Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические механизмы устойчивости Plasmodium berghei к хлорохину и пути ее преодоления

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы устойчивости Plasmodium berghei к хлорохину и пути ее преодоления"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

\

МАЙЕР Татьяна Васильевна

УДК 577.151.042152.199.2:576.809.55893.19: 675.751' .

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ - УСТОЙЧИВОСТИ , РЬАБМОШиМ БЕКОНЕ! К ХЛОРОХИНУ И ПУТИ ЕЕ ПРЕОДОЛЕНИЯ

Биохимия - 03.00.04

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института цитологии и генетики Сибирского отделения АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - член-корреспондент АН СССР,

профессор Р.И.Салганик

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Д.м.н. Т.А.Короленко,

к.б.н. И.Н.Леонова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: НИИ эпидемиологии и инфекционных болезней Ш УССР

Защита состоится У!!_ 1991 г. на

заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР по адресу:

630090,'Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии СО АН СССР.

" № "_ЛУ.

Автореферат разослан " Ы-'Т "_л/ 1991 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО СОВЕТА К 003.52.01

кандидат химических наук О.С.Федоров;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Малярия в последние десятилетия стала, вновь одним из самых распространенных в мире заболеваний и служит причиной инвалидизации миллионов людей и высокой смертности. Одним из препятствий в борьбе с малярией является широкое распространение устойчивых к лекарствам, и в первую очередь к хлорохину, штаммов Plasmodium falciparum. Поскольку природа хлорохинрезистектности. плазмодия остается неясной, изучение биохимических механизмов устойчивости малярийного паразита к хлорохину и поиск путей ее преодоления являются весьма важными задачами.

Ранее было выдвинуто предположение о том, что устойчивость малярийного паразита к хлорохину и, возможно, к другим лекарственным средствам связана с повышением у плазмодия активности ферментной системы монооксигеназ, метаболизирующей ксенобиотики (Salganik, 1982 ), а хлорохин служит фактором отбора резистентных к нему мутантных форм плазмодия с высокой активностью монооксигеназ .

Микросомные монооксигеназы (МО) локализованы в клетках эукариот в эндоплазмагическом ретикулуме и представляют собой систему ферментов с цитохромом Р-450 в качестве центрального звена. Эта ферментная система включает ряд изоформ, обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует окисление большого числа эндогенных и экзогенных субстратов гидрофобной природы.. В результате реакций ферментного окисления, катализируемых этой системой, повышается полярность субстратов, что способствует выведению их из клеток и организма, а в ряде случаев лишает их биологической активности.

Если мутации, ведущие к повышении активности микросомных МО плазмодия, могут обеспечить инактивацию и ускоренное выведение хлорохина из клеток малярийного паразита и таким путем -развитие устойчивости возбудителя к этому лекарству, то представлялось вероятным, что использование ингибиторов МО может вернуть плазмодию чувствительность к хлорохину и, возможно, другим лекарствам.

Целью работы являлось выявление системы МО у малярийного паразита грызунов Plasmodium berghei, изучение ее роли в обес-

печении хлорохину ст ойчивосги плазмодия, а также поиск ингибиторов МО как перспективных средств преодоления лекарственной устойчивости плазмодия.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые показано наличие ферментативной цитохром Р-450 - зависимой системы МО у малярийного паразита. В клетках Plasmodium berghei были обнаружены такие МО, как арилгидрокарбонгидроксилаза (AIT) и аминопи-рин n-деметилаза (and). В микросомах, выделенных из клеток малярийного паразита грызунов, показано наличие цитохрома Р-420 (конвертированной формы цитохрома Р-4 50) и НАДФН-цитохром с-редуктазы.

Показано, что хлорохин метаболизируется как плазмодием, так и микросомами печени мышей.

Установлена зависимость между хлорохинустойчивостью у Plasmodium berghei и высокой активностью ферментативной системы МО у него: у штаммов малярийного паразита, устойчивых к хлоро-хину, активности МО (АГГ и and) значительно выше, чем у штамма, чувствительного к хлорохину.

