+0.1 3,2+0,3

Крысы КМ (интенсивность припадка 4,0) - 2.5+0,3 3,1+0,6 1,2±0.1 Крысы КМ (интенсивность припадка 2,5) 50 мг/кг 0,3±0,1 0,07+0,04 0,7+0,2

Звездочкой указана значимость различий в активности МАО у крыс КМ с и без введения пиразидола (р < 0,05-0,01 ). Активность выражена в нмоль/ мин на 1 иг белка.

По сравнению с крысами Вистар крысы КМ характеризуются повышенным уровнем катехоламинов в головном мозге при снижении содержания их метаболитов (Долина, 1982). Такое распределение тканевого содержания субстратов и продуктов обмена моноаминов наблюдается при низкой активности МАО (Горкин, 1981) и согласуется с нашими результатами. Действие пиразидола на МАО А высоко специфично, его влияние на другие процессы [обратный захват нейромедиаторов (Машковский и др. , 1983; активность фосфодиэстераз циклических нуклеотидов] проявляется при гораздо более высоких концентрациях. С учетом этих данных фармакологический антиконвульсивный эффект пиразидола можно объяснить, в первую очередь, предотвращением модифицирования МАО во время развития эпилептиформного припадка.

Среди других исследованньк соединений выраженной антиконвульсивной активностью обладал изатин, введение которого в дозе 80 мг/кг (но не 10 мг/кг) снижало интенсивность судорожных припадков с 4 усл. баллов до 2.5-3. В аналогичных условиях указанная доза изатина значительно повышала содержание серотонина в мозге крыс с увеличением соотношения серотонин/5-гидроксииндолуксусная кислота, которое свидетельствует в пользу торможения активности МАО (A) in vivo (Horman, Mclntyre, 1990) и согласуется с нашими данными. Недавно изатин был обнаружен в тканях и биологических жидкостях человека и животных (Glover et al., 1983, 1991), где он, как предполагалось.

является основным компонентом ингибитора МАО трибулина, которому придается важное значение в эндогенной регуляции каталитической активности МАО (Glover, Sandler, 1990; Yuwiller, 1989; Glover et al., 1991; Hamaue et al., 1992).

3. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ТРИБУЛИНА - ЭНДОГЕННОГО ИНГИБИТОРА МАО.

Трибулин - эндогенный небелковый ингибитор МАО и связывания бензодиазепиновых рецепторов (Sandler, 1982) - был обнаружен в тканях и биологических жидкостях млекопитающих и человека (Glover et al., 1991; Glover, Sandler, 1993). Содержание трибулина возрастает при различных видах стресса и состояниях тревоги, что имеет важное регуляторное значение. Например, в условиях, характеризующихся повышенным образованием трибулина, введение антидепрессанта фенелзнна крысам вшивает более слабое торможение активности МАО мозга по сравнению с контролем (Clow et al., 1989). Торможение МАО трибулином может обуславливать предохранение норадреналина от биологической инактивации и способствовать поддержанию высокого артериального давления у крыс со спонтанной глпертензией (Hamaue et al., 1992). Химическая природа трибулина окончательно не установлена, поэтому о его содержании обычно судят по ингибированию активности МАО тест - систем, содержащих в качестве субстрата тирании (Glover et al., 1980; Leiaoine et al., 1990; Bhattacharya et al., 1991), который является общим субстратом для обоих типов МАО (Tipton et al., 1987).

В 1988 году Glover et al., показали, что одним иэ компонентов трибулина мочи является изатин (индол-дион-2,3), который, как оказалось, не может объяснить всей биологической активности свойственной трибулину (Glover et al., 1991). Изатин селективно ингибирует МАО Б (Glover et al., 1991), s то время как частично очищенный трибулин в равной мере тормозил активность и МАО А, и МАО Б (Elsworth et al, 1986). Кроме того, изатин, в отличие от трибулина, является слабым ингибитором связывания бензодиазепиновых рецепторов (Glover et al., 1991). Все это предполагало существование других компонентов трибулина, отличных от изатина.

С учетом наших данных об антиконвульсивном эффекте селективного ингибитора МАО-А пиразидола и высоких доз изатина, которые тоже вызывают торможение МАО-А, исследование содержания компонентов трибулина именно на экспериментальной модели эпилепсии представлялось особенно важным.

3.1. Увеличение МАО А-ингибиторного компонента трибулина при аудио-генной эпилепсии у крыс Крушинского—Иолодкиной.

Трибулин мозга крыс Бистар обладает преимущественным ингибиро-ванием МАО Б (-32+5%) по сравнению с МАО А (-20+5%) (Таблица 12). Слабые эпилептиформные припадки не влияли на ингибирование МАО А и МАО Б трибулином. Эпилептиформные припадки у крыс, реагирующих на аудиогенную провокацию двумя волнами возбуждения ( с интенсивностью второй волны в 3 условных балла) вызывали существенное увеличение в 1,9 раза МАО А ингибиторного компонента, в то время как увеличение МАО Б ингибиторного компонента трибулина было выражено в меньшей степени (1,4 раза). Это сопровождается и увеличением соотношения ингибирования МАО А: МАО Б с 0,52 до 0,65. Наиболее интенсивные аудиогенные припадки вызывали еще большее увеличение МАО А-ингибиторного компонента без существенных изменений (по сравнению с предыдущей экспериментальной группой) МАО-Б-ингибиторного компонента трибулина.

