Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние некоторых производных имидазола и пиримидина на экспериментальный атеросклероз у кроликов и метаболизм холестерина в культивируемых гепатопитах и макрофагах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых производных имидазола и пиримидина на экспериментальный атеросклероз у кроликов и метаболизм холестерина в культивируемых гепатопитах и макрофагах"

Г 5 ОД

$ я МП РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ДАУТОВА ГУЗЕЛЬ СИЕЕНЕВНА

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИМИДАЗОЛА И 1ШШВДИНА НА ЗКСПЕИШЕНТАЛЬШЙ АТЕРОСКЛЕРОЗ У КРОЛИКОВ И МЕТАБОЛИЗМ ХОЛЕСТЕРИНА В КУЛЬТИШРУВИХ ГЕПАТОШГГАХ И МАКРОФАГАХ

ОЗ. 00 04 - Биохимия 14. 00. 25 - Фармакология

I

■ АВТОРЕФЕРАТ

диссертанта? на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа, выполнена в лаборатории' куль.тур клеток и тканей Кардиологического Научного Центра РАМН.

Научный" руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

кандидат медицинсхих наук, Косых В.А.

доктор мед. наук, профессор, чл.-корр. РАМН Репин B.C. кандидат химических наук, 5орховская Т.И. доктор медицинских наук, профессор Чичканов Г.Г.

Ведущее учреждение: Российский научный центр профилактической медицины МЗ РФ. „

//

Защита состоится 1995 года в часов на заседании

специализированного ученого совета К 001.22.02 в Кардиологическом Научном Центре РАМН по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического Научного Центра РАМН.

Я

Автореферат разослан ".. . £№¿'1.994 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических нау

Венгерова Т.И.

ош шжшвгтш. гавоты

4$хтквяывоезс& джяа». Пьиск новых фармакологических препаратов антиатеро-склеротйчесхого действия - одна из основных роблем, от решения которой зависит успешное лечение и профилактика атеросклероза. Успехи, достигнутые з изучении молекулярный, механизмов, лежащих в основе атврогвнеэа, создают основа для поиска яояъвс классов соединения, которые, влияя на те или иные этапы метаболизма холестерина в организме, способны снижать риск заболевания атеросклерозом. Большинство лекарственных средств, используемых для лечения атеросклероза и других заболеваний атеросжлеротической этиологии, направлены на коррекцию нарушений обмена холестерина и снижение содержания холестерина в крови (Thompson, 1989). Вместе с тем, развитие атеросхлеротическоя бляшки зависит не только от увеличения содержания холестерина и триглицеридов крози, но также и от многих других процессов, в том числе - клеточных реакция, развивающихся в тхани сосудистой стенки (Aqel et al.,1984; Boss, 1986). В этой связи остается актуальной проблема поиска новь... антиатерогенных препаратов с прямым воздействием на метаболизм холестерина в сосудистой стенке и изучения механизмов их действия.

Уже обнаружены соединения, препятствующие накоплению липидов в моноцитах-макрофагах (антио сиданты, ингибиторы АХАТ) и ингибирующие (омега-3 жирные кислоты, антагонисты лейкотриена-1) метаболическую и функциональную активность клеток сосудистой стенки (Davidson, 1993). Как было показано во многих исследованиях, к этой группе соединений можно отнести некоторые производные имидаэола (Rueker, 1988; Billheimer et al.,1991; Harris et al.,1992; Kimura et al.,1993) и пиримидина (Larsen et al.1991). Проведенный э ИОХФ им.A.E.Арбузова синтез новых имидаэольных и пиримидиновых производных, представляющих интерес для фармакотерапии атеросклероза, и обусловил выполнение этой работы.

Для оценки антиатеросхлеротической активности соединения в работе использовался комплексный подход, заключавшийся: а) в изучении соединений как in vivo, так м in vitro; б) исследования проводились на первичной культуре гепатоцитов - клетках отвечающих за развитие гиперхолестеринемии. а также на макрофагах - основных клетках сосудистой стенки, вовлеченных в t рмирование атеросклеротичесхого поражения.

Пядь и задачи ипплвппипиия. Цель настоящей работы состояла в выяснении эффектов известных (цимвтидин)' и новых производных имидаэола и пиримидина на развитие гиперхолестеринемии и атеросклероза у кроликов, и метаболизм холестерина в гцпатоцитах и макрофагах. В задачи исследования входило:

1) изучить влияние известного производного имидаэола, циметидина (1-циано-2-метил-3[2-(метилимидаэол-4-ил)-метилтиоэтил}-гуанидин) и норосинтрзирооанного производиого имидазолсульфоновой кислоты, 2-имидазолил-пропансульфоновой ' кислоты (С-1273), на развитие гиперхолестеринемии и индекса атеросклеротичекого поражения (ПАП) а аорте кроликов^ содержавшихся на корме, обогащенном холестерином;

2) оцен;. .~ь изменения липидного состава ткани аорты и печени у кроликое с алиментарной гиперхолестеринемией в условиях длительного применении С-1273;

3) изучить эффекты С-1273 на биосинтез липидов, секрецию желчныэ кислот, связывание ^^I-меченного ЛНП культивируемыми. гепатоцитам» кролика; исследовать влияние С-1273 (и других производных имидазолсульфоновой кислоты) на скорость этерифихации и синтеза холестерина i культивируемых макрофагах;

4) изучить влияние производного пиримидина - хсимедон! (Ы-(2-гидрохсиэтил)-4,6-диметил-дигидропиримидон-2) на развитие гиперхолестеринемии и ИАП в аорте кроликов с алиментарно!

