Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеиназы лизосом и гормональная функция щитовидной железы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеиназы лизосом и гормональная функция щитовидной железы"

| и и.Ь>

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Н.Н.ПАВЛОВЛ

На нравах рукописи УДК 612.441.015.13

Кочуков Михаил Юрьевич ПРОТЕИНЛЗЫ ЛИЗОСОМ И ГОРМОНАЛЬНАЯ ФУНКЦИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.00.04. - Биохимии

АВТОРЕФЕРАТ днсссртяпни ня соискаине ученой степени кандидата медицинских наук

Ршань- 1998

Работа выполнена в Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.Г1.Павлова

Научный руководитель - академик РА11 П.А.Строев

Официальные оппоненты - д.м.н., профессор Д.Г.Узбекона

- к.м.н. Л.I}.Дмитриев

Ведущая организация - Московский медицинский

с томатол о I и ч ее к и й и» сп 1 тут имени Н.А.Семашко

Защита состоится " " ._. 1998 года в " " часов на

заседании Диссертационного Совета Д 084.67.02. при Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова.

(391000, РФ, г.Рязань, ул.Высоковольтная, д. 9)

Автореферат разослан " " ._' 1998 года.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета.

(390026, РФ, г.Рязань, ул.Шевченко, д. 34)

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических паук

Н.А.Рязанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Изучение молекулярных механизмов синтеза и секреции йодтиронннов ( Ь и Т4) в фолликулах щитовидной железы и эндокринной регуляции этих процессов является актуальной проблемой, привлекающей внимание многих исследователей. В последние годы, благодаря совершенствованию биохимических и молскулярно-биологических подходов, в этой области исследований достигнут значительный прогресс. В частности, развитие методов молекулярной генетики позволило детально изучить структуру основных специфических для щитовидной железы белков - тиреоглобулина, тиреоидной пероксидазы, №+,1~симпортера, рецепторов тиреотропина и N-ацетилглюкозамина (Y.Malthiery et al., 1989; S.Kimura, 1990; O.Blanck et al., 1994; P.A.Smanik et al., 1996), а также исследовать основные механизмы регуляции их экспрессии. Успешная разработка способов культивирования клеток и реконструкции фолликулов in vitro дала возможность достаточно подробно описать процессы внутриклеточного транспорта и созревания тиреоглобулина (J.T.Dunn, 1990; P.Kim et al., 1991, 1992, 1993, 1995; B.Rousset & R.Momex, 1991). К числу основных достижений последнего десятилетия можно отнести и уточнение некоторых механизмов протеолитического ироцессинга тиреоглобулина (Тг) (установление сайтов расщепления молекулы ирогормоиа основными катепсинами), расшифровку механизма действия тиреотропина (L.D.Kohn, et al., 1989; C.Maenhaut et al., 1990), получение данных об основных механизмах контроля пролиферации и дифференцировки тиреоцитов (C.M.Gerard et al., 1990; G.Villone et al., 1993; G.Damante & R.DiLauro, 1994), постановка экспериментов по изучению функции белков цитоскелега и регуляции подвижности тиреоцитов (W.J.Deery & J.P.Heath, 1993; A.S. Yaps & S.W.Manley, 1994). Вместе с тем, отдельные проблемы остаются обойденными вниманием

исследователей. Так, несмотря на полученные в последние годы данные О важной роли катепсинов щитовидной железы в образовании свободных йодтиронинов (A.D.Dunn et al., 1991, 1996) до сих пор отсутствуют сообщения о возможности регуляции гормоногенеза на этапе протеолитического процессинга тиреоглобулина. Имеющиеся на сегодня сообщения о работах в этой области говорят о; чувствительности лизосомального аппарата тиреоцита к изменениям сывороточного уровня тиреотропина. Повышение уровня тиреотропина (ТТГ) сопровождается изменениями морфологии лизосом щитовидной железы и индукцией ряда кислых гидролаз (A.D.Dunn, 1984, F.Fouchier et al., 1987; I.D.Phillips et al., 1989). С другой стороны, ингибирование лизосомального протеолиза с использованием аминохинолиновых производных и карбоксильных ионофоров угнетает секрецию йодированных соединений фрагментами щитовидной железы in vitro (J.Unger et al., 1985; J.Unger & P.Ketelbant, 1988). Таким образом, дальнейшие исследования регуляции протеолиза в щитовидной железе будут способствовать более детальному изучению одного из основных механизмов контроля синтеза йодтиронинов и разработке новых фармакологических подходов к коррекции гипертиреоидных состояний.

Цель работы:

Изучить значение протеолитической системы лизосом щитовидной железы в регуляции гормоногенеза и некоторые возможности лизосомального процессинга тиреоглобулйна в биосинтезе йодтиронинов.

Основные экспериментальные задачи исследования:

1. Оценить изменения активности катепсинов В, С, D, Н, L и кислой фосфатазы, а также лабильности лизосомальных мембран в щитовидной железе крыс при гипофизэктомии и заместительном введении ТТГ.

2. Изучить изменения ферментного спектра и структуры лизосом при введении различных доз Т3 и Т4.

3. Используя ингибиторы процессов транскрипции и трансляции, изучить роль аппарата белкового синтеза в регуляции активности лшосомальных ферментов щитовидной железы крыс.

4. Оценить влияние лизосомотропного препарата хлорохин на активность ферментов лизосом и гормональную функцию щитовидной железы крыс.

Научная новизна.

Изучение изменений спектра лизосомальных протеиназ в щитовидной железе крыс при гипофизэктомии с заместительным введением ТТГ и при курсовом введении йодтиронинов обнаружило избирательную регуляцию активности катепсинов В, Н и Ь тиреотропином. Охарактеризована ранняя реакция лизосом щитовидной железы на снижение сывороточной концентрации ТТГ, выражающаяся в лабилизации мембран и появлении аутофагии. Показано участие лизосомального аппарата тиреоцита в индукции инволютипных изменений в щитовидной железе, возникающих в первые несколько суток от начала снижения уровня тиреотропина. Установлено, что в основе влияния ТТГ на активность ряда лизосомальных протеиназ лежит изменение скорости биосинтеза молекул катепсинов, реализуемое независимо от процессов трансляции. Доказана принципиальная возможность фармакологической регуляции гормоногенеза в щитовидной железе, при помощи соединений, блокирующих катаболизм белка в лизосомах.

