Ca2+-зависимые протеолитические ферменты некоторых водных беспозвоночных и рыб

Канцерова, Надежда Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ca2+-зависимые протеолитические ферменты некоторых водных беспозвоночных и рыб
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ca2+-зависимые протеолитические ферменты некоторых водных беспозвоночных и рыб"

На правах рукописи

КАНЦЕРОВА Надеязда Павловна

Са2+-ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ НЕКОТОРЫХ ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И РЫБ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 М'.Р 2011

Петрозаводск

2011

4840644

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН

Научный руководитель: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор НЕМОВА Нина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ШАРОВА Наталья Петровна

доктор биологических наук, профессор МУХИН Вячеслав Анатольевич

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 22 марта 2011 года в 12.00 на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.087.02 при Карельской государственной педагогической академии по адресу: 185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельской государственной педагогической академии (185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17).

Автореферат разослан" ¡9" февраля 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

к.м.н., доцент

А.И. Малкиель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Протеолиз — ферментативный гидролиз пептидных связей в белках и пептидах - один из наиболее важных и универсальных химических процессов живой природы (Антонов, 1983; Kirschner, 2000). Актуальность изучения внутриклеточных протеиназ определяется, с одной стороны, их базовыми функциями в клетке, а с другой стороны их ролью в развитии ответных реакций организма на действие разнообразных стресс-факторов, в том числе и факторов среды. Функции внутриклеточных протеолитических ферментов заключаются в деградации белков, а также в катализе реакций ограниченного протеолиза, необходимых для регуляции клеточного метаболизма. Последняя функция становится более очевидной с повышением эволюционной организации живых организмов (Степанов, 1994), и сегодня система Са2+-зависимого протеолиза, включающая Са2+-зависимые протеиназы семейства кальпаинов и их эндогенный ингибитор кальпастатин, рассматривается как одна из важнейших регуляторных систем клеток высших эукариот (Goll et al., 1990; Craall, DeMartino, 1991; Goll et al., 2003). Кальпаины (КФ 3.4.22.17; клан цистеиновых протеиназ СА, семейство С2) - Са2+-зависимые протеиназы, ответственные за селективную деградацию белков в цитозоле клеток всех организмов - от прокариот до человека. Они принимают участие в базовых Са2 "-зависимых клеточных процессах - передаче сигнала, клеточном цикле, пролиферации, дифференцировке, апоптозе, слиянии мембран, формировании мышечных волокон и других (Sorimachi et al., 1997; Goll et al., 2003); изменение их активности описано при некоторых наследственных и эпигенетических нарушениях, дегенеративных заболеваниях (Tidball, Spencer, 2000; Suzuki et al., 2004). К настоящему моменту кальпаин-кальпастатиновая система достаточно хорошо изучена у млекопитающих, хотя и в этой области остается ряд нерешенных проблем (Бондарева и др., 2006; Goll et al., 2003). Сведения же о каль-паинах рыб, а также беспозвоночных животных сравнительно фрагментарны (Mykles et al., 1998; Ladrat et al., 2000; 2004; Salem et al., 2004; 2005a, Saito et al., 2007) и зачастую ограничиваются идентификацией кодирующих их нуклеотидных последовательностей. Несмотря на ограниченность структурных исследований Са2+-зависимых протеиназ цитозоля и кодирующих их генов у беспозвоночных и рыб, в отдельных исследованиях (Бондарева, 2002; 2004; Johnson, 1990) показано участие этих протеиназ в физиологических процессах, включая развитие адаптивных и патологических перестроек метаболизма. Критериями участия кальпаинов в этих процессах является изменение их функциональной активности (на уровне экспрессии, активации, компартментализации, ингибирования, синтеза специфичных форм и их соотношения) и ряда других свойств. Таким образом, исследования структуры, свойств и роли Са +-зависимых протеолитических ферментов в метаболизме беспозвоночных и рыб представляют несомненный интерес как в сравнительно-эволюционном, так и в фгоиолого-биохимическом и экологическом аспектах.

Цель работы заключалась в характеристике внутриклеточных Са2+-зависимых протеолитических ферментов семейства кальпаинов у водных беспозвоночных и рыб и выявлении ответных реакций на уровне Са2+-зависимого протеолиза при влиянии на организмы некоторых антропогенных факторов среды.

Задачи исследования:

1. Выделить и идентифицировать так называемые «классические» формы кальпаинов или их гомологи из органов и тканей беспозвоночных и рыб, изучить их структурные и энзиматические свойства.

2. Изучить общие и специфические особенности внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ у рыб и беспозвоночных.

3. Выявить изменения активности и экспрессии мРНК внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ беспозвоночных и рыб при воздействии на них антропогенных факторов среды.

Положения, выносимые на защиту:

1. Базовый уровень активности, а также структурные и энзиматические свойства внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ зависят от филогенетического положения объекта.

2. Характер ответной реакции со стороны внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ на изученные антропогенные факторы зависит от концентрации, времени воздействия и природы действующего вещества.

Научная новизна. Впервые исследован базовый уровень активности внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ у ранее неизученных в этом отношении объектов - пресноводных беспозвоночных (кольчатых червей, насекомых, ракообразных, двустворчатых и брюхоногих моллюсков). На примере изученных беспозвоночных выявлена зависимость уровня активности внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ от филогенетического положения объекта. Впервые показано изменение уровня экспрессии гена кальпаин-подобной протеиназы в тканях беспозвоночных животных при антропогенном воздействии (при влиянии солей тяжелых металлов в аква-риальном эксперименте). Показана роль исследуемых протеиназ в развитии ответной реакции водных беспозвоночных и рыб при воздействии некоторых антропогенных факторов.

в качестве дополнительного биохимического критерия для оценки состояния организмов, обитающих в загрязненных водоемах. Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных курсах «Экологическая биохимия» и «Введение в энзимологию» для студентов биологических факультетов вузов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и зарубежных научных конференциях: Всероссийской конференции «Научное наследие академика JI.A. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 2008), Ш International conference «Arctic Frontiers. Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change» (Tromso, Norway, 2009), XVI Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2009), Международной научной конференции молодых ученых «Молодежь в науке - 2009» (Минск, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XXVIII Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаводск, 2009), IV International conference «Balwois - 2010. Water observation and information system for decision support» (Ohrid, Republic of Macedonia, 2010), 1П Международной конференции с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010), Международной школе-семинаре для молодых ученых «Биологические ресурсы Арктики и Субарктики - потенциал для биотехнологии: исследования и инновации» (Петрозаводск, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 печатные работы, из которых 1 монография в соавторстве, 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 8 статей в других изданиях и 11 тезисов докладов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 28 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 305 источников, в том числе 206 работ зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своим учителям и наставникам: научному руководителю д.б.н., член-корр. РАН Н.Н. Немовой, научному консультанту к.б.н. JI.A. Лысенко, сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации. Автор искренне признательна сотрудникам ИБВВ им. И.Д. Папанина РАН, ИППЭС КНЦ РАН, ИМБП РАН, ББС ЗИН РАН «Каргеш» за помощь в получении биологического материала, постановке экспериментов и обсуждении результатов исследований. Самые теплые слова благодарности сотрудникам группы молекулярной биологии ИБ КарНЦ РАН к.б.н. JIB. Топчиевой и к.б.н. И.Е. Малышевой за помощь в проведении молекулярно-генетических исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 08-04-01140-а, 09-04-90733-моб_ст), Программы Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-306.2008.4 и НШ-3731.2010.4.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены современные данные о структуре, свойствах, механизмах регуляции и биологической роли внутриклеточных Са2+-зависимых протеолитических ферментов семейства кальпаинов у животных, в том числе у рыб и беспозвоночных. Обобщены данные литературы о роли исследуемых протеиназ в механизмах эколого-биохимических адаптаций в условиях изменения различных факторов окружающей среды, включая антропогенные. Обозначены нерешенные вопросы и перспективы исследования Са2+-зависимых протеиназ у низших позвоночных и беспозвоночных животных.

Глава 2. Материал и методы исследований Материал. В качестве объектов исследования были использованы представители следующих таксонов беспозвоночных: тип Кольчатые черви ('Annelida'): олигохета Stylodrilus heringianus (кл. Oligochaeta, отр. Lumbricu-lida), малая ложноконская пиявка Herpobdella octoculata (кл. Hirudinea, отр. Pharyngobdellae); тип Членистоногие (Arthropoda). кл. Ракообразные (Crustacea): водяной ослик Asellus aquaticus (отр. Isopoda), дафния Daphnia pulex (отр. Cladocera), полифемус Polyphemus pediculus (отр. Cladocera), амфиподы Gammarus sp. (отр. Amphipoda); тип Членистоногие (Arthropoda'). кл. Насекомые (Insecta): личинки эритроммы большой Etythromma najas (отр. Odonata), личинки ручейника-глазка Limnephilus stigma (отр. Trichop-tera), личинки подёнки Линнея Siphlonurus linneanus (отр. Ephemeroptera), личинки полоскуна Acilius sp. (отр. Coleoptera), личинки хаоборуса Chaobonts sp. (отр. Diptera); тип Моллюски (Mollusca). кл. Брюхоногие (Gastropoda'): прудовик Lymnaea intermedia, прудовик болотный L. palustris, лужанка Viviparius viviparius, катушка окаймленная Planorbis planorbis; тип Моллюски (Mollusca). кл. Двустворчатые ('Bivalvia’): дрейссена полиморфная Dreissena polymorpha, дрейссена бугская D. bugensis, перловица Unio longirostris, мидия обыкновенная Mytilus edulis L.; а также пресноводные рыбы: щука Esox lucius L. (сем. Esocidae), карась Carassius auratus L. (сем. Cyprinidae), сиг Coregonus lavaretus (L.) (сем. Coregonidae).

Экстракция протеиназ из тканей. Экстракцию проводили:

1) стандартным методом. Навеску ткани (5.0 г) гомогенизировали в 3-кратном объеме 10 мМ трис-HCl буфера (pH 7.5) с добавлением 0.25 М сахарозы

(Murachi et al., 1981). Гомогенаты центрифугировали 20 мин при 2000 g, затем 60 мин при 105 ООО g;

2) микрометодом. Навеску ткани (100 мг) гомогенизировали в 10-кратном объеме 20 мМ трис-HCl буфера (pH 7.5) (Enns, Beicastro, 2006). Гомогенаты центрифугировали 20 мин при 20 000 g. Супернатант (цитозольная фракция фермента) декантировали. Осадок ресуспендировали в 10 объемах того же буфера с добавлением 0.33% тритона Х-100 и повторно центрифугировали в тех же условиях. Супернатант после повторного центрифугирования (мембраносвязанная фракция фермента) хранили на льду для последующего анализа.

Частичная очистка внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ. Ионообменную хроматографию проводили на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (Дэвени, Гергей, 1976). Элюцию ферментов проводили с помощью непрерывного градиента р-ра NaCl (0.1-0.4 М). Фракции, содержащие Са2+-зависимую протеолитическую активность, концентрировали на ПЭГ-10 000 и использовали для дальнейшей очистки. Гель-фильтрацию проводили на колонках с Sephacryl S-300 («Sigma-Aldrich», США). Элюцию проводили со скоростью 24 мл/ч. Молекулярную массу выходящих с колонки фракций белка определяли с помощью калибровочного графика, построенного по результатам пропускания через колонку белков с известной молекулярной массой: иммуноглобулина G (110 кДа), БСА (67 кДа), трипсина (32.5 кДа), цитохрома с (11.7 кДа). Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970), окрашивание препаратов белка проводили 0.15% Coomassie G-250 (Harnes, 1990).

Определение активности внутриклеточных С а2*-зависимых протеиназ. Активность Са2+-зависимых протеиназ определяли спектрофотометрически по гидролизу щелочно-денатурированного казеина во фракциях, полученных после гель-хроматографического разделения образцов (Murachi et al., 1981) или в цитозольной и мембраносвязанной фракциях, полученных без хроматографического разделения (Enns, Beicastro, 2006). Удельную активность кальпаинов определяли в единицах активности (ЕА) на 1 мг белка. Содержание белка в тканях определяли согласно методу Бредфорд (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта БСА.

Проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тотальную РНК из ткани (50 мг) выделяли с помощью набора «Yellow-Solve» («Клоноген», Россия) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Первую цепь комплементарной ДНК (кДНК) синтезировали из 5 мкг тотальной РНК с использованием случайных гексапраймеров и M-MLV обратной транскриптазы («Силекс», Россия). Синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию проводили в приборе iCycler с оптической

приставкой iQ5 («Bio-Rad», США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green. Праймеры к нуклеотидным последовательностям исследуемого гена кальпаин-подобной протеиназы и референсного гена актина подбирали с использованием компьютерной программы Primer Premier 5. Уровнь экспрессии исследуемого гена определяли методом 2~ллс‘ (Livak, Schmittgen, 2001).

Статистическая обработка данных. Полученные данные обработаны с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вил-коксона-Манна-Уитни) (Коросов, Горбач, 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы некоторых водных беспозвоночных и рыб. Особенности структуры и свойств

3.1. Акггивность кальпаинов в тканях некоторых беспозвоночных и

рыб

Исследован базовый уровень активности внутриклеточных Са -зависимых протеиназ у некоторых видов беспозвоночных и рыб. Анализ полученных результатов (рис. 1) показал, что уровень активности кальпаинов у животных разных таксонов значительно варьирует. Максимальные величины удельной активности кальпаинов в цитозольной фракции отмечены у представителей типа Кольчатые черви - пиявок и олигохет. У остальных исследованных гидробионтов активность Са2+-зависимых протеиназ в цитозольной фракции значительно ниже. При изучении уровня удельной активности кальпаинов в мембраносвязанной фракции установлено, что наивысшие значения активности характерны для кольчатых червей, несколько меньшие — для двустворчатых моллюсков, минимальные - для членистоногих. Промежуточные, близкие между собой значения активности исследуемых ферментов отмечены у брюхоногих моллюсков, а также у рыб. Установленные различия в конститутивном уровне внутриклеточной Са2+-зависимой протеолитической активности у изученных видов беспозвоночных и рыб могут быть связаны как с физиологическими особенностями, так и с таксономической принадлежностью объектов. Ранее высказывалось предположение, что Са2+-зависимые протеиназы эволюционно более древних организмов выполняют преимущественно катаболическую функцию, в то время как у более высокоорганизованных животных на первый план выходит их регуляторная функция в клеточном метаболизме (Степанов, 1994; Бондарева, 2002).