Таблица 12

Активность триёулина в мозге крыс Крушинского-Молодкиной (КМ) при аудиогенных судорожных припадках различной интенсивности

Группа животных Интенсивность Активность трибулина Соотношение

припадков (,% ингибирования/г ингибирования

(усл. баллы) сырого весы ткани ) МАО А: МАО Б

МАО А МАО Б

Контроль (Вистар ) 20+5 32+5 0,57+0, ,09

Крысы КМ 0-2 20+1 38+1 0,52+0, ,03

Крысы КМ 2,5-3 37+2** 56+2** 0,65+0, ,03*

Крысы КМ 4 50+41 58+2*» 0,87+0, ,15*

* - Р < 0,01 по сравнению с контролем; # - р < 0,05-0,01 по сравнению с крысами КМ, реагирующими на аудиогенную провокацию слабыми судорогами (0-2); + - р < 0,05 по сравнению с крысами КМ, реагирующими на аудиогенную провокацию двумя волнами возбуждения (2,5-3). В каждой группе по 4-8 животных.

Существование МАО А-ингибиторного компонента трибулина было подтверждено недавно в независимых экспериментах A.Clow et al.,

обнаруживших избирательное увеличение МАО А-ингибиторного компонента трибулина в моче больных с различными видаки депрессий, которые получали сеансы электро-шоковой терапии. Содержание изатина при этом оставалось неимзменным (Clow et al., 1993). Разделение частично очищенного трибулина мочи человека с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии давало несколько пиков, избирательно ингибиру-ющих МАО А, однако их структура не была идентифицирована. Одним из возможных путей образования ИАО-А ингибиторного компонента трибулина Glover et al. (1991) рассматривали продукты обмена изатина.

3.2. Роль Н2°2 и ~пРодУииРУг">1их ферментов в метаболизме изатина.

Изатин, МАО Б-ингибиторный компонент трибулина, был обнаружен в биологических жидкостях и тканях млекопитающих несколько лет назад (Glover et al., 1968, 1991; Hatkins et al., 1990), и неудивительно, что пути его синтеза и деградации все еще неизвестны. Есть указания на то, что изатин может быстро метаболизироваться в печени (Glover, Sandler, 1993), однако конкретные механизмы ждут своего выяснения. Представлялось маловероятным, что деградацию изатина осуществляет некий еще неизвестный фермент, поэтому в качестве рабочей гипотезы естественно было предположить, что метаболизм изатина ножет катализировать фермент, обладающий гибкой субстратной специфичностью. С учетом известных данных о возможности модифицирования каталитических свойств и превращения ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу (Halli-well, Gutteridge, 1989), мы предположили, что именно ксантиноксидаза могла бы быть ферментом, ответственным за деградацию изатина. Это предположение подтвердилось частично (Таблица 13). Инкубация с ксан-тиноксидазой вызывало выраженное снижение содержания изатина в инкубационной среде только в присутствии физиологического субстрата гипоксантина. Снижение содержания изатина сопровождалось снижением ингибирования МАО Б. В тех же условиях уриказа, другой Н^О^-обра-зующий фермент, не оказывал влияния ни на содержание изатина, ни на ингибнрование МАО Б. Поскольку основное различие этих ферментов заключается в том, что только ксантиноксидаза образует H^Og с фоми-рованиен супероксид-аниона (Halliwell, Gutteridge, 1989), полученные данные свидетельствуют в пользу возможного вовлечения супероксид-аниона (и его образующих ферментов) в деградацию изатина.

Влияние Н^О^, на изатин, оцениваемое также по торможению МАО Б,

наминает проявляться при концентрации 300 мкМ и заметное снижение ингибнторного эффекта происходит при 3 мМ Н^О,. Лишь инкубацня стандартного раствора изатина с избытком Н_,0_ (б М) вызывает снижение

Таблица 13

уриказы и ксантиноксидазы на содержание изатина и вызванное им ингибирование МАО Б

влияние Н^О

Среда инкубации

Содержание изатина Ингибирование МАО Б (мкг) (П=2) (%)

А. Изатин

Изатин + Н202 30 мкМ

Изатин + Н202 300 мкМ

Изатин + Н202 3 мМ

Изатин + Н„0_ 6 М 2 2

7,0

не исследовали не исследовали не исследовали 2,0

73+2 68+2 63+4** 20+3** -(9±.7)**

<*) О) (3) (3) (3)

Б. Изатин 8,8

Изатин + уриказа (0,1 ед. ) 8,3 Изатин + уриказа (0,1 ед. )+

мочевая кислота (1 мМ) 10,0

75+1 71+2

74+2

(3)

(4)

(6)

8,8

9,2

В. Изатин

Изатин + ксантиноксидаза (0.1 ед. ) Изатин + ксантиноксидаза (0,1 ед. )+ гипоксантин (1 мМ) 1,6 Изатин + гипоксантин (1 мМ) 9,0

56+3

46+1*

(3)

<3)

24+4** (4) не исследовали

После инкубации пробы экстрагировали в этилацетат и после выпаривания органической фазы под азотон растворяли в дистиллированной воде для последующего измерения содержания изатина и ингибирования МАО Б. В скобках - количество опытов. * - р <0,02; ** - р < 0,01 по сравнению с контрольными пробами, инкубированными без добавок, содержание изатина в 3,5 раза, сопоставимое с эффектом ксантинокси-дазной системы (Таблица 13). Анализ продуктов деградации изатина, экстрагируемых в этилацетат, выявил присутствие нескольких пиков, два из которых были идентифицированы как антраниловая и фталевая кислоты. Обе кислоты слабо ингибируют МАО А: 1 мМ антраниловая кис-

лота тормозит активность фермента на 27+1%, фталевая - на 37%±&%. Влияние на активность МАО Б оказывала только 1 мМ фталевая кислота -17+1%. Все это свидетельствовало против возможной роли обмена изатина в образовании МАО-А ингибиторного компонента трибулина. 3.3. Очистка и идентификация МАО А-ингибиторного компонента трибу-лина из мочи человека.

