Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние некоторых факторов среды на внутриклеточный протеолиз у гидробионтов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых факторов среды на внутриклеточный протеолиз у гидробионтов"
На правах рукописи
БОНДАРЕВА Людмила Александровна
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ПРОТЕОЛИЗ У ГИДРОБИОНТОВ
Специальность 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Петрозаводск 2004
Работа выполнена в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского научного центра Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор НЕМОВА Нина Николаевна
Официальные оппонента:
Ведущее учреждение:
доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА Татьяна Александровна
доктор биологических наук ОЛЕИНИК Виктор Михайлович
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Зашита состоится "30" сентября 2004 года в часов на заседании Диссертационного совета КМ 212.087.01 при Карельском Государственном педагогическом университете по адресу: 185035 Республика Карелия, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17, ауд. 113 главного корпуса.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельского государственного педагогического университета.
Автореферат разослан "
2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
и^Ч
Малкиель А.И.
^ мше
12550 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вьмснение биохимических механизмов развития адаптивных реакций у животных является важным аспектом решения одной из фундаментальных проблем биологии - взаимодействия организма и среды. Особый интерес представляет изучение биохимических адапгаций у водных организмов (беспозвоночных и рыб), являющихся пой-килотермными животными, у которых легче, чем у теплокровных, установить взаимосвязь со средой, так как у них эта система в большей степени открыта. Результаты таких исследований мотуг иметь несомненное значение для выяснения как специфических, так и общих механизмов развития адаптационного процесса. В современных условиях состояние организмов в природных водоемах в значительной степени зависит от степени антропогенной нагрузки, которое зачастую усугубляется естественными абиотическими и биотическими факторами. Водоемы Карелии, расположенные в зоне северной тайги, отличаются от более южных водных экосистем повышенной чувствительностью и низкой устойчивостью к антропогенному загрязнению (Заличева и др., 2002; Моисеенко, 2003). Известно, что действие на организм факторов среды сопровождается вовлечением различных механизмов регуляции гомеостаза. Среди них важное место занимает протеолиз, являющийся прерогативой выживания организмов. Протеолитические ферменты действуют на первом, ключевом этапе мобилизации белковых резервов клетки, и поэтому их роль в механизмах биохимических адаптации невозможно переоценить (Антонов, 1983; Локшина, 1986; Мосолов, 1988; Немова, 1996; Barrett, 1977; Bohley, 1987). При действии экстремальных факторов повышается активность внутриклеточных протеиназ, образуются биологически активные вещества, которые в последующем влияют на синтез белка и нуклеиновых кислот. Так индуцируются структурные перестройки, характерные для долговременной адаптации, что, по-видимому, является проявлением общего адаптационного синдрома. Нарушение регуляции и нормального функционирования протеолитических ферментов приводит к развитию патологических состояний.
Цель настоящей работы состояла в выяснении особенностей функционирования системы внутриклеточных протеолитических ферментов у гидробионтов, выявлении приспособительных ответных реакций на уровне протеолиза у водных организмов, принадлежащих к разным таксонам, при воздействии на них факторов среды различной природы, в том числе антропогенных. В задачи исследований входило:
1. охарактеризовать в сравнительном аспекте основные ферменты системы внутриклеточного протеолиза (лизосомальные и кальцийактивируемые про-теиназы цитозоля) у гидробионтов - представителей различных таксонов, включая ракообразных, моллюсков и костистых рыб;
2. изучить уровень активности и свойства протеиназ в органах рыб, различающихся особенностями биологии;
3. в натурных и аквариальных экспериментах изучить ответные реакции различных таксономических групп гидробионтов на действие наиболее характерных для водоемов Северо-Запада России факторов, включая антропогенное загрязнение;
4. провести сравнительный анализ состояния системы протеолиза в тканях гидробионтов, обитающих в акваториях с разным уровнем антропогенной нагрузки;
5. на основании анализа полученных данных выяснить возможность использования показателей внутриклеточного протеолиза в качестве биотестов при оценке качества сред обитания гидробионтов, их физиологического состояния и адаптивных возможностей при воздействии неблагоприятных факторов среды. j »'ОС. HAU.,,» .< ->НАЯ j
I библиотека J 3 J йЯт>в,£$Д
09 МО
Научная новизна работы. Большая часть представленных в настоящей работе данных о протеолитических ферментах рыб и морских беспозвоночных получена впервые. Впервые выделены и изучены свойства кальций-зависимых протеиназ у ряда ранее не исследованных в этом отношении объектов. Показано, что под влиянием изменяющихся факторов среды внутриклеточные протеиназы вовлекаются в адаптивные или патологические перестройки в клетках в зависимости от силы и длительности воздействия фактора, резистентности организма, половой принадлежности, тканевой специфичности. Таким образом, научная новизна работы состоит в установлении общих и специфических черт ответных реакций различных таксономических групп гид-робионтов на уровне внутриклеточного катаболизма белков на действие вариабельных факторов водной среды, естественных и антропогенных.
Практическая значимость работы. Работа является частью многолетних исследований, проводимых в лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН в рамках основных направлений биологических наук РАН (5.15,5.21), грантов РФФИ №98-04-48482а, №02-04-48451, №03-04-06351 мае, ФЦП "Интеграция" №641, №3 3010/2354, грантов Санкт-Петербургского конкурса для молодых ученых (№М 01-2.6К-714, №М03-2.6 К-588), гранта Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-894.2003.4). Исследуемые показатели белкового катаболизма (уровень активности лизосомальных катепсинов В и D, молекулярных форм кальпаинов цитозоля) могут быть использованы в качестве дополнительных биохимических критериев при разработке системы эколого-биохимического мониторинга водоемов и для оценки физиолого-биохимического состояния организмов Результаты, полученные в ходе исследований, могут послужить основой для более углубленного изучения сравнительно-эволюционных и физиолого-биохимических аспектов про-теолиза у животных. Материалы диссертации используются в лекционных курсах "Экологическая биохимия" и "Введение в этимологию" доя студентов ПетрГУ и Kl'll У.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V conference "Ichthyo-haematology" (Protivin, Czech Republic, 1998), V international conference "Mercury as a global pollutant" (Rio de Janeiro, Brasil, 1999), 3rd international Lake Ladoga symposium "Monitoring and sustainable management of Lake Ladoga and other large lakes" (Petrozavodsk, 1999), международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны жив. и раст. мира, почв, покрова Восточной Фенноскандии" (Петрозаводск, 1999), международной конференции "Атлантический лосось Salmo Salar. биология, запасы, воспроизводство" (Петрозаводск, 2000), IX Всероссийской конф. "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Ярославль, 2000), VIth European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells (Paris, France, 2000), международной конференции "Биокатализ 2000" (Москва. 2000), XX-XXI Workshops "Biological essentiality of trace and ultratrace elements" (Jena, Germany, 2000, 2002), международной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Ярославль, 2000), конференции "Поморье в Баренц Решоне: Экономика, экология, культура" (Архангельск, 2000), III-IV international symposia "Micro and trace elements in human: new perspectives" (Athens, Greece, 2001,2003), конференции "Экологические проблемы онтогенеза рыб (физиолого-биохими-ческие аспекты)" (Москва, 2001), конференции "Современные проблемы биоиндикации и биомонигоринга" (Сыктывкар, 2001), V симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002), П1 съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), конференции "Современные проблемы водной токсикологии" (Борок, 2002), XIth symposium on trace elements in man and animals (Berkeley. USA, 2002), международном семинаре "Современные проблемы физиологии и экологии морских животных (рыбы, птицы, млекопитающие)" (Ростов-на-Дону, 2002), II АМАР symposium on environmental pollution of the Arctic (Rovaniemi, Finland, 2002), ИГ" young scientists conference "XXI century: ecological science in Armenia" (Yerevan, 2002), IInd international conference on enzymes in the environment: activity, ecology and applications (Praha, Czech Republic, 2003), 9th meeting of PhD students in evolutionary biology (Fiesch, Switzerland, 2003), конференции "Экологические
проблемы бассейнов крупных рек - 3" (Тольятти, 2003), международной конференции "Инновации в науке и образовании-2003" (Калининград, 2003), 10a meeting of PhD students in evolutionary biology (Shrewsbury, Great Britain, 2004).
Б-iiai одарносги. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаб. экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН (особенно с.н.с. Е.И. Кяйвяряйнен и с.н.с. М.Ю. Крупновой), кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, ББС ЗИН РАН "Каргеш", ИБВВ РАН (пос. Борок Ярославской обл.), Кандалакшского государственного природного заповедника (Мурманская обл.), ИВПС КарНЦ РАН за помощь в получении биологического материала, в постановке экспериментов и обсуждении результатов исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе 12 статей и 25 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, четырех глав результатов исследования, заключения, вьдеодов, списка литературы и приложения. В работе имеется 44 таблицы, 42 рисунка. Список литературы включает 361 источник, из них 116 на русском и 245 на иностранных языках.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В разделе приведены современные представления о структуре, свойствах, механизмах регуляции и биологической роли внутриклеточных протеолитических ферментов у животных, в том числе у рыб и водных беспозвоночных. Охарактеризовано воздействие на водные организмы важнейших абиотических факторов водной среды, варьирование которых наиболее типично для малых водоемов Северо-Запада России и прибрежной акватории Белого моря. Анализируются уже имеющиеся данные о механизмах клеточных и молекулярных перестроек у водных организмов в условиях изменения исследуемых факторов среды Рассматривается вопрос об использовании водных организмов в качестве объектов экотоксикологии, биоиндикации и мониторинга.
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материал
Эксперименты по теме диссертации проводились в 1997-2003 гг. в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского НЦ РАН. Материал для отдельных исследований был получен при содействии кафедры молекулярной биологии. биологической и органической химии ПетрГУ, лаборатории физиологии и токсикологии водных животных Института биологии внутренних вод РАН (пос. Борок), Кандалакшского государственного природного заповедника (Мурманская обл.), ББС ЗИН РАН "Картеш", ИВПС КарНЦ РАН.
Объектами исследований служили представители различных таксонов гидробионтов: костистых рыб, двустворчатых моллюсков, ракообразных - обитателей морей и континентальных пресных водоемов Севера России. В экспериментах использовали пресноводных рыб сем. Esocidae (щука Esox lucius L ), сем. Cyprinidae (плотва Rutilus rutilus L., карась Carassius carassius), сем. Percidae (окунь Perca fluviatilis), выловленных в водоемах Республики Карелия и Вологодской области, морских рыб сем. Gadidae (навага Eleginus navaga Pall.), сем. Salmonidae (атлантический лосось Salmo salar L., форель Salmo trutta L ) и беспозвоночных бассейна Белого моря: двустворчатых моллюсков сем. Mytilidae (мидий Mytilus edulis L.) и ракообразных амфипод рода Gammaridae.
В качестве материала исследований использовали различные органы и ткани рыб (белые мышцы, печень, гонады, жабры, селезенка, почки, в некоторых экспериментах
- кровь), гомогенаты цельных организмов мидий и амфипод, печень, почки, мышцы крыс. После препарирования органы исследуемых водных организмов отмывали охлажденным 0.9% раствором NaCl и хранили биологические образцы в состоянии глубокой заморозки при -25 °С до начала анализа. Часть материала использовалась для определения содержания некоторых неорганических элементов в соответствии с целями эксперимента.
Выделение и частичная очистка исследуемых прочеиназ
Очистка протеиназ из тканей рыб и цельных гомогенатов амфипод и мидий включала общепринятые этапы с использованием различных физико-химических методов выделения белков. Гомогенизацию тканей и экстракцию белков проводили в течение 3 мин. при охлаждении (+4 °С), используя гомогенизатор типа Поттера-Эльвейема с теф-лоновым пестиком. Готовили 10%-ные гомогенаты ткани в 0.1 М ацетатном буфере (рП 5.0 для катепсина В, рН 3.6 для катепсина D), содержащем 0.25 М сахарозы и 0.1% тритона Х-100 для разрушения клеточных структур и выделения фракции лизосом. Дня выделения кальпаинов готовили 25%-ные гомогенаты тканей в буфере А (10 тМ трис-НС1, 50 mM NaCl, 4 тМ EDTA, 5 тМ меркаптоэтанола), содержащем 0.25 М сахарозы (рН 7.5). Дифференциальное центрифугирование гомогенатов (Покровский, Тутельян, 1976) проводили при 13 Tbic.g х 30 мин. (центрифуга К-24). Результирующий суперна-тант использовали в качестве первичного источника лизосомальных прогеиназ. Цито-зольную фракцию получали при 105 Tbic.g х 30 мин., в ней определяли активность кальций-зависимых протеиназ. Диализ и ионообменную хроматографию проводили на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (5x30 см) (Дэвени, Гергей, 1976). Элюцию ферментов проводили с помощью непрерывного градиента р-ра NaCl (0.1-0.4 М). Фракции, содержащие кальцийактивируемую протеолитическую активность, собирали, концентрировали на ПЭГ-10 000 и использовали для дальнейшей очистки. Гель-фильтрационное разделение молекулярных форм кальпаинов и отделение белкового ингибитора - кальпастатина проводили на колонках (2.5x95 см) с ультрагелем АсА34 (Sigma) или Sephacryl S200 (Pharmacia), уравновешенными буфером А. Элюцию проводили со скоростью 24 мл/ч буфером А, собирали фракции элюента объемом 4 мл.
Определение молекулярной массы исследуемых белков вели описанным ранее методом гель-фильтрации на ультрагеле АсА34 или Sephacryl S200 с помощью калибровочного графика, построенного по результатам пропускания через колонку белков с известной молекулярной массой. В качестве маркеров использовали: иммуноглобулин G (110 кДа), БСА (67.5 кДа), трипсин (34.0 кДа), цитохром С (12.6 кДа).
Электрофоретическое определение степени очистки ферментного препарата проводили на приборе фирмы "Реанал" по стандартной методике (Маурер, 1971). Поли-акриламидный гель (концентрирующий - 2.5%, разделяющий - 7.5%) готовили в стеклянных трубочках 5x60 мм. После проведения электрофореза гели, извлеченные из трубочек, окрашивали 0.002% Coomassie brilliant blue R-250 в 12% ТХУ.
Определение активности протеиназ
Активность катепсина В определяли по расщеплению 0.065 М раствора этилового эфира гидрохлорида N-бензоил L-аргинина (эстеразная активность) в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.0) (Matsuda, Misaka, 1974), а катепсина D - по гидролизу 1% р-ра бычьего гемоглобина в 0.1 М ацетатном буфере (рН 3.6) согласно модифицированному методу Ансона (Алексеенко, 1968). Активность катепсинов В и D выражали в единицах изменения оптического поглощения (E52s и Е280, соответственно) на 1 г сырой массы ткани за 1 ч инкубации (37 °С).
Активность Са2+-зависимых протеиназ цитозоля (кальпаинов) определяли стандартным методом по гидролизу 0.4% р-ра казеина (Murachi, 1981) в 50 тМ имидазол-HCI буфере (рН 7.5), содержащем 5 тМ дитислреитола в каждой фракции элюента. Инкубация опытных проб (30 мин при 30 °С) происходила в присутствии 3.0 тМ СаС12; в контрольные пробы
6
кальций добавляли после инкубации. Концентрацию кислоторасгворимых продуктов гидролиза определяли спекгрофотометрически (Е280) Единица активности кальпаинов определялась как количество фермента во фракции, приводящее к увеличению на 1.0 оптического поглощения (Егю) за 1 час инкубации (30 °С).
Количественное содержание водорастворимого белка в тканях (мг/мл центрифуга-та) определяли спектрофотометрически (Е595) по методу Брэдфорд (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Статистическая обработка данных
Результаты исследований обработаны статистически с применением непараметрического критерия различий U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) (Гублер, Генкин, 1969). Различия между выборками считали достоверными при Р<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Частичная очистка, распределение, видо-, ткаиеспецифичность и некоторые физико-химические свойства Са2+-активируемых нейтральных протеиназ гилробионтов
Следует отметить, что механизмы Са2+-активируемого протеолиза теплокровных животных достаточно хорошо освещены в литературе (Kawashima et al., 1986; Melloni et al., 1992), хотя и в этой области остается ряд нерешенных проблем. Имеющиеся в литературе сведения о кальпаинах рыб в основном касаются их молекулярной структуры и механизмах регуляции (Toyohara, Makino-dan, 1989; Wang et al., 1992); сведения о Са2+-активируемых протеиназах беспозвоночных фрагментарны (Maeda et al., 1992; Beyette et al., 1993). Недостаточно сведений о роли кальпаинов в метаболизме гидробионтов, в то время как такие исследования представляют несомненный интерес в эволюционном и экологическом аспектах.
В представленной главе приводятся результаты изучения физико-химических свойств Са2+-акгивируемых протеиназ представителей морских беспозвоночных класса ракообразных амфипод Gammaridae и кальпаинов из эритроцитов форели Salmo trutta L. Очистка Са2+-активируемых протеиназ рыб, цельных гомогенатов амфипод (Gammaridae) и эритроцитов форели (Salmo trulla L ) включала общепринятые этапы с использованием различных физико-химических методов выделения белков. Также продемонстрирована ткане- и видоспецифичность кальпаинов рыб на примере плотвы Rutilus rutilus и щуки Esox lucius.
3.1. Активность и ткаиеспецифичность кальпаинов рыб и водных беспозвоночных
Кальцийактивируемые протеолитические ферменты (кальпаины) обычно представлены в тканях позвоночных животных двумя молекулярными формами, различающимися чувствительностью к Са2+ Кроме различного сродства к активатору -ионам кальция, критерием распознавания форм кальпаина может служить значение молекулярной массы (Suzuki et al., 1987) и термостабильность при 58 °С (Murachi, 1981 ) В исходном гомогенате активность кальпаинов не регистрируется из-за присутствия эндогенного ингибитора - кальпастатина (Мг~130 кДа), присутствующего в нитозоле (Murachi et al., 1983; Suzuki et al., 1988).
Рис. 1. Профиль элюции водорастворимых белков гомогената амфипод Gammandae (~ ) и мышц плотвы Rutilus rutilus ( ) после гель-хроматографии на колонках (2 5 х 95 см) с Sephacryl S200 и уровень Са2+-зависимой активности (Е28о/г ткани/ч)
Белки после гель-хроматографии во всех случаях разделяются по молекулярной массе на три пика: наиболее высокомолекулярные белки составляют первый пик (М, 400-110 кДа), белки с Мг в пределах 110-1Q кДа - второй и третий пик включает низкомолекулярные вещества белковой природы, пептиды (рис. 1). Мг индивидуальных белков устанавливали по пропусканию через колонку белков с известными молекулярными массами. Картина соотношения веществ белковой природы, обладающих различными молекулярными массами, а также уровень активности Са2+-активируемых протеиназ тканеспецифичны. Для мышц, в сравнении с другими органами, характерно наиболее низкое содержание высокомолекулярных белков. Подобное соотношение пиков наблюдается также на хрома-тограмме амфипод. Количественное содержание белка, определенное методом Брэдфорд (Bradford, 1976), в этих пробах также сравнительно низкое (особенно у амфипод). Известно (Murachi et al., 1981), что первыми с колонки элюируются фракции, в которых определяется активность более высокомолекулярного кальпаина II (шМ-форма), а затем - активность кальпаина I (цМ-форма) Третий пик, скорее всего, обусловлен наличием каталитически активной субъединицы кальпаинов, образовавшихся в результате автолиза высокомолекулярных форм (Suzuki et al., 1988; Beyette et al., 1993). У изученных видов рыб обнаружено наличие прсггеолитической активности, активируемой ионами кальция, во фракциях белкового элюента с Мг 120, 110 и 80 кДа. Ранее было показано наличие двух форм кальпаина для осетровых, лососевых и карповых рыб (Toyohara, Makinodan, 1989; Немова, 1996). Результаты подтверждают имеющиеся в литературе данные, что оба фермента могут присутствовать в ткани одновременно, однако их относительное содержание варьирует в широких пределах (Murachi et al., 1981; Suzuki et al., 1988). Сравнительные величины активности Са2+-активируемого протеолиза в органах объектов приводятся в диссертации. При рассмотрении полученных результатов изучения Са2+-активируемых протеиназ амфипод и литературных данных для кальпаинов млекопитающих и рыб (Dayton et al., 1976; Toyohara, Makinodan, 1989; Melloni et al., 1992; Немова, 1996) следует
8
отметить, что если уровень активности кальпаинов у рыб и млекопитающих весьма сходен, то у беспозвоночных он на порядок выше. По-видимому, это является отражением эволюционной древности и примитивности организации, а также особенностями среды обитания беспозвоночных холодных морей. Протеолитические ферменты водных беспозвоночных, являясь эволюционными предшественниками протсиназ высших животных, обладают, как правило, и более широкой субстратной специфичностью (Мухин и др., 1998). У щуки активность кальпаинов выше, чем у плотвы, что может бьггь связано с видовыми особенностями (двигательной активностью и кормовой преференцией).
