Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизмы холестерина в культивируемых гепатоцитах кроликов с различной чувствительностью к развитию алиментарной гиперхолестеринемии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизмы холестерина в культивируемых гепатоцитах кроликов с различной чувствительностью к развитию алиментарной гиперхолестеринемии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ЛАКЕЕВ ЮРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

МЕТАБОЛИЗМ ХОЛЕСТЕРИНА В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГЕПАТОЦИТАХ КРОЛИКОВ С РАЗЛИЧНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К РАЗВИТИЮ АЛИМЕНТАРНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой сто пони кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории культур клеток и тканей Кардиологического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

Косых В.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ланкин В.З... кандидат химических наук, Торховская Т.И.

Ведущее учреждение: Российский научный центр профилактической медицины МЗ РФ.

Защита состоится "..."................ 1994 года в ... часов на заседании

специализированного ученого совета К 001.22.02 в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу: 121552, г.Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в научной ' библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан "...".......... 1994 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Венгерова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Известно, что у человека и различных видов животных потребление богатой холестерином пищи приводит к развитию пшерхолестеринемии (Чазов,1982; Климов и соавт..1984; Перова, 1987) В то жо время установлено, что у одних индивидуумов в ответ на пищевую нагрузку холестерином развивается выраженная пгперхолестерипемия

(пшерреактпвные индивидуумы), в го время как другие (гипореактивные) являются устойчивыми к ее развитию. Такая гетерогенность была показана как на кроликах, других видах животных, так и на человеке (Roberts et а].. 1974; Katan et al.,1986). В исследованиях, проведенных в последнее время, изучались основные механизмы, лежащие в основе явления гипо — и гиперреактивности: а) эффективность всасывания холестерина в кишечнике; б) способность к компенсации избыточного поступления холестерина за счет подавления его биосинтеза; в) экскреция холестерина печенью в составе желчи; г) рецетггор — опосредованный захват липопротеидов низкой плотности (ЛНП) плазмы крови (Веупеп et al.,1987). Результаты этих исследований не позволили сделать однозначных выводов о том, какие из механизмов и в какой степени определяют устойчивость к пищевой нагрузке холестерином. Наличие косвенных данных позволяет высказать предположение, что стимуляция окисления холестерина в желчные кислоты и их последующая экскреция с желчью может являться одной из основных причин устойчивости гипореактивных индивидуумов к развитию алиментарной гиперхолестеринемии. Однако на уровне клеток печени это предположение до сих пор не нашло своего подтверждения.

Поскольку низкий уровень синтеза желчных кислот при пищевой нагрузке холестерином может приводить к развитию гиперхолсстеринемшг то возникает необходимость поиска фармакологических препаратов, способных в

печени стимулировать окисление холестерина в желчные кислоты. Некоторые косвенные данные указывают на то, что пробукол — известный гиполипидемический препарат с антиоксидантными свойствами — может стимулировать этот процесс, однако убедительные доказательства этого еще не получены (М^сКтеп, 1972). До сих пор остаются до конца неизученными механизмы действия пробукола. Б последнее время высказываются предположения, что в основе гиполипидемического и антиатеросклеротического эффекта пробукола лежит его влияние на систему обратного транспорта холестерина (Уатато1о е1 а1.,1988). Поскольку пробукол является антиоксидантом, то его эффект на метаболизм холестерина было бы интересно сравнить с эффектом другого липофильного антиоксиданта — а — токоферола, а также соединениями нового класса природных и синтетических антиоксидантов — производных полигидроксинафтахинона (ПГНХ). Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании некоторых параметров метаболизма холестерина в гепатоцитах кроликов с различной чувствительностью к пищевой нагрузке холестерином, а также изучение влияния некоторых антиоксидантов на метаболизм холестерина и липидов на модели первичной культуры гепатоцитов кролика.

В задачи исследования входило:

1) изучить лжшдный состав, секрецию липидов в составе ЛОНП, секрецию аполипопротеина (ало) Е, продукцию желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кроликов с различной чувствительностью к развитию алиментарной гиперхолестеринемии;

2) изучить влияние антиоксидантов — пробукола, а—токоферола и производных ПГНХ на синтез холестерина и желчных кислот, секрецию апоЕ и захват ЛВПо.