Схема очистки МАО-А ингибиторного компонента трибулина из мочи человека приведена на Рис. 4. На первых трех хроматографических стадиях очистки с использованием липофильного сефадекса ЬН20 и чистого метанола (Рис. 5), смеси метанол: хлороформ 80:20 и метанол: дихлорэтан 50:50 в качестве элюента происходит небольшое разделение МАО Б от МАО А-ингибиторного компонентоа, который элюиру-ется с колонки несколько позднее. Полное разделение МАО А- и МАО Б-ингибиторного компонентов было достигнуто на колонке с силикагелем с использованием смесми хлороформ: метанол в качестве элюента (Рис. 6). В этимх условиях МАО-А ингибиторньй компонент элюировался в первых фракциях (Ш 3-6), тогда как МАО-Б ингибиторный компонент удерживался на колонке до тех пор пока подвижную фазу не заменяли на метанол. Последующая дополнительная очистка двух фракций (НЗ и НН4-6, которые были объединены) на колонке с сефадексом ЪН^ с использованием в качестве элюентов смеси хлороформ: гептан: метанол (9:2:1) и дихлорэтан: гептан: метанол (8:5:2) соответственно, дала несколько фракций, которые характеризовались преимущественным ингибированием МАО А (Рис. 7).

Газ хроматографический-масс спектрометрический анализ фракций (Рис. 8), обладающих наиболее сильным и избирательным ингибированием МАО А выявил присутствие трех пиков с массами 180, 189 и 203 Да, соответственно (Рис. 8). ТИБ-дериватизация этих пиков выявила (помимо общего нона ТМЗ-фрагмента, имеющего соотношение касса:заряд т/г 73) присутствие фрагмент-ионов (т/г 179 > 252), (.т/г 202 > 261) и (л/г 202 > 275), которые являются специфичными для этилового эфира 4-гидроксифенилуксусной кислоты, метилового эфира индол-3-уксусной кислоты и этилового эфира индол-3-уксусной кислоты. В последнем случае нельзя исключить присутствия метилового эфира индол-3-пропио-новой кислоты, спектры которого практически идентичны таковым у этилового эфира индол-3-уксусной кислоты, а время удержания этих соединений на колонке различается незначительно (Рис. 9). Присутствие этилового эфира 4-гидроксифенилуксусной кислоты и метилового эфира

Рис. 4. Схема очистки трибулина из мочи человека.

индол-3-уксусной кислоты было обнаружено и при газ хроматографичес-ком-иасс спектрометрическом анализе другой фракции (Рис. 7), очищенной отдельно.

Рис. 3. Гель-фильтрация трибулина на сефадексе ЬН2д с использованием метанола в качестве злюзнта. Здесь и далее результаты представлены в виде X торможения активности МАО А (сплошная линия) и МАО Б (пунктирная линия) в собранных фракциях.

Рис. &. Разделение МАО-А и МАО-Б ингибиторных компонентов трибулина на силикагеле.

О 1 2 Э 4 6

7 в В 10 11 12 13

012346678010 11 12 13 Рис. 7. Гель-фильтрация фракций ИЗ (А) и НИ 4-6 (Б) (см. Рис. 6) на

снеси хлороформ:гептан: метанол и

сефадексе LH2Q с

использованием дихлорэтан:гептан:метанол, соответственно.

80 100 120 Hasi/Charqc

(26 6) Scan 9.471 min of Datai: AP1535.D

а зоооо

I 20000

Я 10000

S

130

44 у 11 У 103 / . , », , 203 '..............1.

60000 -40000 20000 -0

TIC of Data: API535.D

■ иУ'Н^ММ i «¡hii

llMM»' 'HiM'**1 '""M» '

10 15 _Time (win.)

20

2Б

Рис. 8. ции N6

Газ хроматографический-насс спектрометрический анализ фрак-(см. Рис. 7А ).

В

60000

40000

20000

а 0

* 80000

60000

V 40000

р 20000

4 0

• 2.5Е+5 й 2. ОЕ+5 •О 1.58+5 в 1.0В+5 0.5В+5 О.ОЕ+5

¿.010 mi.lV; о?" ",Ба1аТ,Ъ!р15Э5.Б1

119

У гъг

, ,1 I 105 И91 1. Т 1

Д..1 • 1 ' ■ ГЛ.. . Л

10» , 150 М»8»/СЪагд< (106) Бо»п 3.'225 га! П. ©Г"

200 "ЛЯ Б 35".

ч 202

44 73 ( 261

1 ., 130 145 186 1,

50 100 , 150 200 250

. Мавв/СЬагст«

<11Э> ¿олп 9.400 тт. '¿аЬа.- "АН'З'ЗЗ.О ' " '

в.ОЕ+5 С б. ОЕ+5 -4.ОЕ+5 -Я 2.02+5 -3 0 -ОЕ+5

150

_ Мава/СЬагдо

11.0 12.0

Рис. 9. Г аз хроматографический-масс спектрометрический анализ той фракции после ТМЗ-дериватизации.

' 1^8 ' х^в' 1Ьв ' хЬа " гёе ' гха ' ¿в ' ¡¿в'' У»' ' гЬв" йл" йа ' гЬа' йа" зЬа

"¿в " за"чЬ"' ¿Ь"'бЬ"' тё"' вЬ " зв"' хёв'' и» ' ¡¿в'' х5а ' не ' ¡¿в в

1п1о1у1-Э-*св1*1« С11Н11П02

" кк"1 й''' за1'' «¿в " " ьй"' ' Ы»'" 5в"' 1» ' Аз»¿в ' х»'' 1*в ' хм о 1н-|пао1»>э-ггь^мз1с *с14, м«*! ••'Ьег синхзног

И,»' 1К' ■ 1!» ".«>"гЬа''¿1» 1ЙЬ"Й<" Йа ' Щ,"Щ'¿Н. 'Ум''Йо''& ' .и1'' Ж 'Д» ' ЦУ'гЬ. Й» '& 'а»''к» 1 гй''гЬа 'Йв Йл аТО»

.1......