Практическая значимость.

Полученные результаты позволяют уточнить роль лизосомального протеолиза в регуляции биосинтеза йодтиронинов, что способствует дальнейшему развитию фундаментальных и прикладных исследований в области физиологии щитовидной железы. Данные о механизмах гормональной и фармакологической регуляции активности катепсинов щитовидной железы создают предпосылки к разработке новых подходов к лечению нарушений

тиреоидного статуса в клинике. Результаты работы внедрены в учебный процесс' и используются при чтении лекций и проведении практических занятий по курсам биохимии (раздел «Биохимия гормонов»), эндокринологии (раздел «Патология щитовидной железы»).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на региональной научно-практической конференции "Аллергия, иммунитег и патология внутренних органов" (Рязань, 1995), на III Всероссийском съезде эндокринологов (Москва, 1996), заседании Рязанского отделения Всероссийского биохимического общества (Рязань, 1997).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, описания методов исследования, 5 глав собственных результатов, обсуждения^ выводов и библиографического указателя, включающего 13 отечественных й 222 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа выполнена на 380 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах массой 210 - 230 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Гипофизэктомию выполняли сгереотаксическим трансаурикулярным методом в модификации П.А.Чумаченко (1978). Часть животных, начиная с 9 дня от вмешательства получали заместительные инъекции тиреотропина, который вводили подкожно в разовой дозе 0.5 ЕД/кг (R.Seljelid et al., 1971), с интервалом в 12 часов. Остальные крысы вместо тиреотропина получали инъекции изотонического раствора NaCl. Забой всех гипофизэктомированных животных

проводили. на 14 день. Контролем гипофизэктомии служили ложнооперированные крысы.

Т3 вводили подкожно в течение 3 и 7 дней в разовой дозе 10 мкг/кгхсутки, или 100 мкг/кгхсутки, либо в течение 14 дней в дозе 10 мкг/кгхсутки (Е.Л.Строев и Е.А.Рязанова, 1992). Контрольные крысы в те же сроки получали инъекции растворителя (0.025 М ЫаОН). Забой осуществляли через 24 часа от последней инъекции препарата.

Т4 вводили подкожно, 100 мкг/кгхсутки (Е.А.Строев и Е.А.Рязанова, 1992), в течении 14 дней с забоем на 15-е сутки опыта.

Ингибиторы биосинтеза белка - актиномицин Р (АмО) и циклогексимид (Цг) вводили четырехкратно в/брюшинно в разовой дозе 0.2 и 1 мг/кг (Е.А.Строев, 1972; А.В.Васильев, 1993), соответственно, с интервалом в 12 часов. Животных забивали через 6 часов от последней инъекции препарата. Контролем служили крысы, которым вводили растворитель (5 % этанол для АмО, физраствор для Цг). Для изучения эффектов ингибиторов белкового синтеза у обработанных Тз (10 мкг/кгхсутки) крыс, АмО и Цг вводили по описанной выше схеме, в течение 2-х и 3-х суток, или, в другом случае, 6-х и 7-х суток от начала введения гормона.

Хлорохина дифосфат вводили внутрибрюшинио в виде 0.8 % раствора в дозе 50 мг/кг массы телахсутки (Т.А.Короленко и др., 1990) с интервалом в 24 часа в течении 7, 14, и 21 суток. Забой проводили через I час ог завершающей инъекции препарата. Контрольным животным вводили растворитель (изотонический раствор №С1) в те же сроки, что и опытным группам.

За 12 часов до забоя животных лишали пищи. Взятие крови из брюшной аорты на гормональное исследование и тиреоидэктомию выполняли под легким эфирным наркозом, после чего крыс забивали путем деканитации. Гомогенизацию и субклеточное фракционирование ткани щитовидной железы проводили по Ш^агНг^ е1 а1. (1978). Немедленно после удаления щитовидную

железу помещали в холодную 0.25 М сахарозу и гомогенизировали в соотношении 1/100 в стеклянном гомогенизаторе типа Потгера-Эльвехейма (60 секунд при 1000 об/мин). Полученный гомогенат центрифугировали дважды: 10 минут при 1000 g и 30 минут при 20000 g. Конечный супернатант использовали для определения активности лизосомальных ферментов. Осадок, полученный при 20000 g - центрифугировании ресуспендировали в 0.25 М сахарозе с добавлением Тритона X - 100 в конечной концентрации 0.1 %, в объеме, равном объему раствора сахарозы при гомогенизации и оставляли стоять в течении 1 часа до полной солюбилизации ферментов. Описанные выше процедуры проводились при температуре не выше 4 °С. Активность лизосомальных гидролаз в седиментируемой (20000 g) и неседиментируемой фракциях гомогената определяли раздельно и обозначали как, соответственно, седиментирусмая и неседиментируемая активность (CA и НА). Общую активность (OA) рассчитывали как сумму CA и НА. Дополнительно для каждого энзима рассчитывали соотношение НА/ОА, представляющее собой т.н. коэффициент лабильности лизосомальной мембраны (Клаб, %).

Активность катепсинов В, L и Н измеряли спектрофлюориметрическим методом A.J.Barrett & H.Kirschke (1981). В качестве субстратов использовали Na-CBZ-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin, Arg-7-amido-4-methylcoumarin и Na-CBZ-Phe-Arg-7-arriido-4-methylcoumarin, соответственно. Активность катепсина С определяли спектрофлюориметрическим методом Peters п модификации А.В.Васильева (1983) по скорости гидролиза Gly-Phe-ß-naphtylamide. Активность катепсина D определяли по скорости образования свободных аминокислот и коротких ТХУ-растворимых пептидов при гидролизе денатурированного мочевиной бычьего гемоглобина (А.Дж.Баррет и М.Ф.Хит, 1980). Концентрацию -NH2 групп в ТХУ-растворимой фракции измеряли спекгрофлюориметрически по конъюгации с флюорескамином (S.Udinfriend et al., 1972). Активность кислой

фосфатазы оценивали спектрофотометрически но гидролизу нара-нитрофенилфосфата (А.Дж.Баррег и М.Ф.Хиг, 1980).