Большая часть исследований, касающихся Са2+-активируемых протеиназ у рыб и водных беспозвоночных, проведены на мышечной ткани (Jeng et al., 1993; Maeda et al., 1992b; Beyette et al., 1993), как известно, богатой кальцием. По-видимому, функция кальпаинов в мышечной ткани связана с участием в деградации миофибриллярного аппарата: in vitro кальпаины инициируют гидролиз миофибриллярных белков, включая Н-цепь миозина, С-белок, тропомиозин, тропонины Т и 1, белки промежуточных филаментов десмин и виментин (Локшина, 1986; Dayton et al., 1975; Waxman, 1978). Более высокая активность кальпаинов в жабрах щуки по сравнению с плотвой объясняется, по-видимому, большей потребностью в кислороде и, соответственно, большей эффективностью дыхательной функции у активных рыб, чем у малоподвижных (Hughes, 1966). Поскольку у быстроплавающих рыб расходование белков происходит интенсивнее, активность протеолитических ферментов у них выше и процессы автолиза у таких видов протекают быстрее (Bailey, 1942).
3.2. Свойства Со2*-зависимых протеиназ из гомогенатов амфипод Gammaridae
Са2+-зависимая активность у амфипод элюируется в трех пиках с молекулярными массами 110, 80 и 65 кДа (рис. 1). Дальнейшее изучение таких свойств различных фракций, как температурная устойчивость, чувствительность к Са2+ (рис. 2а), рН-зависимость (рис.26), чувствительность к действию ингибиторов, позволило идентифицировать выделенные ферменты как кальпаин-подобные ферменты беспозвоночных. Известно, что классическое разделение кальпаинов на кальпаин I и кальпаин II не характерно для беспозвоночных: размеры их мо-
Рис. 2. Зависимость активности кальпаин-подобных протеиназ амфипод (Мг 110, 80 и 65 кДа) от (а) концентрации Са2+ и (б) рН инкубационной среды
Концентрация Са2+, необходимая для проявления максимальной активности, составила 5.0 мМ для фракции Мг 110 кДа, 3.0 мМ для фракции с Мг 80 кДа и промежуточная зависимость активности от концентрации Са2+ 4.0 мМ характерна для фракции с Мг 65 кДа. Следует отметить, что столь высокий уровень Са2+ не физиологичен для
цитоплазмы клетки. Максимальная активность всех молекулярных форм фермента зафиксирована при рН 7.4-7.6, т.е. в нейтральной области рН, свойственной цитозолю.
Известно, что одним из критериев распознавания кальпаинов I и II у позвоночных служит их термостабильность при 58 °С. Активность кальпаина II карпа снижается на 25% при нагревании в течение 5 минут, тогда как активность кальпаина I не изменяется (Murachi, 1981). Показано, что активность, связанная с фракцией фермента амфипод с Мг 110 кДа полностью инактивируется уже при воздействии 48 °С, протеиназа с Мг 80 кДа частично теряет активность только при 58 °С, фракция фермента 65 кДа демонстрирует промежуточную гермоста-бильность. Полученные данные свидетельствуют о том, что кальпаин-подобные ферменты амфипод значительно более чувствительны к нагреванию, чем каль-паины рыб. Это также согласуется с данными Maeda (1992) о том, чю кальпаи-ны, выделенные из беспозвоночных, обычно менее термостабильны, чем каль-паины млекопитающих (Maeda et al., 1992).
При воздействии широкого спектра ингибиторов протеиназ показано, что зависимые протеиназы амфипод чувствительны к действию ингибиторов, воздействующих на SH-группы цистеина: алкилирующих реагентов, соединений тяжелых металлов, а также агентов, связывающих двухвалентные ионы (например, Са2+), чю позволяет отнести их к цистеиновым протеиназам. Кроме того, известно, что в цито-золе присутствие Са2+-зависимых протеиназ обязательно сопровождается присутствием их эндогенного конкурентного ингибитора - кальпастачина (Suzuki, 1988), необычайно термостабильного (Maki et al., 1990). Кальпастатин из амфипод элюируется с колонки Sephacryl S200 в белковой фракции с М,~130 кДа.
3.3. Свойства Сс?*-зависимых протеиназ из эритроцитов форели Salmo truita L.
Наш интерес к капьпаинам эритроцитов (рис. 3) связан как с выполняемой ими функцией в созревании и регуляции физиологических процессов, так и со своеобразием наличия и соотношения молекулярных форм кальпаина в этих клетках крови.
ности (Е2»/г ткани/ч)
Известно, что обычно в эритроцитах млекопитающих кальпаины представлены только кальпаином I, активируемым цМ концентрациями Са2+ (Murakami et al., 1981), в эритроцитах птиц представлены обе формы кальпаина (I и II), в то время как в эритроцитах карпа обнаруживается только кальпаин II, активируемый мМ концентрациями Са2+ (Toyohara et al., 1985b). По-видимому, в эволюционном ряду чувствительность кальпаинов к Са2+ увеличивается, что может быть отражением молекулярной эволюции эритроцитарных кальпаинов среди рыб. птиц и млекопитающих наряду с сохранением их основных биологических функций.
Данные, полученные в эксперименте, свидетельствуют о том, что в эритроцитах форели присутствует цистсиновая (тиоловая) Са -активируемая протеиназа с молекулярной массой 70 кДа, проявляющая максимальную активность in vitro при рН 7.5 и концентрации Са2+ 3.0 мМ. Физико-химические свойства фермента (чувствительность к Са2*, ингибиторам цистеи-новых (тиоловых) протсиназ, рН-зависимость, значение молекулярной массы, температурный критерий) указывают на то, что он может быть идентифицирован как кальпаин II. что согласуется с имеющимися в литературе данными, полученными для эритроцитов карпа (Toyohara, Makinodan. 1989).
Глава 4. Влияние антропогенного загрязнения водоемов на внутриклеточный протеолиз у водных организмов
4.1. Влияние антропогенного загрязнения прибрежной акватории Белого моря па внутриклеточный протеолиз у амфипод Gammaridae и мидий Mytilus edulis L.
Исследовали влияние комплексного загрязнения на ферменты внутриклеточного проте-олиза у типичных представителей макрозообентоса Беломорского побережья: ракообразных амфипод Gammandae и двустворчатых моллюсков Mytilus edulis L., выловленных, соответственно, в 4 и 12 зонах прибрежной акватории в летний период (табл. 1). Водная биота эстуариев проявляет устойчивость к широкому диапазону температур, солености и доступности кислорода (Bulnheim, 1979; Ritz, 1980; Sheader, 1983), в связи с этим, беспозвоночные прибрежной зоны могут был, преадагтгированы к жизнедеятельности в загрязненных водоемах (Jemelov, Rosenberg, 1976; Gray, 1981).
Прибрежные морские экосистемы Кандалакшскою залива Белого моря подвержены трансформации вследствие значительного антропогенного загрязнения. Основные источники загрязнения - органические вещества наземного стока, тяжелые металлы, нефтяное загрязнение (Наумов, 1981). Ряд зон прибрежной акватории с наименьшей антропогенной нагрузкой могут расцениваться как условно "чистые" (мыс Турий, губа Порья) (точки 1, 2). Точки отбора проб были дифференцированы по принципу близкого расположения к: (а) эстуариям крупных рек, которые могут выступать в качестве мест повышенной аккумуляции загрязнителей среды, включая тяжелые металлы (точки 3, 4); (б) стокам гавани, обогащенным соединениями кальция и фосфора из состава апатитового концентрата (точки 5-8); (в) местам локального радиоактивного загрязнения (точки 9,10); (г) источникам нефтяного загрязнения (точки 11, 12) и/или (д) районам интенсивной промышленной активности (точка 13).
Показаны изменения в протеолитической активности лизосом у беспозвоночных, отражающие степень загрязнения акватории моря. У амфипод (табл. 1) зафиксировано снижение активности кислых протеиназ лизосом (катепсинов D, В) по мере роста загрязненности среды.
Таблица 1. Активность катепсинов О, В и содержание водорастворимого белка в гомогенатах амфипод СаттапсЬе из различных по степени антропогенной нагрузки зон Белого моря (точки сбора приведены в порядке возрастания степени загрязнения)
Точки сбора амфипод катепсин D ДЕ2ю/г ткани/ч катепсин В ДЕ525/Г ткани/30 мин белок мг/мл
1 мыс Турий 1.3 ±0 I 7 60 ± 0 4 2 18 ± 0 2
2 о Ряшков 1 43 ± 0 1 11 65 ± 0 7* 1 22 ± 0 1*
3 дер Лувеньга 1 97 ± 0 2* 9 20 ± 0 6 I 40 ± 0 1
4 о Большой Березовый 1 20 ± 0 1 5 25 ± 0 3 0 92 ±0 1*
5 о Еловый 1 11 ±0 1 4 80 ± 0 2* 1 48 ± 0 1
6 о Овечий 0 88 ± 0 1* 4 05 ± 0 2* 1 12 ± 0 1*
7 о Большая Половинница 1 12±0 1 6 20 ± 0 3 1 62 ± 0 1
8 о Малый 1 19±0 1 5 50 ± 0 4 1 04 ± 0 1*
9 о Большой Лупчостров 0.38 ±0 1* 11.60 ±0 7* 1 74 ± 0 1
10 корга у о Оленьего 0 54 ± 0 1* 5 40 ± 0 3 1 12 ± 0 1*
И о Олений, губа Коровья 0 97 ± 0 1 6 05 ± 0 4 1 10±0 1*
12 "механический завод" I 45 ± 0 1 16 20 ±0 9* 4 88 ± 0 2*
* достоверность отклонения при Р < 0 05, п=12
Для мидий в этих условиях (рис. 4а,б) характерна активация катепсина D (аспар-тильной протеиназы) и достоверное снижение активности катепсина В (цистеиновой протеиназы). В данном случае лизосомальный аппарат клетки, по-видимому, участвует не только в процессах биотрансформации ксенобиотиков, но и в адаптивной перестройке белкового обмена клетки. Об этом свидетельствуют также многочисленные результаты, полученные ранее в лаборатории экологической биохимии на рыбах при изучении действия различного рода токсикантов и их смесей, а также при патологиях, вызванных бактериальными и вирусными инфекциями (Nemova, 1991; Немова, 1987; Немова, Сидоров, 1990; Немова и др., 1994, Немова, 1996; Высоцкая, 1999). Многие загрязнители, включая металлы, аккумулируются в лизосомах, вызывают повышение проницаемости лизосомальных мембран, что ускоряет гидролиз белков и обусловливает клеточную атрофию (Lowe, Clarke, 1989). Степень лабилизации мембран пропорциональна силе стресса (Moore, 1985; Nicholson, 1999а), и эта цитологическая реакция является первичным цитотоксическим.
Рис. 4. Активность (а) катепсина В (Е525Л- ткани/30 мин), (б) катепсина О (Е^/г ткани/ч) и содержание водорастворимого белка (мг/мл) в гомогенатах мшшй Муп1ш есЬЬз из зон Белого моря 1 - Порья губа, 2 -о Ряшков, 3 - корга у о Телячий, 4 - о Овечий (в порядке возрастания степени загрязнения)
Как уже обрисовывалось выше, у амфипод и мидий присутствует Са2+-зависимая проте-олитическая активность во фракциях белка с молекулярными массами 110,80 и 65 кДа (рис. 1). Имеющиеся в литературе данные (Mykles, Skinner, 1990) о разнообразии биологических процессов с участием кальпаинов, а также об их высокой протеолитической способности у водных беспозвоночных (до 60% белков мышечной ткани беспозвоночных гидролизуются кальций-зависимыми протеиназами в цитозоле) позволяют предположить их участие в развитии адаптивных реакций у исследованных нами беспозвоночных Белого моря в ответ на загрязнение среды обитания.
Для беспозвоночных из загрязненных акваторий характерна активация Са2+-зависимых протеиназ. Достоверное возрастание общей Са2+-зависимой активности при этом происходит в основном за счет активации кальпаин I-подобной протеиназы (цМ-формы), что указывает на повышение общего уровня обмена белков. Наблюдается лабилизация ферментных белков, что выражается в приросте субъединичной активности протеиназы. Появляется и возрастает, в соответствии со степенью загрязнения, активность более высокомолекулярного кальпаин Н-подобного фермента (требующего нефизиологично высокой мМ [Са2+], для активации). У амфипод из зоны моря с высокой антропогенной нагрузкой ("механический завод") наблюдаются изменения в протеолизе, характерные для развития патологического процесса. Так, зафиксировано перераспределение Ca +-зависимой протеолитической активности между фракциями фермента с различным молекулярным весом (рис. 5). Ранее для позвоночных животных было показано, что экспрессия кальпаина II возрастает именно при патологических изменениях в тканях (Johnson, 1990; Немова, 1996), сопровождающихся нарушениями кальциевого гомеостаза.
Рис. 5. Распределение Са2+-зависимой активности у амфипод Gammandae между молекулярными формами кальпаина (Mr 110,80 и 65 кДа)' 1 - в норме ("чистая" лона Турий мыс) и 2 - при воздействии загрязнителей (зона "механический завод")
Характерно, что у беспозвоночных из наиболее загрязненных зон акватории на фоне высокого уровня активности протеиназ происходит накопление высокомолекулярных белков. Этот эффект показан также Порте с сотр. (Porte et al., 2001): наибольшее "истощение" низкомолекулярных соединений наблюдается в течение первой фазы воздействия поллютанта на мидий, напротив, высокомолекулярные белки значительно индуцируются при действии загрязнения. Наиболее важны не столько количественные, сколько качественные изменения состава тканевых белков. Так, для морского ракообразного Gammarus marinogammarus olivii, обитающего в зоне городского стока, показано снижение числа белковых фракций (Руднева, 2000).
Загрязнение в природных условиях редко обусловлено единственным веществом, а смеси загрязнителей могут оказывать и синергический, и антагонистический эффекты на биоту в зависимости от изучаемого вида (Fowler, Benayoun, 1974; Phillips, 1976; Pelgrom et al., 1994). Разграничить действие индивидуальных загрязнителей при помощи анализа состояния системы протеолиза установить сложно, для этого необходимо использовать специфические для каждого ксенобиотика биотесты.
Значительное сходство в специфике ответной реакции притеолиза у исследованных в данной работе морских беспозвоночных и ранее изученных представителей водных организмов, вероятнее всего, указывает на то, что наблюдаемые изменения в активности ферментов внутриклеточного про геолиза являются следствием неспецифической модификации белкового метаболизма клеток как части развития механизмов биохимической адаптивной реакции организмов, выработанной и закрепленной в ходе эволюции (Строганов, 1979;Немоваидр., 1994).
4.2. Влияние стоков горнообогатительного комбината на внутриклеточный протеолиз некоторых пресноводных рыб В течение ряда лет проводилось изучение протеолитических ферментов у пресноводных рыб (плотва, щука), обитающих в районе хранилища инфильтрационных вод Костомукшского горнообогатительного комбината (т.н. "хвостохракилище") и в сравнительно "чистых" малых озерах (Лувозеро, Кимасозеро, Куйто) из Кондопожского и Муезерского р-нов Карелии. Рыба из загрязненной зоны была подвержена влиянию высокоминерализованных (до 480 мг/л) техногенных стоков, характеризующихся высоким уровнем неорганических ионов: калия (до 140 mi/л), лития (до 50 мг/л), сульфатов, нитритов, а также высоким содержанием суспендированных частиц руды. Уровень тяжелых металлов в стоках Г ОКа сравнительно низок вследствие сложившегося в хвостохранилище геохимического барьера: при высоких значениях pH (8.0) тяжелые металлы остаются в составе твердых фракций отходов и не поступают в водоемы (Морозов, 1998). Высказывалось предположение, что основной причиной негативного действия промышленных стоков являются ионы калия. Так, видовой ряд устойчивости пресноводных ракообразных к техногенным водам и ионам калия совпадал (Пименова, 2002).
Активность лизосомальной протеиназы катепсина В (рис. 6а), значительно ниже в органах плотвы из загрязненной зоны, чем в контроле, тогда как некоторое повышение активности наблюдалось в органах щук. Показано, что активность аспартильной протеиназы катепсина D (рис. 66) снижается в мышцах как самцов, так и самок, этот эффект еще более выражен в печени самцов (главном органе аккумуляции, детокси-кации и экскреции тяжелых металлов).
самки плотвы печень мышцы жабры гонады селекнка самцы щуки печень мышцы жабры сайки щуки печень мышцы
20 40
активность катепсина В
1 I з
активность катепсина D
Рис. 6. Активность (а) катепсина В (Е525/Г ткани/30 мин) и (б) катепсина В (Е28о/г ткани/ч) в тканях плотвы Я. гиШю и щуки Е 1исгих из оз. Куйто (контроль) и зоны, загрязненной стоками ГОКа (опыт)
Ингибирование основных протеиназ лизосом в тканях рыб может повлиять на скорость обмена тканевых белков, пропессинг вновь образующихся других (отличных от протеолитических) лизосомальных гидролаз, замедлить развитие иммунного ответа, что может существенно отразиться на защитной функции лизосом (Локшина, 1979; Немова и др., 1999). Известно, что лизосомальные ферменты принимают непосредственное участие в процессах экскреции и биотрансформации низких доз ксенобиото-ков, (Чекунова, Фролова, 1986).
Наряду с ингибированием лизосомальных протеиназ, наблюдалась активация кальпаинов в органах опытных рыб. Можно предположить, что это связано ' с регуляцией на уровне фосфолипидов мембран, некоторые из которых являют-
ся эндогенными активаторами кальпаинов. Замечено, что в условиях снижения численности видов и повышенной доступности кормовых ресурсов для выжив-k ших особей в загрязненной зоне, количество энергии, необходимой для роста
организма и накопления липидов, возрастает (Adams et al., 1992, цит по: Моисе-енко, 20026). Однако в печени плотвы прирост общей активности был следствием активации кальпаина I (рис. 7а), тогда как в печени щуки - кальпаина II (рис. 76), что указывает на развитие патологического процесса (Johnson, 1990). Кроме того, мы зафиксировали прирост субъединичной активности, являющейся следствием автолиза нативных форм фермента. Эти результаты, по-видимому, свидетельствуют о развитии адаптивных изменений в органах плотвы и патологических в органах щуки.
(а)
Рис. 7. Распределение молекулярных форм кальпаинов в печени самок плотвы Я гип/ш (а) и щуки Е ¡ист (б) из "чистого" озера (1) и при воздействии сточных вод ГОКа (2)
Общее содержание белка в большинстве изученных тканей рыб из загрязненной зоны ниже, чем в соответствующих контрольных пробах.
Данные о более выраженном эффекте токсикантов на активность и свойства ферментов внутриклеточного протеолиза у тех же видов рыб, полученные ранее (Камагатеп Я а1., 1998), свидетельствуют о том, что наблюдается так называемый "возврат к норме". С 2001 года технологически изменился способ подачи отработанных вод в хвосгохранилище, что привело к значительному сокращению взмученности. Из литературы также известна возможность полной обратимости токсического эффекта после перевода рыб в чистую воду из растворов токсикантов в концентрациях, превышающих ПДК (Токин, Зензеров, 1977; Коси-нова, 1978; Руоколайнен, Высоцкая, 1983).
Следует отмстить, что лабильность исследуемых параметров свидетельствует о меньшей резистентности самцов изученных видов, вплоть до полного их отсутствия в уловах. Сравнительно высока чувствительность хищных рыб, представляющих собой, как известно, завершающее звено трофической цепи.
Глава 5. Влияние соединений ртути на внутриклеточный протеолиз у водных
организмов
5.1. Влияние накопления ртути и сопутствующих этому процессу факторов среды (рН, гумифицированности водоема) на протеолиз в тканях окуня Perca fluvialilis L. из малых озер Вологодской области и Карелии
При всей очевидности существования в России проблемы ртутного загрязнения, усиливающегося с закислением поверхностных вод, молекулярные механизмы воздействия этих факторов на биоту водоемов практически не изучены. Мелкие пресные водоемы подвержены таким изменениям в большей степени, чем крупные. Учитывая тот факт, что для проявления активности иисгеинзависимых протеиназ (кальпаинов цитозоля и лизосомального катепсина В) необходимы SH-гругшы, чувствительные к воздействию тяжелых металлов, особенно ртути, можно полагать, что с ними связан один из возможных механизмов воздействия ргути на клеточный метаболизм, а уровень активности этих ферментов может служить дополнительным биоиндикатором ответной реакции организма рыб на этот фактор. Эти исследования имеют значение также и с точки зрения здоровья человека, так как известно, что основным источником поступления ртути в человеческий организм является рыба (Haines et al., 1994).
