Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные изменения миокарда животных под действием биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения миокарда животных под действием биологически активных веществ"

- На правах рукописи

НЕФЕДОВА Светлана Александровна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МИОКАРДА ЖИВОТНЫХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЬЕХ ВЕЩЕСТВ

03,00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дивов» Рязанском области - 1996

*

ьп

Работа выполнена в Рязанской государственной сельскохозяйственной ака-деинн имени профессора П.А.Косшчсва

Научныеруководатвдк:

член-корреспондент ПАЛИ В.А.Захаров

* доктор биологических наук, профессор А,С.Козлоа ' . Официальные оппонентьв

* доктор биологических наук, академик РАСХН&П. Дегтярев

* кандидат биологических наук, спинаучный сотрудник Г.Ф.Сергиенко

Ведущее, предприятие: Российский государственный агарный заочный университет . •.

Защита состоится «24» декабря 1996 года в 10 часов на заседании диоертационного совета К 020^5.0! во Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства •

Адрес:

391128, Рязанская область, Рыбновский район, д.Дивово, Институт коневодства

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ коневодства

Автореферат разослан «_» ноября 1996 г.

Ученый секретарь, диссертационного совета ___Л

^^Ок^Ф^еЪссСергиенко

<ШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТВ

Актцальность темы исследований. Характерной особениостьв современной биологической науки является изучение приспособительных реакций организка человека и зчвоткнх к постоянно менявшимся условиям йнвнней средн. Установлено,, что зга. приспособительные реакции организма с!)прово*давтс9 изменением показателе А' многих физиологических систем, з тса числе и сердечно - сосудис- ; той. Применение современных методов исследования позволило , установить, что мнвечные клетки сердца более чувствительны ¡^ ряду из-;. v менений внеаней,среды, чем клетки скелетной мускулатура. Сердечные мквцн значительно отличаются от скелетнах и яо Физиодагичес-киы показателям. В последнее время стало . известно,чтс: многие* вневние факторы могут приводить-" к "слоаным структурно-ФРЭДйс-' нальнык изменениям сердца организма человек« и гивотных. f itehs-ford R.G,, 1980; Laratta E.G. 1980;-Gulch О.Д98С j* др. ) ■

Современные представления о приспособительных реакциях сердечно - сосудистой системы организма к различным Факторам знезней среда позволявт разработать мероприятий, ограничивавшие зивотннх от стрессовых состояний ( Строев Е.ft.,1378; Царцидзе О., Xavin- -sky C.J. et.aL,1382 и др.). Однакомногие физиологические особенности сердечной ннащы оставтся мало изученными. Кроме того каждому виду зивотных свойственны определенные особенности защитно-приспособительных реакций, хотя компенсаторно-приспособительный процесс в основной протекает одинаково для всех млекопитающих ( Фролов В.Я. ,-1989 ).'

Регуляция гормонами_протеолитических..сястем является одной из проблем современной биохимии,иыевщей как фундаментальное, так .... и прикладное значение., Выявление механизмов действия гормонов на ультраструктуру кардиомиоцитов миокарда позволит регулировать норфофункциснальноё состояние сердца, способствуя этим создании оптимальных условий для жизнедеятельности, повышению продуктивности, увеличений продолжительности использования многих видов яивотннх С FUnk i.L..i9?7; Frolris U.U..i378 я др., L; ' r

В настоящее время большое значение при выявлении действия гормонов на клетка отводится лизосомам I Строев Е.Й.,1978¡Ноженок Т.П.. 1990 и др.). Это делает проблему изучения ультраструк-турннх особенностей кардиоииоцитов в норме и при парабиозе актуальной.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работа было изучить структурно-функциональные особенности вакуолярного и нито-хондриального аппарата кардиоииоцитов миокарда кроликов и крыс в норме, при изадрининдуцированноы парабиозе, а так же 8 условиях когда п^ред введением изадрина яивотным в. течение недели повывали дрсвень гормонов щитовидной и подзелудочной железы. Исходя из зто^ го были намечены следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия обработки тканей сердца для изучения под электронным микроскопом.

2.Сравнить ультраструктуру кардиоииоцитов двух различных видов животных в норме и эксперименте.

3. Определить особенности структурно-функциональных изменений в ультраструктуре кардиомиоцитов кроликов и крыс при парабиозе

4. Изучить влияние гормонов на морфофункциональные свойства митохондрий и.лизосом кардиоииоцитов изучаемых животных.

5.Выявить зависимость завитно-приспособительных функций кардиоииоцитов при парабиозе от гормонального статуса организма.

Научная новизна. Впервые изучены морфофункциональные сдвиги в нативной сердечной книце при повыиеннон гормональном статусе, установлено блокирование мембран первичных лизосом, ферменты которых ответственны за деполимеризация целвлярных белков. Выяснена Функциональное значение гормонов в профилактике развития парабиоза миокарда индуцированного повышением катехоламинов.

Теоретическое и практическое значение работы. Модифицированная методика подготовки препарата мывечной -ткани сердца для злек- *. тронно-ыикроскопического исследования монет использоваться в различных отраслях биологических, ветеринарных, биоиембранологичес-ких и медицинских исследований. Полученные экспериментальные дан-

.. - з -

та гаезт как фундаментальное, так и прикладное значение. Оки вреДстаедявт интерес при оргаккзги'ии треканга лошадей, при рас-тафровке иеханизкав сердечной патологии к терапии, при создания коделей шкродкффрного якварктзи

Результат» работа расикояя? созрэменназ представления о роли гтатекназнсго иеханкзиа в реализация действия гооиоиов на чстаЗо-лззи штарщ,..-. :

ЙС2Т я&гяйтся таоретяч'з^Ш а-практический основанием для прннекзш?я модификаторов активности протеяназ в качестве лечебных средств..