хЬ'" У» " эт"" чЬ"""ёв '*Ьа ' ' УГ"хЬа 1жл"хЬа"хкв

1Н-|п4о|0-Э-«е^1е «си, «гЬу! •«!«■> С12Н1ЭИ02

Ь''' «Ь ¿к'' 'ьЬЛ'л ив " и»''' ""хЬа' хУ»1' Ш' хея

«-Мь^гож»>1впы)»св41е лсЫ и» С13Н2Я0Э51

Рис, 10. Масс-спектры эфиров индолукаусноЯ и 4-гидроксифенялуксус-

НОЙ КИСЛОТ

о

1 45

8.0

9.0 10.0 Т 1д» .)

в в

МАО-Б

2

биологическими этиловый эфир

Рис. 11. Ингибирование активности МАО-А и эфирами, очищенныни из трибулина иочи человека: индол-З-уксусной килоты, 2- нетиловый эфир индол-3-пропионовой кислоты, 3- метиловый эфир индол-3-уксусной кислоты, 4- этиловый эфир 4-гидроксифенилуксусной кислоты. Сплошная линия - МАО-А, пунктирная - МАО-Б.

Все идентифицированные соединения избирательно (Рис. 10) инги-бировали МАО А (Рис. 11) со значениями 1С50 45-120 мкМ и совершенно не влияли (в диапазоне концентраций 0,1-100 мкМ) на связывание центральных бензодиазепиновых рецепторов. Ингибирование МАО Б этими эфирами было менее 50% даже при концентрации 1 мМ.

Использование вместо трибулина смеси растворов индолуксусной и индолпропионовой кислот при процедуре очистки не выявило образования эфиров, что свидетельствует против искусственного формирования идентифицированных МАО А-ингибиторных компонентов в ходе очистки трибулина. Кроме того при анализе цельной ночи были обнаружены ионы фрагментов, свойственные этиловым эфирам 4-гидроксиуксусной и индол-3-пропионовой кислот.

Пути образования идентифицированных МАО А-ингибиторных компонентов трибулина пока невыяснены. Сопоставление ингибиторных свойств трибулина из иочи обычных и стерильных крыс свидетельствует в пользу эндогенного образования большинства МАО А и МАО Б-ингибиторных компонентов трибулина, в отличие от компонентов трибулина. влияющих

на связывание центральных бензодиазепиновых рецепторов (Таблица 14).

Таблица 14

Активность трибулина ночи обычных и стерильных крыс

Исследуемый Единица параметр измерения

крысы

Обычные

Стерильные р крысы

МАО А

X ингиб'ирования 63.3+4-3 40.0+4.0

< 0,01

МАО Б

% ингибирования 65.0+6.1 37.8+7.2

< 0,02

Бензодиа-зепиновые рецепторы МАО А:

X ингибирования 33,8+4.3 14,5+3,5 < 0,01

соотношение

ингибирования 0,99+0.14 1,13+0,14 н.д.

МАО Б

Мочу животных разводили до постоянной концентрации креатинина 2,4 мМ, 1,7 мл образца (по 4 в каждой группе) экстрагировавли в этилаце-тат при pH 1,5. Органическую фазу высушивали досуха и растворяли в 50 мкл метанола и после добавления 700 мкл воды определяли активность трибулина. н.д. - различия статистически недостоверны.

Индолуксусная и 4-гидроксифенилуксусная кислоты (и соответствующие альдегиды), по-видимому, образуются из триптамина и р-тирамина, соответственно. Оба соединения могут влиять на процессы нейропере-дачи в центральной нервной системе, и нарушения их метаболизма обнаружены при некоторых психиатрических расстройствах (Jones, 1982; Boulton, 1934).

Недавно установлено, что деградация триптамина в мозге свиньи и крысы сопровождается образованием ранее неизвестного продукта (4R)-2-(3-индолилметил)-1,3-тиазолидин-4-карбоновой кислоты (Susilo et al., 1987, 1988). На первой стадии триптамин дезаминируется при участии МАО, на второй - индол-3-укскусный альдегид спонтанно взаимодействует со свободным L-цистеином, присутствующим в ткани мозга. Образовавшийся аддукт довольно селективно (IC5q=0,8 нМ) инги-бирует активность МАО А. Вполне возможно, что аналогичным образон происходит и образование компонентов трибулина, идентифицированных в настоящей работе..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование регуляции биогенными аминами функций митохондрий позволяет выделить рецепторные, метаболические и прямые механизмы их реализации. Рецепторная регуляция биогенными аминами активности ферментов митохондрий, по-видимому, имеет определенное значение при различных видах стресса. Во всяком случае предварительная (перед охлаждением животных) блокада /3-адренорецепторов анаприлинои (пропра-нололом) предупреждает стимуляцию ферментов митохондрий (Таблица 1), (Кулинский и др., 1986) и сокращает продолджительность жизни животных в условиях низких температур окружающей среды (Estler, Ammon, 1969; Плотников, Кулинский, 1983). Среди биогенных аминов, непосредственно взаимодействующих с мембранами митохондрий, наибольшее значение, пожалуй, имеет спермин, концентрация которого в митохондриях, даже освобожденных от полиаминов, связанных с внешней мембраной митохондрий, оценивается не ниже 33+7 мкМ (Solani, Tadolini, 1984). Концентрация моноаминов даже в резервных гранулах и везикулах (Johnson, 1988) меньше тех, которые оказывали в наших условиях МАО-зависимые и МАО-независимые эффекты на активность мембраносвя-занных ферментов митохондрий. С другой стороны, хорошо известно, что ингибиторы обратного нейронального захвата ионоаиинов (резерпин и др. ) вызывают при участии МАО быстрое истощение их эндогенных запасов в центральной и периферической нервной системе (Langer, 1976; Keane et al., 1979). Последнее, по-видимому, не исключает возможности кратковременного взаимодействия митохондрий с достаточно высокими локальными концентрациями моноаминов in vivo. Вовлечение МАО-зависимого механизма в регуляторные эффекты ионоаминов, также будет определяться возможностью их избирательного накопления в органах мишениях. В этой связи уместна аналогия с тканеселективной МАО-Б-зависимой биоактивацией МПТП, его избирательное накопление в стриапаллидарной системе связывают с высоким содержанием нейромела-нина, который в настоящее время считают рецептором МПТП (Wu et al., 1986; Amato et al., 1986, 1986).

