Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

∆8(14)-15-кетостерины как регуляторы метаболизма холестерина в клетках гепатомы человека линии HEP G2

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пийр, Екатерина Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ б

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОКСИСТЕРИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ 9 ЛИПИДНОГО ОБМЕНА.

2.1. ОБРАЗОВАНИЕ ОКСИСТЕРИНОВ.

2.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИСТЕРИНОВ СО СПЕЦИФИЧНЫМИ 17 РЕЦЕПТОРАМИ.

2.3. ОКСИСТЕРИНЫ И МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.

2.4. ТРАНСПОРТ И КАТАБОЛИЗМ ОКСИСТЕРИНОВ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.2. МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ 45 АКТИВНОСТИ Д8(14)-15-КЕТОСТЕРИНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ.

4.1.1. ИНГИБИРОВАНИЕ А8(14)-15-КЕТОСТЕРИНАМИ И 48 РОДСТВЕННЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ БИОСИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ HEP G2.

4.1.2. ВЛИЯНИЕ Д8( 14)-15-КЕТОСТЕРИНОВ НА БИОСИНТЕЗ 51 ХОЛЕСТЕРИЛОВЫХ ЭФИРОВ В КЛЕТКАХ HEP G2.

4.1.3. ВЛИЯНИЕ Д8( 14)- 15-КЕТОСТЕРИНОВ НА 52 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЛЕТОК HEP G2 С ЛНП.

4.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЗР-ГЕКСАДЕКАНОИЛОКСИ-5а-ХОЛЕСТ- 54 8(14)-ЕН-15-ОНА 5 И Зр-(2-ГТЩРОКСИЭТОКСИ)-5а-ХОЛЕСТ-8(14)-ЕН-15-ОНА 7 С КЛЕТКАМИ HEP G2 И МЕТАБОЛИЗМ

ЭТИХ СОЕДИНЕНИЙ.

4.2.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ 3 р-ГЕКСАДЕКАНОИЛОКСИ-5а- 54 ХОЛЕСТ-8(14)-ЕН-15-ОНА 5 С КЛЕТКАМИ HEP G2.

4.2.2. СОДЕРЖАНИЕ Зр-(2-ГИДРОКСИЭТОКСИ)-5а-ХОЛЕСТ

8(14)-ЕН-15-ОНА 7 И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В КЛЕТКАХ HEP G2 В ПРОЦЕССЕ ИНКУБАЦИИ.

4.2.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И УСТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ 58 ПОЛЯРНОГО МЕТАБОЛИТА.

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В РЯДУ Д8(14)-15-КЕТОСТЕРИНОВ

4.3.1. ОБРАТИМОСТЬ ЭФФЕКТОВ Д8(14)-15- 63 КЕТОСТЕРИНОВ В КЛЕТКАХ HEP G2.

4.3.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Д8(14)-15-КЕТОСТЕРИНОВ 67 РЯДА 5а-ХОЛЕСТАНА С ВНУТРИКЛЕТОЧНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ.

4.3.3. ОСОБЕННОСТИ ЭФФЕКТОВ Д8(14)-15- 69 КЕТОСТЕРИНОВ РЯДА (22Е)-5а-ЭРГОСТ-22-ЕНА

4.3.4. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ НЕКОТОРЫХ Д8(14)-15- 71 КЕТОСТЕРИНОВ

4.3. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ, МЕТАБОЛИЗМА И

Введение Диссертация по биологии, на тему "∆8(14)-15-кетостерины как регуляторы метаболизма холестерина в клетках гепатомы человека линии HEP G2"

Фармакологическая регуляция метаболизма холестерина в организме является одной из важнейших проблем биомедицинской науки, объединяющей современные достижения классической и структурной биохимии, клеточной и молекулярной биологии, биоорганической химии, фармакологии, энзимологии, эндокринологии и физиологии. Лекарственные препараты, регулирующие уровень холестерина в организме, широко используются в лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний, дислипидимий, гормональных нарушений, патологий печени и кишечника, болезни Альцгеймера.

В настоящее время в мире активно проводится поиск новых соединений, способных эффективно регулировать метаболизм холестерина. Поиск включает широкий круг природных соединений разных классов и их синтетических аналогов; подход к изучению новых регуляторов метаболизма холестерина базируется на последних достижениях фундаментальных наук и использовании современных технологий.

Среди регуляторов метаболизма холестерина, представляющих интерес в качестве потенциальных фармакологических агентов, особое место занимают оксистерины, их синтетические аналоги и родственные соединения. Оксистерины -полярные производные, образующиеся из холестерина в разных тканях организма, являются промежуточными продуктами метаболических превращений холестерина в стероидные гормоны и желчные кислоты. При физиологических концентрациях оксистерины регулируют биосинтез и метаболизм холестерина и других изопреноидов, липидов, желчных кислот, а также участвуют в регуляции клеточной дифференцировки и апоптоза. Известны оксистерины, ингибирующие биосинтез холестерина в культуре клеток в микромолярных и субмикромолярных концентрациях.

В 70-е годы прошлого века предпринимались неоднократные попытки использования синтетических оксистеринов и продуктов автоокисления холестерина в качестве гиполипидемических средств. Однако, при добавлении к корму животных, оксистерины, в концентрациях на порядки, превышающие физиологические, вызывали многочисленные побочные эффекты (жировое перерождение и частичная атрофия печени, потеря аппетита, иммунодепрессивные эффекты и т.п.).

Синтетический ингибитор биосинтеза холестерина ЗР-гидрокси-5ос-холест-8(14)-ен-15-он (15-кетостерин), в отличие от других оксистеринов, влияющих на метаболизм холестерина в культуре клеток, проявлял мощный гипохолестеринемический эффект ш vivo [1-5]. 15-Кетостерин и родственные соединения ингибировали активность основных ферментов биосинтеза холестерина в культуре клеток, подавляли абсорбцию холестерина в кишечнике, снижали уровень холестерина и уровень липопротеинов низкой плотности (ЛНП) в плазме крови [5-10].

В литературе описано около 200 производных и аналогов 15-кетостерина; многие соединения этого ряда способны регулировать биосинтез и метаболизм холестерина в культуре клеток; несколько Д8(14)-15-кетостеринов проходят предклинические испытания в качестве гиполипидемических агентов. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе биологической активности Д8(14)-15-кетостеринов в настоящее время остаются неизвестными. В связи с этим поиск и изучение новых биологически активных Д8(14)-15-кетостеринов, а также установление корреляций между структурой и проявляемой биологической активностью, очевидно, является важной задачей.

Особое место в изучении биологически активных Д8(14)-15-кетостеринов занимает проблема поиска новых соединений этого ряда, устойчивых к метаболическим превращениям. В исследованиях Шрепфера и соавторов продемонстрировано, что 15-кетостерин, добавленный к корму подопытных животных, или введенный внутривенно, подвергался быстрым метаболическим превращениям. Особенно эффективно 15-кетостерин метаболизировал в печени, образуя полярные продукты, быстро выводимые из циркуляции в желчь [11-14].

В нашей лаборатории был осуществлен синтез новой серии Д8(14)-15-кетопроизводных ряда (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана. Рабочая гипотеза основывалась на известном факте [15], что боковая цепь стеринов, содержащая алкильный заместитель в положении 24 устойчива к ферментативной деградации в клетках печени.

Цель работы - поиск новых регуляторов липидного обмена в ряду Д8(14)-15-кетостеринов; исследование биологической активности и метаболизма новых Д8(14)-15-кетопроизводных 5а-холестана, (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана в клетках гепатомы человека линии Hep G2. Задачи работы:

1) Сравнительное изучение новой серии Д8(14)-15-кетостеринов и родственных соединений, различающихся структурой боковой цепи, а также структурой и конфигурацией заместителя при СЗ, в качестве ингибиторов биосинтеза холестерина и регуляторов биосинтеза холестериловых эфиров в клетках Hep G2.

2) Исследование взаимодействия 3(3-гексадеканоилокси-5а-холест-8(14)-ен-15-она и Зр-(2-гидроксиэтокси)-5а-холест-8(14)-ен-15-она с клетками Hep G2 и установление структуры основного метаболита Зр-(2-гидроксиэтокси)-5а-холест-8(14)-ен-15-она в клетках Hep G2.

3) Выяснение взаимосвязи между структурой Д8(14)-15-кетопроизводных 5ос-холестана, (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана, их биологической активностью и метаболизмом в клетках Hep G2.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1) Установление корреляции между полярностью молекулы, структурой и стереохимической конфигурацией заместителя при СЗ, и способностью Д8(14)-15-кетопроизводных ряда 5а-холестана и (22Е)-5а-эргост-22-ена подавлять биосинтез холестерина в клетках Hep G2.