Згдубленное издченае лнзосонального аппарата, а так зе мехз-нзэйз блокацаа неибрак этих органсдл могут бить использована з 'дчевноа процессе при освещении сакк«и« «таксон. •• ' ' йпребацая работа. Основные подъема гассертацки п-зедсг.-в-декя ч?. надчйой конференций прог^с"':рск<ч-,ь]?!пода^ате;;ьсксго сос-газв а аспирантов СаяйтнЬтзрбцргскзго ордена Трудового Красного знангкк государственного аграрного уш»в9рситета(СПб.-Цуякнн,1333 •. на обьединеннон мезказедральнои заседании с-лрид&чков зооияхенер-його Факультета Рязанской госудзоствннасй се^ьсксхозяйственной академии имени.профессора П.Й.Костычева (Рязань,1996). Пп томе диссертации опвбяичеггт^ 15 :течаг»вг чабзгя.

Структура и обьек дяссертзаяй. ¿;гсзр«ация излоаена на 114 страницах кашинописного текста, содержит 18 таблиц, 12 микрофотографий. Диссертация состоит из ззодения.обзора литература, описания методов исследования, закдзча\ш. выводов и указателя используемой литература, вклачазцего 153 источника Материалы и методы исследования 1. Моделирование опыта.

Опнтн проводились на белых крысах самцах весон 160 - 210 г, ар'оликах породы советская ниниилла весоа 1500 - 2000 г. Зивот-нзе содержались в стандартных условиях вивария на полном рационе соответственно суточным норматива« для данного вида зивотных С Е. Я-. Яковлева ,1971). '

С целью выяснения морфофункции лизосом и митохондрий в норме, при парабиотических состояниях, а так же при изменении Гврмсналь-ногостатуса в условиях экспериментальной патологии и у кроликов, ; И У крас проведены слейдвчив опыты:;

7 7

1 ■ ' 1ивотных зтих групп ливали пищи, за сутки до декапнтации, после чего изучали сердце применяя злектронно-микроскопические, гистохимические к биохимические методы исследования. Полученные данные принимались за -контрольный результат.

1.2. Экспериментальный парабиоз сердечной мквца исследовался в группах кроликов и крас,' в которых моделировалось. повреждение миокарда. С зтой цельа использовали изадрин В дозе.120 иг/кг

. ' который вводили подкожно за 24 часа до декапитации.

1.3. Возможная протекторная-роль гормона «итовидной железы •V при парабиотических изменениях миокарда исследовалась з группах

. кроликов и крыс которых после недельного введения трииодтирони-; , на в дозе10ед/кг подкожно, единожды, вводили изадрин. в дозе , * ,120 мг/кг. После. 24 часов животных декапитировали.. с ^ 1.4.:;^ Цельа'вняснекия 'состояния . лизосомальных ' мембран, а : : так ае' лизосоиалькнх Ферментов в механизме: действия трииодтирони-на у групп кроликов я крыс моделировали гиперфункция щитовидной . железы. Гипертиреоз вызывали .при подкожном введении трииодтир.они-на, в.дозе 10 ;ед/кг С З.И.Соболев,1976) ежедневно , в течение 7 • дней, после чего животных декапитировали.

'. 1.5. Для изучения влияния инсулина на ультраструктуру мио-. карда в группах кроликов и крыс а течение 7 дней вводили инсулин, •внутримыиечно, в дозе 0,3 ед/кг, после чего декапитировали животных.

1.6. Для выявления действия инсулина на поврежденный миокард в других группах кроликов и крыс модулировалось повышение инсулинового статуса путем введения животным инсулина в дозе 0,5 ед/кг в течение недели, после чего единожды подкожно вводили изадрин в дозе 120 мг/кг. , : .

- 5.V;... - - -

.Электронно - микроскопические исследования.

Для электронно .- микроскопического исследования нейолгние кусочки миокарда Фиксировали в растворе глутарового альдегида. Материал промывали в растворе осмиевой кислота, проводили по воз-раставаей концентрации спиртов, заклвчали в смесь аралдита я зпо-на ( Г.Гайер,1974 ).

Гистохимическое выявление фермента кислая фосфатзза проводили но методу Зряксона и Трукяа С Г.Гайер.1974 ).

Зльтратоккие срезы для электронно - микроскопического исследований проводились на ультратонах ШП - 4 и ШП - 5. Исследования проводились на микроскопе ЗНВ 100 АК.

Злектронограимы миокарда выполнялись на пленке РТ 41 и РТ 3$. йорфометрический метод.

При количественном анализе цитоструктур кардиоииоиито& определялись следувщие показатели:

1. Среднее число митохондрий в I электронограмие.

2. Среднее количество крист в одной митохондрии.

3. Среднее количество лизосоа в 1 злектронограане.

4. Общее число лизосок в исследованных электроногранмах.

Показатели указанного метода брали из разработок В^С.Паукова и

В.й.Фролова ( 1980 Данные полдчали от наядой экспериментальной группы вивотных из расчета 52 электроногракк в каждой экспериментальной серии.

Биохимические методы Получение материала для исследований У животных находящихся под легким эфирным наркозом извлекали сердце, тщательно промывали холодной сдспен"ирувзей средой, суви-ли мекду листами фильтровальной бумаги, взвешивали, измельчали и гомогенизировали в 8 объемах 30 мК раствора хлорида натрия, содержащего 4 нй ЗДТй, 50мМ трис - ацетата, при рН = 7,6 (З.Зоуо ога,1980 ).