Научная новизна работы. В работе впервые было показано, что в гепатоцитах гипореактивных кроликов синтез желчных кислот значительно выше, а секреция холестерина и его эфиров в составе ЛОНП ниже по — сравнению с гепатоцитами гиперреактивных животных. Результаты работы указывают на то, что в основе устойчивости к пищевой нагрузке холестерином гипореактивных кроликов может лежать относительно высокая скорость синтеза желчных кислот в гепатоцитах. С другой стороны феномен гиперреактивности связан с увеличением продукции ЛОНП печенью. Показано, что пробукол, а —токоферол и гистохром — одно из производных ПГНХ стимулируют синтез желчных кислот культивируемыми гепатоцитами. При этом впервые установлен один из механизмов стимуляции пробуколом синтеза желчных кислот на уровне клеток печени.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты показывают, что основным механизмом поддержания нормального содержания холестерина в плазме гипореактивных кроликов является относительно высокая скорость его окисления в желчные кислоты. Снижение способности к стимуляции синтеза желчных кислот гепатоцитами гиперреактивных кроликов в .условиях избыточного поступления пищевого холестерина приводит к накоплению в печени холестерина в виде его эфиров. Гепатоциты гиперреактивных животных избыток холестерина выводят путем увеличения секреции холестерина и его эфиров в составе ЛОНП.

Исследование влияния пробукола на метаболизм холестерина позволило установить один из возможных механизмов гиполипидемического эффекта пробукола на уровне клеток печени, при котором пробукол в терапевтических концентрациях стимулирует синтез апоЕ. Секретированный печенью апоЕ связывается с ЛВП2 плазмы, что приводит к увеличению рецептор — опосредованного захвата этих липопротеидов печенью и последующей

стимуляции синтеза желчных кислот. Гистохром стимулирует синтез желчных кислот подобно пробуколу, в то время как а —токоферол активирует этот процесс по-видимому за счет увеличения пула dc novo синтезированного холестерина. Установленный факт, что гистохром может выступать в качестве стимулятора с>штеза желчных кислот позволяет говорить о перспективности использования этого гштиоксидакта в качестве гиполипидемического средства. Апробация работы. Научные результаты представленные в диссертации были доложены на 57 —й (Лиссабон, 1991), 59 —й (Ницца, 1992), 62 —й (Иерусалим, 1993) конференциях Европейского Общества по изучению атеросклероза, на 7 —ом Международном симпозиуме по липопротеидам и атеросклерозу (Дрезден, 1991). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре в Кардиологическом научном центре РАМН (Москва, 1993).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Заключение", "Материалы и методы", "Результаты", ' Обсуждение результатов", "Выъоды" и "Список литературы". Объем работы 118 страниц машинописного текста, она содержит 7 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает 181 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В первой серии экспериментов после содержания кроликов в течение 10 недель на корме, обогащенном холестнрином (0,2 г/кг веса) были отобраны экспериментальные группы животных с крайними значениями уровня холестерина в плазме: гиперреактивные. со средней концентрацией холестерина 912+.65 мг/дл и гипореактивиые с концентрацией 108 + 30 мг/дл. Во второй серии экспериментов после пятидневного кормления холестерином отбирали группы гипо— и гиперреактивных кроликов, которых затем вновь содержали на стандартном лабораторном корме без добавления холестерина в

точение одного месяца По шесть кроликов из каждой группы в первой серии и по три во второй ис пользовались для получения культуры гепатоцитов. Образцы крови получали из вены уха непосредственно перед тем как животных забивали; образцы желчи собирали из желчного пузыря сразу после забора печени.

Гепатоциты выделяли методом коллагеназной перфузии доли печени (Segion, 1976) и культивировали 24 часа в пластиковых чашках Петри до формирования мопослоя. После этого гепатоциты инкубировали 24 или 48 часов с различными концентрациями липопротсидов и антиоксидантов. Для определения синтеза белков и липидов в культуральнуто среду добавлялись радиоактивные предшественники.

Фракции липопротсидов плазмы и культуральной среды выделяли препаративным ультрацентрифугированием по методу (Lindgien,1975). Для определения динамики накопления холестерина, поступающего в клетки в составе ЛВП2, в среду добавляли меченные [1^С]холестерином ЛВП2 (Thomas and Rude], 1983). Получение и определение захвата ЛВП2, меченных холестерин] '^С|олеатом проводили по методу, описанному ранее Pittinan et al., 11987). Разделение апобелков проводили методом SDS —электрофореза в градиенте ПААГ (4 — 20%) (Laemmli,1972). Липиды и желчные кислоты экстрагировали смесыо хлороформ:метанол (1:2, об./об.) (Bhgh and Dyei, 1959), разделяли методом высокоэффективной тонкослойной или газожидкостной хроматографии; количественное определение проводили методоч денситометрин (Schmitz et al., 1984). Радиоактивность определяли методом сцинтилляционной радиометрии. Моноклональные антитела IgG С32 против ЛНП —рецептора были получены и любезно предоставлены в.н.с. ИЭК КНЦ РАМН Цибульским В.П. Статистическая обработка результатов проводилась по

I —критерию Стьюдента. Результаты в графиках и таблицах представлены как среднее ± стандартное отклонение (п = 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержание холестерина в плазме и гепатопитах кроликов с различной чувствительностью к развитию алиментарной гиперхолестеринемии.