В представленной главе приводятся результаты исследований влияния аккумуляции ртути в мышцах рыб, обитающих в малых озерах с различной степенью ацидифи-кации (рН) и цветности (гумифицированности), на активность цистеинзависимых (тиоловых) протеиназ у окуня. Окунь Perca fluviatilis L. интересен как объект изучения воздействия ртути и сопутствующих факторов, поскольку является представителем хищных рыб, завершающих трофическую цепь водоема, а также он весьма устойчив к закислению срсды, продолжая существовать в озерах, рН воды которых падает до уровня рН<4.0 (Комов, 1999). Кроме того, при сопоставлении одноразмерных рыб наибольший возраст и самое высокое содержание ртути в мышцах имеет окунь, а интенсивность линейного роста рыбы может рассматриваться как cyujeci венный фактор, влияющий на бионакопление ртути (Степанова, Комов, 2002).
Материал получен при сотрудничестве с лаб. физиологии и токсикологии водных животных ИБВВ РАН (Борок). Рыбу отлавливали в июне 1997 г. из озер Дарвинского государственного заповедника (Вологодская обл.), расположенных на значительном удалении от источников загрязнения. Ацидные озера представлены как гумифицированными (темновод-ными) - Змеиное (рН 4.5; цветность 109 Ilazen), Дубровское (рН 4.6; 182 Hazen), так и светловодными - Мотыкино (рН 4.8; 19 Hazen). Содержание соединений ртути в мышцах окуней из этих озер составляет соответственно 0610, 0.597 и 0.459 мг/кг. Сопоставление гидрохимических данных изученных малых озер и аккумуляции ртути в мышцах обитающих в них окуней согласуется с имеющимися в литературе данными обследования (Haines et ai., 1994) ряда бессточных нейтральных и кислых озер различной типологии, показавшими повышенный уровень ртути (0.8-1 0 мг/кг) у окуней из ацидных озер с рН<5.0, что превышает ПДК и представляет угрозу здоровью людей при употреблении рыбы в пищу- Показано преимущественное отложение ртути в мышечной ткани и печени по сравнению с кишечником, жабрами и гонадами самцов. Это объясняется повышенным содержанием в макромолекулах, присутствующих в мышечной ткани, функциональных групп белков (-SH, =NH2, -СООН, -ОН), к которым ртуть проявляет высокую степень сродства, и значительной ролью печени в де-токсикации соединений ртути за счет высокого содержания серосодержащих компонентов Гонады каждый год формируются заново, поэтому для них характерна меньшая степень аккумуляции токсиканта (Svobodova et al., 1999).
Выявленное снижение содержания тиоловых белковых групп, являющихся компонентами металлотионеинов (Немова и др., 2001) и исследуемых нами цистеинзависимых ферментов, можно расценивать как подавление защитных реакций на уровне
органов и систем организма, т.к. что свидетельствует об угнетении основного пути выведения тяжелых металлов - в связанном с серосодержащими лигандами состоянии с желчью (Clarkson, 1997; Urano, 1997).
Активность основной иистеинзависимой ггротеиназы лизосом катепсина В в мышцах имеет максимальное значение в тканях рыб из озер с рН 4.5, при этом в гонадах эта активность минимальная. Специфика изменения параметра в различных органах, очевидно, обусловлена различием в уровне аккумулированной ртути. Кроме того, известно (Bose et al., 1993), что в лизосомы проникает минимальное количество ртути в сравнении с другими компартментами клетки, поэтому активацию катепсина В в тканях рыб из наиболее ацидного озера можно объяснить реализацией защитной функции лизосом в процессах экскреции, а следовательно, детоксикации металлов.
Показано наличие у окуня протеолитической активности, активируемой ионами кальция, во фракциях белкового элюента с Мг 120,110 и 80 кДа. При сравнении данных не обнаружено существенных различий между уровнем активности кальпаина П у окуней из всех трех рассматриваемых озер, однако наблюдается достоверное увеличение активности кальпаина 1 в мышцах окуня в соответствии с ростом рН водоемов. Кроме того, у окуней из наиболее кислого озера достоверно выше активность субьединицы кальпаинов, образование которой является следствием аутолиза нативных форм фермента, по сравнению с таковой у окуней из оз.Мотыкино. Не исключено, что в данном случае автолиз инициирован воздействием ртути. Активация кальций-зависимого протеолиза в мышцах с более высоким уровнем ртути согласуется с данными (Gagne et al., 1990; Sakamoto et al., 1996) о дозо-зависимом повышении содержания ионизированного кальция в цитоплазме из внутриклеточных депо при воздействии препаратов ртути. Возможно, значение рН 4.5 является критической величиной, обусловливающей увеличение депонирования в органах рыб ртути.
Проблема закисленчя поверхностных вод актуальна также для малых озер Карелии. Даже при фоновом содержании компонентов ртути в среде, поступающих в водоемы при атмосферном переносе и с территорий водосборного бассейна, ее биогеохимический цикл в значительной степени преобразуется при воздействии сопутствующих факторов среды, главным образом, рН и содержания гуминовых веществ. Специфической особенностью поверхностных вод зоны тайги является повышенная заболоченность водосборной площади и, как следствие, высокое содержание гуминовых веществ и водородных ионов, обусловливающих кислую реакцию среды. Почти 70% озер таежной зоны имеют рН<7.0. Внутренние водоемы Карелии, расположенные в зоне северной тайги, отличаются от более южных водных экосистем повышенной чувствительностью и низкой устойчивостью к антропогенному загрязнению (За-личева и др., 2002).
Сравнивали окуней, отловленных в водоемах Карелии: оз.Чучъярви, оз.Урос, оз Вендюрское Кондопожского р-на (бассейн р.Суна), оз.Вегарусъярви и оз.Вуонтеленъярви Суоярвского р-на (бассейн р.Шуя). Было проанализировано по 30 особей разных полов и возрастных групп из каждого водоема. Концентрацию соединений ртути в мышцах рыб определяли сотрудники ИБВВ РАН (Борок) с помощью метода атомной абсорбции (Наза-ренко и др., 1986) Исследуемые озера близки по ряду гидрохимических характеристик, но сушественно различаются по степени закисленности и гумифицированности: оз.Чучъярви -рН 5.0, цветность 8 Hazen ([Hg] в мышцах окуней 0.10 мг/кг), оз.Урос - рН 5.9,9 Hazen ([Hg] 0.12 мг/кг), оз.Вендюрское - рН 7.0, 23 Hazen ([HgJ 0.15 мг/кг), оз.Вегарусъярви - рН 5.1, 105 Hazen ([Hg] 0.34 мг/кг), оз.Вуонтеленъярви - рН 4.6,186 Hazen ([Hg] 0.53 мг/кг).
Сопоставляя данные о содержании ртути в органах окуня и гидрохимические параметры, выявляется четкая взаимосвязь концентрации ртути и цветности. Зависимость концентрации ртути и ацидности водоема нелинейна. Так, аккумуляция ртути заметно повышена у окуня из наиболее ацидного озера (Вуонте-ленъярви), а минимальна - у окуня из наиболее светловодного озера (Чучъярви).
Ведущий фактор в данном еочетанном действии рН и цветности на биодоступность ртути для рыб выделить сложно, однако, реактивность некоторых биохимических показателей дает ключ к выявлению приоритетного фактора.
При визуальном наблюдении окуни из озера Вуонтеленъярви (наиболее закис-ленного и темноводного) отличаются от рыб из светловодных озер по окраске и состоянию внутренних органов, особенно печени, которая имеет более светлую окраску, включения цист, рыхлую структуру. Данные по возрастной характеристике рыб подтверждают вывод (Комов, 1999) о так называемой "тугорослослой" форме окуня в связи с низкой скоростью линейного роста в ацидных озерах по сравнению с обитающими в нейтральных. Следует также отметить, что при анализе отловленного материала из различных озер было обнаружено, что в оз. Вуонтеленъярви преобладают самки. В работе обсуждаются результаты, полученные для мышц и печени как главных мишеней для аккумуляции ртути в организме в связи с интенсивностью протекающих в них физиологических функций, обилием функциональных групп, обладающих сродством к ртути (мышцы) и ведущей роли в детоксикационных процессах (печень) посредством окислительных систем и низкомолекулярных серосодержащих белков.
Активность лизосомальной аспартильной (карбоксильной) протеиназы катепсина О, каталитическая способность которого напрямую не зависит от ковалентного связывания реакционных групп активного центра с ртутью, также различна у окуней из гидрохимически различающихся озер (рис. 8а,б). Реактивность катепсина Б в этих условиях может быть связана с участием фермента в детоксикационных и иммунных процессах в лизосомах. Активация фермента положительно коррелирует с увеличением цветности озер, т.е. ведущим фактором в данном случае можно считать степень гумифицированности водоема.
Полученные результаты подтверждаются данными о повышенном содержании тиоловых групп (свободных и связанных с белками) в исследуемых тканях самцов и самок окуней из оз.Вуонтеленъярви (№тоуа й а!., 2003) Это свидетельствует в пользу того, что такие сопутствующие ртутному загрязнению факторы как закисление и гумифицированность среды имеют однонаправленное влияние на содержание белковых тиолов (компонентов низкомолекулярных белковых веществ, включая металло-тионеины, и макромолекул, включая цистеиновые протеиназы) в мыпщах и печени в сторону увеличения их концентрации.
о ОД 0,4 0,6 о г 4 6 8
активность, Е 280/г ткани/ч . истинность, С 280/г ткани/ч .
Рис. 8. Активность катепсина Э (Еж/г ткани/ч) в мышцах (а) и печени (б) окуня Р АимаШю из озер, различающихся кислотностью, гумифицированностью и аккумуляцией ртути в мышцах рыб
Активность цистеинзависимой протеиназы лизосом катепсина В снижается в исследованных тканях окуней из темноводных, "кислых" озер с повышенным накоплением ртути в мышцах рыб (рис. 9а,б).
□ Чучъярви В У рос 0 Венд юрское 0 Вегарусъярви ■ Вуоителеиъярви
О 10 20 30 40 активность, Е 525/г ткани/30 мин.
0 10 20 30 40 активность, Е 525/г ткяии/ЭО мин.
Рис. 9. Активность катспсина В (Ьв/г ткани/30 мин) в мышцах (а) и печени (б) окуня Р АиуШгИз из озер, различающихся кислотностью, гумифицированностью и содержанием ртути в мышцах рыб
Содержание белков в тканях рыб из наиболее закисленного и темноводного оз. Вуон-теленъярви в печени самок и самцов окуней было ниже в 1.7-2.4 раза, чем в соответствующих образцах из оз. Чучъярви. Содержание белка в мышцах в данных условиях не различается достоверно (исключение - окуни из оз.Урос), что, вероятно, обусловлено определенной стабильностью биомолекул, входящих в состав мышечной ткани.
В мышцах самок окуней активность кальпаинов (табл. 2) связана обратной зависимостью с величиной рН водоема: она минимальна у окуней из нейтрального оз.Вендюрское и максимальна у рыб из наиболее ацидного оз.Вуонтеленъярви. Взаимосвязь исследуемого показателя с уровнем гумифицированности не прослеживается. Та же тенденция характерна и для жабр, при этом активность каталитически активной субъединицы кальпаина возрастает значительно. В гонадах самок достоверная активация наблюдается только у окуней из оз.Вуонтеленъярви, то есть ведущим фактором является ацидность среды. Однако роль гумифицированности становится очевидна при сравнении озер, близких по рН и достоверно различающихся по цветности -Чучъярви и Вегарусъярви - и выражается в подавлении как общей активности кальпаинов, так и снижении интенсивности автолиза нативных форм. Как следует из полученных в эксперименте данных, существенные отличия наблюдаются в активности кальпаина I: увеличение показателя напрямую зависит от снижения рН среды. Эта форма кальпаинов, судя по данным литературы, обнаруживает большую лабильность и в иных экологических и физиологических ситуациях (Катгатеп е1 а1, 1998; Воп-ёагеуа е1 а1., 2002). В данном случае мы наблюдали относительную стабильность активности кальпаина 11. То, что ответная реакция протеолиза в цитозоле выражается в модуляции активности кальпаина I, косвенно указывает на развитие приспособительных реакций кальций-зависимого протеолиза в клетке. Наблюдаемые изменения активности кальцийактивируемых протеиназ указывают на наличие половых различий в тканеспецифичности ответа на вышеназванные факторы.
Таким образом, результаты исследования уровня активности протеолитиче-ских ферментов, содержания белка и тиоловых групп свидетельствуют о том, что в организме окуней, обитающих в озерах с более низким значением рН и сравнительно большим содержанием биодоступной ртути в мышцах рыб наблюдается снижение содержания белка, активация катепсина В и кальпаинов. Указанные показатели у окуней из нейтральных и низко-гумифицированных озер (Урос, Вендюрское) минимальны. Влияние степени гумификации, выявляемое при сравнении озер, близких по рН, но значительно различающихся цветностью (Чучьярви и Вуонтеленъярви), выражается в достоверных активации кальпаинов и катепсина
Б, снижении активности катепсина В и концентрации белка. Активность аспар-тильной протеиназы катепсина Г) в большей степени коррелирует с уровнем гумификации. Эти результаты, а также визуальные наблюдения состояния внутренних органов окуней, отловленных из разных водоемов, свидетельствуют о неблагополучном состоянии рыб из оз.Вуонтеленъярви и отрицательном влиянии на тиолы и цистеиновые (тиоловые) протеиназы, что обусловлено, скорее всего, воздействием ртути, усиливающемся, как известно, с закислением и органическим загрязнением водоема.
Таблица 2. Уровень Са2+-зависимой активности в тканях окуня Р. /¡^¡аИПя из озер, различающихся кислотностью, гумифицированностью и аккумуляцией ртути
в мышцах рыб
Удельная активность Ено/г белка/час х 103 (М±1п, п=8)
Ткань пол кальпаин I кальпаин 11 субъединица 80
кДа суммарная
Оз. Чучъярви
мышцы ? 4 40± 0 35 7 47 ± 0 89 11 30 ± 0 37 23 00 ±0 93
мышцы с? 4 17 ± 0 64 6 00 ± 0 73 17 90 ±0 22 27 98 ± 0 45
гонады 9 1 30±016 1 13 ±0 И 0 2 26±0 ,31
жабры 9 17 50 ±0 23 3 51 ±0 53 23 70 ± 0 56 44 70± 1 84
жабры с? 17 00± 1 04 2 00 ± 0 24 13 00 ±0 45 32 00 ± 1 78
Оз. Урос
мышцы 9 2 15 ±0 17 2 87 ± 0 23 1 20±0 10 6 22 ± 0 34
мышцы с? 147 ±0 13 6 86 ± 0 66 5 39 ± 0 42 13 71 ±0 98
жабры ? 6 78 ± 0 57 4 24 ± 0 51 14 69 ± 1 02 25 71 ± 1 15
жабры в 13 22 ± 0.93 16 09 ±2 00 10 34 ±0 91 39 65 ± 2 75
Оз. Вендюрское
мышцы $ 2.94 ±0 12 5 40 ± 041 3 30 ±0 21 11 64± 1 02
мышцы с? 4.10±036 5 50 ± 0 80 0 96 ±0 01 10 60 ± 0 87
гонады 9 2.30 ±0.28 0 0 2 30 ± 0 04
гонады с? 0 0 4 40 ± 0.32 4 40 ± 0 41
жабры 5 20 ± 0 64 30 00 ± 1 58 0 35 20± 1 45
Оз. Вегарусьярви
мышцы 9 0 54 ± 0 04 1.62 ± 0 13 3.23 ±0 27 5 39 ±0 41
мышцы с? 2 25 ± 1.45 360±031 0 5 85 ± 0 40
гонады 9 0 84 ± 0 04 0 84 ± 0 06 0 168 ±013
жабры 9 0 226±0 19 3 69 ± 0 32 5 95 ± 0 40
Оз. Вуонтеленъярви
мышцы 9 5.10±061 15 87 ±0 11 12 70 ± 1 48 33 70 ± 2 75
мышцы с? 1840±0 18 8 00 ± 0 93 9 78 ± 0 23 36 20 ± 1 05
гонады 9 5 70 ± 0 23 6 67 ± 0 79 6 48 ± 0 74 18 50 ± 0 22
жабры 9 19 40 ± 0 49 16 13 ±0 45 63 40 ± 2 28 98 90 ± 5 86
жабры с? 34 60 ± 0 85 7 69 ± 0 85 28 20 ±0.78 70 50 ± 2 06
5.2 Влияние пищевой интоксикации соединениями ртути на протеолизу карася Сагач-яшя сагач$ш.ч и окуня Регса/¡ипа^Ш Ь. в аквариальныхусловиях
Изучен дозо-зависимый эффект ртути на рыб в аквариальном эксперименте, поставленном сотрудниками ИБВВ РАН (Борок) под руководством д.б.н. В.Т. Комова. Для эксперимента рыба (окунь, карась) была отловлена в озере с нейтральным значением рН и акклимирована к лабораторным условиям в течение 20 дней (рН 8.0, Т=14-15 °С). По истечении этого периода брали "исходную" точку. Далее опытные группы в течение 30 суток (окунь) или 75 суток (карась) кормили рыбным фаршем (объем корма - 4% от массы тела в сутки), содержащим ртутные компоненты в количествах 0.11мг/кг ("контроль") и 0.48 мг/кг ("опыт").
Как показали данные, полученные в лаборатории экотоксикологии ИБВВ (группа В Т. Комова) (табл. 3), уровень ртути, депонированной в органах рыб, четко коррелирует с количеством ртути в корме, что свидетельствует о бионакоплении токсиканта.
Таблица 3. Содержание ртути в мышцах рыб, подвергавшихся пищевой интоксикации соединениями ртути (М±ш, п=17)
Вариант Карась Carassius carassms Окунь Регса fluviatilis
"исходная"точка 0 24 ± 0 05 0 13 ± 0 05
контроль - 30 суток (в корме 0 11 мг/кг) - 0 31 ±0 02
опыт - 30 суток (в корме 0 48 мг/кг) - 0 59 ± 0 05
контроль - 75 суток (в корме 0 11 мг/кг) 0 54 ± 0 03 -
опыт - 75 суток (в корме 0 48 мг/кг) 121 ±0 04 -
На рисунке 10а приведены данные по изменению активности катепсина В в тканях рыб в аквариальном эксперименте. В печени карася наблюдается достоверная активация этой протеиназы в "контроле" по сравнению с "исходной" точкой, а в мышцах показатель стабилен. В мышцах окуней активность катепсина В возрастает в зависимости от дозы поступающей с пищей ртути.
Рис. 10. Активность (а) катепсина В (Е525/г ткани/30 мин) в тканях и (б) кальпаинов (Е2?о/г ткани/ч) в мьштах окуня Р /1и\>ШШч и карася С сага^шх при пищевой инт оксикации соединениями ртути
На рис 66 отражены значимые (р<0.05) дозозависимые отличия активности каль-паина I у окуня из трех групп, отличия у карася недостоверны. Как уже отмечалось, этот показатель наиболее чувствителен к воздействию токсикантов. Характерно, что в данном случае наблюдается прирост активности кальпаина II у карася в ответ на высокое содержание ртути в корме. Кроме того, соединения ртути, по-видимому, инициируют
распад нативных форм кальпаинов, так как показан дозозависимый прирост субъединичной активности в мышцах карася. В целом, можно говорить об адаптивном характере изменений кальций-зависимого протеолиза при ведущей роли кальпаина I в так называемой "срочной" адаптации к изученному фактору.
Концентрация тканевых белков достоверно возрастает в органах карася из контрольной группы, т.е. при "слабом" воздействии, и близка к исходной в опытной группе. Это может отражать накопление белков с дефектной структурой, образовавшихся при непосредственном взаимодействии ртути и SH-групп белков, которые могут утилизироваться лизосомальной системой гидролаз. У окуня содержание белка достаточно стабильно.