Модифицирование каталитических свойств МАО рассматривают в качестве одного из ключевых элементов в развитии целого ряда церебральных патологий (Gorkin, 1983; Промыслов, 1984; Крыжановский, 1990). В условиях патологического состояния изменения свойств МАО характеризуются не просто снижением активности, но возникновением как бы новой, патологической системы, функционирование которой носит

явно дизадаптивный хзрактер и ножет играть роль патогенного фактора для организма, выходя из под контроля физиологических регуляторных систем (Крыжановский, 1990; Горкин, Овчинникова, 1993). Поэтому наши данные о взаимосвязи изменения каталитических свойств и появления трипсинчувствительного конформационного состояния иеибраносвязанных МАО (А) представляются особенно важными. По-видииону, конформацион-ные изменения молекулы МАО (А ) в мембране, вызванные окислением SH-групп, способствуют дезаминированию «потенциальных» субстратов, которые с интактным ферментом не взаимодействуют. В этом случае вовлечение модифицированных МАО (А) в метаболизм таких азотсодержащих как, например, медиаторные аминокислоты, будет определяться, главным образом, локальными концентрациями последних, которые в головном мозге довольно высоки (Раевский, Георгиев, 1986; Хухо, 1990). Важный практический интерес представляют наши данные о сохранении чувствительности модифицированных МАО (А) к действию селективных обратимых ингибиторов. Ранее было установлено, что окисление SH-групп МАО сопровождается резким снижением чувствительности ферментов к действию необратимых ингибиторов, таких, например, как паргилин, транилцил-рамин (трансамин) (Gorkin, 1976, 1983). Поэтому обратимые ингибиторы могут быть использованы и для лечения патологических состояний, при которых происходит модифицирование каталитических свойств МАО.

Изучение эндогенных ингибиторов МАО проводится во многих лабораториях мира (Glover et al., 1980; 1988, 1991; Egashira et al., 1989, 1993; Lemoine et al., 1990; Горкин и др., 1992). Однако химическая структура даже очищенных ингибиторов установлена далеко не всегда (Egashira et al., 1989, 1993), хотя достижения в выяснении строения некоторых соединений в ряду производных хинолина и тетра-гидроизохинолинов несомненны (Haoi et al., 1993). Идентификация МАО-А ингнбиторного компонента трибулина, впервые осуществленная в настоящей работе, по-видимому, может рассматриваться в качестве звена, связующего обмен следовых моноаминов (тирамина и триптамина) с образованием эндогенных ингибиторов МАО (Susilo et al., 1987, 1988). Результаты многолетних исследований указывают (Boulton, 1984; Dew-hurst, 1984), что низким содержанием в организме следовые амины «обязаны» высокой доступностью МАО. После ингибирования МАО содержание и обмен целого ряда этих аминов в мозге достигает уровня основных нейромедиаторов-моноаминов - катехоламинов или серотонина (Boulton, 1984; Blau, 1989). Обнаружение и идентификация структуры

новых компонентов трибулина, избирательно ингибирующих МАО, которые по своей биологической активности значительно выше многих производных хинолинов (Овчинникова, 1988; Naoi et al., 1993). а также других соединений эндогенного происхождения,имеет, по-видимому, имеет важное значение для понимания физиологической регуляции МАО. Хорошо известно, что органические кислоты, образующиеся после катализируемого МАО окислительного деэаминирования аминов, даже в высоких концентрациях (0,5-2 иМ) МАО практически не ингибируют (Sandler et al. , 1984). Поэтому образование достаточно эффективных ингибиторов МАО из продуктов деэаминирования моноаминов, имеющих, по-видимому, значительные локальные концентрации, может выполнять важные регулятор-ные функции, которые для многих ферментов описываются механизмом ингибирования продуктом реакции.

ВЫВОДЫ

1. Рецепторная цАМФ-зависимая стимуляция функций митохондрий биогенными аминами (катехоламинами) обусловлена модифицированием свойств внутренней мембраны, котороя сопровождается увеличением функциональной подвижности мембраносвязанных ферментов (трансгидрогеназа) или изменением взаимодействимя растворимых ферментов (НАД-изоцитратде-гидрогеназа) с внутренней мембраной.

2. МАО-зависимая регуляция мембраносвязагнных ферментов биогенными аминами определяется накоплением альдегидов - продуктов катализируемого МАО-А и МАО-Е окислительного деэаминирования аминов.

3. МАО-независимые эффекты биогенных аминов на активность мембраносвязанных ферментов митохондрий обусловлены прямым взаимодействием аминов с мембранами, которое вызывает изменением поверхностного заряда последних.

4. Стимуляция перекисного окисления липидов вызывает качественное изменение субстратной специфичности иембраносвязанной МАО-А и существенное увеличение чувствительности к ограниченному протеолизу. Два этих феномена взаимозависимы. Увеличением чувствительности МАО к протеолитической инактивации обусловлено изменением конформационного состояния фермента, а не его топографии в мембране.

5. Модифицирование каталитических свойств МАО (А) является патогенетически важный элементом в развитии эпилептиформных судорожных при-

падков и интоксикации паракватом в эксперименте.

6. Появление трипсинчувствительного конформационного состояния МАО-А, обнаружено при всех патологических состояниях, характеризующихся модифицированием каталитических свойств этого фермента.

