Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточные протеиназы в эколого-биохимических адаптациях у рыб

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточные протеиназы в эколого-биохимических адаптациях у рыб"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Е БАХА

на правах рукописи УДК 597.105:577.152. 34

НЕЮВА Нина Николаевна

ШУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ЭКОЛОГО- БИОХИМИЧЕСКИХ АДАПТАЦИЯХ У РЫБ (03.00.04 - биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ на соискание' ученой степени доктора биологических наук

Мэсква, 1992

Работа выполнена в Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН в лаборатории белковых регуляторов ферментов и в Институте биологии Карельского НЦ РАН в лаборатории биохимии.

Научный: консультант: доктор биологических наук, профессор В.В.Мосолов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор»

В.. В. Кошелев

доктор биологических наук, профессор,

Ю.Б.Филиппович

доктор химических наук,

Л.М.Гинодман.

Ведущая организация: Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН. ■

Защита состоится " " Й^^^к. 1992 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН (117071, Москва, В-71, Ленинский цроспект, 33, корп.2.).

С диссертацией можно ознакомиться в .библиотеке биологической литературы РАН (Ленинский проспект, 33, кор.1).

Автореферат^разослан 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Т,А.Велуева

j Л'ггуалы гость проГшггзл. Важная роль внутриклеточных протеоли-тйче'ских ферментов в обмене веществ у лсивотных обусловливает огромный интерес к изучению их физиологических функций и механизмов внутриклеточного протеолиза у животных (Мосолов, 1971, 1983,1988; Антонов, 1983; Степанов, 1981; Gordon, 1973; Gildbsrg, 1983; Bcbley, 1987). Однако, класс рыб подобные исследования практически не затронули, Вместе с тем, рьйы являются одной из наиболее древних, самой многочисленной в видовом отношении и разнообразной по экологии группой позвоночных животные.

Успехи,достигнутые в исследовании физиологических функций и механизмов внутриклеточного протеолиза у млекопитающих, человека, микроорганизмов, практически не коснулись класса рыб.

Актуальность изучения системы внутриклеточных протеиназ рыб определяется, с одной сгорснн, теки функциям, которые протеиназы еыпо.':ня:;т в клетке б превращении белковых веществ, а с другой -той ролью, которую эти ферменты играет в системе ответа организма рыб на действие разнообразных, в том числе, изменяющихся факторов внешней среды. В конечном итоге, это одна из проблем экологической биохимии рыб, Еыделяэмой в последние годы в самостоятельное направление и используемой при решении разнообразных задач ихтиологии, гидробиологии, рыбоводства ( Ц/льман, 1972; Лав, 1975; Хочачка, Сомеро, 1977; Шатуновский, 1980; Романе кко и др., 1980, 1982; Сорзачев, 1982; Сзернюк, 1986; Амине-ва, Яр.тлкбек, 1S85; Сидоров, 1987).

Особый интерес представляет изучение вопросов, связанных с. участием' системы внутриклеточного протеолиза в биохимических процессах у хозяйственно - полезных рыб, таких как лососевые, осетровые, карповые, что монет иметь значение для их воспроизводства и охраны в связи с усиливающимся антропогенным прессом на

т>г\тт/\л»л.т

Одновременное выделение клеткой гидролаз, активных в кислой и нейтральной зоне рН, обеспечивает организм большим по разнообразию набором внутриклеточных ферментов (дин, 1981). Протеолиэ в кислой области значений рН осуществляется с участием лизосомаль-ных протеиназ - катепсиноз, способных осуществить полный гидролиз белковой молекулы. Среди них важнейшими являются катепсины D и В, концентрация которых в лизосомах достигает гаогда очень высоких значений ( до 1 мМ ) ( Покровский, Тутельян, 1976; Дин, 1981; Bohley, 1987).

Среди протеиназ, активных в нейтральной зоне значений рН на-

• иболее интенсивно изучаемыми в последнее время являются Са++-за-висише нейтральный протеиназы ( кальпанны ), локализованные в основном в цитозольной фракции клетки и включающие в себя два типа ферментов, активируемые микромолярными и миллимолярными концентрациями кальция, соответственно (Мосолов, 1988; Мигаем, 1981, 1989). В настоящее время малоизвестно о взаимодействии лизосомального и нелизосомального путей протеолиза у животных. Актуальность изучения именно этих протеиназ обусловлена как важностью лизосомальной системы протеолиза, так и той ролью, которую в организме играют протеиназы ,. активируемые кальцием, являющимся регулятором многих биохимических систем.

Можно полагать, что исследование внутриклеточного протез-лиза в тканях рыб при различных зколого - физиологических ситуациях откроет пути к пониманию как общих механизмов зтого процесса, так и тех специфических его особенностей, которые свойственны классу низших позвоночных.

Цели и задачи Есслэдаванкя. Основная цель данной работы состояла в обнаружении причинно - следственных связей между действующи фактором (физиологическим, экологическим, патогенным) и изменением основных компонентов внутриклеточного протеолиза у пресноводных рыб, относящихся к различным семействам, а такта выяснение адаптационного смысла найденных зависимостей.. Это должно составить основу понимания функциональной роли катепсиков и кальпаинов в различного рода биохимических и физиологических процессах у рыб.

Исходя из поставленной цели■проведено широкое сравнительное изучение изменения активности внутриклеточных протеиназ у рыб под влиянием следующих факторов:

. 1-физиологичэснюго (рост и созревание половых клеток, эмбриональное и постэмбриональное развитие);

2-эколого - физиологического (сезонность, голодание);

3-рыбоводного (условия содержания рыб при искусственном выращивании, в том числе температурный, кислородный и др. факторы);

4-антропогенного ( загрязненность водоемов, действие токсических компонентов и их смесей в естественных водоемах и в условиях аквариальных экспериментов);

5-болезнетворного (бактериальные и другие болезаи у рыб).

Научная новизна работы. Большинство вопросов, поставленных в

настоящей работе, исследованы впервые. Результаты изучения час-

тично очицэнных катепсина Б и кальпаинов I и П из тканей лососевых рыб свидетельствуют о значительном сходстве с аналогичными ферментами млекопитающих.

Проведено систематическое исследование внутриклеточных про-теиназ в жизненном цикле пресноводных рыб в различных эколого -физиологических ситуациях.

Установлен ряд закономерностей изменения активности лизосо-мллъных и Са++-зависимых протеиназ в созревании самок рыб, оплодотворении и последующем эмбриональном развитии, имеющих важное значение для понимания механизмов индивидуального развития рыб. В частности, установлена корреляция между исследуемыми показателями белкового обмена и стадиями полового цикла рыб, показана преимущественная роль в этом процессе катепсина Б.

Обнаружено адаптивное значение возрастания активности лизо-сомальных протеиназ и кальпаинов в икре рыб к моменту овуляции, связанное, по-видимому, с их функцией в раннем эмбриогенезе. Уровень активности протеиназ коррелирует со стадией развития зародыша. Распределение активности катепсинов В и Б в икре ме.-зду гелт-ком и зародьшем отражает их функциональные различия.

Обнаружен видоеой и индивидуальный характер изменения активности лизосомальных протеиназ органов и тканей рыб в ответ на токсическое воздействие самых разнообразных поврездашцих агентов, обычно встречающихся в производственных выбросах, попадаемых в водоемы. Шханизм такого изменения может быть в разных случаях разный. Установлена корреляция келду активацией лизосомальных протеиназ и степенью поражения рыб бактериальными и другими инфекциями. Впервые продемонстрировано участие лизосомальных и Са-н-- зависимых протеиназ в развитии расслоения мышц у русского осетра. При этом ведущая роль, по-видимому, принадлежит кальпаи-нзм.

Предлозсена концепция о еозмояиой функциональной роли внутриклеточных протеиназ в онтогенезе пресноводных рыб. Особенность функционирования системы лизосомальных и Са++-зависимых протеиназ рыб связана с ее участием в физиологических процессах, характерных для этих, эволкзционно наиболее древних позвоночных животных.

Практическая значкпсть работа Полученные результаты и сформулированные на их основе выводы могут иметь практическое значение для ихтиологии и рыбоводства, в частности, для оценки физиологического состояния рыб. Показатели уроьня активности

исследуемых протеиназ (особенно катепсина. D) могут быть использованы в качестве биохимических критериев нормального созревания, готовности икры к оплодотворении, а также в маркировке эмбрионального развития при их искусственном воспроизводстве.

Отмеченные различия в характере изменения активности исследуемых ферментов в нормальных и патологических ситуациях могут послужить одним из гестов зколого-биохкмического мониторинга и биотестированш, которые в настоящее время интенсивно используются при решении различных практических вопросов рыбохозяйст-венной науки (профилактика, диагностика и лечение отравлений и болезней рыб, определение рыбохозяйственних ПЦК и др.), что в свою очередь, связано с охраной природы.

Полученные результата могут служить основой для более углубленного изучения системы внутриклеточного протеолиза в сравнительно - биологических и эеолюционко - фпзиологичесьсях исследованиях класса рыб.

Практическая реализация полученных результатов осуцэствля-лась через отраслевые институты Министерства ркбкого хозяйства СССР ( СеврыбНИЛпроект, г. Петрозаводск; ПИНРО им. Книпповича, г. Мурманск; ВГ2Ю по рыбоводству, г. Дмитров лЬскоесгой обл.) путем выполнения хозяйственных договоров и договоров о содружестве. Имеются акты о внедрении результатов.