Рис. 1. Удельная активность внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ у изученных видов беспозвоночных и рыб. По горизонтали', логарифм значений удельной активности внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ в цитозольной фракции; по вертикали: - в мембраносвязанной фракции. I - кольчатые черви, II - моллюски, 1П - членистоногие, IV -рыбы. Арабскими цифрами обозначены изученные виды организмов (1 - Stylodrilus herin-giartus, 2 - Herpobdella octoculata, 3 - Asellus aquaticus, 4 - Daphnia pulex, 5 - Polyphemus pediculus, 6 - Limnephilus stigma, 7 - Erythromma mjas, 8 - Siphlonurus linneanus, 9 - Acilius sp., 11 - Lymnaea intermedia, 12 - L. palustris, 13 - Planorbis planorbis, 14 - Viviparius vi-viparius, 15 - Dreissena bugensis, 17 - Unio longirostris, 18 - Carassius auratus, 19 - Esox lucius.

Действительно, наиболее высокие значения активности Са2+-зависимых протеиназ характерны для представителей типа Кольчатые черви - наиболее древних и просто организованных животных среди исследованных групп беспозвоночных (рис. 1). Можно предположить, что более высокий уровень активности кальпаинов у представителей типа Кольчатые черви является отражением древности и примитивности организации данной группы организмов. Высокая эффективность Са2+-зависимого протеолиза в цитозоле у низших животных (по данным Д. Майклса (Mykles, 1998), у ракообразных в цитозоле гидролизуется до 60% белков) тесно связана с другой особенностью их кальпаинов - низкой селективностью по сравнению с гомологами из теплокровных, которая отражается в более широкой субстратной специфичности (Мухин, 2000; Mykles, 1998) и более полном гидролизе белков-субстратов (до коротких пептидов) непосредственно в цитозоле.

3.2. Выделение и частичная очистка внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ из тканей рыб. Распределение, тканевая специфичность и некоторые энзиматические свойства

Энзиматические свойства Са2+-зависимых протеиназ рыб исследовали на примере сига С. lavaretus. На рисунке 2 приведен профиль элюции водорастворимых белков мышц сига после гель-хроматографии. Белки во всех случаях разделяются по молекулярной массе на три пика: наиболее

высокомолекулярные белки составляют первый пик (Мг 400-110 кДа), белки сМ, 110-10 кДа - второй, третий пик включает низкомолекулярные (< 10 кДа) вещества белковой природы, пептиды. Протеолитическая активность, индуцируемая ионами Са2+, обнаруживается в трех фракциях белкового элюента с Мг

120, 110 и 80 кДа (рис. 2). Соотношение активностей в разных фракциях фермента имеет органную специфичность. Для различных фракций фермента определили концентрацию Са2+, необходимую для проявления максимальной активности. Са2+-зависимые протеиназы сига максимально активны при 100 мкМ - фракция сМ, 120 кДа,

2.0 мМ - фракция 110 кДа и

1.0 мМ - фракция 80 кДа. Таким образом, зависимость

активности кальпаинов сига от концентрации Са2+ была установлена для процессов, происходящих в бесклеточной реакционной среде. Кроме того, в наших экспериментах на примере крыс была показана зависимость активности кальпаинов от концентрации Са2+ непосредственно в клетке (Алтаева и др., 2010). В исследовании pH оптимума Са2+-зависимых протеиназ сига показано, что фракция фермента с Мг 120 кДа максимально активна при pH 7.4, фракции 110 и 80 кДа - при pH 7.2.

При воздействии широкого спектра ингибиторов показано, что Са2+-зависимые протеиназы сига чувствительны к ингибиторам, взаимодействующим с SH-группами цистеина: алкилирующим реагентам, ионам тяжелых металлов (Hg2+). Кроме того, Са2+-зависимая протеолитическая активность не детектируется в присутствии ЭГТА - хелатора ионов Са2+. При воздействии группового ингибитора сериновых протеиназ (PMSF), а также ингибитора аспартат-ных протеиназ (пепстатина) уровень Са2+-зависимой протеолитической активности достоверно не снижается по сравнению с контролем. Установлено, что эндогенный ингибитор кальпаинов кальпастатин из мышц сига элюируется с колонки Sephacryl S-300 с белковой фракцией с Mr 170 кДа.

Чувствительность исследуемых ферментов к ингибиторам цистеино-вых протеиназ, абсолютная зависимость активности от присутствия ионов Са2+ и нейтральный pH оптимум однозначно позволяют отнести изучаемые ферменты к цистеиновым протеиназам семейства кальпаинов С2 (Rawlings et al., 2010).

(-----) (ЕА) в мышцах сига С. lavaretus.

Известно (МигасЫ й а1., 1981; Оо11 е1 а!., 2003), что при разделении кальпаи-нов позвоночных первой с колонки элюируется белковая фракция, содержащая более высокомолекулярный р-кальпаин, затем - т-кальпаин, а третий пик, скорее всего, обусловлен наличием каталитических субъединиц, образовавшихся в результате диссоциации высокомолекулярных форм (БигиИ <Д а1., 1988). Данные гель-фильтрации образцов с последующим электрофорезом в ПЛАТ свидетельствуют о том, что протеиназы фракций 120 и 110 кДа состоят из двух различных субъединиц с Мг приблизительно 80 и 27 кДа, то есть в нативном состоянии имеют структуру гетеродимеров, фракция 80 кДа включает смесь двух полипептидов с близкими значениями Мг. Дополнительным критерием различения ц- и ш-кальпаинов у позвоночных служит их термостабильность при нагревании при 58 °С в течение 5 минут. Так, активность т-кальпаина карпа снижается в этих условиях на 25%, тогда как активность ц-кальпаина не изменяется (МигасЫ й а1., 1981). В наших экспериментах показано, что фракция фермента сига с Мг 110 кДа утрачивает 60% активности при нагревании до 58 °С. Протеиназа с Мг 120 кДа сохраняет 70% от первоначальной активности при инкубации при 58 °С. Термо-сгабильность фракции фермента 80 кДа промежуточная. Таким образом, по совокупности экспериментальных данных о димерной структуре, молекулярной массе субъединиц, чувствительности к Са2+, термостабильности можно установить сходство протеиназы фракции 120 кДа с р-кальпаином человека, протеиназы фракции 110 кДа - с т-кальпаином человека, фракция 80 кДа предположительно содержит смесь их каталитических субъединиц.

3.3. Выделение и частичная очистка внутриклеточных Са2+-зависнмых протеиназ беспозвоночных. Распределение и некоторые энзиматические свойства

Исследование энзиматических свойств кальпаин-подобных протеиназ проводили у двустворчатых моллюсков (мидий МуШт ес/и/й) и ракообразных (амфипод Саттапс!ае). Как упоминалось выше, у позвоночных первой с колонки элюируется фракция, в которой определяется активность ц-кальпаина, затем - т-кальпаина (МигасЫ й а1., 1981; воП ^ а1., 2003), а третий пик, скорее всего, обусловлен наличием каталитически активных субъединиц (8иги1а с( а1., 1988). Подобное соотношение пиков наблюдается также на хроматограмме мидий и амфипод. Са2+-зависимая протеолитиче-ская активность в экстрактах мягкого тела моллюска обнаруживается в белковых фракциях с Мг 110, 85 и 65 кДа, в гомогенатах амфипод - в белковых фракциях с Мг 110, 80 и 65 кДа; полипептиды этих фракций мигрируют в ПААГ с белками Мг 85 и 65 кДа. Ферменты мидии максимально активны в присутствии 4.0 мМ Са2+ (фракция 85 кДа) или 2.0 мМ (фракции 110 и 65 кДа) (рис. 3). Ферменты амфипод с Мг 110, 80 и 65 кДа максимально активны при 3.0, 5.0 или 4.0 мМ Са2+, соответственно. Полученные результаты

согласуются с данными литературы о том, что для активации кальпаин-подобных про-теиназ беспозвоночных требуются миллимолярные концентрации Са2+ (Mykles, 1998), в то время как потребность в Са2+ у большинства из известных кальпаинов позвоночных животных (например, изученных нами рыб) лежит в микромолярном диапазоне (исключение - т-кальпаин). Увеличение квоты кальпаинов с высокой чувствительностью к Са2+ ранее было продемонстрировано при сравнении пула эритроцитарных форм кальпаинов среди позвоночных животных (Nemova et al., 2000). Максимальная активность трех выделенных молекулярных форм фермента мидии зафиксирована при pH 7.4. Ферменты амфипод максимально активны при значениях pH 7.4 (фракции с Mr 110 и 80 кДа) и 7.6 (65 кДа). При изучении термостабильности Са +-зависимых протеиназ мидии было показано, что фракция фермента с Мг 85 кДа утрачивает 70% активности при нагревании при 38 °С и полностью инактивируется при воздействии 48 °С. Про-теиназа с Mr 110 кДа теряет активность на 40% при 48 °С и сохраняет 10% от первоначального уровня активности при температуре 58 °С. Сходные результаты были получены для кальпаин-подобных ферментов амфипод. Полученные данные свидетельствуют о том, что кальпаин-подобные ферменты беспозвоночных значительно более чувствительны к нагреванию, чем кальпаины рыб (материалы главы 3.2). Ингибиторный анализ показал, что Са2+-зависимые протеиназы амфипод чувствительны к ингибиторам цистеиновых протеиназ. В то же время при воздействии группового ингибитора сериновых протеиназ (PMSF), а также ингибитора аспартатных протеиназ (пепстатина) уровень активности кальпаинов амфипод снижался на 20% по сравнению с контролем. Са2+-зависимые протеиназы мидий также чувствительны к ингибиторам протеиназ цистеинового типа, их активность не выявляется в присутствии ЭГТА. При воздействии PMSF и пепстатина уровень активности кальпаинов мидий снижался на 25% по сравнению с контролем. Чувствительность Са2+-зависимых протеиназ беспозвоночных к пепстатину и PMSF была отмечена ранее и другими авторами у омара (Mattson, Mykles, 1993). В тканях мидий и амфипод не обнаружена активность кальпастатина.

Рис. 3. Зависимость активности кальпаин-подобных протеиназ (Мг 65, 85 и 110 кДа) из мягкого тела мидии М. ес1иИз от концентрации Са2+ в инкубационной среде

Свойства кальпаин-подобных белков мидий и амфипод (необходимая для активации концентрация Са2+, pH оптимум, чувствительность к действию ингибиторов) позволяют отнести изучаемые ферменты к цистеиновым протеина-зам семейства кальпаинов С2 (Rawlings et al., 2010). Вместе с тем, кальпаин-подобньм ферментам беспозвоночных свойственны специфические особенности структуры и свойств по сравнению с кальпаинами рыб (обобщены в табл.1), выражающиеся в меньшей чувствительности к Са2+, меньшей термостабильности, чувствительности к ингибиторам протеиназ нецистеинового типа. Кроме того, в их структуре отсутствует субъединица, подобная регуляторной субъединице 28 кДа кальпаинов позвоночных. У беспозвоночных отсутствует эндогенный ингибитор кальпастатин.

Таблица 1. Некоторые свойства Са2+-зависимых протеиназ у животных разных таксономических групп

Некоторые свойства Беспозвоночные Рыбы Тенденция в эволюционном ряду

Мидии Амфиподы

чувствительность кСа2* 2-4 мМ 3-5 мМ 100 мкМ-2 мМ повышается

термостабильность (остаточная активность фермента после инкубации при 58 °С в течение 5 мин) 0-10% 0-10% 40-70% повышается

pH оптимум 7.4 7.4-7.6 7.2-7.4 не изменяется

чувствительность к РМЭН и пепстатину + + - утрачивается

регуляторная субъединица - - + усложнение механизмов регуляции

кальпастатин - - +

Глава 4. Влияние некоторых типов антропогенного загрязнения на внутриклеточные Са2+-зависимые протеолитические ферменты водных беспозвоночных и рыб

4.1. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы мидии МуШиБ ейиНъ при воздействии нефтепродуктов

Исследовали влияние нефтепродуктов на активность внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ в тканях мидий в аквариальном эксперименте. Предварительно акклимированных к лабораторным условиям моллюсков подвергали воздействию различных концентраций нефтепродуктов (дизельного топлива, разведенного в морской воде в соотношении 1:9) в течение 6 суток. В контрольный аквариум дизельное топливо не вносили. Активность кальпаинов оценивали после предварительной гель-хроматографии образцов на колонках 8ерЬасгу1 Б-ЗОО (рис. 4).

Рис. 4. Са2+-зависимая протеолитическая активность (ЕА) в различных белковых фракциях экстракта мягкого тела мидии М. edulis при действии различных концентраций дизельного топлива, К - контроль, * - отличие от контроля достоверно при р < 0.05.

Наиболее выраженная активация всех компонентов Са2+-зависимой каль-паиновой системы, и, как следствие, максимальная суммарная активность, наблюдается у мидий при воздействии дизельного топлива в концентрации 17.4 мг/л. Можно предположить, что активация кальпаин-подобных ферментов в тканях мидий, наблюдаемая в данном эксперименте, свидетельствует о компенсаторных изменениях обмена веществ моллюсков, направленных, вероятно, на повышение эффективности утилизации и детоксикации нефтепродуктов. О компенсаторном характере ответной реакции метаболизма мидий при воздействии нефтепродуктов свидетельствуют изменения и других биохимических параметров (Амелина и др., 2006; Bakhmet et al, 2009).

4.2. Внутриклеточные Са2+-зависимые прогеиназы мидии Mytilus edulis при воздействии солей меди и кадмия

В аквариальном эксперименте исследовали влияние солей тяжелых металлов на экспрессию мРНК и активность внутриклеточных Са2+-зависимых про-теиназ в орх анах мидий. Для исследования были выбраны два металла - кадмий, способный связываться с SH-группами биомолекул (Антонов, 1983) и медь - эссенциальный металл, входящий в состав ферментов, однако, в высоких концентрациях токсичный для организма (Губанов и др., 2008; Моисеенко, 2009). Предварительно акклимированных к лабораторным условиям моллюсков подвергали воздействию растворов хлоридов меди и кадмия следующих концентраций: 5 мкг/л Си2+, 50 мкг/л Си2+, 250 мкг/л Си2+, 10 мкг/л Cd2+, 100 мкг/л Cd2+, 500 мкг/л Cd2+ (концентрация приведена в пересчете на катион) в течение 24 и 72 ч. Контролем служили моллюски, содержащиеся в аквариуме без добавления металлов.