Изучение механизмов, лежащих в основе явления гипо— и гиперреактивности проводилось в многочисленных экспериментах как на случайно — скрещиваемых животных, так и инбредных (с генетически определенным типом реактивности) (Beynen et. al., 1987). Согласно одной из гипотез, устойчивость к обогащенной холестерином пище может объясняться снижением всасывания холестерина в кишечнике (Beynen et al., 1989). Loose — Mitchell et al. (1991) обнаружили, что гепатоциты гипореактивных кроликов отличались от клеток гиперреактивных животных повышенной активностью ОМГ —КоА редуктазы, увеличением количества В/Е — рецепторов и сниженной активностью АХАТ при содержании кроликов как на богатом, так и бедном по холестерину корме. Результаты этих исследований лишь отчасти могут объяснить устойчивость к пищевой нагрузке холестерином. Однако роль таких процессов выведения избыточного холестерина как секреция холестерина печенью в составе ЛОНП и его окисление в желчные кислоты остается до конца неизученной.

После 10 недель содержания кроликов на корме с добавлением холестерина были отобраны экспериментальные группы животных (по 15% от общей популяции) с крайними значениями уровня холестерина в плазме: гиперреактивные со средней концентрацией холестерина 912 + 65 мг/дл и гипореактивные с концентрацией 108 + 30 мг/дл. У кроликов, содержавшихся на стандартной диете концентрация холестерина составила 61 +3 мг/дл-

Для изучения некоторых параметров метаболизма липидов в печени мы использовали первичную культуру. гепатоцитов, так как ранее в ряде работ было показано, что гепатоциты в первичной культуре по —крайней мере в течение 5 дней сохраняют изменения метаболизма холестерина, которые были индуцированы in vivo (Ford et al., 1985; Hylemon et al., 1985).

Количественный анализ липидов клеток показал, что содержание холестерина и его эфиров в гепатоцитах гиперреактивных кроликов по — сравнению с таковым в клетках гипореактивных животных было увеличено в 1,2 и 1,7 раза соответственно ив 1,2 и 2 раза по —сравнению с клетками контрольных кроликов (табл.1). Полученные данные согласуются с результатами работы Loose —Mitchell et al. (1991), которые установили, что холестерин не накапливается в гепатоцитах гипореактивных кроликов. Это позволило нам предположить, что гепатоциты этих животных обладают способностью выводить избыточный холестерин из клетки путем стимуляции его окисления в желчные кислоты.

Секреция липидов в составе ЛОНП. а также аполипопротеина Е гепатопитами гипо — и гиперреактивных кроликов.

Относительное увеличение содержания эфиров холестерина в клетках гиперреактивных животных сопровождалось стимуляцией скорости их секреции в составе ЛОНП по —сравнению с гепатоцитами гипореактивных и контрольных кроликов в 2,5 и 3,7 раза соответственно (табл.2). В ЛОНП, секретированных клетками гипореактивных животных соотношение эфиров холестерина и свободного холестерина Такое же как в ЛОНП клеток контрольных животных, в то время как в гиперреактивной группе этот показатель увеличен. Полученные нами данные были в дальнейшем подтверждены Meijer et al. (1993), обнаруживших, что алиментарная

Таблица 1. Содержание нейтральных липидов в гепатоцитах контрольных, гипо - и гиперреактивных кроликов.

Контроль Гипореактивные Гиперреактивные мкг/мг белка клеток

Холестерин 35,9 _±. 3,6

Эфиры холестерина 15,1 .+. 0,8 Триглицериды 30,6 +_ 4,0

37,6 +_ 1,3 45,3 0,8а.б

19,4 1,6а 30,5 ±_ 3,3а.6

27Д! _+ 3,6 19,6 _+ 2,За

Значения представлены в виде средних ,±. стандартное отклонение, (п = 5). п — Н < 0,05: достоверность отличий в сравнении с контрольной группой; б - Р < 0,05: достоверность отличий между эксповиментальными группами.

Таблица 2. Секреция нейтральных липидов в составе ЛОНП гепатоцитами контрольных, гипо— и гиперреактивных кроликов.

Контроль Гипореактивные Гиперрсакгивные мкг/мг белка клаюк/24 часа

Холестерин 2,02 _±_ 0,26

Эфщч.т холестерина 0,38 i 0,01 Триглицериды 3,04 0,20

2,32 .+ 0,31 2,41 0,18а'® 0,57 ±_ 0,07а 1,42 ±_ 0,37а-6 4,42 ± 0,30 2,98.+ 0,10а

а - Р < 0,С5: достоверность отличий в сравнении с контрольной группой;

Р 0,05: достоверность отличий между экспериментальными группами

(п - 5)

гиперхолестеринемия у гиперреактивных кроликов сопровождается стимуляцией секреции ЛОНП с высоким содержанием эфиров холестерина.

Гепатоциты гипореактивных кроликов синтезировали в 1,5 — 3 раза больше апоЕ в составе общей белковой фракции, чем клетки гиперреактивных животных (табл.3). Скорость секреции альбумина не отличалась между культивируемыми клетками экспериментальных групп животных, что говорит о специфичности различий в секреции апоЕ гепатоцитами гипо— и гиперреактивных кроликов. Поскольку апоЕ играет важную роль в обратном транспорте холестерина, заключительным этапом которого является ЛВП2~ опосредованный приток холестерина в печень, мы исследовали апобелковый состав ЛВП2 гипо — и гиперреактивных кроликов in vivo.

Таблица 3. Секреция апоЕ в составе ЛОНП и общей белковой фракции гепатоцитами контрольных, гипо— и гиперреактивных кроликов.

Контроль Гипореактивные Гиперреактивные хЮ3 имп./мин/мг белка клеток/24 часа

АпоЕдонП ~5 ± 0,3 6,8 i 1,1a 6,3 _±_ 2,7a

АпоЕобщ. 41,1 ± 2,2б 19,3 ±_ 1,6

АпоА—I 9,7 i 0,7б 6,5 ±_ 0,4

альбумин 452,7 ± 30,8 419,4 +_ 29,0

а — Р < 0,05: достоверность отличий в сравнении с контрольной группой; б — Р < 0,05: достоверность отличий между экспериментальными группами

(ч = 3).

Анализ фракции ЛВП2 (1,063<гК 1,125), выделенной из плазмы гипо— и гиперреактивных кроликов выявил значительные различия в содержании апоЕ в этих липопротеидах (рис.1). После электрофоретического разделения

АпоЕ АпоА-1

Гипо. Гипер.

Рис.1. Электрофорез в ПААГ АВП2, выделенных из плазмы гипо— и гиперреактивных кроликов.

апобелков методом денситометрии белковых полос установлено, что в ЛВП2 гипореактикных кроликов содержание апоЕ значительно (в 1,5 — 2 раза) увеличено по —сравнению с ЛВП2, выделенными из плазмы гиперреактивных кроликов. При этом содержание основного апобелка ЛВП — ano—А—I также увеличено в 1,2— 1,5 раза в ЛВП2 гипореактивных животных. Секреция апоА— I клетками гипореактивных кроликов на 20 — 50% выше по —сравнению с клетками гиперреактивных животных (табл.3). На основании этих данных можно предположить, что секретируемый печенью и другими периферическими органами апоЕ активно включается в состав липопротеидов плазмы. Увеличение апоЕ во фракции ЛВП2 повышает сродство этих липопротеидов к В/Е— и Е —рецепторам, что может стимулировать захват

ЛВП2 печенью и активации таким образом выведения холестерина из плазмы (Mahley et al.,1982).

Секреция желчных кислот гепатонитами гипо— и гиперреактивных кроликов.

Поскольку ключевой стадией выведения холестерина является его секреция в желчь после окисления в желчные кислоты, мы определили скорость секреции желчных кислот гепатоцитами гипо— и гиперреактивных кроликов. Основной желчной кислотой в культуральной среде гепатоцитов являлась холевая кислота. В следовых количествах присутствовали хенодеоксихолевая и деоксихолевая кислоты, что согласуется с данными Whiting et al. (1989). Продукция холевой кислоты гепатоцитами гипореактивных кроликов была в два раза выше, чем таковая клетками гиперреактивных животных; скорость секреции желчных кислот гепатоцитами контрольной группы практически не отличалась от таковой клетками гиперреактивной группы (рис.2).

Чтобы проверить, не являются ли обнаруженные различия в продукции желчных кислот гепатоцитами двух групп кроликов следствием длительного потребления холестерина, мы поставили вторую серию экспериментов как описано в главе "Материалы и методы". Скорость секреции конъюгированных желчных кислот гепатоцитами гипореактивных кроликов была в 1,5 — 2 раза выше, чем таковая клетками гиперреактивных животных (табл.4). Полученные результаты демонстрируют, что различия в секреции желчных кислот гепатоцитами гипо— и гиперреактивных кроликов не являются следствием длительного кормления холестерином, а существуют изначально.

Поскольку скорость продукции желчных кислот определяется активностью 7а — гидроксилазы, можно предположить, что явление гипореактивности связано с более высоким уровнем базальной активности

О С

со

01

О

Н

3

4

IV

и

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

контроль ГИПО.

гипер.

Рис.2. Секреция холевой кислоты культивируемыми гепатоцитами экспериментальных групп кроликов. а — Р < 0,05 — в сравнении с контрольной группой б — Р < 0,05 — в сравнении с гипореактивной группой (п=6).

Таблица 4. Секреция конъюгированных желчных кислот гепатоцитами гипо — и гиперреактивных кроликов, отобранных после недельного кормления холестерином и в дальнейшем получавших стандартный корм.

Гипореактивные Гиперреактивные мкг/мг белка клеток/24 часа

Таурохолевая кислота 0,87 ±_ 0,04 0,56 0,07®

Гликохолевая кислота 0,28 ±. 0,04 0,14 ±_ 0,02е

а — Р < 0,05: достоверность отличий между экспериментальными группами (п = 3).

этого фермента. С этим предположением согласуются результаты Hulcher et al. (1982), которые показали, что развитие алиментарной гиперхолестеринемии у инбредных голубей связано с низкой базальной активностью 7а — гидроксилазы в группе гиперреактивных особей. Остается неизвестным, чем может определяться разница в активности этого фермента у гипо— и гиперреактивных животных. Одним из возможных предположений может являться íó, что у этих животных активность 7а—гидроксилазы определяется различным составом желчных кислот, поступающих в печень в процессе энтерогепатической циркуляции и по —разному ингибирующих активность этого фермента (Heuman et al.,1988). Однако наши данные показывают, что состав желчных кислот в желчи гипо— и гиперреактивных кроликов неизменен и, следовательно, данный механизм не объясняет различий в скорости продукции желчных кислот у гипо — и гиперреактивных кроликов.

Суммируя вышесказанное, можно предположить, что относительно высокая скорость синтеза желчных кислот в печени может лежать в основе устойчивости к развитию гиперхолестеринемии при пищевой нагрузке холестерином. Нарушение выведения избыточного холестерина в желчь в виде желчных кислот приводит к его накоплению в печени. Это, в свою очередь, стимулирует секрецию эфиров холестерина в составе ЛОНП, что может приводить к развитию гиперхолестеринемии. Роль апоЕ как возможного фактора, способствующего устойчивости к развитию гиперхолестеринемии, может заключаться в стимуляции обратного транспорта холестерина в печень в составе ЛВПз рецептор — опосредованным путем с последующим окислением холестерина в желчные кислоты.

Влияние пробукола и других антиоксилантов на синтез холестерина и секрецию желчных кислот культивируемыми гепатоиитами кролика.

Поскольку относительно высокая скорость секреции желчных кислот печенью может лежать в основе устойчивости к развитию алиментарной гиперхолестеринемии, возникает вопрос о поиске лекарственных препаратов, способных стимулировать синтез желчных кислот в печени. Косвенные данные указывают, что таким препаратом может являться пробукол — известный гиполипидемический агент с антиоксидантными свойствами (М1еШпеп,1972). Его эффект на некоторые параметры метаболизма холестерина в гепатоцитах сравнивался с таковым а—токоферола, а также соединениями нового класса антиоксидантов — производных ПГНХ.

Добавление пробукола и одного из производных ПГНХ — гистохрома в первичную культуру гепатоцитов приводило через 24 часа к снижению скорости включения ацетата в холестерин, что согласуется с данными,

полученными в экспериментах на крысах (ВагпЬаЛ е1 а1.,1988). а—Токоферол, в отличие от пробукола, стимулировал этот процесс (табл.5). Другие исследуемые антиоксиданты — производные ПГНХ не влияли на синтез холестерина. Анализ ТХУ—осаждаемого материала клеток показал, что все исследуемые антиоксиданты в концентрации 100 мкМ практически не влияли на синтез общего белка клеток, определяемого по включению меченной аминокислоты (табл.5), что позволяет исключить неспецифическое влияние этих веществ на метаболизм липидов, синтез и секрецию белков гепатоцитами. Ингибирование синтеза холестерина под влиянием пробукола и гистохрома в концентрации 100 мкМ сопровождалось значительным увеличением внутриклеточного содержания свободного и этерифицированного холестерина соответственно на 35 — 55% и 50 — 60% (п = 3). В аналогичных концентрациях а—токоферол не вызывал внутриклеточного накопления нейтральных липидов.

Пробукол, гистохром и а —токоферол при максимально используемых концентрациях стимулировали синтез желчных кислот (рис.3). Другие исследуемые препараты ПГНХ не влияли на этот процесс. Поскольку известно, что холестерин, синтезируемый de novo преимущественно используется

Таблица 5. Влияние антиоксидантов на синтез [^С]холесторина в культивируемых гепатоцитах.

Антиоксидант, мкМ ['^С]холестерин [^С]белок

% от контроля

Пробукол 10 82,2 ± 9,3 94,4 ± 10,2

100 65,5 ±_ 7,0й 88,5 ± 8,9

Гистохром 10 96,9 ±_ 6,4 90,8 11,1

100 75,2 ± 5,8а 87,2 +_ 10,4

а — Токоферол 10 113,3 ± 4,4 89,8 ± 6,9

100 145,7 jf 10,4а 97,8 _±. 7,8

а — Р < 0,05: достоверность отличий в сравнении с контролем (п = 3). Контрольные значения для синтеза холестерина: 43,2 3,8 (х10^ имп./мин/мг белка клеток); для синтеза белка: 49,2 _+_ 2,7 (х104имп./мин/мг белка клеток).

гепатоцитами в качестве субстрата для синтеза желчных кислот (Einarsson et al.,1979), то эффект а-токоферола на этот процесс можно объяснить по-видимому увеличением пула de novo синтезируемого холестерина, который стимулирует 7а — гидроксилазу (Straka et а]., 1990). Это предположение согласуется с результатами Phonpanichrasamee et al. (1990), которые в

гистохром

пробукол а-токоферол

О

О

25 50 75 100

антиоксидант (мкМ)

Рис.3. Влияние антиоксидантов на синтез желчных кислот гепатоцитами.

экспериментах на кроликах показали, что а—токоферол стимулирует активность 7а—гидроксилазы и это приводит к снижению уровня холестерина в плазме при содержании животных на обогащенном холестерином корме. Пробукол и гистохром, в свою очередь, могут реализовать свой эффект только через увеличение захвата экзогенного холестерина в составе липопротеидов. На рис.4 представлена динамика накопления [ ^С ]холестерина ЛВП2 в гепатоцитах в присутствии и в отсутствии антиоксидантов. В отличие от а-токоферола, пробукол, и в меньшей степени гистохром увеличивали внутриклеточное содержание [ ^С]холестерина ЛВП2-

Инкубация гепатоцитов с ЛВП2 (250 мкг белка/мл) в течение 48 часов приводила к стимуляции синтеза конъюгированных желчных кислот на 20 — 25%. В присутствии пробукола и гистохрома (100 мкМ) и ЛВП2 наблюдалось

— Р < 0,05: достоверность отличий в сравнении с контролем (п=3).

дальнейшее увеличение синтеза и секреции желчных кислот (рис.5). Эти результаты и данные, представленные на рис.4 подтверждают наше предположение о том, что пробукол и гистохром могут стимулировать синтез желчных кислот опосредованно через увеличение доставки холестерина в гепатоциты в составе ЛВП2- Ранее в работе РГеи[[ег е1 а1. (1992) было показано, что пробукол стимулирует селективный захват эфиров холестерина ЛВП без эндоцитоза целой частицы.

Тот факт, что для проявления стимулирующего эффекта пробукола требуется достаточно продолжительное время инкубации (24 — 48 часов), позволило нам предположить, что под влиянием пробукола в среду секретируется какой—то фактор, который способствует увеличению захвата ЛВП2- Для осуществления такого захвата в ЛВП2 наиболее вероятным фактором, выступающим в качестве лиганда для связывания с В/Е— и Е —

рецепторами является апоЕ (КЬоо е1 а1.,1985). 00

пробукол * гистохром

п-токоферол контроль

0 3 6

1(1 24

время инкубации с ЛВП2 (часы)

Рис.4. Динамика накопления ['^С) холестерина ЛВП2 в культивируемых гепатецитах: влияние антиоксидантов. — Р < 0,05 — достоверность отличий в сравнении с контролем.

2.5

2.0

1.5

10 1.0

"к 0.5

0.0

таурохолевая гликохолевая кислота кислота

а,б £

о.* <

/

' О

Рис.5. Влияние ЛВП2 и антиоксидантов на секрецию конъюгированных желчных кислот гепатоцитами. а — Р < 0,05: в сравнении с контролем; 6 - Р < 0,05: в сравнении с ЛВП2, (п=3).

Чтобы проверить это предположение, синтезированную белковую фракцию, меченную [^С]лейцином и секретируемую культивируемыми в течение 24 часов в бессывороточной среде гепатоцитами в присутствии и в отсутствии препарата, разделяли методом электрофореза и определяли включение метки в апоЕ. Пробукол в концентрации 100 мкМ стимулировал скорость секреции апоЕ в 1,5 — 3 раза (рис.6).

По данным денситометрии установлено, что ЛВП2, преинкубированные в среде с пробуколом (100 мкМ), содержали в 2—3 раза больше апоЕ, чем ЛВП2, преинкубированные с клетками в среде без препарата. В то же время

ю 50

Ч у

40

30

20

10

О - контроль РЯ - пробукол

р*

и

л

эксп.1 эксп.2

эксп.З

I

Рис. 6. Влияние пробукола на синтез [^С]—меченного апоЕ в культивируемых

гепатоцитах. *

— Р < 0,05: достоверность отличий в сравнении с контролем.

следует отметить, что ЛВП2 преинкубированные с гепатоцитами в среде нёсодержащей пробукол, также обогащались апоЕ, но в меньшей степени, чем в среде, содержащей пробукол (рис.7). Поскольку секретируемый в присутствии пробукола и ассоциированный с ЛВП2 апоЕ должен стимулировать захват этих частиц клетками через В/Е— и Е —рецепторы (МаЫеу е1 а1.,1982), мы попытались продемонстрировать этот эффект на культивируемых фибробластах человека. Преинкубированные с гепатоцитами в течение 24 часов меченные холестерин! ^С]олеатом ЛВП2 в среде несодержащей пробукол, и затем добавленные в культуру фибробластов, на 40 — 60% эффективнее поглощались клетками, чем нативные меченные липопротеиды (табл.5). ЛВП2, преинкубированные с гепатоцитами в среде,

«Да

92.5

И 5,0 29,0

14 М

1 2 3

Рис.7. Электрофорез в ПААГ апопротеинов ЛВП2: влияние преинкубации с гепатоцитами и пробуколом.

1 — нативные ЛВП2 2 — ЛВП2, преинкубированные с гепатоцитами; 3 — ЛВП2, преинкубированные с гепатоцитами в присутствии пробукола. "

содержащей 100 мкМ пробукола, в 1,5 — 3 раза эффективнее захватывались фибробластами. В обоих случаях добавление моноклональных антител IgG С32 против ЛНП-рецептора, приводило к ингибированию захвата ЛВП2, меченных холестерин['^С]олеатом на 30 — 50% (табл.6). Добавление в той же концентрации мышиных неимунных IgG не ингибировало захвата меченных ЛВП2. Таким образом, пробукол в условиях продолжительной инкубации с гепатоцитами может стимулировать рецептор—опосредованный захват ЛВП2-Из ранее опубликованных данных, полученных в экспериментах на кроликах, следует, что пробукол увеличивает экспрессию мРНК апоЕ в периферических

Дпо Е Дяо A-I

тканях таких органов, как селезенка и мозг (АЬига1аш е1 а1., 1988). Также как и печень, это дополнительные источники поступления апоЕ в ЛВП2 плазмы, благодаря которым может активироваться рецептор — опосредованный транспорт холестерина в печень и стимулироваться продукция желчных кислот (Маккншоп (Н а1„ 1987; КоэукЬ е1 а1., 1991).

Таблица 6. Влияние пробукола и моноклональных антител 1дв С32 против ЛНП —рецептора на захват ЛВП2, меченных холестерин['^С]олеатом, культивируемыми фибробластами человека.

Среда культивирования Захват ЛВП2

+ ЛВП2 хЮ2 имп./мин/мг клеточного белка

Эксперимент 1 Эксперимент 2

1. Контроль 136,3 _±_ 11,4 92,1 _+ 7,5

2. Гепатоциты 146,7 +. 11,2 100,4 ± 8,8

3. Гепатоциты + 450,0 37,6а 229,8 15,1а

Пробукол 100 мкМ

4. Гепатоциты + 262,8 +. 25,2а'6 157,3 ± 14,2а.б

Пробукол 100 мкМ +

Гдв С32 30 мкг/мл

а — Р < 0,05: достоверность от\ичий в сравнении с контролем, б — Р < 0,05: достоверность отличий в сравнении с пробуколом (3). За контрольные приняты значения захвата ЛВП2, инкубировавшихся без клеток.

Полученные данные демонстрируют, что по—крайней мере отчасти, секретируемый под влиянием пробукола и встроенный в ЛВП2, апоЕ обеспечивает увеличение рецептор —опосредованного захвата ЛВП2 и последующую стимуляцию синтеза и секреции желчных кислот. Таким образом, исследуемые антиоксиданты — пробукол, а—токоферол " и соединение класса ПГНХ гистохром стимулируют синтез желчных кислот культивируемыми гепатоцитами. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования гистохрома и других производных ПГНХ в качестве потенциальных гиполипидемических препаратов.

шжш

1. Содержание холестерина и его эфиров в гепатоцитах гиперреактивных кроликов, получавших в течение 10 недель обогащенный холестерином корм, увеличивается в 1,2 и 1,7 раза соответственно по сравнению с таковым в клетках гипореактивных животных ив 1,2 и 2 раза по сравнению с клетками контрольных кроликов.

2. Относительное увеличение содержания эфиров холестерина в клетках гиперреактивных животных сопровождается стимуляцией скорости их секреции в составе ЛОНП по сравнению с гепатоцитами гипореактивных и контрольных кроликов в 2,5 и 3,7 раза соответственно.

3. Гепатоциты гипореактивных кроликов секретируют в 1,5 — 3 раза больше апоЕ, чем клетки гиперреактивных животных, при этом ЛВП2, выделенные из плазмы гипореактивных кроликов содержат в 1,5—2 раза больше апоЕ. Увеличение скорости секреции апоЕ и его ассоциация с ЛВП2 может приводить к стимуляции обратного транспорта холестерина у гипореактивных кроликов и повышению устойчивости к развитию гиперхолестеринемии.

4. Культивируемые гепатоциты гипореактивных кроликов при содержании животных как на богатом, так и на бедном по холестерину корме синтезируют в 2 раза больше желчных кислот, чем клетки гиперреактивных кроликов. Относительно высокая скорость синтеза желчных кислот является, по-видимому, основным механизмом устойчивости к развитию алиментарной гиперхолестеринемии у гипореактивных кроликов.

5. Пробукол, а-токоферол и гистохром — одно из производных полигидроксинафтахинона стимулируют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика, причем эффект пробукола и гистохрома сопровождается ингибированием синтеза холестерина, a d — токоферола его стимуляцией. Исследование механизма действия пробукола показало, что секретируемый под влиянием пробукола и ассоциированный с ЛВП2 апоЕ может обеспечивать увеличение рецептор —опосредованного захвата холестерина в составе ЛВП2 и последующую стимуляцию синтеза желчных кислот.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Podrez Е.А., Kosykh V.A., Lakeev Y.V., Kosenkov E.I., Repin V.S., Miettinen T. Bile acid production by cultured hepatocytes of hyporesponsive and hyperresponsive rabbits.— Abstracts of 57th EAS meeting, Lisbon, 1991, p.47.

2. Kosykh V.A., Podrez E.A., Lakeev Y.V. Bile acid and VLDL production by cultured hepatocytes of rabbits hypo— or hyperresponsive to dietary cholesterol.— Abstracts of 7th international simposium on lipoproteins and atherosclerosis, Dresden, 1991, p.88.

3. Лакеев Ю.В., Косых B.A., Косенков Е.И., Новиков В.П., Лебедев А.В., Репин B.C. Влияние природных и синтетических антиоксидантов —

полигидроксинафтахинонов на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика.— Бюлл. эксп. биол. мед., 1992, т.9, стр.266 — 272.

4. Podrez Е.А., Kosykh V.A., Lakeev Y.V., Kosenkov E.I.,. Mambetisaeva E.T., Repin V.S., Smirnov V.N., Miettinen T.A. Bile acids and VLDL production by cultured hepatocytes of hypo— or hyperresponsive rabbits.— In: Molecular biology of atherosclerosis, John Libbey and Company Ltd., 1992, p.34 —36.

5. Lakeev Y.V., Kosykh V.A., Kosenkov E.I., Tsibulsky V.P., Antonov I.A., Podrez E.A., Repin V.S. Regulation of bile acid synthesis in cultured rabbit hepatocytes: stimulation by probucol and a —tocopherol.— Abstracts of 59th EAS meeting, Nice, 1992. p.72.

6. Лакеев Ю.В., Косых B.A., Косенков Е.И., Цибульский Б.П., Тихомиров О.Ю., Антонов И.А., Репин B.C. Пробукол и а —токоферол стимулируют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика.— Биохимия, 1993, т.58, стр.406 —415.

7. Mambetisaeva Е., Lakeev Y., Podrez Е., Smirnov L., Kosykh V. Comparative effects of probucol and its analogue on lipoprotein metabolism in hepatocytes. — Abstracts of 62th EAS meeting, Jerusalem, 1993.

8. Podrez E.A., Kosykh V.A., Lakeev Y.V., Kosenkov E.I., Mambetisaeva E.T., Repin V S., Smirnov V.N., Miettinen T.A. Bile acid and very low density lipoprotein production by cultured hepatocytes from hypo— or hyperresponsive rabbits fed cholesterol.- Lipids, 1993, v.28, p.709-713.