¿яребещз рабзт Кзтеризлы диссерхадп были представлены на III, IY, У, YI Есесоюз. конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1378, 1931; Телзви, 1S85; Тбилиси, 1989), IY, Y, YI, YIII Есесош. конференциях "Экологическая физиология к биохимия рьй" (Астрахань, 1973; Севастополь, 1982; Пзлакга, 1985; Ярославль, 1989), II Еоесоюз. симпо5ку}лэ"Структура к функции лмзссом" (Новосибирск, 1980) IY, Y Есесоюз. совеаряиях эмбриологов (Москва, 1931; Ленинград, 1985), I и 11 Всесосз. конференциях по экологической биохимии рыб (Ярославль, 1957, 1930), Всееохв. конференции по эволюционной биохимии рыб и происхождение жжьки ■ (Петрозаводск, 1984), III, IY, Y Есесоюз. симпозиумах по циклическим куклеотид-ам (Напев, 1980; Рязань, 1S85; Петрозаводск,, 1.938), совещаниях по энергетическое обмену рыб (Суздаль, 1985, 1988), II Есесоюз. совещании по биотехнике разведения сиговых рыб (Петрозаводск, 1981),XI ceccrai ученого совета "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера (Петрозаводск, 1381), XXI научной конференции по изучения внутренних водоемов Прибалта-

ки (Клайпеда, 1987), II и III Всесога.совещаниях по лососевидным рыбам (Ленинград, 1983; Тольятти, 1988), IY и Y Всесоюз. конференциях по водной токсикологии (Рига, 1983; Одесса, 1S88), I Есесо-юз. симпозиуме по методам ихтиотокстсологических исследований (Ленинград, 1987), Всесоюз. конференции " Биологические проблемы Севера'* (Магадан, 1983), Y Всесоюзном симпозиуме по атлантическому лососю (Сыктывкар, 1990), Y Всесоюз. биохимическом съезде (Киев, 1985).

Пу&сгсщия. По теме диссертации опубликовано 97 печатных работ, получено положительное решение на авторское свидетельство. Структура. и сбьсм работа Диссертация изложена на 310 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав результатов исследования, общего заключения, выводоз и указателя литературы. В работе имеется 72 рисунка, 24 таблицы и 2 схемы. В список литературы включены 216 работ отечественных и 290 иностранных авторов.

"'лтер:;ал a ютоtíí гажладсззггэ.

В качестве объектов исследования в работе использовали представителей семейства Лососевых Salmónidas: лосось Salrro salar, рздуяяая форель Salmo gairdneri, .сиг Coregonus lavaretus, пелядь Coregonus peled, муксун Coregonus rrucsun; семейства Осетровых Acipenseridae: русский осетр Acipenser guldenstadti; семейства Карповых Cyprinidae: карп Cyprinus carpió; Семейства Окуневых Percidae:' Р. fluviatilis. В основном изучены рыбы, обитающие в водоемах Карельской АССР, а тагае бассейна р.Волги и прудового хозяйства ШШШРХа (г.Дмитров Московской обл.). Материалом-для. исследования слуткили некоторые органы вьапеназьанных • рыб, а также их икра и ранние личинки на различных этапах жизненного цикла. Развитие игазы проходило в условиях рыбоводного завода.

Гомогенаты тканей, готовили по стандартной методике в гомогенизаторе ПЪттера-Энъвейэма, затем проводили дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (Покровский, Тутельян, 1976; Matsuda, Misaka, 1974)

- 8 -СХЕМА

выделения дизоеом из тканей рыб методом центрифугирования в градиенте плотности.

Гомогенат

I 750 g X .10 мин

(0,25М р-р сахарозы

1:9 вес/объем)

осадок

(обломки клеток, ядра)

осадок

(тяглые митохондрии)

супернатант

6,5 тыс. g X 10 мин (3 промывки)

1

супернатант

12 тыс. g X 30 мин ( 3 промывки)

осадок (лизосамьн-легкие митохондрга) ресуспендирован в 0,25 U р-ре сахарозы градиент сахарозы (О,25М-0.55Ы) 105 тыс.е х 120 мин легкие митохондрии дйзЗсош

супернатант

105 тыс. g X 30 мин

осадок ( шкросош)

супернатант

Активность фэрмэнтов определяла: Катепеина D - по методу Ансона с некоторыми модификациями (Anson, 1938; Алэксеенко, 1968).

Катепеина В - по расцепления амида ' Н^бензоил-ОЬ-арпгаина (Muftiс, 1965; Matsuda, Misaka, 1974), этилового эфира КУЗенао-ил-ЮЬ-аргинина, 2- нафтиламида Щбензоил-DL-apr:iHiî::a ( Barrett, Heath, 1977).

Са-н-зависимых протеиказ - по гидролизу казеина в присутствии 0,1 мМ и 5 мМ концентраций кальция (ШгасЫ et. al., 1981; Toyohara et. al., 1985).

Кислой фосфатазы (маркерный фермент лизосом) - по методу Боданс-кого (Покровский, Аптекарь,1969) по расщеплению эфирной связи в

^-глицерофосфате.

Глутаматдегидрогеназы (маркерный фермент митохондрий ) - по методу, описанному А. А. ПэкроЕским с соавторами ( 1968 ), используя в качестве субстрата <А-кетоглутарат.

Концентрацию белка в растворах определяли по методу Лоури (1951). Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили в щелочной системе рН 8,9 , а такзвэ в присутствии ДЦС Ыа (Маурер, 1971). Иэлекулярную массу белков определяли методом гель-хроматографии, используя маркерные белки с известной молекулярной массой. Гель-хроматографию проводили в колонках с сефадексами 0-100, 5-25, или ультрогелем АсА 34 с применением стандартной аппаратуры и реактивов фирм "РЬагтзсха" и "ШЗ" (Швеция), как описано Детер-ианом (1970).

Ионообменную хроматографию проводили на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой ДЕт52. фракционирование белков сульфатом аммония, обработку белковых растворов кислотой и шэлочью, тепловую обработку, диализ, концентрирование проводили по методам, описанным ©шшпович ПБ. и др. (1975), Т. Девени, Я. Гергей (1975), Шшковой Е П. .Севериным С. Е. (1979), Севериным С. Е. Соловьевой Е Е(1989). Разделение желтка и зародыша икры в период эмбрионального развития рыб проводили методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, а таган хирургическим методом (Костомарова, Еейфах, 1954; Игнатьева, 1974). Методы ихтиотоксиколо-гических исследований применялись для определения стадий зрелости-гонад рыб (Сакун, Буцкая, 1968; Кошелев, 1984), стадий эморио-нального 'цикла разных видов рыб (Черняев, Кузьмина, 1953; Рыжов, 1975; Игнатьева, 1978; Павлов, 1978). •

Результаты проведенных исследований обработаны статистически с применением . непараметрического критерия различий Вилкоксо -на - Манна - Уинтни (Гублер, Генкин, 1959).

Характеристика часгкчт счщзшпа Енугркхлетсчшх пготешиз рьй.

Катопскп П. На предварительном этапе исследований была изучена и подтверждена лизосомальная локализация катепсика Б из печени радужной форели, основанная на -определении седиментацион-ных свойств ферментов и их лабильности (Бе Юиуе et а1., 1955; Мз£Бис1а, М15ака, 1974; Тутельян, 1978) (рис. 2).

1ДД

5.1

Ки(

:с £!1Я

- 10 -

фосфатаза Д

ЕР

ар

5Я

м Л1 л2

ли

с т%

Глутаматдегидрогеназа

-Щ

мТ1

£2. ш

К

а

и

Ч*

Катепсин Б

и

и -¡И

А

.52 -V

Катепсин В

лм

я м ¿хлгт с

С

Рис. 2. Субклеточное распределение активности ферментов в печени радужной форели. А - относительная удельная активность фермента; Я - ядра, М - митохондрии, Ж - яизосош (смесь), Л2 - лизо-сомы с градиента сахарозы, ЛЫ - легкие митохондрии, С - суперна-тант. ГЬ оси абцисс содержание белка во фракциях а % от суммарной концентрации белка.

Из графиков, приведенных на рис. 2, видно,что удельная активность маркерного фермента лизосом (кислой фосфатаэы) максимальна во фракции лизосом с градиента сахароза, а активность ГДГ(маркер-фермент митохондрий) связана главным образом с фракцией тяиельк и

легких митохондрий. Относительная удельная активность категгсинов В и В максимальна во фракции лизосом, полученных с градиента сахарозы. Эти данные свидетельствуют о лизосомальной локализации исследуемых протеиназ в печени рыб. Аналогичные результаты были получены и для других тканей ( скелетных мыац, селезенки, почек и др.) лосссеЕых рыб. Из скелетных мышц и икры форели была частичка очищена и охарактеризована прогеиназа,активная в кислой области значений рН по отношению к гидролизу гемоглобина

Катепсины из исследованных тканей форели очищены с использованием различных методов белковой химии ( табл. 1).

Таблица 1.

Частичная очистка катепскна Б из икры радужной форели

Процедура Обьем Белок Активность Очистка/выход

очистки мл. МГ/МЛ общая удельная Z

Е280/Ш1 Е280/ иг

фракции белка

за 1 ч за 1 ч

Экстракция

0,5Х-кым

KCl 460 25,4 2,01 0,08 1Л00

Обработка

кислотой

(pH 4,2) 310 17,0 2,38 0,14 1,7/60

ВысадиЕание

(Ш^ЗО^бОХ

насыщения'" 5 10,3 2,06 0,20 2,4/34

Гель-фильтра -

дексе G-100 Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе (О,IM NaCI)

йб

10

3,9 50,27

2,2 -113,51

12,89

51,60

160/30

640/22

Катепсин Б из мьппц форели был очищен в 116 раз, а из икры -в 640 раз .

Электрофорез в полиакриламидном геле препарата фермента из ш-лщ продемонстрировал 1 основную и 2 минорных полосы, а из икры - 1 основную и 1 минорную полосы, что характерно и для препаратов катепсина D из некоторых других тканей животных! селезенки сйиньи CGunnighaw, Tang, 1976), быка (Езтихина и др., 1963),мышц теляпии Tilapia mossarhica (Doke et al., 1980). Однако эти примеси неактивны по отношению к гемоглобину при условиях, оптимальных для катепсина D. Литературные источники (Turk et al. , 1977; Makinodan et al. , 1982; Bonete et al. , 1984) свидетельствуют о том, что при более тщательной очистке катепсина D (в 2000-3000 раз) препарат этой протеиназы при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле обнаруживает единственную белковую полосу.