В стеклянном гомогенизаторе типа Поттвра - Зльвегейиа с теф-лоновым пестиком при 1500 об/мин 90 секунд. После центрифугирова-

- б -

ния гомогената при 1500 « в течение 10 шш. в центрифуге ЦБР - 1. осадок вместе с рыхлым слоев отбрасывали, супернатант повторно центрифугировали при 30000 g 30 нин. в центрифуге ЦБР - 1. Полученный надосадок использовали для определения в нем неседиментируемой активности катепсинов и кислой фосфатазц, свидетельствующей о состоянии лизосоыальной мембраны, Осадок, представляющий собой фракции богатую лиэосоками. ресуспендировали в двух объемах неионного детергента тритона X - 100 для полного освобСЕДениз структурированных ферментов и определение еединентируеыой активности катепсинов и кислой фосфатазы. Все процедура проводились при Т = 4С ( fi.fl.Покровский, 1976

Определение активности катепсина Д Активность катепсина Д в миокарде оценивали по количеству ки-слоторастворшшх продуктов, образующихся при ферментативном гидролизе гемоглабина по методу описанному Барретон ( ft.Barret et 3.DingI,1972 ). Субстрат предварительно денатурировали два часа при 60'С в 8 М растворе мочевины.Инкубационная смесь, содержала 1мл 27. раствора гемоглабина в 0,1 М ацетатном буфере рН = 3,6 и 0,2 мл исследуемого образца. Измерение активности катепсина Д проводили в присутствии ингибитора карбоксильных протеиназ - пеп-сгатино, конечная концентрация которого в пробе составляла Z мкг/нл. После инкубации на водяной бане при 37С в течение одного кислота. Пробы центрифугировали при 3000 об/мин в тече.чие 15 кинут. Определение оптической плотности суперкантанта проводили на СФ 26 при 260 ни. Активность катепсина Д выранали в нноль тирозина/иг белка час.

Б качестве контрода использовали субстратный раствор, в ко-часа реакцию останавливали добавлением 2.0 мл 57. трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали при 3000 об/шн в течение 15- минут. Определение оптической плотности супернентанта проводили на

СФ 26 при 280 ны. Активность катепсина Д выракали в нноль тирози-на/мг белка час.

В качестве .контроля использовали субстратный раствор» в ко— торнй после иикубацм.;; я добавлений тряхлерунсуской кислоты*, добавляли исследуемый образец.

Определение актявиосгн' - г*«дактейя«аг? - определения активности - галактг.о^д&зч -чс-ц^нилк моди-с-ягпфозгктшй" метод Баррета, где s качестве субстрата используется SAüü - пйТВиаен#ч - я - Г»rwSSTOTSJlCßSSSS. ÜUCüVüüi гвцралаяо-ется ферментом при pif = 4,0 с образования:: пара - нитрофенола,который дает окраиизание с максимумом погладешш при 420 ни. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента. Инкубационная смесь содеряала i ил субстрата (концентрация 5 мй) в 0,15 Н цитрат - фосфзтнрн буфере при рй = 4,0 и 0,2 мл исследд-емого образца. Пося<з инчубзщп! s течбпка "36 м»и»»т при тйкпепзту ре 37С на водяной -1ияе реодде? осгзнейлизал; ¿stljfwmges I,.5 мл 0,4 М буфера глицйк - гкдрсксяд натри«. Копсекто^дчз зглхко:^ определяли по оптической плотности проб на СО 26. ккгшкеетъ В-гс-лактозидазн выражали в наоль п - нитрофенол/кг белна ча час.

Белок'определяли макробиуретован методом ( Г.Й.Кочетова,1380 ) Определение активности кислой фосоатазн . Сердце ЕИвотншс гомогенизировала в 3 объемах 50 мМ , содер-надего 4 ЙМ ДТЙ, 50 н'! тркс-ацетата при pH = 7,5 (S,Tortrai,'381) на холоду в гомогенизаторе типа Поттера при 1200 об/зши 30 сек. Гомогенат последовательно центрифугировали при .1500 об/мин при 20000 об/нии 30 мин. В супернантаите определяли неседиментируе-муа активность.Осадок ресуспендировали в растворе тритона Х-100 для определения .седиментируеиой активности. Активность кислой фосфатазы определяли по гидролизу нитрофенолфосфата(3. Dlngl,19?2). Гистохимическое выявление кислой фосфатазы в лизо-сомах кардиомиоцитов проводили по методу Зриксона и Трумпа (1972).

Определение активности катепсина В Для определения активности катепсина В применили модифицированный метод Баррета (й.Barrett et 3.Dlngl.i972). где. в качестве

субстратавашвзфзтса а- -бензоил -¿Ь^яига^пара-ттроаншшда^ гидрохлорид ( БМВД ). Субстрат гидрадоуется, катепсином 8 ^ при рН=М с образованием параяитрофенола, который дает в аелочной среде «едтов окраживание с максимумом поглощения при 410 нм. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента. Инкубационная смесь содержала 0»4мл гомогената, 0,2 мл активирующего раствора и 0,4мл 0,05 К фосфатного буфера рН=0,О. После преинку-бацяи при 371С реакции начинали внесением 0,1 ил раствора субстрата (2,3 ымоль") в диметильфоксидазе и через два часа останавливали добавлением 1 мл 10% растЁора ТХН. После приливания к на-досадку 1 мл нейтрализувдего раствора С1 моль трис+1 моль гидрок-сид натрия) и развития окрашивания оптическдв плотность определяли на СФ-26, Активность катепскна В выражали в ныоль пара-нитроа-нклина/мг белка час.

Статистическая обработка результатов Результаты экспериментов обрабатывались методом вариационной статистики с использованием коэффициента Стьвдента на персональной коипьвтере "Мазовия СМ - 1314". В таблицах достоверность изменений отмечена -: « - Р < 0.03., ** - Р < 0,01., *** - Р < 0,001.

. ' ' РЕЗУЛЬТАТЕ И ИХ ОЗВДЕНИЕ

1. ¥одификация метода обработки сердечной мнвцы для злектронно - микроскопического исследования. Суяествувцие процедуры обезвоживания и .заливки органов для', электронно - кироскопкческого исследования не являвтсз универ-садышш для биологических объектов различной плотности ткани. Из вестно, что органы к ткани помимо различной, плотности обладает отличной структурой, а так ке требуют индивидуальное количество времена для полной пропитки Фиксатором й смолой С Л. С.Голь дин, 1963).

При проведении электронно - микроскопического исследования миокарда крнс и кроликов нами подбирались оптимальные условия обработки изучаемой ткани. Нчнтнвая высокуа плотность ткани нио- -карда желудочков* сердца, связаннуа с сократительной Функцией сер-. -

-дачкой'ашща, дляг кздчвотз.стр^ на дяьтратвк-

; km срезах предлагается собственная модификация метода фиксации, обизвоаивания и заливки, миокарда, J.. . ;

Фиксация. Требувааася часть гелудочка вырезается с помочь безопасной бритвы на фильтровальной бумаге и переносятся в часов?-■ стекло с фтсирувщт раствором (2,5'/ р2ст2ор пщгзрсвогй альдеги-• Далькейзеег изйёдачвйие материала производится в. часовом стек- •• -ле. Материал выдергивается в фиксаторе! часа, пронывается бу?з-'; . рои P5S (рй =7 /4 ); "причем в б смеиах по. 15 минут.-, что '. позволяет: ':..-"-, ; полностью промыть фиксатор из плотное ткани. Дофиксация материала проводилась в 0.1% растворе.OsO а"течение Í2 часов при Т = 4'С. : Таким образов, уменьшив; обаяно; используемда;концентрациа'Osó'и■уве- : 'личивая г>ремя двфиксации материал достигается равномерное распределение фиксатора.в ткаки, сникается возмозность растсорениа части липидно - белковых компонентов внутри кардиохиоцитов йиокардз.

Для приготовления ультратонких срезов без поврегдения изучаемого объекта необходимо, чтобы заливочный материал обладал определенной эластичностью. Плотность заливочного материала долзна совпадать с плотностьа обезвоженного объекта (Г.й.Меркулов,ISSG). ..

Обезвозивание. Начальные стадии проводили при 4'С с повы-иением концентрации этилового спирта в последовательности: 50'/. объект.дерзать,в нем.до почернения раствора, 70'/. - 30 минут, 36% - 2 раза па 30 минут, "абсолютный спирт" - 2 раза по 30 кинут три комнатной температуре. Далее объект помещается последовательно з растворы ацетона и спирта (смесь ), причем смесь i в пропорции 1 : 2 на 30 минут, смесь 2 в пропорции í : I на'ЗО аннут, шсъ 3 в пропорции 2 : i на 30 минут. Такое обезвоживание обеспечивает в • плотной ткани наикеньиее вымывание липидов.

Заливка.Для оптимальной пропитки.миокарда зпон - арзлдитой смолой изткани удалявт весь оставшийся ацетон» для чего объект на 3 минуты оставляют в вытяжном акафу. Далге кусочки мокарда поае-.¡аавт в смолу íes полимеризатора и оставляй- на 15ьшнут s терко-

стате при Т = 304, далее в схолу добавляет отвердитвль. Отверди-тель ЛИП - 30 из расчета на 10 ил смолы 13 капель отвердителя.Материал заливает в эту смолу и оставляет при Т=60 С на 18 часов. 2. Защитно - приспособительные реакции кардиоииоцитов Выяснение возможностей изменения в вувнри для человека направлении функциональных способностей различных систем организма животных с цель» повывения их продуктивности, изменения качества продукции и увеличения сроков использования является одной из основных задач биологической науки.

В настоящее время малоизученной проблеиой гизнедеательности животных, особенво сельскохозяйственных, в указанном аспекте яв- . ляется физиология сердца. Именно с этим органом и его структурно-функциональным состоянием связана все протекавшие в организме про-; цессы (Н.5реге1ак1з,1990). Основные усилия в изучении физиологии сердца направлены на исследования свойств миокарда на клеточном и субклеточном уровне, что требует применения комплексных физиологических, биохимических и электронно - микроскопических методов анализа для создания целостной картины работы сердца животных как в' корме, при парабиозе так и при различных стрессовых состояниях ор-

ГсКИЗМс.

Интенсивность функционирования миокарда зависит и от гормонального статуса организма. Изменение гормонального статуса,вполне вероятно, определяет интенсивность функционирования внутриклеточных протекназ, тек саныы активируя биохимические г-децим или облегчая развитие деструктивных явлений в ткани сердца CE.fi. Рязанова, 1530}.

2.1. Роль лизосом в иардиоыиоцитах миокарда Результаты исследований показали, что одной из мембранных структур, подверженных действию биологически активных веществ, в том числе и горконов, является лдзосомы. Роль лизосом в патогенезе миокарда остается мало изученной»

При ультраструктурном исследовании миокарда экспериментальных животных в контрольных группах и у кроликов, к у крас откеча-

ется нормальное строение миокарда, которое совпадает с исследованиями других авторов (Йе1пв1е1п Н.3.,1384 и др.). Отметим, что сохраняется пропорциональное отноиение типов лизосом у кроликов и 9 крыс, что отмечается в таблице 1 и таблице 2.