7. Предупреждение модифицирования каталитических свойств МАО-А введением предварительным введениен ингибиторов удлиняет латентный период возникновения эпилептиформных судорог у крыс, вызванных аудиогенной провокацией и снижает их интенсивность.

8. Обнаружен ранее неизвестный компонент эндогенного ингибитора МАО трибулина, избирательно тормозящий МАО-А. Его накопление в мозге крыс с аудиогенной эпилепсией зависит от интенсивности судорожных припадков.

9. Из трибулина мочи человека выделен, очищен МАО-А ингибиторный компонент трибулина и идентифицирована его химическая структура. Этиловый и метиловый эфиры индол-3-уксусной кислоты и этиловый эфир 4-гидроксифенилуксусной кислоты, составляющие МАО-А ингибиторный конпонент трибулина, являются избирательными ингибиторами МАО-А, которые слабо тормозят активность МАО-Б и совершенно не влияют на связывание центральных бензодиазепиновых рецепторов. Получены данные против возможного искусственного образования идентифицированных эфи-ров в ходе очистки.

10. Биологические генераторы Нр0_, , образующие супероксид-анион, могут участвовать в деградации изатина - основного МАО-Б ингибитор-ного компонента трибулина.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кулинский В.И., Медведев А.Е., Труфанова Д.В. Влияние катехол-аминов, глкжзгона и цАМФ на активность энергонезависимой НАДСФЗ-трансгидрогеназы. Докл. АН СССР, 1982, Т. 264, Ко. 4, 1002-1004.

2. Медведев А. Е. , Труфанова Л.В. Регуляция сАМР окисления изоцит-рата в митохондриях. В сб. .- Циклические нуклеотиды. Тез. докл. 4 Всес. симпозиума, Минск, 1982, с.92-93.

3. Kulinsky V.I., Trufanova L.V., Hedvedev А.Е. Catecholamine control of enzymes involved in isocitrate oxidation of rat liver mitochondria. FEBS Lett. 1984, V.177, No.1, 143-145.

4- Медведев А.Е. , Кунцевич А.К. , Труфанова Л.В. , Голубенхо А.В. Значение внутренней мембраны в активации ферментов митохондрий сАМР. В сб.: Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных

реакций. Тез. докл. 5 Всес. синпозиуна, Рязань, 1985, с.163-164.

5. Кулинский В.И., Медведев А.Е.. Труфанова Л.В., Колпакова Т.Е. Изучение неханизнов регуляции окисления изоцитрата е митохондриях катехоламинавми, сАМР и кальцием. В сб.: Пробл. совр. биохимии и биотехнологии. Тез. докл. 8 Объед. симпозиума биохимических сообществ СССР-ГДР, Рига, 1985, с.96-97.

6. Медведев А.Е.. Труфанова Л.В.. Кулинский В.И. Регуляция активности митохондриальной трансгидрогеназы катехолаиинами. Биохимия,

1986, Т.51. Но.7, 1165-1173.

7. Кулинский В.И., Медведев А.Е., Кунцевич А.К. Стинуляция окислительных ферментов митохондрий при остром охлаждении и ее катехолами-новые механизмы. Вопросы мед. химии , 1986, Но.5, 84-88.

8. Медведев А.Е., Труфанова Л.В., Колпакова Т.В., Кулинский В.И. О взаимоотношении катехоланинового и метаболического контролей НАД-за-висимой изоцитратдегидрогеназы. В сб. : Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Тез. докл. Всес. симпозиума, Пущино, 1985, с. 13-14.

9. Медведев А.Е. Участие внешней поверхности внутренней нембраны митохондрий в формировании конформационных изменений молекулы трансгидрогеназы при активации катехолаиинами и сАМР. Биол. мембраны,

1987, Т.4, Но. 4, 426-431.

10. Кулинский В.И., Медведев А.Е., Воробьева Л.М. , Труфанова Л. В., Зобова Н.В. , Ковалевский А.Н. , Кунцевич А.К. , Зинич В.Н. , Петрова Л.Д. Катехоламиновая регуляция окислительных функций митохондрий печени мыши и крысы. В сб. : Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Материалы Всесоюзного симпозиума, Пущино, 1987, с.161-174.

11. Медведев А.Е., Труфанова Л.В. Роль внутренней мембраны в цАМФ-зависимой активации ферментов митохондрий катехоламинани. Труды 5 Межуниверситетской конференции «Биология клетки», Тбилиси, 1987, Часть 1, с.96-98.

12. Медведев А.Е. , Труфанова Л.В., Ольховский И.А., Безгачев В.Г. О возножнон механизме активации катехолаиинами НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из митохондрий печени крысы. В сб. : Моноамины и циклонуклеотиды: регуляция метаболизма и медицинское значение. Красноярск, 1987, с.24-34.

13. Труфанова Л.В. , Медведев А.Е. . Воробьева Л.М. , Ольховский И. А. О возможных механизмах сАМР-зависимой активации катехоламинами фернен-

тов митохондрий. В сб. : Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций. Тез. докл. 6 Всес. симпозиума, Петрозаводск, 1988, с.154-153.

14. Медведев А.Е., Кулинский В.И. Анализ некоторых возможных механизмов цАМФ-зависимого контроля окислительных ферментов митохондрий печени крысы. В сб. : Биофизические и биохимические аспекты гомео-стаза. Институт Физики СО АН СССР, Красноярск, 1989, с.102-112.

15. Медведев А.Е. , Труфанова Л.В. . Голубенке А.В., Кулинский В.И. Значение внутренней мембраны в реализации сАМР-зависимой активации ферментов митохондрий. Биохимия, 1990, Т.55 Но. 2, 225-231.

16. Кулинский В.И. , Медведев А.Е. , Зобова Н.В. , Колпакова Т.В. , Баранова 0.0. Роль внутренней мембраны и ионов Са^+ в активации ка-техоламинами и цАМФ окислительных ферментов митохондрий. В сб.: Физиология и биохимия медиаторных процессов. Тез. 5 Всес. конферен-нции, М. . 1990, с. 162.