Рис. 5. Удельная активность кальпаинов (ЕА/мг белка) в жабрах М. ес!иН$ Ь. при действии различных концентраций меди (А) и кадмия (В) (экспозиция 24 и 72 часа), * - отличие от контроля достоверно при р < 0.05).

Активность кальпаинов в жабрах и гепато-панкреасе мидий, подвергнутых воздействию солей меди и кадмия, изменялась в зависимости от природы металла, его концентрации и времени воздействия на организм. Так, по истечении 24 ч воздействия меди (250 мкг/л) и кадмия (500 мкг/л) наблюдался более высокий уровень активности кальпаинов в жабрах по сравнению с контролем (рис. 5 А, В). Вероятно, наблюдаемая активация кальпаинов в жабрах мидий при остром краткосрочном воздействии тяжелых металлов свидетельствует о развитии стресс-реакции. Известно, что становление

стресс-реакции при действии экстремальных факторов сопровождается повышением активности протеолитических ферментов (Генгин и др., 2000). После 72 ч воздействия меди (50, 250 мкг/л) в жабрах, подверженных максимальной аккумуляции металлов (Челомин, 1998; Андроников и др., 2002), наблюдалось снижение активности Са2+-зависимых протеиназ по сравнению с контролем. Вероятно, избыток меди в жабрах оказывает влияние на биохимические процессы, в том числе и на протеолитические. После 72 ч воздействия кадмия (100, 500 мкг/л) также наблюдалось снижение активности Са2+-зависимых протеиназ цитозоля в жабрах мидий по сравнению с контролем. Подавление активности кальпаинов, вероятно, является следствием способности данного металла к ингибированию биомолекул за счет специфичного связывания с их реакционными БН-группами. В гепатопанкреасе мидий при суточном воздействии меди и кадмия активность кальпаинов не изменялась; тогда как через трое суток наблюдались достоверные изменения активности Са2+-зависимых протеиназ в данном органе. Наблюдаемые различия, вероятно, можно объяснить тем, что к

7 -6

S' 6 5 4 >»

0 24 м

£3 72 ч

1 I

Контроль 10 мкг/л 100 мкг/л 500 мкг/л

этому времени начинается отток металлов от уязвимых тканей (жабры) к тканям, функционально задействованным в аккумуляции, детоксикации и экскреции ксенобиотиков (гепатопанкреас и почки).

Для установления возможных механизмов регуляции акивности кальпаи-нов, оценивали уровень экспрессии гена кальпаин-подобной протеиназы в жабрах и гепатопанкреасе мидий экспериментальных групп. Несмотря на то, что кальпаины - конститутивные ферменты, их нельзя рассматривать как белки «домашнего хозяйства», поскольку экспрессия их генов регулируется (Cottin et al., 1994; Nakashima et al, 2005; Lepage, Bruce, 2008). Содержание транскриптов гена кальпаин-подобной протеиназы в жабрах и гепатопанкреасе мидий было стабильным при 24-часовом воздействии меди, и увеличилось только через 72 часа. При воздействии кадмия в жабрах мидии уровень экспрессии исследуемого гена увеличился по сравнению с контролем уже при 24часовом воздействии (рис. 6 А), а в гепатопанкреасе -только после 72 часов (рис. 6 В). Таким образом, в наших экспериментах было установлено, что влияние ионов тяжелых металлов приводит к достаточно быстрому и значительному (в отдельных случаях более чем к 6-кратному) увеличению экспрессии гена кальпаин-подобной протеиназы в органах мидий.

Сопоставление данных о количестве мРНК Са2+-зависимой протеиназы и ее активности показало стабильность обоих показателей в гепатопанкреасе при 24-часовом воздействии металлов и их сочетанное увеличение при 72-часовом воздействии, тогда как в жабрах после 72 ч воздействия металлов активность кальпаинов и их экспрессия изменялись

Рис. 6. Относительная экспрессия гена кальпаин-подобной протеиназы в жабрах (А) и гепатопанкреасе (В) мидии М. ес1иН$. при действии различных концентраций кадмия (экспозиция 24 ч и 72 ч), * -отличие от контроля достоверно при р < 0.05).

разнонаправлено: при повышении количества мРНК активность каль-паинов снижалась. По-видимому, наблюдаемые изменения направлены на поддержание достаточного уровня кальпаинов, обеспечивающего нормальное функционирование клетки: так, при обеднении пула функционально активных кальпаинов за счет блокады их активных центров металлом (кадмием) увеличивается скорость их синтеза de novo. Однако сделанные на основании полученных результатов выводы носят в определенной мере гипотетический характер из-за отсутствия данных о количественном содержании кальпаинов. Прямая оценка их уровня оказалась на настоящем этапе исследований невозможной в отсутствии доступных коммерческих антител к указанным белкам.

Для более полной оценки возможных механизмов действия солей тяжелых металлов, растворенных в среде, на калытаины мидий, в эксперименте in vitro была протестирована способность различных катионов (в том числе Си2+ и Cd2’) воздействовать на активность частично очищенного препарата кальпаинов (ионы добавлялись в конечной концентрации 2.5 мМ в составе хлоридов). Относительная активность кальпаинов также была определена при совместном добавлении 2.5 мМ изучаемого катиона и 2.5 мМ Са +. Как и ожидалось, Са2+ является наиболее эффективным активатором кальпаинов (Са2+-индуцируемая активность принята за 100%). Ионы Си2+ также способны активировать фермент, но в значительно меньшей степени, до 24 % от референтного уровня. В присутствии 2.5 мМ Cd2+ активность фермента не выявлялась, как и при сочетанном действии Са2+ и Cd2+, что, вероятно, можно объяснить способностью кадмия блокировать SH-группу активного центра фермента.

4.3. Влияние накопления стронция на внутриклеточные Са2+-зависимые нротеиназы сига Coregonus lavaretus из водоемов Мурманской области

Исследована активность внутриклеточных Са2+-зависимых протеи-наз в тканях сига из водоемов Мурманской обл., различающихся по степени техногенного загрязнения - оз. Нижняя Пиренга (контроль), качество вод которого является удовлетворительным (уровень микроэлементов не превышает предельно допустимые концентрации для рыбохозяйственных водоемов) и оз. Ковдор (опыт), испытывающего загрязнение стронций-содержащими сточными водами Ковдорского горнообогатительного комбината. Установлено, что стронций - наиболее интенсивно аккумулирующийся в тканях рыб тяжелый металл из состава загрязнителей оз. Ковдор (Кашулин, 1999; Королева, 2001). Стронций представляет серьезную опасность для позвоночных из-за его структурного сходства с кальцием, которое обуславливает способность стронция замещать кальций в костной и других тканях (Шведов, 1997; Оноприенко, 2002).

В жабрах и печени рыб из загрязненного стронцием озера Ковдор наблюдается снижение активности каль-паинов (рис. 7), что можно объяснить вытеснением кальция стронцием из Са2+-связывающих белков, в том числе Са2+-зависимых про-теиназ. Наиболее высокие значения активности каль-паинов у рыб из чистого озера обнаружены в жабрах (рис. 7). Для жабр рыб из загрязненного озера характерно наиболее выраженное по сравнению с другими органами подавление активности кальпаинов. Это может быть связано с барьерной функцией жабр, испытывающих активное первичное воздействие токсичных компонентов среды. Несмотря на подавление суммарной активности Са2+-зависимых протеиназ в жабрах сига из оз. Ковдор, обращает на себя внимание увеличение активности формы кальпаина с молекулярной массой 110 кДа, активируемого нефизиологично высокой миллимолярной концентрацией Са2+, что часто рассматривается как показатель развивающихся патологических перестроек в тканях, вызванных нарушением гомеостаза Са2+в клетке (Немова, 1996; Микой, 1990). О нарушениях в метаболизме сигов из загрязненного стронцием озера Ковдор свидетельствуют изменения других биохимических параметров (Морозов и др., 2007; Нефедова и др., 2007).

Для объяснения механизма действия катиона Бг (основного токсичного компонента водной среды оз. Ковдор) на кальпаины сига, исследовали активность частично очищенного препарата ш-кальпаина в присутствии катионов различных металлов, в том числе Бг2*. Са2+ наиболее эффективно активирует препарат т-кальпаина (его эффективность принята за 100%). В присутствии 2.5 мМ Зг2т фермент также активируется (до 68% от уровня активности, индуцированной Са2'). Ранее было показано, что 8г' способен активировать кальпаины, выделенные из тканей других организмов (О^а й а1., 1988; Ьас1га1 й а1,2002, СаиапаЫ е1 а1., 2003). Сходная способность катионов Са2+ и Б г2” к активации кальпаинов объясняется их структурным родством, на основании которого они входят в одну группу химических элементов периодической системы. Известно, что повышенная способность Бг2+ к аккумуляции в организме обусловлена замещением Са2+ в костной и других тканях (Шведов, 1997; Оноприенко, 2002). Следствием этого является нарушение обмена Са2+ в организме и нарушение Са2+-зависимых регуляторных процессов, что и определяет токсическое действие Бг4.

Рис. 7. Са2+-зависимая протеолитическая активность (ЕА) в тканях самцов сига из оз. Ниж. Пи-ренга (1 - контроль) и оз. Ковдор (2 - опыт), * -отличие от контроля достоверно при р < 0.05.

4.4. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы рыб при минеральном загрязнении водоемов стоками горно-обогатительного комбината

Исследована активность Са2+-зависимых протеиназ цитозоля у сигов и щук, обитающих в озере Костомукшское - хранилище инфильтрационных вод Косто-мукшского горнообогатительного комбината (т.н. «хвостохранилище»). Общая минерализация воды хвостохранилища достигает 645 мг/л, концентрация (в мг/л) ионов К4 составляет 156,1Ча+ -18, Са2+- 38, М§?+- 18, С1 - 7, НС03 - 122, общего азота- 15, общего фосфора- 0.007-0.012; pH- 7.4-7.5. Главный загрязняющий фактор вод хвостохранилища - высокая минерализация (до 645 мг/л), при этом особенно высоки концентрации ионов К+ и НСОз. Кроме того, для вод хвостохранилища характерно наличие мелкодисперсной механической взвеси, которая затрудняет дыхание и пищеварение рыб. В качестве контроля были использованы рыбы, выловленные в озере Каменное, характеризующимся высоким качеством воды: низкой минерализацией (9.5 мг/л), низким содержанием органических соединений (общий азот - 0.41 мг/л, общий фосфор - 0.005 мг/л); pH - 5.97-6.49 (Ильмаст, 2010).

В жабрах, почках и печени щуки (рис. 8), а также в жабрах и печени сига, выловленных в загрязненной зоне, наблюдается более высокий уровень активности кальпаи-нов мембраносвязанной фракции, чем в контроле. В печени рыб, обитающих в хвостохранилище, также повышена активность кальпаи-нов цитозольной фракции.

Рис. 8. Удельная активность кальпаинов (ЕА/мг белка) Повышение активности в тканях щуки Е. 1исш.ч из оз. Каменное (1 - контроль) и кальпаинов в жабрах рыб, хвостохранилища Костомукшского ГОКа (2 - опыт), обитающих в хвостохрани-* - отличие от контроля достоверно при р < 0.05. лице ГОКа, вероятно, объяс-

няется неспецифическим раздражающим действием минеральной взвеси на эпителий жабр. Эпителий жабр постоянно подвергается воздействию факторов окружающей среды, включая токсичные агенты, и является одним из основных путей проникновения ксенобиотиков в организм гидробионтов (Моисеенко, 2009). Вследствие повреждающего действия мелкодисперсной взвеси развивается дефицит дыхательной функции жабр, который негативно отражается на снабжении кислородом всего организма (Алабастер, Ллойд, 1984). По нашим данным, особенно высокой нагрузке в исследуемых условиях подвержена печень. Повышение активности кальпаинов в почках, основная функция которых заключается в обеспечении водно-солевого

обмена, может свидетельствовать о развитии адаптационных изменений метаболизма рыб в условиях минерального загрязнения.

Таким образом, результаты, полученные при изучении структурнофункциональных характеристик кальпаинов водных беспозвоночных и рыб в условиях антропогенного загрязнения, позволяют рекомендовать их в качестве дополнительного биохимического критерия для оценки состояния организмов, обитающих в загрязненных водоемах.

ВЫВОДЫ

1. Изученные свойства Са2+-зависимых протеиназ (чувствительность к Са2+, нейтральный pH оптимум и чувствительность к ингибиторам протеиназ цистеинового типа) исследованных видов беспозвоночных и рыб свидетельствуют о том, что эти ферменты относятся к цистеиновым протеиназам семейства кальпаинов С2. Их свойства оказались сходными с таковыми у кальпаинов млекопитающих, что указывает на определенную эволюционную консервативность белков данного семейства.

2. Кальпаины исследованных рыб отличаются от кальпаин-подобных протеиназ беспозвоночных особенностями структуры (наличием малой субъединицы) и свойств (меньшей потребностью в Са2+ для активации, большей термостабильностью, нечувствительностью к ингибиторам протеиназ нецистеиново-го типа). Особенности выявленных характеристик кальпаинов рыб свидетельствуют об усложнении структуры и свойств ферментов и повышении возможностей более тонкой регуляции их активности.

3. Энзиматические свойства и уровень активности Са2+-зависимых протеиназ цитозоля у исследованных беспозвоночных и рыб являются ткане- и видоспецифичными.

4. Уровень активности внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ у изученных беспозвоночных зависит от их филогенетического положения, у более примитивных организмов он выше.

5. Са2+-зависимые протеиназы участвуют в развитии ответной реакции у беспозвоночных и рыб при воздействии на них тяжелых металлов, компонентов нефти, отходов горно-обогатительного производства. Степень ответной реакции Са +-зависимого протеолиза зависит от концентрации, времени воздействия и природы действующего вещества. Активность кальпаинов может изменяться не только на поспрансляционном уровне, но и на уровне экспрессии гена.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецилсульфат натрия

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтилцеллюлоза

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ЭГТА - этиленгликольтетрауксусная кислота

Мг - молекулярная масса

PMSF - фенилметилсульфонилфторид (от англ. phenylmethylsulfonyl fluoride)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК:

1. Канцерова Н.П., Ушакова Н.В., Лысенко Л.А., Немова Н.Н. Кальций-зависимые протеиназы некоторых беспозвоночных и рыб // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2010. - Т. 46. - № 6. - С. 489 - 494.