Молекулярная масса катепспнов была 42 и 70 тыс. дальтон, соответственно; предпочтительный субстрат для обоих ферментов - гемоглобин. Синтетические субстраты протеиказ (БАА, ЕАЭЭ, БАНА, КВЗ -глу -тир) исследуемые ферменты не расщепляют. 10% -ный NaCl полностью икгибироЕал активность протеиназы из мьщц, что было ранэе показано для катепсина D из мышц телзпии Tilapia mossarrbica (Doke et al. , 1980). Оптимальная активность катепсина D из мышц форели проявляется при pH 3,6 и температуре 42°С, а из икры - pH 4,0 и 45°С, соответственно. При рП 5,5 активность катепсинов снижается, а при pH 7,0 нивелируется.

Катепскны по многим параметрам сходны с соответствующими ферментами, выделенная! из тканей млекопитающих (Barrett, 1977 1980; Barrett, Heath, 1977; Okitani et al., 1981). Кислая протеи-наза из икры форе-ли имеет некоторые отличия : более высокая молекулярная касса, влияние на его активность ионов цинка, некоторый активирующий эффект циетеина (на 25%) и ингибирукд&е влилние (на 45%) соевого ингибитора трипсина. Возможно, что при более тщательной очистке препарата это явление было бы выраглио в меньшей степени. При этом следует отметить, что при изучении влияния различных концентраций цинка на эмбриональное развитие сига было показано (Еэу.эна, Сидоров, 1990), что Zn++ заметно акгквирует катепсин D в икре на определенных этапах ее эмбриогенеза Некоторое активирующее влияние циетеина и ингибируший эффект соевого ингибитора трипсина на катепсин из икры Форели объясняется, по-видимому, либо неспецифическим взаимодействием этих реагентов с группами активного цонтра фермента, либо наличием а препарате фермента примеси других протеиназ. Подобный эффект был обнаружен

при очистке и характеристике катепсина 0 из мыпц карпа (МзктоЗап, 1кес1а, 1975). После кратковременного влияния комнатной температуры или кратковременного замораживания - оттаивания катепсины го исследуемых тканей форели не теряли активности, что весьма существенно, так как анализируемые на активность катепсина Б пробы тканей рыб часто доставляются в замороженном виде.

Таким образом, локализация протеиназы в лизосомах, рН оптимум активности (3,6-4,0), максимальная активность по отношению к гемоглобину и отсутствие гидролиза синтетических субстратов протеиназ, величина молекулярной массы, отсутствие влияния на активность фермента ингибиторов цистеиноЕых и сериновых протеиназ ПХМБ, <1-МСФ, ДТТ, ионов ртути), ингибирующий эффект диазоацетил-норлейцина в присутствии ионов меди (остаточная активность катепсина из мышц-13% , из икры -25%) и некоторые другие свойства свидетельствуют о том, что исследуемые кислые протеиназы из скелетных мышц и икры форели относятся к группе катепсинов 0..

гсротекиази из тгсаггеЛ риб. При изучении хромг-тографического распределения активности кальпаинов на колонках с ультрогелем АсА 34 из некоторых тканей лосося и осетра было показано наличие двух Са)-+-зависимых протеиназ-кальпаинов I и П, различающихся по объему эх-оции и чувствительности к кальцию (рис. 3).

Рис. 3. Хроматография на ультрогеле АсА 34 кальций-зависимых протеиназ из мыпц лосося. Т 280 -поглощение белка, А - активность протеиназ (ед.\мл ), -о-о- кальпаин I, кальпаин П.

Результаты исследования тканевого распределения активности кальций-зависимых протеиназ лосося предстазлены на рис. 4.

Рисунок 4. Активность

до

2,0

У

ш

гы

1^*1

ш

кальпаинов I (СП) и П (рз) в цитозодьной фракции органов лосося. А - (ед. \мл). 1-печень,2-мыпцы, 3-почки,4-селезекка, 5-икра.

Максимальная активность изученные протеиназ свойственна селезенке, что было показано и для крысы ( Улгасм еЬ а1., 1931; 6ора1зкг1зЬпа, Вагзку, 1985; В1ошегеп еЬ а1. ,1989). В отличие от иыэщлхся в литературе сведений о сравнительно небольшой активности кальпанноз в мыпэчной ткани мдекотттаЕЕ?« ( ШгасЫ- ее а1., 1981; 5и~ик1 еЬ а1., 1939), скелетные мышцы лосося содержат относительно высокий .уровень активности кальпаина I. Ее исключено, что это связано со значением больной массы мьпгечяой ткани лососевых рыб для их жзкедеятелькости на фоне высокой двигательной активности. Кальпаины из икры лосося (У стадия зрелости гонад) были изучена подробнее, учитывав их вероятную роль з созреганкк гонад и эмбриональном развитии, о чем говорилось вызе. Используя хрсматогра$ическке методы и электрофорез в градиенте плотности ПАТ, была частично очкарка и охарактеризована Сз++-зависимзя протеиназа из икры лосося. Полученное результаты (рисунки 5, 6). свидетельствуют о наличии в икре рыб дзух еидов зависимых

протеиназ, активных при рН 7,5, соответствующих по профили элщии и чувствительности к Са-н- , кальпаггаам I и Е

Молекулярные массы кальпаика I и кальпаина П - 120 и 87 КДз, соответственно (маркерные белки! иммуноглобулин - 150 ¡{Да, БСА -

67 КДа, трипсин - 45'КДА), что несколько выше значений,обнаруженных для тканей млекопитающих (Suzuki et al. ,1989), но имеют сходство с кальпаинами из икры карпа (Toyohara et al. , 1985).

Рис.5. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе (ДЕ-52) экстракта из И!фы лосося (колонка 2,5 х 95 см). 0,05М - 0,5Ы градиент КаС1. V- 40 мл/ч., Т 280-поглощение белка, А - активность протеинэз (ед. \ мл.), '-о-о- кальпаян I, -о-»- кальпаин И

Рис. 6. Хроматография кальций-зависимых протеиназ из икры лосося на ультрогеле АсА 34 после-ДЭАЭ-хроматографии. V - 22 мл/ч. Т 280 - поглощение белка, А - активность протеиназ (ед. \мл). 1-кальпаин I, 2-кальпаин П.

При исследовании влияния различных концентраций кальция на

активность кальпаинов было показано, что максимальная активность кальпаина I проявляется при 0,9-1,0 мМ Са++,а кальпаина П - при 5 мМ Са++, то есть чувствительность к кальцию у кальций-зависимых протеиназ из икры лосося ниже, чем у соответствующих ферментов крысы (ШгасЫ е1 а1. , 1981; МигасШ, 1989). Подобная Са++-за-висимость для кальпаинов была продемонстрирована для каиачной ткани карпов (ТоуоЬага, >.1ак1пос1ап, 1985). По-видимому, чувствительность кальпаинов к кальцита в эволюционном ряду увеличивается. Известно (МагасЫ еЬ а1. , ТоуоЬага et а1., 1985), что термостабильность при 55°С - 58°С является хорошим критерием различий кальпаина I и кальпаина П. При нагревании (55° С х 5 мин) препаратов кальпаинов из икры лосося было показано, что активность кальпаина П снижается примерно втрое против контроля, в то время как активность кальпаина I практически не игменкется.

Обнаруженные в икре лосося кальпаины и их избирательная активация могут иметь определенное физиологическое значение в созревании гонад самок рыб и последующем эмбриональном развитии.

/■¿шалость Егутрзгиатсчз^ протезкшз и содергэш:о балка, б ткздхх риЗ в сатетгг и зз^брЕДгенгзе.

Согенез является одним из ответственнейших этапов в развитии рыб и сопровождается существенными изменениям! в ядре и цитоплазме ооцитов. У рыб процесс накопления питательны:! веществ в ооцитах является весьма длительны:-,! и напряженным периодом в развитии половой аэлжаы и особи в целом. Результаты изучения изменения динамики активности лизосомальных протеиназ в некоторых органах пресноводных рыб в процессе созревания гонад от стадии протоплазыатического роста ооцитов ( II стадия) до овуляции ( Y стадия) представлены на таблицах 2-4 и рисунках 6-8. ■ У всех изученных видов рыб показано возрастание обпзэй и удельной ( связанной с лизосомами) активности катепсина Б в икре по мере созревания гонад (таблица 2).

Данные, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что к моменту нереста (У стадия зрелости) в яйцеклетках рыб, по-видимому, увеличивается количество лизосом, которые заласаакся в них в ходе оогенеза по типу других структурных элементов клетки, таких как митохондрии, рибосомы, аппарат Гольдгш ( Еейфах, Тимофеева, 1377; Озернюк, 1981 ). Эти структуры имеют значение для последую-

Таблица 2

Изменение активности катепсина Б в гонадах самок рыб в процессе созревания

Активность катепсина Б

ОА_;__УА(во фракции лизосом)

Стадия зрелости Вид II И1 1У-У V II III 1У-У V

Радунная форель 14 3±3,0 17,7*2,0 64,6-0,7* 72,1-6,8 0,10-0,05 0 6-0,2* 1,2-0, 2* 2,7-0,0й

Сиг 2 2-0,2 6,1*1,3* 19,3-2,1' 58,6-2,^ 0,04*0,01 0 + " 4-0,2 0,4*0,1 0,8-0, Iм

Пелядь 6 5+1,4 9,2*1,6 25,2-3, 0* 40,5-2,7м 0,05-0,01 0 -4- ** 5-0,2 0,4*0,2 0,8-0, 1**

! Муксун 7 5-1,2 37,0-4,з" 13,0*2,5 27,0-2, 9* 0,08-0,02 0 7-0, 1* 1,1*0,1 1,1-0,2

Лосось _ 23,6-1,9 _ 48,7-2,О* _ 13 5-1,3 __ 57,8-3,8й

* - результаты достоверны при Р ^ 0,05

** - результаты достоверны при Р 0,01

-. 18 -

щего оплодотворения и эмбрионального развития рыб. '

У всех рыб несколько увеличивается (в большей степени у лосося) отношение свободной активности катепсина 0 к. общей (таблица 3), в значительной степени характеризующее состояние прочности лизосомальной биомембраны, а также локализацию фермента в клетке.