Выявлены перспективные ингибиторы МО плазмодия in vitro, наиболее эффективными из которых оказались медь-лизиновый комплекс, Си(Лиз )2, обладающий супероксиддисмутазной активностью, и фенилгидразин. Исследованные ингибиторы тормозили также систему МО печени мышей in vitro и in vivo, что создает условия для пролонгирования действия хлорохина в организме хозяина.

В опытах на мышах, зараженных устойчивыми к хлорохину штаммами Plasmodium berghei, продемонстрировано, что ингибитор МО - Си(Лиз)2 - существенно повышает лечебную эффективность хлорохина, резко снижая паразитемию у мышей, зараженных штаммом плазмодия с высокой индуцированной устойчивостью к хлорохину.

Таким образом, в результате проведенного исследования впервые показано, что высокая активность МО плазмодия может служить причиной резистентности плазмодия к этому антималярийному препарату, а ингибиторы МО могут рассматриваться в качестве перспективных средств преодоления хлорохинрезистентности плазмодия в тех случаях, когда она обусловлена высокой активностью системы МО у него.

Публикация и апробация работы. Результаты диссертации опубликованы в 14 печатных работах.. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции "Цитохром р—450, структура и функции" (1982, Минск), на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (1985, Москва), на XI Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы эпидемиологии, клиники, лечения и профилактики тропических заболеваний" (1984, Москва ), на V Всесоюзном биохимическом съезде (1986, Киев), на межинститутском совещании СО АН СССР и СО АМН СССР (Новосибирск, 1986 ), на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" ( Новосибирск, 1987 ), на IV Всесоюзном съезде протозоологов (Ленинград, 1987 ).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 страницах, включая 12 рисунков, 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы и 4-х глав, в которых описаны методы и материалы исследования, изложены результаты экспериментов, обсуждение полученных результатов и выводы. Библиография включает 206 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выявление ферментной системы МО в клетках малярийного паразита грызунов Plasmodium berghei.

В основу настоящего исследования положено предположение о. том, что причиной хлорохинустойчивости малярийного паразита является высокая активность ферментной системы МО у него, обеспечивающая инактивацию и выведение из клеток возбудителя хлорохина.

Цитохром Р-450 - содержащая система МО обнаружена в клетках различных тканей и органов животных, высших и низших растений, у микроорганизмов (Головенко, Карасева, 1983 ). Малярийный паразит представляет собой одноклеточный эукариотический орга- . низм, который обладает биохимическими и морфологическими структурами, необходимыми для синтеза и функционирования системы !.'■ О. Однако в литературе нет данных, которые свидетельствова- . ли бы о наличии у плазмодия цитохром Р-450 - содержащей систе-. мы МО. Важно было выяснить, имеется ли в принципе у плазмодия система МО, метаболизирующая ксенобиотики. Проведенные нами

злектронномикроскопические исследования клеток Plasmodium berghei, находящихся на различных стадиях внутриэритроцитарного развития, показали наличие в них хорошо развитого эндоплазмати-ческого ретикулума. В мембранах этой внутриклеточной структуры у эукариот обычно располагается ферментная система монооксиге-наз (Арчаков, 1975 ).

Опыты по определению активности АГГ - одного из ферментов системы МО в лизатах форменных элементов крови мышей, зараженных Plasmodium berghei (штамм Н), показали, что плазмодий способен метаболизировать чужеродные субстраты (табл. 1 ).

Таблица 1

Активность АГГ в лизированных эритроцитах мышей при заражении их Plasmodium berghei на 5-й и 8-й дни инфекции

Активность АГГ (пикомоль Н^-З-оксибенз пирена/мг белка ) (а)

Интактные мыши 26 ± 26

Зараженные шши, 5-й день 26 ±19 (п = 5 )

Зараженные мыши, 8-й день 170 * 30

з

Действительно, гидроксилирование Н -бенз (а )пирена, одного из субстратов АГГ, наблюдается только в лизатах содержавших плазмодия эритроцитов мышей, взятых в опыт на 8-й день заражения, при сильно развившейся па разит емии 90 55). Напротив, в аналогичных пробах, полученных из эритроцитов интактних мышей и мышей, зараженных Р1азшоа1ит ЬегдЬеа, взятых в опит на 5-й день развития инфекции, когда паразиты в крови еще малочисленны (- 3-5 %) активность АГГ в литазах эритроцитов но регистриру ется .

Известно, что метирапон является специфическим конкурентным ингибитором окисления многих субстратов в цитохром Р-450 содержащей системе МО. Торможение активности АГГ в лизате пора жешшх эритроцитов, содержащем, в основном, плазмодий, с п<^ мощью метирапона (рис. 1) подтверждает, что гидроксилирование

субстрата этого фермента, Н3-бенз (а )пирена, осуществляется системой МО.

Активность ЛГГ (%)

Рис. 1. Действие метирапона на активность АГГ P.berghei: а - сапониновый лизат эритроцитов, пораженных P.berghei (без метирапона ); б - в инкубационную среду добавлен ю-4 м метирапон; в - в инкубационную сроду добав-

—з

лен ю м метирапон;

п = 4.

а б в

Известно, что малярийная инфекция у человека и животных ведет к анемии и сопровождается лейкоцитозом и ретикулоцитозом. Для того, чтобы вяснить, не связана ли наблюдаемая нами при заражении Plasmodium berghei активность АГГ в лизате крови мышей с примесью лейкоцитов и ретикулоцитов в гемолизате, били проведены специальные опыты. В четырех отдельных экспериментах осуществляли предварительную очистку крови от лейкоцитов на колонке с целлюлозой. Судя по результатам микроскопического контроля, такая очистка приводила к полному удалению лейкоцитов из крови, однако, это никак не влияло на активность АГГ. Опиты с искусственно вызванным у мышей ретикулоцитозом также свидетельствуют о том, что активность АГГ в гемолизатах не относится к примеси ретикулоцитов: мы не наблюдали окисления бонз(а )пирсна в ретпкулоцитарных лизатах-образцах, выделенных стандартным способом из крови мышей с 90 % ретикулоцитозом.

Гаки.! образом, изложенные выше экспериментальные данные говорят о том. что регистрируемое в лизатах эритроцитов, пораженных Plasmodium berghei, гидроксилированиие бенз(а )пирона осуществляется ферментной системой МО, принадлежащей собственно

100

50

Л,

X

Рис. 2. Спектральные характеристики микросом,выделенных из Р.ЬегдЬех:

Д

(опт.ед.) 0.01

420

400

а - пропущена СО в микро-сомную суспензию в опытной кювете; б - добавлен Ма23204 к микросомной суспензии в опытной кювете; в - добавлен Ыа2$204 и пропущена СО в опытной кювете, в контрольную кювету добавлен Ма2Э204; г - нулевая линия. Концентрация сомного белка мг/мл.

микро- 0.48

1-г.:)

а

плазмодию.

С целью выявления у плазмодия таких основных компонентов микросомной системы. метаболизма, как цитохром Р-4 50 и НАДФН-цитохрсм с редукгаза, из клеток• малярийного паразита грызунов были выделены микросомы - изолированная с помощью дифференциального центрифугирования субклеточная, фракция, содержащая эн-доплазматический ретикулум плазмодия. -

Были сняты спектральные характеристики (рис..2 ) выделенных микросом Plasroodiura berghei по . методу Омура и Сато (Omura, Sato, 1964 ).

При спектральном исследовании микросом Plasmodium berghei нам не удалось выявить максимум поглощения комплекса восстановленного цитохрома. Р-450 с окисью углерода в области 450 нм, характерный для активной формы фермента. Однако обнаруживался максимум поглощения в области 420 нм, присущий конвертированной форме цитохрома Р-450 (рис. 2в ). Видимо, это связано с процедурой выделения микросом Plasmodiura berghei, которое требует достаточно жестких условий для лизиса клеток, плазмодия - интенсивного встряхивания в гипотонической среде или замораживания-оттаивания. Возможно также, что инактивация цитохрома Р-450 происходит при процедуре снятия спектра микросом, например, при восстановлении микросомной суспензии Ма-дитиоиитом. Многочисленные литературные! данные указывают на легкость, с которой цитохром Р-4 50 переходит в свою каталитически неактивную форму - цитохром Р-4 20 при неблагоприятных химических и физических воздействиях (Yamano, Iehikawa, 1978 ).

