Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение состава липидов органов и тканей энтерогепатической системы при внепеченочном холестазе и пути их коррекции (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменение состава липидов органов и тканей энтерогепатической системы при внепеченочном холестазе и пути их коррекции (экспериментальное исследование)"

ШДШЯ ЩИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ПИТАНШ

На правах рукописи

БАДЕЙНОВА Едена Николаевна

УДК 616,153,915ч616.36;577Д

ИЗШЕШ1Е СОСТАВА ДИОДОВ 0РГА1ЮВ И ШНЕЙ ШТЕРОГЕПАтаЧШКОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ВНЕЛЕЧШОЧНОи ХОЛЕСТАЗЕ И ПУТИ ИХ МОРРВДЧИ /экспериментальное исследование/

03.00,04, -Виохимия

Автореферат

диссертации на еоикаше ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательои институте педиатрии МЗ РСФСР

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор М.М.ЛЕВАЧ

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, профессор ЯРОВАЯ Г.. доктор биологических наук БУКИН Ю,В.

Ведущее учреждение -

Университет Дружбы народов им.А.Думуыбы

Защита диссертации состоится

г/^чьа. &Ö пин на заседании специализированного совета Д.001.02.01 при институте питания АШ СССР (1092 Москва, Ä-240, Устьинский проезд, д.2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти питания АМН СССР.

Авторе,'$ерат разослан "__*_________1991 г

Ученый секретарь

специализированного совета

кандидат медицинских наук В.И.Яминченкв

СВОЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

£к5нльность_що£леш. Метаболические сдвиги в организме, приводящие к изменениям биохимического состава желчи, являются, как известно, существенным признаком гепато-билиарной патологии (Мирошниченко В.П., Гайдай B.H,,Iü64; Вагнер Е.А. с соавт. Мансуров Х.Х., IÍ67). Заболевания органов желчевцделительной системы отличатся прогрессивным течением и нередко заканчиваются образованием кашей (¡Мансуров Х.Х.,1901; Комаров Ф.И. с соавт.,1963>, что приводит к необходимости оперативного лечения и связано с частичной утратой трудоспособности.

В настотцее время ведущая роль в нарушении коллоидального статуса жеячи отводятся дисбалансу следующих ее ли пи до в; общего холестерина, суммарных <!юсфолипадсв и суммарных желчных кислот (Фроль-кис A.B.v соавт. ,Iv6I; Дедарер t,M.< ссызг.,I9G3 j Гокчарак И.И. с соавт.и др.), результатом которого является перенасыщение желчи холестерином. По современным представлениям, факт повышения относительного содержания холестерина в состг ве желчных мичелл, выражаемый индексом литогенности, является существенной предпосылкой образования желчных камней. Одцако, как показьтеэтт результаты эпидемиологических исследований, желчь перенасыщенная холестерином нередко обнаруживается у практически здоровых людей (UikyktÁ -3'. ,1960; Анохина Г.А, с соавт.,1969). Имеются сведения и о весьма различной скорости кристаллизации холестерина при одном и том же индексе литогенности ('tó^ / rf.tffjS79), Таким образоу, наличие дополнительных факторов, определяющих образование желчных камней, представляется несомненным. Наименее ияучендам остается биохимический аспект этой проблемы.

Учиткрая тот \якт, что жирные кислоты являются наиболее иэме-нягизшис.« c'CTapKiv.v частями лигадов, опрегелггадими их функпио-напькуп слЛ', ггедставяяется «шипи исследование значения нару-

г .

аенкй метаболизма кирных кислот в изменении коллоидной стабильности желчи. Имеющиеся исследования йирнокнслстного 'пестра яйпкдов желчи в плане изучения ее литогенных свойств единичии и зачасти

противоречивы J.

KS I •Jtil't* tftti г/, 1936; Макс именно В.Е., IS69>. Интерес я роли жирных кислот т нарушении экскреторной функции печени обусловлен также возможностью направленного изменения состава липидон тканей диетой *

c7.,lf. Шб; Язева Л.И. и соавт.,1969; и др.Характер изменений внешнесекреторной функции печени и степени устойчивости компонентов желчи под влиянием обогащения рационов полиненасисечичми жир-кыш кислотами в условиях гепатсбилиарной патологии не изучен«

Раскрытие механизмов формирования биохимических изменений в келчи невозможно без комплексного подхода в изучении метаболическо го статуса не только желчи, но и всех органов,.объединенных сеть» энтерогепатической циркуляции. Ймзющиеся исследования посгященн, главным образом, лечйкочному свену ?тоЯ . слояной системы '' Гелулика Б.Р,, 1963j .'¿охов B.,i., Блздэчк ^ 1967; ЭльстеЯн Н.Б. с соавг. и др. Ч В то же еремн участие эктеропитов в обеспе-

чении липидного гомеостаза организма в . условиях гепатсбилиарной патологии не изучено, что затрудняет разработку адекватных способов коррекции нарушений внешесекрэторной фуикгтии печени.

Цель работы. Комплексное исследование изменений содержания липидо5 и их жирнокиспотного состава в органах и тквнях энтерс-гепатической системы, приводящих к нарушения биохимического ста-, туса жечии в условиях нарушения ее оттока, и обоснование способов коррекции выявленных расстройств. .

Для достижения поставленной цели 6vüo залланировано решение следующих задач: I. Выявить осовенностирк'этчения ясирнь'х кислот в состав различных тегшднь'х .^пакгиЛ желчи, крови, тганий печени и тонкого кишечника.в условиях «тентяркоА гаперхолостеринемии и т* различных этапах,- кюпйчено^ог1» хояеетпаа.

- о -

'¿. Разработать биохимические критерии диагностики раингз^ стадии внепеченочного холестаэа и оценки литогенных свойств жчлчи.

3, Оценить эффективность обогыцения рациона полиненасицониыми мирными кислотами ( -3) и пицрвыми растительными волокнимл ни нормализацию литогенных свойств жеячи в условиях нарушения ее оттока.

^первуе проведено комплексное исследование и дана сравнительная характеристики ли-пидного обмена е изучением лирнокислотного состава фракций нейтрально липидов и фосфолилидов в органах и тканях энтерогепьтичес-кой система под воздействием различных этиологических факторов холелитипза: алиментарной гиперхоластеринемии и экспериментального энепеченочного холестаза.