Таблица 3.

Изменение отношения СА\ОА катепсина 0 в гонадах самок рыб в процессе оогенеаа.

Стадия зрелости П П1 IV-V V

Вид

Радужная форель 0,13+0,02 0,18±0,03 0,18+0,С2 0,23+0,03

Сиг 0,06+0,01 0,09+0,02 0,10±0,02 0,12+0,03

Пелядь 0,22+0,08 . 0,28+0,06 0,30+0,05 0,28+0,05

Лосось - 0,09+0,04 - 0,19±0,04

Активность Са++-зависимых протеиказ, как кальпаина I,так

и .кальпаина П тагага возрастает (в 5-8 раз)в икре лосося к моменту

нереста (шсунок б). А*

чз

и

Рисунок б. Активность кальпаина I (ЕШ) К1 кзльпаина П (G32) в яйцеклетках лосося в процессе созревания гонад. А-активность ферментов ( ед.Лмл). Щ, V -стад-.а! зрелости гонад.

ГТ - I ^

Еа участие. внутренних органов рыб в созреьашш гонад указывают данные, полученные при определении активности кгтепсинов в печени, мышцах и некоторых других органах (рис. 7).

Еа III стадии зрелости гонад, когда начинается интенсивный синтез в печени запасных белков гехтка ккры, сСгоя и удельная активность лизосомальных протеиказ резко увеличивается в пачени и мышцах исследованных рыб (рис.7., данные приведены для катепсина D). На этом этапе развития вплоть до полного созревания (IY-Y)oo-

- 19 -

циты рыб растут з основном за счет питательных веществ, щи с кровью из внутренних органов. А| 60

(0

поступз--

20

■ /\ I ' И

/ /ч \ / / Г Vх X —— 1.-. .......и.. ...л-..— ■—, , т—___ А / N / -X''' * • » %

П Ш 15 I Б И 13 I

Рис. 7. Изменение активности катепскна Б в печени (I) и мыяцах (П) сига (— ), пеляди (- - ), форели ( -а- ), мук.суна (-•- ) в процессе ссгенеза. А-общзя г1сгив1гасть кзтепсика О (Е 280/г ткани/ час), П - V - стадии зрелости гонад.

Увеличение ексиености протекназ в этих тканях коррелирует со сниг£ни2М содержания бэхха в них (рис. 8).

204

№

Я

.ал

П-

п

I

4'

Щ Й!

Рис. 8. Изменение содержания белка в органах рыб в процессе оогенеза. 1-сиг, 2-пелядь, 3-фэрель , За 100% принято

содержание белка на П стадии зрелости -гонад.- П1-У - стадии зрелости гонад: СЗ -П1, Е9 -1Ч-У, ЕЗ -V.

Аналогичные данные получены и при исследовании содер:яания и соотношения белков с различными молекулярными' массам методом

2

гель-хроматографии на сефадекее (МОО.что свидетельствует об усилении протеолиза в органах рыб в этот период. Максимум лабильности лиаосомальных протеин аз (отношение свободной активности ка-тепсинов к общей) также отмочен на III стадии зрелости гонад рыб.

Обнаруженные различия в динамике активности катепсинов и содержания белка в органах рыб коррелируют с экологическим положением каждого вида- лосось - обитатель естественных водоемов, переходящий в период нереста на эндогенное питание; форель - доыес-тифицироЕанная форма лососевых рыб, которая вызревает в условиях рыбоводного завода на искусственных кормах; сиг - обитатель естественного водоема, не переходящий в период нереста на эндогенное питание: пелядь и муксун - акклиматизированные в условиях Карелии виды, завезенные из Сибири. В мышцах форели, пеляди и муксуна активность катепсина D увеличивается по море созревания гонад. В то же время у сига активность исследуемого фермента снижается в печени и мышцах к концу созревания до исходных аначений (рисунок 7). Обнаружены различия в динамике изменения содержания белка в гонадах между акклиматизированными сиговыми рыбами (пелядь, муксун) и сигом - природным обитателем водоемов Карелии (рисунок 8), что можно, вероятно,, объяснить нарушением созревания гонад у этих рыб в новых для них условиях существования.

Особо следует остановиться на лососе, процесс созревания гонад которого включает в себя необходимый, • генетически закрепленный этап голодания,когда снижается активность ферментов пищеварительного тракта Способность лососей выключать экзогенное питание на длительный срок представляет собой феномен, не к.:еи5гй аналогов среди позеоночных животных. Дачные о динамике изменения активности катепсина D в органах лосося представлены в табл.4.

Показано, что на фоне уменьшения содержания белка .в

органах лосося в преднерестовый период возрастает активность катепсина D. Следует отметить, что если общая активность катепсина во всех органах увеличилась в 1,5-2 раза, то свободная активность этого фермента возрастает в 2-4 раза, а в белых мышцах - в 10 раз, составляя до 25% всей активности катепсина Б.что коррелирует с процессом деградации мышечного белка в процессе нерестового созревания гонад и "перекачки" е.го в гонады через печень и кровеносную систему. Обращает на себя внимание достаточно высокий уровень активности катепсина D в сердце. Хотя принято считать, что у рыб

при различных физиологических и патологических ситуациях сердце .затрагивается в ыеныьей степени, чем -другие органы (Лаз,1976), данные, полученные для лосося, свидетельствуют об обратном. Увеличение активности катепсина Б и снижение содержания белка в сердце наблюдали и для семги природной популяции (Крупнова, 1985). Патологические изменения в сердце, а также в стенках сердечных сосудов в процессе нереста у горбуши отмечены в работах Г. Д. Бер-дышева с сотрудниками (1977, 1979).

таблица 4.

Изменение общей (ОА), удельной (УА)в лизосомах, свободной (СА) активности катепсина Б в органах лосося в процессе созревания гонад.

Орган стадии зрелости гонад

П1 (июль) V (октябрь)

ОА УА СА ОА УА СА

Печень 28,5^7,4 3,011,2 1,0+0,4 59,2^4,1 8,3+2,0 8,0+1,1

Почта! 48,0+8,1 8,0±1,6 2,2±0,5 72,1+6,5 13,0+2,8 9,1+2,0

Селезенка 35,4+7,0 10,1:11,4 1,8+0,4 70,1+6,0 15,2+2,7 6,0+1,4

Сердце 31,4+3,5 22,3±4,1 2,410,2 48,8-4,2 44,2+5,1 8,310,9

Ь!ыщцы

белые 18,0+1,5 15,311,0 0,8+0,1 32,6+2,1 23,4+1,2 8,0+0,7

Мышцы

красные 23,5+1,7 7,8+0,8 1,912,3 35,4+2,0 41,9+1,6 6,210,4

Гонады § 23,5+1,9 13,5±.1,3 2,210,8 48,4-12,8 57,3:13,0 8,4-1-1,0

О важной роли мышечной ткани как источника белка в процессе голодания свидетельствуют и данные по изучению активации лизосо-мальных протеиназ органов карпа в период зммовки, когда эти рыбы также перестают питаться. При этом активность катепсина 0 в середине зимовки повышается в 3 раза, а катепсина В - в 2 раза.

Мэжно полагать, что при переходе рыб на эндогенное питание имеет место - адаптивная реакция лизосомального аппарата клеток , связанная у лососей с образованием огромной массы гонад на фоне высокой двигательной активности , а у карповых (генетически теплолюбивых рыб) - с необходимостью обеспечения энергией в период жизни при необычных для них низких температурах на фоне низкой двигательной активности.

Известно,что взаимодействие спермы с яйцом вызывает целый ряд последовательных'структурных и метаболических изменений, приводящих к клеточному делению и дифференцировке. Есть основания полагать, что лизосомы с находящимися в них протеиназами участвуют в оплодотворении и раннем развитии рыб. При оплодотворении происходит разрушение кортикальных гранул оболочки яйца, после чего их содержимое с помощью экзоцитоза выделяется в перивителли-новое пространство (Дорфман, 1353; бугаЬкт еЬ а!., 1980), По имевшимся в литературе предположениям (Брака, 1961; Но^гггапп, 1987) кортикальные гранулы представляют из себя специализированные ли-зосомальные структуры. Данные, полученные при исследовании активности катепсинов В и 0 в эмбриональном развитии лососевых рыб, представлены на рисунках 9, 10 и таблицах 5 и 6.

Таблица 5.

Изменение активности катепсинов в эмбриогенезе радужной форели.

(стадия развития время развития катепсин В катепеин D

OA УА OA УА

Зрелая

яйцеклетка - 18,6 43,5 ■ 9,4 1,9

Образование часы

бластодиека г 17,2А 0,0 7,1 5,5'tf

с уткц

Бластула 7 4,9 0,0 Я53 о о

Гаструляция 9 14,1** 81,7** 2,6* 9,5*&

Хвостовач

почка 20 1.7 0,0 2,3 7,7

Пигментация

глаз 38 0,7 0,0 1.2 1.2

Перед выкле

вом 45 1,6* 0,0 1,8 1.7

Выклев 56 5,5** 3,4 3,5л 0,3*

Личинки 72 0,2* 0,2* 11,3**. 1,2*

* -Р ( 0,05, <с 0,01 OA-общая активность,УА-удельная актив-

кость (в лизосомах).

Таблица 6.

Изменение активности катэпсинов з эмбриогенезе лосося.