2. Немова Н.Н., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П. Протеиназы семейства кальпаинов. Структура и функции // Онтогенез. - 2010. - Т. 41. -№ 5. - С. 381 - 389.

3. Алтаева Э.Г., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Немова Н.Н., Шенкман Б.С. Базальный уровень кальция в волокнах камбаловидной мышцы крыс при гравитационной разгрузке. Механизмы его увеличения и роль в активации кальпаинов // Доклады академии наук. - 2010. - Т. 43. - № 1. - С. 138 - 143.

Публикации в других изданиях:

4. Бондарева Л А., Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И., Токарева (Канцерова) Н.П. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы млекопитающих // Известия национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. - 2008. - №.1. - С. 64 - 84.

5. Лысенко Л.А., Кяйвяряйнен Е.И., Немова Н.Н., Токарева (Канцерова) Н.П Адаптивный и деструктивный потенциал внутриклеточных Са2+-активируемых протеиназ // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008.: тез. докл. - Новосибирск: Изд-во «Арта», 2008. - С. 154.

6. Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Немова Н.Н. Роль внутриклеточных протеиназ в деструкции мышечной ткани // II съезд физиологов СНГ: 29-31 окт. 2008 г.: тез. докл. - Кишинев, 2008. - С. 174.

7. Канцерова Н.П., Лысенко Л.А., Кяйвяряйнен Е.И., Немова Н.Н. Роль внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ в развитии соленостных адаптаций // Научное наследие академика Л. А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний: всерос. конф., 19-20 ноября 2008.: тез. докл. - СПб.: ВВМ, 2008. - С. 63 - 64.

8. Kantserova N.P., Lysenko L.A., Nemova N.N. The effect of oil products on intracellular Ca2+-dependent proteases in marine invertebrates // Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change: abstracts of the intemat. scient. conf. «Arctic Frontiers», 18 - 23 January 2009.-P. 137.

9. Канцерова Н.П., Лысенко Л.А., Немова Н.Н. Влияние тяжелых металлов на внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы беспозвоночных // Актуальные проблемы биологии и экологии: XVI Всерос. молодежи, науч. конф., 6-10 апр. 2009 г.: мат. конф. - Сыктывкар, 2009. - С. 81 - 83.

10. Shenhnan B.S., Kachaeva E.V, Altaeva E.G., Lysenko L.A, Kantserova N.P,. Nemova N.N. Regulation of calpain activities and ubiquitin-ligase expression in rat soleus during hindlimb unloading // 14-th International Conference Biochemistry of Exercise, 2-4 June, 2009: book of abstracts. - Guelph, Canada. - 2009. - P. 74.

11. Shenkman B.S., Kachaeva E.V, Altaeva E.G., Lysenko L.A, Kantserova N.P,. Nemova N.N. Signaling mechanisms, involved in the regulation of proteolysis in rat soleus during gravitational unloading // 17-th IAA Humans in Space Symposium, 7-11 June, 2009, book of abstracts. - Moscow, Russia. - 2009. - P. 118.

12. Канцерова Н.П., Лысенко Л.А., Немова Н.Н. Влияние тяжелых металлов на каль-ций-зависимую протеолитическую активность в тканях беспозвоночных // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», 23-27 июня 2009 г. - Казань: Изд-во «Физ-техПресс» КФТИ КазНЦ РАН, 2009. - С. 373.

13. Немова Н.Н., Лысенко Л А., Канцерова Н.П. Са2+-зависимые протеиназы. Структура, функции, эволюция // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», 23-27 июня 2009 г. - Казань: Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН, 2009. - С. 10.

14. Канцерова Н.П., Лысенко Л А., Немова Н.Н., Осташкова В.В. Влияние ионов тяжелых металлов на внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы Mytilus edulis L. в экспериментах in vitro и in vivo Н Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера: XXVIII международ. конф., 5-8 окт. 2009 г.: мат. конф. - Петрозаводск: Изд-во КарНЦ РАН, 2009. - С. 257 - 261.

15. Алтаева Э.Г., Канцерова Н.П. Изменение базального уровня кальция в миоплазме камбаловидной мышцы крыс и эффекты кратковременной гравитационной разгрузки // IX Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля 2010 г.: тез. докл.-Москва, 2010.-С. 14-15.

16. Kantserova N. P., Lysenko L. A., Nemova N. N. Effect of Waterborne Copper and Cadmium on Calcium-Dependent Proteases in Blue Mussel, Mytilus edulis L. // Balwois -2010. Conference on water observation and information system for decision support: abstracts of the intemat. scient. conf., 25 - 29 May 2010. - P. 700.

17. Немова H.H., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П. Структура и функции кальций-зависимых протеиназ II XV Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 14-18 июня 2010 г.: тез. докл. - Петрозаводск: Изд-во КарНЦ РАН, 2010.-С. 48.

18. Канцерова Н.П., Ушакова Н.В., Лысенко Л. А., Немова Н.Н. Внутриклеточные каль-ций-зависимые протеолитические ферменты некоторых беспозвоночных и рыб // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: III межд. конф. с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов, 22-26 июня 2010 г.: мат. конф. - Петрозаводск: Изд-во КарНЦ РАН, 2010. - С. 73 - 74.

19. Канцерова Н.П., Лысенко Л.А. Влияние нефтепродуктов на кальций-зависимую протеолитическую активность в тканях мидий Mytilus edulis L. // Приложение к журналу Bccui НАН Беларуси Сер. б^ялапчных навук. - 2010. - С. 132 - 135.

20. Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Кяйвяряйнен Е.И., Немова Н.Н., Кашулин Н.А. Влияние Sr24 на внутриклеточные Са5+-зависимые протеиназы рыб // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том 1. Экологическая физиология и биохимия водных организмов. Сборник научных статей - Петрозаводск.: Карельский научный центр РАН, 2010. - С. 127 - 136.

21. Канцерова Н.П., Лысенко Л А., Немова Н.Н. Особенности структуры и свойств внутриклеточных кальцийактивируемых протеиназ у беспозвоночных животных // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том 1. Экологическая физиология и биохимия водных организмов. Сборник научных статей - Петрозаводск.: Карельский научный центр РАН, 2010. - С. 68 - 73.

22. Lysenko L.A., Kantserova N.P., Nemova N.N. Water organisms as a source of proteases and its inhibitors. Calcium-dependent proteases (calpains) // Current problems of physiology and biochemistry of aquatic organisms. Volume II. Arctic and Sub-Arctic biological resources - potential for biotechnology: Collected scientific papers of the fist International seminar and PhD workshop (6-9 September 2010, Petrozavodsk, Russia). - Petrozavodsk: Karelian Research Centre RAS, 2010. - P. 57 - 60.

23. Лысенко Л.А., Немова H.H., Канцерова Н.П. Протеолитическая регуляция биологических процессов // Петрозаводск, КНЦ РАН. - 2010. - 312 с.

Формат 60x84 'li6 Бумага офсетная. Гарнитура «Times». Уч.-изд. л. 1,2. Уел. печ. л. 1,3. Подписано в печать 16.02.11. Тираж 100 экз. Изд. № 177. Заказ № 935.

Карельский научный центр РАН Редакционно-издательский отдел 185003, Петрозаводск, пр. А. Невского, 50

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Канцерова, Надежда Павловна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

941.1. Внутриклеточные Са -зависимые протеолитические ферменты система кальпаинов).

1.1.1. Общая характеристика внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ животных.

1.1.2. Внутриклеточные Са -зависимые протеиназы рыб.

941.1.3. Внутриклеточные Са -зависимые протеиназы беспозвоночных.

1.2. Роль внутриклеточных Са -зависимых протеолитических ферментов в становлении ответных реакций водных организмов при изменении некоторых факторов среды обитания. ^

1.2.1. Биохимические адаптации.

941.2.2. Роль внутриклеточных Са -зависимых протеолитических ферментов в механизмах эколого-биохимических адаптаций. ^

1.3. Влияние загрязнения и сопутствующих факторов среды на водные организмы.

1.3.1. Влияние нефти и нефтепродуктов на водные организмы.

1.3.2. Влияние тяжелых металлов на водные организмы.

1.3.3. Влияние промышленных сточных вод на водные организмы.

Глава 2. Материал и методы исследований.

2.1. Материал исследований.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Определение видовой принадлежности и возраста исследуемых организмов.

2.2.2. Количественное определение тяжелых металлов в тканях исследуемых организмов.

2.2.3. Экстракция протеиназ из тканей исследуемых организмов.

2.2.4. Выделение и частичная очистка

Са2+ -зависимых протеолитических ферментов из тканей исследуемых организмов. ^ ^

2.2.5. Электрофорез в полиакриламидном деле.

2.2.6. Определение активности Са -зависимых протеолитических ферментов.

2.2.7. Количественное определение водорастворимого белка в тканях.

2.2.8. Выделение тотальной РНК и синтез комплементарной ДНК.

2.2.9. Проведение ПЦР в режиме реального времени.

2.2.10. Статистическая обработка данных.

Результаты и их обсуждение.

Глава 3. Внутриклеточные Са -зависимые протеиназы некоторых водных беспозвоночных и рыб. Особенности структуры и свойств.

3.1. Активность и видоспецифичность кальпаинов в тканях некоторых беспозвоночных и рыб.

3.2. Выделение и частичная очистка внутриклеточных

Са2+ -зависимых протеиназ из тканей рыб. Распределение, тканевая специфичность и некоторые энзиматические свойства.

3.3. Выделение и частичная очистка внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ беспозвоночных. Распределение и некоторые энзиматические свойства.

Глава 4. Влияние некоторых типов антропогенного загрязнения на внутриклеточные Са -зависимые протеолитические ферменты водных беспозвоночных и рыб.

4.1. Внутриклеточные Са -зависимые протеиназы мидии МуШш еЛиПя Ь. при воздействии нефтепродуктов в аквариальном эксперименте.

4.2. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы мидии МуШш ес!иШ Ь. при воздействии солей меди и кадмия в аквариальном эксперименте.

4.3. Влияние накопления стронция на внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы сига Соге^-оиш' \avaretus Ь. из водоемов Мурманской области.

4.4. Внутриклеточные Са2+-зависимые протеиназы рыб при минеральном загрязнении водоемов стоками горно-обогатительного комбината.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ca2+-зависимые протеолитические ферменты некоторых водных беспозвоночных и рыб"

Актуальность темы. Протеолиз — ферментативный гидролиз пептидных связей в белках и пептидах — один из наиболее важных и универсальных химических процессов живой природы (Антонов, 1983; Kirschner, 2000). Актуальность изучения внутриклеточных протеиназ определяется, с одной стороны, их базовыми функциями в клетке, а с другой стороны - их ролью в развитии ответных реакций организма на действие разнообразных стресс-факторов, в том числе и факторов среды. Функции внутриклеточных протеолитических ферментов заключаются в деградации белков, а также в катализе реакций ограниченного протеолиза, необходимых для регуляции клеточного метаболизма. Последняя функция становится более очевидной с повышением эволюционной организации живых организмов (Степанов, 1994), и сегодня система Са2+-зависимого протеолиза, включающая Са2+-зависимые протеиназы семейства кальпаинов и их эндогенный ингибитор кальпастатин, рассматривается как одна из важнейших регуляторных систем клеток высших эукариот (Göll et al., 1990; Croall, DeMartino, 1991; Göll et al., 2003). Кальпаины (КФ 3.4.22.17; клан цистеиновых протеиназ CA, семейство C2) — Ca -зависимые протеиназы, ответственные за селективную деградацию белков в цитозоле клеток всех организмов — от прокариот

94до человека. Они принимают участие в фундаментальных Ca -зависимых клеточных процессах — передаче сигнала, клеточном цикле, пролиферации, дифференцировке, апоптозе, слиянии мембран, формировании мышечных волокон и других (Sorimachi et al., 1997; Göll et al., 2003); изменение их активности описано при некоторых наследственных и эпигенетических нарушениях, дегенеративных заболеваниях (Tidball, Spencer, 2000; Suzuki et al., 2004). К настоящему моменту кальпаин-кальпастатиновая система достаточно хорошо изучена у млекопитающих, хотя и в этой области остается ряд нерешенных проблем (Бондарева и др., 2006; Göll et al., 2003). Сведения же о кальпаинах рыб, а также беспозвоночных животных сравнительно фрагментарны (Mykles et al., 1998; Ladrat et al., 2000; 2002; Salem et al., 2004; 2005a, Saito et al., 2007) и зачастую ограничиваются идентификацией кодирующих их нуклеотидньтх последовательностей. Несмотря на ограниченность структурных исследований Са2+-зависимых протеиназ цитозоля и кодирующих их генов у беспозвоночных и рыб, в отдельных исследованиях t ь ъ

Бондарева, 2002; 2004; Johnson, 1990) показано участие этих протеиназ в физиологических процессах, включая развитие адаптивных и патологических перестроек метаболизма. Критериями участия кальпаинов в этих процессах является изменение их функциональной активности (на уровне экспрессии, активации, компартментализации, ингибирования, синтеза специфичных форм и их соотношения) и ряда других свойств. Таким образом, исследования структуры,

94свойств и роли Ca -зависимых протеолитических ферментов в метаболизме беспозвоночных и рыб представляют несомненный интерес как в сравнительно-эволюционном, так и в физиолого-биохимическом и экологическом аспектах.

Задачи исследования:

2. Изучить общие и специфические особенности внутриклеточных Ca -зависимых протеиназ у рыб и беспозвоночных.

Положения, выносимые на защиту:

Научная новизна. Впервые исследован базовый уровень активности внутриклеточных Ca -зависимых протеиназ у ранее неизученных в этом отношении объектов — пресноводных беспозвоночных (кольчатых червей, ъ t насекомых, ракообразных, двустворчатых и брюхоногих моллюсков). На примере этих объектов выявлена зависимость уровня активности внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ от филогенетического положения. Впервые показано изменение уровня экспрессии гена кальпаин-подобной протеиназы в тканях беспозвоночных животных при антропогенном воздействии (при влиянии солей тяжелых металлов в аквариальном эксперименте). Показана роль исследуемых протеиназ в развитии ответной реакции водных беспозвоночных и рыб при воздействии некоторых антропогенных факторов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Значение результатов диссертационной работы для фундаментальной науки заключается в получении новых сведений о роли внутриклеточных Са2+-зависимых протеиназ в механизмах регуляции клеточного метаболизма у животных. Они могут послужить основой для дальнейших исследований протеиназ семейства кальпаинов и механизмов регуляции их активности в сравнительно-эволюционном и физиолого-биохимическом аспектах. Исследуемые показатели внутриклеточного Са2+-зависимого протеолиза у рыб и беспозвоночных могут быть использованы в качестве дополнительного биохимического критерия для оценки состояния организмов, обитающих в загрязненных водоемах. Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных курсах «Экологическая биохимия» и «Введение в энзимологию» для студентов биологических факультетов вузов.

