Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интернализация и транспорт экзогенных стеринов в культуре клеток Hep G2

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселева, Анастасия Федоровна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Поступление холестерина в клетки печени.

2.2. Взаимодействие липопротеинов с клетками.

2.3. Баланс холестерина в гепатоцитах.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.2.1. Получение и характеристика дисперсий.

3.2.2. Введение [14С]холестерилолеата в ЛНП.

3.2.3. Взаимодействие клеток Нер 02 со стеринами и их производными.

3.2.4. Анализ радиоактивных продуктов методом ТСХ.

3.2.5. Определение уровня мРНК НМО СоА редуктазы и ЛНП рецептора.

4. Результаты исследования.

4.1 Неспецифическая интернализация холестериновых эфиров клетками Нер 62.,.

4.2 Транспорт 25-гидроксихолестерина и Зр-(2-гидроксиэтокси)-5а-холест-8( 14)-ен-15-она.

4.3. Участие экзогенных стеринов в регуляции метаболизма холестерина в клетках Нер в2.'.'::;.-.

5. Обсуждение результатов.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интернализация и транспорт экзогенных стеринов в культуре клеток Hep G2"

Возникновение и развитие сердечно-сосудистых патологий связано с нарушениями липидного обмена. Повышенный уровень холестерина в плазме крови является одним из факторов риска атеросклероза и ишемической болезни сердца. Уровень холестерина в плазме крови определяется множеством факторов, зависящих от диеты, возраста, пола, генетических особенностей, гормонального статуса организма, физической нагрузки, употребления алкоголя, курения, медикаментозных воздействий. Разработка подходов, позволяющих нормализовать уровень холестерина в организме, является важнейшей проблемой современной медицины и включает участие фундаментальных исследований в ее решении. Актуальность проблемы и успехи специалистов привели к тому, что за последнее десятилетие произошло объединение всех современных достижений классической и структурной биохимии, клеточной и молекулярной биологии, биоорганической химии, фармакологии, эндокринологии и физиологии в этой области. В настоящее время любое исследование регуляции метаболизма холестерина обязано основываться на всех этих достижениях.

Органом, определяющим гомеостаз холестерина в целом организме, является печень. Печень контролирует потоки холестерина, поступающего из кишечника и кровотока в составе липопротеинов (в основном в форме жирокислотных холестериловых эфиров), и выводит холестерин из организма в составе желчи. Действие гипохолестеринемических препаратов, таких как ингибиторы ШУЮ СоА редуктазы (ключевого фермента биосинтеза холестерина), секвестранты желчных кислот, антиоксиданты, сопровождается значительными эффектами на метаболизм холестерина в печени. Клетки печени "перерабатывают" практически всю массу выводимого из организма холестерина, при этом внутриклеточное содержание холестерина в гепатоците остается постоянным. Постоянное содержание холестерина в гепатоците поддерживается сложными системами регуляции, распределяющими внутриклеточный холестерин между компартментами клетки и "метаболически активными пулами", ответственными за образование желчных кислот и холестериловых эфиров.

В последние годы знания о регуляции метаболизма холестерина в клетке растут лавинообразно. Выделены и охарактеризованы новые ферменты, регуляторные белки и белки-переносчики, участвующие в метаболизме изопреноидов. Идентифицированы ядерные рецепторы, которые активируются короткоживущими промежуточными продуктами биосинтеза холестерина, желчных кислот и стероидных гормонов и контролируют транскрипцию многих генов. Показано, что в метаболизм холестерина вовлечены продукты не менее 150 генов. Установлены сложные молекулярные механизмы регуляции некоторых генов, участвующих в биосинтезе и метаболизме холестерина.

Клетки печени имеют много особенностей в метаболизме стеринов, отличающих их от других клеток. Гепатоциты в культуре способны интернализовать значительные количества холестериловых эфиров, а ЛНП подавляют биосинтез холестерина в гепатоцитах менее эффективно, чем в других типах клеток. Гепатоциты устойчивы к токсическим эффектам оксистеринов, природных регуляторов метаболизма холестерина, и способны их эффективно катаболизировать. Поскольку в клетке печени холестерин не является конечным продуктом изопреноидного метаболизма, а быстро окисляется в желчные кислоты и выходит из клетки, очевидно, что в гепатоците невозможно поддержание внутриклеточного гомеостаза холестерина по принципу обратной связи, как в других типах клеток, где уровень холестерина определяется активностью ЛНП рецептора и HMG СоА редуктазы [Goldstein, Brown, 1990]. Исследования путей интернализации экзогенных стеринов и их производных гепатоцитами, определение взаимосвязи между поступлением экзогенных стеринов в клетку и концентрацией эндогенного холестерина, а также установление роли стеринов в регуляторных процессах, происходящих в гепатоцитах, важно для изучения метаболизма холестерина на молекулярном уровне, для поиска и разработки новых регуляторов липидного обмена, а также для скрининга и исследования механизма действия новых гипохолестеринемических препаратов.

Целью настоящей работы являлось исследование интернапизации и внутриклеточного транспорта экзогенных стеринов (холестериловых эфиров и биологически активных оксистеринов) в клетках гепатобластомы человека линии Hep G2 и их участия в регуляции внутриклеточного метаболизма холестерина.

Клетки Hep G2 являются наиболее распространенной клеточной моделью, позволяющей исследовать особенности метаболизма липидов и липопротеинов в печени человека [Aden et al., 1979, Javitt, 1990а]. Термин "внутриклеточный транспорт" в данной работе применялся для описания процессов, для которых в англоязычной специальной литературе обычно используются термины "traffic" и "intracellular fate". В данной работе исследовался неспецифический путь интернализации холестериловых эфиров, а также изучались внутриклеточный транспорт и регуляторные эффекты 25-гидроксихолестерина - природного оксистерина, контролирующего в клетке транскрипцию генов, чувствительных к стеринам (в том числе HMG СоА редуктазы и ЛНП рецептора) [Goldstein, Brown, 1990] и серии синтетических А8(14)-15-кетостеринов, ингибирующих активность HMG СоА редуктазы в культуре клеток и проявляющих гипохолестеринемический эффект in vivo.