м п/п Стадия развития время развития сутки катепсин В ка: епе5!н 0

СА УА ОА УА

1 Зрелая

яйцеклетка - 20,1 24,3 16,0 5,3

2 Бластула 15 0,0 - 0,0 15,0 3,0*

3 Гаструлякия 30 27,6** 18.0* 10,5 2,5

4 Хвостовая

почка 54 3,3* 0,8* 5,3* 1,0 *

5 Пигментация

глаз 113 0,0 0,0 5,4 1.0

б' Шред

выклеЕом 200 8,1* 0,2 13,7** 5,0**

7 Вжлев 210 7,2 0,4 21,9 1,1

8 Лйчхнки 220 5,7л 0,2 26,1* 3,9**

* -Р С 0,С5, Р < 0,01

ГЬсле оплодстЕсрекил, з период образования перивителлинового

пространства активность катэасикоз остается на достаточно высоком уровне, а затем снижается почти до нулевых значешгЛ. Уровень активности дизссомалькых протеиназ вновь возрастает на стадии гаструляции. Учитывая тот факт, что синтез белков в зародышах рыб усиливается на стадии поздней бластулы - ранней гаструлы (Кейфах, Тимофеева, 1977, 1978; Костомарова, Еафиани, 1978), можно предпо-ло.гить, что в биохимических процессах сплодотзорения и раннего дробления участвует? протепназы, аапасенкые в оогенезе. В данном случае мояно говорить сЗ активации предсущаствуяпцп: молекул, а не о их синтезе. Активация ?£явт осуществляться разными путям:!: удалением соответствуют ингибиторов, активацией зкмогекккх форм протеиназ, изменением субклеточной локализации ферментов, преобразованием первичных лигосом зо вторичные. Отмеченные различия з зеличине отношения свободной и абщэй активности катепсиков свидетельствует об изменении субметочной локализации кагепсянов и соотношения первично: и вторичных лизосом (рис. 9).

Рис. 9. Изменение соотношения СА\ОА катепсинов В (—) и Б С— ) в эмбриональном развитии лосося. 2 - 8 - стадии развития Сем. табл.6).

Резкое возрастание общей и удельной активности катепскна В и удельной активности катепсина Б на этапе гаструляции, вероятно, связано с началом интенсивного разрушения белков запасного гелч-ка икры. Протеиназы гидролизуш белки до исходных аминокислот, а они, в свою очередь, используются для синтеза белков зародыша и, частично, на энергетические нуады (Нейфах, Тимофеева, 1977). По мнению 1£ано (Мзпо, 1970, 1971) колебания активности протеиназ в яйцах морского ежа отражают колебания синтеза и распада белка. Изменения активности катепсинов, наблюдаете в период органогенеза исследуемых рыб, видимо, связаны с последовательной сменой его этапов и коррелируют с динамикой синтеза и распада белков в этот -период развития зародыша.

Следующее заметное увеличение активности катепсинов в развивающейся икре лососевых рыб отмечено перед выклеван (табл. 6). Известно, что процесс вьиупления зародышей из оболочек связан с деятельностью "лелезы"вылупления, которая выделяет ферменты, разрушающие яйцевую оболочку (Зоткн, 1954; Игнатьева, 1975; Детлаф, 1981). 1Ь своей химической природе вещества, выделяемые этими "железами",относят к группе протеолитических ферментов. На исключено, что лизосомальные протеиназы участвуют в процессе выклева зародышей. При этом структурная локализация их меняется, на что указывает увеличение отношения свободной активности катепсинов к общей (рис.9), в результате чего они могут локально участвовать в деструкции оболочек. Вероятно, "железа" вылупления у зародышей рыб приобретает способность выделять ферменты строго на определенной стадии развития (датлаф,1981), поэтому активация катепси-

нов к этом/ моменту монет1 служить своеобразным индикатором готовности икры к выкдеву.

Значительное увеличение активности катепсина 0 у ранних личинок связано с интенсивной ресорбцией белков желточного мешка, который 5 этот период редуцируется. Осуществляется данный процесс, вероятно, посредством аутофагоцитоаа с образованием большого количества вторичных лизосом .

Изучение распределения активности катепсинов между различными частя»,м икры показало, что активность катепсина Б з большей степени обнаруживается в желтке, а катепсина В - в зародышевой части ( табл. 7.),что, по-видимому, отракает их функциональные различия. В частности, повышенное содержание активности катепсина В в зародите на этапах гаструляции и органогенеза можно объяснить активным участием этой протеиназы в реакциях ограниченного протеолиза белков, образующихся з процессе их синтеза в клетках эмбрионов рыб. Этому ферменту отводится значительная роль в ограниченном протеолизе в животных тканях (Логешна, 1971.. 1987). Почти 90% относительной активности катепсина 0 , приходящейся на желток на начальных этапах его ресорбшш у лосося после выклеЕа, свидетельствует прежде всего о важной роли этого фермента в деструкции белкоз желточного мешка личинок и участии его в подготовке "строительных блоков" для синтеза белка .

Таблица 7.

Распределение общей активности катепсинов В и 0 между лелт-ком и зародытпем в эмбриогенезе лосося.

Зтадия развития Бремя Сч) катепсин В катепсин Б

лсэлток зародыш желток зародыш

Бластула 15 0,0 0,0 3,9 5,а

Гзструляцкя 20 9,0 17,2 8,6 2,2

ХЬостовая почка 54 1,4 2 2 10,4 0,5

Пигментация глаз 113 0,0 0,0 3,6 1,2

Выклев 210 3,0 7,5 16,7 6,2

ЛкчинкиС ре сорбция 220 2,5 3,7 24,0 4,6

яелтсчного мешка

на 1\3)

Сравнение хроматогрзфического распределения на колонках с сефадексом G--00 белков из экстрактов икры исследованных рыб в процессе эмбриогенеза позеолило получать дополнительную информацию о роли внутриклеточных протеиназ в развитии рыб. КолпгаестБО белковых фракций икры заметно увеличивается после оплодотворения со значительным возрастанием доли югзко^элекулярных белков Это может быть связано с активным протеодизом, вызванным преобразованием желточного материала икры. По мэре развития эмбриона в составе белков появляются дополнительные компоненты со средней молекулярной массой и низкомолекулярниэ вещества Е белковых экстрактах икры, находящейся на разных стадиях эмбрионального развития, при гель-хроматографии на 6-100 выявляется 3 пика активности катепсина D (в оогенезе-2), а после зыклева зародызей из оболочек -2. Это молэт быть связано с образованием на определенных этапах эмбриогенеза рыб новых молекулярных форм катепсина, либо его активных фрагментов. В литературе имеются сведения о том, что молекула гатепеина D mo.>st растопляться ка 2 фрагмента (2/3 и 1/3 полипептидной цепи ), обладающих каталитической ■ активностью (Barrett, 1980).

Данных о роли и функциях Са++-зависимых протеиназ в эмбриональном развитии животных, в том числе рыб, в литературе нами не обнаружено. Емэсте с тем, учитывая вагную роль Сан- в процессах оплодотворения и развития, мокно предположить, что Са-н- - зависимый протешиз играет определенное значение е этот период. Мы нее- < ледовали динамику изменения активности кальпаинов I и П и их соотношение в белковых экстрактах икры лосося после их хроштографического разделения на ультрогеле АсА'34 (рисунок 10).

После оплодотворения активность кальпаинов снижается,и в последующем она сравнительно невелика с небольпим возрастанием на этапе гаструляции. "Всплеск"акт1шности кальпаинов 'наблюдается при выклеве, и она остается достаточно высокой у выклюнувшихся личинок. При этом большая величина активности характерна для кальпа-ина Б, для активации которого требуются мЫ концентрации Са-н-. Как видно из данных, представленных в таблицах 5, 6 и рисунке 10, изменение активности катепсинов и кальпаинов на определенных этапах эмбриогенеза лосося имеет сходный характер, что косвенно может свидетельствовать о их взаимном действии во внутриклеточном протеолизе в икре рыб. исключено, что последовательность их

действия следующая: повышение внутриклеточного Са++ — активация кальпаинов активация протеинкиказы С лизис кортикальных гранул освобождение лизосомальных гидролаа. Известно, например (Gwatkin, I960), что при оплодотворении возникает "волна" кальция, который активирует кортикальную реакцию в яйцеклетке, а результате чего освобождаются протеиназы лизосом. Возможно, влияние Са-н- на лизис кортикальных гранул опосредовано через активацию Са++ -зависимых протеинзз. Изменение активности внутриклеточных протеиназ в оогенезе и эмбриогенезе исследуемых рыб может служить примером биохимической экспрессии генетической програшы развития этих рыб. Возможно, индукция ферментов в онтогенезе является следствием изменения функционирования регуляторных систем клетки. ГЬдобнсе изменение активности изученных протекназ можно отчасти связать с синтезом ферментов de novo, а также их можно рассматривать как результат структурных изменений в клетках. Обнаруженные различия в изменении активности катепсинов В и D ео времени можно отчасти объяснить их индивидуальной регуляцией в онтогенезе, что было, например, показано яри исследовании регуляции активности лизосомальных протекназ в онтогенезе крысы (Messina rt al. , 1977).

Рис. 10. Изменение активности кальпаина I (— ) я кальпаи-на П (—) в эмбриогенезе лосося. А -активность ферментов (ед./мл). 1-зрелая яйцеклетка, 2-раанее дробление, 3-гаетруляция, 4-органо-геяез, 5-стадия хвостовой почки, б-стадия глазка, 7-выклев,

3-ЛИЧИНКИ.

Вижккз 32излзго-ф>зтшпгче<аож и тагакожэгйЧЕггаж £зкторзз

1а Е1гпшюсть лкзссаизлыськ пратеглсаз гкалггй р^й.

Одним из Еатных факторов, заметно воздействующих на жизненный цикл рыб, является температура. Линь Е определенном температурном интервале они способны сохранять нормальную функциональную активность, что обусловлено целым арсеналом адаптивных приспособлений, направленных на поддержание метаболического гомеостаза. Известно, что при разведении широко распостраненного обьекта прудового рыбоводства - карпа, чувствительным к различным внешним воздействиям этапом жизнедеятельности является зимов!са его молоди. Температура является одним из критическкх факторов этого процесса. Иногда ока достигает пороговых значений, влияющих нз выживаемость рыб и их естественную подвижность. Мы изучили реакцию лкзосомаль-ного аппарата органов сеголеток и двухлеток карпа на различные температуры зимовки. Было показано,что при понижении температуры воды активность катепснноз В и 0 в печени и мышцах карпа повышается, а затем, при снижении температуры до предельно низких значений (близких к нулю), активность лизосомальных лротеиназ резгаз снижается. Близкие к нулевым значениям температуры содержания, по-видимому, выходят за пределы адаптивных возможностей молоди карпа. Это подтверждается и исследованиями других биохимических показателей (ферментов дыхательной цепи, уровня, липидов,циклических нд'йеотидов и др.) (Груздев и др., 1989).

Наряду с температурой одним из важных экологических факторов в развитии ихтиофауны является концентрация растворенного кислорода. Их комбинированное действие во многом определяет метаболизм в тканях рыб. Нехватка кислорода приводит к гипоксиии. Била изучена гипоксия у карповых рыб, для которых дефицит кислорода в период зимовки существенно влияет на выживаемость, а также у сигов, являющихся обитателями холодных вод, а потому очень чувствительными к недостатку кислорода, особенно в эмбриональный период развития. Показано возрастание активности катепсина Ю в мышцах молоди карпа в ответ на кратковременную гипоксию ( 95 час.), усиленную дополнительным стресс-фактором (оОморогениэ). Активность катепсина Б при этом практически не изменяется, возможно, вследствие дефицита БН-доноров, возникающего при гипоксии, а эти группы, как известно, необходимы для активации катепсина К

В условиях длительной гипоксии (6 недель) в акваризльных ок-

сперт,генгах в эмбриональном развитии сига наблюдается значительное снижение уровня активности лизосомальных протеиназ в развивающейся икре, что, вероятно, связано со снижнием адаптационных возможностей лизсеом. При этом отмечалась значительная гибель икры сига.

К числу факторов, влияющих на достигхэние нормативных показателей по выращиванию рыбы в товарном хозяйстве, мо.тно отнести физиологическое состояние молоди, выращиваемой в прудах. В длительном эксперименте по изучению физиолого-биохимичееких особенностей молоди карпа при вырашпзании по так называемой "непрерывной" технологии, наряду с другими показателя!.«, были исследованы лизссомчльныэ гидролазы в органах карпа. Еыло сбнаруяано, з частности, что при отсутствии видимых различий в уровне общей активности ферментов в печени и мышцах карпов из опытной и контрольной групп, отношение свободной активности протеиназ к общей у карпов, выращенных по ногой (непрерывной) технологии, значительно меныгэ.чем у рыб, выращенных по традиционной схеме. Это относится не только к катепсинам, но и к другим исследованным лизосомальным гидролазач (нуклеазам, фосфатазач), что косвенно свидетельствует о целостности лиассом в клетке. Известно, что при разл:ганых неблагоприятнее ситуациях • лизоссмы становятся Солее " хрупкими" (Покровский, Тутельян, 1975). Этот показатель (СА/ОА), наряду с другими изученным* биохимическим! и физиологическими параметрами указывает на то, что при исследуемой технологии выращивания молодь карпа лучше переносит зимовку.

В последнее время в результате усиливающегося антропогенного прессинга на окружающую среду, в том числе, на водоемы, значительно возросло внимание к проблеме адаптации гидробионтов к условиям загрязнения. Влияние на рыб токсикогенных факторов отличается от типично экологически. Существует различные механизмы детокеикавди чужеродных веществ, и среди них значительная роль принадлежит лизссомаы, акх'лвко участвующим в переваривании и выведении из клетки различных ксенобиотиков и образующихся под действием повреждающих агентов биополимеров.

Ддя выяснения роли и участия лизосомальных протеиназ в этих процессах была исследованна общая, свободная и связанная активность катепсинов в органах пресноводных рыб на различных этапах онтогенеза в острых, подострых и хронических экспериментах в ак-вариальных условиях и непосредственно в естественных водоемах,.

различающихся по уровню загрязненности. Было изучено воздействие наиболее часто встречающихся в производственных выбросах и оказывающих влияние на гидробионтов веществ органической и неорганической природы: стоков целлюлозно-бумажного комбината (сложная смесь токсикантов), солей аммония, тяжелых металлов (2п2+ ,Со2+, N12+ ,Нг2+ ,РЬ£+,59б+,Теб+) и некоторых других веществ. Результаты, полученные в этих исследованиях, свидетельствуют о налички вкдо-и тканеспецифичности изменения активности лизосомальных протекназ ркЗ в ответ на действие повреждающего агента На рисунке 11 приведены данные по влиянии различных концентраций соли аммония на активность катепсинов в органах карпа

А

23 203 1Я

4И

«в

2Я

г* ж

гн

Рис. Ц. Изменение активности катепсинов В(1) и 0(П)з тканях карпа при воздействии соли аммония д100% - контроль, и_з- 15 Г|мг\Л (МН^Зг БО«, 5ш1- 50 -^мгчл (нн., ^ 30«.

П - печень, М - мышцы, т ПЧ- почки, Ж - жабры, ГМ - головной мозг.

Показано,что активность катепсина В в печени и особенно в мышцах значительно возрастает под влиянием аммония, в жабрах -резко снижается, в почках - снижается почти вдвое при воздействии концентраци соли 50 мг/л, а в головном мозге наибольшее снижение активности фермента наблюдается при концентрации соли аммония 15 мг/л. Активность катепсина 0 в печени и мышцах снижается при концентрации соли аммония 50 мг/л, а в остальных органах она уьели-Ч1зается при той же концентрат»! токсического Еещества, причем, нахйолее значительно (на 220%) - в почках. Влияние этого токсиканта на активность лизосомальных протеиказ может быть связано с нейтрализацией среды,вызываемой Соли селена и теллура ока-

зывают ингибирующий зффект на активность катепсинов в печени и практически не влияют на нее в мышцах молоди лососевых рыб. Такая

те разконаправленность изменений активности лизосомальных протеиназ в органах различных видов рк5 и развизакглейся икре показана и для других расследуемых токсических агентов. Влияние повреядаюших веществ на лизосомы может быть как прямым, ингибирукиим или ак-тиЕирующы, так и опосредованным через лизосомальную мембрану в результате изменения ее проницаемости. Было сбяару^йно.что молодь и развивающаяся икра более чувствительны к токсикантам.

Полученные данные по вл.кяшга различных токсических веществ на протеолитическуш систему лизссом рыб указывает на возможность использования этих показателей (особенно уровня активности катзп-сияа Б) з качестве дополнительных биохтинческих индикаторов токсического эффекта. Отклонения от нормы могут быть замечены да^се в тех случаях, когла видимые эффекты проязляения токсического воздействия не обнару?,31ва>стся, что особенно ваяно при установлении рыбохозяйстветшх ГЩХ (предельно допустимых концентраций).

Роль шгутрлслйтсп-ш протемпз в тгжячпгеза р^й.

Адаптация рыб к поБрел-даоют* агентам, ее возможности и механизм - малоизценные, но важые вопросы экологической биохимии рыб. К ним можно отнести и участие системы внутриклеточного про-теолиза в отЕете организма на болезиетворнне факторы различной этиологии.

На рисунке.12 приведены результаты изучения активности лизосомзльных протеиназ з тканях молоди лосося, вырацгваемэй на рыбоЕодном заводе и порагенной широко распостраненным заболеванием - плавниковым некрозом, причины которого точно не установлены. Действие возбудителя заболевания ус;!л;гваетея при ухудшении условий содержания и кормления рыб.

Показано, что при отсутствии видимых различий з активности катепсинов з печени и мышцах, в селезенке больных сеголеток лосося активность ка.тепси:*з. 0 увеличивается з 18 раз, а в опорном аппарате плавников - снижаете * в 3,5 раза Селезенка, как известно, является и>ллуЕС!Си>п1ет9Я1 ка:.« органом и з дачном случае таксе резкое возрастание агаинноста катепсина 0 мог^ет быть связано с участием его б организации иммунного ответа ка пораг.энпе рыбы плавниковым некрозом- Кз литературы известно (Баранова и др. , 1980), что именно катепсия 0 з несколько раз увеличивает спонтанную трансформацию лимфоцитов при развитии патологического процесса у млекопитающих. Деструкция плавников молоди лосося приводит к реа-

кому ухудшении ее жизнестойкости. Некроз является генеративна заболеванием, при котором имеет мэсто глубокая перестройка жизненно важных биохимических систем, выполняющих защитные функции, в том числе это касается изменения активности лизосомалького аппарата. Интересно, что при проведении аквариальных экспериментов по действий препарага"Биоетим"на пораженную некрозом молодь лосося, активность исследуемых протеиназ у опытной партии рыб практически возвращалась к норме.

Катепсин В Катепсин Ю

А

Рис.12. Активность катепсинов Б и 0 в органах молоди лосося при заболевании плаЕникозым некрозом. А - активность ферментов. 1 - мышцы, 2 - печень, 3 - селезенка, 4 - плавники. ЯШ - норма, СИЗ - болезнь.

Активация кислых протеиназ, как проявление защитной функции лизосом была продемонстрирована и при изучении азромоноза , широко распостраненного заболевании у карповых рыб , вызываемого сапрофитной грам-отрицательной бактерией Аегогпзпаз Ьус1горЫ1а. Внедрение этого микроорганизма в рыбу через поврежденные кожные покровы и жаберный эпителий Еызывает появление очагов некроза, что приводит к гибели рыб.

Мы исследовали активность внутриклеточных протеиназ н некоторых органах карпа при аэрсмонадной инфекции, в том числе при поражении разглчными штаммами возбудетеля, а также при введении

Из результатов, приведенных на рис. 13 видно, что активность катепсинов (особенно катепсина Б) заметно увеличивается з тканях рыб во всех исследованных случаях.

Катепсин 3 Катепсин О

¿1

1

Я

чт

¡¿¡л

I

I

|

1

§

« « 6? ¡3 ^ |

Рис. 13. Активность катепсинов В и 0 в органах карпа при слабом (ЕЗ ) и сильном (сгэ) заракэнки Аэгстспаз Ьус!горЫ1а . А - активность ферментов, сш -контроль. .

рыбам белковой фракции из экстракта патогенного штамма.

При сравнительном изучении аэромоноза у голодных и пигак>-шихся карпов было показано, что выживаемость выше у голодных рыб. Активность катепсина В при этсм значительно повышается в мышцах, н которых обычно находятся очаги аораления. Обычно при голоданил, без присутствия болезнетворного фактора активность этого катепсина снижена (Еемоза и др., 1930). Вероятно, з данном случае увеличение активности катепснча Б несет определенную адаптационную нагрузку. Активность катепсина П при этом снижается. Активность протеиназ, функцпонирукгпгх в нейтральной и палочной зоне рН, практически не изменяется.

При изучении активности катепсина 0 в сыворотке здоровых к больных рыб показано четкое увеличение ( а 3 раза ) активности этого фермента в крови рыб, пораженных азромонозсм.

В экстрактах из ацетоновых порошков бактерий вирулентных и авирулектных штаммов АеготэпаБ ИусЗгорЬИа обнаружена протеолити-ческая активность. Максимальная протеолихкческая. активность наблюдается в нейтральной зоне рН (7,1-7,4) для обоих видов штаммов. Результаты гель-хроматографического разделения экстракта бактерий на сефадексе &-100 показали, что нейтральная протс-иказа обнаруживается во фракции белков с молекулярной массой 45 тыс. дальтон. Физиологическая роль обнаруженных протекназ штаммов аэромокад может быть связана как с активацией бактериальных токсинов, так и с участием их в дезинтеграции мышц карла. При исследовании разных по вирулентности штаммов была установлена корреляция между степенью патогенности птамма и уровнем протеолитической активности в нейтральной зоне рН.

Помимо известных и широко распространенных болезней инфекционного характера у рыб встречаются заболевания, этиологию которых установить не удается. Так, например, этиология подвившегося не так давно заболевания осетровых рыб, выражащегооя в расслоении мышц, до сих пор неясна, хотя на этот счет имеется множество предположений. При комплексном исследовании этого заболевания у русских осетров наряду с другими биохимическая показателями, была изучена активность лизосомальных и Са-н- -зависимых протеин аз.

расслоении мышц. А - активность фермента (х 10 ). 1 - мышцы, 2 -почки, 3 - селезенка, 4 - икра, 5 - жабры, сз-нормада- болезнь.

■-У больных рыб активность катепсина В (рис. 14) в мышцах практически не изменяется при небольшом увеличении в других исследованных тканях. В то же время активность катепсина 0 (рис. 15) в жаберном эпителии снижается в 8 раз, а в мышечной ткани увеличивается в 2 раза .

Ркс.15 Активность катепсина 0 в органах осетра при расслоении мьсщ. А - активность фермента. 1 - печень, 2 - мышца, 3 -пачки, 4 - селезенка, 5 - икра, 5 - яабры.а-нормар5-болезнь.

Такое резкое угнетение активности катепсина 0 в жабрах связано, видимо, с- ипгибиружщим токсическим эффектом. Еайры, как известно, являются барьерным органом у рыб.- К тагам токсическим агентам можно было бы отнести. аммонийные и нитратные соли, пироко применяемые в качестве минеральных удобрений, или та соли тяжелых металлов, ингибирующий эффект которых на лизосомаяьные протэиназы был показан для карпов (Немова, Сидоров, 1390). Следует отметить, что сама по себе активность лкзосомальных протеиназ в органах осетра относительно мала по сравнению с ранее исследованными лососевыми и карповыми рыбами. Можно полагать, что и содержание ли-зосом з мышечной ткани осетров в данном случае мало и, соответственно, лигосомаяаный аппарат не играет ведущей роли в деградации мышечных белков при данной патологии, хотя он к вносит свой вклад, видимо, наряду с нелизосомальным протеолизом . Активность Са-н-зависимых нейтральных протеиназ, являющихся одними из основных ферментов нелизосомального протеолиза, изменялась при данном заболевании осетров весьма существенно ( рисунок 16 ).

д eajix

ijs

ifl

0.5

i

Рис. 16. Активность кальпаина 1(1) и кальпаина П (П)в органах осетра при расслоении мышц. А - активность ферментов (х10 ) 1. - мвдцы, 2 - печень, -норма -Оолездь.

»

1

I

1!

-г 1

т-2

Активность кальпаинов увеличивается во всех изученных органах у больных рыб. Цри этом соотношение активности кадьпаина I и кальпаина П изменяется в сторону увеличения активности кальпаина П. Возможно, это связано с развитием болезни у исследуемых рыб, так как известно (Kawashima et al. , 1385), что обычно кадьпаин I активен е физиологических условиях, а кальпаин П-при патологии. Увеличение активности кальпаинов в пораженных мышцах может быть связано с усилением протеолиза миофибриллярных белков. Известно что при миодйстрофии увеличивается содержание внутриклеточного Са ++•, который активирует кальпаины, инициирующие миофибриллярную деградацию, начальным этапом которой является дезинтеграция Z-дисков (Dayton et al., 1978). Кальпаины разрушают белки миофиб-рилл на фрагменты, которые, как известно, хорошо пог лощатся ли-зосомами и в них подвергаются деградации при участии катепсинов. Полученные нами данные об увеличении активности кальпаинов и ка-тепсина D в мьшцах больных рыб свидетельствуют о том, что заболевание протекает по аналогии с миодистрофией у млекопитающих, что подтверждается гистологическими иследованиями срезов ,мышц больных осетров (Жедабовская, 1990).

- 37

ЙЗОДУ

1. Свойства частично очищенных катепсинов и кальпакнов из некоторых тканей лососевых рыб свидетельствуют о значительном сходстве с тзковымм выспих позвоночных, что подтверждает их древнее происхождение и слабую филогенетическую изменчивость.

2. Установлена корреляция между содерханкэм белка, .активностей внутриклеточных протеиназ (особенно катепсина D) в тканях и стадиями полового цикла рыб. Показано возрастание активности лизосомальных и Са++^зависимых протеиназ в яйцеклетках рыб к моменту нереста, имеющее адаптивное 'значение, связанное с будущей функцией их в процессах оплодотворения и раннего развития. Количество лизоссм увеличивается, видимо, по аналогии с запасанием других структурных элементов клетки, таких как митохондрии, рибосомы, эндоплззматический ретикулум. Обнаружено различие в характере изменения содержания белка- и активности протеиназ между видами рыб, различными по экологии.

3. В эмбриональном развитии рыб активность внутриклеточных протеиназ колеблется в зависимости от стадии развития зародьааи имеет максимальные значения а период гаструляции, выклева н у личинок с ресорбирувщимся зйэлточным местам. Активность катепсина D в эмбриогенезе связана,главны).! образом, с фракцией .желтка, а катепсина В - с зародьшевой частью икры, что, вероятна, отражает их функциональные различия. Характер изменения активности катепсинов и кальпаянов з раннем и козднем эмбриональном развитии лосося имеет определенное сходство.

' 4 Изменения активности лизосомальных протеиназ в оогенезе и эмбриогенезе рыб можно связать как с синтезом ферментов de novo, на что' указывает увеличение и общей, и связанной с лизосомачи активности протеиназ, та< и со структурными изменениями в клетка, например, при лабилкзащш лизосомальных мембран, что подтверждается результатами изучения отношения свободной активности ферментов к обсрй.

5. Выявлена адаптивная реакция лизосомальных протеиназ тканей рыб при переходе их на эндогенное питание, связанная с деградацией запасных резервов белка У лосося, нерестовые миграции которого сопровоэдаются генетически предопределенным выключением экзогенного питания, усиление . внутриклеточного протеолиза во внутренних органах и, особенно, з мьлцах согласуется с их участи-

ем б поддержан»: жизнеспособности рыб на фоне их высокой двигательной активности и образования массы гонад.

6. Показана роль лизосомальных протеиназ в ответной реакции рыб на токсические воздействия самых разнообразных веществ, встречающихся в производственных сбросах в водоемы. Реактивность этой системы находится в зависимости от вида повреадающего агента, его концентрации, физиологического состояния, стадии развития исследуемых рыб. Наблюдается как ингибируюший, так и активирующий эффект токсикантов, а таюкэ изменение структурной локализации ферментов. В дачном случае лизосомы, по-видимому, играют роль не только в развитии повреждений, но и в адаптационной перестройке белкового метаболизма клетки.

7. Содержание рыб в искусственных условиях ( температурный, кислородный режим и другкг стресс-факторы) существенно отражается на состоянии протеолитической системы лкзосом исследуемых видов рыб.

8. Лизосомальные протеиназы (особенно катепсин Ю )участвует в ответе рыб на горатение их бактериальными и. вирусными инфекциями. Наблюдается активация лизосомального протеолиза в клетках. Наиболее реактивными органами являются селезенка (иммуноксмпетен-ткый орган) и печень ( орган детоксикгции ядов). Степень влияния поражающего агента зависит от физиологического состояния рыбы.

9. При изучении расслоения мышц у осетровых руб получены результаты, свидетельствующие о преимущественной активации Са-н-зависимых протеиназ, активных при нейтральных значениях рН, по сравнению с катепсинами, хотя для них характерен определенный синергизм действия.

10. При оценке результатов изучения внутриклеточного протеолиза удобными показателями вариабельности этой системы являются обшзя и связанная со структурами активности протеиназ,а-также соотношение свободной и общей активности ферментов.

Список ксполь зовгшыс сокращений.

ПАГ - полиакриламидный гель

ДЦС - додецилсульфат натрия

БАЗЭ - этиловый эфир гЫ-бенаоил-ОЬ-аргинина

БАНА - М-Х-бензоил-0Ь-аргинин-2-нафтиламид

БАА - К-^-бензоил-БЬ-аргининамид

- 39 -

EGA - бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотреитол .

ПХМБ - парахлормеркурнбензоат

1МСФ - фенилметилсульфонилфторид

ПДК - предельно допустимая концентрация

OA - сбззя активность

YA - удельная активность

СА - свободная активность

Cc::on:^ работа, спу0л!'.::сЕЛ!!:-ьэ по ?знэ д::сссртац;;;;.

1. Еэмсвз Е Е Катепсикы .тавотных тканей//Зкологическая биохимия лгаотных. Петрозаводск, 1978. С. 75-87.