2010. Water observation and information system for décision support» (Ohrid, Republic of Macedonia, 2010), III Международной конференции с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010), Международной школе-семинаре для молодых ученых «Биологические ресурсы Арктики и Субарктики -потенциал для биотехнологии: исследования и инновации» (Петрозаводск, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Канцерова, Надежда Павловна

выводы

1. Изученные свойства Са2+-зависимых протеиназ (чувствительность к Са2+, нейтральный рН оптимум и чувствительность к ингибиторам протеиназ цистеинового типа) исследованных видов беспозвоночных и рыб свидетельствуют о том, что эти ферменты относятся к цистеиновым прогеиназам семейства кальпаинов С2. Их свойства оказались сходными с таковыми у кальпаинов млекопитающих, что указывает на определенную эволюционную консервативность белков данного семейства.

2. Кальпаины исследованных рыб отличаются от кальпаин-подобных протеиназ беспозвоночных особенностями структуры (наличием малой субъединицы) и свойств (меньшей потребностью в Са2+ для активации, большей термостабильностью, нечувствительностью к ингибиторам протеиназ нецистеинового типа). Особенности выявленных характеристик кальпаинов рыб свидетельствуют об усложнении структуры и свойств ферментов и повышении возможностей более тонкой регуляции их активности.

3. Энзиматические свойства и уровень активности Са2+ -зависимых протеиназ цитозоля у исследованных беспозвоночных и рыб являются ткане- и видоспецифичными.

4. Уровень активности внутриклеточных Са -зависимых протеиназ у изученных беспозвоночных зависит от их филогенетического положения, у более примитивных организмов он выше.

5. Са2+-зависимые протеиназы участвуют в развитии ответной реакции у беспозвоночных и рыб при воздействии на них тяжелых металлов, компонентов нефти, отходов горно-обогатительного производства. Степень ответной реакции Са2+-зависимого протеолиза зависит от концентрации, времени воздействия и природы действующего вещества. Активность кальпаинов может изменяться не только на посттрансляционном уровне, но и на уровне экспрессии гена.

В заключение следует отметить, что выводы, сформулированные на основе экспериментальных результатов диссертационной работы, расширяют имеющиеся к настоящему времени в литературе представления об эколого-физиологических и сравнительно-эволюционных аспектах внутриклеточного протеолиза и о роли Са2+-зависимых протеиназ в механизмах биохимических адаптаций у так называемых «низших» организмов (рыб и беспозвоночных).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Канцерова, Надежда Павловна, Петрозаводск

1. Алабастер Дж., Ллойд Р. Критерии качества воды для пресноводных рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1984. 344 с.

2. Амелина B.C. Кислые нуклсазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов: Автореф. дис. . кандид. биол. наук. Петрозаводск. 2006. 25 с.

3. Андроников В.Б., Коротнева Н.В., Пашкова И.М. Содержание тяжелых металлов в различных тканях кальмара Illex illecebrosus II Экологическая химия. 2002. № 11(1). С. 40-44.

4. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука. 1983. 367 с.

5. Бондарева Л.А. Са2+-активируемые протеолитические ферменты у рыб и водных беспозвоночных // Вестник молодых ученых. Сер. Науки о жизни. 2002. Т. 4. № 1.С. 52-57.

6. Бондарева Л.А. Активность внутриклеточных протеолитических ферментов в мантии мидии Mytilus edulis L. при изменении солености среды // Вестник молодых ученых. Сер. Науки о жизни. 2004. Т. 2. № 1. С. 83-87.

7. Бондарева Л.А., Немова H.H. Молекулярная эволюция внутриклеточных Са2+ -зависимых протеиназ // Биоорганическая химия. 2008. Т.34. № 3. С. 295302.1. У I

8. Бондарева Л.А., Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И. Внутриклеточная Ca -зависимая протеолитическая система животных. М.: Наука. 2006. 294 с.

9. Бондарева Л.А., Немова H.H., Кяйвяряйнен E.H., Крупнова М.Ю., Осташкова В.В. Влияние пищевой интоксикации солями ртути на активностьцистеиновых протеиназ в тканях крыс // Известия АН. Сер. биол. 2003b. № 1. С. 37-40.

10. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // СОЖ. 1998. №5. С. 238.

11. Ведемейер Г.А., Мейер Ф.П., Смит J1. Стресс и болезни рыб. М.: Пищ. пром-сть. 1981. 127 с.

12. Веселов Е.А. Классификация сточных вод и их компонентов по их действию на водоемы и водные организмы. В кн.: Критерий токсичности и принципы методик по водной токсикологии. М., 1971.

13. Воробьев Д.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на макрозообентос // Известия Томского политехнического университета. 2006. Т. 309. № 3. С. 4245.

14. Воробьев В.И., Самилкин Н.С. Микроэлементы у растительноядных рыб. В сб.: Роль микроэлементов в жизни водоемов. М., 1980. С. 24-49.

15. Генгин М.Т., Панченко Л.Ф., Митюшина Н.В., Фирстова Н.В. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в молекулярных механизмах развития стресс-реакции // Нейрохимия. 2000. № 2. С. 83-92.

16. Губанов В.И., Болтачев А.Р., Копытов Ю.П. Состояние загрязнения донных отложений Феодосийского залива нефтяными углеводородами и тяжелыми металлами // Экология моря. 2008. Вып. 75. С. 89-93.

17. Довженко Н.В., Куриленко A.B., Бельчева H.H., Челомин В.П. Окислительный стресс, индуцируемый кадмием, в тканях двустворчатого моллюска Modiolus modiolus // Биология моря. 2005. Т. 31. № 5. С. 358-362.

18. Дорохова И.И. Экологические особенности содержания модифицированных форм сывороточных белков у массовых видов рыб Черного моря // Рыб. хоз-во Украины. 2006. № 3/4. С. 27-30.

19. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир. 1976. 364 с.

20. Егоров H.H., Шипулин Ю.К. Особенности загрязнения природных вод и грунтов нефтепродуктами // Водные ресурсы. 1998. Т. 25. № 5. С. 598-602.

21. Ивантер Э.В., Медведев Н.В. Экологическая токсикология природных популяций птиц и млекопитающих Севера. М.: Наука. 2007. 229 с.

22. Ивантер Э.В., Моисеева В.П., Моисеева Е.А. Экологический мониторинг сточных вод сульфат-целлюлозного производства: опыт водно-токсикологического биотестирования. Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ. 2007. 270 с.

23. Калугина A.A., Миловидова Н.Ю., Свиридова Т.В., Уральская И.В. О влиянии загрязнений на морские организмы Новороссийской бухты Черного моря // Гидробиологический журнал. 1967. № 1. С. 47-53.

24. Карпенко М.Н. Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс): Автореф. дис. . кандид. биол. наук. СПб. 2009. 22 с.

25. Кашулин H.A. Ихтиологические основы биоиндикации загрязнения среды тяжелыми металлами: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Петрозаводск. 2000. 42 с.

26. Кизеветтер И.В. Биохимия сырья водного происхождения. М.: Пищевая промышленность. 1973. 216 с.

27. Ковальский В.В. Геохимическая экология. М.: Наука. 1974. 269 с.

28. Константинов A.C. Общая гидробиология. М.: Высшая школа. 1986. 472 с.

29. Коновалов Ю.Д. Реакция белоксинтезирующей системы рыб на наличие в их организме катионов ртути, кадмия, меди и цинка // Гидробиол. ж. 2001. Т.37. №1. С.95-105.*

30. Королева И.М. Влияние загрязнения на морфофизиологические показатели сигов (Coregonus lavaretus) в водоемах Кольского Севера. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Петрозаводск. 2001. 27 с.

31. Коросов A.B., Горбач В.В. Компьютерная обработка биологических данных. Петрозаводск. Изд-во ПетрГУ. 2007. 76 с.

32. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Л.: Наука. 1981. 339 с.

33. Лав М. Химическая биология рыб. М.: Пищ. пром-сть. 1976. 349 с.

34. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Л.: Гидрометеоиздат., 1986. 270 с.

35. Локшина Л.А. Кальций-активируемые нейтральные протеиназы и их регуляторная роль // Вестн АМН СССР. 1986. Т.59. №8. С. 59-68.

36. Миловидова Н.Ю. Действие нефти на некоторых прибрежных ракообразных Черного моря // Гидробиологический журнал. 1974. № 4. С. 96-100.

37. Миронова О.Г. Некоторые направления исследований в морской водной токсикологии. В кн.: Проблемы водной токсикологии. Петрозаводск. 1975. с. 14.

38. Моисеенко Т.И. Теоретические основы нормирования анропогенных нагрузок на водоемы Субарктики. Изд. Кольский НЦ РАН. Апатиты. 1997. 262 с.

39. Моисеенко Т.И. Экотоксикологический подход к определению критических нагрузок на водные экосистемы. Тез. докл. Всерос. конф. "Современные проблемы водной токсикологии". Борок, 2002. с. 149.

40. Моисеенко Т.И. Водная экотоксикология: теоретические и прикладные аспекты. М.: Наука. 2009. 400 с.

41. Моисеенко Т.И., Кудрявцева Л.П., Ганшина Л.А. Рассеянные элементы в поверхностных водах суши. М.: Наука. 2006. 261 с.

42. Моисеенко Т.И., Лукин A.A. Патологии рыб в загрязняемых водоемах Субарктики и их диагностика // Вопросы ихтиологии. 1999. № 4. С. 535-547.л %

43. Моисеенко Т.И., Лукин A.A., Шарова Ю.Н., Королева И.Н. Рыбная часть сообщества в изменяющихся условиях обитания // Антропогенные модификации экосистемы озера Имандра. М.: Наука. 2002. С. 294-390.

44. Морозов Н.В., Николаев В.Н. Влияние условий среды на развитие нефтеразлагающих микроорганизмов // Гидробиологический журнал. 1978. Т. 14. №4. С. 55-61.

45. Мур Дж. В., Рамамурти С. Тяжелые металлы в природных водах. М.: Мир. 1987. 287 с.

46. Мухин В.А., Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова М.Ю., Оганесян С.А. Кальцийактивируемая протеиназа в половых гаметах морского зеленого ежа (Strongylocentrotus droebachiensis) II Журн. эволюц. биохим. физиол. 2000. Т. 36. С. 3-6.

47. Наточин Ю.В., Михайлова О.Ю., Лаврова Е.А., Хлебович В.В. Содержание воды и электролитов в клетках аддуктора мидии Mytilus edulis в широком диапазоне солености морской воды // Биология моря. 1979. Т. 4. С. 54-60.

48. Немова H.H. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. Петрозаводск: изд-во КНЦ РАН, 1996. 104 с.

49. Немова H.H. Биохимические эффекты накопления ртути у рыб. М.: Наука. 2005. 164 с.

50. Немова H.H., Бондарева Л.А. Протеолитические ферменты: учебное пособие. Петрозаводск.: КНЦ РАН. 2005. 92 с.

51. Немова H.H., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука. 2004.215 с.

52. Немова H.H., Сидоров B.C., Григорьева JI.И., Валуева Т.А., Мосолов В.В., Кяйвяряйнен Е.И., Лукьяненко В.И. Внутриклеточные протеиназы в органах русского осетра Acipenser gueldenstaedti при расслоении мышц // Вопр ихтиол. 1992. Т. 32. № 5. С. 57-62.

53. Нефедова З.А., Руоколайнен Т.Р., Васильева О.Б., Немова H.H., Шарова Ю.Н. Особенности состава тканевых липидов сигов (Coregonus lavaretus L.), обитающих в водоемах с разной антропогенной нагрузкой // Вопр. ихтиологии. 2007. Т. 47. № 1. С. 107-112.

54. Никольский Г.В. Частная ихтиология. М.: Советская наука. 1950. 431 с. 62.0зернюк Н.Д. Феноменология и механизмы адаптационных процессов. М.:1. Наука. 2003.215 с.

55. Оноприенко М.Г. Вода питьевая и здоровье. Сочи: РИО СГУТ И КД. 2002. 63 с.

56. Остроумова И.Н. Биологические основы кормления рыб. СПб: ГосНИОРХ. 2001.372 с.

57. Патин С.А. Экологические проблемы освоения нефтегазовых ресурсов морского шельфа. М.: ВНИРО. 1997. 340 с.

58. Патин С.А. Антропогенное воздействие на морскую среду и биоресурсы: Методология оценок // Антропогенное воздействие на водные экосистемы. М.: Изд-во МГУ. 2005. С. 32-60.

59. Патин С.А., Морозов Н.П. Микроэлементы в морских организмах и экосистемах. М., 1981. 153 с.

60. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука. 2000. 830 с.

61. Подгурская О.В., Кавун В.Я., Лукьянова О.Н. Аккумуляция и распределение тяжелых металлов в органах мидии Crenomytilus grayanus из районов апвеленгов Охотского и Японского морей // Биология моря. 2004. Т.30. №3. С. 219-226.

62. Правдин И.Ф. Руководство по изучению рыб. М. 1966. 376 с.4» *

63. Проссер Л., Браун Ф. Сравнительная физиология животных. М.: Мир. 1967. 766 с.

64. Родюшкин И.В. Формы нахождения тяжелых металлов в воде озера Имандра. В ich.: Проблемы химического и биологического мониторинга экологического состояния водных объектов Кольского Севера. Апатиты: Изд-во Кольск. НЦ РАН. 1995. С. 55-63.

65. Роева H.H., Сидоров A.B., Юровицкий Ю.Г. Металлотионеины белки, связывающие тяжелые металлы у рыб // Изв. РАН. Сер. Биол. 1999. № 6. С. 748-755.

66. Руднева И.И. Влияние антропогенного загрязнения на биохимические показатели черноморских рыб // Современное состояние ихтиофауны Черного моря. Севастополь. 1995. С. 168-188.

67. Сейсума З.К. и др. Тяжелые металлы в гидробионтах Рижского залива. Рига, 1984. 179 с.