Основными задачами данной работы являлось:

1) выяснить способность клеток Hep G2 интернализовать холестериловые эфиры в составе липидных дисперсий, не содержащих аполипопротеинов, и исследовать участие экзогенных холестериловых эфиров в регуляции биосинтеза холестерина и активности ЛНП рецептора;

2) провести сравнительное исследование связывания, внутриклеточного транспорта и метаболизма 25-гидроксихолестерина и ЗЭ(2-гидроксиэтокси)5а-холест-8(14)-ен-15-она в клетках Hep G2;

3) изучить влияние новых синтетических Д8(14)-15-кетостеринов, различающихся структурой заместителя в положении 3, на биосинтез и ацилирование холестерина, захват холестериловых эфиров и регуляцию HMG СоА редуктазы и ЛНП рецептора в клетках Hep G2.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Холестерин, открытый французским врачом и химиком Шеврелем в 1789 году, является основным продуктом изопреноидного биосинтеза в организме млекопитающих. Холестерин является необходимым компонентом клеточных мембран и липопротеинов, предшественником стероидных гормонов и желчных кислот. За прошедшие 210 лет опубликованы сотни книг, тысячи обзоров и сотни тысяч экспериментальных статей, посвященных исследованию холестерина. За достижения в этой области было присуждено семь Нобелевских премий. Исследования холестерина публикуются во всех периодических научных изданиях в областях биологии, химии, физики и медицины. Ежегодно в мире выходят десятки научных обзоров, суммирующих и классифицирующих результаты новых экспериментальных статей. Цель этого обзора - попытаться обобщить результаты недавних публикаций, посвященных изучению путей поступления холестерина и его производных в клетки печени, особенностей локализации, внутриклеточного транспорта и метаболизма холестерина в гепатоцитах. Разумеется, обзор не претендует на описание общей картины метаболизма холестерина в печени, а касается только тех аспектов проблемы, которые непосредственно связаны с темой диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Киселева, Анастасия Федоровна

6. выводы

1. Клетки Нер способны эффективно захватывать холестериловые эфиры в составе двухкомпонентных липидных дисперсий, не содержащих аполипопротеинов (т.н. неспецифический захват). Холестериловые эфиры дисперсий подвергаются расщеплению в клетках Нер 0>2 с образованием холестерина, который метаболизирует в желчные кислоты и частично диссоциирует в среду, и жирной кислоты, включающейся в биосинтез триглицеридов, и не участвуют в регуляции активности НГ\/Ю СоА редуктазы и ЛНП рецептора.

2. Экзогенный 25-гидроксихолестерин, связываясь с клетками Нер в2, образует два пула, различающихся по скорости обмена с тем же оксистерином культуральной среды. Быстро обменивающийся пул 25-гидроксихолестерина участвует в регуляции биосинтеза холестерина и холестериловых эфиров; 25-гидроксихолестерин медленно обменивающегося пула частично связывается с белками цитозоля и медленно метаболизирует с образованием полярных продуктов.

Новый синтетический регулятор биосинтеза холестерина 3(3(2-гидроксиэтокси)5а-холест-8(14)-ен-15-он связывается с клетками Нер в2 равновесно и быстро метаболизирует с образованием 3(3[92-октадеценоилокси(2-этокси)]5а-холест-8(14)-ен-15-она, накапливающегося в клетке, и полярных продуктов, секретируемых в культуральную среду.

3. Новые синтетические А8(14)-15-кетостерины подавляют биосинтез холестерина, влияют на внутриклеточное ацилирование холестерина и захват холестериловых эфиров ЛНП в зависимости от полярности молекулы и структуры заместителя в положении 3 и снижают уровень мРНК НМС СоА редуктазы, не влияя на уровень мРНК ЛНП рецептора.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселева, Анастасия Федоровна, Москва

1. Малюгин A.B., Д.К. Новиков, К. Апки, Ю. Лафонт, А.Ю. Мишарин. 1996. Метаболизм Зр(2-гидроксиэтокси)5а-холест-8(14)-ен-15-она при внутривенном введении крысам. Биоорган. Химия, 22, 717-720.

2. Мамбетисаева Э.Т., В.А. Косых, А.Ю. Мишарин, A.B. Малюгин, Е.И. Косенков, Е.А. Подрез, B.C. Репин. 1993. Эффекты 5а-холест-8(14)-ен-15-она на метаболизм холестерина в гепатоцитах кролика в культуре. Биохимия, 58, 261-267.

3. Мишарин А.Ю. 1998. Взаимодействие аполипопротеина А1 с фосфолипидами и структура смешанных мицелл. Биоорган. Химия, 24, 563585.

4. Мишарин А.Ю., H.A. Шаталов. 1998. Синтез Збета-замещенных аналогов 15-кетостерина. Биоорган. Химия, 24, 862-867.

5. Мишарин А.Ю., Б.К. Чернов. 1997. Удобный метод ацилирования спиртов и аминов. Биоорган, химия, 23, 675-679.

6. Мишарин А.Ю., А.Я. Штейншнейдер. 1996. Синтез Зр(2-гидроксиэтокси)5а-холест-8(14)-ен-15-она и Зр(2-гидрокси-2-3Н.этокси)5а-холест-8(14)-ен-15-она. Биоорган. Химия, 22, 611-616.