Однако известно, что в области 420 нм в тех же условиях поглощают и другие гемопротоады, которые могут присутствовать в мнкроеомах в качестве примесей (оксигемоглобин и метгемогло-бин>, и, следовательно, могут вносить вклад в максимум поглощения. наблюдаешП в области 420 нм (Matsubara ct al., 1974 ). В микросомах плазмодия оксигемоглобин и мстгемоглобнн не были обнаружены (рис. 2а, б ). Это видно из того, что при продувании в опытную кювету с микросомной суспензией только окиси углерода не било обнаружено максимума поглощения в области 420 им (рис. 2а ), характерного для комплекса оке »гемоглобина с СО. При добавлении к мнкросомам восстанавливающего агента Na2s9o

отсутствовал максимум поглощения в области 430 нм, присущий восстановленной форме мет гемоглобина (рис. 26). Полученные данные позволяют считать, что максимум поглощения в области 420 нм (рис.. 2в ) обусловлен конвертированной формой цитохрома Р-450, а не иными гемопротеидами.

По расчетам, цитохром Р-420 присутствует в микросомах плазмодия в концентрации 0,15 нмоль/мг белка, которая на порядок ниже концентрации цитохромзР-450в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени животных, но сравнима с количеством этого гемопро-теида в других мембранных структурах этих клеток (аппарат Голь-джи, мембраны ядер, лизосом, пероксисом) (Ichikawa, Mason, 1973 ) И в клетках других тканей (Головенко и соавт., 1984; Matsubara et al., 1974 ) и организмов (Sauer et al., 1982 ).

Мы обнаружили также в микросомах Plasmodium berghei активность такого компонента МО, как НАДФН-цитохром с-редуктаза, величина которой составила 32,7 нмоль цитохрома с/мин/мг белка (примерно 30 % от величЛш активности НАДФН-цитохром с-редуктазы в микросомах печени крыс).

, Вышеизложенные результаты позволяют сделать вывод о том, что малярийный паразит обладает ферментной системой микросомных МО и-способен к_метаболизму чужеродных субстратов.

2. Исследование метаболизма хлорохина ферментной системой МО микросом печени мышей и плазмодием.

По своей структуре хлорохин может служить субстратом для микросомных МО. Хлорохин:

сн

я

Представлялось существенным выяснить, метаболизируется ли хло-рохин микросомной системой МО и какие продукты при этом образуются. С этой целью инкубировали хлорохин с микросомами печени мышей, где наличие цитохром Р-450-содержащей системы МО является хорошо установленным фактом. При этом наблюдали образование в инкубационной смеси ацетальдегида. Это указывает на то, что хлорохин подвергается ы-дезалкнлированию в системе микросомных МО.

Хлорохин - Н3 инкубировали с микросомами печени мышей и с плазмодием (лизатом пораженных плазмодием эритроцитов ) и разделяли полученную с помощью экстракции смесь хлорохина и его метаболитов методом тонкослойной жидкостной хроматографии (МсСЬезпеу еЪ а1., 1967 ). Было установлено, что в результате инкубации происходит образование, по крайней мере, двух метаболитов хлорохина (рис. 3 ), один из которых в обоих случаях одинаков и является, вероятно, судя по хроматографическим характеристикам, монодеззтилхлорохином. Второй метаболит в случае инкубации хлорохина с плазмодием является, предположительно, ок-сихлорохином, а в случае инкубации с микрооомами печени природу второго метаболита не удалось идентифицировать. Можно предположить, что этот продукт, с отличающейся от веек других производных хлорохина флуоресценцией, возникает в результате окисления хлорохина по кольцу. В количественном отношении метаболизм хлорохина плазмодием (определяемый в лизате пораженных им эритроцитов ) в расчете на белок на порядок ниже, чем в микросомах печени мышей.

Рис . 3. Метаболизм хЛорохина'Р.Ье'гдЬе1'

А

(%)

0,3

0.2

0.1

Т

На рисунке показан .прирост-(Д ) содержания , метаболитов хлорохина после инкубации его с лизатом эритроцитов, зараженных Р.ЬегдЬех мышеи ( в % от общего количества Н^-хлорохина и его метабо- . литов, выявленных с помощью ТСХ).' ., , ,

* результаты отличаются от контроля (лизат эритроцитов интактних мышей) с Р > 0.95; п = 6.

Такое же соотношение наблюдалось■и-при определении активностей фермеотной. системы МОСАГГ и АШ).в микросомных-препаратах печени мышей, и у .плазмодия.. Представляется, вероятным, что метаболизм хлорохина плазмодием ведетг;к утрате хлорохйном ого антималярийного действия. Известно; чтоьмоно--"И' бидезотильные производные хлорохина обладают значительно меньшей антималярийной активностью, чем сам хлорохин, особенно в отношении хлорохии-устойчивых штаммов плазмодия (Айегоипти, Р1ескег^ел.п, 1983 ), а повышенная полярность метаболитов может обеспечить ускоренное выведение их из клеток плазмодия.

3. Исследование активности монооксигеназ у штаммов Р1аБто<Ииш ЬегдЬед., отличающихся по чувствительности к хлорохину.

В связи с предположением о том, что развитие устойчивости к хлорохину у малярийного паразита может обеспечиваться активностью МО у него, следующим этапом нашего исследования явилось сравнение монооксигеназной активности у штаммов Р1а$шоа.1иш Ьегдве! с различной чувствительностью к хлорохину. Для исследо-

вания были взяты три штамма Plasmodium berghet: l) штамм ' Нечувствительный к хлорохину; 2 ) штамм lnk-65 со спонтанно сниженной в 2-3 раза чувствительностью к хлорохину; -3). химиоре-зистентный штамм ХР, селекционированный на устойчивость к хло~-рохпну; этот штамм в 7-10 раз менее чувствителен к хлорохину, чем нормальный -штамм Н. Определяли активность АГГ и AND; (двух' монооксигеназ, которые могут принимать участие в метаболизме антималярийных препаратов хинолинового ряда ) в лизатах пораженных эритроцитов, содержащих плазмодий. Проведенное сравнение показало, что активность АГГ и AND в расчете на общий белок клеточного гомогената выше у штаммов Plasmodium berghei, устойчивых к хлорохину.' Для АГТ была выявлена корреляция между величиной ферментативной активности и степенью чувствительности к хлорохину: у штамма Plasmodium berghei lnk-65 с более низкой степенью устойчивости к лекарству активность АГГ была меньше, чем у штамма ХР, високорезистентного к хлорохину.

Било определено содержание ДНК в лизатах пораженных эритроцитов, отражающее степень развития паразитемий различных штаммов плазмодия ' в крови. Хлорохинрезистентные штаммы Plasmodium berghei размножаются менее интенсивно из-за тропизма к ретикулоцитам, что выражается в более низком содержании ДНК в гемолизате. При пересчете величин активностей монооксигеназ, полученных на мг белка, на мкг ДНК (т.е. фактически на плазмодий }, разница между штаммами по активностям МО была еще более значительной (табл.2).

Таблица 2

Активность АГГ и AND в расчете па ДНК в штаммах. Plasmodium ' berghei, чувствительных и устойчивых к хлорохину

Штаммы Р.berghei активность А1Т Активность and

пмоль Н3-3-окси-бенз (а )пирена/ . мкг ДНК _ ' . ■ - . % пмоль формальдегида/мкг Д){К ' %

н 2 3.4 ± 1.8 \ 100 : 0.126 ± 0:056- 100

lnk-6 5 • 42,1 ± а. 7 ' 180±22 -

ХР 77.5 ± 8.5 331+33 0.604 ± 0 j 088 480 ± 70

п = 5 ' . п = 5

Таким образом, была продемонстрирована связь между хлоро-хинустойчивостью P.berghei и повышенной активностью МО у него.

В связи с этими данными представлялось вероятным, что с помощью ингибиторов МО можно подавить активность МО плазмодия и таким образом преодолеть хлорохинрезистентнссть у него.

4. Ингибиторы МО как перспективные средства преодоления хлорохинрезистентности малярийного паразита.

Был предпринят поиск эффективных ингибиторов монооксигеназ плазмодия с целью использования их как средств преодоления резистентности малярийного паразита к лекарствам. Было изучено влияние на активность АГГ микросом печени мышей и АГГ плазмодия ряда веществ, в отношении которых известно, что они различными способами взаимодействуют с цитохромом Р-450 и ингибируют некоторые монооксигеназы. Это стероиды - вещество s (17 а-оксидезоксикортикостерон ) и его ацетат (21-ацетат 17а-оксидезоксикортикостерона ) Шеделькина исоавт., 1974 ), RBr (4-бромметил-2,2,5,5,-тетраметил-3~имидазолин-3-оксид-1-оксил ) (popova et al., 1982 ), хлорамфеникол (Halpert, Neal, 1980 ), фенилгидразин (Muakkassah, Yang, 1981 ) и медь-лизиновый комплекс Си (Лиз >2 (LyaJchovich et al., 1979 ). Данные о действии исследуемых веществ на активность АГГ микросом печени мышей и P.berghei представлены в таблице 3.

Таблица 3

Торможение активности АГГ микросом печени мышей

и P.berghei ингибиторами монооксигеназ

Исследуемые Соотношение концентрации ингибитора и субстрата в инкубационной среде [I]:[S1 Активность АГГ

соединения микросом печени мышей (в 7о от контроля ) а P.berghei (В У OT контроля) 6

Вещество S 1:1 85.6 ± 0.4 124.0i25.0

Ацетат вещества S 1:1 79.0 i 2.6 9 3.0+22.0

RBr 1:1 73.4 i 5.2 72 . 3±2.2

Хлорамфеникол 4:1 66.8 i 4.0 68.2i6.5

Фенилгидразин 0.25:1 3.0 i 3.0 0.3î0.3

Си (Лиз )2 1:1 5.7 ± 4.1 -

0.1:1 - 0

а - Активность АГГ микросом печени в контрольной 'пробе (без ингибитора ) составляла

881.0+151.6 пмоль Н3-3-оксибенз (а )пирена на мг белка (принята за юо %).

6 - Активность АГГ, определяемая в плазмодиях сапонинового лиза-та эритроцитов зараженных мышей (без ингибитора ), составляла 130.9 + 23.0 пмоль Н3-з-оксибенз (а )пирена/мг белка (принята за 100 % ).

Как видно из таблицы 3, наиболее эффективными ингибиторами АГГ как в микросомах печени мышей, так и в гомогенате плазмодия оказались Си (Лиз )2 и фенилгидразин.

Для того, чтобы оценить способность ингибиторов тормозить монооксигеназы in vivo, в целом организме, а также возможность пролонгировать действие хлорохина в организме хозяина были проведены специальные опыты. В качестве испытуемых веществ были выбраны Си(Лиз)2 и фенилгидразин как наиболее эффективные ингибиторы и хлорамфеникол - антибиотик, широко используемый в медицине. Ингибиторы вводили мышам внутрибрюшинно, и в микросомах печени, выделенных через 1/2 часа и 24 часа после введения, определяли активность АГГ и and (табл. 4). .

Таблица 4

Ингибитор Торможение активности Торможение активности

АГГ (%) AND {%)

1/2 час 24 час 1/2 час 24 час

Хлорамфеникол,

130 мг/кг 38.7+7.2 10.7 актив. 0 15.0 актив.

Фенилгидразин, 50 мг/кг 32.0+2.9 25.0+0.8 21.0+2.7 6.0+0.7

си (Лизин )2,

20'мг/кг 52.0+5.1 37.0+4.0 21.0+5.2 0

п = 4 ' п = 4

Проведенные эксперименты показали, что ис'следованные соединения являются ингибиторами монооксигеназ как плазмодия, так и микросом печени позвоночного хозяина. Вряд ли можно рассчитывать

на обнаружение ингибиторов, избирательно подавляющих эту ферментную систему только в клетках плазмодия. Это совпадение ингиби-торных эффектов имеет определенные достоинства и недостатки. Достоинство его состоит в том, что торможение микросомных ферментов печени будет замедлять метаболизм и выведение хлорохина из организма и дольше поддерживать высокую концентрацию лекарства в организме. С другой стороны, на фоне торможения печеночных монооксигеназ такими ингибиторами потребуется большая осторожность в применении хлорохина и других лекарств, поскольку в этих условиях могут возрасти их токсические эффекты.

Полученные данные позволили предположить, что ингибиторы монооксигеназ будут эффективны при использовании их в качестве средств преодоления хлорохинустойчивости малярийного паразита. Были поставлены специальные опыты на зараженных мышах для изучения действия хлорохина в сочетании с ингибиторами МО на хлоро-хинрезистентные штаммы Р.ЬегдИеа. Оказалось, что, действительно, одновременное введение хлорохина с Си(Лиз)2 резко снижает пара-зитеммо в крови зараженных мышей штаммом Р.Ьегдйе! хр ьык с высокой индуцированной устойчивостью к хлорохину (рис. 4 ), тогда как применение одного хлорохина было совершенно неэффективно. Заметно снижалось количество паразитов в крови мышей, зараженных ХР 1лк штаммом Р.Ьегдйе! и при использовании феиилгидразина в сочетании с хлорохином. Неэффективность совместного применения хлорамфеникола и хлорохина объясняется, видимо, гораздо более слабым ингибирующим влиянием хлорамфеникола на монооксигеназы по сравнению с Си(Лиз )2 и фенилгидразином. Отдельно примененные ингибиторы не приводили к снижению паразитемии у зараженных животных, т.е. сами по себе ингибиторы МО противомалярийным эффектом не обладают.

При лечении у мышей малярийной инфекции, вызванной ьык штаммом р.ЬсгдИе! со спонтанно сниженной чувствительностью к хлорохину, применение сочетания хлорохина с Си(Лиз)2 также заметно снижало уровень паразитемии в крови зараженных животных, но в меньшей степени,' чем в случае штамма хр ьшс. Фсинлгидрозш! и хлорамфеникол таюка усиливали действие хлорохина при лечении малярии, вызванной штаммом ьяк-65 - эффект от совместного ввило ния выбранной дозы хлорохина и ингибитора приближался к эффекту.

Рис. 4. Действие сочетанного применения ингибиторов МО и хлорохика на инфекцию у мышей, вызванную высокорезистентным к хлорохину штаммом ХР ьшс Р.ЬегдЪе!

¥

-Lvgg. iL-(средний балл

парази- 5 темии)

0 1 2 3 4 5

дни после заражения

а - контроль (заражение ), б - хлорохин (175 мг/кг), в - хлорохин (350 мг/кг),

г - хлорохин (175 мг/кг) + хлорамфеникол- (130 мг/кг), д - хлорохин (175 мг/кг) + фенилгидразин (50 мг/кг ), е - хлорохин (175 мг/кг) + Си (Лиз )2 (20 мг/кг), ж - заражение мышей, з - введение препаратов,

л - число паразитов в условном мазке (12 5 полей зрения в световом микроскопе при увеличении в 900 раз ).

I

который оказывала на инфекцию удвоенная доза хлорохина. В случае чувствительного штамма ингибиторы МО не влияли на антималяриГшоо действие хлорохина.

Полученные данные подтверждают исходное предположение о том, что ингибиторы МО могут восстанавливать эффективность этого самого распространенного средства лечения малярии. Нельзя исключить, что дополнительным фактором, который способствует повышению эффективности хлорохина, является торможение микросомных МО печени животных под действием ингибиторов, что может обеспечить поддержание более высокой концентрации хлорохина в крови и более длительную циркуляцию его в организме. Это обстоятельство может служить, вероятно, дополнительной, но не главной причиной эффективности применения ингибиторов совместно с хлорохином, поскольку повышение дозы хлорохина в случае отдельного его применения в 2 раза не приводит к заметному увеличению его противомалярийного эффекта по отношению к штаммам хр ьык и ьык-65 (рис. 4).

Полученные в работе данные позволяют рассчитывать на то, что предложенный подход к преодолению резистентности малярийного паразита к хлорохину может привести к созданию эффективных препаратов - синэргистов хлорохина.

Представляется вероятным, что ферменты, метаболизирующне чужеродные вещества, могут быть ответственны за развитие резистентности к ряду лекарственных средств не только у малярийного паразита, но и у иных возбудителей заболеваний, которые в результате селекции приобрели лекарственную резистентность. В этом случае ингибиторы различных ферментов могут стать эффективными средствами преодоления лекарственной резистентности.

ВЫВОДЫ:

1. У малярийного паразита грызунов показано наличие ферментативных актив^стей системы микросомных монооксигеназ (МО), катализирующих окисление чужеродных веществ:

а 1 в клетках Р.ЬегдГюа обнаружены арилгидрокарбонгидрокси-лазь (АГГ) и аминопирин л-дшлетилаза (мго);

б ) из клеток плаэмодпя выделены микросомы, в которых показано наличие цитохрома Р-420 (конвертированной формы цитохрот

Р-450 ) и НАДФН-цитохром с-редуктазной активности.

2. Выявлена корреляция между высокой активностью МО плазмодия и его устойчивостью к хлорохину: у штаммов P.berghei, резистентных к хлорохину, активности АГГ и and в несколько раз выше, чем у чувствительного к хлорохину штамма плазмодия.

3. Показано, что хлорохин метаболизируется в микросомной фракции печени мышей и в клетках плазмодия, предположительно, с образованием продуктов, обладающих пониженной антималярийной активностью.

4. Продемонстрировано, что ингибиторы МО могут служить средствами преодоления хлорохинрезистентности плазмодия, в тех случаях, когда она обусловлена высокой активностью МО у него:

а ) исследована способность ряда ингибиторов МО печени животных тормозить in vitro активность МО возбудителя малярии; в качестве наиболее эффективных выявлены фенилгидразин и медь-лпзнновый комплекс;

б ) в экспериментах на зараженных мышах установлено, что ингибиторы МО значительно повышают лечебную эффективность хлоро-хнна в отношении штаммов плазмодия, устойчивых к этому противомалярийному препарату.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Панкова Т.Г., Игонина Т.М., Чехонадски?с Т.В., Салганик Р.И., Рабинович O.A., Максаковская Е.В. Повышенная активность микросомальных монооксигеназ хлорохинрезистентных штаммов малярийного плазмодия как вероятная причина лекарственной устойчивости //Вопросы медицинской химии. - 1983. - Т.29, м 5. - С.63 65.

2. Панкова Т.Г., Чсхопадскнх Т.В., Игонина Т.М., Захарова О.Д., Салганик Р.И. Ингибиторы микросомальных монооксигеназ как перспективные средства преодоления лекарственной устойчивости у малярийного паразита //Вопросы медицинской химии. - 1985. -

Т.31, № 6. - С.15-18.

3. Захарова О.Д., Чсхопадскнх Т.В., Комарова H.H., Панкова Т.1'.. Салганик Р.П. Исследование метаболизма хлорохшга в моно

оксигенной системе микросом печени мышей //Вопросы медицинской химии. - 1986. - Т.32, № 6. - С.55-57.

. 4. Чехонадских Т.В., Полякова Н.Е., Панкова Т.Г., Салга-ник Р.И. Выявление системы микросомальных монооксигеназ у малярийного паразита грызунов Plasmodium berghei //Биохимия. - 1987.

- Т.52, J6 3. - С.381-386.

5. Рабинович С.А., Куликовская И.М., Максаковская Е.В., Чехонадских Г.В., Панкова Т.Г., Салганик Р.И. Подавление устойчивости к хлорохину у Plasmodium berghei с помощью ингибитора микросомальных монооксигеназ //Мед. паразитол. и паразитарные болезни. - 1986. - № 4. - С.7-9.

6. Salganik R.I., Pankova T.G., Chekhonadskikh T.V., Igonina T.M. Chloroquine resistance of Plasmodium berghei: boichemical basis and means for overcoming //Bull. Who. - 1987.

- Vol. 65, N 3. - P.381-386.

7. Rabinovich S.A., Kulikovskaya I.M., Maksakovskaya E.V., Chekhonadskikh T.V, , Pankova T.G., Salganik R.I., Suppression of chloroquine-resistance of malarial parasite by treatment of infected mice with an inhibitor of microsomal monooxygenases //Bull. WHO. - 1987. - Vol. 65, N 3. - P.387-3S9.