Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние некоторых синтетических производных холестерина и антиоксидантов фенольной природы на метаболизм холестерина в гепатоцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых синтетических производных холестерина и антиоксидантов фенольной природы на метаболизм холестерина в гепатоцитах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

В г л р. Л КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ' I О У .4

На правах рукописи

МАМБЕТИСАЕВА ЭЛЬВИРА ТЕМИРБЕКОВНА

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ ХОЛЕСТЕРИНА И АНТИОКСИДАНТОВ ФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ НА МЕТАБОЛИЗМ ХОЛЕСТЕРИНА В ГЕПАТОЦИТАХ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории культуры клеток и тканей кардиологического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

Косых В.к.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор .Панкин В.З. кандидат химических наук Торховская Т.И.

Ведущее учреждение: Российский научный центр

профилактической .медицины

• Защита состоится 1994 года в часов на

■заседании специализированного ученого совета К 001.22.02 в

кардиологическом научном центре РАМН по адресу: Москва, 3-я Черепковская улица, д.15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

кардиологического научного центра РАМН. -•

Автореферат разослан ¡¿А ЖЬьЬ^'Ъ^ 1994 года Ученый секретарь'

0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы,

Печень является основным органом, поддерживающим постоянный уровень холестерина в плазме крови (Gruady, 1986). Это достигается за счет ряда взаимосвязанных процессов: а) синтеза холестерина; б) синтеза и секреции липопротеидов, транспортирующих холестерин; в) захвата и катаболизма обогащенных холестерином липопротеидов, а именно, (ä-ЛОНП, ЛНП и ЛВП2 ; г) окисления холестерина до желчных кислот и удаления его в составе желчи.

Наследственные и индуцированные несбалансированным питанием нарушения з одном или сразу в нескольких указанных метаболических процессах могут приводить к развитию дислипопротеидемий (Grundy, 1984; Grundy, 1985; Genest et al., 1985). В связи с этим современная фармакотерапия основана на использовании препаратов, эказывающих либо комплексное воздействие на общий баланс колестерина в гепатоците, либо избирательно воздействующих на тот «ли иной процесс (Thompson, 1989).

К препаратам с комплексным эффектом относится, в частности, штиоксидант пробукол. Пробукол увеличивает скорость захвата ЛНП, шгибирует синтез холестерина, а также, как предполагают, :тимулирует процессы, обеспечивающие захва^ холестерина в составе 1ВПг и ЛОНП (Dt SP, 1989). К другим важным свойствам пробукола вносится его способность ингибировать окислительную модификацию 1НП, вследствие чего снижается захват модифицированных ЛНП ■акрофагами сосудистой стенки и тормозится процесс формирования .теросклеротического поражения (Carev et а!., 1987; Steinberg, 988). Однако то, что пробукол является относительно слабым

гиполипидемичсским препаратом и имеет умеренную антиоксидантнук активность делает актуальны?,! поиск новых более активных егс аналогов.

Ко второй группе лекарств с избирательным механизмом действия относятся конкурентные ингибиторы биосинтеза холестерина, такие как мевинолин, симвастатин, правастатин (Goldstein, 1988; Endo, 1992). Миопатии - основной побочный эффект указанных препаратов (Tobert, 1988). Среди новых разрабатываемых препаратов наиболее перспективными представляются производные холестерина, близкие по структуре внутриклеточным регуляторам активности ГМГ-Ко А редуктазы (Smith, 1989). Б отличие от конкурентных ингибиторов этого фермента производные холестерина супрессируют процесс транскрипции гена ГМГ-Ко А редуктазы и целого ряда белков, вовлеченных в биосинтез изопреноидов и метаболизм холестерина в печени. Другим механизмом их действия может быть активация процесса деградации специфической мРНК ГМГ-Ко А редуктазы (Kandutsch, 1984; Saith, 1989). Мощными ингибиторами холестерина среди этих соединений оказались производные 5Н-а-холестана с полярными заместителями в -вложении 15. Не исключено, что синтетический стерол 5Н-а-холест-8(14 )-ен-3-£-ол-15-он (15-кетостерол), является природным регулятором биосинтеза холестерина, поскольку обнаружен в тканях животных (Emmons, 1988). Исследования на культивируемых клетках печени и на животных показали, что 15-кетос" зрол эффективно -ингибирует ГМГ-Ко А редуктазу и обладает выряженной гиполипидемической активность». Однако полная информация"о влиянии этого вещества на метаболизм холестерина в печени все еще отсутствует и требуются дальнейшие

^следования in vitro и in vivo с целью его применения в качестве гиполипидемического препарата. Большие перспективы также связывают : его аналогами и производными холестерина с заместителями по 3-му голожению (Fung et al., 1980).

