Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазматическая мембрана гладкомышечной клетки: активный транспорт кальция, натрий-кальциевый обмен и реконструкция ионной проводимости

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Плазматическая мембрана гладкомышечной клетки: активный транспорт кальция, натрий-кальциевый обмен и реконструкция ионной проводимости"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

Л/о

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РЫБАЛЬЧЕНКО Владимир Корнеевич УДК 577.352.2-3

ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКИ: АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ КАЛЬЦИЯ, НАТРИЙ-КАЛЬЦИЕВЫЙ ОБМЕН И РЕКОНСТРУКЦИЯ ИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ

03.00.13 — физиология человека и животных 03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

/4 АГ ¿/ЯП

Ар. -НО сЧ, (О^О^ Г1 мйа-Г988 и\ 1 & , //б С С,, )

¿¡ЯШ* " ^

Работа выполнена в Институте физиологии и в лаборатории физико-химической биологии Киевского ордена Ленина и ордена Октябрьской Революции государственного университета им. Т. Г. Шевченко.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

1. Бурлакова Е. Б. — доктор биологических наук, профессор.

2. Глебов Р. Н. — доктор биологических наук, профессор.

3. Колье О. Р. — доктор биологических наук, доцент.

Ведущая организация — Институт физиологии им.

А. А. Богомольца АН УССР.

Защита диссертации состоится « ».....

1989 г. в 15 часов 30 минут на заседании специализированного совета Д 053.05.35 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова (117234, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « »..... 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

И.'Б. Федотова

; \ ощая характеристика рабош

Акту а л ь нос т.ь п р о <5 л в м н. Процессы возбуждения, сокращения и расслабления гладкомшечной клетки во многом определяются состоянием плазматической мембраны (ПМ), ее способностью генерировать электрическую активность, обеспечивать транспорт различных вещестй и ионов, в том числе ионов Са2+. Являясь переносчиками зарядов, модуляторами ионной проводимости мембран и многих мемйраносвязанных ферментов, а также одним из "вторичных мессендееров", иона Са регулируют процессы передачи клеточным системам сигналов, которые поступают в форме электрических импульсов Или химических соединенна па Ш.

Сравнительное слабое развитие саркоплазматического ретику-лума гладкомышечных клеток /О.Я.Кауфдан, 1979/ и весьма слабая его способность связывать и накапливать кальций /С.Н.Орлов,1981, 1982/ приводят в предпологению, что основная часть ионов Са2* диффундирует вйутрь клетки через специфические каналы, повышая уровень внутриклеточного ионизированного Са2+ до микромолярннх концентраций. Кальций в таких концентрациях вызывает конформэця-оннае перестройки сократительных белков, результатом чего является сокращение клетка.'

К пастояаеыу вригени накоплен достаточно большой экспериментальный глториал, полученный в основном электрофизиологическими методами, который свидетельствует о первостепенной роли кальция в возбуждении а электромеханической сопряжении гладкошшечных клеток /Р.С.Орлов и соавт., 1971; П,Г.Богач п соавт., 1981,1984; П.Г.Косгак, 1986; В.И.Скок, М.О.Иуба, 1986; П.О.Шуба, В.Г.Коче-касова, 19В8 и др./. В последние годи усилия исследователей направлена на изучение хпмичоской природы п физико-химических свойств структур Ш, поншащих внутриклеточную концентрацию Са2+ до значений, пнпцппруюлдах расслабление клетки. Таким структурами являются на+/Са переносчик, обеспечивающий иа+-зави-симое трансиембраиное движение кальция, и Са-насоо, осуществляющий выведение кальция из клетки за счет энергии гидролиза АТФ Са2+-актпвируемой АТФазоЙ. '

В отличие от ь'Е2^Са2+-АТФази мембран эритроцитов и сарко-плазгатического ретикулука /Д.О.Левицкий, 1981, 1984; А.А.Болдырев, 1933, 1985; В.Б.Ритов и соавт., 19НЗ, 1986; С.Н.Орлов и

соавт., 1985 и др./ аналогичный фермент гладкомышечных клеток изучен слабо. Лишь в некоторых работах указывается, что фракция ПМ и микросош сонной артерии /Р.Црайсе и соавт., 1287/, желудочно-кишечного тракта /Wibo et al., 1981; Wüytack et el.,1981/, миометрия /М,Д.Курский и соавт., 1976-1988: Akerman, Wikström, 1979; Soloif, Sweet, 1982 / способны к МБ2+-зависимому, Са2+-активируемому гидролизу АТФ, сопряженному с процессами накопле-Ш1я кальция внутри мембранных везикул. Предприняты попытки вы- . делить Mg2+, Са2+-АТФазу из Ш гладкомышечных клеток /В.К.Рыба-льченко и соавт., 1985; Wuytack et al., 1981 / с целью изучения свойств фермента и реконструкции в искусственные липидше мембраны для исследований механизмов его функционирования.,

Реконструкциовный подход в исследовании мембран является важным как в общетеоретическом, так и в прикладном отношении. Он способствует познанию механизмов многих процессов, основанных на взаимодействии мембранных поверхностей,"механизмов слияния и деления клеток, образования клеточных гибридов, что является важным в клеточной инженерии и 'биотехнологии и др. Исследования последних лег /В.Ф.Антонов и соавт., 1981; Л.Б.Маргояис, Л.Д.Бергельсон, 1986; С.А.Бурханов и соавт., 1987 и др./ до использованию липосом для направленной доставки фармакологических препаратов и генетического материала в клетку' свидетельствует о перспективности этого направления для профилактики патологических явлений и лечения многих "болезней. • "

Слияние мембран обеспечивается в основном за счет липвд-ли-пидных взаимодействий, о чем свидетельствует увеличение площади чисто литшдных поверхностей при кластеризации мембранных компонентов. Это предположение подтверждается исследованиями сляяния клеток / Pinto et al.,1977/, взаимодействия липосом /Hui et al., 1981 /, слияния плоских липидных бислоав. и юс взаимодействия с липосомами /Е.А.Либершн, В.А.Венашев, 1972; Й.Н.Бабунашвшш а сонвт., 1981; Ю.Ф.Сокох ^bjL соавт., 1982 и др./. Моделирование ' процессов слияния"в'реконструкции на более сложных системах -протеолипосоыах и везикулах биологических мембран - позволяет формировать активные комплексы на искусственных липидных мембранах, которые позволяют исследовать множество мембранных процессов при действии токсических и лекарственных веществ в контролируемых условиях орада. В этой плане больше надежда возлагаются

- г -

на реконструкцаошшй подход и при исследовании Ш гладкомышечных клеток. Реконструкция гак катальных систем Ш, так и систем активного л пассивного транспорта ионов дает возможность на только изучать молекулярные механизмы трансмомбракного движения Са2+, по и регулировать транспорт катиона. Последнее открггвает широкие порспоктивы з практике гастроэнтерологи:, акушерства п гинекологии, космической медицине.

К началу настоящее исследований (1969 год) не била выделена и охарактеризована фракция Ш гладкошшечлых клеток кишечника, но били пзучеш биохимические а физиологические характеристики систем выведения кальция аз глотки и юс регуляция, оставались но пзвесишук количественные характеристики связывания Са2+ плазматической ийлбраной, отсутствовали сведения о взаимодействии фрагмзйтов ИД глздшточвнх меток о ао!сусствонтша лгатдтша мембранами. Иэлсйошоэ обосновывает актуальность 'комплексного исследования участия Ш гладксиазэпниг глоток в регуляции внутри-меточной концентрация ионизированного кальция. Актуальным вопросом является й реконструкция канальной проводимости Ш гладкому-.сочных'клеток на пскусственцнх лашдапсс мембранах, сведошш о потороЛ в литература отсутствуют. Актуальность проведенных исследований определяется тякзэ запросами современной медицины в связи о'устранэякса гшэтаог да§упкдай и о разработкой методов целзшцравлепноЛ доставка в орган, ткань, клетку фармакологических вэдоств о ксиользосанпем иоиуосзяэннкс мембран гак пооатолэД оослэяюпс.

ЦЙЛГ) я задачи воолодоаанвй. Целью настоящего носяедослнгй.йиго нзучошзо путей выведения Са2+ пз гладлжлтезчцоя пааий и рзкопструдцдя кальциевой ароводаюотн воамдкк пл ибкусстзешсс лзнядпнх мембранах. В связи о постав-лонеоЗ польз в работе ^свались следующие основные задача:

Х.Палутатъ чястув везш^лкровапнуя фракцша Ш гладаомызгач-шх клеток топкого впзочпша, Исследовать связывание кальция и АТСазщ» активность фракции Ш п определить степень влияния на нсследэа условий сроди инкубации, лшшдов, актнвзторов, ингибиторов и др.

2.Изучить АТФ-гависЕкай транспорт кальция мембранной фракцией против электрохимического градиента а его регуляцию.

3.Исследовать поверхностно-актавЕне каяалообразугщпо своЯст-

а-6945-

ьа окситоцша - специфического блокатора Из2+ , Са^+-АТФазы и Са-насоса Ш миоцитов.

4. Определить кинетические параметры натрий-кальциевого обмена и его зависимость от мембранного потенциала.

5.Рассчитать мощность систем выведения Са^+п определить, достаточна ли она для изменения внутриклеточной'концентрации катиона до значений, соответствующих расслаблении клетки.

6.Исследовать поверхностно-активные свойства Ш гдадкомн-шочних клеток, характер взаимодействия мембранной фракции о ли~ ппдшлли монослоями и разработать способ имплантации в ВШ фрагментов Ш с восстановлением канальной проводимости последней.

Предполагалось, что результаты проводишх нами■ исследований окажутся полезными для физиологии гладких мышц и биохимии ионного транспорта, для практической гастроэнтерологии, при разрабохг-ке нових методов предупреждения и устранения мышечных дисфункций, для липосомальной фармакотерапии, а такке в учебном процессе ряда биологических специальностей.

Научная.новизна. Виде лена фракция Ш гладабш-шчншс клеток тонкого кишечника и впорв'ые на данном объекте .проведены комплексные исследования механизмов трансмембранкого движения кальция. Изучена регуляция Са-насоса Ш гладкошаючных клеток кальмодулином и окситоцином. Предложен новый маркерный фермент Ш гладкомшаечных клеток тонкого кишечникаокситоцян-чувст-вигольная, Мг2+ -зависимая, Са^+-активируемая АТФаза. Разработан способ имплантации фрагментов ПМ в искусственные бислоп п впервые реконструированы калиевая и кальциевая проводимости. Установлены злектрогенность и обратимость натрий-кальциевого обмена. . Впервые изучены поверхностная активность ¿локатора Са-насоса окситоцина , его взаимодействие с лшцднши монослоями и образова- • ниэ гормоном потенцкалозависимых ионных кагалов как в азолектпдо-воё Ш1, так и в функционально активном комплексе "ПМ-НМ". Предложена гипотеза связывания окситоцша с Ш: молекула гормона взаимодействует с мембранными лшшдама в результате чего, по-видимому, приобретается такая конформацпя, в которой окситоцин способен проявить физиологическое действие на гладкошшчные клетки.

Полученные данные дают основание для заключения о возиогзюо-ти полной регуляции внутриклеточной концентрации кальция единой мембранной системой - плазматической мембраной, которая, благодаря Са-каналам, Са-насосу и натрий-кальциевому антипорту; обеспе-

- 4 -

чивает сопряжение процессов возбуждения, сокращения и расслабления гладкомышэчной клетки.

Практическая значимость работы» Установленные закономерности регуляции внутриклеточной концентрации кальция плазматической мембраной могут послузить основой при разработке новых подходов и методов устранения мышечных дисфункций п коррекции нарушений моторики пищеварительного аппарата. Раскрытие механизмов взаимодействия окситощша с ПМ и регуляции гормоном внутриклеточной концентрации кальция гладкомншэчннх клеток определяет научную обоснованность и целесообразность использования гормона в качество лечебного средства не только в практике гпнехсолбгии/.но и гастроэнтерологии. Результаты исследований влияния линосогл па ферментативную активность ПМ, взаимодействия фрагментов Ш о исзсусстзешпмп мембранами и формирования фпзиолоп'пескп активного комплекса "ПМ-ЕШ" могут быть использованы в исследованиях шщшэпдуалыш: мембранных систем в контролируем условиях, а такзе при разработке »летодов целенаправленной доставки фзгг-'лкологкчаскпх препаратов, ферментов и генетического материала а клетку, в биотехнологии и селекционной работа,'например, ври получении клотоишх гибридов и т.п. ,

1С настоящему пригони результаты работы■ внедрены в'исследовательскую Практику института физиологии ЛИ Казахской ССР и института' бншкзя ЛИ УССР, при определении предельно допустимых кон-цонтрзциД ¡штэеш: вэдзога в аяднфэряом воадухо (ЦЦК утверя-донн Минздравом СССР), при утопия лзкциД'п проведении практических еаяагзй по обэдк курсах. "Биофизика", "Биохимия" и "Цитология? ежлщреом "Струг;гурз и Луш'-гда биологических монбрап" и "Эломрсшо»м:а;роскош14оск2а катода исследований" для студентов Киоасаого • госушсзорсвтета. Шторвалы работа опубликованы в монографии и в четырех угобпкх пособиях, которые включены в учебные преграда Московского, Киевского и Львовского государственных университетов»

Апробация работы и публикации. Мз-гериалн диссертации долояеш на 24 международных,- союзных и рес-Фблпкзпснкх конгрессах» съездах, конференциях и с шло э пулах, зпедоншх о которая представлены в списке опубликованных работ. 1о зсаториалам диссертации опубликовано 63 работы,в т.ч. 26 статей 1 4 книги. '

Структура п объем работы. Настоящая работа является обобщением исследований, выполненных в соответствии с планами НИР Киевского госуняверситета (номера тем: 76045042, 79066292, 81005043 и 101860076446), утверздоннши Президиумом АН УССР Ü,F308 от 02.11.76 г., JÍ604 от 25.12.80 г.) и . ГКНТ СССР (JÜ80 от 03.05.1979ьг., JI26II3 от 03.02.87 г.).

Диссертация состоит из введения, 8-и глав, заключения, выводов и списка основной использованной литературы, состоящий из 675 источников. Работа изложена на 349 страницах ыашинописи, иллюстрирована 13 таблицами и 56 рисунками.