2. Нгмога Е Е . Зекика Л !.t Активность и субклеточное распределение катепсина D 2 раннем онтогенезе лосося//Еиохимия пресноводных рыб Карелки. Петрозаводск, 1980. С. 52-57.

3. Нэмога Е Е , Рхпатти Е 0. Распределение активности катепсина D в субклеточных фракциях печени сига//Биохимия пресноводных рыб Карелии. Петрозаводск, 1550. С. 57-50.

4. Нэмэез ЕЕ, Сидороз 3. С. , Рипатти Е О. Лизоссм глг.-оо переварив зкие белков органов лосося Salmo salar L. при голо з условиях в условиях содержания в садках з преднерестовый период / /Вопросы ихтиологии. 1980. N 1. С. 180-182.

5. Еемова Е К , Сидоров Е С. Внутриклеточное распрелел-гние активности катепсинов В и D з яйцах сига до и после оплодотворения //Онтогенез. 1980. N 1. С. 85-87.

5. Нэмова Е Е , Сидоров а 0. , Зэкина Л М. Активность кагеп-сина D з яичниках радужней форели и сета з процессе их развития// Тег. догл. S-ro Есесснз. спмпоп. "Структура и функции лизоссм". Новосибирск. 1SS0. С. 123-129.

7. Нзмова Е Е , Сглдороп В. С. Изменение активности лизосо-малькых протеинам в процессе эмбриогенеза лососевых ры5//Тез. докл. Y1 Бсесоюз. совеа смбриолсгоз. Г&сква. 1381. С. 132 -133.

8. Немоза Е Е , Зегаша JL М. , Сидоров В. С. Некоторые свойства кислой претеиназы из мкпц радугяой форели//Тез. декд. ÍY Есессюз. coses. по биохимии мышц. Ленинград. 1981. С. 125-127.

9. Немова Е Е . Зекина Л. М. Изменение .активности катепсинов В и D з эмбриональном развитии радужной ферэли//Сравяительные ас-

пекты биохимии рыб и некоторых других животных. Петрозаводск.

1981. С. 28-34.

10. Немова Е Е , Зекина Л. М. Изменение активности катепсина О в яичниках радужной форели и сига в процессе их созрэвания//Срав-нителькые аспекты биохимии рыб к некоторых других хйеотных. Петрозаводск. 1981. С. 27-28.

Н.Немова ЕЕ Распределение активности кислой протекназы бо фракциях белка из икры форели до и после оплодотворения/Лез. докл. V Всееоюз. кокф. по экологической физиологии и биохимии рыб. Киев.

1982. С. 96-97.

12. Немова Н. Е Катепсины лососевых рыб в процессах оогенеза и эмбриогенеза//Автореф. дисс____канд. биол. наук. Харьков. 1982.23с.

13. Немова Е Е , Дмитренко Ю. Ю. , Зекина Л. !£. Динамика активности лкзосомалькых прстеиназ в оогенезе пеляди и муксуна, акклиматизированных в Карелии//Матариалы по сравнительной адаптации животных к абиогенным факторам внешней среды. Ярославль. 1983. С. 28-30.

14. НемоЕа Е К , Зекина Л. М. , Мигаловский И. П., Сорокин Е П. Катепсины В и Б в икре сига в эмбриогенезе//Сравнитедьная биохимия водных животных. Петрозаводск. 1984. . С. 118-124.

15. Немова Е Е, Сидоров Е С. Лизосомальные протекназы в эмбриогенезе лосося//Еурн. эеолюц. биохимии и физиологии. 1984. Т. 20. N5. С. 576-580.

16.гймзва ЕЕ, Зекина Л.Ы. , Сидоров ЕС. Влияние ионов цинка на активность катепсинов в развивающейся икре сига//Реакция гидробионтов на абиотические воздействия. Ярославль. 1984. С. 3-9.

17. Немова Е Е, Сидоров Е С. Кислая протеиназа из икры радужной форелл//Укр. биэхим. журн. 1985. 11 3. С. 22-25.

18.Немова ЕЕ Гель-хроматография белков И катепсина 0 из тканей рыб в процессе оогенеза и эмбриогенеза//Еиохимия молоди пресноводных рыб. Петрозаводск. 1985. С. 67-71.

19. Высоцкая Р. У., Немова Е Е , Пхимэнко Л, Е , Щербина Т. В. Лизосомальныэ ферменты у карпа при бактериальном заражении//Еио-химия молоди пресноводных рыб. Петрозаводск. 1985. С. 44-49.

■ 20. Немова Е Е , Высоцкая Р. У. Некоторые биохимические показатели у двухгодовиков лосося при заболевании плавников//Тез. докл. VI Всесош. конф. "Экологическая физиология и бмохимия. рыб. Вильнюс, 1985. С. 47-48.

21. Ненова Е Е , Сидоров В. С. Действие катепсина D на миофиб-риллярныэ белки мышц радужной форели//Тез. докл. V Всесоюз. конф. по биохимии мышц. Тбилиси. 1985. С. 76.

22. Немова Е Е , Шсоцкая Р. У., Руоколайнен Т. Р., Смирнов Д Е , Крупнова М. Ю. , Груздев А. И., Михкиева Е С. Эволюция и адаптационное значение изсферментов//Тез. докл. V Всесоюз. съезда. Киев. 1985. Т. 2. С. 54-55.

23. Руоколайнен Т. Р. , Еысоцкая Р. У. , Езмэва Е Е , Крупнова М. а , Рипатти Е 0., Сидоров ЕС. О возможной роли лизосомального аппарата в механизмах реакции рыб на поверхностно-активные веществам/Экспериментальная водная токсикология. Pirra. "Зинатне". 1885. С.. 103-103.

24. Яржпмбек А. А., Лнманский В. Е , Щербина Т. Е , ЛысенкоЕ Е , Бекина Е. Е , Сидоров ЕС., Немова ЕЕ и др. Методические указания по диагностике физиологического состояния личинок и сеголеток карпа Москва 1285. 33с.

25. НемоЕа Е Е , Нефедова 3. А. , Высоцкая Р. У. , Груздев А. Я. Биохимические аспекты эмбриогенеза лососевых рыб//Тез. докл. I Всесоюз. симпоз. по экологической биохимии рыб. Ярославль. 1987. С. 150-152.

26. Немова Е Е Влияние неблагоприятных факторов зимоеки на активность лизосомальных протеиназ тканей карпа//Биохимия молоди рыб в зимовальный период. Петрозаводск. 1987. С. 99-101.

27. Бекин А. Г., Бекина Е. Е , Немова Е Е , Богдан Е Е , Михки-ева Е С., Крупнова IL Ю. Флзиолого-биохимические особенности годовиков карпа, выращенных на непрерывной технологии//Биохимия молоди рыб в зимовальный период. Петрозаводск. 1987. С. 77-84.

28. Немова Е Е , Яржомбек А. А. Влияние соли аммония на активность лизосомальных протеиназ тканей карпа//Еопросы сравнительной физиологии и водной токсикологии. Ярославль. 1387. С. 99-102.

29. Немова Е Е , Крупнова \L KL , Богдан R R Кислые протеиназы лизосом тканей животных при голодании/УЕиохимия зкто-и эндотерм-ных организмов. Петрозаводск. 1989. С. 86-95.

30. Груздев A. il , Немова Е Е , Аверьянова Е Е Влияние гипоксии на активность некоторых ферментов в эмбриогенезе сига//Еиохи-мия экто- и эндотермных организмов. Петрозаводск. 19S9. С. 135-139.

31. Немова Е Е , Крупнова М. Ю. Лизосомальные протеиназы карпа в процессе зимовки//2кзиологические аспекты токсикологии гидроби-

онтов. Ярославль. 1989. С. 84-88.

32. Немова Е Е , Сидоров В. С. Влияние некоторых токсикологических факторов на лизосомальные протеиназы пресноводных рыб//Гидрсбиэл. журнал. 1990. Т. 25. К 4. С. 69-73.

33. Немова Е Е , Сидоров В. С. Динамика активности катепс1ша D в гонадах самок рыб при созрэЕачии//Вояросы ихтиологии. 1990. Т. 30. N'3. С. 516-519.

24. Немова Е Е , Крушюва 1L КЗ. Астибность лизосомальных ферментов некоторых тканей карпа при азром:шозе//Еио>:имня экто- и эндотермных организмов в норме и при патологии. Петрозаводск. 1920. С. 103-111.

35. Немова Е Е , Крупнова ÏL Ю. , Зелинский КЗ. Е Сравнительный анализ активности внутриклеточных протеинза атлантического лосося Saín» salar L. в раннем эмбриогенезе в норме и при термошоковом воздействии на икру после оплодо?вореккя//£иохимия зкто- и эндотермных организмов в норме и при патологии. Петрозаводск. 1920. С. 25 -31.

35. Немова H. Е , Григорьева Л. И., КЬсолов Е В., Кяйвяряйяен Е. II, Зелинский Ю- П. Кальций- активируемые нейтральные протеиназы в эмбриогенезе пресноводного лоеося//Тез. дои. П Есесоюз. симпоз. по экологической биохимии рыб. Ярославль. 1Q20. С. 187.

37. Груздев А. И. , Богдан В. Е , Немова К Е. , }£!хкиеза В. С. , Гурьянова С. Д. , Ерупнова Ы. Ю. Влияние предельно низкой температуры зимовки на некоторые биохимические показатели сеголетков карпа //Проблемы криобиологи;. 1991. N 2. С. 20-22. "

33. Немова Е Е , Лукьяненко В. К., Крупнова 1L Ю. , ЬЬеолоз К Е Внутриклеточные' протеиназы волжского осетра в норме и при расслоении мылц//Еиэ>:нмические особенности болезней рыб. Петрозаводск. 1991. С. 25-31.

39. Немова Е Е , Еолков И. Е Влияние солей селена и теллура на активность лизосомальных протеиназ годовиков радужной форели// Биохимические особенности болезней рыб. Петрозаводск. 1991. С. 118-121.

40. Немова Е Е Свойства и физиологическая роль внутриклеточных протеиназ в тканях рыб//Успехи соврем, биологии. 1991. Т. 3. вып. 6. С. 947-953.