Следует отметить, что в условиях данного эксперимента проявилась меньшая устойчивость карася к изучаемому фактору по сравнению с окунем; об этом свидетельствует и активация кальпаина П, характерная для развития патологических процессов в ткани (Johnson, 1990; Немова, 1996), и повышенный аутолиз основных форм кальпаина, а также отсутствие изменений со стороны лизосомального катепсина В, участвующего в процессах биотрансформации и экскреции ксенобиотиков из клеток, и увеличение белкового пула, вероятно, за счет дефектных макромолекул. Не исключено, что указанные негативные явления обусловлены помимо видовых особенностей и более длительным воздействием ртути на карася (75 сут), чем на окуня (30 сут).
С целью установления особенностей воздействия соединений ртути, обусловленных эволюционной спецификой теплокровных животных, был проведен модельный эксперимент по пищевой интоксикации крыс неорганическими солями ртути. Было показано, что острое воздействие ртути приводит к ингибированию цистеиновых протеиназ, а при длительном воздействии наблюдаются компенсаторные перестройки в белковом обмене. При этом хорошо растворимые соли оказывали более выраженное воздействие на ферменты в цитозоле, а малорастворимые - в лизосомах. Пищевые энтеросорбенты незначительно компенсируют токсическое действие ртути. Полученные результаты могут свидетельствовать о существовании в тканях рыб и крыс определенной специфики ответной реакции на уровне катаболизма внутриклеточных белков на ртутную интоксикацию, которая может быть связана с разной резистентностью к токсиканту и являться видоспецифической характеристикой.
Глава 6. Роль солености окружающей среды для водных организмов
Соленость - один из важнейших абиотических факторов среды. Способность гидро-бионтс® существовать при значительных изменениях солености (эвригалинность) обусловлена различными приспособлениями, анализ которых позволяет разделить эвригалинные организмы на две основные группы. Одна из них - гомеосмотические животные (осморегулято-ры), характеризующиеся наличием осмотической регуляции, основанной на работе механизмов активного транспорта ионов, прежде всего натрия и хлора, достаточно хорошо изучена на примере позвоночных животных, ракообразных и некоторых полихет (Гинецинский, 1963; Наточин, 1967,1976; Проссер, 1977, и др.). Другая группа объединяет пойкилоосмотические организмы (осмоконформеры). Многие пойкилоосмотические организмы, не способные регулировать осмотическое давление жидкости внутренней среды, отличаются, тем не менее, значительной эвригалинностью. Морские моллюски, включая представителей семейства Mytilidae, относятся к типичным пойкилоосмотическим организмам, весьма эвригалинны и способны существовать в диапазоне солености от 4-5%о до 75-80%о. Соленостные адаптации этих животных весьма разнообразны и гораздо хуже изучены, чем соответствующие приспособления гомеосмотических организмов. Ведущая роль в осмотической и объемной регуляции клеток моллюсков принадлежит неорганическим ионам (Наточин, Бергер, 1979), особенно натрию (Наточин и др., 1979). Помимо регуляции электролитного состава клеток, роль натрия важна в реализации клеткой генетической информации, регулировании биосинтетической "машины"
22
клетки в ходе ее ответа на внешние воздействия (Бергер, Харазова, 1971; Kroeger, 1967, 1977; Lezzi, 1970). При этом меняется скорость синтеза РНК и белка, преобразуется активность ряда ферментов, появляются новые изозимные фракции. Таким образом, адаптации к изменению солености среды обеспечиваются деятельностью целого комплекса механизмов, среди которых важная роль принадлежит биохимическому метаболизму, лежащему в основе развития компенсаторных реакций клетки при адаптации к различным внешним воздействиям. Внутриклеточный протеолиз, как уже указывалось выше, является одним из необратимых регуляторных механизмов в клеточном метаболизме. Участие ферментов внутриклеточного протеолиза в развитии адаптивных реакций у водных организмов к изменению солености до настоящего времени изучено достаточно фрагментарно. В связи с этим, мы изучили реакцию активности лизосомальных протеиназ и кальпаинов у мидий при изменении солености среды обитания. Известно, что интенсивность обмена белков зависит от многих внутриклеточных факторов и, прежде всего, от ионных модуляторов (Харазова, 1974; Ми-rachietal., 1981).
В качестве объектов исследования использовали мидий Mytilus edulis, собранных в августе 2002 года в литоральной и сублиторальной зонах Белого моря в районе биостанции ЗИН РАН "Картеш". Мидий распределяли по аквариумам с водой различной солености: 5, 15, 25, 35 и 45%о (Т=10 °С). Контролем служили мидии, находящиеся в аквариуме при солености 25%о, что соответствует солености Белого моря. Пониженную соленость создавали добавлением пресной воды, повышенную - добавлением солей, идентичных по составу морской воде. Экспозиция опыта 12 суток.
Активность протеиназ лизосом - катепсинов В и D - изменялась в зависимости от солености среды, в которой содержались мидии (рис. 11а,б). В интервале солености, близком к контрольному (15%о и 35%о), наблюдается частичное подавление активности катепсинов. Это может бьпъ отражением общего снижения уровня белкового обмена при т.н. "умеренных" воздействиях факторов среды. При минимальной солености (5%о) происходит значительная активация катепсинов В и D. Активация лизосомальных протеиназ, вероятно, является следствием лабилизации мембран лизосом, пропорциональной силе стресса (Moore, 1985; Nicholson, 1999), что ускоряет гидролиз белков и обусловливает клеточную атрофию (Lowe, Clarke, 1989).
i 10
1
QuirencxH В О (едок
гЬ т
а
'i
Рис. 11. Активность (а) катепсина В (Е325/Г ткани/30 мин), (б) кагепсина Р (Е2во/г ткани/ч) и содержание белков (мг/мл центрифугата) у мидий МуиШя е<1иШ литоральной и сублиторальной зон Белого моря при акклимации к солености: 1 - 5%о; 2 - 15%о, 3 - 25%о (контроль), 4 - 35%»; 5 - 45%о
Фракции белкового элюента с М, 110,80 и 65 кДа, содержащие Са2+-зависимую протео-литическую активность у мидий после гель-хроматографического разделения на 8ерЬасгу1
8200, могут быть идентифицированы как гомологи качьпаина II (активируемого мМ [Са24-],), кальпаина I (активируемого цМ [Са2+],) и каталитически активной субьединицы кальпаина высших животных. У мидий контрольной группы значения активности кальпаинов сопоставимы с таковыми у исследованных ранее морских и пресноводных рыб и млекопитающих (ТоуоЬага й а1., 1985; МеИога е1 а1., 1992). Активация кальпаинов у мидии, выдержанных при повышенной солености, и подавление - при пониженной, отражают стрессовую реакцию клеточного метаболизма (рис. 12).
Рис. 12. Распределение общей С'а2+-зависимой активности между молекулярными формами кальпаина (Мг 110, 80, 65 кДа) у мидий М еск/Ия литоральной и сублиторальной зон Белого моря при акклимации к солености: 1 - 5%о; 2 -15%о; 3 - 25%о (контроль); 4 - 35%о; 5 - 45%о
Реакция на уровне внутриклеточного протеолиза у мидий в эксперименте, по-видимому, имеет адаптивную направленность, поскольку не зафиксирована обычная для патологических перестроек гиперактивация кальпаина 11 (Johnson, 1990). Следует также учесть, что ионы Са2+ и К+ часто выступают в качестве аполярных антагонистов, и даже незначительное повышение внутриклеточного К+ при повышении солености среды, можег привести к тому, чю К+ начинает конкурировать с кальцием за участие в кальций-опосредумых процессах, в том числе выступая регулятором активности кальпаинов. В целом, относительная стабильность молекул ферментного белка, о чем свидетельствует незначительный прирост субъединичной активности кальпаинов, частично подтверждает тот известный факт, что у эвригалинных пойкилоосмотических беспозвоночных допустимые изменения концентрации солей, при которых обеспечивается сохранность нативной конформации различных макромолекул, гораздо шире, чем у стеногалинных беспозвоночных или позвоночных животных, поддерживающих постоянный электролитный состав клеток (Somero, Low, 1977).У мидий, выдержанных в средах, близких к типичной солености Белого моря, наблюдается незначительное уменьшение белкового пула в тканях (рис. 11 а,б), что отражает некоторую супрессию белкового обмена в целом при так называемых "умеренных воздействиях". Подтверждением этому служат данные, полученные
методом авторадиографии (по интенсивности включения 358-метионина и 3Н-глицина) для моллюсков L littorea, обитающих в Белом море при солености 25-26%о: синтетическая деятельность клетки в условиях пониженной солености снижалась срачу после начала опыта и восстанавливалась при сохранении нагрузки через 28 часов (Харазова, Бергер, 1974).
Следует отметить, что у мидий, обитающих в литоральной зоне достоверные отклонения изучаемых параметров зафиксированы лишь при солености 5%о (рис. 11а,б, 12). Преадаптированность этой группы мидий к обитанию в прибрежной зоне с неустойчивым температурным, соленостным и кислородным режимом выражается в повышенной устойчивости к гипоксии и факультативному анаэробиозу, сопровождающих ответную реакцию на резкие колебания факторов среды. Параметры состояния системы протеолиза у мидий подтверждают данные о пределах диапазона толерантности вица по отношению к фактору солености. Значительное опреснение среды в большей степени угрожает стабильности обменных процессов на клеточном уровне, а, следовательно, и благополучию организма в целом, чем повышенная соленость. Несомненно, что дальнейшее детальное исследование приспособлений к изменению солености различных беспозвоночных, являющихся более примитивной, исходной формой адаптации, чрезвычайно важно не только для анализа эволюционных аспектов проблемы эвригалинности, но и в целом необходимо для создания общей теории адаптации (Уоддингтон, 1970).
Наряду с исследованиями внутриклеточного протеолиза у беспозвоночных при изменении солености среды обитания, были получены данные по влиянию солености среды на некоторые показатели белкового обмена у личинок атлантического лосося Salmo salar L и наваги Eleginus navaga Pall., обитающей в открытом Белом море и в устье р.Кемь.
Лосось является представителем проходных (катадромных) рыб, в связи с чем является весьма эврибионтным видом, однако, не обладает способностью к осморегуляпии на ранних стадиях жизненного цикла (Idler et al, 1959). При аквариальной акклимации смолтов к полносоленой воде общий уровень кальций-зависимой активности снижается в решающей мере за счет подавления активности субъединицы 80 кДа. Однако наблюдается достоверная активация кальпаина I, что объясняется прежде всего повышением [Са2+], - основного эффектора активности кальпаинов - на данной стадии развития (Рапу, 1961). Кроме того, высокий уровень натрия в организме, обусловленный его концентрацией в морской воде (Kroeger, 1967, 1977; Lezzi, 1970), может приводить как к снижению синтеза фермента de novo, так и к сокращению белковых субстратов протеиназ. Еще одним вероятным механизмом регуляции активности кальпаинов может быть значительное уменьшение содержания ненасыщенных высокореактивных липидов (Lovern, 1950). Кроме того, осморегуляторные процессы требуют дополнительных энергетических трат, что в целом может привести к некоторой супрессии прочих путей метаболизма.
Сравнение показателей в тканях наваги из различных биотопов показало, что наблюдаемые изменения уровня активности протеиназ в большей степени обусловлены вариацией солености и минерализации среды, чем ухудшением экологического состояния в дельте р Кемь по сравнению с открытым морем. Так, известно, что изменение солености в эстуарии влияет на концентрацию кальция в клетках водных организмов (Scheuhammer et al., 1997), являющегося основным эффектором кальпаинов. При этом следует отметить тканеспецифич-ность ответа протеолитической системы на состояние среды. Изменение среды обитания наваги в устье р.Кемь отражается на биохимическом статусе рыб, и в первую очередь адаптивные изменения происходят в жабрах - органе, ответственном за процессы осморегуляции и непосредственно соприкасающемся с содержащимися в воде химическими соединениями.
выводы
1. Основные внутриклеточные протеолитические ферменты у исследуемых рыб и водных беспозвоночных, представленные лизосомальными катепинами В и D и кальций-активируемыми протеиназами питозоля, участвуют в регуляции их функционального состояния. При этом показано их синергическое действие в различных эколого-физиологических ситуациях.
2. Протеиназы исследуемых ракообразных, моллюсков, костистых рыб по физико-химическим свойствам обнаруживают сходство между собой и различаются только уровнем активности и лабильностью в ряде экологических ситуаций. Это указывает на их определенную эволюционную консервативность.
3. Реактивность протеолитических ферментов у водных организмов в ответ на изменение солености среды зависит от степени сформированное™ осморегуляторного аппарата и физиологической толерантности вида к фактору солености.
4. Активность и свойства изученных протеиназ отражают степень загрязнения водоемов поллютантами различной природы - компонентами промышленных и бытовых сточных вод, при этом хищные виды рыб и самцы обнаруживают меньшую резистентность.
5. Активность и свойства внутриклеточных протеиназ отражают биохимический статус гидробионтов в условиях загрязнения водоемов ртутью, при этом значителен вклад сопутствующих факторов среды (ацидности и гумификации) в биодоступность соединений ртути. Внутриклеточные протеиназы принимают участие в процессах поддержания клеточного гомеостаза при кратком (в эксперименте) и хроническом воздействии ртути.
6. Изменение активности внутриклеточных протеиназ у исследуемых водных организмов в условиях изменяющихся факторов среды свидетельствует об участии этих ферментов в развитии компенсаторного или патологического процесса. Динамика активности и свойства протеиназ в различных эколого-физиологических ситуациях позволяет оценить пределы резистентности и толерантности внутриклеточного протс-олиза у изученных видов и служит дополнительным биохимическим критерием при оценке влияния на гидробионтов изменяющихся естественных и антропогенных факторов среды.
Список опубликованных работ по теме диссертации:
1. Nemova, N., Kaivarainen, Е., Krupnova, М, Bondareva, L. The effect of toxic factors on intracellular proteinase activity in freshwater fish. Proceedings of 5 conf. "Ichthyohaematology", Protivin, Czech Republic. 1998. P. 72.
2. Kaivarainen, E., Nemova, N, Krupnova. M., Bondareva, L. The effect of toxic factors on intracellular proteinase activity in freshwater fish. Acta vet Brno 67.1998. P. 306-316.
3. Nemova N, Bolotnikov I., Bondareva L., Ostashkova V., Volokhova N. The effect of inorganic mercuiy salts on cysteinic proteinase activity in rats: comparative characterization. In: V intern, conf! on mercury as a global pollutant, Rio de Janeiro, Brazil. 1999. P. 152.
4. Nemova, N., Kaivarainen, E., Krupnova, M., Bondareva, L. Intracellular proteinases of freshwater fish as indicators of ecological load. In: HI intern, symp. on monitoring and sustainable management of Lake Ladoga and other large lakes, Petrozavodsk. 1999. P.71.
5. Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И., Крупною М.Ю., Бондарева JI.A. Комплексный подход к тестированию природных сред. Тез. докл. межцународ. конф. "Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова Восточной Фенноскандии", Петрозаводск 1999. С. 17.
6. Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е И., Бондарева JI.A. Роль внутриклеточных протеолитических ферментов в созревании и раннем развитии лосося Salmo salar L. Тез. докл. международ, конф. "Атлантический лосось Salmo salar: биология, запасы, воспроизводство", Петрозаводск. 2000. С. 70-71.
7. Nemova, N., Kaivarainen, Е., Bondareva, L. Detection and properties of calpain in some fish erythrocytes. In- Sixth European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells, Paris, France. 2000. P. 37-38.
8. Немова Н.Н, Кяйвяряйнен Е.И., Бондарева J1.A. Обнаружение и свойства кальпаина в эритроцитах некоторых рыб. Материалы международ, конф. "Биокатализ 2000". М: Изд-во МГУ, 2000. С. 134-135.
9. Nemova N., Kaivarainen Е., Krupnova М, Bondareva L., Toivonen L, Komov V. The effect of mercury and acidity от biochemical indices of freshwater fish. In: The intern, conf "The biological essentiality of macro and trace elements", Jena, Germany..2000. P. 814-818.
10. Немова HH, Кяйвяряйнен Е.И., Бондарева ДА., Крупнова М.Ю. Влияние соединений ртути на калышйактивируемые протеиназы пресноводных рыб. Матер, международ, конф.
Экологическая физиология и биохимия рыб", Ярославль. 2000. С. 74-75.
11. Немова Н. Богдан в., Кяйвяряйнен Е, Крупнова М, Смирнов Л, Тойвонен Л., Гурьянова С., Бондарева JL, Суховская И Влияние соединений ртути и закисления водоемов на биохимический статус рыб. Тез. докл. международ. конф. "Поморье в Баренц Регионе: Экономика, экология, культура", Архангельск, Институт экологических проблем Севера УрО РАН 2000 С. 166.
12. N.N. Nemova, E.I. Kaivarainen and LA Bondareva: Ca^-activated neutral proteinase in some fish erythrocytes. Vestnik moskovskogo Universiteta. Khimia. 2000. Vol.41, № 6. Suppl. P. 106-108.
13. Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И, Крупнова М.Ю., Бондарева JIА. Роль внутриклеточных протеиназ в эколого-биохимических адашшиях у пресноводных рыб. Материалы конф. "Экологические проблемы онтогенеза рыб (физиолого-биохимические аспекты). М: Издательство МГУ, 2001. С.171-177.
14. Немова Н.Н, Кяйвяряйнен Е.И, Крупнова М.Ю., Бондарева Л А, Тойвонен Л.В., Комов
B.Т. Активность внутриклеточных протсолитических ферментов в тканях речного окуня Регса fluviatilis с различным содержанием ртути. Вопросы ихтиологии. 2001. Т.41, №5, с. 704-707.
15. Немова Н, Кяйвяряйнен Е, Крупнова М., Богдан В., Смирнов Л, Тойвонен Л, Гурьянова
C., Бондарева JL, Комов В. Биохимическая индикация влияния ртути на рыб. Тез. докл. конф. "Современные проблемы биоицдикации и биомониторинга", Сыктывкар. 2001.137-138 с.
16. Bondareva LA, Nemova N.N., Kaivarainen E.L, Krupnova M.Yu.. Effects of dietary intoxication by mercury salts on cysteinic proteinase activity in rat tissues. In: totem. Symposium 'Trace Elements in Human: New Perspectives". Greece, Athens. 2001. P.l 1.
17. LA Bondareva, N.N. Nemova, E.I. Kaivarainen, M.Yu. Krupnova, V.V. Ostashkova. Effects of (he dietaiy intoxication by mercury salts on cysteinic proteinase activity in rat tissues and detoxic role of absorbents. Proceedings of 3 Intern. Symposium Trace Elements in Human: New Perspectives" Greece, Athens, 2001.98-105 pp.
18. Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова МЮ., Бондарева Л А, Богдан В.В, Мухин
В А Механизмы протеолитической регуляции в развитии гидробионтов. Вопросы рыболовства 2001. С. 189-192.
19. Бондарева Л.А. Са -активируемые протеолитические ферменты у рыб и водных беспозвоночных. СПб.: Вестник молодых ученых №4,2002 (Серия: Науки о жизни №1,2002). С. 5220. Бондарева ЛА, Кяйвяряйнен Е.И, Немова Н.Н., Шкляревич ГА Кальцийаюивируемые протеолитические ферменты (кальпаины) у амфипод. Тез. докл. V симп. "Химия протеолити-ческих ферментов", Москва, 2002. С. 53.
21. Luidmila A Bondareva, Nina N. Nemova, Elena I. Kaivarainen, Marina Yu. Krupnova The effect of mercury compounds on intracellular proteolysis in freshwater fish. In: 11 International Symposium on Trace Elements in Man and Animals (ТЕМА 11), Berkeley, California USA 2002, p. 136137.
22. Бондарева ЛА, Кяйвяряйнен Е.И, Немова Н.Н. Кальпаины эритроцитов форели Salmo tmttaL. Тез. науч. докл. III съезда биохим. общества, СПб.,2002. С. 569.
23. Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И, Бондарева ЛА Са -активируемые протеиназы у рыб и водных беспозвоночных. Тез. науч. докл. Ш съезда биохим. общества, СПб., 2002. С. 554.
24. Немова Н.Н., Кяйвяряйнен ЕЙ, Крупнова МЮ., Бондарева Л. А Механизмы внутриклеточного протеолиза в биохимических адаптациях у гидробионтов. Тез. докл. междунар. семинара "Современные проблемы физиологии и экологии морских животных (рыбы, птицы, млекопитающие)", Ростов-на-Дону, 2002. С. 124-126.
25. Nina N. Nemova, Elena I. Kaivarainen, Marina Ju. Krupnova, Lyudmila A Bondareva. Intracellular proteinases in fish as indicators of environmental load. Extended abstracts in: "The 2™^ AMAP Intern. Symp. cm Environmental Pollution of the Arctic", Rovaniemi, Finland, 2002.