шоды шоодований

Б исследованиях использовались гладкие мышцы тонких кишок кроликов массой 3-4 кг. Фракцию Ш выделяли с учетом разработок в этой области /М.Д.Курский и соавт., IS73; Д.Невилл, 1979; . Kidvmy et al., 1971; Krall, Korenman, 1979/ ультрацонтркфугиро-

ваниеы в градиенте плотности сахарозы. Количественно мембранную фракцию характеризовали по наличию в ней белка, определяемого методом Лоури /Ьоигу et al., 1951/. Анализ чистоты фракция'Ш, степени ее везикулировашюста и сохранения барьерной фушэдии проводили методами электронной микроскопии, по активности шркср-ных ферментов, связыванию (3Н)-уабаина, по проницаемости для ионов Ca + и по отношению Са/АТФ. Липвдаый состав Ш исследовали в соответствии с рекомендациями Д.Д.Бергельсона и соавт. (1981), Электрофорез мембранных белков в присутствия додецилсульфата натрия проводили по методу /М.Данн, Э.Ыедда, 1979/. Об уровне активности АТОаз судили по скорости накопления неорганического фосфата /RQthbun,Betiach, 1969 /, а такке цотевдаомограческиы методой /А.А.Болдырев, 1977/.

Для исследования связывания, АТС- и натрий-завпсшого накопления кальция мембранными везикулами применяли изотопный, метод C^cacig, до бмкКи /мд; очегчйк sb-4000), метод цотанцпоыетрн-ческого титрования растворомЗГТА н флуоресцентный комплексов Quin -2 (спектрофлуоршлетр Hitaohi sp -850). Использовался " лакже Са2+-селективняй электрод Orion 93-20. Концентрацию ионизированного кальция рассчитывали на компьютера Labten-3003 с учетом констант связывания Са2+ и %2+нуклеозидтрЕфосфатаыи, приведенными в работах /CSulliran, Pexrin, 1964? Fabiato.Fabiato,

- 6 -

1979; Pabiato, 3981/. Процессы накопления и связывания Са2*" фракцией ША останавливали фильтрацией через фильтры Miiilpore о диаметров пор 0,45 ыкЫ.

Исследованио электрической активности гладкокошечных клеток проводили иетодами сахарозных лромеяутков,внутриклеточных и электродов давления /ВЖ^Рыбальченко, 1970; Д.П.Артаменко п соавт., 1982/. Сокращение-расслабление гладкоыышечной ткани регистрировали в изометрическом резине при помощи механотрона СМНС /Jt.M. Зайцев, 1981, 1985/. Бремя сокращения и расслабления, длительность сократительного цикла, индекс ритма, частоту сокращений а коэффициент асимметрии вычисляли по специальной программе для ?л»крокулькулятора "Электроника МК-54".

Для исследований поверхностной активнооти фракции ПМ, зависимости АТФазной активности от экзогенных лвпидов, слияния мембран, реконструкции ионной яроводгаости Ш и каналообразуодих свойств окситоцина попользовали липидныэ ыоноодои, ляносомы и плоские ЕМ /Л.И.Богуславский, 1978; В.С.Гевод, 1978; А.М.0мель-чзнко, 1978/. Чулствптэльнооть установки по исследования моно-рлоэв - 0,1 иЦ/м в 2 ыВ, БЛМ - 0,2 пД. Озвучивание водных дисперсий лшшдов проводила о помощи» 7ЭДН-1 на частоте 22 кГц при силе анодного тока 0,4 А.

Статпотпческув обработку результатов проводили по общепринята цэтодаа /В.Л.Вознесенский, 1969; В.А.Кокушш, 1975; Л.И.Йранцавич, 1980/.

результаты иссвдсваний

I

I. Вндолэпие фракции Ш и связы-в а н п о кальция IЛ .Выделение и характеристика фракции Ш

Выделенная фракция Ш состоит из замкнутых везикул со срол--нлм диаметром 437 ici. Пассивный выход Са2+ из предварительно нагруженных катионом везикул за 15 мин составляет 33,3 ± 3,Ь% что соответствует 7,5 нмодь Са2+/'^ белка Ш и близко к значению выхода кальция из гладкошиэчной ткани в раствор Кребса. АТО-за-висилое накопление кальция фракцией Ш характеризуется отношением Са/АТФ, равным 1,88. О сохранении исходных барьерных свойств Ш свидетельствуй! и данные по определению латентных на+, к+-АТСазной и б'-нуклзотидазной активностей. Указанные активности в

3-69YS "7"

присутствии аламатвцина (0,75 иг/кг белка ПМ), додецилсульфата и холата натрия в концентрациях, ниже концентраций ыицеллообразо-вания /А.А.Болдырев, 1985/, увеличивались на 70-104$. На осно-' ваыии этих данных и данных но связыванию ("Н)-уабаина фракцией Ш в присутствии и в отсутствие указанных модификаторов онредз-лено количество правильно (цитодлазш тической стороной внутрь) ориентированных мембранных везикул, которое 'соотавляет 46¡Z. Из результатов исследований по определенна количества гладкешшеч-ных клеток, выделенных из I г сырой ткани (2,1«Х07), связывании уабаина с изолированными клетками, гомогенатом и фракцией Ш, ' площади Ш одной клетки С44,2«Ю~°см2} и I мг белка мембранной фракции (2*Ю3см2) следует, что из I г пани выход белка Ш составляет 0,44 мг, а полнота выделения плазматической мембраны достигает 24%. Подученная мембранная фракция обогащена основными к ркерами Ш: б'-нуклеотидазой - в 15 раз, Мг^и :га+,К+-АТФа-зами - в 17 и II раз, окситоцин-чувствиталъной Mg2,+Ca^+-AK?a3oñ в 18 раз. Из зависимых от Са2+ АТФазных активностей фракции Ш окситоцин-чувствительная составляет Sl-'^t,. азид-чувствительная - 0,1%, а не,.блокируемая ни окситоцином, ш азидом натрия активность - 2,8 * 0,3$. Последнее свидетельствует о незначительны нше примесях саркоплазматнческого.ретикулуш, т.к. по результатам электрофоретичоских исследований близких по м.м. к миозину гладких шшц белковых полоо не выявлено«

Таким образом,■выделенная фракция Ш представляет собой мембрашше везикулы, характеризуемся близкими к исходным барьерными свойствами и пригодна для исследований ион-транспортных процессов.

1.2.Связывание кальция мембранной фракцией Связывание Са^+ мембраной увеличивает концентраций катиона на границе раздела фаз, изменяьг граничный скачок потенциала", активность мембранных ферментов, электрофизиологические и транспортные параметры, ионную проводимость Ш и др. /П.Г.Костик, О.А.Крышталь, 1981;%"0. Левицкий, IS8I-I987; С.Н.Орлов, 19811986; А.А.Болдырев, 1985; C.JI.Миронов, 1986; Kutsky et al.,1sao; Tomita, 1932; Proogmans et al., 1985;Batra,19Ьб и др./. В связи с этим связывание Са Ш гладкош.саачкых клеток ш исследовали на мембранной фракции и на ткани, учитывая определенное по разности мяэду объемом изолированных клеток и ,объемом ткани од- 8 -

ной навески внеклеточное пространство, значение которого составляет 44,3 ± 2,4$.

Анализ экспериментальных данных показал, что плазматическая мембрана гладаомышечных клеток тонкого кишечника обладает двумя типами участков связывания Са2+: с высоким и низким сродством (табл.1). Количество типов участков и их Кс изменяются в зависимости от условий среды. Так, в отсутствие АТФ обнаруживается третий тип участков связывания кальция. Сходная картина увеличения типов участков связывания п их общего количества наблюдается и при удалении Мв2+из среды инкубации.

Такие изменения в связывании Са2+ в общем совпадают о результатами /Клоаку е* а1.,1980/, полученными на фракции Ш аортн. Однако количество участков с низким сродством не только не уменьшается в отсутствие АТФ, как показали авторы, а значительно увеличивается. Эти отличия можно объяснить, исходя из того, что ыиоцптн тонкого кишечника находятся в состоянии спонтанной сократительной активности, сопровождающейся постоянным АТФ-эависи-мшл выведением кальция из клетки. В случае отсутствия АТФ Ш переходит в состояние "относительного покоя*, о чем свидетельствует снижение и увеличение количества мест связывания катиона ня мембране. Напротив, удаленно из среды приводит к появлению нового типа участков связывания кальция, превышающего по сродству к катиону участки связывания Са2+в присутствии магния в 4,4 раза. Учитывая конкурентные взаимоотношения ионов Мй2+ и Са""1' на Ш гладкомышочтк клеток /П. Г. Кос тек, 1986; В.И.Скок, М.Ф.Щуба, 1986/, можно полагать, что это те участки,с которыми были связаны ионы Нз2+и стали доступны ионам Са2+ после исключения магния из среда. Что же касается снижения сродства к Са2+ в безыагнкевсм раствора обоих типов участков, то это вряд ли можно объяснить конкурентными взаимоотношениями между катионами. Вполне возможно, что наличие связанного с Ш магния обеспечивает более высокую специфичность Са2+-связываицих участков. Замена ионов г'з + каль-.'

идем в этих участках не обеспечивает исходную специфичность ИМ в _ о.

Са - . Следовательно, появление третьего тина участков связывания

" . ОТ

Са в-свзкагнирвои растворе, снижение специфичности существующих в присутствии магния участков связывания и увеличение их количества свидетельствуют, что ионы Са2+ и Мз +в отношении Ш могут проявлять не только конкуренцию, но и синергизм.

- 9 -

Связывание кальция плазматической мембраной тладкомышэчных клеток

Таблиш I

Средь инкубации (в кМ). рВ для фракции'Ш - Сродство Константа Количество мест

'¡Л, для ткани - 7,ч. при +37°С. "участков : связывания, ' связывания,

В скобках - количество спытое. связывания Г* . шоль/мг белка

50 мкг/шх белка Ш, 250 сахарозы, 50 тт-дазол-ВСг., по 5 •АТв, хлорида шгния и азида натрия,'100 мкМ уабаина, I ккМ ок-ситоцина, аламетицин (0,75 мг/мг белка Ш) (18) высокое низкое 2,5«Ю4 1,25'Ю3 60 220

Та se срэда, но без AI® и ингибиторов высокое 1,3'Ю4 26

|.Шаз i (II) низков низкое 1,05*10? 0.БЗ-103 290 220

Зыейто Ш,- Ш>, ЦТ®, УТ5, АД® (20) высокое низкое 2,4-2,6«Ю4 ч 1,1-I0S, . 2,07* 10, 54-62 213-247

Та se среда, но без ионов магния ~ (13) высокое высокое, низков 28 7o 240

Вместо сахарозы хлорид натрия , высокое (II) низкое 2,73'Ю4 0,96« 103 . 51 160 .

Вмеото сахарозы хлорид калия. - (II) высокое . низкое 2,27*10^ 70 292

Ткань тонкого кииечника, раствор Кребоа (7) высокое низкое 2,35*ID4 2,0«I0S 32 • 100 - .

Сродство к кальцию и количество участков связывания катиона на Ш зависит и от одновалентных катионов. Так, в условиях натриевой среды (табл.1) сродство участков связывания первого типа незначительно увеличивается и на 2.Ь% снижается Ко участков низкого сродства. В калиевой среде изменения К0 участков обоих типов имеют противоположный характер. Как видно из табл.1, при замене в оредв инкубации ионов К4" на натрий количество мест связывания высокого сродства к Са2+ уменьшается на 30$, а низкого -почти наполовину. Одним из объяснений наблюдаемых эффектов может быть то, что высокие концентрации натрия, активируя натрий-каль-даевый переносчик, повышают его сродство к Са2+, что и выражается в увеличении К0 участков высокого сродства к катиону. Снижения Кс участков низкого сродства является, по-видимому, следствием конкуренции ионов Иа+п Са2+ за места связывания на мембране. Ионн К* но способны активировать антилортный переносчик (см.3.1), но конкурируют, с Са24 за места связывания на мембране, о чем свидетельствует снижение ородства к кальцию учаотков первого тпоа п значительное уменьшение1 К0 учаотков низкого сродства.

Изменения энтропии процессов связывания Са2+ имеют значения 44-46 К1Шл/моль~*град~*, т.е.лЗ > 0, иож т быть следствием .ряда причин: частичная денатурация мембранных компонентов, связывавших кальций; дегидратация ионов Са2+; конфорыационные изменения уча-, стков связывания катиона. Не исключено, что все три причины имеют место. Кроме того, положительные изменения энтальпия свидетельствуют, что при связывании I моля Са2+ плазматической мембраной выделяется 6-8 ккал тепловой энергии. Используя статдалртное уравнение ар в лН - тд Б, можно легко убедиться, что < 0. Это является строгим доказательством, что для реализации процессов связывания Са2+ плазматической мембраной не требуется кяких либо источников энергии.

Таким образом, количество участков связывания Са2> га в га сродство изменяется в зависимости от концентрации катиона, условия среды, наличия в системе АТФ и что в итоге определяет общее содержание катиона в мембране. Процесс связывания кальция Ш является самопроизвольны!! экзотермическим процессом.

2+

2. щ -зависимая, Сай+-а ктивируеыая АТФаза

Проведенные исследования показали,^ что фракция ЕМ обладает Мй +-АТФазной, уабаин-чувствительной На^Кт-ДТФазной, и блокируемой окситоциком ыа Тса2+-АТФазнсй активностями, значение которых

составляет 120067, 215 ± 40 и 440 ± 60 нмоль Ф„/мг белка.ыин,

• н 1

соответственно, ¿»роме того Ш характерна и экто-АТФазная активность /ШЬвЗ-сЬепко ег а1.,1932/.

Как видно из рис.1, Мв2Т Са2+-АТФаза Ш в присутствии каль-иодулина чувствительна к ионам Са2+ уже при концентрациях Ю~8М. Максимальная активация АТФазы в отсутствие кальмодулина достигается при концентрациях катиона 10"%. Исходя из того, что Не Са +-АТФаза Ш миоцитов тонкой киши является основным компонентом Са-насоса (см.3.2), то ее активирование низкими концентрациями катиона физиологически объяснимо и подтверждается ис- ■ следованиями на гладкомышачных клетках пищеварительного тракта крысы /НеИепа, РороуПсЬ, 1981 /, которыми доказан активный транспорт кальция при его внутриклеточной концентрации, не превышающей I мкМ. Учитывая то, что по результатам наших исследований кальмодулин не проявляет' поверхностной активности, не образует монослои на границе раздела фаз и не взаимодействует с'лшщцшад-монослоями, модно полагать, что его активирующее действие на АТФазу является результатом непосредственного связывания кальмодулина молекулой фермента.