2) Влияние конфигурации 3-гидроксильной группы на способность А8(14)-15-кетостеринов ряда 5а-холестана и (22Е)-5а-эргост-22-ена регулировать ацилирование холестерина в клетках Hep G2.

3) Изучение связывания с клетками Hep G2 и метаболизма Д8(14)-15-кетостеринов ряда 5а-холестана и соответствующих кетостериловых эфиров; установление структуры основного метаболита ЗР-(2-гидроксиэтокси)-5а-холест-8(14)-ен-15-она.

4) Различия в биологической активности и метаболизме Д8(14)-15-кетостеринов ряда 5а-холестана, (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана, обусловленные различиями в структуре боковой цепи.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОКСИСТЕРИНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА.

Оксистерины (промежуточные продукты биосинтеза стероидных гормонов и желчных кислот, или продукты автоокисления холестерина) являются важнейшими регуляторными молекулами, контролирующими метаболизм изопреноидов, липидов, желчных кислот, а также рост, дифференцировку и программируемую гибель клетки. Структуре, свойствам, биосинтезу, метаболизму и биологической активности оксистеринов посвящены монография [16] и обзоры [17 - 27], среди которых необходимо особо отметить прекрасный обзор Шрепфера [27], в котором приведена исчерпывающая информация по всем аспектам изучения оксистеринов, собранная на основании работ, опубликованных до 1998 г.

Участие оксистеринов в биосинтезе и метаболизме холестерина впервые было показано Кандэчем и Ченом еще в 70-е годы [28,29]. На основании этих работ была сформулирована гипотеза, что уровень холестерина в организме регулируется по принципу обратной связи, причем оксистерины, ингибируя биосинтез холестерина, играют основную роль в этой регуляции. Важным этапом в изучении оксистеринов, явилось доказательство, что регулируемая оксистеринами транскрипция генов HMG СоА редуктазы (фермента, катализирующего скорость-лимитирующую стадию биосинтеза холестерина) и ЛНП-рецептора (мембранного белка, контролирующего поступление экзогенного холестерина в клетку) [30] определяют баланс холестерина в клетках периферических тканей.

Лавинообразный рост количества публикаций, посвященных оксистеринам, начавшийся в конце 90-х годов, был вызван: открытием ядерных рецепторов оксистеринов LXRa и LXRP [31]; идентификацией и характеристикой ферментов биосинтеза оксистеринов [32]; новыми достижениями в изучении общего механизма, контролирующего баланс холестерина и жирных кислот в клетках млекопитающих [33]. Современные исследования показали принципиальную возможность практического использования оксистеринов и родственных соединений в качестве фармакологических агентов, регулирующих липидный обмен, в первую очередь, метаболизм холестерина [18, 20, 24, 26, 27].

В настоящем обзоре суммированы результаты экспериментальных статей, посвященных участию оксистеринов в регуляции липидного обмена, и опубликованных за период 1998 - 2004 гг. В качестве литературных источников использованы публикации, в которых биологический эффект оксистеринов представлен на молекулярном уровне. Публикации, посвященные идентификации и анализу оксистеринов в пищевых продуктах, растениях и микроорганизмах, а также первичному скринингу оксистеринов на биологическую активность, в данном обзоре не цитируются.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пийр, Екатерина Андреевна

ВЫВОДЫ:

1) Подавление биосинтеза холестерина Д8(14)-15-кетостеринами зависит от структуры и стереохимической конфигурации заместителя при СЗ (ингибиторная активность убывает в ряду: ЗРНО- > ЗаНО-« ЗрСН3СОО- > ЗаСН3СОО-).

2) Биосинтез холестериловых эфиров в клетках Hep G2 ингибируется Зр-гидрокси-Д8(14)-15-кетостеринами ряда 5а-холестана и (22Е)-5а-эргост-22-ена, и стимулируется соответствующими За-эпимерами.

3) На основании исследования взаимодействия зр-гексадеканоил-[1-14С]окси-5а-холест-8(14)-ен-15-она с клетками Hep G2 сделан вывод, что Д8(14)-15-кетостериловые эфиры жирных кислот медленно связываются, интернализуются и метаболизируют не оказывая существенного влияния на метаболизм холестерина в клетках Hep G2.

4) Зр-(2-Гидроксиэтокси)-5а-холест-8(14)-ен-15-он быстро (ti/2 6 мин при 10 мкМ) равновесно связывается с клетками Hep G2 и метаболизирует с образованием зр-(2-гидроксиэтокси)-15-кето-5а-хол-8(14)-ен-24-овой кислоты, секретируемой в культуральную среду.

5) Ослабление способности ингибировать биосинтез холестерина Д8(14)-15-кетостеринами ряда 5а-холестана связано с быстрой деградацией боковой цепи в клетках Hep G2.

6) Биологическая активность и метаболизм Д8(14)-15-кетостеринов ряда 5а-холестана, 5а-эргостана и (22Е)-5а-эргост-22-ена в клетках Hep G2 определяется структурой боковой цепи. Среди новых Д8(14)-15-кетопроизводных ряда 5а-эргостана найдены соединения, обладающие более мощным ингибирующим влиянием на биосинтез холестерина в клетках печени, чем известный 15-кетостерин - ЗР-гидрокси-5а-холест-8(14)-ен-15-он.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Д8(14)-15-Кетостерины занимают видное место среди потенциальных фармакологических агентов, регулирующих уровень холестерина в организме млекопитающих. История изучения гипохолестеринемической активности 15-оксигенированных стеринов насчитывает около 30 лет. На первом этапе внимание исследователей фокусировалось в основном на способности Д8(14)-15-кетостеринов подавлять активность HMG СоА редуктазы.

Однако, последующее изучение Д8(14)-15-кетостеринов, а также достижения в количественном исследовании метаболизма и баланса холестерина in vivo [27, 179, 182], во многом изменили мнение специалистов о причинах гипохолестеринемического эффекта Д8(14)-15-кетостеринов. В настоящее время стало очевидным, что ингибирование биосинтеза 15-оксигенированными стеринами не может объяснить их сильный гипохолестеринемический эффект, наблюдаемый in vivo.

15-Кетостерин, добавленный в корм животным быстро поступает в печень. Доля, которую занимают клетки печени в общей массе холестерина, синтезируемого в организме, относительно невысока [179]. 15-Кетостерин 1 ингибирует активность HMG СоА редуктазы в культуре гепатоцитов крысы, но in vivo вызывает повышение активности HMG СоА редуктазы в печени крыс [193]. Д8(14)-15-Кетостерины, быстро деградирующие в печени, очевидно, не могут поступать в клетки периферических тканей, где синтезируется основная масса холестерина [179, 182]. Тем не менее, в экспериментах на животных Д8(14)-15-кетостерины проявляли мощный гипохолестеринемический эффект. Поэтому изучение действия Д8(14)-15-кетостеринов на клетки печени в культуре представляет большой интерес.

Печень играет ключевую роль в гомеостазе холестерина, захватывая холестерин в составе ЛНП и кишечных хиломикрон, секретируя холестерин в составе вновь синтезированных липопротеинов, и выводя холестерин и желчные кислоты из циркуляции. Поэтому наиболее перспективными регуляторами можно считать соединения, способные изменить соотношение масс холестерина, секретируемого печенью в кровоток, в желчь, а также холестерина поступающего в печень из кишечника.

По мнению Саклинга и Штанге [194] в гепатоците существует несколько "функциональных пулов", между которыми холестерин перераспределяется с большой скоростью. Регуляция метаболизма холестерина в печени осуществляется через "метаболически активный пул", состоящий из холестерина, синтезированного de novo, и холестерина, образовавшегося из холестериловых эфиров ЛНП в результате лизосомального гидролиза. Холестерин "метаболически активного пула" условно отождествляют с холестерином, содержащемся в мембране эндоплазматического ретикулума.

На рис. 20 представлена итоговая схема, иллюстрирующая участие Д8(14)-15-кетостеринов в регуляции метаболизма холестерина в клетках печени.

Кетостерин

Рис.20. Схема, иллюстрирующая взаимодействие А8( 14)-15-кетостеринов с клеткой печени (сплошной линией показаны пути превращения Д8(14)-15-кетостеринов, пунктирной - регуляторные пути).

Д8(14)-15-Кетостерины регулируют биосинтез холестерина и холестериловых эфиров, а также образование полярных метаболитов, то есть влияют на "метаболически активный пул" холестерина в клетке печени. При этом за инактивацию А8( 14)-15-кетостеринов отвечают те же метаболические пути, которые определяют основные

Полярные мет аболиты метаболические превращения холестерина в печени - АХАТ-зависимое ацилирование и СУР27А-зависимая деградация боковой цепи.

Полученные в данной работе результаты показали, что новые А8(14)-15-кетопроизводные 5а-эргостана и (22Е)-5а-эргост-22-ена подавляют биосинтез холестерина в клетках Hep G2 активнее, чем соответствующие производные ряда 5а-холестана. Д8(14)-15-Кетопроизводные (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана существенно отличались от аналогичных Д8(14)-15-производных 5а-холестана по метаболическим превращениям и по влиянию на ацилирование холестерина. Таким образом в работе продемонстрировано, что модификация боковой цепи существенно влияет на регуляторную активность Д8(14)-15-кетостерина.

По-видимому, дальнейшие исследования в этой области перспективны для создания новых биологически активных аналогов 15-кетостерина 1. Кроме того, перспективными продолжением данного исследования могут быть: изучение регуляции 8(14)-15-кетостеринами ряда (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана активности CYP27A и других ферментов катаболизма холестерина в клетках печени; изучение регуляции 8(14)-15-кетостеринами ряда (22Е)-5а-эргост-22-ена и 5а-эргостана абсорбции холестерина в клетках кишечника; эксперименты с указанными соединениями ш vivo.

На основании сравнительного изучения новых Д8(14)-15-кетостеринов ряда 5ахолестана, 5а-эргостана и (22Е)-5а-эргост-22-ена в качестве регуляторов метаболизма холестерина в клетках гепатомы человека линии Hep G2 сделаны следующие

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пийр, Екатерина Андреевна, Москва

1. Schroepfer G.J., Parish E.J., Chen H.W., Kandutsch A. A. (1977). Inhibition of sterol biosynthesis in L cells and mouse liver cells by 15-oxygenated sterols. J. Biol. Chem., 252; 8975-8980.

2. Schroepfer G.J., Parish E.J., Kandutsch A.A (1980). 15-Oxygenated sterol compounds and the use of such compounds to inhibit the biosynthesis of sterols. US Patent 4.202.891.

3. Schroepfer G.J., Pajewsky T.N., Hylarides M., Kisic A. (1987). 5a-Cholest-8(14)-en-3P-ol-15-one. In vivo conversion to cholesterol upon oral administration to a nonhuman primates. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146; 1027-1032.

4. Monger D. J., Parish E. J., Schroepfer G.J. (1980). 15-Oxygenated sterols. Enzymatic conversion of 2,4-3H.5a-cholest-8(14) -en-3P-ol-15-one to cholesterol in rat liver homogenate preparations. J. Biol. Chem. 255: 11122-11129, 1980.

5. Monger D. J., Schroepfer G.J. (1988). Inhibitors of cholesterol biosynthesis. Further studies of the metabolism of 5a-cholest-8(14)-en-3p-ol-15-one in rat liver preparations. Chem. Phys. Lipids 47: 21-46, 1988.

6. Bjorkhem I. (1992). Mechanism of degradation of the steroid side chain in the formation of bile acids. J. Lipid Res., 33: 455-471.

7. Smith L. L. Cholesterol Autoxidation. New York, Plenum Press, 1981.

8. Smith L. L. (1987). Cholesterol autoxidation 1981-1986. Chem. Phys. Lipids. 44: 87125.

9. Smith L. L., Johnson В. H. (1989). Biological activities of oxysterols. Free Radical Biol. Med. 7: 285-292.

10. Smith L.L. (1992). Biological Effects of Cholesterol Oxides (Peng K, Morin R.J. eds), Boca Raton, FL: CRC Press, P. 7-31

11. Smith L. L. (1996). Review of progress in sterol oxidations: 1987-1995. Lipids 31: 453487.

12. Guardiola F., Codony R., Addis P.B., Rafecas M., Boatella J. (1996). Biological effects of oxysterols: current status. Food. Chem. Toxicol. 34: 193-211.

13. Bjorkhem I. (2002). Do oxysterols control cholesterol homeostasis? J Clin Invest. 110: 725-730.23