гипзрлнпидемией;

5) исследовать влияние ксимедона на биосинтез липидов» ЛНП-рецепторный эндоцитоэ и секрецию аполмпопротеина В и желчных кислот а культивируемых гепатоцитах кролика; изучить влияние ксимедона на некоторые показатели яипидного обмена э культивируемых макрофагах. Щщщи&Е и^ямзяа рабптм, 3 работе впервые показано, что новосинтезиро-ваннов сульфированное произаодное имидазола - °-имидазолилпропан-2-сульфокислота (С-1273) оказывало антиатеросжлеротическия эффект у кроликов с экспериментальным атеросклерозом, избирательно влияя на метаболизм холестерина в макрофагах.

Как и в случае-с производными имидазола, показана антиатерогенная активность ксимедона - производного пиримидина, на экспериментальной модели атеросклероза у кроликов и на культура гепатоцитов и макрофагов Л774. Выявлен как гиполипидамический эффект этого препарата, так и значительное сииление ИАП в аортах гиперлипидемических кроликов. Гилолипидемичвскик эффехт при этом не связан с влиянием ксимедона на синтез холестерина и его эфиров в гепатоцитах и реализуете., не на уровне метаболизма холестерина а клетках печени. Антиатеросклеротичес-кое действие ксимедона, по-видимому, ре-пиэуется на уровне сосудистой •стекяи.

Двадоднуяедоа л дваатическо.а гш^чанив рябпти. На примере прс зводных имидазола и пиримидина, показана информативность использования комплексного подхода в поиске новых антиатерогенных (гиполипидемических и антиатеросклеротических) соединений. Установлен", что для обнаружения • органа мишени и возможных побочных эффектов, необходимо проведение комплексного исследования на основных органах, вовлеченных в обмен холестерина. Полученные ре-.льтаты показали перспективность ^альней-

/

шего изучения производного имидазолсульфоновой кислоты С-1273 с целью создания новых эффективных 'препаратов антиатерогенного действия.

Обнаружанныя нами комбинированный гипохолестеринемический и" антиатеросклеротическия эффекты ксимедона, позволяет рассматривать его как потенциальный антиатеросклеротическия препарат.

Апъабямия руйпуыг Научные результаты представленные в диссертации были должены на 62-й конференции Европейского Общества по изучению атеросклероза (Иерусалим. 1993). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре в Кардиологическом научном центре РАМН (Москва, 1994). Структура и пйьим |^яйг>ты. Диссертация состоит из разделов: "Введение",

"06лор литературы", "Заключение", "Материалы и методы",. "Результаты",

■ - . t "Обсуждение результатов", "Выводы" ,•"Список литературы". Обьем работы

110 страниц машинописного текста. Содержит 7 рисунков и 17 таблиц.

Список литературы включает 130 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты in vivo проводились на кроликах породы Шиншилла. Для стандартизации опытов из обвей популяции животных через 10 днея после содержания на корме, обогащенном холестерином (ХС), удаляли гипо- и гиперреактивных кроликов. Группы включали равное количество животных (п=9) с одинаковым типом ответа на нагрузку пищевым" холестерином. Гиперхолестеринемия индуцировалась путем ежедневного введения животным

через зонд 10* раствора ХС из расчета 200 мг/кг, суспензированного в

' . я

подсолнечном масле, в течение 12 недель. Интактные кролики получали через зонд дополнительно к стандартному лабораторному рациону 2 мл/кг подсолнечного масла. Параллельно с ХС, животным ежедневно через зонд вводили циметидин р дозе 10 м!*/кг в 1% крахмальной суспензии. Антиатеросклеротическую и гиполипидемическую активность С-1273 изучали в сравнении с имидазолом. Животным одновременно с ХС ежедневно вводили через зонд С-1273 в дозе 30 мг/кг в 10% водном растворе, а кролики другой группы получали имидазол в дозе 15 мг/кг. По этой же схеме проводили эксперименты с использованием ксимедона.

СН3 Н^СНз

A ^N

С-1273 КСИМИДОН

Рис.1. Химические структуры производных имидазола и примидина.

Зивотным одновременно с ХС з 1% крахмальной суспензии вводили раствор ксимедона в дозе 30 иг/кг. Образцы крови получали из вены уха непосредственно перед тем хах животных забивали.

Производное имидазола — циметидин было предоставлено фирмой "Гедеон Рихтер"; сульфированные производные имидазола были синтезированы з МОФХ им.А.Е.Арбузова (г.Казань) и любезно предоставлены к.х.н. Ивановым В.Б.; субстанция ксимедона была синтезирована там же и любезно предоставлена д.х.н. Резником B.C. (рис. 1.).

Острая токсичность производных имидазолсульфоновой кислоты изучалась методом пробит-анализа по (Miller a. Tainter, 1 14) при внутрибрюпинном введения мыпам и внутрижелудочном введении хрысам.

Липиды аорты и печени экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1, об/об) и определяли содержание ХС по методу (Tapacott, 1975). На макропрепаратах аорты определяли площадь атеросклеротическог _ поражения сосудистой стенки и расчитывали ИАП по методу (Автандилов, 1960).

Гепатоциты выделяли методом коллагеназной перфузии доли печени (Seglen,1976) и культивировали 24 часа в пластиковых чашках Петри до формирования монослоя. После этого гепатоциты инкубировали 24 часа с различными концентрациями липопротеидов и производных имидазола и пиримидина.

Макрофага мьпш линии J774 были любезно предоставлены н.с. V.ЭК КНЦ РАМН Меньшиковым Г.Б. Клетки использовали на второй день культивиро-

t

вания и инкубировали 24 часе с изучаемыми соединениями.

фракции липопротендов раямш выделяли прапар&тивным ультр«центрифугированием по методу ( Llnderen, 1975).

Для определения синтез« липидов и белков в культуральную среду добавлялись рашюакгириы» прешвественники. Яипиды и желчные кислоты экстрагировали смесь» хлороформ-.метанол <1:2, об/об) (8Ueh а. Dyer, 1959), разделяли методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии.- Количество включившегося в яипиды изотопа определяли методом сцинтилляционной радиометрии (Goldstein et al., 1963). Количество секретированного апо В100 определяли методом иммуноферментного анализа (Kooykh a. Preobraohenaky, 1987). Специфическое связывание ^^1-ЛНП гепатоцитами определяли в присутствии 20-кратного избытка немеченных ЛНП (Goldstein et al., 1983). Мечение проводили с использованием IC1 (Bilheimer et Ы., 1972). Статистическая обработка результатов проводилась по t-критерию Стьюдента и непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение (п=3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ииметипингс И 3->щидпаплилпропаи-2-судьаднрпрЯ кислота да зтопевиментяльный ят«»роя1шррп* j£ ТР>9ЛМ1ИШ г

Ряд производных имидазола уже применяется в клиничеокоя практике для лечения заболеваний не связанных с гиперхолестеринемией. В то же время у них обнарул-;ны свойства, позволяющие н&деятся» что они или их производные будут эффективны в лечении гиперхолестеринемии и атеросклероза. Для проверки этого предположения, по следующим причинам, был выбран циметидин: 1) существует в форме лекарственного. препарата и применяется при лечении язвенной болезни; 2) изучены параметры острой и хронической токсичности, определены побочные эффекты; 3) обладает способностью снижать проницаемость сосудистой стенки и увеличивает

уровень ХС ЛВП а-плазме (Stone,1994); 4) имические и фармакокинети-ческиа свойства соответствуют требованиям, предъявляемым к перспективным антиотероснлеротическим препаратам (Dennis,1990).

Длй определения оптимального срока кормления хроников -ХС, при котором развиваете.- выраженная гиперхолестеринемия, определялся уровень i- Зщэго холестерина (ОХС) сыворотки через 8 и 12 недель эксперимента. Через 4 недели кормления уровень ОХС увеличился в 2.7 раза; на 8-ой неделе - в 6.8 раза, а на 12-оя - в 8.3 раза по сравнению с контрольной группой. Влияние производных имидазола и пиримидина fia экспериментальный атеросклероз оценивали на 12-ой недели гилерхо-лестеринемии, поскольку, при данных значениях сывороточного ХС развиваются и проявляются выраженные признаки атеросклероза у кроликов.

Результаты биохимических исследований сыворотки крови показали, что у кроликов получавших дополнительно к холестерин-обогащенному корму циметидин в дозе Ю мг/кг, содержание ОХС и триглицеридов (ТГ) достоверно не отличались от таковых в группе животных, получавших только холестерин. В печени кроликов, получавших циметидин, уровень ОХС уменьшился на 51%, эфиров холестерина (ЭХС) - на 57% и срободного холестерина (СХС) - на 17%.

Планиметрическое исследование внутренней поверхности аорт показало, что у животных получавших параллельно с холе терином циметидин ИАП составлял 5.0±2.3%, тогда как у кроликов ríe получавших препарата, этот показатель составлял 22.5+8.4%.

На примере циметидина нами было пр^1емонстрировано: а) имидазольное производное - циметидин, наряду с уже хорошо известными свойствами, лроятляет антиатеросклеротическую активность, не оказывая1 гиполипидемического эффакть,' б) применяемая нами модель приек^ема для' исследования антиагеросклеротическоя активности у этой группы препаратов. Однако, применение циметидина в качестве самостоятельного

антиатеросклеротического препарата мало перспективно, вследствие побочного эффекта на систему кроветворения (Машкоеский, 1984). Поэтому последующие Наши исследования ln vivo были связаны с новосинтезирован-ным, отечественным производным имидазола 2-имидазолилпропан-2-сульфо-новой кислотой (С-1273) (рис.1).

Целесообразность в изучении влияния этого соединения на течение экспериментального атеросклероза, было обусловлено тем фактом, что сульфирование амикосоединений значительно снижает их токсичность и существенно повышает активность (Джильберт, 1969).

Эксперименты по ' оценки острой токсичности этого соединения показали, что средняя смертельная доза (LD^q) при внутрибркшинном введении мышам составила 1200±80 мг/кг, а при внутрижелудочном введении крысам этот показатель составлял - 5780±367 мг/кг.

У животных получавших только ХС и одновременно с ХС имидазол (15 мг/кг), уровень ОХС в сыворотке крови был в 8 раз выше, чем у контрольных животных. Параллельно, в 2.6 раза увеличивалась концентрация ТГ. При добавлении С-1273 в дозе 30 мг/кг, показатели ОХС и ТГ в сыворотке крови достоверно не отличались от таковых во 2-ой группе (табл.1).

Содержание ОХС в печени животных, получавших только холестерин-■ обогащенный корм, увеличилось в 4.9 раза, тогда как СХС - в 3 раза, ЭХС - в 5.7 раза, соответственно, по сравнению с показателями липидов у контрольных кроликов. Введение С-1273 снизило содержание ОХС на 43%, СХС - на 26% и ЭХС - на 46%, тогда как введение имидазола не изменяло содержания липидов в печени (табл.1).

У животных получавших только ХС отмечалось увеличение содержания липидов в аорте. Дополнительное, к ХС-обогащенному корму, ежедневное введение животным 30 мг/кг С-1273-значительно уменьшило эти показатели. Так концентрация ОХС снизилась на 54%, СХС - на 622U а ЭХС на 49%. В то же гремя имидазол, достоверных изменений не .вызывал (табл.1 К

Таблица 1. Влиянии С-1273 (30 мг/жг) и имидазола (15 мг/кг} на содержания лилияоо ш сыворотке крозн, печени, аорт® кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией

1-Контроль

2-ГХС

3-ГХС+С-1273

4-ГХС+имидаэол

Кровь (мг/дл)

ОХС 8б.6±5.8 719.8±97.5а

ТГ 161.9±9.7 423.9±56.6а

Печень {мг/г смрой ткани)

ОХС 4.2±1.2 20.5±3.1а

СХС 1.0±0.4 3.0±0.3а

ЭХС 3.1±0.7 17.7±2.7а Аорта (мг/г сырой ткани)

ОХС 1.53±0.02 17±0.8а

СХС 0.46±0.03 1.84±0.2а

ЗХС 1.07±0.01 2.83±0.6а

648.2±75.Ра 471.5±59.2а

11.0+1.2аб

2.2±0.2 9.6±1.2

аб аб

1.94±0.34б 0.70±0.1а6 1.44±0.18аб

726.0±79.7а 369.0±46.9а

15.4±2.1а 2.9±0.Iе 12.5±2.1а

6.44±0.96а 1,75±0.23а 4.69+0.В6а

а - р< 0.05 - достоверность отличий по сравнению с 1-ой группой, ® — р< 0.05 - достоверность отличий по сравнению со 2-ой группой,

(п=9); ОХС - Общий холестерин, СХС - Свободный холестерин, ЭХС - Эфиры холестерина, ТГ - Триглицериды.

Планиметрическое исследование аорт кроликгч с экспериментальным атеросклерозом показало, что у кроликов, получавших только ХС, ИАП составил в среднем 19.0±4.4%, а у кроликов получавших С-1273 в дозе 30 мг/хг этот показатель бь в 2,4 раза ниже. Причем, у 5-ти .роликов из 7-ми, получавших С-1273, отсутствовал липоидоз аорты (рис.2).

о и о и о

V ST Я

о *

О.

и

е.

V

ь я

и к 1)

4 X

5

и S

S

ф

а

в а о с

50

40

30

20

10

III

Группы животных

Рис.2. Влияние С-1273 (30 мг/кг) на степень атеросклеротического поражения аорт у кроликов с гиперхолестеринемией.

Группы животных: I- Интактные (n=6); II- +ХС (n=6); III- +ХС+С-1273 (п=7); * - р< 0.05 - достоверность (по U-критерию) отличий в сравнении со 11-оя группой.

Полученные результаты показывают, что введение С-1273 в дозе 30 мг/кг не влияло на уровень липидов плазмы кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией, но оказывало выраженное антиатеросклеротическое действие: 1) предотвращало накопление ЭХС в стенке аорты; 2) значительно снижало ПАП аорт, в сравнении с этим показателем в аортах кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией.

Влияние З-имипязолилпропян-З-сУлыЬпнпрод кислоты яд мятлЛпдичм холестерина а мпт«1игят

На основании данных, что длительное введение кроликам с экспериментальной гиперхолестеринемией 2-имидазолилпропан-2-сульфоно-вой кислоты, замедляет развитие липидных полосок и пятен в аорте и снижает накопление ЭХС, было высказано предположение, что С-1273 может

ингибировать процесс этерификации холестерина в клетках сосудистой стенки. Из недавно опубликованных данных известно, что гиполипидемиче-ския н антиатеросклеротичесхий эффекты фенчлимидазолов реализуются через ингибнрование фермента этерифицирующего ХС - АХАТ (Harri» et al.

1992; Kimura et al.,1993). Поскольку, макрофагам принадлежит ведущая роль в инициации накопления липидов в сосудистой стенхе, исследования проводились на модели - культуре мышиных макрофагов линии J774.

Линейные мышиные макрофаги J774 при инкубации с С-1273 включали С14 С]ацетат. а холестерин и триглицериды с такой же эффективностью как и контрольные клетки.

