Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Блокаторы транспорта ионов Са2+ как реверсанты лекарственной устойчивости малярийных паразитов

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Блокаторы транспорта ионов Са2+ как реверсанты лекарственной устойчивости малярийных паразитов"

Р Г Б ОД

1 й Р"-

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СЙИИТЙРНО - ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ И ТРОПИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ икени Е.И.Марциновского

На правах рукописи

Б У X Т И Н БОРИС АЛЕКСАНДРОВИЧ

БЛОКАТОРН ТРАНСПОРТА ИОНОВ Са*\ КАК РЕБЕРСАНТИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МАЛЯРИЙНЫХ ПАРАЗИТОВ

03.90.19 - Паразитология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандита медицинских наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена б Институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Карииновского Госкоысанзпиднадзора России.

С

Научные руководители: доктор медицинских наук В.С.Орлов кандидат медицинских наук С.А.Рабинович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Озерецковская доктор медицинских наук, профессор Е.Н.Падейская

Ведуцая организация: Военно - медицинская академия им.С.Н.

. Кироза, С. Петербург.

Защита состоится г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д.074.39.01 при Институте медицинской паразитологии и тропической медицины ш. Е.И.Нарциновского по адресу: 119830, г_Косква, р. Калая Пироговская, д. 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан 1994г.

ч/ /

Ученый СШфОТЛрЬ специализированного совета кандидат медицинских наук .

А.Й.Фролова

"Ойре'шшшсть" шшщшимих в шчшкуп »[«шику противомалярийных препаратов в связи с развития« устойчивости к ним у Plasaodiua falciparum а в последние годи и обнаружение палиустойчи-вости у этого вида паразита, свидетельствует, что только изыскаиие новых альтернативных препаратов не сЛкет рйиить проблему адекватной химиотерапии falciparum - малярии. Подобная ситуация обусловила появление нового направления в химиотерапии малярии -.поиск неспецифических биологически активных веществ, способствующих при сочетанием применении активизировать воздействие противомалярийных препаратов на первичные мишени паразита, ответственные за инактивацию препарата ( Орлов B.C., Рабинович С. А.. 1930). Предполагается, что подобные сочетания могут " вернуть к яизни" те препараты, в отношении которых существует устойчивость. В первую очередь, это относится к хлорохину, препарату наиболее дешевому, применяющемуся для лечения и профилактики всех видовых форм малярии.

Один из таких подходов преодоления (реверсии) лекарственной устойчивости, по аналогии с неошнстическими клетками основан, на предполагаемой общности взаимоотноиений специфический препарат/ устойчивая клетка: повышенном выведении специфического препарата устойчивой клеткой в сравнении с чувствительной (Bookchln R.H. et. al.. 1981, Гудков ft.В., 1987, ). Исследования, проведенные в области экспериментальной химиотерапии неопластических клеток (Slater L. Н., 1982, Rogan А. Н. et. al., 1984, Fojo А.. 1985) и последовавшие за ними первые исследования в отношении малярийных паразитов показали, что верапамил - бло-катор каналов Са'препятствует выведении специфического препарата, в частности, хлорохина, из устойчивой клетки, способствуя тем самым, его накоплении в токсичных для клетки концентрациях (Leída M.N. et. al., 1981, Ford 3.H., Halt H.N., 1990, Helleis Т.Е. et. al.. 1990). Эти данные получили свое дальнейиее развитие в исследованиях, направленных

на поиск реверсантов лекарственной устойчивости малярийных паразитов

i

среди веществ, действущих как антагонисты транспорта ионов Са" (Leída Н.Н. et. al.. 1981, KroBStag D.J. et. al.. 1987, Bltontl fl.J. et. al.. 1988. Peters H.,1991).

Бсзкогность использования в качестве реверсантов лекарственной устойчивости малярийных паразитов блокаторов каналов (^"рассматривается в настояиее врешз как одно из приоритетных направлений.

Нами проведена серия исследований, направленных на поиск потенциальных реверсантов лекарственной устойчивости среди препаратов, применяет в медицинской практике и экспериментальных соединений.

Цель исследования. Изучение возможности оптимизации воздействия протиЕомалярийшх препаратов, при разных вариантах устойчивости и полиустойчивости у P. berghel, путем их сочеташого применения с блока-тораки каналов Са1", и выбор наиболее перспективных.

Задачи исследования. Изучение возможности использования модели In vitro фермента Са",Не"- зависимой АТФазы для скриншга блокаторов каналов Са" в качестве потенциальных реверсантов лекарственной устойчивости;

- изучение отобранных блокаторов каналов Са'в качестве потенциальных реверсантов устойчивости к хлорохину, и выбор наиболее перспективного реБерсанта;

- изучение возможного оптимизирующего влияния перспективного ре-версанта на эффект хлорохина, фансидара, его компонентов, сульфадокси-нз и пириметамина, хинина при полиустойчивости к сочетаниям хлоро-хин/фансидар и хлорохин/фансидар/хинин;

- изучение блокаторов каналов Са", различающей по степени ревер-сируадего влияния на лекарственную устойчивость, в отнопении спектра их воздействия на разные пути транспорта Са".