Содержание белка в гомогенате определяли по методу Bradford (1976).

Сывороточный уровень гормонов исследовался в день забоя. Содержание Тз и Т4 измеряли радиоиммунным методом при помощи наборов "Orion Diagnostica"; ТТГ определяли иммуноферментным методом (наборы Umelisa) и радиоиммунным методом ("Orion Diagnostica"). Концентрацию тиреоглобулина в сыворотке крови измеряли радиоиммунным методом при помощи наборов РИЛ-Тг-'251'.

Концентрацию препарата хлорохин в гомогенате щитовидной железы измеряли спектрофлюориметрическим методом M.I.Colombo & F.Bertini (1985).

Материал для электронномикроскопического исследования готовили по R.Seljelid et al. (1971). Полутонкие срезы окрашивали гематоксилином-эозином. Ультратонкие срезы изготовляли с помощью ультрамикротома УМТП - 6 и исследовали под электронным микроскопом ЭВМ - 100АК2.

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики. Достоверность различий оценивалась с использованием t-критерия Стыодспта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Роль лизосомалыюго аппарата тиреоцита в регуляции гормоногенеза: изменения ферментного спектра лизосом при гипофизэктомии и заместительном введении тиреотропипа.

В опубликованных ранее исследованиях (R.Seljelid el al., 1971; J.R.Starling et al., 1978; A.D.Dunn, 1984; F.Fouchier el al., 1987; U.Perrild et ai., 1989; LNitsch et al., 1990; S.Desruisseau et al., 1994) уже были описаны отдельные энзимологическне и структурные изменения лизосомалыюго аппарата тиреоцита

1 Определение сывороточного уровня гормонов проводилось на базе изотопной лаборатории ЦНИЛ РязГМУ.

2 Электронномикроскопическое исследование выполнено на базе лаборатории молекулярной эндокринологии ЦНИЛ РязГМУ

Таблица 1. Изменения тиреоидного статуса крыс при гипофизэктомни и курсовом введении йодтиропннов3.

Серия Концентрация гормонов в сыворотке к рови (М± т)

Тч, нмоль/л Т4, нмоль/л ТТГ4, МЕД/л

1 Ложная операция (п=8). 1.766 ±0.212 33.157 + 5.980 0.797 ±0.214

2 Гипофизэктомия (п=6). 0.321 ±0.185** 9.438 ±3.859** -

3 Гипофизэктомия+ТТГ (п=5). 2.434 ± 0.497 39.183 ±8.098 0.582 ±0.370

4 Контроль (п=22). 1.851 ±0.342 27.313 ±7.223 1.404 ±0.396

5 Т.1, 10 мкг/кг, 3 дня (п=8). 2.081 ±0.521 12.052 ±6.210 0.950 ±0.171

6 Т}, 100 мкг/кг, 3 дня (п=6). 4.186 + 0.288** 11.445 ±6.150* 1.112 ±0.201

7 Тз, 10 мкг/кг, 7 дней (п=8). 1.459 ±0.433 0.973 ±0.655*** 0.074 ± 0.008**

8 Тз, 100 мкг/кг, 7 дней (п=6). 5.095 ±0.318** 0.845 ±0.410*** 0.062 ±0.012**

9 Тз, 10 мкг/кг, 14 дней (п=6). 1.952 ±0.440 1.951 ±0.440*** 0.079 ±0.017**

10 Т4, 100 мг/кг, 14 дней (п= 8). 5.515+0.918* 150.432 + 14.899** 0.104 ±0.011**

при повышении (введение тиреотропина) или понижении (гипофизэктомия или введение тиреоидных гормонов) функциональной активности щитовидной железы. Нами изучены изменения активности катепсинов В, С, Э, Н, Ь и кислой фосфатазы в щитовидной железе крыс при гинофизэктомии и заместительном введении ТТГ.

Как и ожидалось, гипофизэктомия вызывает заметное снижение содержания йодтиронинов в сыворотке крови {таблица I). Изменения гистологической картины говорят о значительном снижении функциональной активности изучаемого органа.

Обнаруженное угнетение выработки тиреоидных гормонов сопровождается уменьшением содержания цистеиновых протеиназ - катепсинов В, Н и Ь {таблица 2). В то тгее время, активность катепсина С, относящегося к этому же

3 Достоверность различий с контролем отмечена: * - р < 0.05, ** - р < 0.01, *** - р < 0.001.

В сериях 4-10 ТТГ определяли иммуноферментным, в сериях 1-3 - радиоиммунным методами.

Животные, служившие контролем для серий с введением Тэ и В одну контрольную группу объединены крысы, получавшие инъекции щелочи разное количество дней.

Таблица 2. Ферментный спектр ли юсом щипшилпои желе 11,1 тофнзэктомированмых и ложноопернровапных крыс (на 15-е сутки после операции)*.

а) ложная операция (п = 8).

Катепсин В Катепсин С Катепсин И Катепсин Н Катепсин 1. Кислая фосфатаэа

9.06 ± 0.79 118.59 ± 11.52 3.01 +0.34 0.61 ±0.04 21.99 ±2.85 0.80 ±0.07

г> 50.19 ± 2.21 73.25 + 2.08 42.15 + 2.88 63.02 ±4.18 51.12 ± 2.51 43.12 + 2.55

б) гипофизэктомия (п = 6).

Катепсин В Катепсин С Катепсин О Катепсин Н Катепсин Ь Кислая фосфата за

3.31 ±0.42** 88.11 ± 10.0* 2.32 ±0.59 0.14 ±0.02*** 6.42 + 0.89*** 0.69 ±0.16

6 51.25 ±4.39 81.98 ± 1.22* 51.17 ± 2.0* 61.64 ±7.65 62.15 ±3.35* 60.57 + 3.88**

о) гипофизэктомия + ТТГ (п = 5).