7. Мишарин А.Ю. 1989. Синтез Збета-аклокси-холест-5-енов из циклохолестерина. Биоорган. Химия, 15, 281-283.

8. Acton S., A. Rigotti, К.Т. Landschulz, S. Xu, H.H. Hobbs, M. Krieger. 1996. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor. Science, 271, 518-520.

9. Adel i К., M. Wettesten, L. Asp, A. Mohammadi, J. Macri, S.-O. Oloffson. 1997. Intracellular assembly and degradation of apo B-100-containing lipoproteins in digitonin-permeabilized Hep G2 cells. J. Biol. Chem., 272, 5031-5039.

10. Aden D.P., A. Fogel, S. Plotkin, I. Damjanov, B.B. Knowles. 1979. Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line. Nature, 282, 615-616.

11. Aoyama T., T. Sawamura, Y. Furutani, R. Matsuaka, M.C. Yoshida, H. Fujiwara, T. Masaki. 1999. Structural and chromosomal assignment of the human lectin-like oxidized LDL receptor-1 (LOX-1) gene. Biochem. J., 339, 177-184.

12. Attie A.D., R.C. Pittman, D. Steinberg. 1980. Metabolism of native and of lactosylated human LDL: evidence for two pathways for catabolosm of exogenous proteins in rat hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 59235927.

13. Ayaki Y., E. Kok, N.B. Javitt. 1989. Cholic acid synthesis from 26-hydroxycholesterol and 3-hydroxy-5-cholestenoic acid in the rabbit. J. Biol. Chem., 264, 3818-3821.

14. Barbaras R., X. Collet, H. Chap, B. Perret. 1994. Specific binding of free apolipoprotein A-l to a high-affinity binding site on Hep G2 cells: characterisation of two high-density lipoprotein sites. Biochemistry. 33. 2335-2340.

15. Batzri S., D.E. Korn. 1973. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys. Acta, 298, 1015-1018.

16. Baum C.L., E.J. Reschly, A.K. Gayen, M.E. Groh, K. Schadick. 1997. SCP-2 overexpression enhances sterol cycling and inhibits cholesterol ester synthesis and HDL secretion. J. Biol. Chem., 272, 6490-6498.

17. Bennett M.K., J.M. Lopez, H.B. Sanchez, T.F. Osborne. 1995. Sterol regulation of fatty acid synthase promoter. J. Biol. Chem., 270, 25578-25583.

18. Bjorkhem I. 1992. Mechanism of degradation of the steroid side chain in the formation of bile acids. J. Lipid Res., 33, 455-471.

19. Bjorkhem I., S. Skrede. 1989. Mechanism of intestinal formation of deoxycholic acid from cholic acid in humans: evidence for a 3-oxo-delta 4-steroid intermediate. J Lipid Res., 30, 1033-1039.

20. Bowling N. W.F. Matter, R.A. Gadski, D.B. McClure, T. Schreyer, P.A. Dawson, C.J. Vlahos. 1996. LY295427, a novel hypocholesterolemic agent enhances 3H.25-hydroxycholesterol binding to liver cytosolic proteins. J. Lipid Res., 37, 2586-2598.

21. Brissette L., M.-C. Charest, L. Falstrault. 1996. Selective uptake of cholesteryl esters of LDL is mediated by the lipoprotein binding site in Hep G2 cells and is followed by the hydrolysis of cholesteryl esters. Biochem. J., 318, 841-847.

22. Brissette L., L. Falstrault. 1992. Analysis of the binding and association of human intermediate density lipoproteins to Hep G2 cells. Biochim. Biophys. Acta, 1213, 5-13.

23. Brown M.S., J.L. Goldstein. 1997. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell, 89, 331-340.

24. Brown M.S., J.L. Goldstein. 1986. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science, 232, 34-47.

25. Casaroli-Marano R.P., R. Garcia, E. Vilella, G. Olivecrona, M. Reina, S. Vilaro. 1998. Binding and intracellular trafficking of lipoprotein lipase and triacylglycerol-rich lipoproteins by liver cells. J. Lipid Res., 39, 789-806.

26. Chang T.-Y., C.C.Y. Chang, D. Cheng. 1997. ACAT. Annu. Rev. Biochem., 66, 613-638.

27. Charbonier M., P. Lechene de la Porte, S. Veesler, R.E. Pike, W.A. Woodley, P. Patin. 1993. Particle size analysis. Intern. Labmate, 18, 37-39.

28. Cheng D., C.C.Y. Chang, X. Qu, T.-Y. Chang. 1995. Activation of ACAT by cholesterol of by oxysterol in cell-free system. J. Biol. Chem., 270, 685-695.

29. Chomczynski P., Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroforme extraction. Analytical Biochemistry, 162, 156-159.

30. Dahl N.K., K.L. Reed, M.A. Daunais, J.R. Faust, L. Liscum. 1992. Isolation and characterisation of CHO cells defective in the intracellular metabolism of LDL-derived cholesterol. J. Biol. Chem., 267, 4889-4896.

31. Dashti N. 1992. The effect of LDL, cholesterol and 25-hydroxycholesterol on Apo B gene expression in Hep G2 cells. J. Biol. Chem., 267, 7160-7169.

32. Dashti N., G. Wolfbauer, E. Koren, B. Knowles, P. Alaupovic. 1984. Catabolism of human LDL by human hepatoma cell line Hep G2. Biochem. Biophys. Acta, 794, 373-384.

33. Dietschy J.M. 1998. Dietary fatty acids and the regulation of plasma low density lipoprotein cholesterol concentrations. J. Nutr., 128, 444S-448S.