В настоящее время первичная культура гепатоцитов кролика >ассматривается в качестве удобной модели для изучения механизмов юйствия гиполипидемических препаратов.

Цель исследования: Цель настоящей работы состояла в изучении зегуляции метаболизма холестерина в гепатоцитах некоторыми гинтетическими приззодными холестерина и антиоксидантами фенольной фиродь!.

о

В задачи исследования входило: I) выяснить влияние 15-кетостерола и его нового синтетического фоизводного 33(2-гидрсксиэтскси)-5а-холест-8(14 )-ен-15-он, а также производных холестерина,молекула которых содержит функцио-«альные заместители при 3 атоме, на следующие параметры метаболиз-ia холестерина в культивируемых гепатоцитах: а)синтез холестерина; >)секреция ano В-содеряаших липопротеидов; в)синтез желчных :и слот;

5) изучить влияние пробукола н других антиоксидантов фенольной фироды на некоторые параметры метаболизма холестерина и шпопротеидов в первичной культуре гепатоцитов. В экспериментах на аппах оценить гипохолестеринемическую активность отобранных в ходе :крининга in vitro фенолзамещенных антиоксидантов (ФЗА).

Научная новизна работа..

3 результате провзденого in vitro тестирования трех новых

производных холестерина с заместителями по 3-му положению выявлено соединение наиболее а-тивно ингибирующее синтез холестерина и снижающее секрецию ano В-содержащих липопротеидов

3/3-(2-аминоэтокси)холест-5-ен. Обнаружено, что среди фенолзамещен-ных антиоксидантов аналог пробукола /3,5-ди-трет-бутил-4-

гидроксифенил/-/3',5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксибензил/-сульфид (5) эффективно и избирательно ингибирует секрецию ano В-содержащих липопротеидов и обладает гипохолестеринемической активностью.

Впервые охарактеризованы эффекты 15-кетостерола на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах контрольных и гиперхоле-стеринемических кроликов. 15-кетостерол: а) снижает секрецию ano В-содержащих липопротеидов, по-видимому, опосредованно, ингибируя синтез холестерина и снижая его внутриклеточное содержание; б) не оказывает влияния на продукцию желчных кислот. Производные холестерина с заместителями по 3-му положению ингибируют биосинтез холестерина и секрецию ano В-содержащих липопротеидов гепатоцита-ми. Установлено, что пробукол в терапевтической концентрации оказывает комплексное влияние на метаболизм холестерина и липопротеидов в гепатоцитах ингибирует синтез холестерина, стимулирует специфическое связывание 125 I—ЛНП и синтез желчных кислот.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные демонстрируют, что первичная культура гепатоцитов кролика является удобной клеточной моделью для проведения первичного скрининга in vitro новых соединений, позволяющей оценить влияние веществ на основные параметры метаболизма холестерина, включая продукцию желчных кислот. Результаты работы обосновывают целесообразность

проведения поиска ' более активных соединений среди аналогов 15-кетостерола и других производных холестерина, а также антио'ссидантоа фенольной природы с целью создания эффективных гиполипидемических препаратов. Аналог пробукола, избирательно подавляющий секрецию ало В-содер.жаших липопротеидов, может оказаться перспективным при создании гиполипидемического препарата для лечения некоторых форм дислипопротеидемий.

Апробация работы. Научные результаты, представленные в диссертации, были доложены на 7-ом Международном симпозиуме по липопротеинам и атеросклерозу (Дрезден, Германия, 1991), на 59-ом конгрессе Европейского Общества по изучению атеросклероза

.-ч

(Лиссабон, Португалия, 1992), на XV симпозиуме Международного общества кардиологов (Миссури, США, 1993), на 62-ом Конгрессе Европейско.-о Общества по изучению атеросклероза, (Иерусалим, Израиль, 1993). Диссертация апробирована на меалабораторном семинаре в кардиологическом научном центре РАМН.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". Объем работы страниц машинописна™ текста, она содержит 16 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на первичной культуре гепатоцитов кролика. Самцов кроликов породы Шиншилла весом 2,5-3 кг содержали на стандартном рационе, состоящем из брикетированного комбикорма и -

овощей. .Для получения кроликов с выраженной гиперхолестеринемией (уровень холестерина 800-1000 мг%), животных содержали на обогащенном холестерином корме (200 мг холестерина/кг веса) в течение 3 месяцев. Для определения гипохолестеринемической активности отобранных в ходе скрининга ФЗА использовались мыши линии Ва1Ь/С (самки), получавшие вещества в течение 18 дней.

Все использованные в настоящей работе производные холестерина были синтезированы в группе химии липопротеинов ИЭК КНЦ РАМН и любезно предоставлены А.Ю.Мишариным. Антиоксиданты фенольной природы были синтезированы в Научном технологическом центре г.Казани и любезно предоставлены проф. Я.Д. Самуиловым.

