Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функции лизосом клеток печени при воздействии хлорохина у здоровых крыс и животных с внепеченочным холестазом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функции лизосом клеток печени при воздействии хлорохина у здоровых крыс и животных с внепеченочным холестазом"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ НОВОСИБИРСКИЙ ОРДЕНА ТРЗДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ - НЕДИЦИНСКИН ИНСТЙТЗТ

На правах рукописи ЗДК:570.311.344-577.152 34-570.385.7.344 Рукавианикова Елена Валерьевна

ФЗНКЦИИ ЛИЗОСОМ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХЛОРОХИНА 3 ЗДОРОВЫХ КРЗС И ШОТННХ С ВНЕПЕЧЕНОЧННМ ХОЛЕСТАЗОИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск. 1992

Работа выполнена в Институте физиологии СО РЙЫК и ЦНМ Новосибирского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Т.П.Короленко

доктор медицинских наук, профессор И.И.Евнина

кандидат медицинских наук Т.А.Рыбакова

Ведущая организация: Институт биохимии СО РАМН. г.Новосибирск

Защита состоится _____193§ года в_______час.

на заседании специализированного совета К 084. 52.03 при Новосибирском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте 10300Э1,г.Новосиоирск-91.Красный проспект,52)

С диссертациси-мохно ознакомиться в биолиотсие Новосибирского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института

автореферат разослан" -МаЯЩ^ лязг г

Ячппыи секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

В.Оарапов

J

üBífia ХАРАКТЕРИСТИКА PAiiOTU

Актуальность темы исследования. Изучение катаболических функции клетки животных остается одной из актуальных медико-биологических проблем.

Перспективным направление« клеточной физиологии и биохимии является исследование изменений функций лизосом с помощью лизосо-мотропных препаратов - соединений, избирательно накапливавшихся в лизосоиах \п vivo /de Duve et al.,1374; Короленко Т.П.. 1390/.Многие лекарственные препараты, используемые в клинической медицине, иоладавт лизосомотропннии свойствами' и иогут накапливаться в печени. так как клетки печени обогашены лизосомами. благодаря их осокой специализации, направленной на поддержание высокой катаболи-чсскоа активности /Панин Л.Е.. Наянская H.H..1387; Maclntyre, Cutler. 138С/.

Лизосомотропные соединения со слабсоснонными свойствами (хло-рохии, метиламин, соли аммония, трет бутиламин и другие амины), используит в экспериментальных исследованиях для подавления внут-рилизосомного протеолиза. Обнаружено. что накапливаясь в лизосоиах изолированных клеток, эти соединения увеличивает в них pH /de Duve et al..1374; Poole. ühkuaa,1981/, что может сопровождаться изменением функций этих оргакелл в перитенеалышх макрофагах, гепатоци-тах. сибробластах и других типах клеток. При этом происходят пару-зение диссоциации комплексов лигандов с рецепторами, которая должна осуществляться при низких значениях pH: наруяенме рециклирования рецепторов, увеличение секреции вновь синтезированиях кислых гидролаз во внеклеточное пространство и. как следствие, подавленно катаоолическоЛ функции лизосом /Dean et.,t38I: Schnarti et dl..138?; Seelen.1387; Braulke et al.,1387/.

Очевидно, подобные изменения функций лизосом яогут развиваться при применении таких препаратов in vivo.

ллсрохин vtíb - лекарственное соединение, мироко используемое в медицинской практике в качестве антипаразитарного 1антималярий-пого; и противовоспалительного средства /HeChesney. Fitch,1984; Rosbo et al., 1387/. С ряду антималарийных препаратов он признается одним из наиоолее эффективных средств. Однако проблема приаенения усложняется появлением устойчивых к действии CQ линий малярийного плазмодия. Для преодоления такой устойчивости приходится прибегать к увеличение дозы и длительности введения препарата, что иожет

повлечь за собой повреждение печени. Аналогичные проблемы возника-от при использовании других лекарственных веществ, обладающих ли-зосомотровдыми свойствами (соединения железа,;различны?кровезаменители и др.; в терапевтической и хирургической,клинике.-:

В этой связи представляло интерес изучить влияние высоких; доз CQ на функции лизосом клеток печени Jn-vivo по схеме, приближенной к использовании препарата в клинических условиях. - •

Учитывая,выведение соединения с желчью, также .было изучено изменение, функций лизосом клеток печени у животных с экспериментальным внвпоченочным холестазом.

Цель исследования. Изучить влияние-высоких доз CQ на свойства и функции лизосом в динамике накопления препарата в клетка*- печени. Учитывая экскреции, с желчью, оценить значение его выведения у здоровых.крыс и животных с экспериментальным внепеченочным холестазом.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние однократных и повторных- введений высоких доз CQ на физико-химические свойства (стабильность мембран, бсмо-тическуп стойкость) лизосом, активность лизосомных кислых гидролаз печени крыс и сопоставить изменения с накоплением CQ в печени.''

2. Исследовать эффект однократного введения СО на эндоцитоз клетками печени ib частности, поглотительную способность систвмы мононуклеарных фагоцитов).

3. Исследовать .динамику накопления препарата в печени и его выведение с желчью при.однократном Евгении здоровым животным и крысам с внепеченочным холестазом.

4. Исследовать действие CQ на активность лизосомных протеиназ изолированных перитонеальных макрофагов мышей и сопоставить его с эффектом in vivó.