Рис.1. %2Т Сз2+-АТФазная активность в отсутствие и в присутствии (2) 20 мхг/ш кальмодулина, определяемая по блокированию общей активности Ю-6Ы ок-ситоцшюм в среде (мМ): 100, 20 и 5 - хлориды натрия, калия 'и магния, 3 - АТФ и 5 - имидазод-.. НС1 (р&=7,2, 37°С). Белок Ш ' - ьО мкг/мл, инкубация - 10 мин.

О высокой специфичности Ь^^Са^-АТФазы фракции Ш к Са2+ свидетельствуют и результаты исследований при замене ионов Са2+ на ионы барит, и стронция, что приводит к снижению активности "а-половину. Присутствие в инкубационной среде ингибиторов кальциевых токов - марганца,' кобальта, лантана /П.Г.Костюк, 1986/, конкурирующих с Са2+ за места связывания на ПМ, угнетает Са2+-АТФазную активность на 20-405?, а значение кажущихся кон -стант ингибирования составляет 0,45, 0,55 и 0,63 ыМ.

В противоположность высокой специфичности к ионам кальция для !%?+Са2+-АТФазн характерна низкая специфичность к нукдеозид-трифосфатам, концентрации которых, необходимые для полумаксдаа-льной активации фермента, составляют: '3,6* 10-4М дня АТФ, 8,0«Ю^ для гта^.э-ю"4!.: для УТО 0 2,8«1б%для Щф (рис.2).

Рис.2. Зависимость Ькорости гидролиза нукле-оэидтрифосфатов от их концентрации в среде (ыМ) 250 сахароза, 2 -имидазол -НС1,3 и 1,5'Ю"2хлорида магния и кальция.(рН=7,2

37°С). Белок ПМ -50 мкг/ыа г -> о / г з

Аналогичной способностью к гидролизу указанных куклеозидтрифос-фатов обладают и ПМ других клеток / Loteraztajn, РескРГ, 198? /, что, наряду с высокой специфичностью к ионам Са2+, является биологически целесообразным - полнее обеспечивается энергией активный транспорт катиона из клетки. 'Замена нуклеозидтрпфос$атов но вносит, по-видимому, существенных изменений в активный центр

, Са +-АТФазЫ, о чем свидетельствуют результаты исследований зависимости АТФазной активности от температуры в присутствии АТФ, ЦТФ, ГМ и Ш (рис.3).

Исследователям,•занятым изучением транспортных АТФаз, хорошо кзвэстны трудности поиска специфических ингибиторов. До на-зих исследований специфический ингибитор для big +,Са2+-АТФазы М гаюцктов тонкого кишечника но был известен. '

- 13 -

Рис.3. Изменения , Са2+-АТФазвой ак- А% тивности от температуры в зависимости от присутствия в среде нуклеозидтрифосфатов: 1-лте, 2-ЦТФ, 3-УТФ, 4-ГТФ. Среда и.-условия инкубации указаны ь подписи к рис.1.

"Е" """"¿б.....'""""¿о" " " ¿8 ¿;е

Нами устанввлено, что нейрогипофизарный гормон окситоцин, влияющий на ыноматрий, мышечные волокна молочной железы, секреторные клетки и адипоцигы /М.С.Констатинова^.В.Наточкин, 1979; М.Со-ДОфф, 1Р'79; Ю.А.ТОЛКУНОВ, 1937^ Зака1, Ыaзsat0U, 1960; Рореаои е! а1., 1984,1985/ шц-ибвруат мв ТСа2+-АТФазу, но индиферентен в отношении других АТФаз Ш миоцитов тонкой кишки (рис.4,5).

ТГ

■о—о-

¡а

<Н; м;и;

• ф/<ХС/, *

Рас.4. Влияние окситоцина на АТФазную активность фракции ПМ. Среда (мМ): 2-иыидазол-НС13-АТФ, 250 сахароза (для 1-3), а также:

3-ИеС1^1 Ю"2СаС1^1), 3-Са01^2^ ж 3-кг012 (3), 3,100 в 20 -хлориды магния, натрия и калия (4); рН == 7,2, 37°0. *

Рис.5. Зависимость АТФазной активности фракции Ш ог концен

и>

(I) и Са'

2+ (2,3). Среда (ыМ): 250-сахароза, 2-имида-

траиии

зол-НС . , 3-АТФ, а такие: 3-СаС12,(1); З-^*^2), "3-МеС12 и КГ3оксктетша (3). Б- \ по Са2+.

9

Чувствительность АТФазы к окситоцину наблюдается уже при его на-номолярных концентрациях, а при Ю~% гормона способность ионов Са2+ активировать фермент не проявляется и в присутствии ; кзльмодулина.

Структурами Ш,. связывающими окситоцин, как свидетельствуют исследования на миометрий / А1ехап<5гота, Зо1о£Г, 19ВО;.Зо1с^г . et аХ. ,1983/, являются рецепторы, что, по нашему мнеггсп, по исключает возможности взаимодействия гормона непосредственно с молекулой АТОазы; Гормон кнгибирует фермент Ш миометрйя на 50^ з концентрации 0,5 нЫ, что является величиной одного порядка с Кс окоптоцдаа рецепторами Ш / Акегиап, ТТ1кв^от, 19795 Зо1о*Т, Зчео^, 1982 /. Однако оэТой:точки;зрения.нелвзя обвяоиить инги-бпрухшй эффект ов^птоцина в наших исследованиях, который но зависал от ориентация {¿собранных везикул. В связи о этим мы предположили участио лшшдов мембраны в связывании тормоши_______

Рас.б. . Исканапко мссфазного патязеши (А), и ГСП (Б) нра,вводоний а субфазу ( 10К01 , б мУ трйс- П01рН в 7,2, 22°С) оксвтоцп-па: чистая (I) а занятая азолэктн-цоВ12ла цояосаояаа (2,3) п попосло-сн пз фракции Ш (4) повэрхность электролита. I - 4 - раочати адсорбция горняка па поЕТфхнооит V раздела фаз.

«пв

Как видно кз рзс.б, веодонио' В субфазу гормона в концентрации 10~% вызывает резкое ловыпзниэ граничного скачйа потенциала (ГСП) п образование окситоцинового моносло'я о поверхностным давлением около' 10 мй/и п значением адсорбции ЗД'ЗХГЧ,?/«2. При наличии агодектпнового монослоя на границе раздолз фаз взаимодействие фосфолшшдов о гормоном пабладается'при шнотлоляршпс кошен-трацишс шслоддего,. о чем свидетельствуют уз сличение поверхност-

-15- ' '

кого давления и ГСП. Площадь ыонослоя, на которой располагается встроившаяся молекула окситоцина, составляет 3,24 ц 5,76 щ2 для • растянутого и плотного слоев', соответственно; Уровень адсорбции, окситоцина в случае взаимодействия последнего с монослояш из фракции Ш составляет 5,6*10М/м2, а'площадь монослоя, прихо-дяеяяся на I молекулу гормона, составляет около 3 нм2.

Из приведенных данных следует, что гормон монет, внедряться . в лихшдный штрикс Ш за счет'свойственной'ему поверхностной активности. Увеличение адсорбции окситоцина на монослоях из фракции 'Ш (по сравнению с азолектиновцми монослоями) свидетельствует, что некоторая часть молекул гормона . взаимодействует с мембранными, балками. Молекула окситоцина, благодаря взаимодействию с ди-падшля, по-видимому, приобретает такуп конформацию, в которой способна связываться с рецепторами (или с молекулой АТФазы?), что и проявляется в'ингибировании Kg2+, Са2+-АТФазной активности фракции Ш, независимо от ориентации мембранных везикул. Изложенное подтверждается исследованиями блокирования Mg2+ , Са2+-АТФа-. зы ПМ при внесении в. среду липосом, предварительно проинку фгро--ванных с окситоцином (табл.2). О том, что ингибирущий эффект на АИазнув активность оказывает связанный с лидидами липосом (а не накопленный во.внутршшпосоыальном пространстве)'окситоцин, сви- ': детельствуют данные опытов о'применением додецилсульфата-натрия. Из'данных следует, что оконтоцин взаимодействует с липидами би-" слоя липосом, приобретает определенную конформациз.и при взаимодействии и слиянии липосом с мембранными везикулами блокирует' Са2+-зависимун АТФазнуи активность Ш,

АТФазная активность фракции Ш изменяется в условиях инкубации мембранной фракции с липосомами и детергентами (табл.2). Кривые зависимости АТФазной активности от концентрации ленидов имеют макет,при концентрации последних 250-350 ккгДш. В известной каре это могно объяснить тем, что азолектин содераит сравнительно большое количество (16$) лкэопроизводных /letters, 1954 /, а в наших лкпосомахэтот показатель был еще выше, т.к. прн ультразвуковой обработке липидов ( а шганно такта методой мы получали лклосомы ) количество лизосоадпнений увеличивается • / Kauser,1971 /. Исходя из того, что лизолкпиды стыдулвруит ели-янсе биологических и искусственных мембран Д).В.Соколов, В.К.Лкзэ-ко, 1979, I960/ путем дезорганизации лнпидного бислоя, можно

Таблица 2

Изменение Mg2+, Са^-АТФазной активности фракции Ш под влияние?« липосом из азолектина, проинкубированных о окситоцином (за IOOJi принята активность в среде без модификаторов).

Активность в % (средние значения 4-8 измерений х)

Ср&дз J Среда без кальмодулина, с калылодулинсм

Без модификаторов Азолектин

Сосфатидплхолпн {Ох)

Смесь аЗолектина и холестерина 150/150 мкг в «л

Общие лицида мозга'быка

Додецилсульфат натрия

Азолектин + ДСЙ

Азолектин + Ю-6 М оябитоцпн

Оосфатидилхолин + Ю-6 Ц окситоцин

Смесь азолектина и & + Ю~6 !.1 окситоцин ,

Общие липидн + I0"6 Ц окситоцин

Азолектин + I0""7 U окситоцин

Азолектин + I0"7 U окситоцин + ДСН

Азолектин + 10"® !! окситоцин

Азолектин + 10"® ?! окситоцин + ДСН

Азолектин + 10""® М окситоцин

Азолектин + 10""® М окситоцин + ДСН

Супернатант-посло осзтшогая липосом, преиЕз^убаровзшшх с 10~5 ц окситоцином

х Среда инкубация (?з!.1): 100, 20 и 5 -хлориду натрия, палия и кзтяяя, З-АТЗ, 5-нмтдазод - hsi, 20 *!гЛ о0сх2 ;-р!Ь7,2, 37°С.

, Са2-.-АТС'азиая ахтиЕНость определяясь- по разности гюдцу активностью л указанная сродо и активностью в присутствии 100 ивЦ окситоципа. Липосотлы инкубировались в указанной среде.

. Модификаторы: Лшшды - 300 мкгЛй;1

100 210

160 250

145 250

120 190

60 160

120 220

180 -

0,0 0,0

0,0 0,0

0,0 0,0

0,0 0,0

0,0 следа

0,0 0,0

70 115

75 НО

130 200

140 190

100 205

считать фузогенные превращения в везикулах Ш о дайн из факторов изменения активности АТФаз.

Активирование мембранных АТФаз заключается и в неспецифи-чеоком ю отношению;к белку влиянии екзоганннх лшшдов на фазовое" состояние лшшдаого матрикса Щ. Об этси свидетельствует то, что липосоыы из яичного фосфатидилхолша оказывавт эффект,.по добшй таковоцу азолектина. В то же время ультразвуковой диспер-гат дшаальмитоилфосфйтидилхолина, характеризующийся высокой * (42°С) температурой фазового перехода /О.А.Грачева и соавт., 1979/ и остатками насыщенной пальмитиновой кислоты, угнетает . АТФазную активность на 20$, по-видимому,'за счет снижения подвижности липидных компонентов .биологической мембраны. Еще больше снижает активность АТфааы холестерин., эффект которого снимается альбумином, что подтверждено такке в исследованиях на эрнтродп-. тах и.тромбоцитах /Б.А.Бородин,1986/. Эффект белка объясняется образованием комплексов альбумин-стерин и удалением последнего из мембраны.

Обращает на себя внимание в то, что кривые концентрационной зависимости АТФазной активности Ш гладкоышаачных клеток в присутствии азолектина и различных детергентов близки по своим характеристикам. Зависимости АТФазной активности от концентрации катионных, анионных и неионных детергентов близки по своему характеру, а при концентрациях .3-7*10~®М (на порядок шве их КШ-/А.А.Болдырев, 1985) (.приросты удельной активности составляют 32, 35 и 30$ дяя ДСН, тритона Х-100 в ЦТАБ, соответственно. Учитывая изложенное и то, что при указанных, концентрациях детергентов теряется устойчивость азолектиновыг £Ш, что используемые ;вещоотва обладают различным строением п знаком заряда,'а также гндрофаль-но-липофильным балансом в интервале 12,5-14,5; характерным дая солюбилизирувдих'мембраны детергентов / Не1еп1ио, 31оопа, 1975 / и обеспечивающих функционирование АТФ-фосфогидролааной активности, например, Са-АТФазы СР / МзЬгипот, дыпо7а,19во /, моано объяснить их действие повышением проницаемости ПМ миоцитов,изменениями жидкостности гидрофобного окружения формантов и поверхностного натяжения на граница раздела фаз Ш-ра створ электролита.

Следовательно, по основным характеристикам Ыв2+, Са2*-АТФаза ИМ миоцитов тонкого кишечника аналогична маыбранным"Са2+-активируемнм АТФазам других объектов. Вместе о тем следует1 отмэ-

- 18 -

'тйть, 'что исследована АТФаза функционирует в двух состояниях, ' отличавшихся. как по сродству к ионам Са , так и по значениям удельной активности* Mg2+,. Са2+-АТФаза Ш активируется кальмоду-лшотл по механизму повышения/сродства фермента к кальции, азолек-iimoîi, ¿тдшшдуальннмп лшшдами ц детергонтами - благодаря фузо-гонной активности перзих й нарушении барьерной функции мембран последними.- ингибиронгтио окситощшом Us2+, Са2+~АТФазы фракции ' TBl о различной оршпаидей шдбрашшх везикул о учотсм поверхностной активности гораойаг ого взаимодействия о лшюсоьйыи, лшшдян-ми мойосло.'ши а монослониа^ ' сфораированни'я из мембранной фракции, свидетельствует о то:.1, что Г эрзичшп^ процессом связывания о мембраной является йзаийодаЕствшз ¿голекул пеггпузз с молекулами ли-Пйдного'штрикса* , ..