68. Смирнов Л.П., Богдан В.В. Липиды в физиолого-биохимических адаптациях эктотермных организмов к абиотическим и биотическим факторам среды. М.: Наука. 2007. 182 с.

69. Сохина Л.И., Щербаков О.Н. Особенности деструкции нефти в прибрежных районах Баренцева моря // Мониторинг окружающей среды в условиях Крайнего Севера/Под ред. В.В. Крючкова. Мурманск. 1984. С. 15—16.

70. Степанов В.М. Протеолитические ферменты и проблемы их эволюции // Материалы 50-х Баховских чтений. М., 1994. С. 112-114.

71. Столяр О.Б., Курант В.З., Хоменчук В.А., Грубинко В.В. Характеристика низкомолекулярных серосодержащих соединений гепатопанкреаса карпа при интоксикации Си и Zn // Гидробиологический журнал. 2003. Т. 39. № 4. С. 91-98.

72. Таможняя В.А., Горомосова С.А. Биохимические показатели метаболизма мидий при действии на них токсинов // Экология моря. 1985. Вып. 16. С. 64 -68.

73. Трахтенберг И.М., Колесников B.C., Луковенко В.П. Тяжелые металлы во внешней среде. Минск. 1994. с. 10-13.

74. Физиолого-биохимический статус волго-каспийских осетровых в норме и при расслоении мышечной ткани (кумулятивный политоксикоз). Отв. ред. Лукьяненко ВИ. Рыбинск: Ин-т биологии внутр. вод АН СССР, 1990. 262 с.

75. Фокина H.H., Нефедова З.А., Немова H.H. Липидный состав мидий Mytilus edulis L. Белого моря. Влияние некоторых факторов среды обитания. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 2010. 243 с.

76. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адатации. М.: Мир. 1977. 398 с.

77. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адатация. М.: Мир. 1988. 568 с. 88.Челомин В.П., Бельчева H.H., Захарцев М.В. Биохимические адаптациимидии Mytilus trossulus к ионам кадмия и меди // Биология моря. 1998. Т. 24. №5. С. 319-325.

78. Челомин В.П. Экологические аспекты биоаккумуляции кадмия (на примере морских двустворчатых моллюсков) Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Владивосток. 1998. 47 с. 90.Чугунова Н.И. Методика изучения возраста и роста рыб. М. 1956. 234 с.

79. Шарова И.Х. Зоология беспозвоночных. М.: Владос. 2002. 592 с.

80. Шафран Л.М., Большой Д.В., Пыхтеева Е.Г., Третьякова Е.В. Роль лизосом в механизме защиты и повреждения клеток при действии тяжёлых металлов // Современные проблемы токсикологии. 2004. № 3. С. 17-24.

81. Шведов В.Л. Биологические эффекты острого, внешнего или внутреннего воздействия на крыс в рамках стронциевой интоксикации // Биология и радиоэкология. 1997. Т. 5. № 37. С. 750-755.

82. Шкорбатов Г.Л. Основные черты адаптации биологических систем // Журн. общ. биологии. 1971. Т. 32. №2. С. 131-142.

83. Яковлев В.А. Воздействие тяжелых металлов на пресноводный зообентос: 2. Последствия для сообществ // Экологическая химия. 2002. Т. 11(2). С. 117132.

84. Ярославцева Л.М., Сергеева Э.П. Влияние ионов меди на ранние стадии развития тихоокеанской мидии Mytilus trossulus (Bivalvia) // Биология моря. 2005. Т. 31. №4. С. 267-273.

85. Ярославцева Л.М., Сергеева Э.П. Влияние температуры на раннее развитие тихоокеанской мидии Mytilus trossulus (Bivalvia) при загрязнении морской воды ионами меди // Биология моря. 2007. Т. 33. № 6. С. 417-422.

86. Andresen К., Tom T.D.T., Strand М. Characterization of cDNA clones encoding a novel calcium-activated neutral proteinase from Schistosoma mansoni II J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 15085-15090.

87. Andersson Т., Forlin L., Hardig J., Larsson A. Physiological disturbance in fish living in coastal water polluted with bleached kraft mill effluents // Canad. J. Fish and Aquat. Sci. 1988. V. 45. P. 1525-1536.

88. Aoki K., Imajoh S., Ohno S., Emori Y., Koike M., Kosaki G., Suzuki K.1. О A

89. Complete amino acid sequence of the large subunit of the low-Ca -requiring form of human Ca2+-activated neutral protease (p-CANP) deduced from its cDNA sequence//FEBS Lett. 1986. V. 205. P.313-317.

90. Arthur J.S.C., Elce J.S., Ilegadorn C., Williams K., Greer P.A. Disruption of the murine calpain SC subunit gene, Capn4\ Calpain is essential for embryonic development but not for cell growth and division // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P.4474-4481.

91. Azam M., Andrabi S.S., Sahr K.E., Kamath L., Kuliopulos A., Chishti A.H. Disruption of the mouse p-calpain gene reveals an essential role in platelet function// Cell Biol. 2001. V. 21. P. 2213-2220.

92. Bakhmet I.N., Fokina N.N., Nefedova Z.A., Nemova N.N. Physiological-biochemical properties of blue mussel Mytilus edulis adaptation to oil contamination // Environ. Monit. Assess. 2009. V. 155. P. 581-591.

93. Barnes T.M., Hodgkin J. The tra-3 sex determination gene of Caenorhabditis elegans encodes a member of the calpain regulatory protease family //EMBO J. 1996. V. 15. P. 4477-4484.л

94. Bayne B.L., Widdows J., Moore M.N., Salkeld P., Worrall C.M., Donkin P. Some ecological consequences of the physiological and biochemical effects of petroleum compounds on marine mollusks // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1982. V. 297. P. 219-329.

95. Bebianno M.J., Serafim M.A. Comparison of metallothionein induction in response to cadmium in the gills of the bivalve molluscs Mytilus galloprovincialis and Ruditapes decussates I I The Science of the Total Environment. 1998. V. 214. P. 123-131.

96. Benyamin Y. The structural basis of calpain behavior // FEBS J. 2006. V. 273. № 15. P. 3413-3414.

97. Bertin G., Averbeck D. Cadmium: cellular effects, modifications of biomolecules, modulation of DNA repair and genotoxic consequences (a review) // Biochimie. 2006. V. 88. P. 1549-1559

98. Beyette J.R., Emori Y., Mykles D.L. Immunological analysis of two calpain-like Ca -dependent proteinases from lobster striated muscles: relationship to mammalian and Drosophila calpains // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 337. P. 232-238.

99. Beyette J.R., Ma J.S., Mykles D.L. Purification and autolytic degradation of a calpain-like calcium-dependent proteinase from lobster (Homarus americanus) striated muscles // Comp. Biochem. Physiol. Biochem. 1993. V. 104. P. 95-99.

100. Beyette J.R., Mykles D.L. Autolysis and biochemical properties of a lobster muscle calpain-like proteinase // J. Exp. Zool. 1997. V. 277. P. 106-119.

101. Blazevich A.J., Sharp N.C. Understanding muscle architectural adaptation: macro- and micro-level research // Cells Tissues Organs. 2005. V. 181(1). P. 1-10.

102. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

103. Bury N. R., Walker P. A., Glover Ch. N. Nutritive metal uptake in teleost fish // J. Exp. Biol. 2003. V. 206. P. 11-23.

104. C. Elegans Consortium. Genome sequence of the nematode, C. elegans: a platform for investigating biology // Science. 1998. V. 282. P. 2012-2046.

105. Campbell P.J., Stokes P.M. Acidification and toxicity of metals to aquatic biota// Fish and Aquat. Sci. 1985. V. 42. № 12. P. 2034-2049.

106. Carragher N.O., Frame M.C. Calpain: a role in cell transformation and migration // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2002. V. 34(12). P. 1539-1543.

107. Carvalho C.S., Fernandes M.N. Effect of temperature on copper toxicity and hematological responses in the neotropical fish Prochilodus scrofa at low and high pH // Aquaculture. 2006. V. 251. P. 109-117.

108. Cheret R., Delbarre-Ladrat C., Lamballerie-Anton M., Verrez-Bagnis V. High-pressure effects on the proteolytic enzymes of sea bass (Dicentrarchus labrax L.) fillets // J. Agric. Food. Chem. 2005. V. 53(10). P.3969-3973.

109. Cheret R., Delbarre-Ladrat C., Lamballerie-Anton M., Verrez-Bagnis V. Calpain and cathepsin activities in post mortem fish and meat muscles // Food Chemistry. 2007. V. 101. P. 1474-1479.

110. Chowdhuury M., Blust R. Effect of temperature on uptake of waterborne strontium in common carp, Ciprinus carpio (L.) // Aquat. Tox. V. 54. P. 151-160.

111. Chowdhuury M., Van Ginneken L., Blust R. Kinetics of waterborne strontium uptake in common carp, Ciprinus carpio (L.) at different calcium level // Environ. Toxicol. Chem. 2000. V. 19. P. 622-630.

112. Combaret L., Taillander D., Voisin L., Samuels S.E., Boespflug-Tanguy O., Attaix D. No alteration in gene expression of the ubiquitinproteosome proteolytic pathway in dystrophin-deficient muscles //FEBS Lett. 1996. V. 393. P. 292-296.

113. Cong J.Y., Goll D.E., Peterson A.M., Kapprell H.P. The role of autolysis in activity of the Ca -dependent proteinases (p-calpain and m-calpain) // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. № 17. P. 10096-10103.

114. Cong J., Thompson V.F., Goll D.E. Phosphorylation of the Calpains (Abstract) // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11. P. 386.

115. Coolican S.A., Hathaway D.R. Effect of L-a-phosphatidylinositol on a vascular smooth muscle Ca2+-dependent protease // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 11627-11630.

116. Cottin P., Brustis J.J., Poussard S., Elamrani N., Broncard S., Ducastaing A. Ca -dependent proteinases (calpains) and muscle cell differentiation // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1223. № 2. P. 170-178.

117. Covington M.D., Arrington D.D., Schnellmann R.G. Calpain 10 is required for cell viability and is decreased in the aging kidney // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2009. V. 296. P. F478-F486.

118. Crawford C. Protein and peptide inhibitors of calpains. In: Intra-cellular Calcium-Dependent Proteolysis. Boca Raton, FL: CRC.1990. P. 75-89.

119. Croall D.E., Chacko S., Wang Z. Cleavage of caldesmin by calpain: substrate recognition is not dependent on calmodulin binding domains // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1298. P. 276-284.

120. Croall D.E., DeMartino G.N. Calcium-activated neutral protease (calpain) systems structure, function, and regulation // Physiol. Rev. 1991. V. 71. P. 813— 847.

121. Croall D.E., Ersfeld K. The calpains: modular designs and functional diversity // Genome Biology. 2007. V. 8. P. 218.

122. Culotta V.C., Gitlin J.D. Disorders of copper transport // The molecular and metabolic basis of inherited disease // Ed. A.L. Scriver et al. Wash.: McGraw-Hill. 1999. P. 210-221.

123. Dare E., Gotz M.E., Zhivotovsky B., Manzo L., Ceccatelli S. Antioxidants J811 and 17beta-estradiol protect cerebellar granule cells from methylmercury-induced apoptotic cell death // J. Neurosci. Res. 2000. V. 62(4). P. 557-565.

124. Dayton W.R., Goll D.E., Stromer M.H., Reville W.J., Zeece M.G., Robson94

125. R.M. Some properties of a Ca -activated protease that may be involved in myofibrillar protein turnover. In: Cold Spring Harbor Conferences on Cell Proliferation. Proteases and Biological Control, edited by Reich E., Rifkin D.B.,

126. Shaw E. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. 1975. V.2. P.551-577.

127. Dayton W.R., Goll D.E., Zeece M.G., Robson R.M., Reville W.J. A Ca2+-activated protease possibly involved in myofibrillar protein turnover. Purification from porcine muscle//Biochemistry. 1976. V. 15. P. 2150-2158.

128. De Pirro M., Chelazzi G., Borghini F., Focardi S. Variations in cardiac activity following acute exposure to copper in three co-occuring but differently zoned Mediterranean limpets // Marine Pollution Bulletin. 2001. V. 42. P. 13901396.

129. De Pirro M., Marshall DJ. Phylogenetic differences in cardiac activity, metal accumulation and mortality of limpets exposed to copper: a prosobranch-pulmonate comparison // Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 2005. V. 322. P. 29-37.

130. Dear T.N., Boehm T. Diverse mRNA expression patterns of the mouse calpain genes Capn5, Capn6, and Capn 11 during development // Mech. Dev. 1999. V. 89. P. 201-209.

131. Dear T.N., Boehm T. Identification and characterization of two novel calpain large subunit genes. Gene. 2001. V. 274. P.245-252.

132. Dear T.N., Matena K., Vingron M., Boehm T. A new subfamily of vertebrate calpains lacking a calmodulin-like domain: implications for calpain regulation and evolution // Genomics. 1997. V. 45. P. 175-184.

133. Denison S.H., Orejas M., Arst H.N. Sygnaling of ambient pH in Aspergillus involves a cysteine protease // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28519-28522.

134. Devay P., Pinter M., Kiss I., Farago A., Friedrich P. Protein kinase C in larval brain of wild-type and dunce memory-mutant Drosophila // J. Neurogenet. 1989. V. 5. P. 119-126.

135. Dinnel P.A., Link J.M., Stober QJ. Comparative sensitivity of sea urchin sperm cell bioassay to metals and pesticides // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1989. V. 18. P. 748-755.

136. Dunn M.A., Blalock T.L., Cousins R.J. Metallothionein // Proc. Soc. Experim. Biol. Med. 1987. V. 185. P. 107-119.

137. Dutt P., Croall D.E., Arthur J.S.C., DeVeyra T., Williams K„ Elce J.S., Greer P.A. m-Calpain is required for preimplantation embryonic development in mice // BMC Dev. Biol. 2006. V. 6. P. 3.

138. Emori Y., Kawasaki H., Imajoh S., Kawashima S., Suzuki K. Isolation and sequence analysis of cDNA clones for the SC subunit of rabbit calcium-dependent protease//J. Biol. Chem. 1986. V.261. P.9472-9476.

139. Emori Y., Saigo K. Calpain localization changes in coordination with actin-related cytoskeletal changes during early embryonic development of Drosophila II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 25137-25142.

140. Enns D.L., Belcastro A.N. Early activation and redistribution of calpain activity in skeletal muscle during hindlimb unweighting and reweighting // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2006. V. 84. P. 601-609.