Научная новизна исследования. Впервые показано выраженное изменение осмотических свойств лизосом клеток печени в динамике па- ' копления CQ в органе; выявлено наличие положительной корреляционной связи между накоплением CQ в печени и повымением осмотической повреждаемости лизосом при повторном введении препарата (при однократном использовании аналогичных доз такой зависимости не отмечено).

Обнаружено. что CQ при однократном введении высоких доз не влияет на поглотительную способность системы мононуклеарных фаго цитов у крыс (по клиренсу коллоидного углерода).

При исследовании действия СО на изолированные перитонеальные иакрофагк имей оонаружено подавление активности цистеиновнх про-тсиназ (.катепсинов B.U.L) при использовании препарата в концентрациях, которые вызывает снижение скорости протеолиза, что, вероятно, кокно объяснить взаимодействие« ферментов с CQ.

В экспериментах in vivo показано увеличение активности проте-иназ в клетках печени, особенно выраженное при повторных введениях препарата, которое не зависело от концентрации CQ в.печени.

Ястановлено. что у животных с внепеченочным хоЛестазок накопление CQ в печени происходит с той te скорость«, что и у здоровых животных, однако выведение его замедлено. что свидетельствует об увеличении периода полувнведения и возможности проявления токсического действия на печень.

Впервые показано, что выведение CQ с желчьи у крыс может осу-чествляться независимо от разгрузки лизосом гепатоцитов.

Практическая и теоретическая значимость работы. Полученные данные об изменении свойств лизосом печени при повторных введениях высоких доз CQ могут быть использованы для воспроизведения признаков лизосомных болезней накопления (.лкпопротеи.козi.

На модели внепеченочного холестаза у крыс показано, что прекращение выведения CQ с хелчьв может обусловливать проявление токсического действия препарата на печень, которое должно учитываться в гепатологической и хирургической практике.

Результаты данной работы использованы в монографии Т.П.Короленко "Катаболизм белка в лизосомах"( Новосибирск:"Наука",1990.-18В с. к

Положения, выносимые на защиту.

1. Накопление CQ в печени при введении его животным in vivo сопровождается нарумением функций лизосом: снижением осмотической стойкости лизосои печени, лабилизацией мембран лизосои, увеличением удельной активности лизосомных ферментов в печени, особенно вк-раженным при повторных инъекциях препарата.

2. В период максимального накопления CQ в печени поглотительная способность системы мононуклеарных фагоцитов не изменяется.

j. Действие CQ на ферменты лизосои (катепенни B.H.Lj изолированных клеток противополоано его эффекту на активность протеиназ печени in viv».

4. Выведение CQ с гелчьо не зависит от разгрузки лизосос.

5. У крыс с внепеченочным холсстазои С6 накапливается с тоГ.

- о -

38 интенсивностью, что и 9 здоровых животных, но выведение его из печени н крови замедлено , что обусловливает токсическое действие соединенна на печень.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены: на конференциях молодых ученых Новосибирского мединститута 1988,1989,1990гг.; конференции молодых ученых Института физиологии СО РййН (Новосибирск,1389); X Международном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР по метаболизму (Ташкент.1389): лабораторном семинаре Института Иедицинской Анатомии (Дания,1989); конференция молодых ученых Института биохимии СО РАМН (Новосибирск,1990); 8-й конференции по протеолизу (ФРГ,Мвнхен,1990); 20-и Симпозиуме ' Европейских ' Биохимических обществ (Венгия, Будапешт,1991); семинаре "Подавление внутриклеточного протеолиза и патология печени" (Япония, Токуаима,1991); 8-м Рабочем Совещании Европейской группы по исследование лизосомных заболеваний (Франция,Йнси,1991).

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация излохена на 132. страницах мажкнописного текста, иллвстрирована 20 таблицами и ¡й рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, заклвчения и выводов. Прилагаемый список литературы включает ?Л0 источника^ из них 2Е -у» русской языке. ■ ■

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ '

Материалы и методы. В эксперименте использованы следующие ио-дели: 1) однократное введение СО в дозе 30 и 50 мг/кг крысам для исследования зависимости изменений функций лизосов от концентрации препарата в печени; 2) повторное введение СО (в течение 7 дней ежедневно в тех же дозах), наиболее приближенное к схемам применения соединения в клинической медицине; 3; однократное введение СО аивотныи с 9-дневныа внепеченочныи холестазои (воспроизводимый путем перевязки аелчного протока) для выявления, какии образом страдает функции лизосои печени, когда наруяено выведение препарата с желчью.

В зкеперияенте использовали 375 крыс Вистар и 50 ыыаей СБА. Концентрации СО в гоаогенате печени, сыворотке, зелчи у крас измеряла флаорииетрически (Со1оаЬо. ВегИп!,1985).Стабильность неайран яязосоя печени определяли по неседнаентнруемой активиости аатрикс-

ного фермента лизосом^-галактозидази: осмотическуп стойкость лизосом - по прироста неседиментируекой активностир-галактозидазы пос-. ле оораоотки гомогената гипотоническим растворов сахарозн.

Активность лизосомных ферментов Ji -галактозидазы. кислой фос-фатазн, оценивали по метода Барретта (Barrett,1972): спектрофото-метрически в гомогенате печени и флвориметрически в смворотке крови и в желчи, где активность лизосомных ферментов низка, активность цистеиковых протеиназ (катепсинов В.Н и L) лизосом печени измеряли, используя в качестве субстрата азоказеин или метил-кумариламидные флворогенные производные (Hiederanders.Klrshke"; 1381).