3. 3 и в о д о н и о к а л ъ ц п я. из

'.■-':. д й.о & « и очно й к л о т к и

3.1*ШтриЙ-кайБЦйовый обмен 1

Одни из путей выведения Са2+ из клетки является -Са2+~ обмза. Зтот процосо достаточно хорошо изучен на Ш скелетной и сордзчкой шзц#- нервных' волокон* форменных элементов крови. Ita-фбр^ашш 6 нэхапшзьай подобного антйпорта ионов в гладких мышцах вескла ограничен, а результаты, полученшэ на мйометрни /С.А.Кос-Tôpniî». ÎÎ.JI.IÎypôiînËè 1935/». свздетольствуат о Ого 'элоктронойтраль-• поста. ■''••; ..' •.'•■.;'

Дроведз1ашэ()п^,а йса"эдог,а!П!л как с применением изотопного метода, так' а Са^-солактизкого. олшетрода показали, что в безнат-риовоЙ ородэ, содержащие хлорид натрия мембрйнные везикулы способны накапливать кальций. Иатопсивпость антипорта зависит от знут^ивазикулярной кошинтрацна натрия (рис.7), т.о. двпзувдой силой процесса является натриешй градиент, создаваемый на Ш в фи-зйодогических условиях Ко -насосом. Скорость' накопления Са2+ везикулами зависит тапга-'з от ого содержания в инкубационной среде (рис.8), достигая ?,якс игольного значения при концентрация катиона 30-35 их!,!. Как видно из этих двух рисунков, скорость антипорта значительно вкко в калиевой среде о 2-3 wcM валнномицшш.

Представленные результаты монпо объяснить том, что увеличение накопления Са2+ везикулами в присутствии валиномищша обусловлено мембранным потенциалом (ГШ), генерируемым в калий-валиномици Новой средо . В таких условиях, как это видно из рис.9, создается

G-69Yf - 19 "

потенциал со знаком

внутри везикул, возрастает макотидьная ; скорость обмена, но на изменяется сродство переносчика к каль-

ТГМЭТ ( rtwft .я ль к' ттп По2+_ on ttvM - . • t ' '■-■•-' : >

t

f лЗ

'A

о А

в

«

• <♦

V

«

<1 : ^ ; aèry

чи си <t» 4< 0,f

: . SÄT ; '^V

- Рис.7.Зависимость Ha+-Ca2+-обмена фракции Ш от концентрации

внутривазикулярного Ha (I), вневезикулярного Иа (2) * калия '

(3). В-валиношщин.З мкМ, Среда инкубации : 50 Ш имвдазол- HCl, 250 ыМ сахароза, I до белка'Щ/ш. Время инкубации 2 минуты,' Увеличение вневезикулярнай концентрации- хлоридов проводилось sa c4ei ■".. соответствующего уменьшения концентрации сахарозы. Для 2 и 3. 125 ыМ Нас 1 внутри везикул, рЕ=7,2, 37°С.В среде 30 мкМ CaCJ^.

Рис.8.Зависимость натрий-кальциевого обмена фракции Ш от концентрации Са2+. Везикулы содержат 125 li.i lioCl. Среда и условш инкубации представлены в подписи'ic рис.7. 1-250 мМ сахарозы; 2-125 ыМ К01+ з ыкМ валшегоздина, 3-125 ыМ HaCl.I* ,2'-выход натрия в среду с сахарозой'и"с KCl + валиноыицин, соответственно. Б~ расчет.К^ дая соотватствуювдх кривых.

Аналогичная зависимость обмена от Ш наблюдается на фракции Ш плеток сердечной и скелетной мышц," на нервных волокнах, нейронах и гладкомышачных клетках мочеточника /Г.В.Максимов и соавт., .1386; С.Н.ДаДалян, 1987; Вега et al.,. 1980;'Phylipson, Hishimoto, ' - 20 -

1985;-''.Й1ок1п вt в!., 1984./* Вмсв*е!е.чтем"рядом исоледовате-лвй сообщается об яёэлвктрогешости, Иа+-Са2+-обмвна Ш гладко-

шпбч^' клаток',' нацршер,ао|1т1гУ МогеГ, Во«га1ш1, 1934 / и

шоматрй.УСД.КоЬтарШ1, М.Д,КУрок1гй4 1985/*' ■ -

•; Рве,9.Изменена? концонтра-1Ш ф9Н1ищикарбау1щвглбораш : • (£кб)' В' условиях .создания на . '. мембране везикул Ш концентра-цйоепых градиентов 1саЛ2й> нат-, £ия и калышя. Среда инкубация содоргала 50 Ь'Д трис-Ш1 (рйь' ■ . (р&6,8,- 22°0} ; 100 нМ фкб; ; , • ■ 100 &№•' бёлка Ш/мл. 1-125 мМ • хлорйдщ калия Ейугра н снаругп везикул; 2-калай снаруки, 250 ¿¿! сахарозы ййутри возккул;. 3-по 125 !,;?,{ хлоридов -га^гия •' а - V натрйя, соответственно, снаружи й'.в'щгтра войпкул; 4,5-125 ¿лорйда натрия внутри и 250 мУ сахароз;! спаржи ьбзпкул (в олучао 5-в среде 40,мк14 хлорадй кальция).- А, В-иопофора: А23187 иГвалийомшиш' (2цкМ).

; Проводешшо нами. исследования показали, что в отсутствие Коноша в'сйдо'отйопршзо количества вышедшего из везикул натрия« 1!ак6пло,1шоиу. кальщ!о (для различий: концентраций последнего а среде) йарьируот от 1,9"до'2,25. Такое отношение соответст-дуот; стёхиоиэтрйп обжога 1Са : 2"Поп свидетельствует о его элек-трояой1ральности.. Еслп ко среда б ¿лоридом ¡калия оодарайт вали-ношщш, такоо отповепио возрастает от, 2,27 до -3,12 и соответствует1 стехиометрии 1Са 3"Па", С уч'етом данных по генерации мп на мембранах везшф! Ш (рис.9) и стехиометрии антшорта моано сделать заключенно' о. том, что На* -Са2+-обмен в гЛадкошшечных клетках кпарчншса мокет функционировать как в электронейтральном, так и в электрогенном режимах, ' . , :

Характерно, что накопление кальция везикулами Ш возрастает в начальный период йнкубации (рис.10) и снижается после 2-ой минуты, как в среде без валиномийина, так и в присутствии .! пояофо-ра (что,кстати, совпадает о временными характеристиками изменения Ш, представленными на рис.9). Такое снижение натрий-зависимого

-■21

Oí

накопления Са*т посла достижения максимума процесса можно объяснить следующими причинами. Во-первых, снижается калиевый градиент на мембрана в результате диффузии катиона внутрь везикул, j что происходит быстрее в присутствии валиномицина,.Во-вторых, в", процессе антипорта уменьшается натриавый градиент, г.'в.'-уманьш-ется движущая'сила антипорта, что такнэ происходит быстрое в"■ среде с валиноыицаноы. В третьих, в результате накопления везикулами кальция создается возможность' генерации "кальциавого" МП • противоположной полярности, потешдалу, создашюму при'внесении валиномицина в инкубационную среду с хлоридом калия. Этот потен- ' шал моает снижать'не только накопление Ca2t везшудаш, но и стимулировать отток катиона во вневезикулярную. срэду.

Если изложенные рассуждения верны,-то в условиях образования МП должны увеличиваться как начальная' скорость ' обмена ? так'. ' и "кальциевая емкость" везикул. Действительно, образование Ш в -' нрисутствии валиномицина увеличивает начальную и шксЕкальнз®'.' скорости обмена на 25 п 50$, а емкость везикул - на 35^ (рис.8,6 и ю,б).

Рис.Ю.Зависимость натрий- ' кальциавого обмена от времени ин- > кубации везикул ПМ: 1,3- в.среде' Д 125 мМ KCl (в случае 3 - + мкМ валиномицина); 2 -125 мМ HaCl. Везикулы содержат 125 tôl хлорида натрия. Другие условия инкубации ' указаны в подписи к рис.7. Б-расчет начальной скорости обмана и "кальциевой емкости" фракции ПМ.

i « < » <

г ; ■ » а п

Эти нзисления скоростей обмана и емкости возккул шгуг'быть-. "следствием наличия в молекуле (тдаолеедларной структура 7) переносчика ионогешшх груш». Из втого следует, что с учетом сбщиг ааконсыарЕоотей функционирования переносчиков /АД.Болдырев, 1985} HosiVu 1981 /в нашем конкретном случае выход и еход Ca2+s измеренные везикула против ковдентрацрошюго градиента ейтрк$'дашш

■ - 22 - ' : ' 4

обладать близкими кинетическими параметрами, И действительно, выход Са2"1' из везикул, проинкубированных в среде с 0,5 мМ хлорида кальция зависит от концентрации натрия й среда инкубации и снижается при введении валиномпциш в калиевую, a моненсика в натриевую среды. Эти данные являются прямым доказательством обратимости антипорта, что подтверадается злектрофизиологическими исследованиями на мшцах / Hume, Uehara, 1986; Kimurn et ol., 1986;' Smith, 19S6 /, в которых зарегистрированы входящий кальциевый и выходящий натриевый токи, обусловленные функционированием натрий-кальциевого обмена.

Кро:ло излоаенных параметров, антипорт натрия и кальция в гладкой мышце характеризуется угнетением при внесении в среду ионов кобальта, марганца, магния, лантана. Причем, это угнетение обмена mosot быть как конкурентным, так и неконкурентным в зави-симостию от места прилозения ингибитора. Так, например, если ионы кобальта взаимодействуют с Ш со стороны приложения Са2+,наблюдается уменьшение почти в два раза сродства антипорта к катиону. Если кобальт действует ка Ш со стороны натрия, снижение скорости антипорта обусловлено снижением максимальной скорости процесса без изменения сродства переносчика к Са2+. ,

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют, что для ПМ гладкоиышечных клеток тонкого кшечника является характерным На+ -Са2+-обмен, скорость которого зависит от концентрации Са2+, натриевого градиента и МП. Так как в физиологических условиях натриевый концентрационный градиент направлен внутрь клопа, ап-типорт постоянно выводит Са2+ из клетки, внося свой вклад в сня-аение внутриклеточной концентрации катиона. Выведение кальция нутом антипорта активируется ЫП с полсзителышм знаком па внешней стороне ПМ клетки в состоянии покоя. Исходя из этого можно полагать, что На+ -Са2+-обмон в гладкомышэчной клетка является электрогешш в период покоя клетки. При деполяризации Ш, так и в период ее реполяризации функционирование антипорта сдвигается в сторону элоктропейтральпоста.

3.2.АТФ-зависишй транспорт кальция АТФ-зависимый транспорт Сг + в гладкомышочных клетках топкого кишечника осуществляется за счет энергии гидролиза АТ5 «g2+ , Са2+"-ЛТ2азой Ш, как это следует из результатов исследова-

- 23 -

aufc, представлении* ua рис.II. АТФ-эависшый транспорт катиона составляет 21 ± 3,2 вмоль Са2+/мг белка-ЗО'ыив.- Из рисунка видно, что самая высокая скорость накопления кальция наблюдается в первые минуты инкубации - на 1-ой минуте мембранные везикулы накапливают до катиона от величины максимального.накопления. Полученные нами результаты близки к результатам аналогичных исследований иа фракции ПМ желудка свиньи / Wuytack et al.,1981 /, шшросомах клеток тонкого кишечника морской свинки / Chaturvedi et al.,1979/, и на фракции ПМ из волокон седалищного нерва лягушки /Г.В.Максйыов и соавт., I98G/»____

Fuu.II. Изшнеяия АТФ-завкси-мого накопления Са2+ везикулами ПМ ■ ог времени инкубации (А) и от концентрации кальмодулина (Б). Среда инкубации (ыМ): 250-сахароза, 50-шодазод- НС1, 5-АТ6,'5-MgCija 20 икЫ СаС12 (рй=7,2, 37°С), а так-ке: 20 мкг/мл кальмодулина (I), кальыодулин и 5*Ю окситоцина (3), окситоцин, но без калъыодулши (4); 5-среда без АТФ, окситоцина и каль-кодулина. 100 мкг белка Ш]ш.

i s

Активный процесс накопления кальция мембранными везикулами является кальыодулин-зависимыы, максимум накопления достигается при его концентрации 20-25 мкг/ыл и составляет 28 - 3,5 нмоль. Са2+/мг белка-30 шш. Сравнение характеш активации кальмодулин-ном АТФ-аависимого транспорта Са2+ и Mg Са2+-АТФазной активности Чсы.2) свидетельствует, что оба процесса имеют сходный характер и близкие концентрации кальыодулина, при которых наблюдается максимум активации. Однако, ^независимо от присутствия каль-ыодулина в' среде, окситоцин блйкирует АТФ-зависиыое накопление Са' f везикулами ПМ. Эти данные " явились основанием д"я проведеная серии опытов но исследованию влияния этого гормона на оократи-тэльнуо' активность полосок тонкого кшавчника. Идея исследований заключается б тон, что если, окситоцин блокирует Mg \ Са- -АТФаз-нуГ) активность и АТФ-зависимий транспорт Са' + (т.е. Са-насос Ш), то введение гормона в окружающую среду должно привести к усилению ' " "' - 24 -

сокращения ткани за счет увеличения внутриклеточной концентрации кальция. Как видно из рис.12, оксигоцин в концентрациях, близких к физиологическим, вызывает тоническое сокращение мышечной полоски, аналогичное сокращению миометрия /Ы.Солофф, 1979; оыг е\, а1.,1931 /, что свидетельствует в пользу возможности регуляции пептидом сокращения гладкомшечной ткани за счет блокирования Са-насоса.

Рис.12. Влияние окситоцина (10""%) на сократительную активность полоски тонкой киши кролика в растворе Крабса. р1Ь7,4, 37°С.

Однако п приведенные данные на давали ответа на два важных вопроса..Во-первых, о учетом пнгибирующих эффектов в поверхностной активности окситоцина, неизвестной оставалась ориентация пептида в Ш. Во-вторых, оставалось непонятным, почему в присутствии окситоцина сокращение п расслабление гладаоыашечша клеток продолжается в том же секундном диапазоне времени, хотя полупэриод "жизни" гормона в плазме измеряется минутами /; О.С.Папсуович , . И соавторы, 1986 ; Еака!, Ма0оа18и, 1980; Рореаси е! о1. Д984; Ва4го, 1986/ и концентрация его в крови величина постоянная. В связи с этим, а также исходя пз наших данных по инициации окспто-одном выхода Са^ из мембранных везикул в среду о сахарозой или хлористым калием, гш предположили, что пептад монет не только взаимодействовать с лишщшм матриксси ПМ> но и образовывать ионные каналы в мембране.