34. Dietschy J.M., S.D. Turley, D.K. Spady. 1993. Role of liver in the maintenance of cholesterol and low density lipoprotein homeostasis in different animal species, including humans. J. Lipid Res., 34, 1637-1659.

35. Dolmer K., W. Huang, P.G.W. Gettins. 1998. Characterisation of the calcium site in two complement-like domains from LRP and comparison with a repeat from the LDL receptor. Biochemistry, 37, 17016-17023.

36. Duane W., I. Bjorkhem, J.N. Hamilton, S.M. Mueller. 1988. Quantitative importance of the 25-hydroxylase pathway for bile acid biosynthesis in the rat. Hepatology, 8, 613-618.

37. Fielding C.J., P.E. Fielding 1997. Intracellular cholesterol transport. J. Lipid Res., 38, 1503-1521.

38. Fisher W.R., L.A. Zech, P.W. Stackpoole. 1994. Apo B metabolism in familial hypocholesterolemia. Inconsistences with the LDL receptor paradigm. Arterioscler. Thromb., 14, 501-510.

39. Forman B.M., B. Ruan, J. Chen, G.J. Schroepfer, R.M. Evans. 1997. The orphan nuclear receptor LXRa is positively and negatively regulated by distinct products of mevalonate metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10588-10593.

40. Forman B.M., E. Goode, J. Chen. 1995. Identification of a nuclear receptor that is activated by farnesol metabolites. Cell, 81, 687-693.

41. Gerst N., F.D. Pinkerton, A. Kisic, W.K. Wilson, S. Swaminathan, G.J. Schroepfer. 1994. Inhibitors of sterol synthesis. Effects of a new fluorinated analog of 3p-hydroxy-5a-choles-8(14)-en-15-one in rats. J. Lipid Res., 35, 10401056.

42. Gliemann J. 1998. Receptor of LDL receptor family in man. Biol. Chem., 379, 951-964.

43. Goldstein J.L., S.K. Basu, M.S. Brown. 1983. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells. Methods Enzymol., 98, 241-260.

44. Goldstein J.L., M.S. Brown. 1985. Progress in understanding the LDL receptor and HMG CoA reductase, two membrane proteins that regulate the plasma cholesterol. J. Lipid Res., 25, 1450-1461.

45. Goldstein J.L., M.S. Brown. 1990. Regulation of the mevalonate pathway. Nature, 343, 425-430.

46. Graham A., J.L. Wood, L.D. RusseL 1996. Cholesterol esterification is not essential for secretion of lipoprotein components by Hep G2 cells. Biochim. Biophys. Acta, 1302, 46-54.

47. Green S.R., R.C. Pittman. 1991. Selective uptake of cholesteryl esters from low density lipoproteins in vitro and in vivo. J. Lipid Res., 32, 667-678.

48. Guardiola F., R. Codony, P.B. Addis, M. Rafecas, J. Boatella. 1996. Biological effects of oxysterols: current status. Fd. Chem. Toxic., 34, 193-211.

49. Handa T., H. Saito, I. Tanaka, K. Miyajima. 1992. Lateral interactions of pig apolipoprotein A-1 with egg yolk phosphatidylcholine and with cholesterol in mixed monolayers at the triolein-saline interface. Biochemistry, 31, 1415-1420.

50. Havekes L.M., E.C.M. De Wit, H.M.G. Princen. 1987. Cellular free cholesterol in Hep G2 cells is only partually available for down-regulation of LDL receptor activity. Biochem. J., 247, 739-746.

51. Hiltunen, T.P., J.S. Luoma, T. Nikkari, S. Yla-Herttuala. 1998. Expression of LDL receptor, VLDL receptor, LRP, and scavenger receptor in rabbit atherosclerotic lesions. Circulation, 97, 1079-1086.

52. Hornick C.A., D.Y. Hui, J.G. DeLamatre. 1997. A role for retrosomes in intracellular cholesterol transport from endosomes to the plasma membrane. Am. J. Physiol., 273, C1075-1078.

53. Ishii H., D.-H. Kim, T. Fujita, Y. Endo, S. Saeki, T.T. Yamamoto. 1998. cDNA cloning of a new LDL receptor-related protein and mapping of its gene (LRP3) to chromosome bands 19q12-q13.2. Genomics, 51, 132-135.

54. Izem L., E. Rassart, L. Kamate, L. Falstrault, D. Rhainds, L. Brissette. 1998. Effect of redused LDL receptor level on Hep G2 cell cholesterol metabolism. Biochem. J., 329, 81-88.

55. Janowski B.A., M.J. Grogan, S.A. Jones, G.B. Wisely, S.A. Kliewer. E.J. Corey, D.J. Mangelsdorf. 1999. Structural requirements of ligands for the oxysterol liver X receptors LXRa and LXRp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 266-271.

56. Javitt N.B. 1990a. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. Faseb J., 4, 161-168.

57. Javitt N.B. 1990b. 26-Hydroxycholesterol: synthesis, metabolism, and biologic activities. J. Lipid Res., 31, 1527-1533.

58. Javitt N.B., K. Budai. 1989. Cholesterol and bile acid synthesis in Hep G2 cells. Metabolic effects of 26- and 7 alpha-hydroxycholesterol. Biochem. J., 262, 989992.

59. Javitt N.B., R. Pfeffer, E. Kok, S. Burstein, B.I. Cohen, K. Budai. 1989. Bile acid synthesis in cell culture. J. Biol. Chem., 264, 10384-10387.

60. Jeske J.D., J.M. Dietschy. 1980. Regulation of rates of cholesterol synthesis in vivo in the liver and carcass of te rat measured with 3H water. J. Lipid Res., 21,. 364-376.