IIa фоне однократного введения CQ здоровым животным оценивали фагоцитоз по клиренса из крови частиц коллоидного углерода, введенного в хвостовая вена под легким эфирным наркозом (Saba,1970). Функциональные пробы печени (ЙЛТ. ACT, общий билирубин, щелочндв фосфатазд) в сыворотке крови определяли при помощи биотестов "Хе-мапол" (Чехо-Словакиа) совместно с сотрудниками биохимической лаборатории больницы N7. Эффект CQ in vitro оценивали при инкубации перитонеальных макрофагов мнжей с возрастающими концентрация*)! CQ ют 1G до 250 мкЮ.

Статистическув обработку результатов проводили методом параллельных рядов вариационной статистики с использованием критерия Стьвдента, а также методами регрессионного и корреляционного анализа iЛакин,1073).

Результаты исследования

1.Эффект CQ на активность катепсинов В,Н и L в перитонеальнм макрофагах мымей in vitro. При исследовании влияния CQ на макрофаги. выделенные из перитонеальной полости мнвей, обнаружен кнгибн-рувщий эффект препарата на лнзосомнке цистеиновне протеяназн 0,, И и L (табл.1/,зависящий от концентрации препарата в среде. При концентрации 10 мкИ активность катепсинов В и Н бала подавлена на 31 и 142, по сравнении с контролем, в то время как активность катвпсина L при этой концентрации CQ не изменялась. При увеличении концентрации CQ в среде инкубации до 100 икй было отмечено значительное снижение активности изученных протеиназ: катспсина В - па 60%, ка-тспсина II - па G8Z, катепскна L - на 50Z (табл.1). Еще более существенное подавление катепскнсв зарегистрировано при концентрации CQ 250 ккК (до IbX от контроля), .хотя, очевидно, в данное случае проявляется цитотоксичвский эффект препарата.

- в -

Полученные на макрофагах результата подтверждается данными литературы о подавлении CQ протеолиза в изолированных гепатоцатах iSeglen.l987j, а такке об ингибирования CQ очкдешшх катепсшшв & и Н iKorolenko et al.,1387; Короленко и др.. 1987; Короленко, 1Э87).

В связи с обнарувенным подавлением активности протеиназ ln vltrc представляло интерес изучить влияние CQ на функции лизосоа клеток печени in vivo в высоких дозах, когда возаовно наруввние функций лизосои.

Таблица 1

Эффект хлорохнна на активность цистеиновых протеиназ В, Н и L

8 пернтонеальных иакрофагах ¡аыаей

Концентрация СО.икН Активность протеиназ

. .В II L

контроль J 100 100 100

10 8G 03 101

25 - 73 83

50 81 49 77

100 40 32 50

250 10 3

Время инкубации клеток - 1 час при 37 С. Активность протеиназ определяли флвориметрически и выражали в процентах от контроля.

2. Эффект однократного введения СЦ крысам в дозе 30 мг/кг.

При использованных дозах СО 30 и 50мг/кг, составляпцих, соответственно, 1/3 и 1/2 от 1.0 50, не вызвал существенных изменений массы тела животных, относительной массы печени и содержания белка в органе. Функциональные пробы печени (АЛТ, АСТ, общий билирубин, «елочная фосфотаза) существенно не изменялись при однократном введении препарата. Лимь через 1 час после инъекции СО отмечено увеличение активности АЛТ контроль - 1.1±0,06, опыт - 1,8±0,2. п=5).

При введении однократной дозы хлорохина 30 мг/кг наблюдалось быстрое накопление препарата в печени, которое достигало макси-

мальных значений чгрез 0.5 - I ч после ннъекцки СрнсЛа) - 0,18 икколь/ г сырой ткани.

Выведение препарата осуществлялось постепенно к заверзалось спустя 24 часа после инъекции (.рис.1а). Однократное введение С9 сопровоядалось укоренной лабилизацией лизосои печени, регистрируемой но повыменкв неседикентируемой активности JJ-галактозидазк Ctpsp-tteiiTa,связанного с иатриксоы лизасон). Так, в период иаксикальиага накопления CQ печеньа неседииентируейаа активностьр-галактозидаза составляла через 0,5 ч 17И,72, тогда как контроль- 12,7t0,08%. Отмеченная лабйлизация, вероятно, связана с индукцией аутофагшГСй i&lauaann et al., 1988).

Наиоолее выраженные изменения осмотических свойств лизосон печени отмечались через I ч после инъекции препарата н по времени почти совпадали с периодом максимального накопления CQ в печени. Обнаружено снижение осмотической стойкости лизосом, при этом прирост неседиментируемой активности^галактозкдазы в гипотоническом растворе сахарозы составлял до 302 от исходного уровня. Нормализация осмотических свойств отмечалось через 24 ч, и совпадала с периодом выведения препарата (рис. 1а). Однако не обнаружено корреляционной связи между нарувеннякк осиоткческкх свойств к концентрацией CQ в печени tr =0,2).