Научная новизна. 1. Показана возможность использования модели In vitro фермента Са", Не" зависимой АТФазы для скрининга блокаторов каналов Са", с целью выбора потенциальных реверсантов лекарственной ус-

-л-

тойчивости.

2. Выявлены новые блокаторы каналов Са* среди лекарственных средств. применяемых в медицинской практике, : азафен - оригинальный отечественный трициклический антйдепрессант, празиквантель - антгельмин-тин, циклофосфая - противораковый препарат.

3. Установлена способность азафена, празиквантела. циклофосфана реверсировать устойчивость к хлорохину при моноустойчивссти к этому препарату и полиустойчивости, включаюцей хлорохин.

4. Установлена способность азафена реверсировать устойчивость не только к хлорохину, но и к фансидару, одному из его компонентов - пи-риметашну, а такме к хинину при полиустойчивости к сочетаниям хлоро-хин/фансидар и хлорохин/фансидар/хинин.

5. Введен Индекс комбинационного эффекта, позволявший количественно оценить результат взаимодействия блокатор транспорта ионов Са**/ре-версант с противомалярийным препаратом. .

6. Использование модели потенциалзависимых, потенциалнезависимых и ЙТФ-зависимых Са"=-. каналов позволило выявить спектр воздействия отобрании реверсантов лекарственной устойчивости на пути транспорта ионоз Са".

Практическая значимость. 1. Модель Са1*,Нв'-зависимой ОТФззы ммет быть использована для скрининга новых блокаторов каналов Са1*в целях поиска потенциальных реверсантов лекарственной устойчивости малярийных паразитов.

2. Предложенный Индекс комбинационного эффекта монет быть использован для сравнительной оценки типа комбинационного эффекта сочетаний препаратов, разрабатываемых в экспериментальной химиотерапии малярии и других болезней.

3. Полученные данные могут быть использованы в медицинских учреждениях. при разработке фундаментальных и прикладных исследований феномена лекарственной устойчивости.

-

Положения, выносимые на защиту. I. Азафен обладает широких спектром реверсии полиустойчивости к противомалярийным препаратам разного механизма действия - хлорохину, фансидару, хинину.

2. Кодель Са1*,Ке1- зависимой АТОазн позволяет проводить скрининг блокатороз каналов Са1 с целью отбора потенциальных реверсантов лекарственной устойчивости.

3. Индекс комбинационного эффекта позволяет количественно оценить оптимизирующее влияние блокаторов каналов Са'на эффект противомалярийного препарата, к которому выражена устойчивость/и оценить тип комбинационного эффекта.

Апробация работы. Основные положения работы долояены и обсувдены;

- на коллоквиуме отдела медицинской протозоологии ИНЛиТМ им.Е.И.Йзрциновсксго, 1992 г.

- на U съезде ВОПР, Витебск. 1992 г.

- на научной конференции "Актуальные вопросы медицинской паразитологии". С.- Петербург, 1994 г.

- на ученом совете ЮШиТН, 1994 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 работы, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глав, заключения, выводов, списка литературы. Объем диссертации.....страниц мавинописного текста, включая..... рисунков...... таблиц. Список литературы включает ..... отечественных и

..... иностранных источников.

С0ДЕРКЛ1МЕ РАБОТЫ Материалы к методы исследования

Парззитологические модели 1п vivo. Работа выполнена на модели малярии грызунов: - белые беспородные кыои - Р. berghai.

Исходный кзолят LNK65 и его полиустойчивые линии, сформированные ранее рецидивным методом на золотистых хомяках: LNK6SChlFR и LKK65ChlFCR С табл.1) (С.А. Рабинович, 1965, Ф. Ханмирзоев с соавт., 1390).

.ц.

Таблица i Условные обозначения кзолята и его линий

! Обозначения 1 Спектр лекарственной устойчивости!

! LNK65 1 1 ! Естественная устойчивость к 1 ! хлорохину !

! LNK65CMFR 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! Приобретенная устойчивость к соче-! ¡танив хлорохин/фансидзр. Устойчиво-! !сть к хлорохину снижена в 4 раза, к! ¡Фансидару в 2. пиржетамину в 31, к! ¡сульСадоксину в 2 в сравнении с ис-! ¡ходит изолятом 1.КК65 !

i LNKG5ChlFQR 1 1 t 1 1 1 i i i 1 Приобретенная устойчивость к соче-.! ! таниг хлсрсхии/фзнсидар/хинин. Ус-!' ¡стейчгаость к еючена в 2,6 ! ¡раза в сравнении с ШБ5Сп1гк, при !' ¡сохранении уровня устойчивости к ! ¡хлорохину и фансидару !

* Структура обоз)ичения: LNK65 - исходный изолят. Chi - хлорохин, F - фансидар, Q - хинин. R - рецидивный метод формирования устойчивости.

Для сохранения достигнутого уровня устойчивости к хлорохину. Фан-сидару, хииину хомякам, зараженным обеими полиустойчивыми линиями, периодически вводили хлорохин, фансидар, хинин в ранее установленных максимальных дозах, не приводиввих к снижении паразитемии.