Катепсин В Катепсин С Катепсин О Катепсин 1-1 Катепсин Ь Кислая фосфат пча

12.1810.69* 140.77 ±9.46 3.14+0.79 0.44 ±0.06* 18.26 + 3.40 0.79 + 0.14

б 45.33 ±3.21 77.52 + 3.40 40.25 + 2.97 58.99 + 6.48 55.87 ±2.29 40.61 ±3.15

лассу, изменяется в значительно меньшей степени, а изменения активности атепсина О (аспартнльной протеиназы) и кислой фосфатазы - недостоверны. Для ольшинства энзимов отмечается некоторое увеличение Клаб.

Заместительное введение тиреотропина сопровождается восстановлением ормонального профиля крови (таблица /). Активность кислых гидролаз (за сключением кагепсина Н) возвращается к контрольному уровню, пли ревышает его (таблица 2. (в)). Коэффициент лабильности лизосомальпых ембран также возвращается к контрольным величинам.

Таким образом, среди изученных лизосомальпых гидролаз, высоко увствительными к изменениям сывороточного уровня ТТГ являются

<\ктивность катепсипов В, II и Ь выражена в нмоль 7-амино 4-метилкумарипа/мг белкахчас, степенна О-в нмоль тирозина/мг белкахчас, кислой фосфатазы - в мкмоль пара-итрофенола/мг белкахчас; Кла<-, выражен в %. Данные по сериям представлены как М ± т, зстовсрность различий с контролем отмечена: * - р < 0.05, ** - р < 0.01, *** - р < 0.001.

цистеиновые протеиназы - катепсины В, Н и L, которые, как известно, играют важную роль в процессииге тиреоглобулина и образовании свободных Т4 и Т3 (A.D.Dunn et al., 1991, 1996). Это подтверждает тезис о возможности физиологической регуляции гормоногенеза через изменение скорости протеолитической деградации прогормона в щитовидной железе.

2. Этимологические и структурные изменения лизосом тиреоцита при курсовом введении тироксина и трийодтирочина.

До настоящего времени остается неясным значение лизосомалыю-вакуолярной системы тиреоцита при развитии атрофических изменений железистой паренхимы. В частности, не установлено, сопровождается ли инволюция щитовидной железы усилением аутофагии, как это имеет место, например, при атрофии простаты (данные литературы по этому вопросу (M.F.van den Hove-Vandenbrouke, 1982; R.Seljelid et al, 1988; L.Nitsch et al., 1990; O.Tachiwaki et al., 1990) достаточно противоречивы); не объяснен и механизм часто наблюдаемого увеличения количества вторичных лизосом (L.Nitsch et al., 1990).

Кратковременное (3 дня, 10 мкг/кгхсутки) введение Т3 не приводит к достоверным изменениям гормонального профиля. Увеличение дозы вызывает появление начальных признаков гипертиреоза на фоне возрастания сывороточной концентрации Т3 и снижения содержания Т4. При более продолжительном введении гормона (как 100, так и 10 мкг/кг) наблюдается падение концентрации тиреотропина и угнетение секреции эндогенных йодтиронинов, о чем свидетельствует понижение уровня Т4. Курсовое введение тироксина (14 дней, 100 мкг/кгхсутки) также приводит к снижению секреции ТТГ; концентрация йодтиронинов, напротив, значительно возрастает.

Таблица 3. Общая активность кислых гидролат (М ± т) н лабильность лнчосом (1<"„-, % (М ± ш)) щитовидной железы крыс при введении Т, и Т4\

рменг Серия

Кошроль, Ъ,3дня Т,, 7 дней ТА т„

п=18 10 мкг/кг, п=8 100 мкг/кг, п=6 10 мкг/кг, н=8 100 мкг/кг, п=6 10мкг/кг 14 дней, п'6 100 мкг/кг 14 дней, п=7

т.В: ОА 9.7(Ж).бЗ 12.10ШЗ** Ю.04Й.41 7.34+0.62** 6.86+0.71** 5.76+034*** 6.15+0.28»**

л 53.11±1.99 ШШ.69»' 821944.32** 63.98i2.23*» 60.51+2.02* 73.82+2.85*» 65.91+2.04**

гг.С:ОА 123.59t7.52 126.13+14.02 109.48±10.63 11325+5.37 107.04±12.56 102.51 ±639» %. 77+7.01*

л 6539±2.68 83.21+2.81»» 80.88ttl.42»» 80.21±2.14» 74.16+1.23* 77.97±3.08* 75.18+2.98

[Г.О: ОА 2.76Ю25 2.12+036 2.66+031 2.46+0.16 234+0.52 2.71+0.29 2.01+0.21*

л 3l.92i2.01 77.1514.04** 81.95i3.l4»» 46.69t5.10» 55.18+2.67** 51.1414.%* 42.18+3.22*

(т.Н: ОА 0.55±0.04 0.48Ю.03 0,47+0.04 0.32+0.03** 035+0.03** 0.1710.02*** 0.25Ю.04**

* 68.87i3.12 79.92+4.20» 85.12±3.99** 55.93i6.79 60.l8i5.ll 59.70+1.46 CO.l6i2.54

гг.и ОА 24.8Ш.46 24.62±1.77 22.17+2.44 15.25+1.48»* 12.81±1.98** 10.44i0.61*»» 12.87+2.11**

дб 50.0512.76 8225+325»»» 76.89il.46»'* 63.09+1.41** 60.44±1.26* 70.40+1.58»** 60.14+1.01*

[>:ОА 0.84+0.08 0.69*0.08 0.5 5+0.06* 0.52+3.02** 0.<ЯШ09** 0.49+0.05** 0.56+0.03**

л 44.8ftt2.70 66.47±5.55» 69.98i3.96*» -16.39+1.37 42.12il.24 51.26+2.91 46.1113.15

На фоне 7- и 14 дневного введения иодтиронинов также как и при гипофизэктомии наблюдается значительное снижение активности большинства лизосомальных гидролаз (таблица 3.). И в этом случае максимальной чувствительностью к колебаниям сывороточного тиреотропина обладают катепсины В, Н и Ь. Лабильность лизосомальных мембран резко возросла в результате трехдневного введения Тз, оставаясь повышенной, хотя и в меньшей степени, и на более поздних сроках развития атрофии железы. Повышение дозы трийодтиронина с 10 до 100 мкг/кг не сопроволодается достоверным усилением эффекта гормона: дальнейшего снижения активности ферментов или более выраженных изменений лабильности лизосомальных мембран не наблюдается.

7 Единицы активности и обозначения достоперности изменений - аналогично табл.2.

Ультраструктурные изменения, возникающие в щитовидной железе крыс' при длительном (более двух недель) угнетении секреции ТТГ (гипофизэктомия или введение тиреоидных гормонов) изучены достаточно подробно. В связи с этим мы решили заострить внимание на ранних морфологических признаках развития инволютивных процессов в железистой паренхиме.

При электронно-микроскопическом исследовании препаратов щитовидной железы животных, получавших Тз, удается обнаружить ряд характерных признаков инволюции железистой паренхимы. Клетки фолликулярного эпителия приобретают уплощенную форму, выявляется гетерохроматизация ядра с усложнением контуров ядерной мембраны и формированием многочисленных инвагинаций. Гетерохроматин, компактизируясь, узким прерывистым слоем располагается вблизи кариолеммы. На апикальной поверхности клеток определяется редукция микроворсин. Количество коллоидных капель в цитоплазме невелико. В базальном отделе тиреоцига наблюдается редукция цистерн эндоплазматического ретикулума с уменьшением числа рибосом. Митохондрии набухшие, обнаруживается уменьшение числа крист. В большинстве митохондрий наблюдается расширение межмембранных пространств, фрагментация и гомогенизация крист. В отдельных полях зрения наблюдается "просветление матрикса митохондрий. Происходит заметное уменьшение количества первичных и увеличение числа вторичных лизосом. Лнзосомы часто располагаются вблизи митохондрий с признаками деструкции, некоторые имеют признаки аутофагических вакуолей. Первичные лизосомы чаще всего обнаруживаются в апикальных отделах цитоплазмы. Перечисленные изменения отчетливо визуализируются даже после 3-х дневного введения Тз, не нарастая при более продолжительном курсе инъекций гормона.

Таким образом, курс инъекций тиреоидных гормонов вызывает развитие инволютивных изменений в паренхиме щитовидной железы крыс и угнетение продукции йодтиронинов. Наиболее ранние изменения лизосомального аппарата

выражаются в повышении лабильности лизосомальных мембран, увеличен!" > числа вторичных лизосом и появлении аутофагии. На более поздних м.шах инволюции железы происходит ингибирование катепсинов В, Н и 1-, играющих важную роль в процессинге Тг и лизосомальный аппарат тиреоцита полностью "переключается" на аутофагическую деградацию субклеточных структур.

3. Механизмы регуляции активности лизосомальных гидролиз щитовидной железы: эффекты ингибиторов белкового синтеза.

Механизмы регуляции протеолитического процессинга Тг в щитовидной железе до настоящего времени остаются практически не изученными. В частности, требует объяснения феномен различной чувствительности отдельных представителей протеиназ к изменениям уровня ТТГ. Предлагалась гипотеза, объясняющая изменения активности тиоловмх протеиназ в щитовидной железе зависимостью от содержания восстановленного НАДФ (Н.РегтПс! й а!., 1989). Однако, как показывают наши исследования, среди тиоловых протеиназ также есть ферменты не чувствительные к ТТГ (кленат С). Поэтому более логично предположить существование специфического механизма контроля экспрессии определенных ферментов, возможно, на этапах биогенеза. Об этом же свидетельствуют и данные об изменениях содержания мРНК катепсина В в культивируемых тиреоцитах в ответ на ТТГ (Ш.РЫШрв е( а!., ¡986, 1989). Для проверки этого предположения изучено влияние ингибирования биосинтеза белка на уровне транскрипции и трансляции на тиреоидный статус животных и активность лизосомальпых тиоловых протеиназ в исходно интактной и угнетенной курсовым введением Тз щитовидной железе крыс.

Введение АмР и Цг в выбранной нами максимально-переносимой дозе сопровождается выраженным общетоксичсским действием. Значительные изменения гормонального профиля крови происходят при введении Цг: содержание Тз, Т4 резко снижается {таблица 4).

Таблица 4. Изменения тмреоидного статуса крыс при введении ингибиторов, белкового синтеза8.

Серия Концентрация гормонов в сыворотке крови (М ± ш).

Тз, нмоль/л Т4, нмоль/л ТТГ, МЕД/л

Контроль (п= 18). 1.665+0.195 36.668 ± 6.433 1.530 + 0.555

AmD (п=8). 0.824 + 0.401 16.960 + 8.596 0.701+0.283

Тз, 3 дня + AmD (п=6). „ 1.9 И +0.356 12.445 ±6.190* 0.681 ±0.316

Тз, 7 дней + AmD (п=6). 1.738 + 0.244 0.984 + 0.655*** 0.072 + 0.011**

Цг(п=8). 0.302 + 0.098*** 12.792 ± 1.771* 0.350 + 0.171

Тз, 3 дня + Цг (п=6). 1.952 + 0.440 1.951 +0.440*** 0.216 + 0.134**

Тз, 7 дней + Цг (п=6). 1.568 ±0.356 1.023 ±0.820*** 0.091 +0.008**

Совместное введение AmD, Цг и Т3 приводит к некоторому усилению токсического эффекта препаратов. Картина изменений гормонального профиля крови таких животных напоминает обнаруживаемую у крыс, получавших только

Т3.

Отдельные лизосомальные ферменты неодинаково реагируют на ингибирование транскрипции и трансляции (влияние AmD и Цг на скорость синтеза суммарных РНК и белка в щитовидной железе доказано (J.M.McKenzie et al., 1968». Более выраженные изменения вызывает Цг: введение препарата приводит к резкому снижению ОА катепсинов В, С и L (таблица J). Наибольшее, по сравнению с остальными сериями понижение активности ферментов происходит при введении AmD и Цг на фоне 7 дневного курса инъекций Т3. При этом ÄmD и Тз действуют синергично: активность катепсинов В, Н и D после введения AmD без Т3 не изменяется, а катепсинов С и L - лишь немного снижается, в то время как у крыс, получающих инъекции гормона п течение 7

'Достоверность различий с контролем отмечена: * - р<0.05, ** - р < 0.01, *** - р< 0.001.

9 Содержание тиреотропина определяли иммуноферментным методом.

Таблица 5. Активность кислых гидролаз (М + т) и лабильность ли юсом

(К1яГ„ % (М ± т)) щитовидной железы крыс при ввсдсмип ингибиторов белкового синтеза

» . ю

при исходно нормальной и пониженной гормональном функции .

а) актиномицчн О

Фермент Серия

Контроль, п = 18 АмО, 0.08 мкг/кг, п ~ 8 Т1, 10 мкг/кг +• АмО

3 дня, п = 8 7 дней, п — 6

Кат.В: ОА 9.31 ±0.89 8.69 ± 1.78 7.49 ±0,65** 2.83 ±0.28***

К11ав 48.47+ 1.83 61.68 + 8.2 73.20 + 4.14** 72.10 + 4.85**

Кат.С: ОА 118.35 ±7.44 89.02 ± 8.34* 103.45 + 6.16 55.75 + 18.37**

Кп„б 65.74 + 2.49 70.53 + 2.93 75.39 ±2.45* 66.47 + 4.26

Кат.О: ОА 3.05 ±0.24 2.46 ± 0.49 2.95 + 0.26 2.49 ±0.10*

К.чаб 39.65 + 3.51 30.67 + 8.37 77.13+4.11*** 83.01 +5.41***

Кат.Н: ОА 0.55 ±0.04 0.64 ±0.20 0.42 ±0.12 0.11 +0.05**

КЛа<! 61.66 + 3.31 59.55 + 9.07 72.12 + 3.02* 75.14 ± 3.83*

КатХ: О А 25.62+1.86 16.93 ±2.33* 20.21 ±2.47 |Т4(иГо.42***

51.03 + 2.37 52.49 + 4.95 64.32 ±5.58* 0.74 ±0.08 6М7 ± 3,32* 0.73 ±0.12

КФ: ОА 0.75 ±0.06 0.78 ±0.10

Клаб 44.47+1.83 34.55 + 9.45 42.12 ± 1.24 65.12 ±3.27***

б) цикпогексилшд

Контроль, п = 18 Цг, 0.4 мкг/кг, (п = 6) Тз, 10 мкг/кг + Цг

3 дня, (п = 6) 7 дней, (п - 7)

Кат.В: О А 9.31 ±0.89 4.44 + 0.53*** 4.98 ±0.58** 2.98 ±0.16***

Клай 48.47 ± 1.83 76.83 ±4.59*** 70.45 + 3.11** 67.50 ±5.42*

Кат.С: ОА 118.35 + 7.44 57.15 + 8.47*** 72.56 + 10.39* 37.25 ±9.85**____ 65.25 ±4.54

КдаВ 65.74 ± 2.49 75.27 + 3.60 63..77 + 3.71

Кат.О: ОА 3.05 ±0.24 2.81+0.55 2.52 ±0.31 2.19 ±0.23*

^лаб 39.65 ±3.51 34.96 ±9.0 58.19 + 3.0* 66.31 +4.78**

Кат.Н: ОА 0.55 ±0.04 0.75 + 0.23 0.22 ± 0.06** 0.12 ±0.04***

61.66 + 3.31 74.87 ±4.98* 60.75 + 2.0-1 Кб. 58 + 3,4."!** 6.04 ± 1.05**

Кат.Ь: ОА 25.62 ± 1.86 11.84 ± 1.99** 11.54+ 0.79***

К,иг> 51.03 ±2.37 65.46 ±4.98** 63.28 + 4.66* 61.63 ±4.08,чц,%

КФ: ОА 0.75 ±0.06 0.71 +0.16 0.73 ±0Л0_________ 51.26 + 2.91* 0.72 ± 0.08 61.60 ±3.20***

К„„г. 44.47 ± 1.83 39.35 + 5.93

дней, активность большинства ферментов при введении АмГ) резко снижается {рисунок 1). Степень Цг-индуцированпого ингибирования катспсинов печавнеит

и> Единицы аю-ивности я лабильности, обозначения достоверности изменений - см тшашцг 2

О. Кат.В ! Кат.С Кат.Ц Kar.ll Кат.1. Кисл.ф-'а 1Р<0.01) (Г 0.115)

"ОТ

СР®

-24.7?

1

-39.92

б. Кат.1! Кат.С Кат.|) Кат.11 Каг.1. Кися.ф-1 II' 0.(II) ¡1' (1.01) (Р 0.01) (Р 11.111)

60 40 20 0 -а

-40 -60 -80

1.22

-<1,44

40.39

га

■ в

уя рг

I

1 -58.03

в. Кат.В Кат.С К»т.1> (Р<а.оо1) (р<о.оо1)

Кат.11 Кат.1. Кислила (Р<0.01)

40 20 0 -20 -40 -60

36.36

"ЩГ

-5.33

и

-7.87

-5231 -51,72

г. Кат.В Кат.С Кат.15 Кат.П Кат.1. Кмса.ф-' (р- 0.01) (р'-О.О!) (Р ОЛИ) II" 11.01)

60-, 40 20 0 -20 •40 -60

-59,4

-S7.il

-<2.5

-60,39

Рисунок 1. Влияние предварительного введения Т, на актиномицин О и циклогексимид-индуцированные изменения активности лизосомальных ферментов щитовидной железы крыс. Изменения активности даны в % от соответственного контрольного уровня. Серии: а. - введение актиномицина Э без предварительного введения Т3 (нулевой уровень - активность у контрольных животных); б. • введение актиномицина О на фоне 7-дневного курса Т, (нулевой уровень - животные, получавшие только Т,). «• -введение циклогексимида без предварительного введения Т, (нулевой уровень - активность у контрольны животных); г - введение циклогексимида на фоне 7-дневного курса Т, (нулевой уровень - животные, получавшие только Т,).

от предварительного введения Тз в меньшей степени: в отношении ряда энзимов имеет место простой аддитивный эффект.