Набухание лизосом является одним кз косвенных признаков накопления препарата в лизосоиах изолированных клеток (Poole, Ohkuaa. 1381). Очевидно, увеличение осмотической повреждаемости лизосон in vivo не может отражать накопление CQ в лязосоках. Нарц-яение осмотической стойкости лизосон при введении CQ кожно объяснить развнткеи аутофагии, так как известно, что аутофаговые вакд-или характеризувтеа повивенной повремдаекостьп при обработке в гипотонической среде (de Duve et al..1374J. Формирование аутофаго-вых вакуолей было отмечено в работах других ксследователей, ис-пользоваввих дозы CQ от 10 до 50 иг/кг СSewell et al.,1988). Uausann et al.il38G) предложили новый иетод выделения аутсфаго-сои, индуцируя их образование при покори Сй.

При однократной введении CQ в печени крыс обнйругено увеличение удельной активности ферментов лизосом - кислой оосратазн иуь-га-лактозидаза на 25-302, кислой <рос?атазы - на 80Z (5ч), а также ка-тепсина D на 20 и 272 через 3 и 5 ч соответственно после введения преперата; цистекновкх портенназ В, II я L - на 582 (1ч) и 532 (Зч) <. таил.;!).

Таблица 2

Удельная активность цистеиновнх протеиназ печени крыс при однократном н повторных введениях хлорохина в дозе 30 мг/кг

Группа животных п I II

Контроль 10 100 i 5,0 100 i G.3

Хлорохин 0,5 ч 7 115 i 7.6 117 i 8.1

1 ч С 150 ± 8.Б* 200 i 12.5*

3 ч 7 1G3 ± 9,7* 214 I 10,3*

24 ч 5 121 i 5,2 148 t 5,8*

72 ч 5 - 13В i 13.5

Примечание: Активность протеиназ S.L.H в суыиарной грану лярной фракции гоаогената печени вирагена в процентах от контроля (принятого за 10ÜX) Субстрат - азоказеип, I • однократное, II -повторное введение CQ ; п - количество гивотных в группе.

* - р < 0,05 ^Исследование проведено codmcctho со ct.h.c., k.ó.h. Пупыэевым й.Б.;.

Известно, что в некоторых типах клеток CQ вызывает подасление фагоцитоза in vitro. Полагали, что аналогичный эффект препарата üoshc ожидать в условиях in vivo. Поэтоау представляло интерес исследовать действие CQ in vivo на этот процесс.

Поглотительная способность системы иононуклеарных фагоцитов то клиренсу из русла крови частиц коллоидного углерода) не изменялась в динанике накопления препарата в печени. Период нолувчве-дения коллоида у контрольных животных составлял 7-12 мин., что соответствовало коэффициенту фагоцитоза 0,03 ± 0,003, а в опытной группе ICQ через i ч)- 0,03±0,005. По-видимому, для проявления ин-гибирувщего влияния на фагоцитоз in vivo требуются более высокие концентрации CQ, чем достигнуты в нажих экспериментах. С другой стороны, это подтверждает, что эффекты CQ in vivo и in vitro могут отличаться.

При повторных введениях СО в той же дозе наибольвие значения концентраций соединения в печени не превыжали соответствующих показателей при однократном введении. Максимальное накопление препарата отмечено через 0,5 ч, как и при однократном введении (рис.1). Вместе с тем, выведение препарата происходило медленнее, чем при однократных инъекциях (рис. 16).

Рис. I. Концентрация хлорохина в печени и осмотическая стойкость лизосон при однократном (а) и повторных (б) введениях препарата.

По оси абсцисс - время после шгьекции; по оси ординат - справа: (---) концентрация С(? (мкмоль/г);

слева: (—) — прирост неседиыентируемой активности

> -галактозидазн в гипотоническом растворе сахарозы (в процентах от исходной).

Повторные введении СО сопровождались осмотическими изменения аи л'лзосои более продолзнтелышаи, чем при однократной введении. Нормализация осмотической стойкости наступала ливь через 72 часа после последнего введения (рнс.1).

Как известно, при повторной введении препарата происходят вторичные изменения лнзосоа. связаннее с внутрнлизосоапиа накопяе-инея $ос?о.я1шадов, что пеняет структуру внутренней среды лизосоа и, вероятно, уаеньаает в лизосоаах осаотическое пространство, доступное для СО.

В отлцчие от группы с однократными инъекциями, у зииотных с повторными введениями препарата выявлена положительная корреляционная связь ыевду концентрацией СО в печени и изменениеи осмотической стойкости лизосои (г =0.810,32).

При многократных введениях СО крысам обнаружено увеличение удельной активности^-галактозидазр и кислой фосфатазы на всех исследованных сроках до 130-1402. В сравнении с ^галактозидазой я гшслоЯ фос^атазой, увеличение активности протеиназ было более ви-равешши: катепенка 0 - до 200'/. через 1 ч и цистеиновых протеиназ (катепсинов В, Н и Ь) - до 160-160% через 1 и 3 ч (табл.2). Спустя 72 часа после последней инъекции, когда происходило почти полное выведение препарата, не обнаруаено нормализации активности изученных катепсинов (табл.2).

Полученные результата подтверждавт данные других авторов, которые использовали хроническое ( в течение нескольких месяцев) пе-роралыше введение СО кинисвиньяа и обнаружили значительное повышение активности целого ряда лизосомных ферментов в печени (кислой (росдатазн, £ -О-гексозаминидази, (¿-маннозидазы, -фукозидазы) (Ргейяап еЬ а1.,1Э87), а также у крас при повторных (5 дней внут-рнбрваинно) введениях СО: уяглвкуронидазы, Н-ацетил-^-О-глвкоз-аминидазы.^-галактозидазы почти вдвое (БенеН еЬ а1..1388),возможно, за счет индукции синтеза ферментов лизосои.

3.Эффекты однократного и повторного введения СО в дозе 50 кг/кг.

При однократном введении СО в дозе 50 иг/кг (1/2 от Ш 50) как и при дозе 30 мг/кг, отмечалось быстрое накопление препарата тканью печени. Через 0,5-1ч максимальное значение составляло 0,32+0,014 ыкмоль/г ткапи. По абсолвтному значении накопление соединения превывало таковое у кивотных с введением более низкой дозц (0,18 акаоль/г при дозе 30 ыг/кг) в период максимального накопления СО I табл.3). Звеличение дозы препарата с 30 аг/кг до 50 нг/кг.

т.о. ь ¡,7 рапа сопровождалось аналогична* усилением накопления СО в клеткпх почгии: 0.32:0,10-1.7. Это свидетельствует о зависимости интенсивности накопления соединения печеньв от дозы при однократное »ведении препарата, где 0,32 нкыоль/г и 0.18 якмоль/г - концентрация СО в печени при использовании доз 50 и 30 иг/кг, соответственно.

3 сравнении с зявотныити, получавзияи инёекции С9 в дозе 30 ■аг/кг, зиведенио соединения пря использования препарата з дозе 50 иг/кг било существенно изменено: через 24 ч а печени оставалось около половины накопленного препарата (0,32+0,014 ахаоль/г через О, 5 ч, 0,14+0,028 акаоль/г через 24 ч) (табл.3.1, а при дозе 30 аг /кг через 24 ч препарат почти полностьо выводился из печени (рис.1 л >,

При повторно» введении СО в дозе 50 мг/кг в течение 7 дней интенсивность накопления соединения была визе, чей при однократной а той зе дозе 10.45+0.035 акаоль/г ткани, через 3 ч после последней инъекции, по сравнении с однократным введение« в те ае сроки -0.28 + 0,023; р < 0.01 к Аналогичным образом скорость освобогдениа печени от соединения была существенно снижена, в сравнении с однократная введением такой зе дозы. Так, при повторных введениях СО я дозе 50 мк/кг через 24 ч в печени оставалось больве половины накопленного соединения. Вероятно, полученные данные отрааавт зависимость накопления СО печенья от дозы введенного препарата: с увеличением дозы печень более интенсивно накапливает СО.

При изучении уровня СО в сыворотке крови крыс было обнаружено, что при повторных введениях высокой дозы (50 мг/кг) период полувыведения СО значительно снижен, по сравнении с группой крыс, получаваих однократные инъекции в аналогичных дозах. Через 24 ч при однократной введения СО концентрация в сыворотке составляла 0,35+0,025 зкй (табл.3>, в то время как при повторных введениях через 24 ч после последней инъекции концентрация препарата не снижалась и составляла 1,3+0,32 мк!1 (р < 0.01), что свидетельствует о достижении в сыворотке стабильного уровня препарата, сохранявшегося. по крайней мере, а течение суток после заверваюдего введения СО. Снижение скорости выведения СО из печени при повторных использованиях, по сравнения с таковыаи при однократной инъекции, мояэт, гакич образом, оить обусловлено созданием постоянной концентрация лрепарата з плазме крози.

■¡слагают, что основной путь разгрузки лизосом - заброс содер-

Таблица 3.

Концентрация хлорохина в гохогенате печени, сыворотке и велчя у здоровых вивотннх и крыс с внепеченочннм холестазом при однократной введении препарата С50 иг/кг)

Группы 3 д о р о вые х и в о т н ы е Еивотные с х о л е с тазом

5ив0тных.

Печень Сыворотка 1елчь Печень Сыворотка Еелчь

Контроль 0 0 0 0 0 0

Хлорохин: 0,5ч 0,32±0,014 1,4210,163 32.7i4.78 (3) 0,3010,40 1,8910,359 13,216,96*

1ч 0.3210,027 1.6610.353 58.719.18 (3) - - -

Зч 0,2В±0.029 1.2Ц0.347 66,ЦЭО.О (4) 0,3910,018* 2,2410,338 5,212,40*

5ч 0,2710,012 0.9110,211 90,0112.40(4) 0,36±0.022* 1,4710,027 7,212,15*

244 0,1410,028 0,3510.025 20.314.25 (3) 0,2410,029* 0,8710,121* 4,012,99*

Лрсуечанис: цифры в скобках - количество яивотннх в группах,в остальных случаях в кавдой группе число вивотных - 5. л - р< 0.05

зи^ого эти* органелл в аелчь (Бене!1 еЬ а1.,1988), что доказывается наличиен в зелчи лизосокнкх кислых гидролазС^-галактозядазы, кислой дюсдатазы, Я-ацетил -уз- Б-гексозамшшдазы, глпхуронндазы п др. ). Однако работа по изучении связи функционирования лизосон с процессами аелчеотделения немногочисленна, и эта проблема находится в стадии разработка.

СЦ относится к соединениям, которце частично эхскреткруптся г. зелчьв. Максимальное содеряание препарата в аелчн обнарузено через 3-5 ч после введения соединения. Спустя 24 ч концентрация СО в зелчи снизалась примерно в 3 раза, но соединение е?е полностьп не выводилось (тапл.З;.