Методы. Использовались опыта "лечебного типа". Препараты по отдельности и в комбинации с блокаторами каналов Са"(БКСа) вводили щт развиввейся инфекции и по разным схемам: однократно, 3 и 4 последова-тельннх дня, один раз в день.

В связи с тем, что изолят 1Ж65 и линии 1КК65ШП*. Ы1К65СЬ1Р0Я характеризуются сниженной вирулентностьв, что проявляется в склонности к митнгации инфекции. эталоном эффективности противомалярийного препарата (ПИП) в сочетании с БКСа служила не доза, приводящая к полному излечению или излечения определенного процента животных СЕЛ 50. ЕБ 90 и т.д.), а доза, обеспечивавшая условный эффект - падение паразитемии до субмикроскопического уровня с лоследдаии рецидивом - доза стандартного эффекта (ДСЭ).

Кокбинацкя вклшала ГШ и БКСа в заведомо неэффективных дозах, предварительно установленных в повторных опытах; контролем, наряду с нелеченными животными, служили животные, получаввие те «е препараты по отдельности в тех же дозах.

Для каждого опыта определялась доза специфического препарата, к которому проявилась устойчивость, приводящая к эффекту, близкому к эф-(екту комбинации - эквивалентная доза (ЭД). Эффективность комбинации БКСа /Ш определяли на основании ряда критериев, характеризующих различные этапы инфекции после ее воздействия (табл. 2) (Моиковский О.Д. с соавт.. 1981).

Таблица 2

Тип опыта и критерии оценки

! Тип оюта I Критерии оценки !

• Лечебный ! 1. Срок наступления паразитарной ремиссии после !

! ¡введения препарата, а при ее отсутствии - срок !

! ¡максимального снижения уровня паразитемии (дни) |

! ! 2. Длительность паразитарной ремиссии (дни) !

! ! 3. Срок достижения условного урошш паразитемии-!

5 '.балл 4 при паразитарном рецидиве (дни) !

Оценку паразитемии проводили ежедневно по вкале Иовковского В.Д. (Рабинович С.Й.. Яожковский В.Д.. 19G4). Движение паразитемии внражали графичеам с использованием статистических программ (Stat Graf, fervard Presentation trafics) персонального компьютера.

Копичественнуг оценку эффективности комбинации БКСа /ПМЛ в сравнении с препаратами по отдельности проводили основании 2 взаимодопол-няисих показателей: показателя эфрективности (ПЗ), определяемого гра-«ичеаи. введенного и нос ранее (Дздавева Н.Р., 1986), и вновь принятого нами Индекса комбинационного .эффекта ШЭ). ПЗ и ИКЗ были использованы для определения типа комбинационного эффекта.

Для интегральной количественной оценки указанных критериев эффективности бил использован ПЗ (Рис.1), определяемый графически.

• &

Рис. 1. Вычисление ПЭ на основании течения паразитемии

Дли иниекиии

А -заражение, Б - введение препарата, В -условный уровень паразитемии (УУП)

ПЭ представляет собой числовое выражение площади фигурн, ограниченной горизонтальной линией, соответствующей условному уровни паразитемии (УУП) - балл 4, и кривой хода паразитемии ниже этого уровня. Величина ПЗ выражается суммой условных единиц (УЕ) за все дни инфекции, когда кривая находится ним уровня балла 4. За УЕ принимается расстояние между уровнями паразитемии балл 4 и балл 0. Соответственно этому промежуточные уровни паразитемии оценивается как десятичные доли от единиц; чем выие эффект на каждый отдельно взятый день, тем значение УЕ больно приближается к показателю единица.

ИКЭ представляет собой отполете между ЗД противомалярийного препарата и неэффективной дозой того же препарата в комбговции (К) с БКСа

ЗД

приводящей к сходному эСФекту, ИХЭ рассчитывается по формуле: -.

К

Типы комбинационного эффекта с использованием ПЭ и ИКЭ определяли согласно Нокковскому В.Д. (1943) в несколько сокраценном варианте.

ПЗ и ИКЭ позволяют дать числовое выражение комбинационного аффекта. При ПЗ и ИКЭ > 1. но < 2 - дыигриа в аффекте незначительный в сравнении с отдельно взятым ПИП; если ПЭ и ИКЭ > 2, но < 4 - комбинация считается эффективной, при ПЗ и ИКЭ > 4 - комбинация высокоэффективна, т.е. эффект соответствует аддитивности, потенцированию или выраженному потенцированию.

Биохимические модели in vitro. Модель фермента Са ,Hg - зависимой ПТФазы саркошшматического ретикулима (CP) аналогична по функционировании каяьмодулинзависимой Са* .Kg1- ЙТОазе плазматических мембран, регулирующей выход ионов Са'из клетки за счет энергии гидролиза АТФ. Ис-1+

тсчиигам фермента Са - (ТГОазы CP служили белые мыпцы задних конечностей кроликов, содержание ««печные ьолокна преиму?ственно быстрого типа. Ходель энергозависиных. потенциалнезависиных и АТФ - зависимых Са1* каналов плазматических мембран. Источником модели служили изолированные паппилярные мыжцы правого желудочка сердца кролика.

Препараты. Пр^таома^ийнме np_enagajH. Хлорохин дифосфат ( дела-гил), Фансидар - фиксированная комбинация сульфадоксина с пириметами-. ном ( тиндурин). хинина сульфат. Использовали промышленную субстанцию (порокок) хлорохина, сульфадоксина, пириметамина, хинина, официнальные таблетки фансидара.

Беверли _ с. _известшм_ влия«е_м_ на^еаиспо2Т_иш_ов_Са1_. Азафен -трицкклический антидепрессант, мелипрамш1 ( имизин) - -трициклический антидепрессант, верапамил ( изопгин) - кардиотропный препарат, цикло-ФосФан, рубоксил, рубромщин - противораковые препараты, празикван-тель, дихлорофен. трихлорофен - антгельминтные препараты, фаридон, це-реброкраст - дегидроперидинового ряда, кардиотропные препараты.

Экот^шента^ные^оедаешя. Синтезированы в Институте по испытанию биологически активных соединений под условным обозначением ИБО 1 -30.

Водорастворим«.препарат« вводили в виде растворов в дистилирован-ной воде. Нерастворимые препараты вводили в виде взвеси в крахмальном клейстере. Препараты вводили внутрь через зонд в желудок. Препараты вводили животным в соответствии с массой тела. Лозу препаратов, выпускав»« в вида солей, исчисляли из расчета на основание. Дозы препаратов, выпускаемых в таблетках, расчитывали с введением поправочного коэффициента следующим образом: после взвемвания 10-15 таблеток каждого вещества, определяли средний вес одной таблетки. Вычисляли коэффициент пересчета путем определения действующего начала препарата на 1 весовую единицу таблетки. С использованием величины коэодициэнта определяли количество таблеток, требуемых для получения необходимой дозы препарата.

Методы. рН_ _-_м_етр№«ский. АТОззную активность испытуемых веществ

определяли по их влиянию на изменение концентрации протонов в растворе

с помощью рН-метрической установки. Испытуемые вещества вводились в

реакционную среду в концентрации от 10 -4 до 10 -б мМ. 0 скорости пог-

„ 1+

лащения везикулами СР ионов Са судили по времени, за которое известное количество ионов Са'*, вводимое в среду инкубации, полностью поглоча-лось везикулами СР, что, в свою очередь, приводило к прекращению реакции гидролиза АТФ.

Флуоросцомт1_п(й^етод. Бил использован для регистрации изменений в

структуре Са"-канала или его окружении, вызванных биологически-активными препаратами, которые отражается на собственной флуоресценции триптофановых остатков СР. Измерение проводили на спектрофлуориметре. СР обладает собственной флуоресценцией при длине волны возбуждения -295нМ. В спектре флуоресценции СР наблюдается один максимум при -335нМ.

При исследовании влияния биологически активных соединений на мембрану СР использовали гидрофобный флуоресцентный зонд - пирен, который

«страинлса а гидрофобнцч пасть мвибраш CP, Йлуорвсцонция пирона,

встроенного в СР. составляет - 334нН.

Метод изменения вщт£^вточных потет^илов^ Проводилась регистрация изотермических сокрацений палпилярных мыиц с применением внутриклеточного отведения потенциалов действия при помоии "плаващих" стеклянных микроэлектродов. Оценка изотермических сокращений клеток сократительного миокарда кролика осуществлялась по трем тестам. Первый тест чувствителен к изменениям, связанным с электровозбудимыми Са* -каналами. Второй тест дает возможность исследовать процессы, связанные с Са - На обменом. Третий тест оценивал влияние препаратов на АТФ-зависимый Са'обмен плазматической мембраны клеток.

Результаты исследований

Скрининг биологически активных соединений в отношении их влияния на транспортную функцию Са", Kg1- зависимой АТФаза саркоплазматическо-го ретикулука. lia этой аадели проведен скрининг 45 биологически активных соединений. Изучение включало определение их ингибирушего влияния на Са1- транспортную и/или гидролитическую Функции Са1*-, Mgl- зависимой ЙТФазы саркоплазкатического ретикулума (CP). В связи с тем, что три-цихлический антидепрессант дезипрамин, применяемый за рубежом, по данным литературы вироко изученный как реверсант лекарственной устойчивости. не был в наяем распоряжении, в наги опыты был включен мелипра-юш - близкий аналог дезипрамина. Противораковые препараты были отобрана по аналогии с литературными данными, относящимися к характеристикам ряда других цитостатиков; атгельминтики - в связи с их способностью вызывать судорожные сокрацения гельминтов в модельных опытах in vitro. Было отобрано 10 активных веществ, различающихся по степени 9т0г0 влияния в стандартной концентрации - 0.01 мК (Табл.3).

- to

Таблица 3

Показатели шмата отобранных веществ на СаЧИе2-зависимую ДТОззу

1 Вещество ! Торможение активности 1 Гидролиз ЙТФ Г ! ! ЙТФазы в /У. к контроля I в ХУ. к контроля !

йзафен 54 52

Миклофосфан . Иелипрамин 42 30 20 10

Рубоксил 35 40

Рубромицин 35 40

Празиквантель 20 18

Дихлорофен Трихлорофен 21 15 25 30

Фаридон Цереорокраст Ш 16 18 18

У остальных испытанных веществ - НЕЙ 1-30, интибирующее влияние на активность Са^Нв^АТвзэи и гидролиз ЙТФ при испытании в стандартной концентрации было ниже, чек 10%.

Таким образом, наиболее выраженным торможением активности Са^.Ие1* - зависимой ЙТФазы по выбранным критериям обладают азафен и циюгафос-Фан. Тем не менее, в последующее изучение в качестве потенциальных ре-версантов лекарственной устойчивости были включены все вещества. Этот выбор был обусловлен необходимистью определить существует ли взаимосвязь между ингибирующей и реверсирующей активностью того или иного вещества и влиянием на реверсирующий эффект совокупности биохимических показателей: торможение активности йТФазы. гидролиз ЙТФ.

г*

Влияние отобранных блокаторов каналов Са на эффект противомалярийных препаратов при полиустойчивости к ним.

Все препараты по отдельности и в комбинации вводили при развивеей-ся инфекции по одинаковой схеме - 3 дня подряд, за исключением хинина.

- Во всех опытах проявилась определенная тенденция в течении инфекции. Независимо от типа полиустойчивости наблюдался ее митигирующий характер (рис 2-9). Проявление митигации было неоднозначным в разных группах опытов.

- К

У нелеченых контроле^ инфекция развивалась остро, заканчиваясь гибель*! нквотни на 9 -13 день после заражения, что несколько превышает срок жизни животных, зараженных лекаретвенночувствительным «таимом. При воздействии препаратов по отдельности в неэффективных дозах, мити-гация прошлялась в несколько более длительных сроках выживания кивот-кых, з сравнении с контролем. При воздействии комбинации неэффективных доз препаратов, так же, как и доз, эквивалентных по эффекту комбинации, паразитемия не достигала уровня контроля в период рецидива, сох-{йняясь на белее низком уровне в сравнении с другими группами опыта. В пределах срока наблюдений, 14-10 дней, гибели шштных в этих группах не наблюдалось.

Сочетание вераламил / хлорохин. Линия 1.КК65СЬ1Н? (Рис.2, табл.). Изучение егтоевкрущего влияния блокаторов каналов Саг*бцло начато с верапамкла как препарата, который стал "основополоаником" изучения феномена реверсии лекарственной устойчивости.- Зти опыты шились логическим продолжением исследований, проводимых ранее в институте.

Вераламил в дозе 50 кг/кг и хлорохин в дозе 45 кг/кг по отдельности не проявили противомалярийной активности. Воздействие комбинации сопровождалось прогрессивным снижением паразитемии, и ко второму дню после окончания ее введения наступила кратковременная паразитарная ремиссия с последующим рецидивом. Доза хлорохина, приводившая к эффекту, сходному с комбинацией, составила 180 мг/кг, что подтверждается различием в ПЗ лииь на 0.2 УЕ. Величины ПЗ и ИКЗ позволили оценить эффект комбинации, как потенцирование.

Сочетание азафен / хлорохин. Линия [.КШСМП? (Рис.З.табл. ). Азафен в дозе 500 мг/кг - стандартная доза для всех опытов, независимо от полиустойчивой линий, и хлорохин в дозе 45 мг/кг по отдельности не мазали влияния на течение инфекции. При введении комбинации паразитемия стала плавно снижаться. На следувдий день после окончания введения паразитемия достигла субмикроскопического уровня. После относительно

-и-

Рис. 2. Сочетение верапамил/хлорохмн. Линия ШОЗСЫП}.

7 8 9

[ни тщт

10 11 12 13 14

Препарат I N на ¡графике

Лоза ! Критерии оценки

1

2

3

ПЭ

икз

Контроль

Берапамин

Хлорохин

Комбинация

Хлорохин

50 45

50+45 2 180 1.5

5.5 5,2

3.2 3.6

а Рис.3. Сочетание азафен/хлорохин. Линия 1Ж55СЫп;

Препарат ! N на 1 Доза ¡графике'

6 в 7 в 0 10 11 12 13 14 16 10

йни ишвкши __

Критерии оценки

1

2

ПЭ I ИКЗ

Контроль 1 _ _

Лзафен 2 500 _ -

Хлорохин 3 45 _ _

Комбинация 4 500+45 2 4 7 5,7

Хлорохин 5 270 2 3 7 4.65 6.0

- И~

4

продолжительной ремиссии наступил паразитарный реццдаш. Елюкш к аффекту комбинации оказался эффект хлорохина в дозе 270 мг/кг, разница в ПЗ составила 0,75 УЕ. Сопоставление ПЭ и ИКЗ позволяет оценить эффект комбинации азафен /хлорохин как выраженное потенцирование.

Сочетание азафен / фансидар. Линия ШШЫГО (Рис.4.табл. ). Кратковременный незначительный эффект оказал азафен собственно в стандартной дозе: к третьему введении паразитемия снизилась на 1 балл, однако в последующе сроки условный уровень не был достигнут, паразитемия неуклонно нарастала и практически не отличалась от уровня контроля. Несколько более выраженным оказался эффект фансидара в дозе 1,5 мг/кг. Через два дня после окончания введения паразитемия кратковременно снизилась лишь на 1 балл относительно условного уровня и в пос-ледупцие сроки стала прогрессивно нарастать, приблизиввись к 10 дни течения инфекции до уровня контроля. Введение комбинации сопровождалось резким снижением паразитемии,, при котором минимальный уровень был достигнут на следующий день после окончания введения. После двухдневной ремиссии паразитемия при рецидиве стала постепенно нарастать. При введении фансидара в дозе 4.5 мг/кг эффект оказался сходным с эффектом комбинации, различие в ПЗ - 0,47 НЕ. Величины ПЭ и ИКЗ позволяет оценить эффект комбинации азафен / фансидар как потенцирование.

Сочетание азафен / пириметамин. Линия 1Ж65СЫР{{ (Рис.5, табл).

йзафен в стандартной дозе не проявил эдикта, После введения пиршета»

мина в дозе 2,5 мг/кг наблюдалось кратковременное незначительное снижение паразитемии практически только до условного уровня, с последующим подъемом до уровня контроля. При воздействии комбинации паразитемия стала резко снижаться уже после второго введения. На следу щий день после окончания введения наступила паразитарная ремиссия, продолжавшаяся два дня, с последующим рецидивом. Доза пириметамина, приво-дивиаз к эффекту, сходному с эффектом комбинации составила 6,5 мг/кг, различие в ПЗ оказалось равным 0,6 УЕ. На основании ПЗ и ИКЗ подобный

д Рис.4. Сочетание фансидар/хлорохин. Линда ШС5ШРЯ

6 6 7 8 о Дни инбекши-

10 11 12 13 14 16 19

Препарат ! N на ¡графике

Доза I Критерии оценки

1

ПЗ

ИКЭ

Контроль 1 -

Азафен 2 500 - - А ^

Фансидар 3 1,5 2 0 3 0.25

Комбинация 4 500+1,5 1 2.5 5Х5 3,63

Фансидар_5_4.5 .1 2 э 3,35 3

А Рис.5.' С'оче'т'ание пириметамин/хлорохин. Линия 1Ж65СЫга,

0 12 3 4 6 6 7 8 9 10 11 12 13 И 16 18

__Дни иншекши

Препарат I N на ¡графике • Доза Критерии оценки пэ икз;

112 13

Контроль 1 - Азафен 2 500 - Пириыетаыин 3 2,5 - Комбинация 4 500+2.5 1 2 4,5 3.8 Пириметаыин 5 6,5 2 1 4,5 3,2 2.6

- /У-

аффект комбинации воден /пириметамин можно оценить как потенцирование.

Сочетание азафен / сульфадоксин. Линия LKK65ChIFR. (Рис.6, табл.). Снижения численности паразитов при воздействии азафена в стандартной дозе и сульфадоксина в дозе 0.5 мг/кг практически не отмечалось. При воздействии комбинации зфрект наступил только после третьего введения. Однако паразитемия к этому сроку максимально снизилась лишь на 1,2 балла в сравнении с условным уровнем, с последующим выраженным нарастанием. ЗСФект, сходный с комбинацией, наступил при воздействии дозы сульфадоксина в 0,9 мг/кг, различие в ПЗ составило 0,1 УЕ. Величины ЛЭи ИКЭ свидетельствует о том, uro эффект сочетания азафен/сульфадоксин выразился лишь как аддитивность.1

Сочетание азафен / хинин. Линия LHK65ChlFQR (Рис.6,табл. ). В связи с быстрым выведением хинина из организма препараты по отдельности и в комбинации вводили 4 дня подряд. Введение азафена в стандартной дозе не дало эффекта. Введение хинина в дозе 30Ü мг/кг вызвало незначительный эффект: ливь на следующий день после окончания введения паразитемия снизилась на 0.2 балла по отношению к условному уровню. После первого введения комбинации обоих препаратов численность паразитов начала прогрессивно снижаться, к третьему введению наступила паразитарная ремиссия. В последующие сроки наблюдения паразитемия стала постепенно нарастать. Доза хинина, вызывавшая эффект близкий эффекту комбинации составила D00 мг/и\ Различие в ПЗ не превысило 0,2 УЕ. Величина ПЗ и

№3 позволяет оценить э#ект комбинации как потенцирование.

Сочетание'циклофосфан/ хлорохин. Линия LNK65ChlFR. (Рис.7, табл.). После введения циклофосфана в дозе 152 мг/кг и хлорохина в дозе 45 мг/кг по отдельности течение инфекции не отличалось от контроля. После окончания введения комбинации наблюдалось выраженное снижение числа паразитов, и через день наступила относительно продолжительная паразитарная ремиссия, с последующим рецидивом. Доза хлорохина. приводившая к эффекту, сходному с эффектом комбинации, составила 220 мг/кг, разли-

Д Рис ."61" Сочетанив сцльфадоксин/хлорохии. Линия ЬИКСЗСЫП?

о> X

нч

1

+*

1-1-1-1-1-1-1--х--.1.. 11*1

б е 7 В 0 10 11 12 13 14

Дни инфекиии

Препарат I N на ¡графике

Доза

Критерии оценки ! 113

1

ИКЗ

Контроль

Пзафен

Сульфадоксин

Комбинация

Сульфадоксин

500 0.5 500+0.5 0.7

1.5 .1.7

0.2 0.3

1.4

д Рис.7. Сочетанив хинин/хлорохин. Линия 1Ж65СЫга

6 6 7 8

'Дни инфекции

10 11 12 13 14 16 1в

Препарат

N на графике

Поза

Критерии оценки

1

ПЗ

ИКЗ

Контроль

йзафен

Хинин

Комбинация Хинин

500 300 500+300 Б00

2 2 2.2

0,08 3.2

3.0 2.0

4

чие в ПЗ соответствовало 0.45 УЕ. Величины ПЗ и ИКЭ позволяют оценить эффект комбинации циклофосфан/ хлорохин как выраженное потенцирование.

Сочетание циклофосфан / фансидар, линия [Ж65СМга и сочетание циклофосфзн / хинин, линия ЬКК05СЬ1Р0К. Оптимизирующего влияния цикло-фосфанз на эффект цансидара и хинина не выявлено.

Сочетание празиквантель/ хлорохин. Линия 1ЛК65СЫРй (Рис.8, табл.). Динамика паразитемии после введения празиквантеля в дозе 125 мг/кг и хлорохина в дозе 45 мг/кг по отдельности не отличалось от контроля. После первого введения комбинации паразитемия начала нрогрес-сивно сншться и на следующий день после окончания се ввдения наступила кратковременная паразитарная ремиссия, с последующим рецидивом. Доза хлорохина приводившая к стандартому эффекту, близкому к эффекту комбинации, равнялась 100 иг/кг, различие в ПЗ составило 0,12. Эффект комбинации празиквантель/ хлорохин на основании ПЗ и ИКЗ может быть оценен как потенцирование.

Сочетание празиквантель/фансидар, линия ШбЭСШЯ и сочетание празиквантель/хинин. линия ШЖЫРОА. Оптимизирующее влишше празиквантеля на эффект фзнсидара и хинина не выявлено.

Сочетание рубоксил / хлорохин. Линия 1ЛХ65СЬ1Р1?. Рубоксил даже в дозе, близкой к максимально переносимой - 100 кг/кг, как и хлорохин в стандартной неэффективной дозе не проявили противомалярийного действия. При воздействии комбинации после третьего введения паразитемия кратковременно снизилась лишь на 0,5 относительно условного уровня с последующим нарастанием.

Сочетание мелипрамин/хлорохин. Линия 1К05СЫГв. Мелилрамин в дозах, переносимых мышами не оказал влияния на эффект хлорохина.

Сочетания фаридон. цсреброкраст, дихлорофен, трихлорофен. руброми-цин/Хлорохин соответственно. Линия 1КК65СЫП). Оптимизирующего влияния на активность хлорохина у вывеперечисленных веществ не обнаружено.

Сочетание экспериментальных соединений ИБй 1-30/хлорохин. Линия

6 0 7 6 0

Дни инФекиии

10 11 12 13 1«

I Препарат! N на ! ¡графике

Доза ! Критерии оиенки

I

2

ПЗ

икз:

Контроль

ЙшюЗюсфан орохин Комбинация Хлорохин__

152 45 152+ 45 220

б

5.8

4.35

3.9 4.8

д Рис.9. Сочетание празиквантель/хлорохин. Линия ЬКШСЫГЯ.

6 О 7 В в 10 11 12 И Н И И

Дни инсскцю^

Препарат ! N на ¡графике

Доза ! Критерии оценки

1

пз : икз

Контроль

П^ТШКИЛНТВЛЪ

Хлмрохин 'КимЛшиция Хлирикии

12!3 -45

125» 45 | 1 3.0 3.1 ?00 3.8 3.23 4.0

LHC65ChlFR. Не видилоно оптимизирушого влияния каждого из указанных соединений на sicm хлорохина в дозах максимально переносимых мииаки.

Таким обраэоы, азафен в сравнении с другими из испытанных блокато-

ров каналов CaV прошил наиболее выраженное реверсирущее влияние при попиустойчивости P.berphei к препаратам разного механизма действия -хжорохин, фансидар, хинин соответственно.

Сопоставление зэдекта сочетания неэффективных доз азафена с хлоро- . хином, фансидаром и его компонентами,а также с хинином в сравнении с каждым из этих противомалярийных препаратов по отдельности, в дозах, привоших к стандартному эффекту, близкому к эодюкту соответственных

« комбинаций, 1ЮЭВШЮ дать ецед К* ЙЬЛбШШокнЗРо Hà осйЗ= ваши принятых нами показателей комбинационного эффекта - ПЭ и ИКЭ влияние азафена в отношении хлорохина можно оценить как выраженное потенцирование. В отношении фансидара, пириметамина, хинина - как потенцирование. Влияние азафена ta эффект сульфадоксина проявилось ливъ как аддитивность.

Исследование влияния реверсантов лекарственной устойчивости аза-л--

Фена, циклофосфана и празиквантеля на Са - канал, липидиуд и белковуп матрицы мембраны саркоплазматического ретикулума.

Методом флюоресценции было исследовано влишше на мембрану СР ре-версантов лекарственной устойчивости - азафена, циклофосфана, празиквантеля . Исследования показали, что наиболее перспективный реверсант лекарственной устойчивости - препарат азафен взаимодействует с липид-ной и белковой матрицами СР и опосредованно через них влияет на структуру Са - канала. Аналогичен

по действии на Са-транспортный канал препарат цкклофосфан . который связывается непосредствешю с трилтофано-выми остатками Са* - канала, не влияя на липидную матрицу мембраны. Празиквантель незначительно изменяет структуру липидной матрицы СР, не взаимодействуя с функциональными группами Са**-канага,

Твои образом, азафен, цикдофосфан, празиквантель, обдадащие на

моделью« системах выраженным реверсирущим действием в разной степени

„ 9»

взаимодействуют с функциональными структурами Са - канала, более «иро-ко - азафен, менее «ироко - циклофосфан. наиболее ограничено влияние празиквантеля.

Заключение

Функция Ca^.He'- зависимой ЙТФазы CP является одним из механизмов,

д.

регулирующим транспорт ионов Са через мембрану живой клетки. Использование модели этого Фермента in vitro позволило отобрать наиболее ак-

!• I*

тивные Слокаторы каналов Са по их влиянию на Са .Kg - зависимую ЙТФазу и гидролиз ОТО. Эти всиества были изучены в качестве потенциальных ре-версанов лекарственной устойчивости на линиях P.berciiei полиустойчивых к сочетаниям хлорохин/фансидар и хлорохин/фансидар/хинин. При сочетан-ном воздействии с соответствующими противомалярийными препаратами в неэффективных дозах выраженным преимуществом обладал азафен. Он оптимизировал эФФокт хлорохина, Фансидара, пириметамюв и хинина, не оказывая выраженного влияния 1и эффект сулъфадоксина. Келипрамин - близкий аналог дезипрамина, в переносимых юлами дозах не оказал оптимизирующего влияния. Оптимизщдаее влияния циклофосфан и празиквантеля бмло ограничено только хлорохином. Отсутствие выраженного влияния на эффект сульфадоксши, а также циклофосфана и празиквантеля на эффект фансидара и хинина возможно связано с иными путями транспорта ионов Са" В специальных биохимических опытах наиболее широкий спектр влияния на липидную, белковую матрицы, Са'- канал плазматических мембран выявлен у аззфена. Мсньяим спектром действия обладает циклофосфан, празик-вантель опосредовало действует на липидную матрицу мембран. Вымеска-занное позволяет придти к заключении, хотя механизм полиустойчивости и реверсиругаего влияния БКСа не раскрыт - Факт преодоления лекарственной устойчивости сочетании противомалярийного препарата с БКСа заслуживает внимания.

Внедрение результатов исследования в практику.

Методические подходы, разработанные при изыскании новых блокаторов каналов Са'/реверсантов лекарственной устойчивости внедрены в практику научно-исследовательских работ Института по испытанию биологически активных веществ.

ВЫВОДЫ

1. Модель фермента Са8'.Мвг- зависимой йТОазы позволила выявить новые блокатори каналов Са1'. среди препаратов, примешемых в медицинской практике - азафен, оригинальный российский трициклический антидепрессант. циклофосфан - противораковый препарат, празиквантель - антгель-минтный препарат.

2. На модели малярии грызунов - P.berghel с естественной устойчивостью к хлорохину и полиустойчивостью к сочетанию хлорохин /фансидар и хлорохин/фансидар/хинин установлена способность азафена, циклофосфа-нз, празиквантеля реверсировать лекарственную устойчивость.

3. ЦиклоФан и празиквантель при сочетанном применении проявили ре-версируюиие влияние на устойчивость к хлорохину при монои полиустойчивости.

4. Наиболее вироким спектром реверсирующего влияния при сочетанном пр^енении обладает азафен, повывая эффект хлорохина, фансидзра, его компонента пиркметамина, а также хинина в 6, 3, 2.6, 2 раза соответственно.

5. йзафен обладает наиболее вироким спектром влияния на пути транспорта ионов Са^* взаимодействуя с липидной. белковой матрицей и опос-

„ г»

редованно через них - на структуру Са канала, что возможно определяет

i

его «ирокую реверсирующую активность в отношении противомалярийных препаратов разного механизма действия.

6. Модель In vitro Са1.* Hg*- зависимой АТОазы может быть использо-

. it

вана для скрининга модуляторов транспорта ионов Са - потенциальных ре-версантов лекарственной устойчивости.

- г*. ■

Список опубликованных работ

1. Рабинович С.ft., Орлов B.C. Бухтин Б.Й. и яр. Модуляторы транспорта ионов Са, как реверсанти лекарственной устойчивости малярийных паразитов. // Тезтсы докладов У съезда ВОПР. Витебск 1992, с. 128.

2. Rablnoulch S., Bukhtln В.., Salganlc R., at al. Approaches towards nonspecific reversal of drug resistance In Plasmodia. // U1II International congress of parasitology., Izair - Turkey. 1994, p.388.