61. Johnson K.A., C. Morrow, G.D. Knight, T.J. Scallen. 1994. In vivo formation of 25-hydroxycholesterol from endogenous cholesterol after a single meal, dietary cholesterol challenge. J. Lipid Res., 35, 2241-2253.

62. Johnson W.J, F. Mahlberg, G. Rothblat, M.C. Phillips. 1991. Cholesterol transport between cells and high-density lipoproteins. Biochim. Biophys. Acta, 1085,273-298.

63. Kamps J.A.A., T.J.C. Van Berkel. 1993. Regulation of low-density-lipoprotein receptors in the human hepatoma cell line Hep G2. Eur. J. Biochem., 213, 989994.

64. Kamps J.A.A., T.J.C. Van Berkel. 1992. Complete down-regulation of LDL receptor activity in the human hepatoma cell line Hep G2 by ßVLDL and non-lipoprotein cholesterol. Eur. J. Biochem., 206, 973-978.

65. Kandutsch A.A., E.P. Shown. 1981. Assay of oxysterol-binding protein in a mouse fibroblast, cell-free system. Dissociation constant and other properties of the system. J. Biol. Chem., 256, 13068-13073.

66. Kandutch A.A., E.B. Thompson. 1980. Cytosolic proteins that bind oxygenated sterols. Cellular distribution, specificity, and some properties. J. Biol. Chem., 255, 10813-10821.

67. Kandutsch A.A., H.W. Chen, E.P. Shown. 1977. Binding of 25-hydroxycholesterol and cholesterol to different cytoplasmic proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 2500-2503.

68. Kandutsch A.A., H.W. Chen. 1975. Regulation of sterol synthesis in cultured cells by oxygenated derivatives of cholesterol. J. Cell Physiol., 85, 415-424.

69. Kaplan M., R. Simoni. 1985. Transport of cholesterol from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane. J. Cell Biol., 101, 446-453.

70. Keppler D., I.M. Arias. 1997. Transport across the hepatocyte canalicular membrane. Faseb J., 11, 15-18.

71. Kesav S., J. McLaughlin, T.J. Scallen. 1992. Participation of sterol carrier protein 2 in cholesterol metabolism. Biochem. Soc. Trans., 20, 818-824.

72. Khiri H., Reynier P., Peyrol N., Lerique B., Torresani J., Planells R. 1996. Quantitative multistandart RT-PCR assay using interspecies polymorphism. Mol. Cell. Probes, 10, 201-211.

73. Kilsdonk E.P., D.W. Morel, W.J. Johnson, G.H. Rothblat. 1995. Inhibition of cellular cholesterol efflux by 25-hydroxycholesterol. J. Lipid Res., 36, 505-516.

74. Klausner R.D., J.G. Donaldson, J. Lippincott-Schwartz. 1992. Brefeldin A: insights into the control of membrane traffic and organelle structure. J. Cell Biol., 116, 1071-1080.

75. Kozarsky K.F., M.H. Donahee, A. Rigotti, S.N. Iqbal, E.R. Edelman, M. Krieger. 1997. Overexpression of the HDL receptor SR-BI alters plasma HDL and bile cholesterol levels. Nature, 387, 414-417.

76. Krieger M., J. Herz. 1994. Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors: macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP). Annu. Rev. Biochem., 63, 601-637.

77. Kume N., H. Arai, C. Kawai, T. Kita. 1991. Receptor for modified LDL on human endothelial cells: different recognition for acetylated LDL and oxidized LDL. Biochim. Biophys. Acta, 1091, 63-67.

78. Lagace T.A., D.M. Byers, H.W. Cook, N.D. Ridgway. 1997. Altered regulation of cholesterol and cholesteryl ester synthesis in CHO cells overexpressing the OSBP is dependent on the pleckstrin homology domain. Biochem. J., 326, 205213.

79. Lala D.S., P.M. Syka, S.B. Lazarchik, D.J. Mangelsdorf, K.L. Parker, R.A. Heyman. 1997. Activation of the orphan nuclear reseptor steroidogenic factor 1 by oxysterols. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 4895-4900.

80. Lange Y., J Ye, J. Chin. 1997. The fate of cholesterol exiting lysosomes. J. Biol. Chem., 272, 17018-17022.

81. Lange Y., T.L. Steck. 1997. Quantitation of the pool of cholesterol associated with acyl-CoA:cholesterol acyltransferase in human fibroblasts. J. Biol. Chem., 272, 13103-13108.

82. Lange Y., J. Ye, F. Strebel. 1995. Movement of 25-hydroxycholesterol from the plasma membrane to the rough endoplasmic reticulum in cultured hepatoma cells. J. Lipid Res., 36, 1092-1097.

83. Lange Y. 1994. Cholesterol movement from plasma membrane to rough endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 269, 3411-3414.

84. LangeY., F. Echevarría, T. Steck. 1991. Movement of zymosterol, a precursor of cholesterol among three membranes in human fibroblasts. J. Biol. Chem., 266, 21439-21443.

85. Lange Y., B.V. Ramos. 1983. Analysis of the distribution of cholesterol in the intact cell. J. Biol. Chem., 258, 15130-15134.

86. Lindgren F.T. 1975. in Analysis of Lipids and Lipoproteins, (ed. Amer. Oil Chemists' Soc.), E.G. Perkins, Amsterdam, 202-224.

87. Liscum, L., K.W. Underwood. 1995. Intracellular cholesterol transport and compartmentation. J. Biol. Chem., 270, 15443-15446.

88. Liscum L., Dahl N. 1992. Intracellular cholesterol transport. J. Lipid Res., 33, 1239-1251.

89. Lopez J.M., M.K. Bennett, H.B. Sanchez, J.M. Rosenfeld, T.F. Osborne. 1996. Sterol regulation of acetyl coenzyme A carboxylase: a mechanism for coordinate control of cellular lipids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1049-1053.