141. Erk M., Ruus A., Ingebrigtsen K., Hylland K. Cadmium accumulation and Cd-binding proteins in marine invertebrates a radiotracer study // Chemosphere. 2005. V. 61. P. 1651-1664.

142. Ersfeld K., Barraclough H., Gull K. Evolutionary relationships and protein domain architecture in an expanded calpain superfamily in kinetoplastid parasites // J. Mol. Evol. 2005. V. 61(6). P.742—757.

143. Everaart J.M. Uptake and release of cadmium in various organs of the common mussel Mytilus edulis // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1990. V. 45. P. 560-567.

144. Frantz T., Vingron M., Boehm T., Dear T.N. Capn7: a highly divergent vertebrate calpain with a novel C-terminal domain // Mamm. Genome. 1999. V. 10(3). P.318-321.

145. Futai E., Kubo T., Sorimachi H., Suzuki K., Maeda T. Molecular cloning of PalB, a mammalian homologue of the Aspergillus atypical calpain PalB // Biochim Biophys Acta. 2001. V. 1517. P. 316-319.

146. Futai E., Maeda T., Sorimachi H., Kitamoto K., Ishiura S., Suzuki K. The protease activity of a calpain-like cysteine protease in Saccharomyces cerevisiae is required for alkaline adaptation and sporulation // Mol. Gen. Genet. 1999. V. 260. P.559-568.

147. Gaitanaki C., Papazafiri P., Beis I. The calpain-calpastatin system and the calcium paradox in the isolated perfused pigeon heart // Cell. Physiol. Biochem. 2003. V. 13(3). P. 173-180.

148. Gautheier E., Fortier I., Courchesne F. Aluminium form in drinking water and risk of Alzheimer's disease // Environ. Res. 2000. V. 84. P. 234-246.

149. Geesink G.H., Morton J.D., Kent M.P., Bickerstaffe R. Parial purification and characterization of Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) calpains and an evaluation of their rolein postmortem proteolysis // J. Food. Sci. 2000. V. 65. P. 1318-1324.

150. Geesink G.H., Nonneman D., Koohmaraie M. An improved purification protocol for heart and skeletal muscle calpastatin reveals two isoforms resulting from alternative splicing // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 356. P. 19-24.

151. Gewurtz S.B., Drouillard K.G., Lazar R., Haffner G.D. Quantitative biomonitoring of PAH's using the Barnes mussel (Elliptio complanata) // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002. V. 43. P. 497-504.

152. Goll D.E., Dayton W.R., Singh I., Robson R.M. Studies of the a-actinin/actin interaction in the Z-disk by using calpain // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 8501-8510.

153. Goll D.E., Thompson V.F., Li H., Wei W., Cong J. The calpain system. Physiol Rev. 2003. V. 83. № 3. P. 731-801.

154. Goll D.E., Thompson V.F., Taylor R.G., Zalewska T. Is calpain activity regulated by membranes and autolysis or by calcium and calpastatin? // Bioessays. 1992. V.14. P. 549-556.

155. Hajimohammadreza I., Raser K.J., Nath R., Nadimpalli R., Scott M., Wang K.K.W. Neuronal nitric oxide synthase and calmodulin-dependent protein kinase Il(alpha) undergo neurotoxin-induced proteolysis // J. Neurochem. 1997. V. 69. P. 1006-1013.

156. Hames B.D. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In: Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach. Hames, B.D. and Rickwood, D. (eds.). Oxford, U.K.: IRL Press. 1990. P 1-147.

157. Hatzizisis D., Gaitanaki C., Beis I. Purification and properties of a calpain II-like proteinase from Octopus vulgaris arm muscle // J. Сотр. Biochem. Physiol. 1996. V. 113B. №2. P. 295-303.

158. Hatzizisis D., Gaitanaki C., Beis I. Degradation of myofibrillar proteins by a calpain-like proteinase in the arm muscle of Octopus vulgaris II J. Сотр. Physiol. 2000. B. 170(5-6). P. 447-456.

159. Heath A. Water pollution and fish physiology. L.: Lewis Publ., 2002. 506 p.

160. Hemelraad J., Holwerda D., Herurg H. Effect of cadmium in freshwater dams. Interaction with energy metabolism in Anodonta cygnea // Arch. Environ. Contam. and Toxicol. 1990. V. 19. P. 699-703.

161. Hollis L., McGeer J.C., McDonald D.G., Wood C.M. Protective effects of calcium against chronic waterborne cadmium exposure to juvenile rainbow trout // Environ, and Toxicol.Chem. 2000. V. 19. P. 2725-2734.

162. Hosfield C.M., Elce J.S., Davies P.L., Jia Z. Crystal structure of calpain94reveals the structural basis for Ca -dependent protease activity and a novel mode of enzyme activation // EMBO J. 1999. V.18. P. 6880-6889.

163. Hughes G.M. The dimensions of fish gills in relation to their function // J. Exp. Biol. 1966. V. 45. P. 177-195.

164. Ikavalko J. Effects of oil spills on Arctic marine ecosystems 2005 .www.arcop.fi/reports/D4232.pdf

165. Imajoh S., Kawasaki H., Suzuki K. The amino-terminal hydrophobic region of the SC subunit of calcium-activated neutral protease (CANP) is essential for its activation by phosphatidylinositol // J. Biochem. 1986. V. 99. P. 1281-1284.

166. James M.O. Biotransformation and disposition of PAH in aquatic invertebrates. In: Varanasi U (ed) Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons in the aquatic environment. CRC, Boca Raton, FL. 1989. 69 p.

167. Jekely G., Friedrich P. The evolution of the calpain family as reflected in paralogous chromosome regions // J. Mol. Evol. 1999. V. 49(2). P. 272-281.

168. Jiang S.-T., Wang J.-H., Chen C.-S. Purification and some properties of calpain II from Tilapia muscle (Tilapia niloticaxTilapia aurea) // J. Agric. Food. Chem. 1991. V. 39. P. 237-241.л *

169. Jiang S.-T., Wang J.-H., Chen W.-S., Su J.-C. Substrate and calcium cffects on the autolysis of Tilapia muscle m-calpain // Biosci. Biolechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 119-120.

170. Johnson P. Calpains (intracellular calcium-activated cysteine proteinases): structure activity relationships and involvement in normal and abnormal cellular metabolism // Int. J. Biochem. 1990. V. 22(8). P. 811-822.

171. Kaivarainen, E., Nemova, N., Krupnova, M., Bondareva, L.: The effect of toxic factors on intracellular proteinase activity in freshwater fish. Acta vet. Brno 67. 1998. P. 306-316.

172. Kamunde C., Grosell M., Higgs D., Wood Ch. M. Copper metabolism in actively growing rainbow trout (Oncorhynchus my kiss): interactions between dietary and waterborne copper uptake I I J. Exp. Biol. 2002. V. 205. P. 279-290.

173. Kapprell H-P., Goll D.E. Effect of Ca2+ on binding of the calpains to calpastatin //J. Biol. Chem. 1989. V. 264(30). P. 17888-17896.

174. Kaur A., Gill K.D. Disruption of neuronal calcium homeostasis after chronic aluminium toxicity in rats // Basic. Clin. Pharmacol. Toxicol. 2005. V. 96(2). P. 118-122.

175. Kidd V.J., Lahti J.M., Teitz T. Proteolytic regulation of apoptosis // Cell. Dev. Biol. 2000. V. 11. P. 191-201.

176. Kim H.W., Chang E.S., Mykles D.L. Three calpains and ecdysone receptor in the land crab Gecarcinus lateralis: sequences, expression and effects of elevated ecdysteroid induced by eyestalk ablation // J. Exp. Biol. 2005. 208(Pt 16). P. 3177-3197.

177. Kirschner M. Intracellular proteolysis // TCB. 2000. V. 9. №. 12. P. M42-M45.

178. Kishimoto A., Mikawa K., Hashimoto K., Yasuka I., Tanaka S., Tominaga M., Kuroda T., Nishimura Y. Limited proteolysis of protein kinase C subspeciesby calcium-dependent neutral protease (Calpain) // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 4088-4092.

179. Kozuch J., Pempkowiak J. Molecular weight of humic acids as a major property of the substances influencing the accumulation rate of cadmium by a Mytilus edulis L // Environment International. 1996. V. 22. P. 585-589.

180. Kulkarni S., Saido T.C., Suzuki K., Fox J.E.B. Calpain mediates integrin-induced signaling at a point upstream of Rho family members // J. Biol. Chem.1999. V. 274. P.21265-21275.

181. Kumamoto T., Kleese W.C., Cong J., Goll D.E., Pierce P.R., Allen R.E. Localization of the Ca2+-dependent proteinases and their inhibitor in normal, fasted, and denervated rat skeletal muscle // Anat Rec. 1992. V. 232. P. 60-77.

182. Kunimatsu M., Higashiyama S., Sato K., Ohkuho I., Sasaki M. Calcium dependent cysteine proteinase is a precursor of a chemotactic factor for neutrophils //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 164. P. 875-882.

183. Ladrat C., Chaplet M., Verrez-Bagnis V., Noel J., Fleurence J. Neutral calcium-activated proteases from European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) muscle: polymorphisms and biochemical studies // Comp. Biochem. Physiol.2000. V. 125. P. 83-95.

184. Ladrat C., Verraz-Bagnis V., Noel J., Fleurence J. Milli-calpain from sea bass (Dicentrarchus labrax) white muscle: purification, characterization of its activity and activation in vitro // Mar. Biotechnol. 2002. V. 4. P.51-62.

185. Laemmli U.K. Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

186. Lares M.L., Rivero L.E., Huerta-Diaz M.A. Cd concentration in the soft tissue vs. the nacreous layer of Mytilus californianus // Marine Pollution Bulletin. 2005. V. 50. P. 1373-1381.

187. Laskowski R., Hopkin S. Accumulation of Zn, Cu, Pb and Cd in the garden snail (Helix aspera): implications for predators // Environ. Pollution. 1996. V. 91. №3. P.289-297.

188. Laurent T.S., Killander J.A. A theory of gel filtration and its experimental verification // J. Chromatogr. 1964. V. 14. p. 317.

189. Laval M., Pascal M. A calpain-like activity insensitive to calpastatin in Drosophila melanogaster U Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1570. P.121-128.

190. Leavitt D.F., Lancaster B.A., Lancaster A.S., McDowell Capuzzo J. Changes in the biochemical composition of a subtropical bivalve, Area Zebra, in response to contaminant gradients in Bermuda // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1990. V. 138. P. 85-98.

191. Lee W-K, The'venod F. Novel roles for ceramides, calpains and caspases in kidney proximal tubule cell apoptosis: Lessons from in vitro cadmium toxicity studies //Biochemical pharmacology. 2008. V. 76. P. 1323- 1332.

192. Lepage S.E., Bruce A.E.E. Characterization and comparative expression of zebrafish calpain system genes during early development // Developmental Dynamics. 2008. V. 237. P.819-829.

193. Lindesjoo E., Thulin J., Bengtsson B.E. Abnormalities of a gill cover bone, the operculum, in perch Perca fluviatilis from a pulp mill effluent area // Aquat. Toxicol. 1994. V. 28. P. 189-207.

194. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2"AACT Method // Methods. 2001. V. 25. P. 402^108.

195. Lynch G. Memory and the brain: unexpected chemistries and a new pharmacology //Neurobiol Learning Memory. 1998. V. 70. P.82-100.

196. Ma H., Nakajima E., Shih M., Azuma M., Shearer T.R. Expression of calpain small subunit 2 in mammalian tissues // Curr. Eye. Res. 2004. V. 29(4-5). P.337-347.

197. Maeda O., Ojima T., Nishita K. Calpain II-like proteinase of scallop {Patinopecten yessoensis) striated adductor muscle // Comp. Biochem. Physiol. 1992a. B102. P. 149-153.

198. Maeda O., Ojima T., Nishita K. Comparative studies on heart stability and autolysis of scallop {Patinopecten yessoensis) calpain II-like proteinase and rabbit calpain II // Comp. Biochem. Physiol. 1992b. B102. P. 155-157.

199. Mageau C., Engelhardt F.R., Gilfillan E.S., Boehm P.D. Effects of short-term exposure to dispersed oil in arctic invertebrates // Arctic. 1987. V. 40. P. 162

200. Maki M., Kitaura Y., Satoh H., Ohkouchi S., Shibata H. Structures,94functions and molecular evolution of the penta-EF-hand Ca -binding proteins // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1600(1-2). P.51-60.

201. Matena K., Boehm T., Dear T.N. Genomic organization of mouse CAPN5 and CAPN6 genes confirms that they are a distinct calpain family // Genomics. 1998. V.48.P. 117-120.

202. Mattson J.M., Mykles D.L. Differential degradation of myofibrillar proteins by four calcium-dependent proteinase activities from lobster muscle // J. Exp. Zool. 1993. V. 265. P. 97-106.

203. Medler S., Chang E. S., Mykles D. Muscle-specific calpain is localized in regions near motor endplates in differentiating lobster claw muscles // Comp. Biochem. Physiol. 2007. V. 148. P. 591-598.

204. Mellgren R.L., Mericle M.J., Lane R.D. Proteolysis of the calcium-dependent protease inhibitor by myocardial calcium-dependent protease // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 246. P. 233-239.

205. Mellgren R.L., Song K., Mericle M.T. m-Calpain requires DNA for activity on nuclear proteins at low calcium concentrations // J. Biol. Chem. 1993. V. 268(1). P. 653-657.

206. Melloni E., Minafra R., Salamino F., Pontremoli S. Properties and intracellular localization of calpain activator protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 272(2). P. 472^176.

207. Mitch W.E., Goldberg A.L. Mechanisms of muscle wasting. The role of ubiquitin-proteasome pathway // Mechanisms of Desease. 1996. V. 335(25). P. 1897-1905.

208. Moiseenko T.I., Voinov A.A., Megorsky V.V. Ecosystem and human health assessment to define environmental management strategies: The case of long-term human impacts on an Arctic lake // Sci. Total. Environ. 2006. V. 369. P. 1-20.

209. Miiller U., Altfelder K. The calcium-dependent proteolytic system -calpain-calpastatin in the neural tissue of the honeybee Apis mellifera // Insect Biochem. 1991. V. 21. P. 473-477.

210. Miiller U., Spatz H.-C. Calcium-dependent proteolytic modification of the cAMP-dependent protein kinase in Drosophila wild-type and dunce memory mutants // J. Neurogenet. 1989. V. 6. P. 95-114.

211. Murachi T., Hatanaka M., Hamakubo T. Calpains and neuropeptide metabolism. In: Neuropeptides and Their Peptidases, edited by Turner E. Chichester, UK: Ellis Horwood. 1987. P. 202-228.

212. Murachi T., Hatanaka M., Yasumoto Y., Tanaka K. A quantitative distribution study on calpain and calpastatin in rat tissues and cells // Biochem. Int. 1981. V. 2. P. 651-656.

213. Muramoto M., Yamamoto Y., Seki N. Comparizon of calpain of various fish miosins in relation to their thermal stabilities // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1989. V.55. P.917-923.

214. Muyssen B.T.A., Janssen C.R. Accumulation and regulation of zinc in Daphnia magna: links with homeostasis and toxicity // Arch. Environ. Contamin. Toxicol. 2002. V. 43. P. 492-496.

215. Mykles D.L. Intracellular proteinases of invertebrates: calcium-dependent and proteasome/ubiquitin-dependent systems // Int. Rev. Cytol. 1998. V. 184. P. 157-289.

216. Mykles D.L., Skinner DM. Ca -dependent proteolytic activity in crab claw muscle. Effects of inhibitors and specificity for myofibrillar proteins // J. Biol. Chem. 1983. V. 258(17). P.10474-10480.

217. Mykles D.L., Skinner D.M. Four Ca2+-dependent proteinase activities isolated from crustacean muscle differ in size, net charge, and sensitivity to Ca2+ and inhibitors // J. Biol. Chem. 1986. V. 261(21). P. 9865-9871.

218. Nakashima K., Komatsu T., Yamazaki M., Abe H. Effects of fasting and refeeding on expression of proteolytic-related genes in skeletal muscle of chicks // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2005. V. 51(4). P. 248-253.

219. National Academy of Sciences (NAS): Oil in the Sea. 1985. National Academy Press. Washington. DC. 601 p. (www.nap.edu)

220. Neff J.M., Hillman R.E., Carr R.S., Buhl R.L., Lahey J.I. Histopathologic and biochemical responses in arctic marine bivalve mollusks exposed to experimentally spilled oil // Arctic. 1987. V. 40. issue 1. P. 220-229.

221. Nemova N.N., Kaivarainen E.I., Bondareva L.A. Ca2+-activated neutral proteinase in some fish erythrocytes // Vestnic Moskovskogo Universiteta. Khimia. 2000. V. 41(6 Suppl). P. 106-108.

222. Ohno S., Emori Y., Suzuki S. Nucleotide sequence of a cDNA coding for the SC subunit of human calcium-dependent protease // Nucleic. Acids. Res. 1986. V. 14. P.5559.

223. Ojha M., Wallace C.J .A. Novel Ca2+-activated neutral protease from an aquatic fungus, Allomyces arbuscula // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 1254-1260.

224. Okitani A., Goll D.E., Stromer M.H., Robson R.M. Intracellular inhibitor of a Ca2+-activated protease involved in myofibrillar protein turnover // Federation Proc. 1976. V. 35. P. 1746.

225. Oldenburg K.R., Hubbel W.I. Invertebrate rhodopsin cleavage by an endogenous calcium activated protease // Exp. Eye. Res. 1990. V. 51. P.463-472.

226. Otsuka Y., Goll D.E. Purification of the Ca -dependent proteinase inhibitor from bovine cardiac muscle and its interaction with the millimolar Ca -dependent proteinase // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P.5839-5851.

227. Ou B.R., Forsberg N.E. Determination of skeletal muscle calpain and calpastatin activities during maturation // Am. J. Physiol. 1991. V. 261(6 Pt 1). P. E677-E683.

228. Overturf K., Gaylord T.G. Determination of relative protein degradation activity at different life stages in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Comp. Biochem. Physiol. 2009. PartB. 152. P. 150-160.

229. Patriarca M., Menditto A., Di Felice G. Recent developments in trace element analysis in the prevention, diagnosis and threatment of diseases // Microchem. J. 1998. V. 59. P. 194-202.

230. Phillips D. The chemistries and environmental fates of trace metals and organochlorines in aquatic ecosystems // Mar. Pollut. Bull. 1995. V. 31. P. 193200.

231. Pinter M., Stierandova A., Friedrich P. Purification and characterization of a Ca2+-activated thiol protease from Drosophila melanogaster II Biochemistry.1992. V. 31. P. 8201-8206.*

232. Pourang N., Dennis J.H., Ghourchian H. Tissue distribution and redistribution of trace element in shrimp species with the emphasis on the roles of metallothionein // Ecotoxicology. 2004. V. 13. P.519-533.

233. Pruski A. M., Dixon D.R. Effects of cadmium on nuclear integrity and DNA repair efficiency in the gill cells of Mytilus edulis L // Aquatic Toxicology. 2002. V. 57. P. 127-137.

234. Raspor B., Dragun Z., Erk M. Is the digestive gland of Mytilus galloprovincialis a tissue of choice for estimating cadmium exposure by means of metallothioneins? // Science of the Total Environment. 2004. V. 333. P. 99-108.

235. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the peptidase database //Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. P. D227-D233.

236. Reddi S., Venrugopal N. In vivo effect of cadmium chloride in certain aspect of carbohydrate metabolism in the tissue of a fresh water field crab // Mol. Mechanisms Chem. Toxicity. 1989. V. 42. № 6. P. 847-853.

237. Redpath K.J., Davenport J. The effect of copper, zinc and cadmium on the pumping rate of Mytilus edulis L. // Aquatic Toxicology. 1988. V. 13. P. 217-225.

238. Saavedra Y., A. Gonzalez, P. Fernandez, J. Blanco. Interspecific variation of metal concentrations in three bivalve mollusks from Galicia // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2004. V. 47. P. 341-351.

239. Saito M., Li H., Thompson V.F., Kunisaki N., Goll D.E. Purification and characterization of calpain and calpastatin from rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // Comp. Biochem. Physiol. 2007. V. 146. P. 445-455.

240. Sakamoto S.-I., Yamada Y., Seki N. Comparison of enzymatic properties of calpain II from carp and rabbit muscles // Bull. Jpn. Soc. Fish. 1985. V. 51. P.825-831.

241. Salanki J. Invertebrates in neurotoxicology // Acta. Biol. Flung. 2000. V. 51. №2-4. P. 287-307.

242. Salem M., Nath J., Killefer J. Cloning of the ealpain regulatory subunit cDNA from fish reveals a divergent domain-V // Anim.Biotechnol. 2004. V. 15. P. 145-157.

243. Salem M., Nao J., Rexroad C.E., Kenney P.B., Semmens K., Killefer J., Nath J. Characterization of calpastatin in fish: its potential role in muscle growth and fillet quality // Comp. Biochem. Physiol. 2005a. B 141. P. 488-497.

244. Salem M., Nath J., Rexroad C.E., Killefer J., Yao J. Identification and molecular characterization of the rainbow trout calpains (Capnl and Capn2): their expression in muscle wasting during starvation // Comp. Biochem. Physiol. 2005b. V. 140. P.63-71.

245. Salvat C., Aquaviva C., Jariel-Encontre I., Pariat M., Steff A.M., Carillo S., Piechaczyk M. Are there multiple proteolytic pathways contributing to c-Fos, c-Jun, and p53 protein degradation in vivo? // Mol. Biol. Reports. 1999. V. 26. P. 45-51.

246. Schad E., Farkas A., Jekely G., Tompa P., Friedrich P. A novel SC subunit of the calpains // Biochem. J. 2002. V. 362. P. 383-388.

247. Serafim M.A., Company R.M., Bebianno M.J., Langston W.J. Effect of temperature and size on metallothionein synthesis in the gill of Mytilus galloprovincialis exposed to cadmium // Marine Environmental Research. 2002. V. 54. P.361-365.

248. Serra R., Isani G., Tramontano G., Carpene E. Seasonal dependence of cadmium accumulation and Cd-binding proteins in Mytilus galloprovincialis exposed to cadmium // Comparative Biochemistry and Physiology. 1999. Part C. V.123.P. 165-174.

249. Soazig L., Marc L. Potential use of the levels of the mRNA of a specific metallothionein isoform (MT-20) in mussel (Mytilus edulis) as a biomarker of cadmium contamination // Marine Pollution Bulletin. 2003. V. 46. P. 1450-1455.135

250. Sokol S.B., Kuwabara P.E. Proteolysis in Caenorhabditis elegans sex determination: cleavage of TRA-2A by TRA-3 // Genes. Dev. 2000. V. 14. P. 901-906.

251. Sorimachi H., Ishiura S., Suzuki K. A novel tissue-specific calpain species expressed predominantly in the stomach comprises two alternative splicing products with and without Ca2+-binding domain // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19476-19482.

252. Sorimachi H., Ishiura S., Suzuki K. Structure and physiological function of calpains // Biochem. J. 1997. V. 328. P.721-732.

253. Sorimachi H., Suzuki K. The structure of calpain // J. Biochem. 2001. V. 129. P. 653-664.

254. Stekoll M.S., Clement L.E., Shaw D.G. Sublethal effects of chronic oil exposure on the intertidal clam Macoma balthica // Mar. Biol. 1980. V. 57. P. 5160.

255. Suchanek T. Oil Impacts on Marine Invertebrate Populations and Communities // American Zoologist. 1993. V. 33(6). P. 510-523.

256. Sunila I. Chronic histopathological effects of short-term copper and cadmium exposure on the gill of the mussel, Mytilus edulis // Journal of1.vertebrate Pathology. 1986. V. 47. P. 125-142.

257. Sunila I., Lindstrom R. Survival, growth and shell deformities of copper-and cadmium-exposed mussels (Mytilus edalis L.) in brackish water I I Estuarine, Coastal and Shelf Science. 1985. V. 21. P. 555-565.

258. Suzuki K. The structure of the calpains and the calpain gene. In: Intracellular Calcium-Dependent Proteolysis, edited by Mellgren R.L. and Murachi T. Boca Raton, FL: CRC.1990. P. 25-35.

259. Suzuki K., Hata S., Kawabata Y., Sorimachi H. Structure, activation, and biology of calpain // Diabetes. 2004. V. 53. (Suppl 1). P. S12-S18.

260. Suzuki K., Imajoh S., Emori Y., Kawasaki H., Minami Y., Ohno S. Regulation of activity of calpain // Advances Enzymol. Regulat. 1988. V. 27. P. 153-162.

261. Taneda T., Watanabe T., Seki N. Purification and some properties of a calpain from carp muscle // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1983. V. 49. P.219-228.

262. Theopold U., Pinter M., Daffre S., Tryselius Y., Friedrich P., Naessel DR., Hultmark D. Calp A, a Drosophila calpain homology specifically expressed in a SC set of nerve, midgut, and blood cells // Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 824834.

263. Thruhaut R. Ecotoxicology: objectives, principles and perspectives // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1997. V. 3. P. 151-173.

264. Tidball J.G., Spenser M.J. Calpains and muscular dystrophies // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2000. V. 32. P. 1-5.

265. Tompa P., Emori Y., Sorimachi H., Suzuki K., Friedrich P. Domain III of calpain is a Ca -regulated phospholipid-binding domain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V.280. P.1333-1339.

266. Tonami K., Kurihara Y., Aburatani H., Uchijima Y., Asano T., Kurihara H. Calpain 6 is involved in microtubule stabilization and cytoskeletal organization // Mol. Cell. Biol. 2007. V. 27. P. 2548-2561.

267. Toyohara H., Makinodan Y. Comparison of calpain I and calpain II from carp muscle // Comp. Biochem. Physiol. 1989. V. 92. P. 577-581.

268. Toyohara H., Makinodan Y., Ikeda S. Detection and some properties ofo Icalpain II (high-Ca -requiring form of calpain) in carp (Cyprinus carpi o) erythrocytes // Comp. Biochem. Physiol. 1985a. V. 81. P.583-586.

269. Toyohara H., Makinodan Y., Tanaka K., Ikeda S. Purification and properties of carp (Cyprinus carpio) muscle calpain II (high-Ca2+-requiring form of calpain) // Comp. Biochem. Physiol. 1985b. V. 81. P.573-578.

270. Toyohara H., Makinodan Y., Tanaka K., Ikeda S. Mutual inhibitory effect of calpastatins on calpains from carp muscle, carp erythrocytes, and rat liver // Comp. Biochem. Physiol. 1985c. V. 81. P. 579-58.

271. Tsuchiya H., Seki N. Action of calpain on a-actinin within and isolated from carp myofibrils // Nippon Suisan Gakkaishi. 1991. V. 57(6). P.l 133-1139.

272. Twardovska I. Ecotoxicology, environment safety and sustainable development challenges of the third millennium // Ibid. 2004. V. 58. P. 3-6.

273. Ueyama H., Kumamoto T., Fujimoto S., Murakami T., Tsuda T. Expression of three calpain isoform genes in human skeletal muscles // J. Neurol. Sci. 1998. V.155.P. 163-169.

274. Wang J.-H., Jiang S.-T. Properties of calpain II from tilapia muscle (Tilapia niloticaxTilapia aurea) // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 339-345.

275. Wang J.-H., Ma W.-C., Su J.-C., Chen C.-S., Jiang S.-T. Comparison of properties of m-calpain from Tilapia and grass shrimp muscles // J. Agric. Food Chem. 1993. V. 41. P. 1379-1384.

276. Xie X., Dwyer M.D., Swenson L., Parker M.H., Botfield M.C. Crystal structure of calcium-free human sorcin: a member of the penta-EF-hand protein family // Protein. Sci. 2001. V.10. P.2419-2425.

277. Yu X., Mykles D.L. Cloning of a muscle-specific calpain from the American lobster Homarus americanus: expression associated with muscleatrophy and restoration during moulting // J. Exp. Biol. 2003. 206(Pt 3). P.561-575.

278. Zhang W., Lane R.D., Mellgren R.L. The major calpain isozymes are long-lived proteins // The Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271. P. 1882518830.

279. Zimmerman U.J.P., Boring L., Pak J.H., Mukerjee N., Wang K.K. The calpain SC subunit is essential: its inactivation results in embryonic lethality // Iubmb Life. 2000. V. 50. P.63-68.1. J *

Информация о работе

Канцерова, Надежда Павловна
кандидата биологических наук
Петрозаводск, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Ca2+-зависимые протеолитические ферменты некоторых водных беспозвоночных и рыб - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы