Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная организация миокарда при действии производного новокаина на фоне хронического стресса

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная организация миокарда при действии производного новокаина на фоне хронического стресса"

На правах рукописи

БРИТИК АНДРЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МИОКАРДА ПРИ ДЕЙСТВИИ ПРОИЗВОДНОГО НОВОКАИНА НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

з о СЕН 20Ю

Саранск-2010 г.

004610012

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова и на кафедре цитологии, гистологии и эмбриологии Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Кругляков Павел Павлович •

доктор би< ' хор Балашов Владимир

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич.

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Сернов Лев Николаевич

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова»

Защита диссертации состоится «16» октября 2010 г. в 12 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.117.01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» vyww.mrsu.ni: Е-таН:ё50Уе1@тг5и.ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева.

Автореферат разослан 2010 г.

Павлович

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Инчина В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время фармакологическое действие известных лекарственных средств и новых соединений оценивается преимущественно с функциональных позиций, в то время как не вызывает сомнения тесная взаимосвязь между функцией и морфологией органов-, тканей- и клеток-мишеней. Согласно современным требованиям по доклиническому и клиническому изучению новых фармакологических веществ, при исследовании специфической фармакологической активности применение морфологических методов офаничено довольно узкими рамками. В частности, кардиофармакология привлекает морфологические методы лишь для верификации антиишемической активности по определению размеров зон ишемии и некроза.

Стрессорное повреждение структур организма и их коррекция фармакологическими средствами, механизм действия которых опосредован наличием энергообеспечивающих, антиацидотических и противоишемических свойств, составляет важное направление современной медицины. В рамках изучения этой проблемы представляет интерес исследование влияния производных новокаина на ультраструктуру миокарда в условиях хронического стресса.

Выбор цели настоящей работы предопределен рядом положений. Во-первых, новокаин (прокаинамид) в отличие от лидокаина и тримекаина и сегодня остается препаратом выбора в кардиологической клинике (Кушаковский М.С., 2004). Более того некоторые исследователи пытаются продемонстрировать не только его положительные электрофизиологические свойства при патологии сердца, но и изучить влияние антиаритмика на ультраструктуру миокарда. В частности в исследовании Ршбш Ь.Н. е1 а1. (2008) было показано, что прокаинамид (новокаинамид) существенно облегчал нормализацию синусового ритма у больных, подвергнутых операции на аортальном клапане, и авторы предприняли попытку оценить влияние антиаритмика на ультраструктуру миокарда (по данным биопсии).

Во-вторых, учитывая данные литературы, что четвертичные производные лидокаина, тримекаина и других противоаритмических средств, превосходят свои структурные предшественники по противоаритмическим и противоишемическим : свойствам представляет интерес оценить морфофункциональные свойства миокарда левого желудочка лабораторных грызунов под влиянием четвертичного производного новокаина (ЛХТ-Н204), чему, и посвящена настоящая работа.

Цель работы - морфофункциональное исследование миокарда мышей в условиях коррекции Н-аллил-М-(2-оксиэтилкарбокси-4-аминофенил)-диэтиламина бромидом (лабораторный шифр ЛХТ-Н204) при стрессорном и ишемическом повреждении.

Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. оценить стресспротекторную и противоишемическую активность Ы-аллильного производного новокаина и его гемодинамическую безопасность;

2. изучить морфофункциональное состояние и ультраструктуру сократительных кардиомиоцитов и компонентов микроциркуляторного русла при стрессе и действии ЛХТ-Н204.

Научная новизна. Выявлены противоишемические свойства у производного новокаина ЛХТ-Н204 на модели адреналиновой интоксикации у мышей и при транзиторной ишемии у крыс. В опытак на кошках с экспериментальным инфарктом миокарда показана высокая гемодинамичеСкая безопасность исследуемого соединения.

ЛХТ-Н204 оказывает протекторное действие на эндотелиальные клетки сосудов, сохраняя их транспортную активность. Таким образом, обеспечивается своевременное удаление продуктов распада, появляющихся при повреждении кардиомиоцитов. Это, в свою очередь, создает условия для нормальной внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов и повышает их выживаемость.

Практическая ценность. Полученные данные дополняют знания об изменениях морфо-функионалыюй организации сократительных элементов миокарда и компонентов микроциркуляторного русла при развитии стресса и действии производных новокаина, а также являются материалом для обобщения представлений о зависимости между структурой и активностью, а так же структурой и токсичностью представителей этого класса химических веществ. Результаты работы являются основанием для продолжения комплексных морфо-физиологических и фармакологических доклинических исследований ЛХТ-Н204. Полученные результаты внедрены в научно-исследовательскую и учебную работу кафедр морфологии и фармакологии Мордовского госуниверситета.

Основные положения выносимые на защиту.

1. И-аллильное производное новокаина превосходит свой структурный предшественник по противоаритмической и противоишемической активности, не обладает негативным влиянием на системную и центральную гемодинамику.

2. ЛХТ-Н204 не оказывает существенных изменений ультраструктуры сократительных кардиомиоцитов и компонентов микроциркуляторного русла, вызванных иммобилизационным стрессом.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, докладывались на: VI Всероссийский съезд анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов 2009); Бабухинские чтения (Орёл 20072008); Международная научная конференция (Иваново, 2009); Междунароодный экологический форум «Экология большого города» (Санкт-Петербург, 2009)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, две из которых - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав с результатами собственных исследований, заключения и выводов. Работа

изложена на 114 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 35 рисунками и 11 таблицами. Библиографический список содержит 83 отечественные работы и 44 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовали противоишемическое действие N-аллильного производного новокаина. Вещество было синтезировано во Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ Б AB, Старая Купавна, Московская область) и любезно предоставленно нам профессором С.Я. Скачиловой.

Ы-аллил-Н-(2-оксиэтилкарбокси-4-аминофенил)-диэтил амина бромид (лабораторный шифр ЛХТ-Н204). Белый кристаллический порошок нерастворимый в воде, легко растворимый в этаноле и хлороформе. Молекулярная масса субстанции 357. Перед работой готовили спиртовой матричный раствор субстанции. Его хранили в темноте на холоду. Из матричного раствора путем разведения получали водно-спиртовые рабочие растворы. Рабочие растворы являлись неустойчивыми, поэтому готовились ех tempore перед каждым опытом. Структура исследуемого соединения представлена на рис. 2.1.

Препаратами сравнения в зависимости от задач исследования служили: 1) производные лидокаина с соответствующими радикалами при четвертичном атоме азота; 2) новокаин, новокаинамид, а также: 3) некоторые средства патогенетической терапии при каждом виде экспериментальной патологии. 1) М-аллил-Н(2,6-диметилфениламинокарбонилметил) бромид (J1XT-13-02). Его противоаритмическая активность подробно изучена Букаевым О.Н. (2005) и Блиновым Д.С. (2006).

Ы-аллил-Т\1(2,6-диметилфениламинокарбонилметил) морфолиний

бромид (ЛХТ-12-02). Активность этого вещества исследована Лазутенковой Е.А. (2006) и Блиновой Е.В. (2007). Субстанции, синтезированы в ВНЦ БАВ.

Представляют собой белые кристаллические порошки белого цвета легко растворимые в воде и в спирте. Их структурные формулы приведены на рис. 2.2.

/=\ + /°2Н5

Н2Ы—^ ъ— со— ин— сн2— сн2— ы—сн2—сн — сн2 ^^ С2н5

/=\ + /СА

Н2М у—с°—° —СН2—сн2—N—сн2—сн—сн2 Б.

Рис. 2.1. Структуры Ы-аллильных производных новокаина (А) и новокаинамида (Б).

СН

/

СН=СН

2

/' 3 Н,С

^Н СО СН2 ^д^у® Вг

сн3

А. 3

СНЭ

/=( / 2 5 МН2—СН—СООН

4 /)—1ЧН—СО —СН,—N |

чсн СН2—СН2—соон

сн3

Б.

Рис. 2.2. Структуры препаратов сравнения - четвертичных производных лидокаина: А - ЛХТ-12-02; Б - ЛХТ-13-02.

2) Новокаин и новокаинамид использовали в работе как структурные предшественники исследуемых веществ. Применяли официнальный 10% раствор новокаинамида в ампулах по 5 мл и официнальный 1% раствор

новокаина в ампулах по 5 мл. 3) на модели хлоридкальциевой интоксикации мышей в качестве препарата сравнения использовали верапамил (изоптин). Применяли официнальную жидкую лекарственную форму в виде 0,25% раствора в ампулах по 2 мл "Knoll", Германия. 4) При оценке безопасности исследуемых соединений их активность сравнивали с активностью лидокаина гидрохлорида. Применяли 2% раствор в ампулах по 2 мл "ICN-полифарм", Россия.

Исследуемые соединения и препараты сравнения испытывались в эквитоксических дозах. Исследования выполнены на 1082 нелинейных белых мышах (18-23 г) и 132 беспородных кошках (2-3,5 кг). Все болезненные процедуры, в обязательном порядке, проводили под общей анестезией. В качестве средства для наркоза использовали тиопентал- натрий (50 мг/кг, внутрибрюшинно).

Острая токсичность производных новокаина и новокаииамида изучена на белых мышах при внутрибрюшинном и перорольном путях введения. Каждое соединение вводили группе животных, состоящей из 6-10 мышей, весом по 18-20 г. Показатель острой токсичности (LD30) вычисляли графически по методу Миллера и Тейнтера (Беленький M.JI., 1963).

Острые коронарогенные нарушения ритма сердечной деятельности моделировали на беспородных кошках обоего пола массой 1800-4500 г (Сторожук В.Г., 1985; Manning et al., 1986). Животным, находящимся под общей анестезией в условиях искусственной вентиляции легких, проводили левостороннюю торакоперикардитомию в 4-м межреберье. осуществляли инфузию гепарина 100 МЕ/кг. Лигировали верхнюю треть нисходящей ветви левой коронарной артерии. Концы лигатуры пропускали через полиэтиленовую трубку с фиксатором, позволяющим осуществлять последующую реперфузию коронарной артерии. Острая коронарная окклюзия (ОКА) достигалась подтягиванием концов лигатуры (продолжительность 30 мин), а реперфузия — их ослаблением (период наблюдения 15 мин). О нарушении коронарного кровотока и ритма сердечной деятельности судили по ЭКГ, которую регистрировали во II

стандартном отведении на протяжении опыта при помощи осциллоскопа ОСИ-01 (Россия). Запись фрагментов ЭКГ осуществляли через каждые 5 минут на электрокардиографе ЭК6Т-02 (Россия).

Антиаритмическую активность оценивали по частоте развития нарушений ритма сердца, характеру аритмий - ЖЭ, ЖТ, ФЖ - латентному периоду возникновения ишемических аритмий, частоте эктопической активности.

Смешанные - предсердно-желудочковые - аритмии воспроизводили по методу, описанному Н.В. Кавериной и соавт. в 1981 г (Фисенко В.П. (ред.), 2000). Нарушения сердечного ритма моделировали у наркотизированных уретаном (внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг) нелинейных белых лабораторных мышей весом 18-20 г. В качестве аритмогенного фактора использовали аконитин (аконитина нитрат, субстанция, «Sigma», Германия), вводимый в хвостовую вену в дозе 50 мкг/кг через 5 минут после внутривенной инъекции изучаемых соединений в растворе объемом не более 0,1 мл. Изучали профилактическое действие исследуемых соединений.

Аритмию вызывали путем внутривенного введения хлористого кальция в дозе 250 мг/кг белым мышам, наркотизированным внутрибрюшинной инъекцией тиопентал-натрия (50 мг/кг) методом В.В. Горбуновой В.В., Горбунова Н.П. (1983). Исследуемые соединения и препараты сравнения вводили внутривенно за 1 минуту до введения аритмогенного фактора. Инъекция хлористого кальция у животных контрольной группы в большинстве случаев вызывала развитие летальной фибрилляции желудочков. Запись ЭКГ проводили во II стандартном отведении.

Для оценки безопасности исследуемых соединений при длительном применении, использовали метод, предложенный ранее В.П. Балашовым и соавт. (2002). Принцип метода основан на оценке смертности белых мышей, подвергнутых действию пролонгированного иммобилизационного стресса. В этом случае, в отличие от классических методик, вещества воздействуют не

на интактные ткани животных, а на ткани и органы с характерными для стресса патологическими изменениями.

Для электронно-микроскопического исследования брели фрагменты стенки левого желудочка сердца мышей. Кусочки ткани фиксировали в смеси глутарового альдегида и параформа на ОД М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 4-12 часов при 4° С. После промывания в 0,15 М фосфатном буфере (рН 7,2) (пять смен по 30 минут при 4° С) проводили постфиксацик) в 2% растворе осмиевой кислолгы в течение 3 часов при 4° С.

Для обезвоживания кусочки постепенно проводили через батарею спиртов возрастающей концентрации до абсолютного этанола (50°, 70°, 96°, - 1 смена по 30 минут при 4° С и 100° - 3 смены по 30 минут при 18°С). Затем применяли 2 смены окиси пропилена при 18°С. Перед заливкой проводили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в соотношении 1:1. Затем кусочки помещали в чистую заливочную смесь на 30 минут при 60°С. Заливку материала осуществляли в смесь эпоксидных смол ЭПОН-АРАЛДИТ (Mollenchauer Н., 1964) с последующей полимеризацией в течение 2-х суток при 60°С.

Ультратонкие срезы (50-80 нм) получали на микротоме Ultracut (Япония), монтировали их на сетки и бленды и контрастировали уранил ацетатом (5% раствор в метиловом спирте) и цитратом свинца (Reynolds E.S., 1963, Venable J., Coggeshal R., 1965). Препараты изучали в электронный микроскоп ЭМ-125 (Россия) при ускоряющем напряжении 75 «В. Статистическую обработку результатов исследования проводили методами "%2" и t-критерия Сгьюдента при 5% уровне значимости (Беленький М.Л., 1963; Закс Л., 1976). В работе использовали персональный компьютер Pentium - 200 ММХ.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

К противоаритмическим препаратам как к классу лекарственных средств предъявляется ряд требований, среди которых особое внимание уделяется соотношению эффективности и безопасности препаратов. Таким

образом, широта терапевтического действия является важнейшей их характеристикой, и, к сожалению, у большинства антиаритмиков она весьма невысока. Противоаритмические средства применяются при аритмиях различного генеза, однако наиболее часто они показаны при коррекции аритмий, осложняющих ишемическую болезнь сердца (ИБС), в том числе, острый инфаркт миокарда (Кушаковский М.С., 2004). К сожалению, в последние годы к обычным недостаткам антиаритмической терапии, связанным с развитием кардиальных и экстракардиальных побочных эффектов присоединилась другая более значимая проблема. Оказалось, что некоторые антиаритмики, относящиеся к I классу (блокаторы быстрого натриевого тока) при длительных сроках лечения способны увеличивать смертность больных с ИБС (CAST I, 1989; CAST II, 1992; Тео К.К. et. al., 1993).

В связи с этим задача поиска соединений, обладающих высокой противоаритмической активностью и большой широтой терапевтического действия сохраняет свою актуальность. Исследования, проведенные ранее в Мордовском государственном университете свидетельствуют о перспективности модификации молекул местных анестетиков и антиаритмиков путем кватернизации атома азота, входящего в их структуры. При этом, варьируя размер, состав, предельность радикала при четвертичном атоме азота можно получить соединения с разнообразными токсикологическими и противоаритмическими свойствами. Как показал анализ в рядах производных тримекаина, аймалина и лидокаииа одной из наиболее удачных модификаций является присоединение к четвертичному азоту аллильного радикала. Поскольку четвертичные дериваты новокаина являются малоизученными, оценке указанных аспектов токсикологии и фармакологии его N-аллильного производного посвящена данная работа.

На первом этапе нашего исследования мы изучили острую токсичность четвертичного аммониевого производного новокаина (JIXT-H204) в опытах на белых мышах, выполненных нами в сотрудничестве с кандидатом медицинских наук К.С. Моськиным (2008). При парентеральном -внутрибрюшинном - пути введения показатель LD50 составил 64,0 мг/кг. Это позволило нам определить дозу JIXT-H204 для дальнейшего

фармакологического и гистологического исследования. Руководствуясь общепринятым положением, что высшая экспериментальная терапевтическая доза составляет 5% от 1Л)50, в дальнейших исследованиях мы применяли ЛХТ-Н204 в дозе 3,2 мг/кг.

Согласно полученным данным новокаин и его ближайшие структурные аналоги новокаинамид и лидокаин (данные взяты из работы Моськина К.С., 2009) относятся к классу "малотоксичных веществ", а их четвертичные дериваты, в том числе Ы-аллильное производное новокаина - ЛХТ-Н204 принадлежат к классу "умеренно токсичных" веществ (Сидоров К.К., 1973). Наглядное представление о токсикологии испытуемых соединений можно получить при анализе данных, представленных на рисунке 6.1. Примером антиаритмического средства, относящегося к классу умеренно токсичных веществ является представитель четвертого класса - верапамил.

На следующем этапе работы мы исследовали, обладает ли тестируемое производное новокаина противоишемическими свойствами. Для ответа на данный вопрос мы оценили влияние вещества на размеры зоны некроза и ишемии при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс в ранние сроки после лигирования коронарной артерии. Для решения этой задачи использовали дифференциальный индикаторный метод, предложенный группой авторов под руководством профессора Сернова Л.Н. (1989).

мг/кг

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

ц

1_|||

и

ш

0,- --„ .—р

новокаин новокаинамил

Рис. 6.1. Значения 1Л)5о производного новокаина и препаратов сравнения при внутрибрюшинном пути введения белым мышам.

Для обсуждения полученных нами результатов (Рис. 6.2) мы позволили себе привлечь материалы, полученные ранее на кафедре гистологии Мордовского государственного университета и в лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств ВНЦ БАВ (г. Старая Купавна) при исследовании противоишемических свойств пропранолола и мексидола.

Препараты сравнения пропранолол и мексидол эффективно ограничивают альтеративные процессы в миокарде при моделировании экспериментального инфаркта. Выраженность противоишемического эффекта обоих препаратов примерно равнозначна, хотя по своему качественному и количественному выражению мексидол несколько превосходит (на уровне тенденции) бета-адреноблокатор - пропранолол -одно из эталонных противоишемических средств. 1Ч-аллильное производное новокаина (ЛХТ-Н204) заметно уступает препаратам сравнения в способности ограничивать размеры зоны некроза, однако, положительный эффект вещества проявляется в уменьшении отношения величины этой зоны к зоне ишемии, что свидетельствует о его безопасности и высокой перспективности исследования, например в качестве противоаритмического средства.

контроль пропранолол мекседал ЛХТ-Н204

13 зона ишемии Озона некроза Я зона некроза£зона ишемии

Рисунок 6.2. Влияние ЛХТ-Н204 и препаратов сравнения на размеры зон некроза, ишемии и их отношение в опытах на крысах через 4 часа после перевязки коронарной артерии.

Важные данные о противоишемической активности ЛХТ-Н204 в рамках исследования его противоаритмического профиля можно получить при тестировании эффективности вещества на модели катехоламиновых микронекрозов миокарда у мелких лабораторных грызунов. Данный раздел работы был нами выполнен в опытах на белых мышах. Влияние ЛХТ-Н204 и пропранолола на продолжительность жизни подопытных мышей приведено на рисунке 6.3.

Ы-аллильное производное новокаина (ЛХТ-Н204) проявило дозозависимое действие в условиях данной экспериментальной патологии. В первой серии опытов вещество вводили в дозе 1,6 мг/кг, что соответствует величине 2,5% от ЬО50. В этой дозе вещество не проявляло противоаритмических свойств, не оказывало заметного положительного дромотропного эффекта, но уменьшало число мышей, погибших за первые 10 минут наблюдения. Продолжительность жизни подопытных животных была заметно выше (32±3,0 мин) чем аналогичный показатель у мышей, получавших терапию препаратом сравнения.

Рис. 6.3. Влияние ЛХТ-Н204 и пропранолола в различных дозах на продолжительность жизни мышей при интоксикации адреналина гидрохлоридом.

При увеличении дозы ЛХТ-Н204 в два раза (5,0% от ЛД50) мы наблюдали статистически достоверное снижение числа животных с эктопическими желудочковыми комплексами (3 против 14 в контроле) и с

блокадами проведения (7 против 14 в контроле). Выживаемость животных при этом была весьма значительной при максимальном значении продолжительности жизни (37±8 мин).

Важнейшим этапом доклинического исследования потенциальных сердечно-сосудистых средств является изучение их кардиогемодинамических эффектов. Ранее (Моськин К.С., 2009) было показано, что производное новокаина не обладает кардиодепрессивным действием в опытах на здоровых кошках. Гемодинамическая характеристика вещества в условиях острой ишемии миокарда была не полной, поскольку были получены данные лишь о динамике инотропной функции левого желудочка и величины среднего динамического артериального давления. В связи с этим, мы поставили перед собой задачу в опытах на кошках с экспериментальным инфарктом миокарда оценить влияние ЛХТ-Н204 на такие показатели центральной и системной кардиогемодинамики как: частота сердечных сокращений (ЧСС), ударный объем крови (У О), минутный объем кровотока (МОК), общее периферическое сопротивление сосудов (ОПСС) и уровень артериального давления (АД), что позволит получить более полную характеристику исследуемого вещества и составить надежные представления о его безопасности. Полученные результаты приведены на рисунке 6.4.

Проведенные эксперименты позволяют констатировать, что в условиях ишемического повреждения миокарда левого желудочка кошек ЛХТ-Н204 в дозе 3,2 мг/кг, с одной стороны, не усугубляло кардиодепрессивного эффекта ишемии, а, с другой стороны, не оказывало и достоверного коррегирующего воздействия на ишемически опосредованные расстройства гемодинамики. В то же время, мы можем отметить тенденцию к стабилизации уровня артериального давления в конце периода наблюдения. Кроме того, для эффекта ЛХТ-Н204 характерен рост тонуса периферического сосудистого ложа, (хотя изменения не носили статистически достоверного характера), что свидетельствует об ангиотоническом эффекте производного новокаина.

120 100

-НАСТШ1АХЕЕДЕНН ЫХ СОКРАЩЕНИИ_____

аехешалшоелшдеыие-

-МИНУТНЬЩ-ОБЪЕМ КРОВОТОКА

ОБЩЕЕ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЕ СОПРОТИВЛЕНИЕ СОСУДОВ

~ контроль —ЛХТ-Н204

Рисунок 6.4. Изменение параметров гемодинамики в условиях экспериментального инфаркта миокарда у кошек и после введения ЛХТ-Н204 в дозе 3,2 мг/кг.

Таким образом, проведенные эксперименты позволили выявить определенные противоишемические свойства у производного новокаина с лабораторным шифром ЛХТ-Н204. Ранее в Мордовском государственном университете (Моськин К.С., 2009) было показано, что это вещество проявляет противоаритмические свойства на модели острых окклюзионных и реперфузионных аритмий у кошек и на модели аконитиновых аритмий у мышей, при этом, механизм антиаритмической активности у вещества, по-видимому, определяется уменьшением крутизны нарастания переднего фронта потенциала действия.

Учитывая высокую вероятность принадлежности J1XT-H204 к первому классу противоаритмических средств и учитывая, что препараты данной группы повышают смертность кардиологических больных представляло интерес оценить влияние вещества на смертность белых мышей в условиях хронического иммобилизационного стресса (Балашов В.П. и соавт., 2002). Ранее группой авторов была показана показана высокая корелляция между влиянием антиаритмиков с различным механизмом действия на летальность подопытных животных и их влиянием на смертность кардиологических больных по данным различных зарубежных рандомизированных исследований.

Кроме того, в работах Бирлюковой Д.В. (2002) и Шуваловой E.H. (2003) было показано, что миокард животных является весьма чувствительным к негативному действию противоаритмических средств. В связи с чем исследование ультраструктуры миокарда может явиться высоко информативным для анализа безопасности потенциальных антиаритмиков и предопределяет ее актуальность на доклиническом этапе.

В контрольной серии опытов в условиях иммобилизационного стресса погибало 30% подопытных животных. Длительное введение лидокаина вызывало увеличение смертности мышей до 52,5% (р<0,05), тогда как N-аллильное производное новокаина проявляло лишь статистически недостоверную тенденцию к изменению летальности среди мышей, подвергнутых хроническому стрессу.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о достаточной безопасности производного новокаина, тогда как в отношении лидокаина следует высказать самые тревожные опасения. Следует отметить, что клиницисты уже описывали его негативное влияние на исход лечения больных с острым инфарктом миокарда (Вудли М., Уэллан А., 1995).

Для углубленной оценки безопасности и возможной стресс-протекторной эффективности вещества мы изучили ультраструктурную картину миокарда левого желудочка при введении JIXT-H204 на фоне

хронического иммобилизационного стресса. Такая модель выбрана в связи с тем, что рядом авторов (Меерсон Ф.З., 1984; Павлович Е.Р., 2001) показана однотипность повреждений миокарда при стрессе и ишемии.

60 50 40 30 20 10 0

□контроль Вновокаин ПЛХТ-Н204

Рис. 7.24. Влияние новокаина и его И-аллильного производного на летальность мышей при иммобилизационном стрессе.

При изучении ультраструктуры миокарда животных, подвергавшихся длительному иммобилизационному стрессу, мы наблюдали повреждения как мембранных, так и не мембранных структур кардиомиоцитов. Ряд исследователей считают первичным развитие деструктивных изменений мембранных органелл. (Пшенникова М.Г., 2001, Бирлюкова Д.В., 2002). Другие же, склонны считать ведущим фактором повреждение сократительного аппарата клетки. (Непомнящих Л.М., 1998).

Нами отмечено появление целого ряда изменений в структуре кардиомиоцитов. Среди них: изменения формы ядер и формирование крупных ядрышек, набухание митохондрий и расширение канальцев саркоплазматической сети, увеличение межклеточного пространства в области нексусов. Мы считаем, что это проявление адаптивной реакции клеток миокарда на стрессорную нагрузку. Наше мнение согласуется с предположениями других авторов. Так изменение формы ядер кардиомиоцитов может расцениваться как следствие усиления

функциональной активности клеток. (Форбс М.С., Сперелакис Н., 1990) Однако, складчатость ядерной оболочки может быть объяснена образованием контрактур миофибрилл в клетках. (Непомнящих J1.M., 1998).

Причиной появления в кардиомиоцитах участков пересокращения миофибрилл вероятно является повышение концентрации Са2+ в цитозоле. Показано, что при развитии стресс реакции происходит не только увеличение содержания Са2+ в гиагтоплазме, но и снижение запасов АТФ, что отражается на эффективности работы Ca - АТФ-азы. (Меерсон Ф.З., 1984)

Образование контрактур в клетке может стать причиной наблюдавшихся и нами и другими исследователями (Шувалова E.H., 2003, Кулькова Н.П., 2007) «аркадоподобных» складок оболочки кардиомиоцитов. В то же время Серов В.В. и Пауков B.C. (1975) считают подобные изменения результатом усиления функциональной активности клетки. По нашим данным образование подобных складок, хотя бы отчасти, является следствием развития внутриклеточного отека.

Среди кардиомиоцитов имевших изменения тонкого строения после иммобилизационного стресса в части клеток мы и ряд других авторов (Подсеваткин В.Г. 2000; Шувалова E.H., 2003; Кулькова Н.П., 2007) отмечали разрушение миофибрилл, мембран крист митохондрий, сарколеммы и, как следствие, образование обширных зон внутриклеточного отека. Перестройки такого рода следует считать деструктивными. С большой долей вероятности мы можем предположить, что их появление приведет к некрозу клетки.

Разрушение внутриклеточных мембран и плазмолеммы вероятно. обусловлено усилением перекисного окисления липидов (ПОЛ) при стресс -реакциях (Меерсон Ф.З., 1993; Зорькина A.B., 1997). Повреждение плазмолеммы и базальной мембраны клетки однозначно приводит к развитию клеточного отека. В нашем исследовании, как и в работах других авторов (Шувалова E.H., 2003; Кулькова Н.П., 2007) зоны внутриклеточного отека обычно локализовались в субсарколеммальных и торцевых участках кардиомиоцитов. Изменение формы клетки, вызванное развитием отека,

часто приводит к нарушениям структуры межклеточных контактов в области вставочных дисков. Повреждение коннексонов нексусов вызывает разрушение функционального синцития миокарда, что выражается в нарушениях его электрической стабильности и развитии аритмий. (Форбс М.С., Сперелакис Н., 1990)

Наряду с развитием участков внутриклеточного отека в миокарде животных подвергшихся стрессовой нагрузке появлялись и зоны интерстициального отека. При стресс - реакциях появляются изменения ультраструктуры не только кардиомиоцитов, но и эндотелиоцитов мелких сосудов. Часть клеток эндотелия сосудов выглядела электронноплотной и содержала мало пиноцитозных везикул, в других эндотелиоцитах отмечали высокое содержание эндоцитозных пузырьков. Во многих капиллярах эндотелиоциты образовывали микроворсинки, выступающие в просвет сосуда. Подобные изменения описываются и другими авторами (Шувалова E.H., 2003; Кулькова Н.П., 2007). Изменения ультраструктуры стенки капилляров трактуются или как следствия усиления функциональной активности (Красных И.Г. и др., 1984) или как нарушением их иннервации (Павлович Е.Р., 2001). При анализе данных, полученных нами, представляются справедливыми обе гипотезы. Сосуды стенка которых образована «темными» электронноплотными клетками, вероятно, имеют нарушения иннервации. Капилляры, содержащие эндотелиоциты с большим количеством эндоцитозных везикул и микроворсинками в просвете, вероятно являются активно функционирующими.

Таким образом, возможно, часть микрососудов при развитии стресс — реакций снижает интенсивность транспортных процессов, что может приводить к появлению интерстициального отека. С другой стороны, так как часть капилляров продолжает интенсивно функционировать, появляется зональность в развитии интерстициального отека. В свою очередь, это обусловливает разную степень ишемии и гипоксии и, соответственно,

полиморфность ультраструктуры кардиомиоцитов разных участков миокарда.

Итак в кардиомиоцитах животных, подвергавшихся иммобилизационному стрессу, развивается ряд перестроек ультраструктуры, описанных выше. Подобные изменения наблюдали ранее и другие авторы (Бирлюкова Д.В., 2002; Шувалова E.H., 2003; Кулькова Н.П., 2007). Однако, по нашим данным, в большей части клеток, строение которых отличается.от типичного, изменения ультраструктуры носят адаптивный характер и являются обратимыми. Только незначительная доля кардиомиоцитов характеризуется наличием необратимых деструктивных изменений. Такой вывод согласуется и с данными по выживаемости животных подвергавшихся длительной стрессорной нагрузке.

При введении ЛХТ-Н204 животным, подвергавшимся иммобилизационному стрессу наблюдалась достаточно полиморфная ультрамикроскопическая картина. В разных участках миокарда, а часто и в соседних клетках отмечали как небольшие адаптивные перестройки ультраструктуры, так и значительные деструктивные изменения тонкого строения кардиомиоцитов. Это позволяет говорить о неоднозначности действия исследуемого вещества на сердечную мышцу.

При сравнении контрольных животных и получавших терапию ЛХТ-Н204 следует отметить заметное уменьшение величины и количества зон интерстициапыюго отека. При этом почти во всех наблюдавшихся капиллярах ультраструктура эндотелиоцитов была близка к норме и, хотя в большей части сосудов эндотелиоциты имели микроворсинки, эндоцитозная активность эндотелия была не высока. Вероятно, ЛХТ-Н204 оказывает протекторное действие на эндотелиальные клетки сосудов, сохраняя их транспортную активность. Таким образом, обеспечивается своевременное удаление продуктов распада, появляющихся при повреждении кардиомиоцитов. Это, в свою очередь, создает условия для нормальной внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов и повышает их

выживаемость. Данные об эффективном снижении соотношения зон некроза и ишемии, полученные нами, подтверждают эту гипотезу.

В пользу - этого предположения косвенно свидетельствует и наблюдавшееся нами уменьшение степени перестроек ультраструктуры кардиомиоцитов, а также увеличение доли адаптивных и снижение величены деструктивных изменений. Нормальная работа сосудов и уменьшение количества разрушающихся митохондрий способствуют поддержанию запасов АТФ, что подтверждается сохранением гликогена в цитоплазме кардиомиоцитов животных этой группы. Кроме того, уменьшение степени внутриклеточного отека кардиомиоцитов также наблюдавшееся нами, вероятно, обусловлено устойчивостью и лучшей сохранностью межклеточных контактов в области вставочных дисков. Возможно, с этим связана показанная ранее (Моськин К.С., 2009) антиаритмическая активность ЛХТ-Н204.

О цитопротекторном действии изучаемого вещества может свидетельствовать и отсутствие погибающих сердечных мышечных клеток. Непомнящих Л.М. и др. (1989) показали, что на фоне стрессорной нагрузки наблюдается апоптоз кардиомиоцитов. В наших исследованиях кардиомиоциты с признаками апоптоза отсутствовали.

ВЫВОДЫ

1. Хронический иммобилизационный стресс оказывает повреждающее действие на мышечную ткань сердца. Степень повреждения разных участков миокарда значительно варьирует.

2. Действие стресса приводит к повреждению энергетического, сократительного аппаратов кардиомиоцита, а также оболочки клетки, что сопровождается развитием внутриклеточного отека. Под действием стресса образуется также интерстициальный отек.

3. Введение ЛХТ-Н204 животным, подвергшимся действию хронического стресса, оказывало стресс протекторное действие на

кардиомиоциты. Оно выражается как в уменьшении количества поврежденных клеток, так и в снижении степени их деструкции.

4. Применение ЛХТ-Н204 приводит к улучшению сохранности стенки микрососудов интерстициальной ткани миокарда и к уменьшению величины интерстициального отека.

5. ЛХТ-Н204 оказывает умеренное противоишемическое действие, что проявляется уменьшением отношения размеров зоны некроза к зоне ишемии, а также увеличением времени жизни мышей при адреналиновой интоксикации.

6. ЛХТ-Н204 не оказывает отрицательного инотропного, батмотропного и дромотропного эффектов, не снижает уровень среднего динамического артериального давления, а также не повышает периферическое сопротивление сосудов в течение часа после внутривенного введения кошкам с экспериментальным инфарктом миокарда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении лекций, проведении практических занятий и написании методических рекомендаций по соответствующим разделам морфологии и фармакологии в медицинских ВУЗах.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Герасимова Н.Г. Сравнительный анализ морфофункциональных изменений миокарда при адаптации к иммобилизационному стрессу / Герасимова Н.Г., Бритик A.B., Акимова И.С., Давыдов И.Ю., Балашов В.П., Кругляков П.П. // Морфология. 2008. Т. 133. № 4. С. 75-76.

2. Бритик A.B. Влияние N-алпильного производного новокаина на ультраструктуру сократительных кардиомиоцитов белых мышей при стрессе. / Бритик A.B., Абрамов В.Н., Балашов В.П., Акимова И.С.,

Давыдов И.Ю., Кругляков П.П. // Современные наукоемкие технологии.

2009. № 3. С. 49-50.

3. Бритик A.B. Изучение возможностей модулирования адаптационных процессов в миокарде при действии повреждающих факторов / Бритик A.A., Балашов В.П., Подрезов М.А., Герасимова Н.Г., Акимова И.С., Белова Л.А., Давыдов И.Ю., Кругляков П.П. // Материалы международной научной конференции. Иваново. 2009. С. 83-86.

4. Бритик A.B. Морфофункциональная характеристика миокарда при экспериментальной патологии и терапии. / Бритик A.B., Балашов В.П., Блинов Д.С., Ванькова Л.В., Блинова Е.В., Белова Л.Л., Ямашкина JI.A., Гончарова А.Ю., Кругляков П.П. // Морфологические ведомости.

2010. № 1. С. 18-21.

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. печ. л. 1,48. Уч.-изд. л. 1,83. Тираж 100 экз. Заказ № 64.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт» 430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21. тел. (8342) 48-25-33