90. Lowry O.H., N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem., 193, 265-275.

91. Lusa S., P. Somenharju. 1998. Degradation of LDL cholesterol esters by lysosomal lipase in vitro. Effect of core physical state and basis of species selectivity. Biochem. Biophys. Acta, 1389, 112-122.

92. Lusk L.T., L.F. Walker, L.H. DuBien, G.S. Getz. 1979. Isolation and partial characterisation of high density lipoprotein HDL1 from rat plasma by gradient centrifugation. Biochem. J., 183, 83-90.

93. Malugin A.V., N.V. Medvedeva, V.V. Abramov, A.Yu. Misharin. 1994. Hypocholesterolemic potency of 3p-(2-hydroxyetoxy)-substituted sterols. Atherosclerosis, 109, 197.

94. Matsumoto A., A. Mitchell, H. Kurata, L. Pyle, K. Kondo, H. Itakura, N. Fidge. 1997. Cloning and characterisation of HB2, a candidate high density lipoprotein receptor. J. Biol. Chem., 272, 16778-16782.

95. Mellon S.H., S R. Bair. 1998. 25-Hydroxycholesterol is not a ligand for the orphan nuclear receptor SF-1. Endocrinology, 139, 3026-3029.

96. Miller L.R., D.H. Needleman, J.S. Brabson, K.-S. Wang, G.J. Schroepfer. 1987. 5a-cholest-8(14)-en-3p-ol-15-one. A competitive substrate for acyl coenzyme A:cholesterol acyl transferase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 148, 934-940.

97. Misharin A.Yu., C. Alquier, N.V. Medvedeva, A.D. Morozkin, H. Lafont. 1999. Receptor-independent internalisation of cholesteryl esters in human hepatoma Hep G2 cells. J. Hystochem. Cytochem., in press.

98. Morawietz H., U. Rueckschloss, B. Niemann, N. Duerrschmidt, J. Galle, K. Hakim, H.R. Zerkowski, T. Sawamura, J. Holtz. 1999. Angiotensin II unduced LOX-1, the human endothelial receptor for oxidized LDL. Circulation, 100, 899902.

99. Morel D.W., M.E. Edgerton, G.E. Warner, W.J. Johnson, M.C. Phillips, G.H. Rothblat. 1996. Comperison of the intracellular metabolism and trafficking of 25-hydroxycholesterol and cholesterol in macrophages. J. Lipid Res., 37, 20412051.

100. Musanti R., L. Giorgini, P.P. Lovisolo, A. Pirillo, A. Chiari, G. Ghiselli. 1996. Inhibition of ACAT decreases apolipoprotein B-100-containing lipoprotein secretion from Hep G2 cells. J. Lipid Res., 37, 1-14.

101. Nagata Y., J. Chen, A.D. Cooper. 1988. Role of low density lipoprotein receptor-dependent and -independent sites in binding and uptake of chylomicron remnants in rat liver. J. Biol. Chem., 263, 15151-15158.

102. Natarajan R., S. Chosh, W.McLean Grogan. 1998. Molecular cloning of the promoter for rat hepatic neutral cholesterol ester hydrolase: evidence for transcriptional regulation by sterols. Biochem. Biophys. Res. Commun., 243, 349-355.

103. Neufeld E.B., A.M. Cooney, J. Pitha, E.A. Dawidowicz, N.K. Dwyer, P.G. Pentchev, E.J. Blanchette-Mackie. 1996. Intracellular trafficking of cholesterol monitored with a cyclodextrin. J. Biol. Chem., 271, 21604-21613.

104. Owens D., P. Collins, A. Johnson, G. Tomkin. 1990. Cellular cholesterol metabolism in mitogen-stimulated lymphocytes requirement for de novo synthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1051, 138-143.

105. Panini S R., R.C. Sexton, H. Rudney. 1984. Regulation of HMG CoA reductase by oxysterol by-products of cholesterol biosynthesis. Possible mediators of LDL action. J. Biol. Chem., 259, 7767-7771.

106. Parton R.G., B. Joggerst, K. Simons. 1994. Regulated internalization of caveolae. J. Cell Biol., 127, 1199-1215.

107. Patel D.D., R.A. Forder, A.K. Soutar, B.L. Knight. 1997. Synthesis and properties of the very-low-density-lipoprotein receptor and a comparison with the low-density-lipoprotein receptor. Biochem. J., 324, 371-377.

108. Patel N., E.B. Thompson. 1990. Human oxysterol-binding protein. I. Identification and characterization in liver. J. Clin. Endocrinol. Metab., 71, 16371645.

109. Phillips M.C., K.L. Gillotte, M.P. Haynes, W.J. Johnson, S. Lund-Katz, G.H. Rothblat. 1998. Mechanisms of HDL-mediated efflux of cholesterol from plasma membrane. Atherosclerosis, 137S, S13-S17.

110. Phillips M.C., W.J. Johnson, G.H. Rothblat. 1987. Mechanisms and consequences of cellular cholesterol exchange and transfer. Biochem. Biophys. Acta, 906, 223-76.

111. Pinkerton F.D., C.H. Spilman, D.P. Via, G.J. Schroepfer. 1993. Differing effects of three oxysterols on LDL metabolism in Hep G2 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 193, 1091-1097.

112. Pittman R.C., D. Steinberg. 1984. Sites and mechanisms of uptake and degradation of high density and low density lipoproteins. J. Lipid Res., 25, 15771585.

113. Raulston D.L., C.O. Mishaw, E.J. Parish, G.J. Schroepfer. 1976. Inhibition of hepatic sterol synthesis and reduction of serum cholesterol in rats by 5a-cholest-8(14)-en-3p-ol-15-one. Biochem. Biophys. Res. Commun., 71, 98409.