»Ьказена вьсокая гЧ«|>ентивность определения соотношения семи показателей липидного обмена (зфирон холестерина, суммы тауро-коньагатов желчных кислот, фосфатидияхолина, лизофосфатидилхолине, свободных аирных кислот, арахидоновой кислоты в составе фосфати-дплхопина и олеиновой кислоты в составе зфнров холестерина желчи) дяя оценки яитпгеннык свойств яелчи и выявления холвлитиаза.

Ьпарвь'в при гелагэвиж&рноР патологии на фоне нерушения оттока жёлчи изучена функция тонкого кишечника в регуляции распределения липидов и составйяицих их жирных кислот.

«1сеявдованы особенности Формирования липидных комплексов в органах и тканях эитерогеиатичеакоИ системы при обогащении рациона кроликов с ннепеченочнь'М хо лес тазом лянетолом и пищевыми рас тигель-' НЬЯМ яолокнями.

»'«рачтичрская значимость работы, фактически важной является тстадордонная в услогиях. эксперимента взаимосвязь нарушений включения жчрн'ч-яиояот в с ос тар лмпиднкх фракций крови и желчи с развитом нятчттчеакио ирогпсса в т^.то-билиаиной зоне, '¡змене-ние огнпоитсльного содержания ряда уионгх кислот в составе основ-

нь'Х липидных фракций келчи отражается на ее коллоидной стабильности, и, следователь, з, при оценке литогеннкх сьойстн желчи необходимо уч ии-рать содержание индивидуальных франций нс-йтрял*нюс и фосфолипидов и их жирнокислэтш Я состав. Важным для практическою здравоохранения является также установленное в .эксперименте влияние обогащения рациона иолиненасмценнкми жири^и кислотами сем. /г'-З и лищевьми растительными волокнами ьа литогенные свойс ва желчи.

"Материалы диссертации доложена:

1. На »лежинститутской конференции изобретателей и рационализаторе в области медицинк Порький,

2. На совместной научно-практической конференции молодкх ученых ГорькоЕского медицинского института и ш'л педи&трии "^аука -прейти чес к ому здравоохранению" \Горький, Ь^о').

3. На заседаниях Горьковссого отделения Ьсесопэного биохимического общества (Горький,

^^Йй^Шй*''0 теме диссертации опубликовано 4 пачатнь'х работь-, перечень которьх приводится г конце автореферата. .

1. Для оценки коллоидной стабильности желчи необходимо учитывать соотношение раэличннх липиднкх фрсямий желчи-и их жирнокислог-ный состав. Общепринятая характеристики литогенных свойств желчи по соотношению ее основных липидов'- общего холезтерина, суммарных фосфолипидов и халатов - не является объективным критерием наличия желчных кашей.

2. Обоснование целесообразности коррекции нарушений биохимического статуса желчи с ¿-четом целенаправленного воздействия применяемого препарата на метаболизм липидон в тзнко.ч кишечнике".

3. Доказательство неэффективности сбрг;здркия рациона '. пояиненась«-щечннш юрн^и киоясУгамй.Чсчм.' для снижения лятогенкых; свойств келчи при внепеченочн'ом «огестазе у кролаксв.' • •.'.■

_ а -

Лате риалы диссертации изложен» нч 1о2 страницах машинописного текста и состоят из введения, обзора литература, трех гляп собсгненммс исследований, заключения, вмно-дор и указателя литературы. Списои использованной литератур состоит из 10У отечественных и «¿12 зарубежных источников. Раоота иллюстрирована 22 табличмми и 12 рисунками.

- .4А'ГЬЫАЛ »1 ЛьТОДЫ гЮ^-гДИоЛЫ!. представляемая работа является акснергментальным исследованием, выполненные на чрлликах-самках трьх-митгрех месячного возраста, весом 1,^-2,0 кг, у которых были изучены особенности формирования липицнь:х комплексов органов и тканей знгерогепг.тической системы (Э1С) под воздействием различных этиологических факторов, приводящих к наругаенип биoxиvичecxoгa статуса лелчи.

Кроликов содержали на общетринятом рационе, включающем воду, ржаной хлеб, овес, ячмень и сырые картофель, морковь, капусту и свеклу (Батрак Г.ь., Кудрин А.Н. ,1у7у 1. Калорийность раниона составила Зо ккал на 100 г массь' животного. 14,31! калорийности обеспсчивалось за счет белков, - жиров, 62,2% -углеводов.

Контрольных животных в течение I мес.содержали на стандартной диете, затем забивали. У кроликов остальных экспериментальных групп получали различные формы нарушения биохимического статуса желчи в условиях, вызывающих повышение ее литогеннооти - при алиментарной гиперхолестеринемии .1 при частичном нарушении оттока желчи. Объем проведенных исследований представлен на схеме I. •

Развитие алиментарной гиперхолестеринемии вызывали ежедневным добавлением к рашону интакгных животных 2Х от веса рациона чистого холестерина в течение грех месяцев

^кстранечгночный холеетаз воспроизводили дозированным сужением пузгрного протока го методу м.Л.Гараховского с соарт. (IV.'/). Широтных с лкстраг.рирночным холеотаэом забивали череА 2 или 4 недели ног: по огкт.^'-ми.

Схема I.

Контроль Алиментарная гипер-холестери-немия _______Ьнг 2-х нед. п^ченочньй___лолесгоз_______ 4-х недельнгЯ

стандартный рацион стандарт-нкй рацион »Цт а -3 Хк'Ъ

8 6 о- о V 0

Лспользуемье субстрагн энгерогеиатической системы.

Оттекающая от печени кровь

Iепатотлтм

леячь

Химус |.

Оттекакщая от кишечника нрооь_

„_¡^нтероцитн

.ь1зучаемнП пинидннй спектр биологических жидкостей и тканей.