Скорость включ0ния Е14С] олеата в эфиры холестерина культивируемых макрофагоз мыши линии J774 в среде, несодержащей экзогенный холестерин и з присутствии 50 мкМ С-1273, снижалась на 24% (рис.3). В условиях стимуляции синтеза эфирсв холестерином ЛНП а 1,4 раза, скорость включения меченного пр дшественника под влиянием 50 мкМ С-1273 снижалась на 27%. В другой серии экспериментов продемонстрировано, чт добавление ХС (50 мкг/мл) в культивируемую среду вызывало 10-ти кратное увеличение включения [^С]олеата натрия в ЭХС. В этих условиях, преинкубации макрофагоь с С-1273 в концентрации 50 мкМ снижала скорость включения Ü^C]олеата в ЭХС я среднем на 43%, тогда как ингибитор АХАТ U-74.138 в концентрации 50 мкМ ингибировал синтез ЭХС на 98% (рис.3).

Таким образом, С-1273 не влияет на синтез ХС в мышиных макрофагах линии J774, но ингибируют синтез ЭХС, как в условиях стимуляции зтерификации добавленным в среду культивирования хо..зстерином, так и без таковой.

Возможно также, что другим механизмом предотвращения С-1273 накопления ЭХС в макрофагах, является стимуляция ЛВП2_опосредованного обратного транспорта холестерина. Об этом свидетельствуют недавно опубликованные данные,'продемонстрировавшие, что производные имидазола.

в частности октимибвт натрия, увеличивает активность ЛВП-рецепторов и способствуют ЛВП-олосредоааикому' оттоку кеэтерифицированного холестерина из макрофагов (Schmitz et а.1. i 1988).

а

с

Рис.3. Влияние С-1273 (50 мкМ) на скорость синтеза эфиров холестерина в макрофагах.

ДЛС - делипидированная сыворотка крови человека: а - р<0.05, достоверность в сравнении с .ДЛС; 6 - р<0.05, в сравнении с ЛНП или с ХС.

Влиянии 2-ими^я^пямдпропяи-?.-пу1Ч>Й80Н0И0й КИСЛОТЫ Ш МЯТабПЛИЗМ

холастприна а дультивгогвиме гппатонитдл

Для ответа на вопрос - с чем связано снижение содержания ОХС в печени под влиянием ■ 2-имидазолилпропан-2-сульфоновой кислоты, на первичной культуре гепатоцитов кролика изучали влияние этого соединения на основные процессы ^втаболизма холестерина: 1) синтез ХС; 2) этерификация ХС; 3) специфическое связывание 1251-ЛНП; 4) синтез, желчных кислот.

Избирательность эффекта изучаемого соединения определялась .по включению С^СЗлейцина в суммарный клеточный белок. Установлено, что-

еинтез м секреция белков, представляющие одну из основных функций клетки печени, ие ингибировались, в концентрациях - 1-50 мкМ С-1273. Это позволило исключить кеспецифичвское действие зтого соединения на синтез белков клетками печени, и детально исследовать его влияние на различные процессы метаболизма ХС.

Таблица 2. Влияние С-1273 на включение. ацетата в холестерин

культивируемых гепатоцитов кролика

Условия опыта холестерин

(х10^ имп/мин на мг клеточного белка)

ЭТС-контроль ДЛС-коитроль ДЯС + 1273-ЮмуЛ ДЛС + 1273-50мхМ ДЛС + 1273-ЮОмкМ ДЛС + 1273-150мкМ ДЛС- + ыевинйлин ЮнМ

Эксперимент 1 19.6±3.2 75.8±4.8а 55.9±6.8аб 53.2±10.8аб

Эксперимент 2 17.8+4.6 62.5+5.5а

55.1±2.8 53.9+9.8 41.2±5.1аб ЗВ.З±5.2аб

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка; ДЛС - делипидированная сыворотка крови человека;

а - р<0.05 -г достоверность отличия в сравнении с ЭТС-контролем, ® - р<0.05 - достоверность отличий в сравнении с ДЛС-контролем; результаты представлены в виде средних ± стандартное отклонение,п=3.

Методом иммуноферментного анализа, было проверено влияние С-1273 на секрецию гепатоцитами аполипопротеина 8-100, Установлено, что инкубация гепатоцитов с С-1273 в концентраций 1-50 мкМ. не вызывала значитель-

ного изменения секреции ano-В. Скорость синтеза желчных кислот в присутствии 1-50 мкМ С-1273 не изменялась (контроль - 109±5; в присутствии С-1273 - 101±9 х103 имп/мин/мг белка). С-127Э также не влияло на специфическое связывание ^¡Л-ЛНП гвПатоцитами (контроль -0.79±0.03 нг/иг белка; в присутствии С-1273 - 0.8±0.04 х102 нг/мг белка).

Влияние С-1273 на скорость синтеза холестерина в гепатоцитах, изучали при инкубировании клеток в отсутствия экзогенного холестерина. Скорость синтеза холестерина при добавлении 10 мкМ, 50 мхМ и 150 мкМ С-1273 снижалась на 26%, 30% и-34%, соответственно (табл.2). Результаты сравнивали с эффектом известного гиполипидемического препарата мевино-лина, конкурентного ингибитора ГМГ-КоА редуктазы. Скорость включения С^4С]ацетата в ХС снижалась в присутствии меаинолина на 49% (табл.2)

Соединение С-1273, при инкубировании с гапатоцитами в концентрации 10-50мкН,, не изменяло скорости синтеза эфиров холестерина как в условиях нагрузки гепатоцитов нелипопро- .ивовым ХС и ХС ЛНП, так и без таковой. Включение [-^СЗолеата в холестерин-£^СЗолеат, изучалось в

I

сравнении с эффектами - U-74.138 специфического ингибитора АХАТ. U-74.138, в условиях стимуляции синтеза эфиров ХС ЛНП снижал синтез эфиров на 41%, тогда как в условиях стимуляции нелипопр геиновы* холестерином - на 80% (табл.3).

Таким образом, проведенные эксперименты полазали, что соединение 1273 ингиб-ровало синтез холестерина в гепатоцитах, практически Ht

влияя на секрецию апо-В и другие процессы метаболизма холестерина. Эт1

*

результаты позволили нам предположить, что одним из возможны; механизм<?в снижения содержания ХС в печени у кроликов получавши; параллельно с холестерин-обогащенным кормом С-1273 являетег ингибирование в гепатоцитах синтеза ХС de novo. 1

Таблица 3. Влияние С-1273 на включение [14С]олеата натрия в эфи[ы холестерина хультивируемых гепатоцитов

Условия опыта эфиры холестерина

(х10^ имп/мин на мг клеточного белка)

ДЛС-контроль

ЛНП-контролъ

ДЛС+1273-10мкМ

ДЛС+1273-50мкМ

ЛНП+1273-50мкМ

ЛНП+и-74.138-50мкМ

ДЛС-контроль ХС-контроль ХС+1273-50мкМ XC+U-74.138-50мкМ

Эксперимент 1 22.0±1.8

. 17.6±1.1 18.1+1.0

Эксперимент 3 52.1+1.3 1515.0+264.7" 1157.5±150.0а 305.5±49.8аб

Эксперимент 2 49.7±7.9 67.6±3.6а

.58.8±5.2 39.9±6.3б

ДЛС - делипидированная сыворотка крови человека; а - р<0.05 - достоверность по сравнению с ДЛС-контролем,

р<0.05- достоверность по сравнению с ХС-контролем или ЛНП-контролем; представлено в виде средних ± стандартное отклонение,п=3.

Из данных полученных in vitro на двух типах клеток следует, что исследуемое соединение значительно снижало скорость этерификации ХС в макрофагах, но не влияло.на этот процесс в гепатоцитах, что указывает на возможность существования избирательного эффекта на клетки сосудистой стенки. Это может иметь особое значение, поскольку известно, что рдним из нежелательных последствий' рНиженйя актигности АХАТ в печени

при использовании ингибиторов АХАТ может являться увеличение внутриклеточного содержания CXG, и последующее снижение экспрессии ШШ-рецепторов в гепатоцитах. Следствием этого.является увеличение концентрации ХС ЛНП в плазме (Aahton et el. »1992) .

Таким образом, » основе антнатеросклеротического действия С-1273 может лежать способность этого соединения к ингибированип процесса превращения макрофагов стенки сосуда в пенистые клетки. При этом эффект С-1273 не опосредован его влиянием.на нормализацию липидного профиля крови. Более того, как показали результаты экспериментов с использованием.культуры макрофагов, добавление С-1273 в среду приводилс к снижению скорости образования ЭХС в этих клетках. , .

Влияние жегшвдаша яа эжвгоаммвмтяллимя ■, ятаимжповгга х тапликпп х инпунироапннпа гмпярходептгерммяммай]

Анализ литературных данных показывает, что известный .препара; пармидин Подобно исследуемому нами соединению 1273 обладает у кролико! антиатеросклеротическим эффектом, не влияя на содержание холестерина i

крови (Рыженков и др., 1976). Пармидин относится к производит

»

пиримидина, среди которых в пс.ледние годы выявлены б"ологическ> активные соединения с гипохолестеринечичосхой.и антиатеросклеротичесхс активностью. Механизм антиатеросклеротического действия пармидина н изуч. н. Однако, показано, что он способен снижать проникновение ЛНП арте! (альную стенку (Камбург и др., 1993-). Другой возможный эффек связан с- иь.'нбированием АХАТ.

В процессе поиска новых соединений с антиатеросклеротическо активностью в ряду производных пиримидина нами был изучен ксимедо N-(2-гидроксиэтил)-4,6-димэтил-дигидропиримидон-2. Это ^оединени обладает следующими общими характеристи: ::>ми: 1) химически родственн пиримидин^вым основаниям и. представляет- собой нвгликоэилированн^ нуклеоэид со стойкой лактамноЯ конфигурацией- (рис.11; 2) обладае

умеренной липофильностыо; 3) существует в лекарственной форме и применяется при ожогах, как препарат стимулирующий регенерацию и оказывающий иммуномодулирующев действие.

В ходе проведенного нами исследования было установлено, что ксиивдон введенный в дозе 30 иг/кг кроликам с экспериментальной гиперлипидемией снижал уровень ХС гак в сыворотка крови, так и в печени, на 24% и 25 %, соответственно (рис.4).

150 -1 125 -

а, § юо -

75 -

В! Ч

£ Ё Ь; о

5 «

о

50 -25 -0

КРОВЬ

ПЕЧЕНЬ

Э 1 Интактные 0 2 +ХС

В 3 +ХС+ксимедон

0ХС

ТГ

0ХС

СХС

ЭХС

Рис.4. Влияние хеимедона (30 мг/кг) на содержание липидов в сыеоротке крови и в печени у кроликов с алиментарнои гиперлипидемией (М±т). а - р<0.05, в сравнении с 1-ой группой, 0 - р<0.05, в сравнении со 2-011 группой, (п=Э); За 100% - 2-ая группа.

Гипохолестеринемическии эффект ксимедона сопровождался снижением ИАП аорт кроликов. У всех животных получавших только холестерин ИА11 в среднем составлял 45%. Ксимедон в 1.8 раза снизил ИАП аорт (24%). Из 6 аорт кроликов, получавших дополнительно кхолестерик-обогащенному корму ксимедон, в 4-х случаях интима .имела минимальные поражения и только у 2-х аорт отмечался выражений!! :липоидоэ интимы (рис, 5).

1 ИНТАКТНЫЁ (п=в)

н +хс (п=а)

Ш+ХС+КСИМЕДОН (п=б)

I II пГ

Группы ЖИВОТНЫХ'

Рис.5. Влияние хсимедона (30 мг/кг) на степень атеросклеротического поражения аорт у кроликов с гилерхолестеринемией.

* - р<0/.05» в сравнении,со 11-ой группой.

В проведенных нами экспериментах на культуре гепатоцитов кролика и макрофагов - была предпринята попытка объяснить возможный механизм рипохолестеринемического и актиатвросклеротического дейсть .я хсимедона Известно, ч-го гилохолестеринемический эффект препаратов, воздействующих на метаболизм холестерина в печени, может достигаться за счв'.. а) снижения сиитеэа и/или этерификаиии холестерина; б) стимулацин захвата ДНО; в) снижения секреции ЛОНП; г) стимуляции синтеза желчных кислот в т.д. Принимая во внимание, недавно опубликованные да-~чые> «то некоторые производные пиримидина являются мощными ингибиторами. АХДТ (Ьагаеа эЬ а!. , 199>.т ^, нами было изучено влияние ксимедона на этерификацию холестерина и; другие парь.летры его метаболизма в культивируемых гепатоцитах кролика.

о и о и о

4)

Н о а.

4)

е:

о X о Ч X К

100

80

к 5

Я

ш

N

а а. о с

60

40

20

КУЛЬТИП КРУПНЫХ

Влияния дсимвдона яа

гипатппига* жрпяияя -

Специфическое связывание меченных 125 J ^Нп гепатоцитами, скорость секреция апо-В и синтеза желчных кислот в присутствии 50 мкМ ксимедона не изменялись (данные представлены в диссертации).

Таблица 4. Влияние ксимедона на включение [*4С]олеата натрия в эфиры холестерина культивируемых геп'атоцитов кролика

Условия опыта эфиры холестерина ( х ЮЗ имп/мин на 1 мг клеточного белка)

Эксперимент 1

ДЛС-контроль 47.9+4.4

ДЛС+ЛНП-контроль 65.2+2.1а

ДЛС+ЛНП + ксимедон-50ыхМ 66.1±6.6а -V

ДЛС+ЛНП + Ц-74.138-50мкМ 38.4±4.3б

Эксперимент 2

ДЛС-контроль 49.4+0.9

ДЛС+ХС-контроль 1437.0±145.2а

ДЛС+ХС + хсимедон-50мхИ 1351.6^54.9®

ДЛС+ХС + и-74.138-50мкМ 289.6+27.1аб

ДЛС - делипидированная сыворотка крови человека; а - р<0.05 - достоверность по сравнению с ДЛС-контролем, ® - р<0.05 - достоверность по сравнению с ЛНП- или ХС- контролем; представлено в виде средних ± стандартнее отклонение, п=3

Необходимо отметить, что при изучении влияния ксимедона (50 мкМ) на метаболизм холестерина, жизнеспособность клеток, регистрируемая по

янутрикяеточному включению трипакоаогЬ синего, составляла 05-90% и не отличалась от контрольных значений, что свидетельствует об отсутствии токсического эффекта препарата.

Препарат в терапевтической концентрации 50 мкМ добавляли х гепатоцитам, культивированным в среде, содержащей 100 мкг белка ЛНП/ш (эксп.1) или 50 мкг ХС/мл (эксп.2) (табл.4). Скорость включения меченного олеата в »тих условиях стимулировалась по сравнению с контролем с 1.4 и 29 раза, соответственно. Ксимедон в концентрации 50мкМ, г условиях нагрузки гелатоцитов нелипопротеиновым ХС или ХС ЛНП, не влиял на скорость этерификации ХС. В тоже время ингибитор АХАТ U-74.138 снижал синтез эфироа на 42% (эксп.1) и 80% (эксп.2) (табл.4).

Итак, мы установили, что ксимедон а терапевтических концентрация: не влиял на этерификацию ХС, захват ЛНП, секрецию Л0НП и синтез желчны: кислот. Эти результаты дают основание предполагать, что гипохолес-теринемический эффект ксимедона, по-видимому, реализуется ме за сче1 изменьиий метаболизма холестерина в п. мни, а на уровне процессе! обмена холестерина в кишечнике.

Влиянии квимвпона яа ;тгвриД!идпшт лгалестврина а щтаоФагпя.