114. Reddy, J.K., G.P. Mannaerts 1994. Peroxisomal lipid metabolism. Annu. Rev. Nutr., 14, 347-370.

115. Reingoud D.J., M.C. Phillips. 1982. Mechanism of dissociation of human apolipoprotein A1 from complexes with dimyristoyt phosphatidylcholine. Biochemistry, 21, 2969-2976.

116. Reinhart M.P. 1990. Intracellular sterol trafficking. Experientia, 46, 599-611.

117. Ridgway N.D., K. Badiani, D.M. Byers, H.W. Cook. 1998. Inhibition of phosphorylation of the oxysterol binding protein by brefeldin A. Biochem. Biophys. Acta, 1390, 37-51.

118. Ridgway N.D., P.A. Dawson, M.S. Brown, J.L. Goldstein. 1992. Translocation of OSBP to Golgi apparatus triggered by ligand binding. J. Cell Biol., 116, 307-319.

119. Rinninger F., T. Kaiser, W.A. Mann, N. Meyer, H. Greten, U. Beisiegel. 1998. Lipoprotein lipase mediates an increase in the selective uptake of HDL-accociated cholesteryl esters by hepatic cells in culture. J. Lipid Res., 39, 13351348.

120. Rinninger F., R.C. Pittman. 1988. Regulation of the selective uptake of HDL-associated cholesteryl esters by human fibroblasts and Hep G2 hepatoma cells. J. Lipid Res., 29, 1179-1194.

121. Roberts D.C.K., N.E. Miller, S.G.L. Price, D. Crook, C. Cortese, A. La Ville, L. Masana, B. Lewis. 1985. An alternative procedure for incorporating radiolabeled cholesteryl ester into human plasma lipoproteins in vitro. Biochem. J., 226, 319322.

122. Rothblat G.H., F.H. Mahlberg, W.J. Johnson, M.C. Phillips. 1992. Apolipoproteins, membrane cholesterol domains and the regulation of cholesterol efflux. J. Lipid Res., 33, 1091-1097.

123. Rudney H., S.R. Panini. 1993. Cholesterol biosynthesis. Curr. Opin. Lipidol., 4, 230-237.

124. Rustaeus S., K. Lindberg, P. Stillemark, C. Claesson, L. Asp, T. Larsson, J. Boren, S.-O. Olofsson. 1999. Assembly of VLDL: a two step process of apo-B core lipidation. J. Nutr., 2S, 463S-466S.

125. Sakai J., A. Hoshino, S. Takahashi, Y. Miura, H. Ishii, H. Suzuki, Y. Kawarabayasi, T. Yamamoto. 1994. Structure, chromosomal location and expression of the human very low density lipoprotein receptor gene. J. Biol. Chem., 269, 2173-2182.

126. Sausier S.E., A.A. Kandutsch, F.R. Taylor, T.A. Spencer, S. Phirwa, A.K. Gayen. 1985. Identification of regulatory oxysterols, 24(S),25-epoxycholesterol and 25-hydroxycholesterol, in cultured fibroblasts. J. Biol. Chem., 260, 14571-14579.

127. Scallen T.J., A. Pastuszyn, B.J. Noland, R. Chanderbhan, A. Kharroubi, G.V. Vahouny. 1985. Sterol carrier and lipid transfer proteins. Chem. Phys. Lipids, 38, 239-361.

128. Schmitz G., T. Bruning, E. Williamson, G. Nowicka. 1990. The role of HDL in reverse cholesterol transport and its disturbances in Tanglier disease and HDL deficiency with xanthomas. Eur. Heart J., SupplE, 197-211.

129. Schroepfer G.J., A. Christophe, A.J. Chu, A. Izumi, A. Kisic, B.C. Sherrill. 1988b. Inhibitors of sterol synthesis. A major role of chylomicrones in the metabolism of 5a-cholest-8(14)-en-3p-ol-15-one in the rat. Chem. Phys. Lipids, 48, 29-58.

130. Schroepfer G.J., T.N. Pajewski, M. Hylarides, A. Kisik. 1987. 5a-Cholest-8(14)-en-3|3-ol-15-one. In vivo conversion to cholesterol upon oral administration to a nonhuman primate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 146, 1027-1032.

131. Schroepfer G.J., Parish E.J., Kandutsch A.A. 1980. 15-Oxygenated sterol compounds and the use of such compounds to inhibit the biosynthesis of sterols. US Patent 4.202.891.

132. Schroepfer G.J., E.J. Parish, H.W. Chen, A.A. Kandutsch. 1977. Inhibition of sterol biosynthesis in L cells and mouse liver cells by 15-oxygenated sterols. J. Biol. Chem., 252, 8975-8980.

133. Schwarz M., E.G. Lund, R. Lathe, I. Bjorkhem, D.W. Russell. 1997. Identification and characterization of a mouse oxysterol 7alpha-hydroxylase cDNA. J Biol Chem., 272, 23995-4001.

134. Sinensky M., G. Mueller. 1981. Cytosolic 25-hydroxycholesterol binding activity of Chinese hamster ovary cells. Arch. Biochim. Biophys., 209, 314-320.

135. Smith L.L., B.H. Johnson. 1989. Biological activities of oxysterols. Free Radical Biology & Medicine. 7, 285-332.

136. Smith L.C., F. Faustinella, L. Chan.1992. Lipases: three-dimentional structure and mechanism of action. Curr. Opin. Struct. Biol., 2, 490-496.

137. Spady D.K., L A. Wollet, J.M. Dietschy 1993. Regulation of plasma LDL-cholesterol levels by dietary cholesterol and fatty acids. Annu. Rev. Nutr., 13, 355-381.