26. Bondareva, L., Kaivarainen, E., Krupnova, M., Nemo cell proteolytic enzyme system in some fish. In: "Macro am 711-716.
27. JIA Бондарева, Е.И. Кяйвяряйнен, М.Ю. Крупно ние загрязнения прибрежной акватории Белого моря на (Gammaridae). Тез. докл. конф. "Современные проблем: 135-136.
28. Н.Н. Немова, ЕЛ Кяйвяряйнен, МЮ. Крупнова, нова, JLB. Тойвонен, Л. А. Бондарева, И.В. Суховская, 1 озер на биохимический статус органов у рыб, отаича Тез. докл. конф. "Современные проблемы юдной тока?
29. L. Bondareva, Е. Kaivarainen, М. Krupnova, N. Nen. some fish under the effect of ore-dressing sewage. In: "XXI century: ecological science in Armenia", Yerevan, 2002. P. 136.
30. Бондарева Л., Немова H, Кяйвяряйнен Е., Крупнова М, Осташкова В. Влияние пищевой интоксикации салями ртути на активность цистеиновых протеиназ в тканях крыс. Известия АН Серия биол_ № 1,2003. С. 47-50.
31. Lyudmila A. Bondareva, Elena I. Kaivarainen, Marina Yu. Krupnova, Nina N. Nemova The methylation process in limnic sediments affects mercury bioavailability. In. "2 Intern. Conf on Enzymes in the Environment: Activity, Ecology, Applications", Czech Republic, Prague, 2003, p. 48.
32. Nemova N.N., Bogdan V.V., Gurjanova S.D., Krupnova MYu., Kaivarainen E.L Smimov L.P., Toivonen L.V., Bondareva L.A., Sukhovskaya I.V., Komov V.T. Effects of mercury and water acidification on fish biochemical status. In: the XI Intern. Symp. on Bioindicators "Modem Problems of Bioindication and Biomonitaring", Russia, Syktyvkar, 2001.Ed. Syktyvkar, 2003. P. 308-318.
33. Л.А. Бондарева, HH Немова, Е.И. Кяйвяряйнен, МЮ, Крупнова. Влияние стоков горнообогатительного комбината на систему внутриклеточного протеолиза у рыб. Тез. докл. меявду-народ. конф. "Экологические проблемы бассейнов крупных рек - 3", Тольятти, 2003. С. 39.
34. Bondareva L., Kaivarainen Н, Nemova N. Evolution of molecular fcrais and biological role of calcium-dependent proteolytic enzyme. In: "9^ Meeting of PhD Students in Evolutionaiy Biology", Switzerland, Fiesch, 2003. P. 19-20.
35. N. Nemova, E. Kaivarainen, L. Bondareva, S. Guryanova, M Krupnova, L. Toivonen, V. Komov. The effect of modeling dietary uptake of mercury compounds on intracellular proteolysis in muscle of freshwater fish. In: the 4 Intern. Symp. "Trace Elements in Human: New Perspectives", Part I. Athens, Greece, 2003.836-844 pp.
36. H.H. Немова, М.Ю. Крупнова, Е.И. Кяйвяряйнен, Л. А. Бондарева, И.Н. Бахмет. Влияние различных концентраций солености на протеолитическую систему мидий Mytilus edulis Белого mojm. Тез. международ, науч. конф. "Инновации в науке и образовании - 2003". Калининград,
37. Lyudmila A. Bondareva, Helena I. Kaivarainen, Nina N. Nemova Evolution of the adaptive response reactions of sulfur-containing bioligands on mercury contamination in various animals. In: "l<r Meeting of PhD Students in Evolutionary Biology", Shrewsbury, Great Britain, 2004. P. 11.
Щд лиц. № 00041 от 30 08 99. Подписано в печать 25.08 04. Формат 60x84'/,6 Бумага офсетная Гарнитура «Times» Печать офсетная Уч-изд л 1,5 Уел печ л 1,6. Тираж 100 экз Изд. №50 Заказ №433
Карельский научный центр РАН 185003, Петрозаводск, пр А Невского, 50 Редакционно-издательский отдел
»18422
РНБ Русский фонд
2005-4 12550
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бондарева, Людмила Александровна
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Общая характеристика внутриклеточного протеолиза.
1.1. Протеолитические ферменты.
1.1.1. Сериновые протеиназы.
1.1.2. Цистеиновые (тиоловые) протеиназы.
1.1.2.1. Лизосомальные протеиназы.
1.1.2.2. Са2+-активируемые нейтральные протеиназы цитозоля.
1.1.3. Аспартильные (карбоксильные) протеиназы.
1.1.4. Металлопротеиназы.
1.1.5. Мультикаталитические протеиназы.
2. Особенности протеолитических ферментов водных организмов и их участие в эколого-биохимических адаптациях.
3. Влияние загрязнения и сопутствующих факторов среды на водные организмы.
3.1. Общие положения токсичности.
3.2. Влияние промышленных и бытовых сточных вод.
3.3. Влияние тяжелых металлов.
3.4. Влияние соединений ртути.
4. Роль солености окружающей среды для гидробионтов.
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Материал.
1.2. Характеристика материала.
1.3. Методика отбора и хранения биологических проб.
2.2. Методы исследований.
2.2.1. Определение стадии зрелости исследуемых организмов.
2.2.2. Приготовление гомогенатов тканей и экстракция протеиназ.
2.2.3. Количественное определение водорастворимого белка в тканях.
2.2.4. Определение активности протеиназ.
2.2.4.1. Определение активности катепсина В.
2.2.4.2. Определение активности катепсина D.
2.2.4.3. Определение активности Са -зависимых нейтральных протеиназ
2.2.5. Схема выделения и очистки исследуемых протеиназ.
2.2.5.1. Разделение белков из тканей исследуемых объектов методом гель-фильтрации на колонках с ультрагелем АсА 34 и сефадексом S
2.2.5.2. Определение молекулярной массы исследуемых белков методом гель-фильтрации.
2.2.5.3. Ионообменная хроматография на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой.
2.2.5.4. Оценка чистоты препаратов протеиназ методом электрофореза в полиакрил амидном геле.
2.2.6. Статистическая обработка данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Глава 3. Частичная очистка, распределение, видо-, тканеспецифичность и некоторые физико-химические свойства Са2+-активируемых нейтральных протеиназ гид-робионтов.
3.1.Активность и тканеспецифичность кальпаинов рыб и водных беспозвоночных.
3.2. Свойства Са2+-зависимых протеиназ из гомогенатов цельных амфипод Gammaridae spp.
3.3. Свойства Са2+-зависимых протеиназ из эритроцитов форели Salmo trutta L.
Глава 4. Влияние антропогенного загрязнения водоемов на внутриклеточный протеолиз у водных организмов.
4.1. Влияние антропогенного загрязнения прибрежной акватории Белого моря на внутриклеточный протеолиз у амфипод Gammaridae spp. и мидий Mytilus edulis L.
4.2. Влияние стоков горно-обогатительного производства на внутриклеточный протеолиз у щуки Esox lucius и плотвы Rutilus rutilus.
Глава 5. Влияние соединений ртути на внутриклеточный протеолиз у рыб и млекопитающих.
5.1. Влияние ртутного загрязнения в сочетании с сопутствующими факторами (ацидификация, гумифицированность) на протеолиз в тканях окуня Perca flu-viatilis L. из малых озер Вологодской области и Карелии.
5.2. Влияние пищевой интоксикации соединениями ртути на внутриклеточный протеолиз у карася Carassius carassius и окуня Perca fluviatilis L. в аквариальных условиях.
5.3. Влияние пищевой интоксикации солями ртути, различными по растворимости, на внутриклеточный протеолиз в органах крыс и протекторная роль эн-теросорбентов.
Глава 6. Роль солености окружающей среды для водных организмов.
6.1. Влияние различной солености среды на показатели внутриклеточного протеолиза у мидий Mytilus edulis L. в аквариальных условиях.
6.2. Влияние солености среды на некоторые показатели белкового обмена у личинок атлантического лосося Salmo salar L.
6.3. Влияние солености среды на показатели белкового обмена у наваги Eleginus navaga Pall.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние некоторых факторов среды на внутриклеточный протеолиз у гидробионтов"
Актуальность проблемы. Выяснение биохимических механизмов развития адаптивных реакций у животных является важным аспектом решения одной из фундаментальных проблем биологии - взаимодействия организма и среды. Особый интерес представляет изучение биохимических адаптаций у водных организмов (беспозвоночных и рыб), являющихся пойкилотермными животными, у которых легче, чем у теплокровных, установить взаимосвязь со средой, так как у них эта система в большей степени открыта. Результаты таких исследований могут иметь несомненное значение для выяснения как специфических, так и общих механизмов развития адаптационного процесса. В современных условиях состояние организмов в природных водоемах в значительной степени зависит от степени антропогенной нагрузки, которое зачастую усугубляется естественными абиотическими и биотическими факторами. Водоемы Карелии, расположенные в зоне северной тайги, отличаются от более южных водных экосистем повышенной чувствительностью и низкой устойчивостью к антропогенному загрязнению (Заличева и др., 2002; Моисеенко, 2003). Известно, что действие на организм факторов среды сопровождается вовлечением различных механизмов регуляции гомеостаза. Среди них важное место занимает протеолиз, являющийся прерогативой выживания организмов. Протеолитические ферменты действуют на первом, ключевом этапе мобилизации белковых резервов клетки, и поэтому их роль в механизмах биохимических адаптаций невозможно переоценить (Антонов, 1983; Локши-на, 1986; Мосолов, 1988; Немова, 1996; Barrett, 1977; Bohley, 1987). При действии экстремальных факторов повышается активность внутриклеточных протеиназ, образуются биологически активные вещества, которые в последующем влияют на синтез белка и нуклеиновых кислот. Так индуцируются структурные перестройки, характерные для долговременной адаптации, что, по-видимому, является проявлением общего адаптационного синдрома. Нарушение регуляции и нормального функционирования протеолитических ферментов приводит к развитию патологических состояний.
Цель настоящей работы состояла в выяснении особенностей функционирования системы внутриклеточных протеолитических ферментов у гидробионтов, выявлении приспособительных ответных реакций на уровне протеолиза у водных организмов, принадлежащих к разным таксонам, при воздействии на них факторов среды различной природы, в том числе антропогенных.
В задачи исследований входило:
1. охарактеризовать в сравнительном аспекте основные ферменты системы внутриклеточного протеолиза (лизосомальные и кальцийактивируемые протеиназы цитозоля) у гидробионтов - представителей различных таксонов, включая ракообразных, моллюсков и костистых рыб;
2. изучить уровень активности и свойства протеиназ в органах рыб, различающихся особенностями биологии;
3. в натурных и аквариальных экспериментах изучить ответные реакции различных таксономических групп гидробионтов на действие наиболее характерных для водоемов Северо-Запада России факторов, включая антропогенное загрязнение;
4. провести сравнительный анализ состояния системы протеолиза в тканях гидробионтов, обитающих в акваториях с разным уровнем антропогенной нагрузки;
5. на основании анализа полученных данных выяснить возможность использования показателей внутриклеточного протеолиза в качестве биотестов при оценке качества сред обитания гидробионтов, их физиологического состояния и адаптивных возможностей при воздействии неблагоприятных факторов среды.
Научная новизна работы. Большая часть представленных в настоящей работе данных о протеолитических ферментах рыб и морских беспозвоночных получена впервые. Впервые выделены и изучены свойства кальций-зависимых протеиназ у ряда ранее не исследованных в этом отношении объектов. Показано, что под влиянием изменяющихся факторов среды внутриклеточные протеиназы вовлекаются в адаптивные или патологические перестройки в клетках в зависимости от силы и длительности воздействия фактора, резистентности организма, половой принадлежности, тканевой специфичности. Таким образом, научная новизна работы состоит в установлении общих и специфических черт ответных реакций различных таксономических групп гидробионтов на уровне внутриклеточного катаболизма белков на действие вариабельных факторов водной среды, естественных и антропогенных.
Практическая значимость работы. Работа является частью многолетних исследований, проводимых в лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН в рамках основных направлений биологических наук РАН (5.15, 5.21), грантов РФФИ №98-04-48482а, №02-04-48451, №03-04-06351 мае, ФЦП "Интеграция" №641, №3 3010/2354, грантов Санкт-Петербургского конкурса для молодых ученых (№М 01-2.6К-714, №М03-2.6.К-588), гранта Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-894.2003.4). Результаты исследований имеют практическое значение для оценки физиолого-биохимического состояния организмов. Исследуемые показатели белкового катаболизма (уровень активности лизосомальных катепсинов В и D, молекулярных форм кальпаинов цитозоля) могут быть использованы в качестве дополнительных биохимических критериев при разработке системы эколого-биохимического мониторинга водоемов. Результаты, полученные в ходе исследований, могут послужить основой для более углубленного изучения сравнительно-эволюционных и физиолого-биохимических аспектов протеолиза у животных. Материалы диссертации используются в лекционных курсах "Экологическая биохимия" и "Введение в энзимологию" для студентов Петр ГУ и КГПУ.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V conference "Ich-thyohaematology" (Protivin, Czech Republic, 1998), V international conference "Mercury as a global pollutant" (Rio de Janeiro, Brasil, 1999), 3rd international Lake Ladoga symposium "Monitoring and sustainable management of Lake Ladoga and other large lakes" (Petrozavodsk, 1999), международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны жив. и раст. мира, почв, покрова Восточной Фенноскандии" (Петрозаводск, 1999), международной конференции "Атлантический лосось Salmo Salar. биология, запасы, воспроизводство" (Петрозаводск, 2000), IX Всероссийской конф. "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Ярославль, 2000), VIth European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells (Paris, France, 2000), международной конференции "Биокатализ 2000" (Москва, 2000), XX-XXI Workshops "Biological essentiality of trace and ultratrace elements" (Jena, Germany, 2000, 2002), международной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Ярославль, 2000), конференции "Поморье в Баренц Регионе: Экономика, экология, культура" (Архангельск, 2000), Ш-IV international symposia "Micro and trace elements in human: new perspectives" (Athens, Greece, 2001, 2003), конференции "Экологические проблемы онтогенеза рыб (физиолого-биохими-ческие аспекты)" (Москва, 2001), конференции "Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга" (Сыктывкар, 2001), V симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002), Ш съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), конференции "Современные проблемы водной токсикологии" (Борок, 2002), XIth symposium on trace elements in man and animals (Berkeley, USA, 2002), международном семинаре "Современные проблемы физиологии и экологии морских животных (рыбы, птицы, млекопитающие)" (Ростов-на-Дону, 2002), П АМАР symposium on environmental pollution of the Arctic (Rovaniemi, Finland, 2002), IIIrd young scientists conference "XXI century: ecological science in Armenia" (Yerevan, 2002), IInd international conference on enzymes in the environment: activity, ecology and applications (Praha, Czech Republic, 2003), 9th meeting of PhD students in evolutionary biology (Fiesch, Switzerland, 2003), конференции "Экологические проблемы бассейнов крупных рек - 3" (Тольятти, 2003), международной конференции "Инновации в науке и образовании-2003" (Калининград, 2003), 10th meeting of PhD students in evolutionary biology (Shrewsbury, Great Britain, 2004).
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаб. экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН (особенно с.н.с. Е.И. Кяйвяряйнен и с.н.с. М.Ю. Крупновой), кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, ББС ЗИН РАН "Картеш", ИБВВ РАН (пос. Борок Ярославской обл.), Кандалакшского государственного природного заповедника (Мурманская обл.), ИВПС КарНЦ РАН за помощь в получении биологического материала, в постановке экспериментов и обсуждении результатов исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе 12 статей и 25 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, четырех глав результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В работе имеется 44 таблицы, 42 рисунка. Список литературы включает 361 источник, из них 116 на русском и 245 на иностранных языках.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бондарева, Людмила Александровна
выводы
1. Основные внутриклеточные протеолитические ферменты у исследуемых рыб и водных беспозвоночных, представленные лизосомальными катепинами В и D и кальций-активируемыми протеиназами цитозоля, участвуют в регуляции их функционального состояния. При этом показано их синергическое действие в различных эколого-физиологических ситуациях.
2. Протеиназы исследуемых ракообразных, моллюсков, костистых рыб по физико-химическим свойствам обнаруживают сходство между собой и различаются только уровнем активности и лабильностью в ряде экологических ситуаций. Это указывает на их определенную эволюционную консервативность.
3. Реактивность протеолитических ферментов у водных организмов в ответ на изменение солености среды зависит от степени сформированности осморегуляторного аппарата и физиологической толерантности вида к фактору солености.
4. Активность и свойства изученных протеиназ отражают степень загрязнения водоемов поллютантами различной природы - компонентами промышленных и бытовых сточных вод, при этом хищные виды рыб и самцы обнаруживают меньшую резистентность.
5. Активность и свойства внутриклеточных протеиназ отражают биохимический статус гидробионтов в условиях загрязнения водоемов ртутью, при этом значителен вклад сопутствующих факторов среды (ацидности и гумификации) в биодоступность соединений ртути. Внутриклеточные протеиназы принимают участие в процессах поддержания клеточного гомеостаза при кратком (в эксперименте) и хроническом воздействии ртути.
6. Изменение активности внутриклеточных протеиназ у исследуемых водных организмов в условиях изменяющихся факторов среды свидетельствует об участии этих ферментов в развитии компенсаторного или патологического процесса. Динамика активности и свойства протеиназ в различных эколого-физиологических ситуациях позволяет оценить пределы резистентности и толерантности внутриклеточного протеолиза у изученных видов и служит дополнительным биохимическим критерием при оценке влияния на гидробионтов изменяющихся естественных и антропогенных факторов среды.
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН (особенно с.н.с. Е.И. Кяйвяряйнен и с.н.с. М.Ю. Крупновой), кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, Беломорской биологической станции ЗИН РАН "Картеш", Института биологии внутренних вод РАН (пос. Борок Ярославской обл.), Кандалакшского государственного природного заповедника (Мурманская обл.) за помощь в получении биологического материала, в постановке экспериментов и обсуждении результатов исследований.
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДЭАЭ-целлюлоза - диэтил-аминоэтил-целлюлоза
ИЭТ - изоэлектрическая точка
ПААГ - полиакриламидный гель
GSH - глутатион
Мг - молекулярная масса
PMSF - фенилметилсульфонил фторид пХМБ - парахлормеркурийбензоат
ME - международные единицы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В материалах диссертационной работы предпринята попытка выяснения общих и специфических особенностей ответных реакций водных организмов (беспозвоночных и рыб) на воздействие изменяющихся факторов среды, включая естественные и вызванные деятельностью человека, а также сочетанное действие экологических факторов. Несмотря на очевидные успехи, достигнутые в изучении протеиназ микроорганизмов и высших животных, включая человека, следует признать некоторую фрагментарность сведений о свойствах и биологической роли протеиназ в развитии приспособительных реакций водных организмов, особенно беспозвоночных.
Выделены и изучены некоторые свойства кальций-зависимых протеиназ из ряда ранее неисследованных в этом отношении объектов. Выявлены специфические особенности уровня активности, молекулярной массы, термостабильности Са2+-активируемых протеиназ морских беспозвоночных, обнаруживающих, тем не менее, значительное сходство с кальпаинов млекопитающих и рыб по многим параметрам (оптимум рН, чувствительность к Са2+, ингибиторам), что говорит о высокой степени эволюционной консервативности исследуемых протеиназ. Эволюционные особенности Са -активируемых протеиназ наряду с сохранением основных биологических функций показаны на примере кальпаинов из эритроцитов форели.
Комплексное загрязнение поверхностных вод, вызванное деятельностью человека, в значительной мере определяет благополучие водных организмов, обитающих в районах с высокой антропогенной активностью. Исследование представителей пресноводных рыб, выловленных в зоне выброса сточных вод горнообогатительного производства, а также бентосных беспозвоночных, обитающих в прибрежной зоне Белого моря, наиболее сильно трансформируемой человеком, показало изменения в активности и свойствах протеиназ, зависящие от степени загрязнения и чувствительности вида. Так, выявлена большая чувствительность хищных видов рыб, являющихся завершающим звеном водной трофической цепи. При сравнении специфики изменений в процессе протеолиза, обусловленной полом организмов, обнаружена меньшая устойчивость самцов рыб, что подтверждается некоторыми признаками популяционного неблагополучия в загрязненных зонах. Весьма чувствительна к загрязнению биота прибрежной зоны моря, которая, исходя из особенностей местообитания, преадаптирована к значительным колебаниям абиотических факторов среды. У ракообразных и моллюсков из наиболее трансформированных деятельностью человека акваторий Белого моря наблюдаются перестройки на биохимическом уровне, характеризующие развитие патологического процесса в тканях.
Ртутное загрязнение является распространенным антропогенным фактором, воздействующим на водную биоту Севера России, учитывая существующую проблему закисления поверхностных вод и высокой степени органического загрязнения. Реактивность системы протеолиза у рыб, обитающих в этих водоемах указывает на синергический эффект указанных факторов: при фоновых концентрациях соединений ртути в среде наблюдается повышенная аккумуляция ртути в органах рыб, пропорциональная степени закисления и гумифицированности водоемов. Повышение биодоступности токсиканта сказывается на активности и свойствах изучаемых ферментов, которые могут как непосредственно взаимодействовать с соединениями ртути, выступая в качестве SH-содержащих биоли-ганд, так и принимают участие в процессах их биотрансформации и экскреции, являясь регуляторами иных звеньев клеточного метаболизма. Так, у рыб из "умеренно" неблагополучных озер наблюдается определенная супрессия протеолитических процессов на фоне общего снижения интенсивности метаболизма белков. Значительные перестройки в белковом катаболизме, указывающие на лабилизацию ферментных белков, вероятные нарушения основных физических свойств биомембран и кальциевого гомеостаза, показаны у окуней с высоким уровнем ртути в тканях из ацидных и высокогумифицированных озер. Модельные эксперименты подтверждают способность соединений ртути накапливаться в организме, преимущественно в печени и мышцах, что приводит к угнетению некоторых метаболических путей, в том числе системы внутриклеточного протеолиза. В эксперименте по интоксикации крыс солями ртути, проведенном для сравнения ответных реакций рыб и теплокровных животных, была выявлена большая чувствительность крыс к острому воздействию соединений ртути, наряду с большей устойчивостью при продолжительном их воздействии, выражающейся в нивелировании отклонений в изучаемых параметрах, вероятно, за счет более сформированной системы защитных реакций, главным образом, низкомолекулярных серосодержащих соединений.
Реакции гидробионтов на изменение солености среды обитания, оцениваемые по показателям протеолитических процессов, зависят от специфики вида, главным образом, от степени сформированное™ осморегуляторных биохимических механизмов. В аквари-альном эксперименте по содержанию двустворчатых моллюсков мидий при пониженной и повышенной солености среды выявлена достаточно низкая чувствительность организмов к фактору солености. У обитающих в акваториях с неустойчивым соленостным режимом моллюсков, вероятно, функционирует комплекс механизмов, называемых псевдоосморе-гуляторными. Критически низкой соленостью для голубой мидии, являющейся морским видом, является, по-видимому, соленость 5%о, когда наблюдается резкая активация лизо-сомапьных протеиназ. У личинок атлантического лосося достоверно изменяются показатели кальций-зависимого протеолиза, что объясняется важностью ионной компоненты для функционирования данных протеиназ, а также присутствием других, неионных модуляторов активности кальпаинов (например, фосфолипидов мембран). Для адекватного реагирования на смену солености среды принципиально важна стадия развития молоди лосося, обусловливающая становление осморегуляторной способности.
Таким образом, показана реактивность внутриклеточных протеолитических ферментов у водных организмов при воздействии ряда факторов, действующих как индивидуально (в эксперименте), так и сочетанно (в природных условиях). Показатели обмена белков могут указывать как на становление адаптивных перестроек в тканях, так и на развитие патологических изменений. Степень лабильности протеиназ в указанных условиях зависит от силы и длительности воздействия факторов, изучаемого вида, пола, стадии зрелости организма. Если воздействующий фактор превышает пороговые значения, то адаптивные возможности организма рыб (в первую очередь на уровне регуляции протеолиза, как прерогативы выживания), резко снижаются и возможно развитие патологических состояний.
Следует отметить, что высокая и адекватная действующим факторам реактивность систем внутриклеточного протеолиза говорит о ее важной роли в развитии ответных реакций организма на изменение условий внешней среды как одного из инструментов биохимической адаптации клеток, направленной на перестройку метаболизма и обновление клеточных структур. Трансформируя или отвечая на внешний сигнал запуском внутриклеточных каскадов реакций, протеиназы участвуют в осуществлении направленных изменений функций клеток, связанных с качественными изменениями обмена. Эти процессы могут лежать в основе клеточной дифференцировки и трансформации клеток, адаптационной перестройки обмена. Естественно, что такие сложные изменения не могут быть реализованы с помощью только одного регуляторного механизма. Они осуществляются при координационном действии различных регуляторных систем, и протеиназы могут служить одним из индукторных или регуляторных механизмов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бондарева, Людмила Александровна, Петрозаводск
1. Авцин А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А. Микроэлементозы человека, этиология, классификация, органопатология. М.: Медицина, 1994. с. 216-218.
2. Александров В.Я. Проблема авторегуляции в цитологии. Реактивное повышение устойчивости клеток к действию повреждающих агентов (адаптация). Цитология. 1965. Т.7. №4. с. 447-466.
3. Алексеенко Л.П. Определение активности протеиназ по расщеплению белковых субстратов. В кн.: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1968. Т.2. С. 112-137.
4. Алякринская И.О. Биохимические адаптации водных моллюсков к воздушной среде. Зоол. журн. 1972. Т.51. С. 1630-1636.
5. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Мир. 1983. 367 с.
6. Артамонова В.Г., Дадали В.А., Полканова Е.К. Современные аспекты ртутных интоксикаций и проблемы реабилитации. Ртуть. Комплексная система безопасности. 1996. с. 10-14.
7. Беляев Г.М. Физиологические особенности представителей одних и тех же видов беспозвоночных в водоемах различной солености. Тр. Всесоюзн. гидробиол. о-ва, 1957. Т.8. с. 321-353.
8. Бергер В.Я. Исследование адаптации некоторых литоральных беломорских моллюсков к изменениям солености среды: Дис. канд. биол. наук. Л., 1971.
9. Бергер В.Я., Ковалева Н.М. Соленостные адаптации и характер распределения брюхо-ногого моллюска Littorina saxatilis в эстуариях Кандалакшского залива Белого моря. В кн.: Экспериментальная экология морских беспозвоночных. Владивосток, 1976. с. 2326.
10. Бергер В. Я., Харазова А.Д. Исследование субстанциональных изменений и синтеза белка в процессе адаптации некоторых беломорских моллюсков к пониженной солености среды. Цитология. 1971. Т.13, № 10, с. 1299-1303.
11. Бондарева Л.А., Кяйвяряйнен Е.И., Немова Н.Н., Шкляревич Г.А. Кальцийактивируе-мые протеолитические ферменты (кальпаины) у амфипод (Gammaridae). Тез. докл. V симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Москва, 2002. С. 53.
12. Ведемейер Г.А., Мейер Ф.П., Смит JI. Стресс и болезни рыб: Пер. с англ. Москва: Легкая и пищевая промышленность, 1981.128 с.
13. Воробьев В.И., Самилкин Н.С. Микроэлементы у растительноядных рыб. В сб.: Роль микроэлементов в жизни водоемов. М., 1980. С. 24-49.
14. Гинецинский А.Г. Физиологические механизмы водно-солевого равновесия. М.; Л., 1963.427 с.
15. Грин Н.В., Ермаченко А.В., Беседина Е.И., Говорунова Н.Н., Николаенко В.Д. Состояние генеративной функции животных при круглосуточном ингаляционном воздействии смеси ртутьсодержащих солей. Гигиена и санитария .1981, №10, с. 88-90.
16. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение критериев непараметрической статистики для оценки различий двух групп наблюдений в медико-биологических исследованиях. М.: Медицина. 1969. С. 9-11,24.
17. Дин Р. Процессы распада в клетке. М.: Мир, 1981.120 с.
18. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир. 1980. 344 с.
19. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1976. 364 с.
20. Евтихина З.Ф., Орехович В.Н., Шпикитер В.О. Очистка и некоторые свойства высокореактивного катепсина из селезенки. Вопросы мед. химии. 1963. Т.9. с. 626.
21. Жарская В.Д., Куликов A.M. Ртутные отравления в повседневной жизни. СПб., 1999. с. 34-48.
22. Жирмунский А.В. Реакция клеток мерцательного эпителия мидий и актиний на повышение солености. Журн. общ. биологии. 1962. Т. 23. № 2. с. 119-126.
23. Зайцева О.В., Куриленко В.В. Универсальные методы биотестирования с использованием культур брюхоногих моллюсков для целей водной токсикологии и мониторинга. Тез. докл. Всерос. конф. "Современные проблемы водной токсикологии", Борок, 2002. с. 141.
24. Зарубин C.JL, Ботяжова О.А. Оценка степени токсичности загрязняющих стоков, воды и грунта методами биотестирования. Тез. докл. Всерос. конф. "Современные проблемы водной токсикологии", Борок, 2002, с. 142.
25. Зарубин C.JL, Цветков И.Л., Урванцева Г.А. Энзимоиндикация токсичности природных и сточных вод по степени активности фермента кислой фосфатазы речных моллюсков. Тез. докл Всерос конф. "Современные проблемы водной токсикологии", Борок, 2002, с. 144.
26. Иванова JI.K., Нижарадзе М.З. Токсичность хлорида, иодида и амидохлорида ртути на различных структурно-функциональных уровнях организма. Гигиена труда и профессиональные заболевания. 1997, №4, с.43-45.
27. Иванова JI.A., Коршун М.Н., Савченко М.В. Сравнительная токсичность иона ртути (П) в виде катиона и комплексного аниона на организменном и клеточном уровнях. Гигиена труда. 1991, №3, с. 42-43.
28. Казакова О.В., Локшина Л.Н, Тарханова И.О., Орехович В.Н. Иммунохимические исследования катепсинов D у человека. Вопр. мед. химии. 1980. Т.26. С. 114-117.
29. Казакова О.В., Орехович В.Н. Выделение катепсинов группы D с помощью хроматографии по сродству. Биохимия. 1975. Т.40. С. 969-977.
30. Карандеева О.Г. Процессы, обеспечивающие осморегуляцию у водных беспозвоночных. В кн.: Физиология морских организмов. М. 1966. с. 176-232.
31. Кизеветтер И.В. Биохимия сырья водного происхождения. М.: Пищевая промышленность, 1973.
32. Киршке X. Характеристика и функциональные свойства лизосомальных протеиназ. В сб. тез. докл. Ш всесоюз. симп. "Строение и функции лизосом". М. 1986. С.249-250.
33. Комов В.Т. Природное и антропогенное закисление малых озер Северо-Запада России: причины, последствия, прогноз. Автореф. Дис. д-ра биол. наук. С-Пб. 1999.
34. Коновалов Ю.Д., Местечкина А.Я. Активность пептидгидролаз в эмбриональном развитии карпа. Онтогенез. 1975. Т.6. с. 201-205.
35. Коршун М.Н. О токсичности неорганических производных ртути. Гигиена и санитария. 1989.№ I.e.169-170.
36. Котеров А.Н., Требенюк В.А., Пушкарева Н.Б., Никольский В. Стимуляция экзогенным Zn-MT репликативного синтеза ДНК и пролиферации клеток костного мозга мышей. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1966. №1. с. 505-508.
37. Котеров А.Н., Сазыкин А.Ю., Филиппович И.В. Связь между содержанием металло-тионеинов в костном мозге, печени и выживаемостью облученных мышей после введения хлористого кадмия. Радиобиология. 1993. №1. с. 122-127.
38. Косинова Н.Р. Влияние фосфорорганических пестицидов на уровень метаболизма некоторых видов рыб. Автореф. канд. дисс. Севастополь, 1978.24 с.
39. Кузьмина О.Ю. Роль внутриклеточных неорганических ионов в адаптации некоторых пойкилоосмотических животных к изменению солености среды: Дис. . канд. биол. наук. Л., 1982. 172 с.
40. Локшина Л.А. Регуляторная роль протеолитических ферментов. Молекулярная биология. 1979. Т. 13. С. 1205-1229.
41. Локшина Л. А. Кальций-активируемые нейтральные протеиназы и их регуляторная роль. Вестн.АМН СССР. 1986. Т.59, N 8. С.59-68.
42. Лужников Е.А. Клиническая токсикология. М.: Медицина. 1994. с. 216-218.
43. Луканин В.В. Исследование адаптивных реакций сцифомедузы Белого моря Aurelia aurita L. к изменению солености внешней среды. В кн.: Соленостные адаптации водных организмов. Л., 1976. с. 26-58.
44. Маляревская А.Я. Биологические механизмы интоксикации гидробионтов. В кн.: Экспериментальная водная токсикология. 1985. с. 15-21.
45. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М. 1990.
46. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М., 1971.258 с.
47. Мельянцев В.Г. Рыбы. Петрозаводск: Карелия, 1974.
48. Мецлер Д. Биохимия. М. 1980. Т. 3. 487 с.
49. Миронова О.Г. Некоторые направления исследований в морской водной токсикологии. В кн.: Проблемы водной токсикологии, Петрозаводск, 1975, с. 14.
50. Моисеенко Т.И. Экотоксикологический подход к определению критических нагрузок на водные экосистемы. Тез. докл. Всерос. конф. "Современные проблемы водной токсикологии". Борок, 2002а, с. 149.
51. Моисеенко Т.И. Биоэнергетические механизмы изменчивости организмов и популяций рыб в условиях длительного загрязнения вод. Тез. докл. Всерос. конф. "Современные проблемы водной токсикологии", Борок, 20026, с. 130.
52. Моисеенко Т.И. Закисление вод: факторы, механизмы и экологические последствия. М.: Наука, 2003. 276 с.
53. Морозов А.К. Химический состав воды. В сб.: Современное состояние водных объектов. Петрозаводск: изд-во КНЦ РАН, 1998.
54. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971.413 с.
55. Мосолов В.В. Механизмы контроля протеолиза. Успехи биол. химии. М., 1988. Т. 28. С. 125-144.
56. Мухин В.А. Протеолитические ферменты в тканях некоторых морских беспозвоночных: Дис. .канд. биол. наук. Москва, 1998.
57. Мухин В.А., Немова Н.Н., Крупнова М.Ю., Кяйвяряйнен Е.И. Выделение и очистка кислой протеиназы из гепатопанкреаса камчатского краба (Paralitodes kamtschatica). Проблемы рыбохозяйственной науки в творчестве молодых. ПИНРО. 1995: 176-187.
58. Мухин В.А., Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова М.Ю. Кальций-активируемая нейтральная протеиназа в гаметах морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis. Журн. эвол. биох. физиол., 2000. Т.36. № 1. С. 6-9.
59. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Ферментные белковые гидролизаты тканей морских гид-робионтов: получение, свойства и практическое использование. М. 2001.
60. Назаренко И.И., Кислоева И.В., Кашина Л.И. и др. Атомно-абсорбционное определение ртути в водах после сорбционного концентрирования на полимерном тиоэфире. Журн. Анал. Химии. 1986. Т. 11. Вып. 8. С. 1385-1390.
61. Наточин Ю.В. Реакция мидий на раздельные изменения осмотической концентрации и солености среды. Журн. общ. биологии, 1966, т. 27, № 14, с. 473-479.
62. Наточин Ю.В. Транспорт воды и натрия в осморегулирующих организмах: Дис. . д-ра биол. наук. Л., 1967.
63. Наточин Ю.В., Бергер В.Я. Ионный состав клеток моллюсков эволюционный и экологический аспекты. Журн. эволюц. биохимии и физиологии, 1979, т. 15,№ 3, с. 295302.
64. Наточин Ю.В., Михайлова О.Ю., Лаврова Е.А., Хлебович В.В. Вода и электролиты в аддукторе Mytilus edulis при акклимации к сниженной солености in vivo и in vitro. Журн. эволюц. биохимии и физиологии, 1976,т. 15, № 2, с. 170-176.
65. Наточин Ю.В., Михайлова О.Ю., Лаврова Е.А., Хлебович В.В. Содержание воды и электролитов в клетках аддуктора мидии Mytilus edulis в широком диапазоне солености морской воды. Биология моря, 1979, № 4, с. 54-60.
66. Наумов А.Д., Оленев А.В. Зоологические экскурсии на Белом море: Пособие для летней учебной практики по зоологии беспозвоночных. Под ред. А.А. Стрелкова. Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1981. 176 с.
67. Нгуен Ким Хунт. Аминокислотный состав кефалей Черного моря и Шаболатского лимана. В кн.: Биол. пробл. океанографии южных морей. Киев, 1969. с. 151-153.
68. Нейфах А.А., Давидов Е.Р. Отсутствие ядерного контроля над увеличением активности катепсина в раннем эмбриональном развитии. Биохимия. 1964. Т.29. с. 273-282.
69. Нейфах А.А., Тимофеева М.Я. Молекулярная биология процессов развития. М, 1977. 312 с.
70. Немова Влияние некоторых неблагоприятных факторов зимовки на активность лизосомальных протеиназ тканей карпа. Биохимия рыб в зимовальный период. Петрозаводск, 1987. С. 99-101.
71. Немова Н.Н. Свойства и физиологическая роль внутриклеточных протеиназ в тканях рыб. Успехи совр. биол. 1991. Том Ш, вып. 6. С. 948-954.
72. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. Петрозаводск: изд-воКНЦРАН, 1996.
73. Немова Н.Н., Крупнова М.Ю., Кяйвяряйнен Е.И., Волков И.В. Влияние токсических факторов на протеолитическую активность в икре и ранних личинках рыб. Известия РАН. Сер. биол. 1994. №4. С. 605-610.
74. Немова Н.Н., Сидоров B.C. Внутриклеточное распределение и активность катепсинов в яйцах сига до и после оплодотворения. Онтогенез. 1980. №1. с. 85-87.
75. Немова Н.Н., Сидоров B.C. Влияние некоторых токсических факторов на лизосомаль-ные протеиназы пресноводных рыб. Гидробиол. журнал. 1990. Т. 26, №4. С. 69-73.
76. Николаев С.А. Сукцессии ихтиоценозов малых рек вследствие загрязнения. В сб.: Физиологические аспекты токсикологии гидробионтов. Ярославль, 1989. С. 47-51.
77. Палладии А.В., Белик Я.В., Полякова Н.М. Белки головного мозга и их обмен. Киев: Наук, думка. 1972. 313 с.
78. Патин С.А., Морозов Н.П. Микроэлементы в морских организмах и экосистемах. М., 1981.153 с.
79. Пименова И.В., Калинкина Н.М. Реакция некоторых видов пресноводного зоопланктона на комбинированное действие калия, натрия, кальция и магния. Борок, 2002. с. 119.
80. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. М.: Наука. 1976. С. 12-95,244-294.
81. Проссер К.Л. Сравнительная физиология животных. М., 1977, т. 1. 608с.
82. Репин B.C. Критические факторы химической регуляции развития. М., 1980. 247 с.
83. Руднева И.И. Ответные реакции морских животных на антропогенное загрязнение Черного моря. Автореф на соиск. ученой степени докт. биол. наук, Москва, 2000.
84. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У. Активность лизосомальных ферментов в печени окуня из разных зон Онежского озера. В кн.: Сравнительная биохимия водных животных, Петрозаводск, 1983. с. 85-92.
85. Сейсума З.К. и др. Тяжелые металлы в гидробионтах Рижского залива. Рига, 1984. с. 179.
86. Сидоров B.C. Эволюционные и экологические аспекты биохимии рыб: Автореф. дис. .докт. биол. наук. Москва, 1986.
87. Сидоров B.C. и др. Принципы и методы эколого-биохимического мониторинга водоемов. В кн. Биохимия экто- и эндотермных организмов в норме и при патологии, 1990, с. 5.
88. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985. С. 197-213.
89. Скульский И.А. О роли калия в адаптации морских моллюсков к пониженной солености внешней среды. В кн.: Экспериментальная экология морских беспозвоночных. Владивосток, 1976. с. 165-166.
90. Степанова И.К., Комов В.Т. Накопление ртути в рыбе из водоемов Вологодской области. Экология. 1997. Т.28, №4. С. 196-202.
91. Степанова И.К., Комов В.Т. Биоценотические закономерности накопления ртути в рыбе внутренних водоемов. Экология, 2002. № 4. с. 317-318.
92. Строганов Н.С. Моделирование возможных изменений экосистемы при загрязнениях по чувствительности гидробионтов к токсикантам. Л.: 1979, с. 142-149.
93. Токин И.Б., Зензеров B.C. К проблеме изучения механизмов действия загрязнителей на клеточном и субклеточном уровнях. В кн.: Проблемы изучения действия загрязнений на экосистемы северных морей. Апатиты, 1977, с. 22-43.
94. ЮО.Трахтенберг И.М., Иванова Л.А. Современные представления о воздействии ртути на клеточные мембраны. Гигиена и санитария. 1984. N5. С. 59-63.
95. Ю1.Трахтенберг И.М., Колесников B.C., Луковенко В.П. Тяжелые металлы во внешней среде. Минск, 1994, с. 10-13.
96. Ш.Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.268 с.
97. ЮЗ.Уоддингтон К.Х. Основные биологические концепции. В кн.: На пути к теоретической биологии. М., 1970, с. 11-38.
98. Фауна беспозвоночных Карского, Баренцева и Белого морей (информатика, экология, биогеография). Коллектив авторов. Апатиты: Изд. КНЦ РАН, 2003. 385 с.
99. Харазова А.Д. Исследование изменений синтеза белка и РНК при реакции клеток на внешнее воздействие: Дис. канд. биол. наук. Л., 1974. 157 с.
100. Юб.Харазова А.Д., Бергер В.Я. Изменения синтеза РНК в тканях моллюска Littorina lit-torea при понижении солености среды. Цитология, 1974, т. 16, № 2, с. 241-243.
101. Ю7.Харазова А.Д., Бергер В.Я. Роль пластического обмена в соленостных адаптациях ос-моконформеров. В сб. I Всесоюз. конф. по морской биологии. Владивосток, 1977, с. 146-147.
102. Ю8.Харазова А.Д., Ростова В.В. Исследование изменений синтеза белка и РНК в тканях беломорского моллюска Coryphella rufibranchialis при пониженной солености среды. В кн.: Соленостные адаптации водных организмов. Л., 1976, с. 142-155.
103. Ю9.Хлебович В.В. Критическая соленость биологических процессов. Л., 1974. 230с.
104. ПО.Хлебович В.В. Особенности состава водной фауны в зависимости от солености среды. Журн. общ. биологии, 1962, т. 23, № 2, с. 90-97.
105. Ш.Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977.
106. Чекунова М.П., Фролова А.Д. Роль лизосом в токсикологии металлов. Тезисы докл. 3-го всесоюз. симпоз. "Структура и функции лизосом". Тбилиси: изд-во ХОЗУ Мину-ралсибстроя СССР, 1986. С. 228-229.
107. ПЗ.Чухловина М.Л. Поражение нервной системы при ртутной интоксикации. Ртуть. Комплексная система безопасности. 1996, с. 27-31.
108. Ш.Шкляревич Г.А. Экология сообществ макробентоса Белого моря. Автореф на соиск. степени докт. биол. наук, Петрозаводск, 2002
109. Шлипер К., Тиде Г. Приспособление морских животных к абиотическим факторам среды. Биология моря, 1975, № 6, с. 3-25.
110. Пб.Шипунов Ф.Ф., Степанов A.M., Фролов В.А. Загрязнение биосферы в северном полушарии. Антропогенные нарушения и природные изменения наземных экосистем. М. 1981. С. 7-28.
111. Atchinson W., HareM. FASEB J. 1994. 8: 622.
112. Bailey В., Koran P., Bradley H.C. The autolysis of muscle of highly active and less active fish. Biol. Bull. mar. biol. Lab., Woods Hole. 1942, 83:129-136.
113. Barrett A.J. (Edit.) Proteinases in mammalian cells and tissues. North Holland, Amsterdam. 1977.218 р.
114. Barrett A.J., Heath M.F. In: Lysosomes: a laboratory handbook (ed. J.T. Dingle) North Holland, Amsterdam. 1977. pp. 19-145.
115. Becker D.S., Bigham G.N. Distribution of mercury in the aquatic food web of Onondaga Lake, New York. Water Air Soil Pollut. 1995. 80: 563-571.
116. Becker D.S., Bilyard G.R., Ginn T.C. Comparison between sediment bioassays and alterations of benthic macroinvertebrate assemblages at a marine superfund site: Commencement Bay, Washington. Environ. Toxicol. Chem. 1990. Vol. 9, pp. 669-685.
117. Berger V.Ja., Khlebovich V.V., Kovaleva N.M., Natochin Vu.V. The changes of ionic composition and cell volume during adaptation of molluscs (Littorina) to lowered salinity. Сотр. Biochem. Physiol. 1978. Vol. 60A. N 3. pp. 447-452.
118. Beyette J.R., Ma J.Sh., Kykles D.L. Purification and autolytic degradation of calpain-like calcium-dependent proteinase from lobster (Homarus americanus) striated muscle. Сотр. Biochem. Physiol. 1993,104B (1): 95-99.
119. Bloom N.S. On the chemical form of mercury in edible fish and marine invertebrate tissues. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1992. 49: 1010-1017.
120. Bodaly R.A., Hecky, R.E., and Fudge, R.J.P. Increases in fish mercury levels in lakes flooded by the Churchill River diversion, northern Manitoba. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1984. Vol. 41. pp. 682-691.
121. Bodaly R.A., Rudd J.W.M., Fudge R.J.P., Kelly C.A. Mercury concentrations in fish related to size of remote Canadian Shield lakes. Can. J. Fish Aquat. Sci. 1993. Vol. 50. P. 980-987.
122. Bohley P. Intracellular proteolysis. Hydrolytic enzymes. Biomedical division. 1987. P. 307332.
123. Bondareva L., Kaivarainen E., Krupnova M., Nemova N. The effect of ore-dressing sewage on cell proteolytic enzyme system in some fish. In: Macro and Trace Elements. Jena, Germany. 2002. P. 711-716.
124. Bonete M.J., Manjon A., Llorca F., Iborra J.L. Acid proteinase activity in fish. П. Purification and characterization of cathepsin В and D from Mujil auratus muscle. Сотр. Biochem. Physiol. 1984. Vol.75B, №1. P. 207-210.
125. Borowitzka L.J., Brown A.D. The salt relations of marine and halophilic species of the unicellular green alga, Dunaliella: The role of glycerol as a compatible solute. Arch. Microbiol., 1974, N 1 , vol. 96, p. 37-52.
126. Bose S., Ghosh P., Bhattacharya S. Distribution kinetics of inorganic mercury in the subcellular fractions offish liver. Sci. Total Environ. 1993. Suppl. Pt. 1: 533-538.
127. Boudou A., Ribeyre F. Experimental study of trophic contamination of Salmo gairdneri by two mercury compounds HgCb and CFbHgCl. Analysis at the organism and organ levels. Water Air Soil Poll. 1985. 26: 137-148.
128. Boyd T.A., Cha Chung-ja, Forster R.P., Goldstein L. Free amino acids in tissues of the skate Raja erinacea and the stingray Dasyatis sabina: effects of environmental dilution. J. Exp. Zool., 1977. Vol. 199, N3, pp. 435-442.
129. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72:248-254.
130. Bragadin M., Scutari G., Manente S., Toninello A. The interaction of methylmercury with lysosomes from rat liver. Inorganica Chimia Acta. 2002. 336: 163-167.
131. Brett J.R. Implications and assessment of environmental stress. In: Investigation of fish power problems. H.R. MacMillan Lectures in Fisheries, 1958. pp. 69-97.
132. Bulnheim H.P. Comparative studies on the physiological ecology of five euryhaline Gamma-rus species. Oecologia (Berl.). 1979. Vol. 44, pp. 80-86.
133. Burton G.A. Sediment toxicity assessment. 1992. Lewis Publishers, Boca Raton, FL, USA.
134. Burton R.T. Cell potassium and the significance of osmolality in vertebrates. Сотр. Biochem. Physiol. 1968. Vol. 27, N 4., pp. 763 -773.
135. Burton R.T. The significance of ionic concentrations in the internal media of animals. Biol. Rev. 1973. Vol. 48, N2, pp. 195 -231.
136. Cabana G., Tremblay A., Kalff J. Rasmussen J. Can. J. Fish Aquat. Sci. 1994. Vol. 51. P. 381.
137. Callow P. Handbook of Ecotoxicology (vol. 2) Blackwell Scientific Publications. UK, 1994, p. 416.
138. Cao Y., Bark A.W., Williams W.P. Measuring the responses of macroinvertebrate communities to water pollution: a comparison of multivariate approaches, biotic and diversity indices. Hydrobiologia. 1996. Vol. 341, pp. 1-19.
139. Castagna M., Chanley P. Salinity tolerance of some marine bivalves and estuarine environments in Virginia waters on the Midatlantic coast. Malacologia, 1973, vol. 12, N1, p. 47-96.
140. Chapman P.M. Current approaches to developing sediment quality criteria. Environ. Toxicol. Chem. 1989, Vol. 8, pp. 589-599.
141. Chesley LC. The concentration of proteases, amylase and lipase in certain marine fishes. Biol. Bull. mar. biol. Lab., Woods Hole. 1934,66:133-144.
142. Ciarelli S., Vonch W., van Straalen N.M. Reproducibility of spiked-sediment bioassays using the marine benthic amphipod, Corophium volutator. Mar. Environ Res., 1997, Vol. 43, pp. 329-343.
143. Claisse D., Cossa D., Bretaudeau-Sanjuan J., Touchard G., Bombled B. Methylmercury in mollusks along the French coast. Mar. Pollut. Bull. 2001. Vol. 42. No. 4. pp. 329-332.
144. Clarke A. Seasonality in the Antarctic environment. Сотр. Biochem. Physiol. 90B (3). 1988, pp. 461-473.
145. Clarkson T.W. Factors involved in heavy metal poisoning. Fed. Proc. 1977. V.6. №5. P. 1634-1639.
146. Clarkson T.W. The toxicology of mercury. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1997. Vol.34. №4. P. 369-403.
147. Close A.H., Guo T.L., Shuker B.J. Toxicol. Sci. 1999. 48: 68.
148. Coleman N. Water loss from aerially exposed mussels. J. Exp. Mar. Biol, and Ecology, 1973. Vol. 12, N 1, pp. 145-155.
149. Conlan K.E. Amphipod crustaceans and environmental disturbance: a review. J. Nat. Hist., Lond. 1994. Vol.28, 519-554.
150. Constantini M.L., Fazi S., Rossi L. Size distribution of the amphipod P. walkeri (Stebbing) along a depth gradient in Antarctica Hydrobiology, 1996, 337, pp. 107-112
151. Conte F.P., Wagner H.H., Fessler J., Gnose C. Development of osmotic and ionic regulation in juvenile coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Сотр. Biochem. Physiol. 1966. Vol. 18, pp. 1-15.
152. Cordier D., Barnoud R., Brandon A.M. Influence du passage de l'eau douce a l'eau salee sur le taux de l'azote amine et de l'azote non proteique du plasma chez la tanche (Tinka vulgaris L.). Compt. rend. Soc. biol. 1958. Vol. 152, N 7. Pp. 1147-1149.
153. Costa F.O., Correia A.D., Costa M.H. Acute marine sediment toxicity: A potential new test with the amphipod Gammarus locusta. Ecotox. Environ. Safety. 1998. Vol.40. P. 81-87.
154. Costa F.O., Costa M.H. Life history of the amphipod Gammarus locusta in the Sado estuary (Portugal). Acta Oecologica 1999. Vol.20. P. 327-332.
155. Cowey C.B. Amino acids and related substances in fish. In: Studies in Comparative Biochemistry (K.A. Munday, ed.). Pergamon Press, Oxford. 1965. Chapter 3, pp. 41-61.
156. Cowey C.B., Daisley K.W. & Parry G. Study of amino acids, free or as components of protein, and of some В vitamins in the tissues of the Atlantic salmon, Salmo salar, during spawning migration. Сотр. Biochem. Physiol. 1962. Vol. 7, pp. 29-38.
157. Cunningham P.A., Tripp M.R. Accumulation, tissue distribution and elimination of 203HgCl2 and CH3203HgCl in the tissues of the American oister Crassostrea virginica. Mar. Biol. 1975. 31:321-334.
158. Dayton W.R., Goll D.E., Stromer M.H., Revill WJ.,Zeece M.G., Robson R.M. Proteases and biological control. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1975,2: 551-577.
159. Dayton W.R., Revill W J., Goll D.E., Stromer M.H. A Ca2+-activated protease possibly involved in myofibrillar protein turnover. Purification from porcine muscle. Biochemistry. 1976. V.15. N 10. P. 2150-2158.
160. Dean R.T. Direct evidence of the importance of lysosomes in the degradation of intracellular proteins. Nature (London). 1975. pp. 414-416.
161. De Martino G.N. Calcium-dependent proteolytic activity in rat liver: identification of two proteases with different calcium requirements. Arc. Biochem. and Biophys. 1981. Vol.211. №1. P. 253-257.
162. Depledge M.H., Rainbow P.S. Models of regulation and accumulation of trace metals in marine invertebrates. Сотр. Biochem. Physiol. 1990.97C, 1-7.
163. DeWitt Т.Н., Swartz R.C., Lamberson J.O. Measuring the acute toxicity of estuarine sediments. Environ. Toxicol. Chem. 1989. Vol. 8, pp. 1035-1048.
164. DeWitt Т.Н., Redmond M.S., Sewall J.E., Swartz R.C. Development of a chronic sediment toxicity test for marine benthic amphipods. 1992. Contribution № N-240, US Environmental Protection Agency for the Chesapeake Bay Program, Newport, 99 pp.
165. Di Giulio R.T., Benson W.H., Sanders B.M., Van Veld P.A. Biochemical mechanisms: metabolism, adaptation, and toxicity. In: Fundamentals of aquatic toxicology. 2nd Edition. Ed. Gary M. Rand (Taylor and Francis, 1995). P. 523-561.
166. Epel D., Nishioka D., Perry G. The role of Ca2+ in triggering development at fertilization. Biol. Cell. 1978. Vol. 32. P. 135-140. 1978
167. Fimreite, N. and Reynolds, L.M. Mercury contamination of aquatic birds in north-western Ontario. J. Wildl. Manage. 1974. Vol. 37. pp. 62-68.
168. Fish G.R. The comparative activity of some digestive enzymes in the alimentary canal of tilapia and perch. Hydrobiologia. 1960,15: 161-178.
169. Fisher S.W. Changes in the toxicity of three pesticides as a function of environmental pH and temperature. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1991. Vol. 46, pp. 197-202.
170. Florkin M., Stoffeniels E. Euryhalinity and the concept of physiological radiation. In: "Studies in Comparative Biochemistry" (K.A. Munday, ed.). Pergamon Press, Oxford. 1965, pp. 6-40.
171. Florkin M., Schoffeniels E. Molecular approaches to ecology. New York, 1969. 203 pp.
172. Forster R.P., Goldstein L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranches. Amer. J. Physiol. 1975. Vol. 230, №4. P. 925-931.
173. Forster R.P., Hannafin J.A., Goldstein L. Osmoregulatory role of amino acids in brain of the elasmobranch, Raja erinacea. Сотр. Biochem. Physiol. 1978. Vol. A60, N 1. Pp. 25-30.
174. Fowler S.W., Benayoun G. Experimental studies on cadmium fluxes through marine biota. In: Comparative studies of food and environmental contamination IAEA, Vienna, 1974. pp. 159-178.
175. Freel R.W., Medler S.G., Clark M.E. Solute adjustments in the coelomic fluid and muscle fibers of a euryhaline polychaete Neanthes succinea, adapted to various salinities. Biol. Bull. 1973. Vol. 144, N2, pp. 262-268.
176. Fritz H., Muller M., Henshem A. Proteolysis Mid fertilization. In: Biol. Function of proteinases. Mosbacher Kolloqium der Gessellschaft fur Biol. Chem. "Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.", 1979. B36, p. 492.
177. Gagne F., Marion M., Denizeau F. Metallothionein induction and metal homeostasis in rainbow trout hepatocytes exposed to mercury. Toxicol. Lett. 1990. 51 (1): 99-107.
178. Gates B. J., Travis J. Shrimp trypsin. Biochemistry. 1969. Vol. P. 4483.
179. Gilles R. Mechanisms of osmoregulation in animal. Chichister etc., 1979. 667 p.
180. Gilmour C.C., Henry E.A., Mitchell R. Sulfate stimulation of mercury Methylation in freshwater sediments. Environ. Sci. Technol. 1992. 26: 2261-2287.
181. Goll D.E., Thompson V.F., Taylor R.G., Zalewska T. Is calpain activity regulated by membranes and autolysis or by calcium and calpastatin? Bioessays. 1992. V.14, N 8. P. 549-556.
182. Goralski H., Frol H. Encephalopathy after poisoning with organic mercury compounds. Neurol Neurochir Pol. 1979,13 (4): P.371-376.
183. Gray J.S. The ecology of marine sediments. Cambridge University Press, Cambridge, 1981.
184. Grieb T.M., Driscoll C.T., Gloss S.P., Schogield C.L., Bowie G.L., Porcella D.B. Factors affecting mercury accumulation in fish in the upper Michigan peninsula. Environ. Toxicol. Chem. 1990. 9: 919-930.
185. Groninberg H.S. Partial purification of cathepsin and some properties of a proteinase from Albacore muscle. Agr. Biohem. Biophys. 1964. Vol. 108, N. 2. P. 175-182.
186. Hall, B.D., Bodaly, R.A., Fudge, R.J.P., Rudd, J.W.M., and Rosenberg, D.M. Food as the dominant pathway of methylmercury uptake by fish. Water Air Soil Pollut. 1997. Vol. 100. pp.13-24.
187. Handeland S.O., Berge A., Bjornsson B.Th., Stefansson S.O. Effects of temperature and salinity on osmoregulation and growth of Atlantic salmon (Salmo salar L.) smolts in seawater. Aquaculture. 1998. Vol. 168. pp. 289-302.
188. Handeland S.O., Stefansson S.O. Effects of salinity acclimation on pre-smolt growth, smolt-ing and post-smolt performance in off-season Atlantic salmon smolts (Salmo salar L.). Aquaculture. 2002. Vol. 209. pp. 125-137.
189. Hare M.F., Atchinson W.D. Toxicologist. 1992. Vol.12. P. 313.
190. Harris R.C., Snodgrass W.J. Bioenergetic imulations of mercury uptake and retention in walleye (Stizostedion vitreum) and yellow perch (Perca flavescens). Water Poll. Res. J. Canada. 1993. 28 (1): 217-236.
191. Harvey M., Vincent B. Spatial and temporal variations of the reproduction cycle and energy allocation of the bivalve Macoma balthica (L.) on a tidal flat. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1989, Vol. 129, pp. 199-217.
192. Herbert D.W.M., Merkins J.C. The effect of suspended mineral solids on the survival of trout. Int. J. Air Water Poll. 1961, 5. 46-55.
193. Hintelmann H., Welbourn P.M., Evans R.D. Binding of methylmercury compounds by hu-mic and fulvic acids. Water Air Soil Pollut. 1995. 80: 1031-1034.
194. Hintelmann H., Welbourn P.M., Evans R.D Measurement of complexation of methylmercury (П) compounds by freshwater humic substances using equilibrium dialysis. Environ. Sci. Technol. 1997. 31: 489-495.
195. Houston A.H., Threadgold L.T. Body fluid regulation in smolting Atlantic salmon. J. Fish. Res. Bd Can. 1963. Vol. 20. pp. 1355-1369.
196. Huckabee J.W., Elwood J.W., Hildebrand S.G. Accumulation of mercury in freshwater biota. In: The Biogeochemistry of Mercury in the Environment. J.O. Nriagu, Ed. (Elsevier/North Holland, New York), 1979. 277-302.
197. Hughes G.M. The dimensions of fish gills in relation to their function. J. exp. Biol. 1966,45: 177-195.
198. Jeng H.W., Wei Ch.M., Jong Ch.S., Ching S. Ch.,Shann T.J. Comparison of the properties of m-calpain from tilapia and grass shrimp muscles. J. of Agricultural and Food Chem. 1993, 41(9): 1379-1384.218Jensen S., Jernelov A. Nature. 1969. 223: 753.
199. Jernelov A., Rosenberg R. Stress tolerance of ecosystems. Environ. Conserv. 1976. Vol. 3, pp. 43-46.
200. Johnels A., Tyler G. Westermark T. Ambio. 1979. Vol. 8. P. 160-167.
201. Johnson P. Calpains (intracellular calcium activated cysteine proteinases): structure - activity relationships and involvement in normal and abnormal cellular metabolism. Int. J. Biochem. 1990,22(8): 811-822.
202. Kagley A.N., Snider R.G., Krishnakumar P.K., Casillas E. Assessment of seasonal variability of cytochemical responses to contaminant exposure in the blue mussel Mytilus edulis (Complex) Arch.Environ. Contam Toxicol. 2003. V 44. N1. pp. 43-52.