Активность ^-галактозидазы в сыворотке и зелчи изиеряля с по-аохьв длгшресцентных субстратов, что обеспечивало увеличение чувс-тяительности метода изиерения. Было обнарузено, что при сведении Си крысам активность фермента в сыворотке крови существенно не изменялась. Я зелчи через 3 ч пссле введения препарата з дозе 50 аг/ кг отмечалось снизение активности у?-галактозидаза более, чея в 3 раза, по сравнении с контролем (з контроле 0,13±0,028 наоль/мин/мг. через 3 ч после введения препарата 0,04±0,007, р < 0,011. Через 0,5 ч после инъекции было обнарузено увеличение активности р-галактозидазы в зелчи в 3 раза СО,13±0.028 нзсль/яин/иг з контроле, 0,35+0,075 - через 0, 5 ч после введения СО) (табл.4).

Таблица 4

Активность ^-галактозидазы в зелчи крыс при однократной зведении СО (50 мг/кг)

Группы Активность£ -галактозидазы

аивотнах (ниоль МНО/мин/ал)

Контроль 0.13 к 0,028 (п=3)

Хлорохин: 0.5 ч 0,35 ± 0,075* (п-3)

1 ч 0.17 ± 0.084 (п=4)

5 ч 0,04 ± 0.007* (п-4)

5 ч 0.13 í 0,052 (п=4)

24 ч 0,08 1 0,020 (п=4)

Примечание; МЗ© - 4-метилумбеллиферон, п - количество животных в группе; * - р < 0,05.

Таккн образок видно, что секреция лизосокных ферментов в аелчь не совпадает по времени с выведение* в шелчь СВ. что новет свидетельствовать о независимости этих процессов.

При повторных введениях СО в дозе 50 иг/кг обнаружено увеличение активности всех изученных ферментов в печени, сохранявшееся в течение 24 ч. Так, активность^-галактозидазы была увеличена па 50г 12,4 1 0,18 - в контроле, 3,010,30 - через 3 ч; 3,510,34 -через 24 ч после последней инъекции), катепскна й - на 100% 16.610,73 - в контроле, 12.3±1.30 - через 3 ч; 11.2±1.07 - через 24 ч после последненй инъекции). Активность цистеиновых протеиназ также была увеличена: катепсина В - на 30-40% через 5 и 24 ч; ка-тепсина Н - на 100% через 24 ч. Активность катепсина I не изменялась во все исследованные сроки.

Нвеличение активности лизосомных ферментов в печени крыс при введении СО как повторно, так и на поздних сроках при однократных инъекциях через 5-24 ч, по-видимому, обусловлено индукцией синтеза кислых гидролаз 15е«е11 еЬ а1.,1988).

Вместе с тем, при повторных введениях происходит увеличение активности различных ферментов лизосои (как протеиназ, так к гли-козидаз). Возможно,имеет место их неспецифическая активация накапливавшимися в лизосомах липидами. Этот процесс еве мало изучен, к механизм такого увеличения до сих пер не выяснен.

На основании сказанного можно заключить, что с увеличением дозы препарата усиливалось накопление ¿0 в печени. а увеличение активности изученных кислых гидролаз не зависело от концентрации соединения в печени. Наиболее значительное увеличение активности ферментов лизосом отмечены при .повторных введениях СО в дозе 50 мг/кг.

4. Эффекты однократного введения СО в дозе 50 мг/кг животным с внепеченочным холестазом (ВПХ). Учитывая выведение ряда лекарс-т°енных соединений, в том числе и СО, через желчь, на модели ВПХ у крыс была предпринята попытка вызвать задержку этого пути. Контрольной группой служили крысы с ВПХ, которым вводили физиологический раствор в соответствующих объемах.

9 животных с ВПХ отмечено выраженное увеличение общего били -рубина в сыворотке крови, по сравнения с контролен, что подтверждает развитие холестаза. Активность АЛТ в сыворотке не отличалась от показателя здоровых контрольных крыс, а активность АСТ была по -■ выаена на 20% 11,4+ 0,03 - у здоровых контрольных еквотных: 1,8.-

Таолица 5.

Влияние однократного введения хлсрохина 150 аг/кг) на сиде^лим г.оьрти ¿¿¡ирубииа,, активность трансаминаз и целочной оосфатазы в сыворотке крови у здоровий крис и крис с внепеченочнмы холестазои

Группы 2ИВ0ТНЫХ Б АЛТ АСТ № X Б О Л 8 АЛТ стаз АСТ

Контроль 3,310,52 1,1*0.06 1.410.03 6,810,78 58,2127,4 1,210.17 1.810,14 10.912.40

Хлорохин:

0,5 ч - 1,910.72 1,610,01 3,710,35* 137.4110,2 2,010,20 2.410,15 19,112,31*

1 ч 2,0±1,10 1,8+0,20* 1.310.17 3,811,03* - - - -

3 ч 2.НО.25 1,510,15 1,010,20 4,610,30 50,5118,7 2.010.15 ,1.810.19 14.413,08

5 ч 1,410,28 1,210,10 1,210,10 4,710.61 46,3121,7 1.1*0.22 1.7*0,20 24.4i3.80*

24 ч 3,210,63 1.110.18 1,210.12 8.7+0,84 105,0154.14 1.210.49 2.110.24 11.812.94

Примечание: Б - содераание общего билирубина (икиоль/л); АЛТ,АСТ -активность траисаыииаз (нколь/вик/мл); Р - активность щелочной росфатазы Iмкиоль/ал/чВ группах по 5 - 0 зизотиих * - р < 0.05

¿0,14 - у контрольных крыс с ВПХ). (табл.В). Щелочная фосфатаза проявляла тенденции к повывенив активности у контрольных животных с ВПХ, по сравнении со здоровыми, но увеличение активности было недостоверным 1табл. 5).