138. Spady D.K., M. Huettinger, D.W. Bilheimer, J.M. Dietschy 1987. Role of receptor-independent low density lipoprotein transport in the maintenance of tissue cholesterol balance in the normal and WHHL rabbit. J. Lipid Res., 28, 3241.

139. Spady D.K., S.D. Turley, J.M. Dietschy. 1985. Rates of LDL uptake and cholesterol synthesis are regulated independently in the liver. J. Lipid Res., 26, 465-472.

140. Spady D.K., J.M. Dietschy 1983. Sterol synthesis in vivo in 18 tissues of the squirrel monkey, guinea pig, rabbit, hamster, and rat. J. Lipid Res., 24, 303-315.

141. Srivastava, R.A.K., H. Ito, M. Hess, N. Srivastava, G. Schonfeld. 1995. Regulation of low density lipoprotein receptor gene expression in HepG2 and CaCo2 cells by palmitate, oleate, and 25-hydroxycholesterol. J. Lipid Res., 36, 1434-1446.

142. Tabas I., S. Lim, X.X. Xu, F.R. Maxfield. 1990. Endocytosed beta-VLDL and LDL are delivered to different intracellular vesicles in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol., 111, 929-940.

143. Tabas I., Tall A.R. 1984. Mechanism of the association of HDL3 with endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts. Evidence against the role of specific ligand and receptor proteins. J. Biol. Chem., 259, 13897-13905.

144. Tall A.R. 1993. Plasma cholesteryl ester transfer protein. J. Lipid Res., 34, 1255-1274.

145. Taylor, F.R., A.A. Kandutsch. 1989. Metabolism of 25-hydroxycholesterol in mamalian cell cultures. Side-chain scission to pregnenolone in mouse L929 fibroblasts. J. Lipid Res., 30, 899-905.

146. Thuren T., K.H. Weisgraber, P. Sisson, M. Waite. 1992. Role of apolipoprotein E in hepatic lipase catalyzed hydrolysis of phospholipid in high density, lipoproteins. Biochemistry, 31, 2332-2338.

147. Thuren T., R.W. Wilcox, P.J. Sisson, M. Waite. 1991. Hepatic lipase hydrolysis of lipid monolayers. Regulation by apolipoproteins. J. Biol. Chem., 266, 48534861.

148. Tokunaga, K., Y. Nakamura, K. Sakata, K. Fujimori, M. Ohkudo, K. Sawada, S. Sakiyama. 1987. Enhanced expression of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in human lung cancers. Cancer Res., 47, 5616-5619.

149. Tomita Y., D.H. Kim, K. Magoori, T. Fujino, T.T. Yamamoto. 1998. A novel LRP with type II membrane protein-like structure is abundant in heart. J. Biochem., 124,784-789.

150. Turley S.D., D.K. Spady, J.M. Dietschy. 1995. Role of liver in the synthesis of cholesterol and the clearance of low density lipoproteins in the cytomolgus monkey. 1995. J. Lipid Res., 36, 67-79.

151. Underwood K.W., N. Jacobs, A. Howley, L. Liscum. 1998. Evidence for a cholesterol transport pathway from lysosomes to endoplasmic reticulum that is independent of the plasma membrane. J. Biol. Chem., 273, 4266-4274.

152. Vaskovsky V.E., E.V. Kostetsky, I.M. Vasendin. 1975. A universal reagent for phospholipid analysis. J. Chromatogr., 114, 269-274.

153. Wall D.A., T. Maack 1985. Endocytic uptake, transport, and catabolism of proteins by epithelial cells. Am. J. Physiol., 248, 12-20.

154. Wilson G.M., E.A. Roberts, R.G. Deeley. 1997. Modulation of LDL receptor mRNA stability by phorbol esters in human liver cell culture models. J. Lipid Res., 38, 437-446.

155. Wilson W. K., K.-S. Wang, A. Kisic, G. Schroepfer. 1988. Concerning the chemical synthesis of 3 beta-hydroxy-5 alpha-cholest-8(14)-en-15-one, a novel regulator of cholesterol metabolism. J. Chem. Phys. Lipids, 48, 7-17.

156. Wollet L.A., D.K. Spady, J.M. Dietschy 1992. Saturated and unsaturated fatty acids independently regulate low density lipoprotein receptor activity and production rate. J. Lipid Res., 33, 77-88.

157. Xu S., M. Laccotripe, X. Huang, A. Rigotti, V.I. Zannis, M. Krieger. 1997. Apolipoproteins of HDL can directly mediate binding to the scavenger receptor SR-BI, and HDL receptor that mediates selective lipid uptake. J. Lipid Res., 38, 1289-1298.

158. Yamamoto T., C.G. Davis, M.S. Brown, W.J. Schneider, M.L. Casey, J.L. Goldstein, D.W. Russel. 1984. The human LDL receptor: a cystein-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA- Cell, 39, 27-38.

159. Zengers M. M. P., D. Hoekstra. 1998. Mechanisms and functional features of polarized membrane traffic in epithelial and hepatic cells. Biochem. J., 336, 257269.

160. I.Zhang J., O. Larsson, J. Sjovall. 1995. 7a-Hydroxylation of 25-hydroxycholesterol and 27-hydroxycholesterol in human fibroblasts. Biochim. Biophys. Acta, 1256, 353-359.

161. Zhang Z., K. Cianflone, A.D. Sniderman. 1999. Role of cholesterol ester mass in regulation of secretion apoB100 lipoprotein particles by hamster hepatocytes and effects of statins on that relationship. Atheroscler. Thromb. Vase. Biol., 19, 743-752.