При ультраструктурном исследовании миокарда экспериментальных зевотных у групп кроликов и крыс, который вазавалл поврезде-

аиокарда путем введения изадрина отмечаются следувдие изменения. Вольная часть яардиошшцитоз обнардаиваатся а состоянии набухания. Сарколемма на всем протяжении остается двухконтурной, на отдельных участках формируя небольиие аркады и пальцеобразные выросты. Ядра увеличены в размерах, инезт округлую форму. Хроматин конденсируется по внутренней мембране кариолеммы, образуя различной величины зону высокой электронной плотности. Изменения саркоплазмы заключается в появлении различной степени отека я снижении количества электронно-плотных частиц. В сгркомерах зиднн участки деструкции в области I - дисков, а таг, же полосы лересокрачения, свидетельствуицие о неравномерном сокращении миофибрилл. В отдельных полях зрения обнаруаиваэтся.очаги гомогенизации, расплавления миофибрилл распространяющиеся на 2 - 3 саркомера. Нерйдко встречается фрагментация миофибрилл. Митохондрии набухзие, с отчетливой структурой двухконтурной мембраны. В некоторых митохондриях отмечается фрагментация крист, расэкрекяе их иеккембранных пространств, а так зе гоногенизация крист. В набухзих митохондриях аег-ду кристами обнаруживаются анастомозы, из-за чего нарушается рельеф поверхности органелл. Вр всех митохондриях уиеньаается количество крист. Часто я количество нятохокдрнй в кардиоииоцяте меняется (таблица 3 и таблица 4 ).

В саркоплазме поврежденных кардиоииоцитов возрастает количество лизосои. Вторичные лизссомн с гетерогенным содзр5«аым локализуются в местах гомогенизации сократительных пучков. Множество лизосом обнаруживается вблизи поврежденных митохондрий. Количественны* изменения типов лизосом в кардиомиоцитах кроликов и крас остается пропорциональным (таблица 3 и таблица 4).

у : Таблица 1 .

Лизосомы кардиохиоцйтов крыс (М)

~ ПЕРВИЧНЫЕ .ВТОРИЧНЫЕ . ; В с е г о

ПОКАЗАТЕЛИ с плотным содержимым с неплотным содержимым с плотным содержимым с неплотным содержимым

4 ? 2 .6 19

Кзадрйи 9 28 30 9 72

Трийодтиронин 9 13 ' 21 3 46

Трийодтиронин/ /

изадрнн 6 10 9 4 29

Инсулин 30 г . 12 3 , 7 54

Мнсрин/нзадин 6 _ 8 .2 ■14 30

^7.".--- •:}' .7-7.. ;-7;'7 Таблица 2 ,

- Лизосоынхзрдиоаяоцйтов кролика " !

;.;••■ : ПЕР5ИЧШ1Е . .ВТОРИЧНЫЕ в

ПОКАЗАТЕЛИ с плотным. с неплотным с,плотным с неплотным е

содерзиаым содержимым содержимым содержимым г 0

НорваСконтроль) 7 ; , 10 ■ .-"■'.'' 5 ■■;■' 9 31

Йэадрйн . 13 : 32 30 12 79

ТрйЙОйТИр(ШН* ¡(Т ) 18 12 33 7 60

Т / азадрин. ■■ 7 9 " 13 11 8 41

йнеулан : 41 18 ' . 4- V •9 72

Йксрин/нзадр ин • 12 21 . ; 7 - 8 '.:.':■ . 1? эа

- 13 -

. -. .:■•... . Таблица 3

Количества митохондрии в кардионаоцитах миокарда крыс в норме и при влиянии различных биологически активных веществ (п=10)

Количество

-спэдкяя

___.-1 ;-,ясцадъ 1 ЙЙТОХОНДРИИ ут^и .

| и.»п ;д а г- • — | | шггохондрий_ ? '[ и 1'^ОЙ' з/г * 1 ¡' . крйст а •' Ьптт • ■ . I ярйст в 1 I ....... |

НорнаСконтроль) 2? : 20 • .378. 0.14

Изадрин 18 7 123 '. 0.41

• Трийодтиронин з : 43 0.24

Трийодтиронин/

. изадрин 24 • 18 :.. 336 0.21: .

йнсрин • В 3 45 0.34

йнсулин/изадрин 24 13 336 0.21

* - э/г - электрокогранна

• Таблица

J

Количество митохондрии з кардиомиоцитах миокарда кролика в норме и при влиянии различннх биологически активных ващестз с п=б)

'■'"' - Количество средняя

Показатели Ш]ОВДДЬ 1

митохондрий. .крист в. крист в митохондрии

в 1-ой э/г * 1-ой 1-ой э/г мкн

НорааСконтроль) 34 14

йзадрин ' 26 9

Трийодтиронин. 1? 15 Трийодтиронин/

изадрин 30 22

йнсдлин 12 ; 7

Йнсрйй/изадрик 3? ; , И

№ 234 255.

66.0 84 .

407

0.1? 0.09 0.52

0.23 0.83 0,23

венные изменения типов лизосом в кардиомиоцитах кроликов и крыс остается пропорциональны« (таблица 3 и таблица 4).

В пластинчатом комплексе большинства исследованных .кардиомио-цитов отмечается гиперплазия пузырьков и цистерн. Изменения сарко-плазматического ретикулума заключается в резком расиирении канальцев, вплоть до образования крупных вакуолей.

В поврежденных кардиомиоцитах, согласно проведенным морфомет-рическим исследованиям, увеличивается количество лизосом по сравнение с контролем. Причем, первичных лизосом с плотным гомогенным содержимым становится больве в 2 раза, а с гетерогенным в 3,8 раза. Наряду с увеличением количества лизосом наблюдается понихение интенсивности их реакции ка протеолитическуи реакции ферментов,что свидетельствует о лабилизации лизосомальных мембран.

Подтверхдением этого предполохения является изменение отношения седиментируемой активности к неседиментируемой в сторону увеличения внелизосомальной (таблица 5 и таблица 6).

- . - . Таблица 5

Изменение активности кислой фосфатазы в миокарде крыс (К + м; п=1б)

МИОКАРД Неседиментируемая Седиментируемая

активность активность

Норма( контроль)*** 0,396 +

Изадрин*** 0,486 +

Трийодтиронйн*** 0,218 + Трийодтиронин/

изадрин* 0,387 +

Инсулин*** 0,241 + Инсулин/

изадрин**« 0,385 +

0,02а . 0,442 + 0,023

0,040 0,191 + 0,016

0,017 . 0,362 + 0,023

0,019 0.449 + 0,080

М19 0,632 + 0.020

0,021 0,437 + 0,01?

• -13 . ,- . Ч.

Таблица б

Изменение активности кислой фосфатазв з миокарде кроликов (И + м; п-10)

ЙИ0КЙРД Неседиментируемая Сегментируемая

активность активность

Норка?контроль)*** 0,652 4 0,013 0.743 + 0.027

Изадрин*** 0,607 + 0,025 '' 0,384 > 0,021

Трийодтиронин*** ' . 0,423 +0,021 0,561 + 0,011

Трийодтиронин/ ,

изадрин »** 0,613 + 0,024 • 0.802 + 0.022

Инсулин*** 0,329 + 0,017 0,318 + 0,025

Инсулин/изадрин*** ■' 0,631 + 0,018 "' 0,737 + 0,021

2.2. Елияние трииодтиронина на лизосональный аппарат

кардиомиоцитов миокарда Реализация регуляторного влияния тиреоидных гормонов на кле-точноне процессы происходит различными путями. Одним из внутриклеточных посредников иодтиронинов является цййФ, обладающая стабилизирующим действием на мембраны лизосом СВ.Б.Розен,1984). Вместе с тем трииодтиронин изменяет внутриклеточную концентрацию ионов Са (В.Г.Селивоненко,19?9), избыточное накопление которых проявляется в увеличении проницаености лизосомальных мембран (В.X.Василенко. 1989). Какой из этих процессов будет преобладать, судя по нааиа исследованиям, зависит от состояния миокарда. В изучении проблемы гормональной регуляции состояния миокарда при его парабиотичес-ком изменении особого внимания заслуживает исследование .иорфоф^нк-ции лизосом. При помощи электронно-микроскопических, биохимических и морфометрических методов исследования изучали миокард крыс и кроликов при некрозоподобннх изменениях индуцированных изадринои при предварительном гормональном воздействии.

„ Количественная характеристика дязосойадънаго аппарата кар-кардиомицитов (таблица 1 И таблица при некроЗоподобных изменениях миокарда в условиях гипертнреоза показивает, что происходит изменение лиэосокаяьиой йеябранв, биохиикческие анализы подтвер-вдавт этот факт (таблица 5 и таблица,6Д.- ОДнако; "надо: отметить, V-что компенсаторно-приспособительный процесс происходит.; гораздо эффективнее.в клетках, где при парабиозе отмечается влияние гор-, мона щитовидной зелези. Приникая во внимание степень гистохини- . ческой активности протеиназлизосон. обнардвеннне кзиеннения :мож-но рассматривать как результатпротектсрного /действия• трииодтмро-нина на миокард в условиях парабиотических изменений сердечной

мыецн. ■■ ■ ; ■ - л.-.1-. . • • •

2,3, Влияние инсулина на лизосомальный . . . .

- .»аппарат кардиониоцктов.

. Инсулин - гормон.регулирующий обменные процессы в организме животных и человека, Кновественность форм существования этого -гормона затрудняет изучение-механизма его действия, ;который зависит от молекулярного состояния рёцепторного участка мембран... Изменение проницаемости мембран под действием инсулина есть результат тиолдисильфидного взаимодействия.молекул инсулина с белкам; мгибрак. Эффект инсулина реализуется в митохондриях и микро-' сокальной фракции (Пезп.1980 5. Е зависимости от. дозы инсулин изменяет активность лизосональных. ферментов, -лредупрегдает аутолиг, аутофагив. Б сердечной ыыЕце гормон усиливает транспорт аминокислот, стинулирует синтез . и тормозит распад рибосом ($.£иНшап е1 а!.,1981). Резко изменяется активность катепсинов и других лизосональных ферментов. Добавление, в • перфузат инсулина замедляет распад белка и нормализует активность лизосональных протеиназ (Е.А.Рязанова,1990). . .

Качественные изменения в кардиомиоцитах показанные в нашей работе, при введении инсулина на Фоне . параоиотических изменений йиокарда, а так Ее количественные азкенения в митсхондриальнон и ,

лнзосокальясй аййара?а£ изучаемых кардиомиоцитов указывает на непосредственное влияние гормона гсодяйлддочной яелезн на функциональное состояние миокарда. Откечается протекторное дейстзиэ ин-■ сулина на ииокард ш?вотнгог в условиях позрегдения сердца.

Такин образок, на основании собственных исследований и при изцчвнш научной литератдрн становится очовиднзга. что регулятор-.«-..» »««шее биоявпгсгшг озтяваа:' гздзс'тз' га. сговогсы аротекаа-щга а вардяониоцктах происходи? - различиями путями Отдельные . эффекты действия гормонов происходят через посредство цйМФ, кота-рая обладает иембраностабилизирующим действием, тогда как изучаемые гормоны проявлятт иногда алабштазирувдее действие. Действие гормонов на мембраны зависит от монофункционального "состояния „ клетки. Звелйчвние количества лкзосоа. при введении гормонов указывает на активации зануояяркого аппарата, изменение соотношения количества- первичных и вторичных лнзосои относительно друг друга зависит от способности первичных лизосом к образованна вторичных, то ость отразает состояние лизосокальннх мембран. Количество лизосом в кардиомкоцнтах миокарда крас при введении нивотным трииодтиронина увеличивается в 2,Зраза, количества первичных лизосом« невысокой-электронной плотности превышает таковые с высокой электронной плотностьа,'что указывает на стабилизации лизосо-мальных мембран. Я кроликов в кардиомиоцитах подвераениый тиреотоксикозу общее количество первичных лизосом 'с плотным гомогенным содерзимым выше, чем- количество таковых с неплотным гомогенным содэряиннм» что отличается от состояния миокарда в норме. Повышение количества вторичных лизосом у обоих видов аивотных указывает на то» что мембрана лизосом сохраняет способность соединяться с пиноцитозными вакуолями При компенсаторно-приспособительных процессах- Сохранение этой важной функции мембраны лизосом позволяет выполнять вторичным лизосомам функции "чистильцика", чем приводит к дскорения процесса восстановления кардиомиоцита в цэлои.

Одновременно с изменениями в лизосомальной фракции кардио-миоцитов в митохондриальным компартменте так ае обнаруживаются некоторые изменения.Так при введении крысам трииодтиронина отме-. чается увеличение объема митохондрии в 2,7 раза, сильно понижается количество митохондрий, а так ге количество содерааиихся в них крисг.Дугообразная форма сохраниввихся крист позволяет говорить,что митохондрии синтезирувт ЙТФ полностьа в соответствии с потребностью.

3 кроликов объем митохондрии увеличивается в 3 раза, количество крист почти не изменяется. Форма крист извилиста, с частыми разрывами, что указывает на неспособность митохондрий в полной мере обеспечивать энергией клетку.

При сравнении данных электронно-микроскопического анализа с биохимическими результатами, полученными у животных той яе группы, трииодтиронин практически мало влияет на функциональные способности ьембранй самой лизосомы, несколько стабилизируя ее в условиях повреждения, Неседиментируемая активность по прежнему ос- гаегсй ниве свдиментируемой, хотя сумма этих. показателей меньше нормы, что указывает на понихение синтеза ферментов лизосом..

Изучая изменение активности тех яе протеолитических ферментов лизосон в условиях изменения инсулинового статуса в организме крис и кроликов удалось установить, что инсулин обладает способность» влиять на лизосомальные мембраны. Изменение структуры лизосомальной мембраны, когда лизосома теряет способность к присоединение с вакуолей и тем самым лишает клетку возмоаности нормального течения компенсаторно-приспособительного процесса однозначно ведет к негативнны последствиям для клетки. Однако при введении инсулина как* у крыс, так и у кроликов отмечается резкое увеличение первичных лизосон с гомогенным содераиным высокой электронной плотности на фоне умекьиения количества вторичных лизосом. Седи-иентируемал активность протеиназ выше, чем неседиментирдемая. Эти Факты дказывают, что при повыиении в организме количества инсулина •первично лнзосоин терявт способность к образовании вторичных, то есть происходит блокация мембраны,

Наряди с «тми в:*арйющ!вцит«игеотннхобоихвидов отмечается йозызеннаа деструкция митояондрнй, Нитохондрии с просветленным матриксом, гомогенизацией крис'т, разрывами наружной митохои-дриальиой мембраны. Количество митохондрий уыенынается. увеличивается средняя плочадь одной митохондрии, количество йрист 'сокращается в 3 - 4 раза. Митохондрии являотса энергетическими "депо" клетки» их деструкция ведет к нардвениям в. сократительном коипар-?менте »аряионпошггов'. /стенда и разрыхление в 2-дисках, что ведет" к нарушениям в сокращении киоцита.; ; ^ ' , •//.'-•

При различных"стрессовых'состояниях, которым подвёраен'ы в-особенности кролики, отмечается увеличение количества катехолами-но8, что в данном исследовании индуцируется введением изадрина. В нашем эксперименте выявлявтся возможности уменьвеи.ия воздейст- : вия стрессовых состояний"на жизнедеятельность животных. Всё подобные работы проводились с учетом лииь биохимических показателей изменений в организме. Нами впервые применен злектронио-микроско-пический анализ кардкомиоцитов с учетом изменений лизосомального, . аппарата. '•".-..'■'

При ультраструктурном исследовании миокарда животных в условиях катехоланининдуцированого воздействия в кардномиоцитая отмечаются все признаки парабиотических изменений. Количество лизоеом по сравнении с норной повышается "как у крыс, так я у кроликов. Увеличивается количество вторичных лизоеом, что указывает на нормализации процесса образования этих органелл. Первичные лизосомы-с содержимым низкой электронной, усиленный аутолиз вокруг тж указывай? нацеильную лабилизациа/ разрыхление лизосомальной мембраны.

При изадрининдуцированном парабиозе обьен большей части митохондрий у крыс увеличивается в 3 раза, у кроликов' в 4 раза» Крис-ты митохондрий крыс приобретав! дугообразная форма, 8,кроликов,они сильно разрыхлены. Отличие изменений структур крисг митохондрий'."■"■; у разных видов животных в условиях влияния биологически активных веществ указывает на различный способ'выхода организма из патологического состояния. Ддгообразныб ;крисгн-_ в условиях уменьшения их ;

обцего числа способны поддерживать энергетический баланс Нардио-миоцитов, тогда как у кроликов т же проблема решается путем сохранения возможно.большего количества крист в органелле.

При биохимических исследованиях отмечается, что в условиях изадрининдуцированннх изменений в кардномиоците неседиментируемая активность изучаемого фермента превышает седимвнтируемуи активность, что подтверждает способность изадрина к лабилизации лизо-сомальной мембраны.

Влияние некоторых гормонов, в частности инсулина и трииод-тиронина при катехоламкншщуцированных изменениях, давт положительные результаты. Количественные и ыорфофункциональные изменения митохондриального и лизосомального компартментов указнвавт, что компенсаторно-приспособительные реакции проходят в кардио-миоцитах в полной мере. Первичные лизосомы легко преобразуются во вторичные, кардиомиоцит содержит достаточное количество вторичных лизосом для реализации их функции.