Известно, что увеличение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови является важным диагностическим признаком развития ВПХ у лвдей «.БсЬв1|1Ъ е1 а1.,1986). У крыс при ВПХ выраженных изВе-кений щелочной фосфатазы не выявлено. Введение СО животным с хо-лестазом не сопровождалось далънейвими изменениями как общего билирубина. так и активности трансаминаз в сыворотке крови. Напротив, активность щелочной фосфатазы повывена через 0.5 и 5 ч после инъекции СО, а спустя 3 ч отмечена тенденция к ее повывенив Iтабл.5 >.

Таким образом, судя по активности щелочной фосфатазы. увеличение которой в сыворотке крови является одним из критериев нару ■ения целостности гепатоцитов, СО не вызвал повреждения печени у здоровых крыс, в то время как у животных с ВПХ повреждение печени усугублялось при введении высокой дозы СО (щелочная фосфатаза в сыворотке была повывенаК

Следует подчеркнуть, что при однократном введении СО крысам с ВПХ обнаружено, что интенсивность накопления препарата печены) не отличалась от соответствувщего показателя у контрольных животных Iчерез 0,5 ч после инъекции у контрольных крыс содержание СО в печени составляло 0,32±0,014 мкмоль/г ткани , а у животных с ВПХ -0.30*0,040 мкмоль/г ткани) (табл.3 к Вместе с тем, выведение СО из печени происходило значительно медленнее, чем у контрольных животных. Так. через 24 ч после введения препарата у крыс с ВПХ в печени концентрация СО на 702 выве, чем у контрольных животных в соот -ветс1вующие сроки (0,14±0,028 мкмоль/г ткани - в контроле: 0,2810,029 мкмоль/г ткани - у животных с ВПХ).

Концентрация СО в сывортке в первые 5 часов после введения препарата крысам с ВПХ также не отличалась от контроля, но через 24 ч после инъекции отмечалась задержка выведения СО из русла кро бн (0,3510,025 мкМ - в контроле: 0.8710,121 мкй - у^животных с ВПХ) (табл.3).

При введении СО крысам с ВПХ обнаружено, что препарат у этих животных через желчь практически не выделяется. Во все исследованные сроки в желчи регистрировались ливь следовые количества соединения, в то время как у контрольных животных, как было отмечено

- 19 -

выве, происходило выведение препарата с аелчьа (табл. 3).

На основании полученных данных можно заключить, что у животных с СИХ введение лизосомотропного соединения СО сопровождается увеличением периода полувыведения препарата из печени и сыворотки, что обусловливает проявление его токсического действия на печень.

Таким образом, In vivo CQ иоает быть использован для воспроизведения некоторых признаков лизосомнах болезней накопления, называемых введение» лекарственных соединений со слабоосновшмн спойствааи, однако они выражена в меньшей степени, чем при изучении изолированных клеток. Признаки лизосомных болезней включает лаоилизацив нембран лизосоа. резкое набухание лизосои, изменение осмотических свойств, нарушение деградации белков, фосфолипидов и других макромолекул в лизосомах, обусловленное подавлением активности гидролаз. и связанная с этим перегрузка лизосом недеградированным материалом (липопротеиноз).

D U 3 О Д Н

1. При однократном введении CQ крысам ( 30 и 50 мг/кг) происходит накопление препарата печенью, которое зависит от дозы соединения: при дозе 50 мг/кг интенсивность аккумуляции препарата важе, а скорость выведения из печени ниже, чеа при использовании доза 30 мг/кг.

2. Однократное введение CQ крысам сопровоадалось:

1) значительны!» усилением осмотической повреждаемости лизосом печени;

2) умеренно выраженной лабилизацией мембран лизосом;

3> увеличениен активности лязосомнх фераентов печени: кислой ¡рос(?атаза,^-галактозидазы, катепсина D, цистеинових проте-яназ B,II,L, которое не зависело от концентрации препарата в печени.

3. При повторных введениях CQ в тех же дозах накопление его з печени не превышало соответствувпих показателей при однократных инъекциях, но скорость заведения из печени была снижена.

4. Изаенение осмотической стойкости лизосоа бало более выра-зенныа, по сравнения с показателем при однократном введении препарата в тех зе дозах, причеа выявлена полов.чтельная корреляционная связь кеяду накоплением СЯ в печени и поврззденнем осаотнческой стойкости нембраи лизосоа пря повторных введениях CQ.

5. Действие CQ на фермента лизосоа in vitro противоположно его эффекту in vivo: активность протеиназ изолированиях макрофагов

сила подавлена при инкубации клеток с СО, в то вреия как активность катепсинов B,H,L в печени увеличивалась, особенно при повторных введениях препарата.

Б. CQ не влиял на поглотительную способность системы мононук-леарных фагоцитов in vivo.

7. Выведение CQ в Велчь осуществляется через 3-5 ч после однократной инъекции препарата и по времени не совпадает с секркци-ей в желчь лизосомных ферментов, что свидетельствует о независимости выведения СО от разгрузки лизосом.

8. Замедленное выведение CQ с желчью у животных с ВПХ является одним из существенных факторов проявления токсического действия соединения при повреждении печени.

9. Введение CQ крысам можно использовать в качестве модели для воспроизведения некоторых признаков лизосомных болезней накоп ления, включающих набухание лизосом, лабилизацкю мембран лизосой. формирование аутофагосок, увеличение активности лизосомных кислых гидролаз (возможно, вторичное по отновенив к накоплению в лизосо-мах непереваренных белков, фосфолипидов).

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

i. Korolenko Т.A., Rukavishnikova E.U., Ropanova I.ft. Intralysosoaal accumulation of exogenous ¿Mines and changes of physico-cheaical features of rat liver lysosoBes// International Biocheaical Congress. Abstracts.- Prague. Czechoslovakia. 1988.-P. 149.

2 Рукавивникова E.B. Внутрилизосбмное накопление хлорохина и его влияние на свойства лизосом печени крыс при введении in vivo// Актуальные проблемы теоретической и практической медицины: Тезисы докладов 50-й итговой научной конференции студентов и молодых ученых.- Новосибирск, 1989. - С.40.

3. Korolenko Т.A.. Pupyshev А.В., Rukavishnikova E.V.. Ropanova I. й. HechaniSB of suppression of intralysosoial protein degradation by inhibitors of proteolysis and proteinases// Intracellular Proteolysis. Mechanist! and Regulation: Proceeding of the 7th International Coanittee on Proteolysis tJCOP) Neetine.- Schleoda, Japan, 1989,- P. 494-49i.

4. Korolenko ' T.A., Rukavishnikova E.U., Ropanova i.ii. Lysosomotropic agents supperssinf? the intraiysosor -;

proteolysis; action in vivo//. Abstract,; book uof ,13th FEBS fleeting.- Roae. 1989.^ P. 224. :;n -

5, Kprolenko Т.н., Rukavishnikova E..U,.Urazgallev K.ShviLysoseao-irojrtc agents and endocytosis by rat liver ?cells//Jth Workshop of the ^European , Group on Lysosoaal. " Diseases-. Abstracts; Switzerland! ЛвЗ^.Р 3B. . . ■ -

0. Короленко Т.A., Рдкавианикова E.B;.;. Пдпыаев П.Б. Эффект, однйк-ратного и повторного введения хлорйхина яа активностк лротеиназ лизосом клеток печени крыс//Вопр. .. мед> химии — 1990;- т. 38, вып. В. С, 20-23. ; ,, ' • i: : . „\"

7. Рукавияникова Е.В; Воспроизведение признаков лизосомнйх: болезней накопления у крыс, с помоаы лизосомотропиого амина¿хлорохи-на// Новое в биологии и медицине: - Тез. докл. 5^-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых, мединститута.-Новосибирск. 1990.- С. 28-29.

П. Korolenko Т.н., Rukavishnikova E.U., Safina A.F., Kynklna G.I. Effect of proteolysis and proteinases inhibitors on lysosoies and endocytosis by liver cells in vivo// Mechanise and Regulation of Intracellular Protein Catabolis». Satellite Syaposiua to the 20th Meeting of FEBS. Abstracts.-Budapest/Nottinghaa. 1990. - P. 36.

Э. Korolenko Т.н., Rukavishnikova E.U.. Safina A.F., Mynkina C.I. Endocytosis by liver cells during suppression of IntralysosoMal proteolysis// The 23th Regional Meeting of Japanese Society of Nutritional and Food Science,- Tokushiaa, Japan, 1990.- Nov. 18 - 17.- P. 11.

10. Korolenko Т.н.. Rukavishnikova E.U., Safina 8.F., Uereschagin E.I..Mynkina I. Effect of chioroquine on endocytosis and liver lysosoies.// Acta Biologica Acad. Sci. Hong., 1991.- U. 42, N2, P. 301-309.

11. Korolenko Т.Й., Rukavishnikova E.U., Safina A.F. Chloroqulne adainistration to rats: a aodel of lysosoaal storage diseases? Keystone Syaposia on Molecular and Cellular Biology. Abstracts. 20th Annual Meeting, Proteolysis in Regulation and Disease. 3. Cellular Biocheaistry. 1991. Suppl. 15b. CHZ14.-P. 132.

12. Рукавианикова E.B.. Короленко Т.А., Внутрилизосомное накопление хлорохина в клетках печени и фармакокинетика соединения при развитии внепеченочного холестаза у крыс. //Тез. III Все-

совзной конференции по фариакокинетике. Москва. 53 13 дек. 1331г.

13. Рукавивникова и.В. Накопление хлорохина в печени и его сскре ция у крыс в норне и при экспериментальной холестллс.//Тез.53 -м кошр. молодых ученых Новосибирского мединститута. 1331,- С.

14. Korolanko Т.ft.. Rukavishnikova E.'J. f:ccuiulation cf lysosomotropic drugs by liver cells: Role In adverse reactions and liver injury// Abstract of 5th Horld Conference on Clinical Pharaacology and Therapeutics. Yokohaia. Зарап. July 20-31,199?..

15. Korolenko Т.П.. Rukavishnikova E.O.. Safina fi.F.. Dushkin K.I., Mynkina t.l. Endocytosis by liver cells during suppression of intralysosoaal proteolysis// Biol. Che«. Hoppe Seyler. 1332.-U.373.- P. 573-580.

«»-41

Зак. 267 Тир. 100. Печ.л.'. .0 Тип. CO Pi'iMli. r.HoDocM5.i;ic';