Гепатоциты кроликов выделяли методом коллагеназной перфузии доли печени (Seglen, 1976) и культивировали в пластиковых чашках.

Для определения синтеза липидов и белков в культуральную среду добавлялись радиоактивные предшественники. Эксперименты проводили по следующей схеме. Через 24 часа после начала культивирования гепатоциты помещали в среду, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки и различные количества исследуемых веществ, которые доб^зляли в среду культивирования в растворах: производные холестерина - .в ДМСО, ФЗА - в этаноле. Клетки культивировали 24 часа, после чего среду меняли на бессывороточную и определяли включение [14С]ацетата в холестерин, [14С]лейцина в белки.

Фракции липопротеидов илазмы и культура'льной среды выделяли методом ультрацектрифугирования (1.1п<]§геп, 1975). Апобелки липопротеидов разделяли 'методом БОБ-электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (3-20%) (ЬаетП, 1972). Количество

секретированного ano В—100 определяли методом иммуноферментного

анализа (Kosykh a. Preobrashensky, 1987). Для определения

синтеза желчных кислот использовались ЛВПг , меченные

[4-14С]холестерином (Thomas a. Rudel, 1983). Липиды и желчные

кислоты экстрагировали смесью хлороформ¡метанол (1:2, об/об)

(Bligh a. Dyer, 1959). Липиды и желчные кислоты разделяли методом

высокоэффективной тонкослойной хроматографии; количественное

определение проводили методом денситометрии (Schmitz, 1984).

Радиоактивность определяли в толуольном сцинтилляторе на счетчике

Rack-betta (LKB Wal lac, Финляндия). Специфическое связывание

125I—ЛНП гепатоцитами определяли в присутствии 20-кратного избытка

о

немеченных ЛНП. Мечение ЛНП 125 I проводили с использованием ICI (Bilheioer et al., 1972). Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию Стьюдента. Все данные в работе представлены в виде среднее + стандартное отклонение (п=3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние 15-кетостерола и CK—15 на метаболизм холестерина д. гепатонитах.

На основании многочисленных исследований оксистеролов, снижающих активность ГМГ-Ко А редуктазы, было показано, что• для проявления ингибирующей активности молекула стерина должна содержать свободную экваториальную З/3-гидроксильную группу, а вторая полярная группа должна находиться на максимально возможном удалении от атома С-3 (Gibbons, 1983; Parish, 1986; Holmes, 1987). Согласно этому положению, 15-оксигенированные стерины должны быть мощными ингибиторами ГМГ-Ко А редуктазы" и биосинтеза холестерина,

что и было продемонстрировано во многих работах (Schroepfer et al., 1987; Ругек et а'., 1987; Swaminathan, 1992; Herz, 1992). Кроме того, установлено, что соединения стериновсго ряда, несущие в 3-ем положении алкокси- фрагмент и устойчивые к гидролизу (Stein et al., 19S5) также эффективно ингибируют синтез холестерина (Khachadurian et al., 1981). В этом случае было несомненно интересным исследовать 3(3(и-оксиалкокси)- замещенные стерины. В соединениях этого ряда присутствует и свободная гидроксильная группа, необходимая для проявления биологической активности, и простая эфирная связь, препятствующая протеканию реакций, затрагивающих 3ß-0H, в том числе, и образование цитотоксических продуктов. Поэтому в процессе изучения 15-кетостерола представляет интерес сравнение эффективности действия этого соединения и

нового его аналога с заместителем по 3-му положению -30(2-гидроксиэтокси)-5а~холест-8(14)-ен-15-он (СК-15) на некоторые параметры метаболизма холестерина в гепатоцитах кролика.

Как видно из рис.1, включение [14С]ацетата в холестерин снижалась под действием 15-кетостерола и СК-15 при максимальной концентрации (1 мкг/мл) на 50У и 60%, соответственно. Достоверных отличий в эффективности ингибирования синтеза холестерина между этими соединениями не обнаружено. Жизнеспособность клеток, инкубированных с указанными веществами в концентрации 0,1 - 1,0 мкг/мл и регистрируемое, по окрашиванию трипановым синим, во всех экспериментах составляла 85-90% и эти величины не отличались от контрольных значений.

Влияние этих соединейий на скорость синтеза общего клеточного белка оценивалось по включению [14С]лейцина. Синтез суммарной

и §

Л? Я

I X

I

73

25

" о 0,5 и)

£Зеяц&Езр«щ»*г етзряноэ (ихг/ил)

Рис. 1. Влияние 15-хетостерола (о—о) и СК-15 (А--) на синтез

холестерина. Представлены репрезентативные данные одного эксперимента. * - р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с контролем (п=»3).

100

53

"о аз 10

Яозцзшрацвя сгсрлтоз (шг/ия)

ис. 1. Влияние 15-кетостерола (о—о) и СК-15 (а---А) на синтез

уммарного клеточного белка. р < 0,05; достоверность отличий сравнении с контролем, (п»3). Представлены данные 3-х езависимых экспериментов.

фракции белков гепатоцитами, инкубированными с 15-кетостеролом, не отличался от контроля, тогда как СК-15 в концентрациях 0,5 мкг/мл и 1,0 мкг/мл ингибировал этот процесс на 20-40% и 30-55%, соответственно (Рис.2). Эти результаты свидетельствуют о неспецифическом действии соединения и сделали нецелесообразным проведение дальнейших исследований с СК-15, по-крайней мере, на культивируемых клетках печени кролика, так как синтез и секреция плазменных белков гепатоцитами представляет одну из основных функций клетки печени.

В связи с тем, что в литературе до настоящего времени отсутствовали данные об эффектах 15-кетостерола на некоторые параметры метаболизма холестерина в печени, на следующем этапе работы изучалось влияние 15-кетостерола на секрецию de novo синтезированных апопротеинов, регистрируемое по включению меченой аминокислоты в ano В и ano Е. Для того, чтобы выяснить, существует ли зависимость между эффектом 15-кетостерола на этот процесс и содержанием холестерина в гепатоците, эти эксперименты проводились одновременно на гепатоцитах контрольных и гиперхолестеринемических кроликов. В гепатоцитах псгледних содержание свободного и этерифицированного холестерина увеличено на 26% и 102'á, соответственно, а биосинтез [14С]холестерина снижен на 51% (Табл.1). Наряду с этим секреция ano В и ano Е гепатоцитами гиперхблесте-ринемических кроликов увеличена в 2,5 раз по сравнению с клетками контрольных животных. В клетках нормальных животных, инкубированных с 15-кетостеролом (1 мкг/мл) в течение 24 часов, секреция ano В и ano Е снижалась на 70-80% и 40-50%, соответственно, тогда как в клетках гиперхолестеринемических кроликов это соединение не

Таблица 1. Липидный'состав и скорость синтеза холестерина з

гепатоцитах контрольных и гиперхолестериемических кроликов.

гепатоциты гепатоциты гиперхоле-

контрольных кроликов стеринемических кроликов

(мкг/мг клеточного белка) ш Свободный холестерин 35,9 ± 3,6 45,3 ± 0,8

Эфиры холестерина t 15,1 + 0,8 30,5+3,3*

(«10^ имп/мг клеточного белка)

[14С]холестерин 74,2+7,6 36,2 ±5,4*

* - р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с контрольной группой (п=5).

подавляло секрецию апобелков (табл.2.).

Таким образом, 15-кетостерол не способен влиять на секрецию апо В-содержаних липопротеидов при значительном увеличении внутриклеточного содержания холестерина. На основании этих результатов и данных литературы (Tanaka, 1991) можно предАсложить, что 15— кетостерол ингибирует секрецию апо В-содсржащих липопротеидов опосредованно, через снижение внутриклеточного содержания холестерина, достигаемое за счет ингибирования его синтеза.

Окисление холестерина до- желчных кислот является преимущественным путем его выведения из организма (Danielsson, Sjovall, 1975), поэтому в работе изучалось-влияние 15-кетостерола на синтез желчных кислот. Для этого клетки инкубировали з присутствии ЛВПг, которые являются основной формой доставки в гепатоциты холестерина - субстрата для ключевого фермента синтеза желчных кислот 7а-гидроксилазы (Ford et al., 1985; Herscovitz et al., 1985). Ранее было показано (Kosykh et al., 1991), что культивируемые гепатоциты кролика синтезируют' холевую кислоту и

Таблица 2. Влияние 15-кетостерола (1 мкг/мл) на включение [14С]лейцина в ano В и ano Е, секретированных гепатоцитами.

апо В

апо Е

х 10 распадов/мин на 1 мг клет. белка'

Гепатоциты контрольных кроликов Эксперимент 1

контроль 28,04 ± 0,34

15-кетостерол 5,41 + 0,07а

Эксперимент 2

контроль 31,47 + 0,67

15-кетостерол 9,39±0,19а

17,38 ± 0,31 8,59 ± 0,42a

28,80 + 0,07 16,70 ± 0,36a

Гепатоциты гиперхолестеринемических кроликов Эксперимент 3

контроль 69,47 ± 0,416 49,67 ± 0,49б

15-кетостерол 77,19 ± 0,10 45,48 ± 0,54

Эксперимент 4

контроль 72,05 ± 0,916 52,09 ± 0,30б

15-кетостерол 76,34 + 0,10 54,46 ± 0,34

а - р < 0,05; достоверность отличий по сравнению с контролем. ® - р < 0,05; достоверность отличий между показателями, характеризующими два типа клеток.

секретируют ее в виде коньюгатов с таурином и глицином. Добавление в инкубационную среду ЛВПг стимулировало синтез желчных кислот на 56-87% (значения 3-х независимых экспериментов). В то же время 15-кетостерол, добавленный с ЛВПг , не снижал продукцию таурохоле-вой и гликохолевой кислот гепатоцитами. Полученные результаты показывают, что 15-кетостерол не нарушает окисление холестерина до

аелчных кислот в гепатоцитах, тем сакам не препятствуя основному пути выведения холестерина из организма в виде желчных кислот и планируемое его использование в клинике не будет сопровождаться побочным эффектом - образованием желчных камней.

Влияние производных холестерина s. заместителями при 2. атоме молекулы нд биосинтез и метаболизм холестерина гепатоцитах.

Ранее было показано, что синтетические 3ß-0- полиоксиэтилиро-ванные производные холестерина эффективно снижают синтез стериноз и активность ГМГ-Ко А редуктазы в культивируемых клетках (Khachaaurian et al., 1981). Предпринятая нами попытка получить более активное чем 15-кетостерол соединение, несущее в 3-0-0-положении молекулы 15-кетостерола 2-гидроксиэтокси- фрагмент, не привела к ожидаемым результатам (Рис. 1; 2). Однако принимая во внимание теоретическую возможность получения такого соединения на оснозе 15-кетостерола с заместителем по 3 атому, нами было проведено сравнение эффективности действия соединений с различными заместителями в 3 положении молекулы холестерина. В настоящей работе были использованы три новых производных холестери'-а: 3/3-( 2-аминоэтокси)холест-5-ен (П2); 3ß-( 2-азидоэтокси)холест-5-ен (ПЗ); 3ß-( 2-п-толуолсульфонилокси- этокси)холест-5-ен (П4). В качестве, стандарта нами использовалось известное соединение 3£-(2-гияроксиэтокси)холест-5-ен (П1) (Ahmad а. Logani, 1974; Derne 1 et al., 1985).

Соединение П2 з концентрации 1 ыкг/мл более эффектизно, чем ПЗ и П4 ингибировал включение [14С]ацетата в холестерин (П2 - на 42%; ПЗ - на 37%; П4- на 24%). Необходимо отметить, что

ннгибкрование синтеза холестерина соединением П2 (1 мкг/ил) сопоставимо с "таковым для уже известных полиоксиэтилированных производных холестерина (Fung et al., 1980). На рис.3-представлена концентрационная зависимость .влияния этого соединения и мевинолинг. на скорость синтеза холестерина. Несмотря на то, что синтез ХС с гепатоцитах заметно снижался уже при небольших концентрациях (0,1 мкг/мл) соединения П2, эти эффекты не зависели от концентрации, как при краткосрочной (3 часа; Рис.3, кривая 3), так и при 24-часовой преинкубации (Рис.3, кривые 1,2). На основании* этого мы предположили, что соединение П2 вызывает в клетке достаточно быстрый эффект, который сохраняется в течение 24 часов. При максимальной концентрации (1 мкг/мл) П2 через 3 часа инкубации ингкбировал синтез холестерина на 50%. В отличие от П2 эффект

Рис.3. Эффекты соединения П2 (1-3) и мевинолнна (4) на синтез холестерина. * - р < 0,05%, достоверность отличий в сравнении с контролем.(*- р < 0,053, достоверность отличий в сравнении с мевинолином.

при максимальной концентрации (1 мкг/мл) составлял 80$ (Рис. 3, кривая 4).

Ни одно из исследуемых соединений в испэльзусных концентрациях не ингибировало синтез балка, что позволяет исключить носпецифическое влияние этих веществ на синтез и секрецию белков клетками печени (Тгбл.З). Наряду с этим, установлено, что

Таблица 3. Влияние производных холестерина на включение

[14С]лейцина в общий белок гепатоцитов и секрецию аполипопротеина В в среду.

Соединения Общий белок Ano В % ингибиро-

мкг/мл (имп./мннмг белка)х103 (мкг/мг белка) вания

Эксперимент 1

контроль П1 235,5 + 20,6 • 1,57 + 0,10 -

соединение

1,0 224,3 + 5,5 1,22 + 0,20 -

соединение П2

0,1 209,1 ± 27,0 1,25 f 0,09a 20%

1,0 250,2 + 8,0 1,01 + 0,10a 36%

соединение ПЗ X

0,1 248,6 + 6,7 1,74 + 0,40° —

1,0 258,7 + 13,0 1,09 + 0,20a 30%

Эксперимент 2 •

контроль П1 128,8 + 19,1 4.08 а. 0,20 -

соединение

1,0 148,6 + 15,6 3,95 + 0,50 -

соединение ¡12

0,1 177,2 X 23,8 3,10 + 0,20a 24%

1,0 137,1 + 4,8 3,00 4- 0,10a 26«

соединение ПЗ < Ш

0,1 158,9 + 29,3 3,62 + 0,30°

1,0 162,6 ± 13,6 3,38 + 0,60 17«

соединение П4 чй 12%

0,1 151,9 ± 19,7 3,57 £ o.iof

1,0 144,8 ± 8,1 3,22 ± 0,30a 2155

а - р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с хонтролем, а=3. ® - р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с соединением П2.

соединение П2 (0,1 мкг/мл) наиболее активно снижало секрецию апо В-100. (Табл.3).

В последующих экспериментах показано, что вещество П2 не оказывало влияния на продукцию желчных кислот как в случае добавления экзогенного субстрата холестерина в виде ЛВПг , так и без него. Эти результаты позволяют высказать предположение об отсутствии отрицательного эффекта на общий баланс холестерина в клетках.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ новых производных холестерина с заместителями по 3-му положению молекулы показал, что Зд—(2-аминоэтокси)холест-5-ен в наибольшей степени ингибирует синтез и секрецию апо В-содержащих липопротеидов, не оказывая неблагоприятного воздействия на синтез желчных кислот. Эти- данные позволяют рассматривать исследованные соединения как достаточно перспективную группу гиполипидемических соединений. Получено экспериментальное обоснование использования 2-аминоэтокси- заместителя по С-3 атому для создания более активного аналога 15-кетостерола.

Влияние Ш на метаболизм холестерина л липопротеидов £ культивируем гепатоиитау кролику.

Одним из перспективных подходов в комплексном лечении гиперлипидемий является применение антиоксидантов (Steinberg, 1992). В настоящей работе сопоставлялось влияние известного антиоксиданта пробукола и новых ОЗА: ди-/3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил/-ди-ацетил-метан (1); 1,3,5-триметил-2,4,6-три-/4-оксн-3,5-ди-трет-бутилбензил/-бензол (2); М-/4-окси-3,5-ди-трет-

-бутилбензил/-бензотиазол-тион-2 (3); /2-гидроксн-З,5-ди-трет-бу-тилбвнзил/-бензотиазолил-сул1.фид (4); /3,5-ди-трет-бутил-4-гидро-ксифзкил/-/3'5'-ди-трет-бутил- 4'-гидроксибензил/-сульфид (5) на синтез холестерина, секреции апо В-содержаиих липопротаидов, специфическое связывание 125I—ЛНП, синтез и секрецию желчных ипслот.

Ранее было показано (Барский и соавт., 1992), что из ухазанных соединений наибольшей антиоксидантной активностью обладает вещество 3 и наименьшей - пробукол.

Пробукол з терапевтической концентрации (100 мкМ) ингибирозал на 24-28% включение меченого ацетата в холестерин (Рис.4), что -согласуется с данными литературы (ВагпЬаг: ег а!., 1988). Вещества

алтаизжпдаггщ (100 ихМ)

Рис. 4. Влияние ФЗА на синтез холестерина. (П - пробукол; 1-5 -ОЗА). - р < 0,05; достоверность отлнчий в сравнении с контролем, (п«3).

1 и 4 (100 мкМ) эффективно снижали синтез холестерина на 55-60% и 76-78%, соответственно. Остальные ФЗА, в том числе и вещество 5, являющееся аналогом пробукола (Рис.5), в концентрации 100 ыкМ не влияли на скорость синтеза холестерина в гепатоцитах.

(СНАЯ сн3 (снАс сОД

■ H0-Q-5-C-S-QW)H HO-Q-CH3-S-Q-OH

. íCBtf СНз сссн,), (СН^С з «

Пробукол (j2,5-дн-т?Е1-ЕЮТ-4-тегао:г:£Ш/-

Рис. 5. Химическая структура пробукола и вещества 5.

Среди исследованных ФЗА лишь вещество 4 (100 мкМ) значительно (на 52-68%) ингибировало включение [14С]лейцина в клеточные белки к поэтому данное вещество было исключено нами из дальнейиего анализа.

Пробукол в терапевтической концентрации стимулировал специфическое связывание 12 51-ЛНП на 29-64%. Наши результаты подтверждают ранее полученные'данные (Kesaniemi a. Grundy, 1984), что увеличение пробуколом клиренса ЛНП печенью, является одним из механизмов, с помощью которого этот препарат снижает уровень холестерина ЛИЛ. Остальные ФЗА не влияли на этот процесс (Рис.6).

Вещества 2 и 5 в концентрации 100 мкМ снижали секреция ano В-100 гепатоцитами в среду инкубацию на 42-50% и 56-65%, соответственно, тогда как пробукол к остальные ОЗА не оказывали влияния на этот параметр (Рис.7)• Представленные результаты

антисксиданги (100 инЦ)

Рис.б. Влияние ФЗА на специфическое связывание 1г!1-ЛНП гвпатоцитаки. (к - контроль; п - пробукол-, 1, 2, 3, 5 - ФЗА).

- р < 0,05; достоверность отличий по сравнению с контролем, (п-3).

я

18 S Я

W с?

! I 4 4 §

8ч

| ,е

О

*ис. 7. Влияние ОЗА на секрецию ano В-100 гепатоцитами. (к -юнтроль; п - пробукол; 1, 2, 3, 5 - ФЗА).

- р < 0,05; достоверность отличий по сравнению с контролем, п=»3).

азтээжэдаягаг (100 irií)

указывают на то, что аналог пробукола (5) я вещеетво 1 эффективно снижают количество секретируемых гепатоцитами ano В-содержаиих частиц. Для ответа на вопрос, избирательно ли вещество 5 снижает секрецию ЛОНП гепатоцитами, в дальнейшем нами изучалось влияние этого вещества иа секрецию de novo синтезированных ano В и ano А-1 - основного апобелка. частиц JIBI1. Установлено, что вещество 5 снижало секрецию ano В на 53%, не влияя на продукцию ano A-I (Табл.4), что счидетельствует об избирательном влиянии вещества 5 на секрецию ano В-содержащих липопротеидов.

Таблица Влияние аналога пробукола (5) (100 мкМ) на включение

[14С]лейцина б ano В и ano А-1, сскретированных гепатоцитами.

апс í ano А-1

х 102имп./мин на 1 мг клет. белка контроль 36,06 ± 0,58 6,55 ± 0,57

аналог пробукола (5) 16,87 ± 0,20* (53%) 7,10 ± 1,04

« - р < 0,05; достоверность отличий по сравнению с контролем, п»3.

Пробукол увеличивал на 61% синтез гликохолевой' кислоты и на 58% - таурохолевой кислоты, тогда как его аналог не влиял на продукции желчных кислот (Рис. 8). Полученные результаты позволяют предположить, что данные соединения не будут нарушать in vivo процесс окисления холестерина в аелчные кислоты.

3

с

г

2 о

х у

о &

с

X

<2 а

таурохолеваа кислота

глккохолеваа кислота

Рис. 8. Влияние пробукола и вещества 5 на продукцию желчных кислот. * - р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с контролем, (п-3).

В заключительной части исследования мы попытались оценить гипохолестеринемическую активность аналога пробукола (5). В качестве препарата сравнения нами использовался пробукол. У мьгаей, получавших вещество 5 в течение 18 дней, уровень- холестерина сыворотки крови снижался на 35%; пробукол снижал этот показатель на 6595 (Табл.5.).

Таблица 5. Влияние пробукола и его аналога (5) на содержание холестерина в сыворотке крови мыаей.

Экспериментальные группы Содержание холестерина 95 от контроля

мг/мл

Группа 1 (контроль) 0,75 ± 0,13 -

Группа 2 (+ пробукол) 0,26 ± 0,10 35«

Группа 3 (+ К5) 0,49 ± 0,09* 65%

- р < 0,05; достоверность отличий по сравнению с контролем, п*10

Таким образом, полученные в эксперименте in vivo данные, свидетельствуют о наличии гипохолестеринемической активности у аналога пробукола (5). Опубликованные недавно данные (Барский и соавт., 1992),что вещество 5 является более активным антио^сидан-том, чем пробукол, а также полученные нами результаты, свидетельствующие о достаточно эффективном и избирательном снижении новым аналогом пробукола секреции ano В-содержащих липопротеидных частиц гепатоцитами, позволяют нам рассматривать его в качестве потенциального гиполипидемического и антиатерогенного соединения.

ВЫВОДЫ.

1. Известное гиполипидемическое соединение 15-кетостерол в терапевтической концентрации (1мкг/мл): а) ингибирует на 50-80% синтез холестерина; б) снижает на 70-80% секрецию ano В-содержащих липопротеидов; в) не влияет на синтез желчных кислот. Полученные данные позволяют считать, что гиполипидемическая активность этого вещества может быть обусловлена как ингибированием синтеза холестерина в клетках печени, так и снижением секреции ano В-содержащих липопротеидов.

2. 15-кетостерол, снижая секрецию ano Б-еодержапих липопротеидов в контрольных культивируемых гепатоцнтах кролика и человеке., не вл.:лет на этот процесс в гепатоцитах гиперхолестеринемических кроликов, особенностью которых является увеличение внутриклеточного содержания холестерина и 2-х кратное снижение его синтеза. По-видимому, 15-кетостерол снижает секрецию ano В опосредованно, ингибируя синтез холестерина.

3. Новое соединение, полученное на основе 15-кетостерола с

заместителем в 3 положении, 3/з(2-гидрсксиэтокси)-5а-холест-8( 14)-эн-15-он (СК-15) также эффективно ингибирует синтез холестерина. Обнаруженное одновременное снижение синтеза суммарных белков указывает на отсутствие избирательности е воздействии данного вещества.

4. Проведенный сравнительный анализ следующих производных холестерина с заместителями в положении 3 молекулы: 3¡3-( 2-амино-этоксн)холест-5-ена; 30-(2-азкдоэтокси)-холест-5-ена; Зэ-(2-п-то-луолсульфонилоксиэтокси)холест-5-ена показал, что За-(2-амино-этокск)холест-5-ен з наибольшей степени ингибирует синтез холестерина и секрецию ano В-содсржащих липопротеидов.

5. Гиполипидемический и антнатерогенкый препарат пробухол в

терапевтической концентрации (100 мкМ) оказывает комплексное

глияние на метаболизм холестерина в гепатоцитах: а) ингибирует

синтез холестерина на 24-28%; б) стимулирует на 29—6456 специфичес-125

коз связывание 1-ЛНП; в) стимулирует на 25-36% синтез желчных кислот; г) не влияет на секрецию ano В-содеряащих липопротеидов.

6. Проведенный in vitro скрининг пяти фенолзамещенных антисксидантоз показал, что аналог пробукола" (5) эффективно и избирательно ингибирует секрецию ano 3-содержащих липопротеидов. Обнаруженная на ыышах гнпохолестеринемическая активность этого веоестза, позволяет рассматривать его в качестве возможного гипохолестеркнемического соединения с избирательным механизмом действия.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Mambetisaeva Е., Xosykh V., Misharin A., Malugin A., Kosenkov Е., Podrez Е.А., Repin V.S. Action of 5a-choIest-8(14 )-en-3p-oI-

-15-one on cholesterol metabolism in cultured rabbit hepatocytes. Abstract of 59th EAS meeting, Lisbon, 1992, p.72.

2. Мамбетисаева Э.Т., Косых В.А., Мишарин А.Ю., Малюгин А.В., Косенков Е.И., Подрез Е.А., Репин B.C. Влияние 5Н-а холест-8(14)-ен-З-Д-ол-15-она на' метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика. - Биохимия, 1993, 2, т.58, стр.261-267.

3. Мамбетисаева Э.Т., Косых В.А., Мишарин А.Ю., Косенков Е.И., Подрез Е.А., Репин В.С.Влияние новых синтетических производных холестерина на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика. - Биохимия, 1993, 7, т.58, стр.1126-1132.

4. Mambetisaeva Е.Т., Kosykh V.A., Misharin A.Yu., Kosenkov E.I., Podrez E.A., Repin V.S. The effect of new cholesterol derivatives on lipid metabolism in cultured hepatocytes. In: Journal of Molecular and Cellular Cardiology. Acedemic Press. Abstract of XV simposiu-a of international society for heart research, Missouri, USA, 1993.

5. Podrez E.A., Kosykh V.A., Lakeev Y.V., Kosenkov E.I., Mambetisaeva E.T., Repin V.S., Smirnov V.N., Miettinen T.A.

Bile Acids and Very Low Density Lipoprotein Productioh by Cultured Hepatocytes of Rabbits Hypo- and Hyperresponsive to Dietary Cholesterol. Lipids, 1993, v.28/8, p.709-713.

6. Mambetisaeva E., Lakeev Yu., Podrez E., Smirnov L., Kosykh V. Comparative effects of probucol and its analogue on lipoprotein metabolism in hepatocytes. Abstract of 62nd EAS Congress, Jerusalem, Israel, September 5-6, 1993.

7. Malugin A., Mambetisaeva E., Fuki I., Kosenkov E.., Kosykh V., Misharin A. Effect of 3a-cholest-8(14)-en-3p-oI-15-one on apolipoprotein В secretion and receptor-dependent LDL uptake by cultured rabbit hepatocytes. Abstract of 62nd EAS Congress, Jerusalem, Israel, September 5-6, 1993.

8. Мамбетисаева Э.Т., Косенков E.H., Подрез E.A., Самуилов 51.Д., Косых В.А. Вли ние пробукола и его нового аналога на метаболизм холестерина и липопротеидов в культивируемых гепатоцитах кролика. Биохимия, 1994, 1, т.59, стр.136-143.