Седиментируемая активность ферментов выше, чем неседиментируемая, соответственно мембрана лизосом в норме. При введении трииодтиронина. ломимо стабилизации лизосомальной мембраны отмечается понижение активности ферментов. Таким образом кардиомио-цит избегает аутолиза в условиях, когда лизосомальная мембрана не достигает нормы стабильного состояния.

При определении особенностей структурно-функциональных изменений лизосом и митохондрий кардиониоцитов кроликов я крыс возникавших в результате введения биологически активных веществ отмечается различие в аорфофункциональных ответах митохондриального аппарата. ' , •

Количественная характеристика лизосонального аппарата указывает. что в условиях нормы в кардиониоцитах крыс лизосом иеныае, чем у. кроликов, хотя размеры самих кардиомиоцитов у крыс больие. Введение одного и того же биологически активного вещества опытный группам крыс и кроликов вызывает пропорциональное друг другу изменение количества различных типов лизосон кардиомиоцитов.

...... ■ ' "■' - - 21 - " "

йзучая влияние инсулина и трииодтнронина на норфофункционзль-нне особенности ультраструктуры кардиоияоцитов нами были получены следувцие результаты: во-перэнх, влияние этих двух гормонов на ли-зосомальный аппарат кардиоыиоцитое ииеет различней механизм действия. Инсулин влияет непосредственно на лйзосомайьиуа мембрану. тэШ? 813 грииодтирйшш оказзвайт действие т снстэму синтеза м-»тт&шшх йротзийзз. Зо-зторых, влияние инсулина на лизосомаль-иуи аоабранй приводит к ее 'блокировании, нарушается система образования вторичных лнзосом* '

Изменение гормонального статуса у животных подверженных ка-техолаыининдуцированнону парабиозу оказывает положительное действие на ультраструктуру шокарда изучаемых животных. Протектор-•■■■'» ' .......

кос действие;инсулина и тркиодтхрокииа объясняется влиянием этих

гормонов на лизосокальнуэ неабрану кардиомиоцитоз.

БНБОДН

1. Оптимальная эксикация и фиксация ткани сердечной мыпцы, необходимые требования при получении препаратов для электронно-микроскопического исследования с сохраненной ультраструктурой органелл клетки достигается за счет изменения технология обработки исследуемого натериалаа саесьз ацетона и спирта в соотношении 1 : 3; 1 : 1; 3 : 1. '

2. Увеличение концентрации панкриатического гормона инсулина и гормона щитовидной железн трпиодтирокина б крови с'уцествзнно влияет на норфофункциональный статус кардиомиоцитов: з частности .на соотношение пе'рпичанх и вторичных лизосои, изменение проницаемости этих органелл.

3. Трииодтиронин в концентрациях 10 ед./кг веса зйвотного обладает протекторным действием при парабиотическоа изменении миокарда. '

4. Инсулин в концентрациях 0,3 ед./кг веса зйвотного обладает протекторный действием при катехоланининдуцированном пара- . биозе. .;

'-22- • .-Л----- - ; • ^.^^/ij;':%^^aв|»o¿ть-.JMЗO«o1»aIЬиoй мембраны кердиомиоцитов опре--делается уровнем инсддина. Гормон подяелудочной железы изменяет стрдетдрз мембраны, соотновение протеолитичоских органелл, про; цессн образования из них вторичных лизосом. Инсулин блокирует мвмбранц лизосом. :

6. Зровень трииодтиронина влияет на синтетические процесса даосомаяькнх ферментов. Трииодтнронян блокирует аутолитичеекйе процесс« изменяя активность лиэосоиалышк ферментов, ■

7. Митохондрии кардиошшитов животных с четнрбхкамеркнй; сердцем отлкчавтся по структурному располоаеннв крист. по ответным реакциям на введение биологически-активных веществ.Здвако изменение гормонального статуса при парабиотическок ссстожш приводит штохондрии в корму.

Практические рекомендации Разработанный способ обработки, миокарда для электронно-микроскопического исследования,, основанный на определении точного срока фиксации и эксикации ткани сердца, монет быть использован в научно-исследовательской работе и в клинической ветеринарной правтиве.Описанные ворфофуюадиональкые характеристика типов лвзосоа при действии различных4биологически активных ..веществ иагцт использоваться при тренинге животных,при выводе их из пара-биотического состояния, а такяе в учебном процессе при раскрытии значения лизосом в клетке миокарда.

тж пж ошлшвднш па теме

; . • - ДИССЕРТАЦИИ

-!. Строев Е.Й., бстраханцев Й.Ф., Нефедова С.б. Роль лизосом в патология кардяомиоцитов // Влияние охраны здоровья населения и состояния окружающей среды. - Рязань; 1995.- С.137-141,

2. йефедсза С.й. Влияние инсулина на лизосомальннй аппарат кардионйоцйтпв //-Социально - гигиенические и -Медицинские аспекты здоровья. -.Рязань, 1995. - С.99-103.

- - .. ... . --23 - ' ' ' *V

3. Захаров S.A.. Козлов A.C., Нефедова С.Й. Эашно-пркспо-сОбитеяьныв реакций кардиониоцитров миокарда кроликов и крнс при различном Физиологическом состоянии животных // Сборник научных работ и материалов Всероссийской научно-практическсй конференции.

- Рязань. 1996.-0.147-151.

4. Нефедова С.А.Модификация метода обработки материала для электронно-микроскопического исследования с учетом свойств миокарда // Сборник научных работ и материалов Всероссийской научно-практической конференции "Теоретическое наследие П.Й.Костычева и его развитие в .современном земледелии". -. Рязань, 1396.-С.144-143.

5. Захаров В,А., Нефедова С.А. О роли электронной микроскопии в изучении компенсаторно-приспособительных реакций организма //Материалы международного симпозиума по эмиссионной электронике; -Рязань. 1996.-С.213-217.