17. Медведев А.Е., Райгородская Д.И., Горкин В.3. Об участии нембра-носвязанных моноаминоксидаз в дезаминировании некоторых нейронедиа-торов при стимуляции перекисного окисления липидов. Там же, с. 191.

18. Медведев А.Е. Регуляция биогенными аминами энергетических функций митохондрий. Вопросы мед. химии 1990, Т.36, Но.5, 18-21.

19. Медведев А.Е. Предупреждение лидокаинон и аминазинон цАМФ-зави-симой стимуляции активности некоторых окислительных ферментов митохондрий. Вопросы мед. химии. 1990, Т.36, Но. 6, 74-76.

20. Medvedev А.Е., Rajgorodskaya D.I., Gorkin V.Z. The role of lipid peroxidation (LPO) in the possible involvement of membrane-bound monoamine oxidase (MAO) in gamma-aminobutyric acid (GABA) and glucosamine deamination in rat brain. In: 8 General Meeting of European Society for Heurochemistry. Abstract. - Leipzig, 1990.

21. Gorkin V.Z., Medvedev A.E., Rajgorodskaya D.I.,, Fedotova I.В., Semiokhina A.F. Modification of catalytic properties of brain membrane-bound monoamine oxidases in audiogenic epilepsy. In: Constituent Congress of International Society for Pathophysiology, Moscow, 1991, p.19.

22.Райгородская Д. И. , Медведев А.Е. , Горкин В.3. , Федотова И.Б., Семиохина А.Ф. О модифицировании каталитических свойств митохондри-альных моноаминоксидаз при эпилепсии в эксперименте. Вопросы мед. химии. 1991, Т.37, So.2. 46-49.

23. Медведев А. Е. , Горкин В.3. Роль моноаминоксидаз в регуляции

энергетических функций митохондрий. Вопросы мед. химии, 1991, Т.37, Но. 5, 2-6.

24. Anokhina I.P., Gorkin V.Z,, Medvedev А.Е., Ovohinnikova L.N., Khristoluybova N.A. Studies on mitochondrial metabolic processes in offspring of alcoholized rats. 1. Evidence for altered activity and sensitivity to monoamine oxidase-dependent control by biogenic amines of some membrane-bound enzymes. Alcohol and Alcoholism, 1991, V.26, 559-565.

25. Медведев A.E., Райгородская Д.И., Горкин В.3., Федотова И.Б., Сеииохина А.Ф. Модификация каталитических свойств мембраносвязанных моноаминоксидаз мозга при перекисном окислении липидов. Нейрохимия, 1992, Т.11, No.1, 56-64.

26. Medvedev А.Е., Rajgorodskaya D.I., Gorkin V.Z., Fedotova 1.В., Semiokhina A.F. The role of lipid peroxidation in the possible involvement of membrane-bound monoamine oxidases in gamma-aminobutyric acid and glucosamine deamination in rat brain: focus on chemical pathogenesis of experimental audiogenic seizures. Molecular and Chemical neuropathology, 1992, V.16, 187-201.

27. Hedvedev A.E., Gorkin V.Z. Biogenic amines and monoamine oxidases in the regulation of activities of membrane-bound mitochondrial enzymes. Biogenic Amines, 1992, V.8, p.323-338.

28. Medvedev A.E,, Goodwin В., Clov A., Halket J., Glover V., Sandler M. Inhibitory potency of some isatin analogues on human monoamine oxidase A and B. Biochem. Pharmacol., 1992, V.44, 590-592.

29. Medvedev A.E., Gorkin V.Z., Fedotova I.В., Semiokhina A.F., Glover V., Sandler M. Increase of brain endogenous monoamine oxidase inhibitory activity (tribulin) in exper imenta.l audiogenic seizures in rat. Evidence for a monoamine oxidase A inhibiting component of tribulin. Biochem. Pharmacol.1992, V.44, 1209-1210.

30. Medvedev A., Gorkin V, Shvedov V, Fedotova 0, Fedotova I, Semiokhina A, Efficacy of pirlindole, a highly selective reversible inhibitor of monoamine oxidase type A, in the prevention of experimentally induced epileptic seizures. Drug Investigation, 1992, V.4, 501-507.

31. . Medvedev A.E., Gorkin V.Z. The effects of lipid peroxidation (LP0) on brain membrane-bound monoamine oxidases. Neurochem. Int. 1992, V. 21 (Suppl), D9,

32. Демчук M. Л. , Медведев A.E., Промыслов M.Ш. , Горкин В.3. Процессы

перекисного окисления липидов и активность сукцинатдегидрогеназы мозга при черепно-мозговой травме в эксперимента. Вопр. мед. химии 1993, Т. 39, Но. 2, 23-25.

33. Медведева М.В. , Федотова О.А. , Шведов В.И. . Белов А.А. , Медведев А.Е-, Бобрускин И. Д. Действие антидепрессанта пиразидола и его нит-роаналога на cGMP-зависимую фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов растворимой Фракции коры головного мозга человека. Биохимия 1993, Т. 58, No. 5. 789-798.

34. Medvedev А.Е., Kirkel A.Z., Kamyshanskaya N.S., Gorkin V.Z. Lipid peroxidation affects catalytic properties of rat liver mitochondrial monoamine oxidases and their sensitivity to proteolysis. Int. J. Biochem. 1993, V.25, Ho- 12, 1791-1799.

35. Medvedev A.E., Kirkel A.Z., Kamyshanskaya N.S., Axenova L.N., Moskvitina T.A., Gorkin V.Z., Andreeva H.I., Golovina S.M., Mash-kovsky M.D. Inhibition of monoamine oxidase by novel antidepressant tetrindole. Biochem. Pharmacol., 1994, V.47, Ho.2, 303-308.