Влияние ксимедона на этерификацию ХС в мышиных макрос гах J77 изу 1ли в условиях стимуляции синтеза ЭХС холестерином. Представлении результаты показывают, что после 24-часовой пр<.инхубации макрофагов ксимедоно1 в концентрации 50 мкМ скорость включения [*^С]олеат натрия в ЭХС снижалась в среднем на 42% (35-50%; два эксперимента) тогда как при инкубации с ингибитором АХАТ U-74.138 на 95% (рис.6) Мы установили, что ксимедон значительно ингибировал скорост синтеза ЭХС в культивируемых мышиных макрофагах s условиях стимуляци этого процесса нелипопрот.еиновым ХС, добавленным в среду культивирс вания клеток, что позволило смоделировать ситуацию атеросклероза

сосудистой стенке. Эти результаты позволяют высказать предположение, что ксимедон, по-крайнеа мере, отчасти осуществляет

антиатеросклеротический эффект непосредственно ингибируя этерификацию ХС в макрофагах сосудистой стэкки. Важно отметить, что как и п случае с С-1273 существует тканевая специфичность у ксимедона по влиянию на АХАТ. Следует особо отметить, что в отличии от С-1273, антиатеросклеротический эффект ксимедона может быть обусловлен как прямым его воздействием на метаболизм холестерина в сосудистой стенке, так и снижением холестерина в плазме крови.

И

я о

□ длс

□ +ХС

га +ХС+кси.чедон (50мкМ) ЕЗ +ХОи.7413» (50мкМ)

ЭКСП.1

эксп.г

Рис.6. Влияние ксимедона на скорость синтеза эфиров холестерина в макрофагах.

ДЛС - делипидированная сыворотка;

а - р<0.05, в сравнении с ДЛС, 6 - р<0.05, в сравнении с ХС

Сравнивая эффекты этих двух соединений на обмен холестерина в клетках печени и макрофагах пока преждевременно делать еыеоды какой из них более перспективен, посколько потребуется проведение дальнейших,

многочисленных исследований по выяснению видоспецифичности соединений и их эффективности.

ныводн.

1. Новое производное имидазола - 2-Имидаэолилпропан-2-сульфоновая кислота, введенное кроликам с алиментарной гиперхолестеринемией в дозе 30 иг/кг, в среднем в 2,5 раза снижает индекс агеросклеротичесхого поражения; уменьшает содержание свободного и .зтерифицированного холестерина в аорте и в печени, не оказывая достоверного влияния на содержание холестерина в плазме.

2. 2-Имидаэолилпропан-2-сульфоновая кислота ингибирует синтез холестерина в гепатоцитах кролика, и тем самым может снижать содержание холестерина в печени на модели in vivo.

3. 2-ИмиДазолилпропан-2-сульфоновая кислота в исследованиях на линии мышиных макрофагов. J774 ингибирует эт рификацию холестерина, чтс

отчасти может объяснять его антиатеросклеротический эффект.

t

4. Препарат пиримидинового ряда хсимедон (Н-(2-гидрокс: этил)-4,6-диметил-дигидропиримидон-2), введенный в дозе 30 мг/кг кроликам- с алиментарной гиперхолестеринемией, оказывает гипохолестеринемическое дейс._>ие (на 24%) и снижает индекс атеросклеротического поражения в 1.6 раза. Одновременно ксимедон уменьшает в ¿0рте и в печени содержание обяего и'этерифицированного холестерина на ¿4 - 25%, соответственно.

5. Сопоставление эффектов ксимедона на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика и мышиных макрофагах J774 показывает избирательность действия препарата на этерификацию в макрофагах. Возможно этим обусловлен выраженный антиатеросклеротический эффект

кси.. jflona.

ПТБЛИКАШИ Ш ТЕМЕ Ш7СКРТЛПИИ

1. Ваймарданова (Даутова) Г.С., Камбург P.A., Евстигнеева Р.П. , Сергеева Н.В. Имидаэол и его производные как биологически активные вещества // Хим. Фарм. Журнал.- 1992.- N 3.- С. 31-38.

2. Камбург P.A. , Кондратьева М.Б., Валеева И.Х., Ваймарданова (Даутова) Г.С., Ибрагимов O.E. Влияние циметидина на экспериментальный атерогенеэ у кроликов // Билл, экспер. биол. и мед.- 1993.- N 4.- С.380-382.

3. Hamburg R.A. , Dautova G.S., Kosykh V.A. , Ivanov B.B. Anti-Atherosclerotic actyvity of the new imidazole derivative DI-1273 in cholesterol-fed rabbits. In: 62nd European Atherosclerosis Society. Jerusalem, Israel. Septem. 1993.- P. 71.

4. Даутова Г.С., Косых В.А., Репин B.C., Камбург P.A. Влияние Диметил-(имидазол-1-ил) метансульфоновой кислоты на экспериментальный атерогенеэ у кроликов // Экспериментальная и клиническая фармакология, - 1994.Т. 57,- N 5,- С. 21-24.

5. Даутова Г.С., Косых В.А. ," Репин B.C., Камбург P.M., Ибрагимов О.Б. И Др. Влияние ксимедона на метаболизм холестерина и экспериментальный атеросклероз у кроликов // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 1995,- Т. 58.- N 1,- С.