Полученные результаты подтверждают предположение о механизме ингибирования лизосомальных цистеиновых протеиназ в щитовидной железе крыс при курсовом введении Тз, связанном с подавлением биосинтеза катепсинов. Особенности взаимодействия AmD и Тз указывают на регуляцию уровня м-РНК катепсинов по нетранскрипционным механизмам, (подобный эффект ТТГ уже был показан для тиреоидной НАДФ-зависимой малат дегидрогеназы и №+,Псимпортера (L.D.Kohn et al., 1989)). Если такой механизм действительно существует, укорочение периода полужизни м-РНК тиоловых катепсинов при Т3-индуцированном снижении уровня тиреотронина может . обусловить синергизм в действии AmD и Т3.

4. Функциональное состояние щитовидной железы крыс при длительном введении лизосомотропного препарата хлорохин.

Из результатов, представленных в предыдущих главах следует, что одним из возможных путей коррекции гормональной функции щитовидной железы может быть использование лизосомотропных соединений, способных ингибировать образование свободных йодтирошшов при про теолнзе тиреоглобулина. Обнаружено подавление секреции йодсодержаших соединений инкубируемыми в присутствии хлорохина фрагментами щитовидной железы свиньи (J.Unger el al., 1985), однако влияние препарата па тирсоидную функцию in vivo не исследовано. Нами изучены состояние гормональной функции и характер изменений активности ряда кислых гидролаз щитовидной железы крыс при длительном курсовом введении хлорохина 50 мг/кгхсутки.

В крови животных опытных групп обнаружено выраженное достоверное снижение содержания Т3 (таблица б.). Уровень Т4, ТТГ и тиреоглобулина

Таблица 6. Изменения тиреоидного статуса крыс при длительном введении хлорохина.

Серия || Содержание в сыворотке крови в день забоя (М±мУ1

1 ■ 11 ■ ! Т3, нмоль/л Т4, нмоль/л ТТГ", МЕД/л тиреоглобулин, нг/л

Контроль | (п-24) 1.754 ±0.254 32.689 ± 5.060 0.590 ±0.124 3.99612.148

Хлорохин, 7 дней (п=П) 0.705 ± 0.052* 25.246 ±3.289 0.502 + 0.129 4.89213.424

Хлорохин, 14 дней (п=12) 0.633 ± 0.095* 25.788 ±3.213 0.673 + 0.194 4.186 + 2.273

Хлорохин, 21 день(п=11) 0.508 ±0.124* 31.960 ± 2.418 0.70010.214 3.865 ± 2.799

достоверно не изменяется. Нормальное содержание тиреоглобулина говорит об отсутствии токсического действия препарата на железу. Установлено, что хлорохин интенсивно проникает в клетки практически любых органов (Е.Ш.МсО^пеу & С.Э.РйсЬ, 1984). Однако, сведения о накоплении хлорохина щитовидной железой до настоящего времени в литературе отсутствуют. Концентрация препарата в гомогенате железы при одно-, двух- и трехнедельном введении хлорохина составила, соответственно, 0.426 ± 0.096, 0.762 ± 0.240 и 0.664 ± 0.117 мкмоль/г сырой ткани (различия статистически недостоверны), что сравнимо с содержанием хлорохина в других органах при аналогичных условиях (ЕЖМсСЬеэпеу & С.О.РЦсЬ, 1984; Т.А.Короленко и др., 1990).

Активность кислых гидролаз при введении хлорохина менялась разноналравлено: при нарастающем ингибировании тиоловых катепсинов В, Ь и, в меньшей степени, С имела место значительная активация аспартильной протеиназы - катепсина Б (таблица 7.).

Гистологическая картина щитовидной железы характеризуется неоднородностью изменений: наряду с гипертрофией отдельных фолликулов с резорбцией коллоида, встречаются обширные участки ткани с крупными

" достоверность различий с контрольным уровнем отмечена: * - р < 0.05.

12 сывороточную концентрацию ТТГ определяли радиоиммунным методом.

Таблица 7. Общая активность кислых гндролаз (\1 ± т) и лабильность лнзосом (Кл,5,М ± ш) щитовидной железы крыс при введении хлорохина13.

Фермент серия

Контроль14, п= 16 Хлорохин, 50 мг/кг, 7 дней, п = 8 хлорохин, 50 мг/кг, 14 дней, п = 8 хлорохин, 50 мг/кг 21 день, л = 6

Кат.В: ОА 8.71 ±0.66 1 7.19+1.44 5.71 10.74* 3.81 10.76**

Клав 56.40 1 2.77 73.85 + 5.93* 64.4512.80 70.2816.82*

Кат.С: ОА 111.6517.33 116.22 + 6.79 94.1514.03 88.8914.70*

Клаб 69.30 + 2.11 76.1015.16 70.1813.18 72.201 1.11

Кат.О: ОА 3.01 ±0.26 4.64 + 0.59** 5.62 + 0.38*** 6.25 10.63***

Клав 40.1314.20 56.21+5.69* 60.18 + 2.87** 54.6513.05*

Кат.Н: ОА 0.43 10.04 0.22 + 0.02** 0.3910.06 0.31 10.04

Клаб 62.89 + 3.12 80.3812.98** 68.0716.34 64.01 15.35

Кат.Ь: ОА 25.19+1.36 22.81 ±2.51 19.21 12.22* 15.4912.08**

Кдаб 51.62 + 2.91 67.43 + 7.15* 55.741 8.73 57.5815.68

КФ: ОА 0.74 ± 0.05 0.58 + 0.06 0.7610.07 0.6510.06

Клаб 49.96+3.41 81.32+4.89** 58.8217.76 54.25 13.73

фолликулами полигональной формы, темным коллоидом и уплощенным эпителием. При электронномикроскбпическом исследовании чаще встречаются клетки уплощенной формы. Ядра округлые или овальные, расположены ближе к базальной мембране и занимают значительную часть объема клетки. Преобладает, гетерохроматин, который местами подвергается конденсации и узким прерывистым слоем располагается вблизи кариолеммы. Контуры ядра неровные. Апикальная поверхность большинства клеток содержит множество микроворсинок. В апикальном отделе цитоплазмы определяется большое количество первичных лизосом. Встречаются единичные вторичные лизосомы с

13 Единицы активности и обозначения достоверности изменений - аналогично тиГа.2

14 Крысы, получавшие инъекции растворителя втечение 7, 14 и 21 днем объединены в одну контрольную группу.