36. Medvedev A.E., Gorkin V.Z. Endogenous stimulation of lipid peroxidation in brain increases proteolytic inactivation of mitochondrial monoamine oxidases. Int. J. Developmental Heurosoi 199^, V. 1$,,

н г, -ш -i6&.

37. Медведев A. E. Влияние адреналина на активность и функциональную подвижность трансгидрогеназы во внутренней мембране митохондрий. Вопр. мед. химии, 1994. X.40. Но. 1. 7-10.

38. Gorkin V.Z., Amanov К., Mamadiev Н., Medvedev A., Khuzhamberdiev М. The biochemical mechanisms of the toxic effects of some pyridine derivatives. 1. Study on the deamination of biogenic amines and other nitrogenous compounds in paraquat intoxication. Arch. Environment. Contamin. Toxicol. 1994, V. 2,6, 5b4 '&3J.

39. Горкин В.3., Медведев A.E. Моноаниноксидазы и их эндогенная регуляция в механизмах повреждения ЦНС при эпилепсии и некоторых других патологических состояниях ЦНС. Бюлл. экспер. биол. мед., 1994. Но. 2, 202.

40. Медведев А.Е., Труфанова Ji.В., Кулинский В.И. Роль внутренней мембраны митохондрий в механизме активации НАД-изоцитратдегидрогена-зы катехоламинами. Вопросы мед. химии, 1994, Т. 40, Но. 4.

41. Горкин В.З., Медведев А.Е. Моноаминоксидаза, В кн.: Белки и пептиды т. 1 (ред. В.Т.Иванов и В. М. Липкин), М. : Наука, 1994.

Автор глубоко признателен чл.-корр. РАМН, профессору В.З.Горкину за ценные замечания и постоянные внимание к этой работе, сотрудникам лаборатории биохимии аминов и других азотистых оснований НИИ Биомедицинской химии РАМН, кафедры высшей нервной деятельности МГУ, принимавшим участие в ее выполнении. Автор благодарен профессору В.И.Кулинскому за творческое содружество, положившее начало многолетнему интересу к исследованиям в области биогенных аминов и митохондрий. Автор благодарен директору Института Биомедицинской химии академику РАМН, профессору А.И.Арчакову за внимание и поддержку этой работы.

Author is grateful to professor Nerton Sandler, FRSM, for his strongest support, constructive criticism and helpful discussion of this work. Fruitful cooperation with Dr Vivette Glover and Dr John Halket and their collègues at Queen Charlotte's and Chelsea Hospital (London) is also appreciated.

В разное время проведенные исследования (помимо бюджетного финансирования) были поддержаны грантами:

1 ) в рамках программы "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" : (а) "Изучение роли аминоксидазной системы организма в патохимических механизмах алкогольной интоксикации и формировании зависимости к алкоголю" (по направлению 05, "Наркомании, токсикомании и алкоголизм"); (б) "Поиск психофармакологических лекарственных средств (анксиолитиков и антидепрессантов) на основе антимоноаминок-сидазного механизма действия новых классов химических соединений" (по направлению 07, "Фундаментальные и прикладные проблемы новых лекарственных средств");

2 ) в рамках программы "Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза" : "Молекулярно-графический анализ взаимодействия производных хинолина и индола с активным центром моноаминоксидаэ с целью поиска наиболее эффективных структур для создания новых классов психотропных лекарственных средств, избирательно блокирующих ферментативное окисление биогенных аиинов" (по направлению 04, "Компьютерное конструирование новых лекарственных средств" );

3 ) Российского Фонда Фундаментальных Исследований "Трибулин А новый ингибитор моноаминоксидаэ из мозга: очистка, идентификация структуры и путей метаболизма" (Но. 94-04-11531).

This work was also supported by two Royal Society Fellowships (1991,

г * А о

Q

о >.

а .

м ,

1 с >■

1 о •

! х 2

I ч

1. > £

; ч) J

I - <t

I И ■

i . H <t

M I X

ф К -rJ

] » ч

СП *

о .Ь

1 I -

; к

; > ¿

н ш

. Н О

Ф

И

а тз

о

й Ф

О ТЗ

с

« г2

С X

•Í с

! Ф

I - w

3

: ы * ■rJ

; « N й

fi

; <t

, > и

1 <й

: V ' ф ф

> ¿ , тз л Ù ■ ri N

: ф i ^ « >'

i *

a ГА С

С! С О

dl Ü

О fi d

ф S

en

3 к, Q

i!) ф

о

ь

и fi

а о X Ü1 А

О

" ® А '

. г О -J Ы Í "g

'О з

N о

>

0)

"3 ф

> s

-о Л!

С

СГ>

с

> ф

и

•ri

с

d >.

fe к

с >

а о о d

>

> о _

й J « и.

г1 О

С „

ф Ф

§ .5

о >

о

о

-о ф

Ь.

« * о ->

a -rf ?

ф

ф ТЗ

ф

Ï) 'О

Ф Ф

ь С

3 п

H fe

■ IJ

о

¿ О

Ф ja й и О 43

« 5

0) Ф

• rf ti

tJ. ф

- -è

ft n ¿i ®

о с

ф' о о

> s

б

с

.»J

А

о

■о

л

ф гл

с

ф

о о

43

э tí

а

>

Ф

•а

X С

о ■ г*

Í.

ф

а

1 с £

ф ш

Ci

О О

Í. А)

тз d

^ w

Ф

£

Ф о fi h

- §

^ Í < 13

ö .

t û 2 а

ф X

73

■г с ф о л;

О S

ф о ф

¿I) ф

- К л-

S ф

> о t-ф

О

й И

Ï ^ d о

43

с 5

ф

■а

у. о

ф а

> „

® t

xi ®

Ф

> 2

^ -о

I >

л л

N N

ст>

с .

■Ö 2

3 fi

и