Как видно из рис.13, оксигоцин приводит к увеличении проводимости гак азолектинойой ЕДМ, так и ко?яшекса ВМ-ЕЛМ. Эти данные свидетельствуют, что молекулы гормона встраиваются в мембрану с образованием ион-проводящих га на лов. Амплитудно-частотный анализ токовых флуктуаций при концентрации окситоцина М~5М показал, что по проводимости ионные каналы колеблются от 10 до 140 ИСм с пре-

- 25 -

обладанием двух грунн каналов: 20-30 и 90-110 пСм. Асимметрии -ность и характер токовых кривых свидетельствуют о том, что образованные каналы способны находится в закрытом и открытом состояниях и это состояние каналов зависит от потенциала на мембране. Отрицательный потенциал на маыбране со стороны введения оксито-цина не изменяет время кизни канала, в то время как полояитель-най потенциал при его градуальном увеличении уиоцыиа&т время су-щестоваиия канала в открытом состояния, а при + 100 мВ. канальная проводимость блокируется. Вольт-амперные характеристики азолек-тиновых EJLM, модифицированных I0_br.i оксиюхщна асимметричны. Рассчитанные из этих кривых проводимости в среде с KCl,CaCl2 и Ва012 значительно меньше зависят от отрицательного напряжения с цис-стороны БЛМ и резко изменяются при положительном напрякении, что качественно совпадает с результатами исследований /О.В.Красиль-: ников и гоавт., 1983; Р.З.Сабиров, 1986/, проведенных с использованием фосфатидилсериновых мембран.

Рис,13. Изменение проводимости БЙМ (2-7) и комплекса Ш-БЛЫ (8,9) под влиянием оксито-I-среда баз окс&тоцнна;

9

2-6-окситоцин в концентрации 10 , Ю-8, Ю"7, 5«Ю~6 и Ю_5М, соответственно. 7-9-10~^М окситощша, 2-6,&-цотенциал на мембране 50 мВ ("-" со стороны добавок окситоци- ■ на), 7,9 - +100 мВ. Среда: 100 мМ ксх, I f.i.i CaCie,2 мм ¡агадазол-HCi (рН=7,3, 22°С). Стрелками слева -внесение окситоцдаа,-справа - переключение напряжения на

положительное.

Щ'

J/Pl.

M I ' U«

Если,исходя из представленных результатов, предположить,что оксптощш в'виде ионного канала может оказывать ингибирувщеэ влияние на Са~насос только в открытом состоянии, тогда мы нахо-

дим ответ на вопрос, почему гладкая мышца способна сокращаться в присутствии гормона: окситоцин меняет свой ингибирующий эдйект на Са-насос в соответствии с изменением Ш на плазматической мембране. Т.е. окситоцин, внедрившийся в лпппдный матрикс П?Л, блокирует АТФ-зивисимое выведение Са2+ из клеток только в период ее возбуждения (в период генерации Щ и сокращения), что соответствует отрицательному потенциалу на комплексе ПМ-БЛМ со стороны введения окситоцина.

.Таким образом, противоградиентный активный транспорт кальция плазматической мембраной гладкошшечных 1слеток обеспечивается ме2+, Са"*+-АТФазой, которая является основнш структурным компонентом Са-насоса. Кальмодулин, путем'повышения сродства насоса к катиону активирует транспорт кальция. Специфическим блокатором 'транспорта является окситоцин, внедрташийся в липидный ыатрикс ПМ, эффективность которого определяется трансмембранным электрическим потенциалом клетки.

3.3.0 мощности Са-насоса и натрий-кальциевого обмена

Исходя из представленных результатов следует, что выведение ионов Са2+ из гладкошшечной клетки осуществляется Са-насосом за счет энергии, освобожденной при гидролизё АТФ мембраносвязанной м32+ Са2+-АТФазой, и' Na+-Ca' -обменом за счет энергии натриевого градиента. Однако оставался нерешенным актуальный вопрос, достаточна ли мощность Са-насоса и На+-Са2£обнена для обеспечения внутршслеточной: кощентрации Са2+, способствующей расслаблению клетки.

Чтобы ответить на этот вопрос, ш исследовали сократительную активность полосок тонкого кишечника кролика б изометрическом режиме при помощи механотрона 6MXIC /Л.М.Зайцев, 1981, 1985/ и провели соответствующие расчеты. Полученные з экспериментах данккэ и вычисленные параметры'-представлены'в табл.3, из которой видно, что время расслабления полосок тонкого кишечника колеблется в пределах 3,7-4,1 с; Для упрощения расчетов мы приняли зту величину за 4 с. .

й '• " При 'определении мощности путей выведения кальция из клетки мы исходили из следующих данных. Выделенные нами мембранные везикулы имеют средний'диаметр 437 mi. Объем одной везикулы и площадь ее поверхности составляет 4,46,10~^шох и 6,03'Так как средний обьем возикул I мг белка плазматических мембрпн равен

14,3 мкл (что совпадает с данными других авторов - М.В.Астапова, Г.А.Бобкова, 1980; Огоуег а1.,19В0/, количество везикул I мг белка Ш составляет 3,2'Ю**, а их общая площадь достигает 2*103см2. Исходя из определенной нами средней площади одной гладкомышечной клетки - 44,2,10~6 ¡см2, количество клеток, из которых выделяется I мг (по белку) плазматических мембран, составляет 4,41,107, а с учетом процента выхода мембран - 4,9»Ю7,

Таблица 3

Параметры сократительной активности полосок тонкого кишечника кролика

' \ 1 Параметр Единицы Значение

измерения параметра

_____________________(£ О.ОбГ.

Время сокращения Время расслабления Интервал между сокращениями Длительность сокращения Длительность сократительного цикла Индекс ритма Коэффициент асимметрии Частота сокращений

секунда 1,7 * о,1

секунда 3,9 £ 0,2

секунды 0,2 ± 0,05

секунды 5,6 - 0,3

секунда 5,8 ± 0,4

усл.ед. З.б.'Ю"2* 2,1'Ю""3

усл.ед. 4,3'10~1± 0,5'Ю"2

в I мин 10,43 ± 0,1

Внутриклеточная концентрация ионов Са2+ в период сокращения -расслабления гладкомышечной клетки изменяется с 10"^ до /В.А.Бурый И соавт., 1986; Рг11;с11агс1, АяЫву, 1986; 8иа1то*о, Киг1уата, 1986/, а с учетом среднего объема клетки (1670 и 2760 мкм , соответственно в периоды сокращения н расслабления) плазматическая мембрана выкачивает во внешняя среду за период расслабления (4 сек) 37,71«10""^М ионов кальция. Количество кальция, вышедшее за период расслабления из 4,9"КУклеток составляет 18,5 нмоль. Если выход кальция из метки в период ее расслабления происходит с одинаковой скоростью, то за I сек это количество катиона составляет 4,63 нмоль/мг белка Ш. Однако сравнивать эту величину со значениями АТФ-зависимого накопления кальция фракцией ПМ, представленными на рис.11, нецелесообразно по следующим причинам. Как видно йз графиков (рис.14,6,1,2), начальная скорость

АТФ-зависимого накопления кальция мембранными везикулами по исследованиям процесса в минутном диапазоне даже в присутствии кальмодулина не превышает 0,3 юдоль Са2+/мг белка-С, хотя значительно выше, чем на мембранной фракции миометрия /С.А.Костерин, Н.Ф.Бурчинская, 1987/.

Рис.14. Накопление кальция везикулами ПМ. 1,2-натрий-каль-циевый обмен в отсутствие (I) и в присутствии (2) градиента натрия (2-80 мМ Nací внутри везикул); 3-АТФ-зависимое накопление кальция. Б-расчет начальных скоростей накопления кальция в соответствии с кривыми 1,2 (рис.11) и 3 (рис.14).

Мы предположили, что определенные нами значения начальной скорости АТФ-зависимого накопления кальция мембранными везикулами являются^ кажущимися, они занижены в результате постоянного выведения катиона из везикул -Са2+-переносчиком и диффузии по градиенту концентрации. Соображения к такому предположению следующие. Допустил, что за 2 мин I мг белка ПМ АТФ-зависимым путем накаплиавет ГГнмоль Са2+ (рис.11). "Уже при таком значении накопления внутривезикулярная концентрация кальция будет превышать вневезикулярную почти в 40 раз (7,7» 10""% внутри и 2*ТО"*5 снаружи везикул). В таких условиях активируется Иа+'-Са2+-переносчик, как минимум по трем причинам. Во-первых, антипорт может обеспечивать перенос катиона'как в одном, так и в противоположном направлении (см.3.1). Во-вторых, указанный переносчик может активироваться ионами Са2+ в отсутствие ионов натрия и обеспечивает, по-видимому, Са2+-Са2+-обмен.' В третьих, т.к. уже на второй минуте АТФ-зависимого накопления Са2+ внутривезикулярная концентрация ка тиона больше вневезикулярной, создаются условия для генерации мембранного потенциала со знаком "-" внутри везикулы, что; как следует из рис.8 и 10, способствует ускорению транспорта катиона и переходу антипорта в элоктрогетшй режим.

В связи с этим мы исследовали АТФ-зависимое накопление Са2+

р.

мембранными везикулами с помощью Са -селективного электрода (рис.14, кривая 3), который позволяет 'непрерывно измерять изменение концентрации катиона. Из рисунка видно, что скорость процесса довольно высокая и за время расслабления гладкой мышцы' ". мембранные везикулы способны -накопить около .4 шоль Са2+/мг бел-га. Начальная скорость АТФ-зависимого накопления Са2+, рассчитанная по экспериментальным данным в первые секунды накопления,составляет 2,05 нмоль Са2+/мг белка*С. Исходя из этой величины и с уче ом процента ориентации мембранных везикул выведение Са2+ из деле тки АТФ-зависимым путем за 4 сек составляет .15 нмоль/мг белка. Этст процесс усиливается кальмодулином (рис.II, 14), которого в гладко?,'шшечной клетке достаточно много - около 40 mil /Grand et ai*> I979;Somiyo et al., 1983 /. Кроме того, в нормальных физиологических условиях Иа+ -Са2+-обмен такке обеспечивает выведе-нио Са из клетки с начальной скоростью, как это видно на рис.10(6), около I нмоль Са2+/мг белка*С, что за время расслабления составляет 4,32 шоль катиона. Значение АТО-зависимого транспорта катиона в сумме с транспортом посредством антипорта ( в соответствии с начальными скоростями процессов) составляет за время расслабления клетки 19,32 нмоль/мг белка*4 сек, что являете ся соизмеримым со значением количества вышедшего 1сальцця при расслаблении гладкошшечной клетки.

Таким образом, в физиологических условиях мощность Са-насо-са и На+-Са2+-обмена вполне достаточна для.обеспечения расслабления гладкомышечной клетки. К аналогичному выводу ъа приходим и на .основании другого способа расчетов, используя для этого полученные на мембранной фракции данные по .связыванию (^О-уабашш, по АТФ и натрий-зависимому транспорту кальция плазматической мембраной.

4. Взаимодействие, фрагментов плазматических мембран с искусственными липидными мембранами

Воспроизведение функций Ш гладко;,шшечной глотки на БШЛ является актуальны:.! с той точки зрения, что это позволило, бы изу- -чать механизмы регуляции активного и пассивного транспорта ионов на одной модоли в условиях контролируемой среды. В связи с недостаточной изученностью указанных процессов и тем, что имплантация

фрагментов Щ гладкомшечия: клеток в БЛ?Л вообще не проводилась, рог.спструг дш менбрашгах компонентов и воспроизведение их отдель-пнх §7шщий'на искусствешнх лишщшх системах сопрянена со значительными трудностями, обусловленными эширизмом в выборе способа 'реализации конкретной идеи. В этой связи ванным является исследование липидного состава, поверхностной активности'биологической мембраны и ее взаимодействие с искусственными мембранами различного уровня организации.

- .• '4,1.Липцшшй состав и поверхностная активность . . \ плазматической мембраны

Из представленных в табл.4.результатов видно, что липидный состав Ш! гладко1«шпачпнх клеток в общем на отличается от таково-' го Ш других клеток '/И.Д.Курский и соавт., 1981/. В то ке время о бра сд от га себя внимание' высокое содержание сфингомиелина, холестерина-и глттолнпндов. Интересным на наш взгляд является и факт обЕарупен&г 7-кетохолестернна в Ш гладкошшечгасс клеток. Роль

....,-' . " . ,, ., -'■'".' Таблшщ 4

, Соотав липидов. фракции ПМ гладкомшаечных клеток , •' ■•, . ' . ' • V тонкого кишечника

Лвлцда :. . • 1Л{г/:.!Т белка Фосфолипвдн.'

■;'•' V ~"н±"й ~ % ■ . ' ' '; ■■

в % от.общего количества, -

. М ± ш

' Об~зя фракция-.' 700 ± 29 ■ ■ липпдсв

йосфолщшда

2олестарин

"-кетохолесто-, ■ -рянх ■

Глвколгшпда Эзрше кислоты.

455 ± 32 Ш * II

3,5 = I

60 ¿13 45

100' " Фосфатпдплхолнн 45,1 ± 1,1 65 20

босфатндклэтанол-5,5 - 0,3

' - ■ ЕШЯН

Оосфагидилоарик 7.0,2 £ 0,9

10

2,5

8,8 ' 6,4

х от количества холестерина

Фосфатидюшнозит 9,4 0,5

■'Сфингомиэдив • 18,0 0,6

Кардиолнпик следы

Лизофссфатпдил- .

холи: 7,5 4 0,3

ПолиглицеооЗюс-

фатадй 4,2 0,3

Т-катоходестзр'лца (7-Кх) пока что не ясна, но сна моае;? оказаться частично"'к такой, которую играет холестерин. Том более, что нвэяачкташй» юияиоства 7-^ когавнсируотся очень высокой ак..

тивностыо /см.В.К.Рыбальченко, М.Д.Курский, 1977/. Важным явля- . . ется вопрос взаимодействия 7-Кх с фосфолипидамй мембран, в свя-;" зи с чем мы изучили молекулярные состояния 7-Кх возможность';:. образования водородной связи между стерином и трийропилфосфицок- .-сидом (ТШ)). Протоноакцепторнне свойства фосфорюгьной группы ТШ) весьма близки к свойствам фосфатной , группы фосфолипидов/. ' поэтому взаимодействие 7-Кх-ТПФО является уДобной моделью исследования взаимодействия стерина с фосфолипидами.* Взаимодействие' молекул проявляется в ИК-спектра изменением характеристического , поглощения функциональных, груш,' непосредственно ' участвующих в комплексообразовании.' Характер этих изменений & ' проявление . 5 позволйет судить о.механизмах взаимодействия. ;г'"'•'''.••"■•

: г.Г

Рис.15. Спектры поглощения .!

7-Кх и'ТИМ в области колебаний гидроксила (1-3, 9-11), карбонильной (4,5) и фосфатной (6-8) групп. 1,4-10 Ш и 2-40 мМ 7-Кх;" 6,9-по 10 мМ ТШО и стерина, соответственно; 7,10-10 Ш ТШ0 и стерина; 8,11-40 мМ 7-Кх и 10 ыМ ТПФ0. 3,5-кристаллический 7-Кх В таблетках из бромида.калия. Все ■' растворы в С01д, поглощающий слой - I км. ин -20. •

. . • -' 1 • " . . ■ ¡_ . ' ' г

. Наблюдаемые изменения в ИК-спактрах (рис.15) указывают .на изменение молекулярных состояний 7-Кх в растворе в присутствии ТИЮгчэбразование комплексов с водородной овязью между Р=0-группой фосфиноксида и гидроксилом стерина. При образовании та ких комплексов происходит разрыв водородной связи саыоассоциатов стерина, на что указывает исчезновение полосы 3500 см""*,;'а динамическое равновесие в растворе смещается в сторону преобладания ' комплексов между'ТПЗО.и ?-Кх, что объясняется частотными сдвигами гидроксила. Как известно", величина частотного сдвига прямо пропорциональна энтальпии комплексообразования /Дя.Пиментел, О.Мак-Клелан, 1964/. При образовании указанных 'комплексов частот-

вый сдвиг гидроксила значительно-больше (300 см"1), чем .при; об-*разовании■саиоассоциатов 7~кетохолестерина (150 см"*). Следовательно, энтальпия образования комплексов с фосфиноксидом превышает энтальпию образования саиоассоциатов 7-Кх. ТШО-является более ' сильным акцептором протона, чем 7-Кх и поэтому при нуклеофильной атаке фосфиноксида происходит разрыв саиоассоциатов стерина с образованием более устойчивых комплексов. Полученные данные свиде-

"тельствуют, что между гидроксильной группой стеринови В=0 группой фосфолипидов в мембранах возможно образование водородной связи, . --J ■ ■'•• '-.'/, ' .:- . ' / . ; . Одним из важных этапов исследований взаимодействия биологически мембран с искусственными является определение поверхностной активности плазматической мембраны. Введение фракции ПМ гладкошшечных клеток в субфазу приводит к концентрированию мембранного материала на границе, раздела фаз. Как следует из изотерм .поверхностного натяжения и граничного скачка потенциала, фракция Ш формирует поверхностную структуру с поверхностным натяжением '.5-6 ыН/м (табл.5). Граничный скачок потенциала (ГСП) поверхностной структуры более положителен со стороны воздуха, имеет, по-ви-/ дтаому', • ту же. природу, что и потенциал фосфолипидного монослоя

- /А.В.Бабаков и соавт., 1972; В.С.Гевод и соавт., 1978-1986/. Его значение составляет 176Й4'мВ, в 1,7 раза меньше потенциала фос-. фолипидных монослоев, что может быть-объяснено наличием мембранных белков в поверхностных структурах.

' При наличии фосфатидилхолинового монослоя выход мембранного материала на границу раздела фаз ускоряется. Кривая выхода обладает выраженным максимумом, что указывает на проявление системой кооперативных свойств. Из этого следует, что фосфолипидный монослой' ограниченной плотности упаковки молекул на границе раздела играет роль своеобразной затравки и способствует внедрению компонентов Ш в монослой, что может привести к'изменению ориентации

- липидных молекул монослоя или компенсации потенциала монослое поливалентными ионами мембранных белков. Не исключено такие, что ■выход белковых компонентов в монослои приводит к их частичной или полкой денатурации /Л.В.Часовникова и соавт., 1981/ и, как следствие, к изменению их общего электрического заряда.

" Использование для формирования монослоев фосфатидилхолияов

различного строения позволило установить. отличия в изменениях как

поверхностного натяжения, так и ГСП (табл.5). Молекула яичного

- 33 -

фосфатидклхолина, являясь цвиттерионом, при рН=2-Н электрически нейтральна /Л.И.Богуславский, 1978/, ее гидрофобные радикалы' прэдсхавлеш в основном остатками ненасыщенных кирннх кислот. „'

. '/ Таблица 5 .'•: Изменение поверхностного натяжения и граничного скачка потенциала в фосфатидилхолшовых монослоях После введения в субфазу фракции Ш

. Тип . монослоя

Средние зтчения параметров;

Исходные'"';. . В бубсЕазо монослои фракция Ш •

Изменения

(+,-) исходных параметров .

ыН/м

мВ

мН/ы

мВ

мН/м.

мВ

Плазматические

• мембраны 5,5 176 - '- . -

Яичный фосфатп-

ДИЛХОЛЕН ' 3,5 286' 20,3 226 .. +16,8 -60

13,5 360 26,5 207 ...+13,0 ' -153

32,4 316 36,5 304 ! +14,1 -12

Диолеклфосфати-

ДИЛХОЛИН 2,7 262 9,2 238 +6,5 -24

4,3 254 15,6 231 +11,3 <-23

9,4 233 13,8 233 +4,4 0

IX,0 225 ' 15,2 204 +4,2 -21

Дилальмиюплфос-

фатпдидхолин 3,5 260 8,9 . 246 +5,4 -14

9,4 350 . 16,1 320 +6,7:- -30

10,2 310 15,2 .283 +5,0 -57

Радикалами дшшльмитоил- и длолоилфосфатвдилхолшюв являются остатки индивидуальных киршк кислот, причем последний'обладает двойной связью.'С учетом этого дашшо табл.5 свидетельствуют( Ч10 йпрнокпсдотние остатки молекул фосфатпдаяхолпнов оказывают 'Влияние на внедрение в лшщдный монослой'фрагментов.Ш. Возможно, что различия в структуре гидрофобных участков фосфатидилхолинов могут изменять кесткость самого конослоя п, следовательно, изменять, внедрение в него мембранного материала. Кроме того,.отличия в на-' сыщеннооти кирнокислотншс остатков изменяют асимметрии полярных

- 34 - '-..•-..-'

головок фосфолппидов в мембранах / Етте1о1;, Ное-уеп, 1975 /, ЧТО сказывается и на составляющей ГСП, определяемой ориентацией ди-польпых молекул в монослое.

Подобную монослойной поверхностную структуру можно получить и нанесением суспензии везикул ЕМ непосредственно на поверхность раствора электролита, что приводит к образованию монослоя, обладающего ГСП, равным таковому при введении ПМ в субфазу. Это свидетельствует, что в обоих случаях монослой из ПМ имеет одинаковую ориентацию молекул на границе раздела фаз.

Таким образом, в монослоях, сформированных введением суспензии везикул в субфазу, регистрируется устойчивая воспроизводи-"^ ш<$ть изотерм сжатия-расширения при их циклировании, а при нанесении фракции ИЛ на поверхность раствора электролита циклирование приводит к трансформации изотерм от начального вида, к устойчиво воспроизводимому (рис.16). Переход от первого цикла сжатия таких монослоев к последующим сопровождается не уменьшением поверхностного давления (шш его постоянством), что характерно для фосфоли-пидных монослоей, а увеличением. Это явление можно объяснить следующим образом. Исходя из трансформации изотерм при циклировании монослоеа, сформированных нанесением фракции Ш на поверхность электролита, можно заключить, что меммбрашшй материал локализуется не только в монослойной структуре. Вполне возможно, что под монослоем формируется адсорбционный слой мембранных везикул пли ламелл, который при движении барьера разрушается. Вследствие последующего циклирования на границе фаз концентрируется дополнительное количество молекул лплидов и белков ЕМ, чем после нанесения везикул на поверхность. Напротив, при введении фракции ПУЛ в субфазу, везикулы диффундируют по всему объему раствора электролита и заполняют границу раздела фаз. Стационарное состояние, достигаемое через 4-6 часов (в 8-12 раз медленее, чем при нанесении фракции на поверхность), обеспечивается равновесием между веществом ЕЛ на поверхности раздела фаз и в субфазе, о чем свидетельствует устойчивая воспроизводимость двумерного давления при циклировании мо-послоев. Если образующий монослой мембранный материал в избытке или поверхность раствора электролита покрыта фосфолипидным монослоем, может формироваться мультислойная структура, которая, помимо истинного монослоя, содержит слой везикул ПМ,

- 35 -

РисЛ6.Последовательные | (1-3) изотерма сжатия-расши- | рения монослоев, сформированных из дииальмитоилфосФатидил-холина (А), нанесением фракции Ш на поверхность электролита (Б; 1-3)'и введением фракции в субфазу (4). Скорость сжатия - 5,2 см/мин. Среда (мМ): кс1 -10, Трис - НС1-5; рй=7,2. I

v

«

«я est tu S/r.

Б J^Z^

я

е

«И . ею »аз ■ s/s.

Обсуждаемые результаты исследований свидетельствуют о выраженной поверхностной активности фракции 1Ш гладаоншпэчных клеток, тонкого кишечника кролика. Учитывая образование поверхностных структур из мембран CP, эритроцитов, щеточной каемки, кишечной палочки /Schindler, Rosenbusch, 1978j Schindler, 1979-1932} íattua et ol.,1981; Sohurholz,Schindler,1981 /, можно полагать, ЧТО подобные свойства характерны ддя всех типов биологических мембран. Обращает на себя внимание тот факт, что при высоких плотностях упаковки молекул в монослое выход мембранного вещества па поверхность затрудняется. При. поверхностном давлении в 30-35 иЗ/и средняя площадь на молекулу фосфолипида в монослое составляет 4-6 юл2, что совпадает с аналогичными показателями для ЕДЫ /Tardieu et al.,1973/. Это означает, что плотность упаковки молекул в бислое также составляет величину порядка 30 ыН/м, как и в клеточных мембранах /Demei et al., 1975/. Вполне bosmosho, что этим к объясняется инертность во взашмдойствпа везикул Ш гладко -мыэечных клеток с БЛМ из индЕаидуальшх фосфолшадой и'-обецк ли-пидов мозга' быта. Так как регулировать плотность упаковки иолокуд в бимолекулярных липпдных мембранах мсоно хншь в незначительных продолах (а в клеточных мембранах ецо мзньша), то усиление взаимодействия и илшантащш этих мембран можно достичь шрувениаи структуры лшшдаого ьатрикса.

- 35 -

' 4.2.Взаимодействие фрагментов плазматической . мембраны с БШ л реконструкция ионной проводимости ■ Учитывая то, что фосфолшшда обладают выраженной фузогенной активностью в отношении везикул,Ш гладкомышечных клеток (см.2), цц предприняли попытку использовать это свойство дая внедрения мембранных фрагментов в БШ. Для этого мы первоначально определили влияние азолектиновых липосом на электрические характеристики ЕЛМ. Оказалось, что липосомы из азолектина приводят к уменьшению сопротивления ЕШ в несколько раз, но в отсутствие внешнего напряжения сопротивление релаксировало до исходного уровня. Вольт-амперные характеристики модифицированной азолёктиновыми липосоьа-ци ЕШ линейны и симметричны.

■ '. Внесение в измерительную ячейку суспензии мембранных везикул, преинкубированкых с азолектиновыми липосомами (в результате их взаимодействия образуются гибридные везикулы, названные условно протеолипосошмн), приводит к резким изменениям электрических характеристик ЕШ. Как видно из рис.17, кривая ток-время немодифл-цированной протеолипосомами БШЛ илеот вид ровной линии на протя-ненш часов. После внесения в ячейку протеолипосом 20-30 мкг белка уае на 5-15 мин наблюдается как снижение электрического сопротивления мембраны, так и модификация кривой ток-время (кривая 2).

Рис.17.Вольт-амперная характеристика (А) и флуктуации, тока БШ, модифицированной мембранной фракцией.(В, 2). 1-кривая ток-время исходной азолектиновой ЕШ. Среда: 100 мМ хлорида натрия, 2 имидазол - HCl; рН=7,3. Скорость развертки напряжения -0,2 мВ/сек.

Сначала появляется слабые флуктуации, которые со временем переходят в скачкообразная изменения тога. Воли-емпергая харзктрргств -

кз модвФишроБанно'З протоолотгоссузин иълцреРт IV,ч), а

- 37 -

г*

ю ■ I/.mS

5 L

_jv

lüLJI

i

мембрана при напряжении 80 мВ и 'выше теряет устойчивость. Уменьшение и устранение внешнего напряжения приводит к затухании скач -кообразных флуктуаций тока и-стабилизации мембраны.

Характер изменений , сопротивления и проводимости БШ в присутствии протеолшюсом зависит от состава среды. Наблюдаемые уже на первых минутах после введения протеолипоссм флуктуации тока но чувствительны к введению в среду 1-2 мМ МвС12, но их частота и амплитуда резко возрастают при внесении 3 ыМ АТФ. Эффект усиления тока временный. Инициацию токовых флуктуаций вызывает СабЗ.^ Как и в случае с АТФ, со временем возбуждение проходит. Последующее прибавление хлорида кальция приводило к аналогичным вффектам. Учи -тывая тот факт, что ни СаСД^ ни АТФ в отсутствие протеолипосом не приводили к появлению флуктуаций тока на ЕШ, можно сделать заключение, что аа указанные процессы отвественнн структурные компоненты плазматической мембранн. Исходя из того, что флуктуации тока ^модифицированной БШ но зависели от знака напряжения на мембране и что в пла'зштичеокой мембране гладкомшпечн.ой клетки преобладают калиевая и кальциевая канальные проводимости /П.Г.Богач и соавт., 1969-1984; П.Г.Костюк, 1986; В.И.Скок, М.Ф.Щуба, 1986/, мы заменили натриевую среду на калиевую а провели аналогичные описанным выше исследования.

Рис.18. Кривые ток-время модифицпро- '; ванной фракцией мембран азолектиновой БШ в среде, содержащей 100 ыМ хлорида калия, 2 мМ имидазол-нот.; рН=7,2. ТЭА-тетраэтил-. аммоний, I ыМ.

Как видно из рис.18, в присутствии протеолшюсом и 100 til хлоюида калия удалось сформировать БШ, обладающие совершенно шш -ми"характеристиками. Общее сопротивление изибрани было ивга по сравнению с неыодифицированной БШ в 4 раза. Мембрана обладала асимметричными свойствами - упорядоченные флуктуации тока наблюдались при положительном (со стороны введения протеолипосом) пап»

гмш

ряаании на БШЛ. При отрицательном напряжении 30-40 мВ флуктуации тока были весьма незначительны и полностью отсутствовали при более высоких значениях потенциала. Амплитуда скачков проводимости варьировала в широких пределах 12-172 пСм. Амплитуды наиболее часто встречающихся скачков (70$) колеблются в диапазоне .. ." 12-22 пСм. Асимметричность модифицированной БЛМ и характер токовой кривой указывают на регуляцию проводимости мембраны структурами канального типа, способными находиться в открытом или закрытом состояниях.

Время жизни таких структур в растворе хлорида калия, определяемое по длительности скачка проводимости, не превышает 25 с. Обусловленные положительным напряжением флуктуации, тока устранялись посла введения со стороны протеолипосом ТЭА в концентрации I мМ с последующим плавным падением сопротивления мембран. Учитывая то, что ТЭА является специфическим блокатором калиевых каналов гладкомышечных клеток и клеток других тканей /П.Г.Костюк,1986; Sáncheá,Stefani, 1983 /, а также форлируемых полиеновыми антибиотиками в липидных КИЛ анионных каналов /Ermishkin et al., 1976/ и то, что в наших опытах полиеновые антибиотики не применялись, есть все основания полагать о восстановлении в модифицированной БШЛ активных калий-проводящих структур плазматической мембраны.

Что касается реконструкции натриевой.канальной проводимости ИЛ на БШЛ, разделяющих эквимолярные (100 мМ) растворы хлоридов калия и натрия, то можно сказать следующее. Характер флуктуаций тока свидетельствует о проводимости канального типа, однако эти флуктуации не блокируются тетродотоксином (ТТХ). Нелинейность вольт-амперных характеристик модифицированной протеолипосомами БШЛ объясняется тем, что последняя более проницаема к ионам натрия. Отношение лроводимостей БЛМ при положительном и отрицательном потенциалах в 50 мВ составляет 1,4-1,6. Электрофизиологическими исследованиями ионных механизмов генерации электрической активности гладксмышочнши клетками показано, что большинство этих мышц.способны генерировать ПМ как в безнатриевых растворах, так и в растворах, содержащих натрий и ТИС /М.Ф.Щуба и соавт., IP62-1984; П.Г.Богач И соавт., 1969-1984; Kuriyama, 1981¡Tomita, 1981, 1982 и др/. Создается впечатление, что ионы Ni* не принимают непосредственного участия в генерация электричоской активности гладко -

мышечных клеток, йлэсто с тем в отдельных работах /см. М.4,Шуба,

- 39 -

1981/ приводятся доказательства натриевой природы Щ гладкомы -щечных клеток. В связи с этим предложенный нами способ реконструкции ионной проводимости плазматической мембраны на БЛМ может быть полезным для окончательного решения вопроса об участии натриевых тетродотоксин-нечувствительных каналов в генерации электрической активности гладкомышечных клеток.

Используя описанные выше подходы мы попытались реконструировать кальциевую проводимость плазматической мембраны на. БЛМ.

Рис.19.Флуктуации тока азолектиновых ЕМ, модифицированных фракцией ПМ, при различных добавках. I- немо-дифицяровання БЛМ; 2- модифицированная БЛМ,"0,1 мМ СаС?2 3- 7 - объяснены в тексте. Среда: 100 мМ КаС1и 2 мМ имидазол-НСХ , рН=7,2; 50 мВ. Стрелками показано введение 0,1 мМ верапамила с одной или двух сторон БЛМ.

Как видно из рис.19, увеличение концентрации СаС12 (до 0,5-1 мМ) вызывало флуктуации тока БЛМ, модифицированной протео-липосомами (кривые 3,4). Такие изменения, как правило, заканчивались последующим затуханием флуктуаций, которые можно было возобновить последующей добавкой СаС1? Мы предположили, что в данных условиях локусы Ш внедряются в липидный бислой о восстановлением функции кальциевых каналов. Для проверки этого предположения были проведены следующие опыты. Введение СаСЦв указанных концентрациях по обе стороны модифицированной БЛМ увеличивало флуктуации тока по сравнению с прибавлением кальция только со стороны введения протеолипосом (кривая 5). Такие флуктуации тока бло-'

кируготся ионами Ип2+(или ьерапамилом) в кощентрациях, которые

- 40 -

блокируют как спонтанные, так и вызванные катодом 1Щ гладкошшечных клеток /П.Г.Костюк, 1986; В.И.Скок, М.Ф.Щуба, 1986; М.Ф.Щуба, Н.Г.Копэмасова, 1988/. Причем, блокирование флуктуаций тока наблю -дается: почти полное, если СаС12и блокаторц находятся по обе сто -роны мембраны (кривая 5); неполное, если блокаторы, находятся с одной ст'ороны (любой) БШ, а СаС12- по обе стороны мембраны (кривая 6); если СаС12вводится во внешнюю ячейку, а лротеолипосомы -во внутреннюю, блокаторы действуют только со стороны добавки каль--ция (кривая 7). Результаты этих исследований с учетом разнонаправленной ориентации мембранных везикул свидетельствуют, что фраг -менты Ш встраиваются в БЯМ так, что примерно половина их ориентирована цитоплазматической стороной ПМ во внутреннюю ячейку, другая часть - в наружную, а блокаторы действуют на ионные токи в результате взаимодействия их с внешней стороной плазматической мембраны.

Таким образом, плазматическая мембрана гладкошшечных клеток тонкого кишечника имеет сходный с ПМ других клеток липидный состав, сравнительно высокое содержание холестерина, содержит 7-ке-тохолестерин, обладает поверхностной активностью, взаимодействует о липидными моно- и бимолекулярными слоями. При взаимодействии с последними преинкубированных с азолектином фрагментов ПМ происходит "их "имплантация в бислой с восстановлением ионной проводимости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На везикулированной фракции плазматической мембраны гладкошшечных клеток"тонкого кишечника получена новая информация об основных путях трансмембранного движения Са2+.Иа+-Са -обмен, один из механизмов выведения кальция из клетки, обладает высоким сродством к катиону (^=20 мкМ) и обеспечивает транспорт последнего за счет энергии натриевого градиента, создаваемого -насосом. Антипорт катионов 'характеризуется насыщаемостью по субстрату переноса, обратимостью и способностью функционировать как в электрогенном , так и электронейтральном режимах;Из этого следует, что что при.деполяризации ПМ во бремя генерации ПИ за счет антипорта должен стимулироваться выход ионов натрия из клетки и вход в нее ионов Са2+. Этот вывод в последнее врегч подтвержден исследованиями на мионитах, в которых обнаружены кратковременные выходящий (натриевый) и входящий (кальциевый) токи как компоненты "скрытых токов", которые не чувствительны к блокаторамНц - и 0ч- клнплгв

/Hume, Uehara, 1986; Kimura et al.j 1986; Smith,1986/.

Окончательное снижение концентрации внутриклеточного кальция до уровня, обеспечивающего полное расслабление клетки, осуществляется Са-насосом Ш за счет энергии гидролиза АТФ Mg , Са2+-АТФазоВ. Характерно, что АТФаза в присутствии кальмодулина активируется Са2+ в очень низких (Ю-8- ЮМ) концентрациях. . К(л по Са2+ гидролиза АТФ не превышает I мкМ. Такое высокое сродство АТФазы к катиону обеспечивает ее постоянную активность при низких-концентрациях внутриклеточного Са2+ и, следовательно, вы-ведьлие последнего из клетки с начальной скоростью около "2 нмоль/мг белка»С. Такая скорость активного транспорта вполне достаточна для снижения за время расслабления концентрации Са2+ внутри клетки до 10~7- 10-8М, что соответствует полному расслаблению гладкомышечных клеток и последним данным по определению внутриклеточной концентрации катиона /Prltchard, Ashley, 1986; Suainoto, Kuriyamo, 1986 /. Mg2+, Ca-AT Фа за гладкомышечных клеток по основным характеристикам аналогична транспортным АТЕа-зам других тицов мембран. Фермент может функционировать в двух состояниях, отличающихся по сродству к кальцию, его активность зависит от состояния липидного ыатрикса, он активируется кальмо-дулином и специфически блокируется окситоцином.

Относительно последнего паыи получены новые данные, позволяющие предложить "липидную" гипотезу взаимодействия гормона с Ш. Т.к. окситоцин эффективен как при введении в среду гомогенна зации ткани, так и в среду инкубации фракции ЕМ, содержащей примерно половину везикул, ориентированных цитоплазма-.ической стороной наружу, то связывание гормона с мембранными рецепторами : не --является первичным процасооа\механизка взаимодействия Пептида с Ш. Используя методы моно- и бимолекулярных липидных мембран, мы установили, что окситоцин обладает поверхностной активностью, взаимодействует с монослоями, сформированными как из лйпидов.так и из фракции Ш, а также образует потенциалозависимне ионные каналы в азолектиновой HUÍ и в БЯМ с имплантированными фрагментам Ш. Эти данные с учетом информации о взаимодействиях биологически активных пептидов с липидными бислоями /О.В.Красилышков и соавт., 1983; Р.З.Сабиров, 1986; Schnyzer, 1985 / дают основание полагать, что первичным процессом связывания окситоцина с ПМ гладкомышечных клеток является взаимодействие молекул.гормона с молекулами лшш-дов мембраны. В этой связи очень важным оказалось то, что оксито-

циновые каналы в азолектиновой БЛМ с имплантированными фрагментами ГОЛ являются потенциалозависиыыми. Если допустить, что в закрытом состоянии канала окситоцин нэ блокирует Са-насос, а в открытом - подавляет АТФ-зависимый транспорт Са2+ из клетки, тогда становится понятным попеременное активирование и угнетение активного транспорта катиона в присутствии окситоцина: процессы управляются мембранным потенциалом клетки.

Третьим путем трансмембранного движения Са2+, способным быс-' тро изменять внутриклеточную концентрацию катиона, являются Са-каналн. Учитывая морфолого-фушшионалышэ особенности гладкомы-шечннх клеток, которые затрудняют исследование ионного транспорта, перед нами ставилась задача разработать способ реконструкции ионной проводы,гости Ш и БШ, позволяющий исследовать транспорт в условиях контролируемой "внутри - и внеклеточной" среды. Этими исследованиями установлено, что предобработка азолектиновыми ли-посомами фракции Ш повышает фузогенные свойства последних без угнетения активности Ме2+ , Са -АТФазы и позволяет имнлангиро -вать фрагменты мембраны в искусственный бислой. Такой подход позволил нам впервые продемонстрировать возможность реконструкции ионной проводимости Ш гладкомышечной клетки на плоских БШ. Сформированные комплексы Ш-БШ обладают блокируемой ТЭА калиевой, не чувствительной к ТТХ натриевой и чувствительной к верапамилу и Ип2+ кальциевой проводимостями. Флуктуации тока через такой комплекс,' определяемые потенциалом на мембране, асимметричность и характер токовых кривых свидетельствуют, что проницаемость мембраны определяется структурами канального типа.

Таким образом, полученные экспериментальные данные позволяют заключить, что плазматическая мембрана гладкомышечной клетки обладает достаточной для быстрой регуляции внутриклеточной концентрации катиона мощностью механизмов активного и пассивного транс-;'" порта кальция, позволяющих обеспечить активацию процессов сокращения и расслабления.

■ ь , ВЫВОДЫ

I.Получена ъ^зполированная фракция плазматических мембран гладкошшвчных клеток тонкой кишки со средним диаметром веникул 437 им, 46$ из которых имеют исходную ориентацию. Для мэмбрага характерны два основных типа 'участков связывания кальция. Сродство и количество участков зависит от состава среды и услойнЛ инкубации. Связывание ка-шшя являемся экзотермнчсг.кги чщ/юпроу-чол-.ь-

ным процессом. Мембранные везикулы обладают близкими к исходным Ш барьерными свойствами и пригодны для исследований ионного транспорта.

2. Мв +,Са2+-Лтааза плазматической мембра!ш является основной структурой Са-насоса, проявляет активность в низко- и высокоаффинном состояниях, характеризуется высокой специфичностью .. кальцию и сравнительно низкой - к нуклеозидтрифосфатам. Фермент избирательно блокируется окситощшом, чувствителен к изменениям состояния липидного матрикса и к эн -реагентам, в низкоаффинном состоянии активируется ЭГТА и кальмодулином, достигая значений активности высокоаффинного состояния.

3.Плазматическая мембрана гладкомышечной клетки обладает системой /Са2+-обмена, которая характеризуется высокой специфичностью к кальцию и насыщаемостью по катиону, обратимостью и зависимостью от натриевого градиента. Стехиометрия обмена -1Са2+: 2(3)Но+. В условиях генерации мембранного потенциала со знаком "+" внутри'везикул увеличивается начальная и максимальная скорости антипорта и повышается "кальциевая" емкость мембранных везикул, что может быть следствием наличия в молекуле переносчика ионогенных групп.

4.Проведенные расчеты показывают, что Са-нзсос й йа+-Са2+-обмен способны обеспечивать за время, соизмеримое с временем расслабления гладкомышечной клетки, снижение внутриклеточной концент--рации катиона до величины, необходимой для расслабления. С учетом '"мощности" Са-капалов ато означает, что плазматическая мембра--на мпоцитов тонкой кишки способна обеспечить процессы возбуждения, сокращения и .расслаблений клетки, как' в сопряжение этих процессов.

б.Липпдная фракция плазматической мембраны гладкошЕЭЧных клеток тонкой кишки кролика содержит фосфолипидЫ, характерные для ПИ клеток других типов мышц, характеризуется высокгал содержанием холестерина и наличием 7-кетсхолестершш, гидроксильная группа которого способна образовывать водородную связь с фосфатной группой фосфолиппдов мембраны.

6.Везикулы фракции ПМ проявляют выраженную поверхностную активность, образуют моносло&ше структуры, взаимодействуют с ли-липдцыми монослоями и сливаются о липосомамп. Основную роль во

взаимодействии везикул ПМ с фосФолипидными искусственными мембра-

- 44 -

нами играют гидрофобные взаимодействия и фузогешше процессы. Экзогенные липиды существенно изменяют АТФазную активность и проницаемость плазматической мембраны в результате нарушения ее барьерных свойств, жидаостности липидного матрикса и непосредственного влияния на ферментативные комплексы. Установленные закономерности могут быть использованы при разработке методов целенаправленной доставки фармакологических веществ в орган и клетку с помощью липосом.

7.Предложен способ имплантации фрагментов плазматической мембраны гладкомышечных клеток в БШ с использованием азолектина, стимулирующего активность мембранносвязашшх АТФаз. Способ позволяет сохранить функциональную активность ПМ, проводить исследования трансмембранного движения ионов й контролируемых условиях "вне- и внутриклеточной" среда и мскет быть использован как для дальнейших исследований ПМ гладкомышечных клеток, так и для ре кон-конструкции ионной проводимости других типов клеточных мембран.

8.В результате предобработки фракции ПМ азолектиновыми липо-оомами с использованием предложенного способа имплантации мембранных фрагментов сформирован физиологически активный комплекс Ш-БЛМ, обладающий рядом свойств плазматической мембраны гладкомышечных клеток: избирательностью к катионам, канальной проводимостью, чувствительностью к приложенному напряжению и блокаторам ионных каналов.

9.Специфический блокатор Мз2+,Са2+-АТФазы ПМ гладкомышечных клеток окситоцш обладает поверхностной активностью, взаимодействует с липиднши монослоями и монослойными структурами, сформированными из мембранной фракции. В азолектиновой ЕШЛ, как и в комплексе Ш-ТШМ окситоцин способен образовывать два типа потешша-лозависимых ионных каналов с проводимостью 0,02-0,03 и 0,09 -0,11 нСм. Предполагается, что ингибирующий аффект 1И Са-насос гладкомшаечной метки оказывает гормон в виде белково-липидного комплекса, активность которого регулируется мембранным потенциалом.

у: Ю.Полученные экспериментальные дагаше в сочетании с электрофизиологическими исследованиями дают возможность представить следующую схему событий, обеспечивающих гомеостаз Са2+з гладко?,тисочной клетке плазматической мембраной на протяжении времени ло сократительного цикла. Во время возбуждения лош! кальпия входят

в клетку по Са-каналам. Деполяризация ПГЛ стимулирует вход кальигч

- 45 -

в клетку и путем Ка+ -Са2+-обмена, что ускоряет рост внутриклеточной концентрации катиона. Окситоцин в период деполяризации и высокие внутриклеточные концентрации Са2+ (10~®М) блокируют Са-насос, что исключает выведение катиона против концентрационного градиента в период генерации Щ и развития сокращения. Последующая реноляризация блокирует Са-каналы, стимулирует выведение Са2+ из клетки путем антипорта а снижает ингибирующий эффект окситоци-на, что проявляется в активации Мв2+,Са2+-АТ®азы. Са-насос,' активирующийся кальмодулином, обеспечивает дальнейшее понижение внутриклеточной концентрации катиона до значений, соответствующих полному расслаблению гладкомышечйой клетки.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Х.Регуляторная роль кальция в проницаемости клеток гладких мышц для ионов натрия //2-ой Всесоюзн. биохим. съезд. Тез.докл.- Ташкент: Фан, 1969. - С.90-91.

2.0 механизмах деполяризации мембран клеток гладких маши в среде, лишенной ионов кальция //Биофизика. - 1970. - 15, внн.З. - 0.458465.

3.Участие ионов кальция и натрия в механизмах генерации электрической активности клеток гладких мышц //1У Мендунар. биофйз. конгресс. Тез. докл. - М.: Наука, 1972. - С.242-242. Соавт. П.Г.Бо-гач, Н.А.Каплуненко, П.Н.Шевчук.

4.Химический состав и формонтативные свойства плазматических мембран //Укр. биохим. журн. - 1974, - Т.46, Д5. - С.661-674. Соавт. М.Д.Курский.

б.Дискретная проводимость бислойных мембран-из'7-кетохолеотершш и неокисленного холестерина, сформированных в присутствии детергентов //Докл. АН УССР, сер.Б. - 1977. - 1». - С.259-262. Соавт. О.С.Ксегосек, П.Г.Богач, А.М.Омельченко, Я.З.Яворский. 6.Молекулярная организация и ферментативная активность биологических мембран //К.:Наукова думка, 1977. - 212 С. Соавт. М.Д.Курский.

7.0 межколекулярном взаимодействии между 7-кетохолестерином и трйпрошлфосфиноксидом Ц Сб. -.Молекулярная генетика и биофизика.

- К.:Вииа школа, 1978. - Вип.З. - С.46-51. Соавт. П.Г.Богач и др. 8.Структура и функции биологических мембран //К.:Вица щкола, 1981,

- 336 С. Соавт. П.Г.Богач, М.Д.Курский, Н.Е.Кучеренко.

9.Влияние ионофора Х-537А на электрическую активность гладкоми шечных клеток // I Всесоюзн. биофиз. съезд. Тез.дом. - I/!.: Наука, 1982. - Т.1. - С.230. Соавт. В.И.Карамушка, П.Н.Шевчук.

10.Влияние катиошшх поверхностно-активных: веществ на нервно-мы-течпую передачу в гладких шипах //Физиол. журн. АН УССР. - 1982. - Т.28, И2. - С.239-242. Соавт. Волощенко В.И. и др.

II.Электрические явления в неисчврченной мышечной ткани пищевого канала в связи с механизмом ее сокращения //Гастроэнтерология. -1983. - Вып.15. - С.8-15. Соавт. П.Г.Богач, Н.А.Каплуненко. .12.Поверхностная активность плазматических мембран //Вал. экспер. биол. и модицшш,- 1983. - Т.ХСУ1, ^7. - С.107-109. Соавт.

B.С.Гевод, В.И.Карамушка и др.

13.Реконструкция свойств сарколеммы гладкогллпечных меток на плоских липидных мембранах //Укр. биохшл. :-гурп. - 1983. - Т. 55, Л5. - С.552-556. Соавт. В.И.Карамушка , Т.Г.Грузина и др.

14.Влияние экзогенных липидов на функционирование ферментов сар-колем.ш гладкомшгачных клеток // 1У Всесоюзн. симпозиум по биохимии липидов. - К., 1983. - С.167. Соавт. В.И.Карамушка и др.

15.Выделение плазматических мембран клеток гладких мышц тонкой кишки кролика //Бал. экспер. биол. и медицины. - 1984. - Т.ХСУП, Ж. - С. 105-108. Соавт. П.В.Погребной и др.

16.Основы электрофизиологии // К.:Вита школа, 1984. - 231 С. Соавт. П.Г.Богач, М.Ю.Клевец.

17. 1.?£2+, Са^+-АТФазная активность сарколеммы гладкомышечких клеток тонкой динки кролика //Биохимия. - 1984. - Т.29, вып.9. -

C.1523-1528. Соавт. Т.Г.Грузина и др.

18.Физиологические аспекты взаимодействия сарколеммы гладкалышеч-ной ткани о лштаднкми мембранами //Всеоюзн. конф. Современные цробл. физиол. нервной и мышечной систем. Тез.докл. - Тбилиси, 1965. - С. 151-152.

л, р ,

19.Регуляция активности Мз , Са -АТФазн плазштической мембраны гладкошЕечвдх клеток //8 объедай, симпозиум биохимического общества СССР-ГДР. Прббл. биохим. и биотехнолог. - Рига, 1985. -С.127-128. Соавт. П.В.Погребной и др.

20.Взаимодействие плазматической мембраны гладкомншечных клеток о плоской лшшдноЗ'мембраной //Еюл. экспер. биол. и медицины. -1985. - Т. С, ГЯО. - С.507-509. Соавт. В.И.Карамушка.

21.Изучение механизмов слияния и реконструкции мембран: успчхи.

трудности, перспективы //Сб.-.Молекулярная генетика и биофизика.

- К.:Вища школа, 1985. - Вып.10. - С.46-53.

22.Влияние меркурибензоата и альбумина на Mg2+, Са-АТФазную активность плазматических мембран гладкомышечных клеток // Укр. бвохш. жури. - 1986. - Т.58, И. - С.35-39. Соавт. В.И.Карамуш-

ка, Т.Г.Грузина. 2+ 2+

23. Mg , Са -АТФаза плазматических мембран гладкомышечных клеток: биохимические свойства и регуляция // У Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. докл.- М.:Наука, 1986. - Т.2. - С.397-398. Соавт. П.В.Пог-ребной, М.А.Солдаткина.

24.Физико-химическпб особенности лппосомалыюй фармакотерапии // Междунар. сиг.ш. Нейрогуморальные механизмы старения. Тез. докл.

- К., 1986. - С.203.

25.Нейрогуморальная регуляция внутриклеточной концентрации кальция в гладкомышечных клетках //Междунар. симп. . Нейрогуморалыше механизмы старения. Тез. докл. - К., 1986. - С.88. Ссавт. Н.Е.Кучеренко и др. ,

26.Кальциевый насос и натрий-хальциевый обмен в гладюшшечной клетх:е //ХУ съезд Всесозззн. физиол. общества гш. К.Н,ПаШ10Еа. Тез. докл. - Л.¡Наука, 1987; - Т.2. - С.478-479. Соави). П.В.Погребной, Н.Е.Кучеренко и др.

27.Поверхностный потенциал монослой|, сформированных из фракции плазматических мембран глздкомышэчнщ: клеток //Сб.:Молекулярпая генетика и биофизика. - К.:Впаа школа, 1987. - Вып.12. - С.33-37,

28.Регуляция окситоцдном транспортной 'Дз^Са^-АТФагы и акпаз- . ного транспорта кальция плазматической ыамбрапой гладкеюдаечнш: клеток // Докл. АН УССР, сср.Б. - 1987. - M.Î - С.81-83. Соавт. П.В.Погребной и др.

29.Активация кальмодулином окситоцин-чувотвитолыюй

АТФаэы и АТФ-завпсшого транспорта кальция пгайятгкешш мембранами гладкомылочных клеток //Доил. АН УССР, сор,Б. - 1237, -Кб. - С.78-80. Соавт. Н.Е.Кучерэнко и др. ^

30.Нейрогипофизарный гормон окситоцин - ингибитор Мс Са2'1"-АТФазы плазматической мембраны гладкомышечных клеток //Сб.:" Проблемы физиологии гипоталамуса. К.:Вища школа, 1987. - Бап.21.

- С.76-79.

31.Влияние детергентов на АТФазиую активность и барьерные свойства плазматической мембраны гладкомшшзчной клетки //Укр. бйо-

хим. журн. - 1987. - Т.59, Кб. - С.48-53.

- 48 -

32.Участие плазматической мембраны в регуляции содержания кальция в гладкомшаечной клетке //Сб.:Регуляция фосфорно-кальциево-го обмена в норле и патологии. - РигагРМН, 1987. - С.122-128.

33.Траисмембрапное движение кальция в гладкомышечных клетках тонкого кишечника. 1.По электрохимическому градиенту //Сб.Молекулярная генетика и биофизика. - К. :Вшда школа, 1988. - Вып. 13. - С.81-85. Соавт. Н.А.Капдуненко.

34.Трансмембранное движение кальция в гладкомышечных клетках тонкого, кишечника. П.'Против электрохимического градиента // Сб.:Молекулярная генетика и биофизика. - К.:Вица школа, 1988. -Вып.13. - С.81-85. Соавт. Н.Е.Кучеренко.

Зб.Окситоциновые каналы в бимолекулярной лшидной мембране // Всесоюзн; сшлпоз. "Физиология пептидов". Тез. докл. - Л., 1988 -С.169-170.

36.Образование окситоциновых ионных каналов в азолектиновой бимолекулярной мембране //Сб.гПроблемы физиологии гипоталамуса. -К.:Вища школа, 1988. - Вып.22. - С.85-92. 37.Структура и функции мембран. Практикум. - К.:Вища школа, 1988. - 312 С. Соавт. М.М.Коганов.

За. The role of calcium iono in the transmembrane electrical ргосезоез of smooth тизс1ез // In. Physiology and Pharmacology of smooth rnnsolo. Hat. 1. Intern, sympos. - Varna, 1976. -P. 62. - Co-author - Kaplunenko II.A.

39. Catiopic surfactant influence on nevromuscular transmission in smooth tnusclo // In: Physiology and Pharmacology of smooth muscle. Hat. 2. Internet, зуироз. - Varna, 1979« - Ю9. Co-author ~ Vlasenlto H.I.

40. Characteristic of р1азта тепЬгапез from smooth muscle colls // Ins Physiology and Pharmacology of Smooth muscle. Mat. 3. Internet, зутроэ. - Varna, 1982. - P. 100. Co-author -Gruaina I.G., Koratnushbs V.I. et al.

41. Isolation of plasma membranes and single smooth cello from rabbit intestine and their ATPase activity // In: Physiology and Pharmacology of smooth muscle. Mat. 3 Internat sympos. -Varna, 1982. - P. 101. Co-author - Pogrebnoy P.V., Kulikovn N.V.

42. ATP hiârolysis.by smooth auscle coll иоиЪгопез in the presence of calcium // Abstr. seventh joint зуироз. of the bio-

chem. sooietien of the GDR ana USSR. - Leipzig, 1993. - Ï. S3*

2+

43« Plactaa membrane of smooth muscle cell. I. Ca - pump and + 2+

Ka /Ca - exchange // In: Physiology and ïharnaoology of smooth muscle. Kat. 5 Internat, вушроа. - Varna,.198Q. - P.77. Co-authorKucherenko Ц.Е.

44. ïlasma иеиЪгапе of snooth nuoelo oeil. II. Ноя dota on interaction with oxytocin // Ins Physiology and Pharmacology of smooth muscle. Mat, 5. Internat® вутроз. - Varna, 1988. -

T. 97. Co-author. - Ostrovslccya G.Y.', Masyuk A.I.

45. Plaana membrane of eraooth nunclQ coll. III. Iloconatitutiou of ion conductivity // Int ïhyaiology and Ihnrmaoology Of _ smooth muscle. Mat. 5 Internat, еуюроо. - Varna, 1S88. - P. JI3,

Подписано в печatl2,6 ¡¿, Цт;¡р. J10 sait. Â~J9S£</$.

' Тппотзхфщ имени Вороненого .- 50 -