■ I! ■ I!

гетерогенным содержимым. Внутриклеточные капли коллоида мелкие 'и немногочисленные.

Эндоплазматическая сеть развита хорошо, формирует удлиненные I

' IГ

широкие цистерны, просвет которых заполнен мелкозернистым содержимын средней: электронной плотности. Митохондрии многочисленны, овальной ши округлой формы. Значительная часть митохондрий - с немногочисленным! кристами, явлениями вакуолизации, просветлениями матрикса. Базальна мембрана гомогенна, имеет сложный рельеф за счет образования складок. Вблиз! базальной мембраны тиреоцитов хорошо развита микрокапиллярная сеть.

Таким образом, длительное курсовое введение лизосомотропноп препарата хлорохин вызывает торможение продукции Тз и появление отдельны: морфологических признаков снижения функциональной активности щитовидно! железы крыс.

ВЫВОДЫ:

IГ

1. Активность ферментов, играющих ключевую роль в образовании свободны:

йодтиронинов - катепсинов В и Ь в щитовидной железе крыс резко снижаете:

; м

после гипофизэктомии и восстанавливается до нормальных значений пр!

заместительном введении ТТГ.

ф;

2. Первичная реакция лизосом щитовидной железы крыс на падение уровня ТТГ вызываемое курсовым введением трийодтиронина (первые несколько суток) выражается в генерализованной лабилизации мембран, увеличении числ; вторичных лизосом и появлении аутофагии. При более длительном сниженш концентрации тиреотропина присоединяется ингибирование ключевые ферментов процессинга тиреоглобулина - катепсинов В, Н и Ь.

3. Ингибирование трансляции циклогексимидом вызывает резкое снижени< сывороточного уровня йодтиронинов и содержания катепсинов В, С и Ь I щитовидной железе у крыс. Влияние тиреотропина на лизосомальньн

протеолиз в щитовидной железе не связано с изменениями трансляции, поскольку степень циклогексимид-индуцированного ингибирования катеисинов у крыс с нормальным и пониженным уровнем ТТГ одинакова.

4. Тиреотропин контролирует биосинтез катеисинов В, С, Н и Ь щитовидной железы но механизму, функционально сопряженному с процессом транскрипции: введение актиномицина О не сопровождается существенными изменениями спектра л.изосомальиых гидролаз в щитовидной железе крыс с исходно нормальной секрецией 'ГТГ, но вызывает значительное снижение активности катепсинов у животных с пониженным уровнем тиреотропина.

5. Изменения активности лизосомальных протеиназ в щитовидной железе крыс, вызываемые хлорохином, зависят от длительности введения и отличаются разнонаправленностыо: наряду с постепенным снижением активности тиоловых катеисинов В, С и Ц происходит активация аспартилыюй протеиназы - катепсина О, что говорит о неодинаковом значении механизма регуляции внутрилизосомального рН для биогенеза катепсинов различных классов.

6. Длительное введение лизосомотронного препарата хлорохип сопровождается выраженным снижением сывороточной концентрации трийодтиронина и появлением отдельных морфологических признаков гипофункции щитовидной железы у крыс. Токсического действия препарата на исследуемый орган не обнаружено.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кочуков М.Ю., Пляхин И.В. Изменение активности протеолитических ферментов в щитовидной железе при экзогенном пшертиреозе // Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов: Тез. докл. научно-практич. конф. -Рязань, 1995.-С. 137.

2. Ультраструктурные изменения в митохондриях тироцита крыс при угнетении гормоиогепеза / Е.А.Строев, А.Ф.Лстраханцев, М.Ю.Кочуков, О.Л.Царева // Актуальные вопросы здоровья населения на рубеже XXI века: Сб. научи, трудов РязГМУ. - Рязань, 1996. - С. 164 - 167.

3. Строев Е.А., Кочуков MIO. Влияние ингибиторов белкового синтеза активность лизосомальных тиоловых протсиназ в щитовидной железе крь Современные аспекты экспериментальной и клинической фармакотсраг Сб. научн. трудов РязГМУ. - Рязань, 1996. - С. 71 - 73.

4. Кочуков М.Ю. Изменение активности лизосомальных тиоловых протеин? щитовидной железе крыс при введении трийодтнронипа // Гормональ регуляция метаболизма в норме и при патологии: Сб. научн. трудов. - 1'яза 1996.-С. 8- 10.

5. Кочуков М.Ю., Строев Е.А., Волков A.A. Щитовидная железа: взаимосв! функциональной активности и состояния лизосомального аппарата Актуальные проблемы эндокринологии: Тез. докл. Ill Всероссийского съе! эндокринологов. - Москва, 1996. - С. 143 - 144.

6. Гормональная функция щитовидной железы при длительном введен лизосомотропного препарата хлорохин / А.Ф.Астраханцев, М.Ю.Кочукс О.А.Царева, В.В.Николаев П Диагностика vi реабилитация физически состояния человека: Сб. научн. трудов РязГМУ. - Рязань., 1997. - Т. 1. - С. (•>'. 67.

7. Ультраструктурные изменения щитовидной железы под воздействие ингибиторов белкового синтеза / Л.Ф.Лстрахапцев, О.Л.Царев

М.Ю.Кочуков, В.В.Николаев // Диагностика и реабилитация физического состояния человека: Сб. научн. трудов РязГМУ. - Рязань., 1997. - Т. 1. - С. 131 -140.

8. Строев Е.А., Кочуков М.Ю. Механизмы регуляция активности лизосомальпы? тиоловых протеиназ в щитовидной железе: эффекты ингибиторов белковой синтеза // Бюлл. экснер. биол. мед. - 1997. - Т. 21, № 5. - С. 521 - 523.

9. Строев Е.А., Кочуков М.Ю., Николаев В.В. Протеолитическая систем! лизосом и функциональная активность щитовидной железы крыс npi введении хлорохина//Экспер. клин, фармакол. - 1997. - Т. 60, № 4. - С. 50 - 52.

_4/зд. /сод М 08 (03)

. Рязмеднистнтут. Ротапринт. Заказ M^^/ffi^.TwpawTffi9*3-{