л1

адлчные кислоты

К да^+Ш

гэдивдс

Хл Й»

Е1

. ^ Л И П И Д Ь>

Нейтральнее ли пидм $ОСфОЛ/ИИДЫ

I

¡Спектр тарных кислот^ ¡Спектр жирны/, кислот

Рипион части животных с дозированной перетяжкой общего желчного протока обогащали ежедневным включением с течение I мес. после операции препарата полиненасиценных жирных кислот (¿¡пъп) (в основном семейства /"-3) линч толе, которой вводили у*'* через эовд в количестве 0,5 т I роя в сутки. С целью инактивации процессов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот лине-тол применяла в присутствии известного антнокеиданта -¿-токоферол ацетата в количестве 0,02 г- (Бяграк Г.'С., Кудрин А.Н., 1979). Ь рацион другой груипь: кроликов с дозированной перетяжкой хояедоха включали луговое сено е количестве г/сутки, как дополнит'«?льнк источник пие^емс радтительнкх волокон \iiPii) в форме нерастворимой

клетчатки,

С целью изучения влияния изменений состани лмпидов, жирных и желчных кислот на коллоидную стабильность желчи, ними иссл^дош.лсн спектр отих иипкдов ь желии, а также в тканях и биоло»ичоских жидкостях, обеспечивающих их энт^рогелатичеоку» циркуляцию (схема!). Органы и ткани забирали в острой опыте, утром, натощак, Ьремн голодания до забоя - Iu чассп. '¡осле внутривенного введения летальной дозы раствора гексенвла проводили вскрытие брюшной полости. При работающем сердць иопучь ли оттекающую от кишечника кровь из воротной аены. Затем воротную вену пережимали и собирали оттекающую от печени кровь из нижней полай вены. Желчь собирали, отсасывая ее из желчного пузкря. Для получения изолированных клеток печени и слизистой кишечника, аискобленн й на протяжении верхней трети тонкой кишки, использовали диссоциирующий раствор, содержащий гомплексон ЗДТл ¿Панаева ti.il. с совет. ,1У/Ь).

Затеи нз полученных биологических жидкостей и тканей экстрагировали общие липидн по методу A'üfr c'f, л7- (ivo?), Экстракт использовали для тонкослойной хроматографии нейтральных лигшдов (МЛ)

и фосфолипидов (М). Разделение HJ1 по фракциям осуществляли на

р

стеклянных пластинах (Iüx2b см ) о 1,0-1,2 мм слоем силикагеля "CinriUpiC "(ЧССР) иврки ЛС d/40 и!л в двух системах; дизтиловый эфир¡бензол:этанолгледяная уксусная кислота (40 :з0;2;0,2) и гексам: зфир i fltf/'/Ujt / ,т' ах>), Для разделения из биосред

использовали аналогичные '.пластины и хроматографическуи систему, состоящую из хлороформа:метаяола:води, (0У;2Ь;4) {JUÜi'tt. Ж , 1а/6). Количественную опенку проводили с помощью деиситометрин на регистрирующем устойстеэ »WG-4aI,

мля анализа жирнокислотного спектра яипидов использовал» газа RLit хроматограф "цвет-ПО". Разделение проводили при условиях кр;»«атогоа-Ьфо вопия, разрабоганиьх Ьогдариным i-'.A, с соавт.(1ус2) , Ог.очтр желчн|»х кис лот определяли по методу тонкослойной хро-

- о -

матографии на силуфалов'-х пластинках размером см^(ЧССР).

Разделение холатов осуществляли в системе толуол: ледчняя уксусная кис гота: вода (Ь;12:1) (..еянов А.И. Количественное определе-

ние отдельных желчных кислот проводили путем спектрофомметрии элгсатов пятен. Результат оценивали по калибровочном кривь-м, построенным на основании экстинкши ипвестных количеств стандартов желчных кислот (фирмы "И-'и^ч "). предварительву» подготовку биосубстратов и экстракцию желчных кислот из сыворотки крови, гегтто-цитоя и энтероцитов осуществляли яри условиях, разработанных Ьлю-гером А.Ф, с соавт. йелчь к хроматографии подготавли-

вали добавляя к 0,1 мл пузырной желчи 0,4 мл -о°слирта, по-

догревали при ьОиС р течение 3 мин., хлопья удаляли центрифугированием.

Аля оценки лнтогоннкх свойств ж:>ячи в шшшх исследованиях мн пользовались аналитическим методом определения н&о;-щения желчи холестерином, предложенным иы>3),

Ста.гнстическвл обработка » определений достоверности цифровых показателей по критерию Стьпдента проведены с использованием ЪЪА

РЕЗУЛЬТАТЫ ССВДСБаШЫ А ИХ РЕШЕНИЕ.

Проведенные исследования выявили следующую картину, ¿¡ри алиментарной гиперхолестеринеши и частичном наруиении оттока желчи, т.е. в условиях повышающих риск литогенеза, в содержании показателей лия'идного обмена отмечается ряд общих изменений, индуцированных избытком холестерина ¡? оргзииз««. %еаде всего, развитие эндо- и экзогенной гиперхолестеринекии повлекло за собой усиление эстеразной активности печени и тонкого кишечника (уабл.Т). Усиление эстерификации свободного холестерина 1СХ) сопровождается присоединением к холестерину зккркых кислот из других лигтидакх фрак-ПИЙ. Гак, в клетках печени и тонкого кишечника при внепеченочнии хслестяре отмечается достовернее снижение уровня триапйлглкп.ёркнор

СГГ) и накопление продуетон их гидролиза - свободных жирных кие-ло1!' СОл'Д), Последние могут утилизироваться в реакции с участием фермента лХлТ, которм-Й, как известно, катализирует присоединение СЖ к холестерину с образованием эфиров холестерина (иХ). 0 о значительным усилением процессов астерификации СХ,возможно, до некоторой степени связано и достовернее уменьшение концентрации фосфатидил-холина (£Х) - основного фосфолилида органов и тканей - во всех иэуяаемых субстратах, за исключением энтеропитов у животных с алиментарной гиперхолестеринемией. Одновременно в тканях печени и кишечника кроликов обеих групп отмечается накопление метаболита ИС - лизо*>Х. Нрковыраженные детергентные свойства последнего могут способствовать нарушению целостности мембран и развитию патологического процесса (Алимова а. К. 0 с^авт. .

Па этапе 3-х месячной алиментарной гиперхолестеринемии увеличение содержания ¿X в тканях печени и тонкого кишечника отмечается в меньшей степени, чем при 4-х недельном внепеченочном холестаэе, -Последнее обусловливает менее выраженные отклонения в спектре ли-пидов, участвующих в метаболических превращениях свободного холестерина - СлК, ХГ, -IX и лизо^Х, однако тенденции в изменении этих липидных фракций при алиментарней гиперхолестеринемии и вне-печеночном холестез« носят однонаправленный характер (табл.1).

Ь жирнокислотном спектре тапидов у "животных с алиментарной гиперхолестериьемией и внепвчьночным холестазом также отмечается ряд однонаправленных изменений, "Чрезвычайной" мерой борьбы с» иэбыточнмм свободным холестерином в клетке является, по-видимому, усиление биосинтеза олеиновой кислоты в тканях печени и тонкого кишечника, т.к. установлено, что на эстериЛикацию СХ преимущественно используется олеат {¿'"¿а \fltyint М , Как показали результаты нашх исследований, в гепатщштах, энгерог.итах к крови, но Не р я'-лчи, жиротных ос?еих групп происходит накопление олеатов холесгрринч »тм .г.!'», чдюврРМпнно олеиновая кислота 1Ь:X1 пере-

Тай;

'одеряание основных липиднък фракций, холатов и иирнмх кислот в органах и тканях кроликов с алиментарной гиперхолестеринемией и внепеченочнум холест

липа ■гг

адом.

Субстрат

1епато-

иитм,

кг/г

онтеро-ниты, мг/г

яелчь, ммоль/л

Оттекет-щая от печени кровь. шоль/л

СХ

4,76+ 0.47-

ЗС

2,32+

18,74+х 5.60+ 2 9- 10 42-

СЖ

тг

0,96+

6,53 гх* I 31"

1,38 г

15,Зс 1,60

12,20 г

0.58-

2.1У+ I

°139Г~_ !

"§,14™'

1143~ _* __ Х-

0^90"

~5,04+ 2,79 +

19,31+Ьс2,42+Х 2*50~" ;0,6Ь-

"о71б"*"'То,й+~"

0^04- !0[15Г

0 ,89+""|0, 35+ п ,05~ 'О 1СГ

1.62-

1\36+

т 'по—

39,9

Л Г

1>Г ___

"о, 41+

:0 1(Г

~4,7бТх 0[о4-

~2,907" ■О 4СГ

4 7"

15,8+х [1,27+х 9 76

'4.62+хх-О '70-

13л6+х ¡0,23 3

Т II- Ь'пч— п

_________.ежи

0,15-___

,„,07+х

о ог-

3,57^ 3.25+*

О! Ее" ¡О'.Зб"___

'0.66+:гЯ2,ЬС+~*Ь,б5~ ' О'14" |0!33- Ю!02-

.бОг™

_0ХУГ 0*05-О Ы

0,80 ь

лиэсйС

0,15+ О 03-

0,69+х О 07-

0,32+х О ЗСГ

0,44+

1,05+ 0^30-

"2,457х"

о;е2-

0,35^

о1о£г_

1,66+*

-оЖ™

°1071-~0.141- ~

0[0Г"_ о,п7

о,оь7

ФХ

Сумма ! Содерг??.-желчиьж ( ние 1Ь;1 ^ кислот I к-тн/^/в ЙХ

17,91+ О^ВСГ "10,407Х 2 73"

0,325+ 0]034~

I

0,469+ 0 .07 -

17,9,-2^3-

47,3+х 4 5"

12,56+*

1.37-

0,346»-0 07 ~

31,6+Ьс

11,66+ 0[7СГ

0 324+ 0{035~

11,7+

12,71+ 0,328+ ___1|2:-,0;0о0-

К,45+^x0,459+

ia.iv

7,2ЬХ _0*Ь4"

пз,г>

143,3 +

.Шт

4,27+^102.3+

0,63+ р 020+ 0*05~ ¡о^оог-

~ 0,42+х"Б 025+

.К004"".

~~5,447хО,ОГ;7" ^ о;о7~ р;оо&-

30,В+Х

ьхо~

"0,97™ 18-

0

1

9,3 + _____

13,01 з^сг

"яо,б7" ____

41,5+х _____

36,7+х

-А)!

п,

римечание:

'-контроль, I-алиментарная гиперхолестеринемия, 2- 4-х нед.чиепеченочный холестаэ, :- достогеркке различия по сравнения с контролем, хх - меаду I и 2 группами

- Il -

распределяется и го другим фрккгилм lui и '/J1 органон и тканей ¡31 С, Таким о') раз о м, щ.шенаэнашпе ¡..змен^иия в содержании ità, ¿д и ссстевяяпщих их жирных кислот у жирэтиде двух сравниваем»-х групп ян лямтся сбщеГ' ццялташснной реакцией организма в ответ на развимю-щуюся гиперхолестеринемию.

а то же время нарушение оттока желчи сущьстиенним образом отражается на функциональном состоянии гепагоцига (Логинов A. , Че-банов G.-i., lS£>£). jрзяень сумларнкх желчных кислот в ткани печени и келчи при нарушении ее оттока оказался в 1,4 раза ниже, чем у кроликов, получавших вгсо^зколястеркновый рашон (табл.1). Ослабление процессор V гидроксилирования холестерина до желчных кислот, имеющее место при хслестазе (Князева д.С., Шорохова K.Ï.,1у6о), зопровождаятся, по-видимому, компенсаторным усилением других процессов, направленных на нейгрализымю вредного воздействия избытка свободного холестерина, i¡сдобным процессом в условиях частичного крушения оттока келчи является, на наш взгляд, усиление эстерифи-(ации СХ. Доля ЬХ у животных с I мес.внепеченочным холестаэом в ;оставе общего холестерина гепатоцитов составила в составе )бщего холестерина йнтероштов - ¿>035, тогда как у животных с алн-1енгарной гиперхолестеринеиией - соответственно 23^ и Щ (в конт-|Оле - 33% и '<'% ).

¿5 условиях прогрессирояания патологического процесса в печени а этапе I мес.холестаза (по д.лшш морфологического исследования) оль тонкого кишечника в обеспечении нового лигти.цного статуса оргн-изма еуществённо повышается. '<->6 этом свидетельствует, в частности, от факт, что еоли при алиментарной гип е рхо лес т е р и п е ми и уровень СХ энтеро(титах и гепатопитях увеличивается в одинаковой степени в 4,2 и S,- ряда соотретстпрчно), то при 4-х недельном холесгялз геличение консгигрании СХ п плетках тонкого кклечника происходит 3fa рвэя, дч -гя.ч в пр-'гни 'т.чь.чо р разя, данное обстоя-

: льет во мтчет овяз«ло с тгм, что "'сил^нир синтеза х'."Д< -Л"»рйП'

при холестаэе происходит не только в гепатоцитах, но также и в энтероиитах. ¿тому может способствовать и достоверное уменьшение при нарушении оттока же лчи концентрации холят о в в химусе 1,07 ммоль/л по сравнение с Ь,16+р,оо ммоль/л в контроле), являг щихся, как известно, регулятор.чыи ,'синтеза холестерина в кишечник

,19'И). Одновременно в клетках тонкого кишечника происходит значительное усиление процессов, ответственных за эстерификаиию СХ; по сравнению с контролем уровень а\ в энтероцитах увеличился в 42,5 раза, тогда как в гепатоцитах только в Ь,4 раза (при алиментарной гиперхолестеринемии - в а,6 и 2,4 раза соответственно). Ускоренная эстерификапия СХ в кишечнике обусловливает, очевидно» и более ш-.рзяенкое увеличение относитель' ного содержания олеиновой кислоты в составе йЛ и ¿-1 энтеропитов по сравнению с гепатоцитами СрисД.). ^ри эгом нельзя исключить возможности усиления биосинтеза Ш:I кислоты непосредственно слизистой тонкого кишечника. Та/, например, доказеяс наличие в эпителии слизистой оболочки тонкой низки фяруенгных систем, осуществляя 1цих дес&турацию и з лонг ада» 1Ъ;2 кислоты до 20:4 кислоты (Астваца-турьян А.Т. с соавт. ,1*79),

|>1етаболиом высших жирных кислот остается наименее изученным разделом в общей картине липидкого обмена при генатобилиарной патологии. Нами установлено, что начальный - 2-х недельный этап -холестаэа характеризуется, в осноином, снижением доли .полиеновых кислот (главным образом за счет 1Ь;3 кислоты) и увеличением в составе НЯ гепатоцитов, желчи и крови 1Ь:0 кислоты. Для энгероштов подобные изменения показаны в меньшей степени. Увеличение малоактивной в метаболическом отношении 1Ь;0 кислоты в ряде липиднкх фракций приводит к нарушению их физиологических функций, т.к. ли-пидм становятся малорастворимыми и менее лодвижйь-ми, ло сравнению с этими ке липиднкми фракциями, если в их состав зходят незаменимые

Рие. I. Содержание основных жирных кислот к состчве лишдоя органоз и тканей Э1С на этапе 4-х нед.холестаза.

жирные кислоты. й£/иа/г Я, г/Ж (1У65) полагают, что ирпным признаком дсфицит-1 эссекциаяьных тогриьх кислот является снижение содержания 1Ь:2 кислоты и увеличение синтеза нрсыценных кислот г? особенно наименее активней стеариновой киеклы. Не и-гклг.чгн'!, чп

недостаточная концентрация полменбвых кнелат является одной из важных причин разбивающейся на фоне холестаза гиперхолестерине-мии, т.к. в результате дефицита этих кислот снижается их тормозя-» щее действие на синтез холестерина Л ы'. ,1*74).

При уменьшении количества незаменимых высших жирных кислот, обусловленного, по-ьидимому, усиленной их утилизацией в ткьнях в качестве первостепенного пластичэского и энергетического материала» а также нарушенным процессом всасывания «ирных кислот пищи, в организме развивается компенсаторная реакция, направленная на восстановление ь балансе полиеновых кислот. В частности, это проявля* ется в усилении утилизации 1й;3 кислоты, доля которой в составе НЛ и энтероцигов, а также ИЛ гзпятоцитов, на этапе 4-х нед.хол* стаза существенно уаеличиваегся (рис.1), по пути образования полил-ноытх жирных кисиот. В условиях дефицита 1Ь;2 кислоты обмен жирных кислот И'-Ъ серии не подавляется, увеличивается количество к». олеиновой кислоты, так и ее метаболитов {Нау?и^Й Л ,1^60),

в частности, появляется 20¡3 /^-5 эйкозатриеаовая кислота (до 1% от суммы жирных кислот). Образовавшиеся триековые кислоты не являются, однако, кислотами линолевого типа и поэтому не могут служить эквивалентной заменой незаменимых кислот в случае их дефицит» при синтезе липидных фракций ( С. ,1974).

В этой связи, нам представлялось, что одним из путей коррекции нарушений липидного обмена при внепеченочном холестазе может служить обогащение рациона экспериментальных животных незаменимшй жирнкми кислотами. В качестве источника полиеновых кислот нами бул использован препарат линетол, яирнокислотный спектр которого на представлен линоленовой ( н) -3) и 18,сУ| линолевой (^-6)

кислотами. Обогащение региона кроликов с холесгазом 11НЖК вызвало гсгг.лькэй повмгение ненасьадекности тканевых липидов, преимуществен-счрт всзрпстания относительного содержания 1Ь:3 кислоть1, что пе-вцдиусм..*» на изменении параметров Функционального

- 1а -

состояния мембран, а также на активности мембрашосвяэаннктс ферментов (Лупиношч Ь.Л. с соарт., 1*^7). Последнее привело к тому, что обогащение рациона кроликов с холсстазом ¿¡¡¿ХК вкапало сущнстпсннъ"? изменения не только в жирьокислотном спектре лини,нов, но также и в абсолютном содержания некоторых яипиднкх фракций гипатоцитов и эн-тероцитов. Лрзжде всего, значительно ослабевает зфиросинтетичесхзл функция печени и тонкого кишечника, являющаяся, как было показано в псе, основным источником нейтрализации вредного воздействия избытка свободного холестерина при пнепеченочном холестазе. Уровень сХ гепатоцитов при обогащении рациона сем. ^-3 понизчлся до 7,2^+0,у мг/г, энгероцитов - до 1,о2+0,о мг/г, желчи - до 3,Ы+0,Ь ммоль/л. Одновременно снижается способность гепатоцитов превращать холестерин в желчные кислоты. Суммарное содержание холатов в желчи -снижается до о6,.'ЗЧ),У4 ммоль/л. Ь лшшдном спектре гепатоглточ достоверно уменьшается концентрация (7,66+0,4 мг/г) и увеличивается уровень его метаболита - лизой (1,3^+0,4 мг/г). Тем не менее в тканях п?чени и тонкого кишечнике ко происходит дальнейшего накопления свободного холестерина, избыток его начинает усиленно экскрети-рояаться в желчь и инкретироваться в кровь. Последнему,безусловно, зпоссбствует специфическая перестройка жнрнокислотного спектра ли-чидов мембран гепатоцитов и эктероцитов.

Следствием обогащения рациона кроликов с холестаэом 11НЖК сем. У-3 явилось существенное изменение у них внешнесекреторной функ-ш печени, которое привело к увеличению лигогеннсго индекса жолчи • этой группы животных до 2,ио+р,63 4по сравнению с 0,75+0,20 в онтроле) и образовании холостериновьт? желчных камней у о7% животик: той груипк. Литогенн1-й индекс у живэтних с внепечатнкм хслестп-зм, содержащихся на стандартном рационе, увеличивался в меньшей тепени - до 1,Зи+0,Э1 при двухнедельном холеотазе и до а этапе 4-х нед.холестазе. Однако образования жеячн:-.?: конкрг-м^нг

у животных этих двух групп не происходит, чту, как мы полагаем, может бить связано с рядом коипенсаторннх изменений в лштдном и зырноккелотом спектрах желчи. Отсутствие камней б желчном пузыре имеет место также у животных с 3-х месячной алиментарной гипер-хоиеотеринемией, несмотря на то, что индекс ли-гогчзнности'у них составил 3,00^0,72,-Следовательно, общепринятая в настоящее время оценка литогенных свойств желчи по соотношению 3-х основных классов «алчных лнлидов по-видимому, не может считаться достаточно надежным индикатором конкрементов в желчном пузыре.

В развитии холестеринового литогенеза важная роль, очевидно, принадлежит дисбалансу тех сторон обмена липидов, которые затрагивают метаболизм индивидуальных «елчных и жирных кислот, в также соотношение отдельных фракций Ш1 и желчи.

Так, содержание СЕЧ в желчи животных с алиментарной гипер- • холеетеринемией в 12,7 рада выше (1,27+0,24 ммоль/л^, чем у живет-них с холестазом, получавших линетол (0,10+0,02 ммоль/л) (рис.2). В качестве компенсаторных изменений на фоне неблагоприятного соотношения желчных лнлидов у животных с алиментарной гиперхолестеринг мией можно расценивать, по-вндшому, значительное увеличение доли ЙО;4 кислоты в состава 4Х желчи у животных втой группы: 30,4+6,3$ по сравнению с 4,В+0,б& у контрольных кроликов (р40,0о) и (

у киротньех с холестазом, содержащихся на лине толе (р<с0,0о), Одновременно в составе ФЛ желчи кроликов о алиментарной гипержолесте-рннемиеЙ снижается процент насыщенных (16:0 и 1Ь;0> кислот. Такое перераспределение трнокчалотного спектра ФЛ при избыточном потреблении холестерина возможно позволяет им более эффективно уч&ст вочать в процессах солюбилизации желчного холестерина (Галлер Г. с еоавт.,*^).

Обращает внимание значительное увеличение доли 1о¡1 кислоты » сос.рь ЬХ желчи у животных с холестазом, соаержчщихся на ра-;-•• ,!:,- ".г-.; гу!г?нном йййС 132,2^3, . подобное увеличен»? содернаки

- Ib -

Lo ; 1 к'лслотн в составе ЭХ келчи отмечено нами тать у живстньх с калькулезным холециститом (27,3+3,0%), не получавших каких-либо фармакологических препаратов и диетических добавок, «а этом основании сделано предположение, что вэзрьстание доли олеиновой кислоты во фракции ЙХ желчи может служить прогностическим признаком обра-эоеышя холестериновых желчных камней. Механизм подобного взаимо-дгйстзня не ясоц, Некоторые исследователи полагают, что неблвго-приягное воздействие IU:I кислоты связано с тем, что в организме кроликов она служит источником углерода, используемого в синтезе холестерина ( 4ï ¿>J ef.&C ,Ivb?). Проведенная нами корреляция между абсолютным содержанием ХВкислоты во фракции SX и уровнем общего холестерина позволила выявить высокую степень корреляционной связи меяду агами показателями как в печени С К- ,7У), так и в тонком кишечнике (î =+0,В4), т.е. органах, принимающих активное участие в-мет#боллз»лз холестерина, В келчи эта взаимосвязь оказалась значительно слабее (£-=+0,37),

Существенные различия у животных с алиментарной гиперхолестеринеиией и I иес.холестазоы, содержащимися на линетоле, отмечаются также и в желчнокисяотном спектре келчи. Кроме того, что суммарное содержание желчных кислот у животных, получавших на фоне холестаза 1ШК сем. значительно ниже, чем у кроликов о алиментарной гиперхоаеотерииемией, в 3 раза у них уменьшается содержание таури-новых кониогатов и хенодезоксихолевой кислоты, что является, поводимому, дополнительным неблагоприятным признаком, т.к. показано, что тауроконъигаты способны ускорять ток желчи, предупреждать холе-стаэ и индуцировать секрешс ФИ и холестерина Ww^lybb;

JiiiÙ-'d.ïUi' A t'f- ,1Ш7), а увеличение насьзцения желчи ХДХК резко усиливает переход кристаллов холестерина в жидкую фазу (к'-енсуров Х.Х., Uwien.J66 4»fX.,I664j Логинов A,C.,lJ85).

iicfiîf, оказалось, что в нарушении коллоидной стабильности желчи, с-1 .--;-тннсЛ с, глубокими изменениями метаболизма липидав в печени и

тонком кишечнике, кек в условиях гепата-билиарной патологии, так и при алиментарной гиперхолестерииемии, существенное значение имеют изменения следуяа^х показателей липидною обмена: СЖ, ЗХ, лизо'й, ¿К, тауроконъюгатов желчных кислот, относительного содержания 20;4 кислоты в составе ¿X и 1Ь:I кислоты в составе ЭХ желчи. В этой сряян, по соотношению вышеназванных показателей липидного и желчнокисяот-ного обмена, нами был проведен дискриминадгнкй /разграничительный/ анализ №иган Ь.Н., 1УЬ6) совокупности лииейннх дискриминантных Функций у трех групп кроликов: в контроле, при 4-х иед.бескаменном холлстазз и у группы животных с колесгеринопыми желчными камнями, разбившимися на фоне холест;»яа при обогрл;ении ратиона ЛНЖК. На основании группировки семи тиагнйэьакных значений признаков у 3-х групп крэлккоь нами были получены следующие дискрнминантные функции: I) для контрольной группк /Д^/: Д| = 3085+2,0У6Ь7.а + 0049з.» + э,944и*.с + ЗЪ,1221Л-(/ + 48,ъ342о.е - 0,22432.к 4-Л,146о4'1 , где а-кониентрамия ¿л в желчи (ммоль/л), в- суммарная сошентрацня тдуроконъпгатов желчна кислот (мг$), с - концентрация ?Х (ммолъ/л), ,{ -кснцентрагия язм (ммоль/л), е-кониентрация ^КК ммоль/л), к-относительнее содержание 20:4 кислоты в составе ФХ клчи (тЙ), ¿-относительное содерк;'Ние 18:1 кислоты в составе ЭХ ;елчи

) для группы животных с бесиаменным холестазом /Д^/: -87,2У9У7^-6,23^оо«а + 0,ОЗОЫ'Б ч- 0,0о267'С * + 71,16035.е 4-

0,6о2У4-К + . -

) для группы животных с каль.кулезным холециститом /Д3/: Д3-ЬО,Ь377о + 4,-2240.а V О.ОШСЗ'в + 1,4'^45Г.С * Зч>,52859.Л V 1*,ъ1У70.е + 1.779Л.к + .

¿¡ри вьчисле.чии значения дискриминаятной функиии для накпго-1бо объекта следует умножить коэффициент на значение с>от»?етот»ул-п;6 ему- признака, л затем слолскрь гмест-т псе получокн1,е проиг<пг":"-

ния и константу Со. Классифицируемый объект относят к той лэуппв, номер которой совпадает с номером налйольл^! дискримиюштьой функции

Оказалось, что при классификации объекта по трем общепринятым показателям» вероятность, с которой объект принадлежал к данной п,искрииин:1нтн0й функции часто была сравнительно невысокой ',0,0-0,6), Использование же 7 показателей позволяет классифицировать объекты о наивысшей вероятностью = I.

Ь связи с тем, что в формировании специфических липидных комплексов желчи в условиях экспериментального внепёченочного холестаэа, наряду с печенью, била установлена важная роль тонкого кишечника, нами было высказано рредполслсениэ, что коррекцию нарушений ли пи дно-' го обмена, характерных для заболеваний гепато-билиарной зоны, необходимо проводить о учетом возможного воздействия применяемого препарата целенаправленно на метаболизм липидов в тонком кишечнике, Ьс качестве такого препарата в наших исследованиях было использовано луговое сено, как дополнительный источник пищевых растительных волокон (НРВ) и ^-ситостеринов.

Дополнительное включение в рацион кроликов с холестазои ЯРВ, по сравнению с животными, содержащимися на стандартном рационе, вызывает в лмпидноы спектре ентероцигов существенное уменьшение содержания Ш (0,29+0,06 мг/г) и лизоФХ (0,7В+0,10 мг/г), обладающих выраженными детергентными свойствами; до контрольного уровня увеличивается содержание £Р (15,3+3,16 иг/г), уменьшается концентрация Ж (0,73+0,12 мг/г), В гепетоцитах отмечаются аналогичные изменения в содержании, изучаемых липидов, однако выражены они в меньшей степени. Изменения в жирнокислотном спектре лиадов гепа-тоцнтов и энгероцатов оказались также сходны»®. Они выразились, прежде всего, в нормализации относительного содержания 1в;1 кислоты в составе всех изучаемых липидов. Нормализующий эффект обогащение р'.тг?на к-рпликов с колестазом ПРВ оказало также на содержание хола-т"'н I' ос г.-нах и тканях &ГС.

Следстриеи этих изменений явилось отсутствие конкрементов в желчном пузнре у животных этой групп«. Уменьшение литогеннссти желчи обусловлено как снижением урояня общего холестерина (в основном за счет фракции ЗХ /1о,о+1,1Ь ммоль/л), так и увеличением концентрации АХ (Ь,иЗ+-1,17 ммоль/л) желчи. При этом доля 20:4 кислоты в составе ¿X желчи значительно увеличивается (12,2.^3а кислоты в ¿X - снижается Значение дискриминантннх

функииЯ, вычисленное с учетом 7 выаенаэг.аннюг показателей липид-ного обмена, позволяет отнести животных эт^й группы к промежуточному положению между контрольными кроликами и животными с бсс-каменным холестаэом. Следовательно, внеоковолоконный рацион является хорошим средством профилактики нарушения коллоидной стабиль- • ности желчи при зотруднекииее оттока.

■ Ь Ы Ь О Д и.

1. Нарушение оттока желчи у кроликов вызывает существенные изменения в содержании лигшдов и входящих а их состав жирных кислот

в органах и тканях гзнтерпгеп&тической системы: гепатоцитах, энгерогтитед, желчи и крови.

2. Ь условиях, повпяягждах риск литогенеза - при алиментарной гиперхолестеринемяи и экспериментальном внепе'теночном холестме, в органах и тканях: янтерогепатической системы установлен ряд эднонапраряенкпе изменений в содержании липидов, спектрах жирных И жеячкь;х кислот, вызванных нарушением метаболизма холестерина: возрастаем содержание свободного холестерина и его зфи-ров, свзбоджлс жнрных кислот, лизофозфатидилхолина, холявой кислоты и тауроконъягатов желчных кгслот, доли 16:1 кислоты

в составе, , лиг.иднкх фракций, снижается концентрация фосфатидил-хо.тени. В то же время, при нарушении оттока желчи В1 кглена более, вграженна я степень изменений в липидном и жирнокис г,отнчм сье/тре гпгеропитов, по срярнвни») с гдг.атяитя/и, «то с ¡»уиит

основанием для проведения цепенапраэленной коррекции метаболизма >«;гшдов в эктерсцитах. 3, Общзпринктые критерии оценки коллоидного состояния желчи по соотношению общего холестерина, суммарна фосфолипидов и суммарных холатов недостаточны дня диагностики наличия конкрементов в желчном пузыре. Дополнительное использование многофакторного анализа для оценки литогекных свойств желчи, выявившее наиболее значимые показатели липидного и жирнокислотного обмена (эфирк холестерина, свободные жирные кьсяоты, фпсфат идияхо дины, яизо-фэсфатицияхеяини, таурокон-ьюгаты желчных кислот, уровень 20:4 кислоты в составе фосфатидияхолина ы 16:1 кислоты в составе афи-ров холестерина желчи), позволяет увеличить диагностическую ценность исследования «елчи для выявления холеяитиаза. •1. На основании изменений жирнокислотного спектра ли пи до в в гепато-билиарной системе разработаны критерии диагностики внепецепочного холаатахза (по увеличению уровня 1Ь:0 кислоты в составе ТГ И ЗХ крови и желчи) и прогнозирования холестеринового хоязлити&за $по возрастанию относительного содержания 1о;I кислоты в" Ж желчи) у кроликов) 6. Обогащение рациона кроликов с экстрапзченочтд» холестсзом лине-толсм вызывает тотальное повышение уровня ПНИК семейства ,с> в липидах органов и тканей энтврогепатнческой системы, приводит к значительным изменениям в содержании основных лкпидных фракций (свободных жирных кислот, эфиров холестерина, фоефатидияхояина), следствием которых явилось нарушение внеснесекраторной функции печени н формирование холестериновых желчных конкрементов у Ь'7% хивотнйх этой группы. Это служит основанием в случаях нарушения оттока желчи для ограничения использования жиров богатых ПНлК ' сем, "-'-3.

о. ^ «сличение в рационе кроликов с нарушенным оттоком желчи пищевих ¡рэспиельнкх юлокон сопровождается снижением уровня общего хо-

лестерина и увеличением концентрации фос '¿ятид/лхолинов, нормали-за-здеЗ суммарного содержания желчных кислот, трнглицеридов и свободна жирных кислот в желчи, снижением огносительного содержания 1о:I кислоты в составе и погшскке;* доли 20:4 кислоты в '¿X желчи, следствием чего явилось снижение литогенности желчи и отсутствие желчных конкрементов у животных зтой группы.

Результаты проведенных исследований служат основанием для к ли-1Ичес!;ой апробации ряда диагностических тестов, разработанные в ■словиях эксперимента:

•'поведения уровня 2Ь;0 киелоты в составе нейтральных липидов крои к желчи как кри^рия ранней стадии внелеченпчного холестаза; (■озрястянг.я доли 1Ь;1 кисят; в составе ЭХ желчи как критерия алькулезного холецистита.

Практическое аначгии? имеет также вывод о том, что для харак-ьристики коллоидной стабильности желчи важно исследование дисбаланс 1 но юлько трех оснсвнкх желчных липидов - общего холестерина, /(.'«арных фосфолипидов и суммярчнх желчи« кислот, но и изменение ¿держаная эмиров холестерина, фос {атидил- холина, лизофосфатидил-)лпна, свободш-гх хирньх кислот, суммй таурокенъгогатов желчных кис-»т, кислоты в составе .¿X и кислоты в составе ЭХ келчи. 1& кр имин бнткый аналпа с учетом семи тиенлопзднкх показателей !пкдн01 о обмена позволяет с наивысшей вероятностью отнести оболй-■рмгй субъект к одной из групп: контрольной, бескаменного холе-стига и кьлькулезного холецистита.

С целью профилактики холестеринового холелитиаз» при зяболова-ях Гепптобчлиарной систсмг, связанных с нарушением оттока желчи, ко*!ендуетсч: -избегать применения яинетола, а также избыточного греЛления продуктов питания, ¿01 ттис ШИК сем. .у-^; эбзг^ать .ра шонк продуктами яитяяия, богатвми пищчвуки расти-

иькыми ^олгжн'1мл.

ClMCOK РАБОТ, йШБМШЬАШЫХ Ш'ТЫь ДЛ£ЕРТАЦ>1п.

1, Богдарин íj.А., Кулакова С.ti., Бадейнова ii.ti. плияни? ¿ли ме Карпов гиперхолеотеринеши на состав липкдов хккуса.и оттекахцей

от кишечника кроии/У^изиологический ж-л CCOF.-Ivbo.I0.-G.l4o2-146У,

2, Еедййнова К.Н,, Левачев Богдарин ь, А. Лиг,иды, желчи -с и жирные кисдоуы желчи кроликов при гиперхолестеринекий//Ьопросы

мед.химии. -IUÍ9. I. -С. УУ-104.

3, Вогдарин W.A., Бадейнова Влияние алиментарной гип%рхолесте-ринемии не уровни ли1шдов и эссенцилльных лирных кислот в внтеро-гепатической циркуляции у кроликов//Вопросы мед.химии.-IУуЭ.-

-I? I.-С.33-37.

■1. Богдарин kJ.A., Левачев й.ьД., Бадейнова ".И. влияние района, обогащенного пищевыми растительными волокнами и п о линенасмщенны•• ми жирными кислотами, на состав липидньэс компонентов в системе внтерогепатической циркуляции у кроликов при холестазе//Ьопросы питания. -1990.- » I.-C.44-47.

Считаю своим долгом выразить сердечную благодарность руководители биохимической лаборатории Никегородекого НШ педиатрии, доктору медицинских наук КОиЦРОБОИ Л.Г. ба консультативную помощь в ходе выполнения настоящей работ«.

СШЯОК ЖГОЛЬЗУЕШХ СОКРАЩЕНИЙ,

ПРВ -

знтеоогепатическая система фосфолигтиды нейтрально липиды свободные жирные кислоты триаци лглицерины эшры холестерина свободный холестерин общий холестерин лизофосфатидилхолин фосфатиди чхолин суммарные желчные кислоты тауроконгюгатн желчных кислот таурохолевая кислота таурохенодезоксихолевая кислота тауродезогссихолевая кислота гликохолевая кислота гликохенодезоксихолевед кислота гликодезоксихолеаая кислота холевая кислота хенодезоксихолевая кислота дезоксихолевая кислота полиненасыщенные жирные кислоты пищевые растительные волокна

БДЦНЯНОВА Елена Николаевна

Изменение состава липидов органов и тканей энтерогепатической системы при внепеченочном холестазе и пути их коррекции /экспериментальное исследование/

Формат 60 х 8С1/16

Бумага писчая. Печ.лист I. Тираж 100 экз. Заказ № 161 Горьковская Областная типография, 603030, Гордеевская, 7 1991 год