203. Kaivarainen, E., Nemova, N., Krupnova, M., Bondareva, L.: The effect of toxic factors on intracellular proteinase activity in freshwater fish. Acta vet. Brno 67. 1998. P. 306-316.
204. Kawashima S., Inomata M., Imahori K. Autolytic and proteolytic process of calcium-activated neutral protease and independent from each other. Biomed. Res. 1986, 7 (5): 327331.
205. Kidd K.A., Hesslein R.H., Fudge R.J.P., Hallard K.A. The influence of trophic level as measured by delteN15 on mercury concentrations in freshwater organisms. Water, Air, and Soil Pollut. 1995. Vol. 80. P. 1011-1015.
206. Kinne O. Salinity animals - invertebrates. In: Marine ecology. London etc., 1971. Vol.1, N2, pp. 820-995.
207. Koch H.J.A., Evans J.C., Bergstrom E. Sodium regulation in the blood of parr and smolt stages of the Atlantic salmon. Nature. Lond., 1959. Vol. 184. 283 only.
208. Komulainen H., Bondy S.C. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1987. 88: 77.
209. Kremer M., Judd J., Rifkin В., Auszmann J., Ousler M.J. Estrogen modulation of osteoclast lysosomal enzyme secretion. J. Cell. Biochem. 1995. V. 57, N 2. P. 271-279.
210. Kroeger H. Hormones, ion balance and gene activity in dipteran chromosomes. Mem. Soc. Endocrinol. 1967. Vol. 15. №1. P. 55-66.
211. Kroeger H. The control of puffing by ions: a reply. Molec. Cell. Endocrinol. 1977. Vol.7, N l,pp. 105-110.
212. Kubota S., Ohsawa N., Takaku F. Purification of calcium-activated neutral proteinase from human placenta. Biochem. Biophys. Acta. 1984. Vol. 802. №1. P. 379-383.
213. Laurent T.S., Killander J.A. A theory of gel filtration and its experimental verification. J. Chromatogr. 1964. Vol. 14. p. 317.
214. Lawrence A .J., Poulter C. Development of a sub-lethal pollution bioassay using the estuarine amphipod Gammarus duebeni. Wat. Res. 1998. Vol. 32, No.3, pp. 569-578.
215. Lezzi M. Differential gene activation in isolated chromosomes. Intern. Rev. Cytol., 1970. Vol. 29, N1. Pp. 127-168.
216. Lindqvist O., Johansson K., Aastrup M., Andersson A., Bringmark L., Havsenius G. et al. Mercury in the Swedish environment recent research and causes. Water Air Soil Poll., Special Issue. 1991. Vol. 55.
217. Lindquist S., Craig E.A. The heat shock proteins. Annu. Rev. Genet. 1988,22: 631-677.
218. Loeb V., Siegel V., Holm-Hansen O., Hewitt R., Fraser W., Trivelpiece W., Trivelpiece S. Effects of sea-ice extent and krill or salp dominance on the Antarctic food web. Nature. 1997. Vol. 387, pp. 897-900.
219. Lovern J.A. Some causes of variation in the composition of fish oils. J. Soc. Leath. Trades Chem. 1950, 34, pp. 7-21.
220. Lowe D.M., Clarke K.R. Contaminant -induced changes in the structure of the digestive epithelium of Mytilus edulis. Aquat. Toxicol. 1989. Vol. 15, pp. 345-358.
221. Mace H.H. Disposal of wastes from water treatment plants. Pub. Works. 1953. 7, pp. 73-76.
222. MacNeil C., Dick J.T.A., Elwood R.W. Differential physico-chemical tolerances of amphipod species revealed by field transplantations. Oecologia. 2000. Vol. 124, pp. 1-7.
223. Madsen S.S., Naamansen E.T. Plasma ionic regulation and gill Na+, K+-ATPase changes during rapid transfer to seawater of yearling rainbow trout, Salmo gairdneri: time course and seasonal variation. J. Fish. Biol. 1989. Vol. 34, pp. 829-840.
224. Maeda O., Ojima Т., Nishita K. Comparative studies on heat stability and autolysis of scallop (Patinopecten yessoensis) calpain П-like proteinase and rabbit calpain П. Сотр. Biochem. Physiol. 1992,102B (1): 155-157.
225. Maki M., Hatanaka M., Takano E., Murachi T. In: Intracellular calcium-dependent proteolysis (Mellgren R.L. and Murachi T. eds.). CRC Press, Inc., Boca Raton, FL. P. 37-54.
226. Makinodan Y., Akasaka Т., Toyohara H., Ikeda S. Purification and properties of carp muscle cathepsin D. J. Food Sci. 1982. Vol.47. №2. P. 647-652.
227. Marques J.C., Nogueira A. (1991) Life cycle, population dynamics and production of Echi-nogammarus marinus Leach (Amphipoda) in the Mondego estuary (Portugal). Oceanol. Acta 11,213-223.
228. Mason R.P., Reinfelder J.R., Morel F.M.M. Uptake, toxicity and trophic transfer of mercury in a coastal diatom. Environ. Sci. Technol. 1996. 30: 1835-1845.
229. Matsuda K., Misaka E. Studies on cathepsin D of rat liver lysosomes. I. Purification and multiple form. Biochem. 1974. V.76. p. 639-649.
230. McCormick S.D. Hormonal control of gill Na+, K+-ATPase and chloride cell function. In: Wood C.M., Shuttleworth T.J. (Eds.), Cellular and Molecular Approaches to Fish Ionic Regulation. Academic Press, New York, 1995. pp. 285-315.
231. McKee J.E., Wolf H.W. Water quality criteria, 2nd ed. Resources Agency of California, State Water Quality Control Board, Sacramento, 1963. Publ. No. 3-A. 548 pp.
232. McLusky D.S. Ecology of estuaries. London, 1971.144 p.
233. McLucky D., Bryant V. and Campbell R. The effects of temperature and salinity on the toxicity of heavy metals to marine and estuarine invertebrates. Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. 1986. Vol. 24, pp. 481-520.
234. Melloni E., Salamino F., Sparatore B. The calpain calpastatin system in mammalian cells: properties and possible functions. Biochem. 1992, 74 (3): 217-223.
235. Mercuric chloride nephrotoxicity and its influence on the metabolism of essential elements in rats. Master thesis in medical science from the Dep. of Environmental Medicine Faculty of Medicine. University of Umea, Sweden, 1991.
236. Milanesi A.A., Bird J.W.C. Lysosomal enzymes in aquatic species. П. Distribution and particle properties of thermally acclimated muscle lysosomes of rainbow trout Salmo gairdneri. Сотр. Biochem. Physiol. 1972. Vol.41B. №3. P. 573-591.
237. Miskimmin B.M., Rudd J.W.M., Kelly C.A. Influence of dissolved organic carbon, pH, and microbial respiration rates on mercury methylation and demethylation in lake water. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1992. 49: 17-22.
238. Moloney C.L., Ryan P.G. Antarctic marine food webs. In: Nierenberg, W.A. (Ed.), Encyclopedia of Environmental Biology. 1995. Vol. 1. Academic Press, San Diego.
239. Moore D.W., Dillon T.M. The relationship between growth and reproduction in the marine polychaete Nereis arenaceodentata (Moore): implications for chronic sublethal sediment bioassays. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1993. Vol. 173. P. 231-246.
240. Moore M.N. Cellular responses to pollutants. Mar. Pollut. Bull. 1985. Vol. 16, pp. 134-139.
241. Moszczynski P., Slowinski S., Rutkowsky J., Bern S., Jacus Stoga D. Lymphocytes, T and NK cells in men, occupationally exposed to mercury vapours. Int. J. Occup. Med. And Environ. Health. 1995. V. 8, N 1. p. 49-56.
242. Murachi T. Calpain and calpastatin. Rinsho Byori. 1990. Vol. 38. № 4. P. 337-346.
243. Murachi Т., Hatanaka M., Yasumoto Y., Tanaka K. A quantitative distribution study on cal-pain and calpastatin in rat tissues and cells. Biochem. Int. 1981,2 (6): 651-656.
244. Murachi, Т., Takano, E., Tanaka, K. Proteinase Inhibitors: Medical and Biological Aspects. Japanese Science Society Press Tokyo (Springer, Berlin). 1983. p. 165-172.
245. Murakami Т., Hatanaka M., Murachi T. J. Biochem. (Tokyo). 1981. Vol. 90. P. 1809-1816.
246. Muus B.J. The fauna of Danish estuaries and lagoons: Distribution and ecology of dominating species in the shallow beaches of the mezohaline zone. Meddelelser fra Danmarks Fisk-eriog Havundersgelser. 1967. Vol.5. N 1. p. 3-316.
247. Mykles D.L., Skinner D.M. Ca2+-proteolytic activity in Crab Claw muscle. J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. № 17. P. 10474-10480.
248. Mykles D.L., Skinner D.M. Atrophy of crustacean somatic muscle and the proteinases that do the job. A review. J. Crust. 1990. Vol.10. №4. P. 577-594.
249. Nathanson M.H., Mariwalla K., Ballatori N., Boyer J.L. Effects of Hg2+ on cytosolic Ca2+ in isolated skate hepatocytes. Cell. Calcium. 1995. 18 (5): 429-439.
250. Nichols F.H., Cloern J.E., Luoma S.N. & Peterson D.H. The modification of estuary. Science. 1986. Vol. 231, pp. 567-573.
251. PARCOM. A sediment bioassay using an amphipod Corophium sp. PARCOM protocols on methods for the testing of chemicals used in the offshore industry. Oslo and Paris Commissions, London, 1995, 35 pp.
252. Parry G. Osmotic and ionic changes in blood and muscle of migrating salmonids. J. Exp. Biol. 1961. Vol. 38. pp. 411-427.
253. Pequignot J., Serfaty A. Influence of salinity on the respiration of teleostean tissues. Experi-entia. 1965. Vol. 21. pp. 227-230.
254. Phillips D.J.H. The common mussel Mytilus edulis as an indicator of pollution by zinc, cadmium, lead and copper. I. Effects of environmental variables on uptake of metals. Mar. Biol. 1976. 38: 59-69.
255. Pinter M., Friedrich P. Biochem. J. 1988,253: 467-473
256. Porte C., Biosca X., Sole M., Albaiges J. The integrated use of chemical analysis, cytochrome P450 and stress proteins in mussels to assess pollution along the Galician coast (NW Spain). Environmental Pollution. 2001. Vol. 112, pp. 261-268.
257. Potts W.T.W., Parry G. Osmotic and ionic regulation in animals. Oxford-London, 1964. P. 1-423.
258. Press E.M., Porter R.R., Cebra J. The isolation and properties of a proteolytic enzyme, cathepsin D, from bovine spleen. Biochem. J. 1960. 74. p. 501.
259. Rainbow P.S., Phillips J.H., Depledge M.H. The significance of trace metal concentrations in marine invertebrates a need for laboratory investigation of accumulation strategies. Mar. Poll. Bull. 1990. 21, pp. 321-324.
260. Rainbow P.S., White S.L. Comparative strategies of heavy metal accumulation by crustaceans: zinc, copper and cadmium in a decapod, an amphipod and a barnacle. Hydrobiology 1989,174, pp. 245-258.
261. Rasmussen R.A., Rasmussen L.E. Some observations on the protein and enzyme levels and fractions in normal and stressed elasmobranchs. Trans. N.Y. Acad. Sci. 1967. Vol. 29. Ser. П, pp. 397-413.
262. Reddy P.K., Constantides S.M., Dymsza H.A. Catheptic activity of fish muscle. J. Food Sci. 1972. Vol. 37. P. 643-648.
263. Reish, D.J. (1993). Effects of metals and organic compounds on survival and bioaccumula-tion in two species of marine gammaridean amphipod, together with a summary of toxico-logical research on this group. J. Nat. Hist., Lond. 27, 781-794.
264. Ribeyre F., Boudou А. ТгорЫс chains and experimental ecosystems: study of bioaccumula-tion and transfer processes. In: Boudou A., Ribeyre F. (Ed.), Aquatic Toxicology: Fundamental Concepts and Methodologies. CRC Press, Boca Raton, FL. 1989. pp. 3-46.
265. Richmond C.E., Woodin S.A. Effect of salinity reduction on oxygen consumption by larval estuarine invertebrates. Marine Biology, 1999,134, pp. 259-267.
266. Ritz D.A. Tolerance of intertidal amphipods to fluctuating conditions of salinity, oxygen and copper. J. Mar. Biol. Ass. UK. 1980. Vol. 60, pp. 489-498.
267. Roch M., McCarter J.A., Matheson A.T., Clark M.J.R., Olafson R.W. Hepatic metal-lothionein in rainbow trout (Salmo gairdneri) as an indicator of metal pollution in the Campbell River system. Can. J. Fish Aquat. Sci. 1982, 39: 1596-1601.
268. Rodgers D.W. In: Mercury Pollution: Integration and Synthesis, Lewis Publishers, Boca Raton, 1994. P. 427
269. Roesijadi G. Metallothioneins in metal regulation and toxicity in aquatic animals. Aquat. Toxicol. 1992, 22: 81-114.
270. Rousefell G.A., Everhart W.H. Fishery science. Ita methodsand applications. John Wiley and Sons, Inc., New York. 1953.444 pp.
271. Rudd J.W.M., Furutani A., Turner M.A. Appl. Environ. Micro. 1980. 40: 777.
272. Rudd J.W.M., Turner M.A. The English-Wabigoon River system: V. Mercury and selenium bioaccumulation as a function of aquatic primary productivity. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1983.40:2251-2259.
273. Ryan R.E., Sloane B.F., Sameni M., Wood P.L. Microglial cathepsin B: An immunological examination of cellular and secreted species. J. Neurochem. 1995. V. 65, N 3. P. 1035-1045.
274. Sakamoto M., Ikegami N., Nakano A. Protective effect of Ca2+ channel blockers against methyl mercury toxicity. Pharmacol. Toxicol. 1996. 78: 193-199.
275. Salanki J. Invertebrates in neurotoxicology. Acta Biol. Hung. 2000. Vol.5l.N.2-4.pp 287307.
276. Sanders B.M. Stress proteins in aquatic organisms: an environmental perspective. Crit. Rev. Toxicol. 1993, 23: 49-75.
277. Scheuhammer A.M., Blancher P.J. Potential risk to common loons (Gavia Immer) from me-thylmercury exposure in acidified lakes. Hydrobiologia. 1994. 279/280: 445-455.
278. Schlenk D., Brouwer M. Induction of metallothionein mRNA in the blue crab (Callinectes sapidus) after treatment with cadmium. Сотр. Biochem. Physiol. 1993,104C: 317-321.
279. Selye H. Stress and the general adaptation syndrome. Brit. Med. J. 1950, 1. pp. 1383-1392.
280. Sharma A. Clastogenic effects of metals on higher organisms. In: "7th Int. Bioindicators Symposium & Workshop on Environmental Health, Kuopio, Eds. S. Roy, L. Karenlampi & O. Hanninen, 1992. P. 50.
281. Sheader M. The reproductive biology and ecology of Gammarus duebeni (Crustacea: Am-phipoda) in southern England. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. Vol. 63,1983, pp. 517-540.
282. Shenker B.J., Guo T.L., Shapiro J.M. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1999.157: 23.
283. Shepard J.L., Olsson В., Tedengren M., Bradley B. Protein expression signatures identified in Mytilus edulis exposed to PCBs, copper and salinity stress. Mar. Environ. Res. 2000. Vol. 50. N 1-5. pp. 337-340.
284. Siebert G., Schmitt A., Traxler G. Reinigung und proteolytische spezifitat eines neues kathepsins aus dorschmilz. Z. physiol. Chem. 1963. 332. p. 160-166.
285. Somero G.N., Low P.S. Enzyme hydrotation may explain catalytic efficiency differences among lactats dehydrogenase homologues. Nature, 1977, vol. 266, N 4287, p. 276-278.
286. Somero G.N., Neubauner M., Low P.S. Neutral salt effect on the velocity and activation volume of the lactate denydrogenase reaction: evidence for enzyme hydration during catalysis. Arch. Biochem. Biophis., 1977, vol. 181, N 2, p. 225-247.
287. Sorimachi H., Saido T.C., Suzuki K. New era of calpain research. FEBS Lett. 1994. Vol. 343. №1. P. 1-5.
288. Sorimachi H., Ishiura S., Suzuki K. Structure and physiological function of calpains. Biochem. J. 1997. V. 328, Pt 3. P. 721-732.
289. Spry D.J., Wiener J.G. Metal bioavailability and toxicity to fish in low-alkalinity lakes: a critical review. Environ. Pollut. 1991. Vol. 71. P. 243-304.
290. Stefansson S.O. Berge A.I., Gunnarsson G.S. Changes in seawater tolerance and gill Na+, K+-ATPase activity during desmoltification in Atlantic salmon kept in freshwater at different temperatures. Aquaculture. 1998. Vol. 168. P. 271-277.
291. Stuhlbacher A., Maltby L. Cadmium resistance in Gammarus pulex (L.). Arch. Environ.
292. Takano E., Hamakubo Т., Kawatani Y., Ueda M., Kannagi R., Murachi T. Multiple forms of calpastatin in pig brain. Biochem. Int. 1989. Vol. 19. №3. P. 633-642.
293. Theede H., Lassig J. Comparative studies on cellular resistance of bivalves from marine and brackish waters. Helgolander wiss. Meeresunters., 1967, Bd 16, H. 1, S. 119-129.
294. Toyohara H., Makinodan Y., Ikeda S. Detection of calpain and calpastatin in carp eggs. Bull. Soc. Sci. Fish. 1985a, Vol. 51. № 8. P. 1281-1286.
295. Toyohara H., Makinodan Y., Ikeda S. Detection and some properties of calpain П (high Ca2+-requiring form of calpain) in carp (Cyprinus carpio) erythrocytes. Сотр. Biochem. Physiol. 1985b. Vol. 81B. №3. P. 583-586.
296. Toyohara H., Makinodan Y., Tanaka K., Ikeda S. Mutual inhibitory effect of calpastatins on calpains from carp muscle, carp erythrocytes and rat liver. Сотр. Biochem. Physiol. 1985c. Vol. 81. №3. P. 579-581.
297. Toyohara H., Makinodan Y. Comparison of calpain I and calpain П from carp muscle. Сотр. Biochem. Physiol. 1989. V.92. № 3. P. 577-581.
298. Wong A.H.K., McQueen D.J., Williams D.D., Demers E. Transfer of mercury from benthic invertebrates to fishin lakes with contrasting fish community structures. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1997. Vol. 54. P. 1320-1330.
299. World Health Organization (Ed.), IPCS, Environmental Health Criteria 101. Methylmercury, World Health Organization, Geneva, 1990. P. 60-99.
300. Wren C.D., MacCrimmon H.R. Mercury levels in the sunfish, Lepomis gibbosus, relative to pH and other environmental variables of Precambrian Shield lakes. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1983. Vol. 40. P. 1737-1744.
301. XiaoXia Т., Cuye Т., Castoldi A., Manzo L., Costa L., J. Toxicol. Environ. Health. 1993. Vol. 38. P. 159.
302. Xun L., Campbell N.E.R., Rudd J.W.M. Measurements of specific rates of net methyl mercury production in the water column and surface sediments of acidified and circumneutral lakes. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1987. Vol. 44. P. 750-757.
303. Yamashita M., Konagaya S. High activities of cathepsins B, D, H and L in the white muscle of chum salmon in spawning migration. Сотр. Biochem. Physiol. 1989. Vol.94. №1. P. 149-152.
304. Yoshizawa Т., Sorimachi H., Tomioka S., Ishiura S., Suzuki K. Calpain dissociates into sub-units in the presence of calcium ions. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 208. №1. P. 376-383.
305. Zamuda C.D., Sunda W.G. Bioavailability of dissolved copper to the American oyster Crassostrea virginica. I. Importance of chemical speciation. Mar. Biol. 1982. Vol. 66. P. 7782.
-
Бондарева, Людмила Александровна
-
кандидата биологических наук
-
Петрозаводск, 2004
-
ВАК 03.00.04
- Протеолитические ферменты в тканях некоторых морских беспозвоночных
- Изучение комплекса протеолитических ферментов при воздействии токсинов различной химической структуры в печени живородки речной
- Внутриклеточные протеиназы в эколого-биохимических адаптациях у рыб
- Разработка стратегии получения ферментативных белковых гидролизатов из тканей морских гидробионтов
- Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм
