Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимоотношения в системе малярийный паразит-эритроцит при моделировании IN VITRO

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Взаимоотношения в системе малярийный паразит-эритроцит при моделировании IN VITRO"

Л-

у(]} / ^ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР / Л ^ ^ --—

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ V Iе' ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ (К И ТРОПИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

имени Е. И. МАРЦИНОВСКОГО

На правах рукописи

АЛЛАХВЕРДИЕВ Адиль Магамедали Оглы

УДК 576.893.102.8:576.8.093.1

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ МАЛЯРИЙНЫЙ ПАРАЗИТ-ЭРИТРОЦИТ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ IN VITRO

03.00.19 — Паразитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА — 1989

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е. И. Марциновского Минздрава СССР.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лысенко А. Я.

доктор биологических наук, профессор Дьяконов Л. П. доктор медицинских наук, ст. н. сотр. Шуйкина Э. Е.

Ведущая организация — НИИ МП и ТМ им. С. С. Вир-саладзе МЗ ГССР.

Защита диссертации состоится «_ »_ 1989 г.

в __ часов на заседании специализированного совета

Д 074.39.01 при Институте медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е. И. Марциновского МЗ СССР по адресу: 119435, г. Москва, ул. Малая Пироговская, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « _ »__ 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Коновалова С. И.

3.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Среди паразитарных болезней по оо-циально-зкономической и медико-оиологической значимости особое меото занимает малярия. *

Несмотря на успехи глобальной кампании ликвидации малярии, заболеваемость этой инфекцией доотигает 200 млн.олучаев в год. От малярии ежегодно погибает только в странах Африки около I шш. детей ( fferaedorfer, I9B3; Лысенко, 1986). В нашей стране ма-ляриологическая ситуация также оотаетоя напряженной, главным образом в связи с завозом малярии из-за рубежа (Духанина и со-авт., 1979; Лыоенко, Горбунова, 1983; Сопрунов, 1984), появления малярийных паразитов, устойчивых к современным противомалярийным препаратам. Преодоление этих трудностей потребовало усиления фундаментальных исследований в облаоти биологии и культивирования малярийных паразитов. Изучение различных аопектов отношений паразит - хозяин при малярии на клеточном и молекулярном уровнях немыслиш без разработки методов культивирования различных стадий возбудителей (Акиншина, Федянина, 1986). Наибольшие успехи в этом отношении достигнуты в ооласти культивирования эритроди-тарных стадий возбудителя тропической малярии, Plasmodium falciparum ( Trager, Jensen, 1976). Несмотря на воспроизведение метода Träger и Jensen в ряда лабораториях мира, он нуждается в дальнейшем усовершенствовании. Непрерывное культивирование эритроцитарных стадий других видов возбудителей малярии человека не разработано. Советским исследователям удавалось поддерживать разк жение p.faicipnrura в культуре в течение нескольких пассажей (Крайнова и соавт., 1981; Оганесян, 1984), ио некоторые изоляты этого паразита пооле длительной транспортировки оо неизвестным причинам погибали. Отсутствие в налей стране вепре-

равной культуры P.falciparum затрудняло проведение фундаментальных и прикладных исследований по малярии.

До оих пор оотаетоя неизученным механизм возникновения врит-роцитарных решдивов и оутцеотвования "кризисных" форм малярийных паразитов. Исследования указанных вопросов имеют большое научное и практическое значение. Механизмы криоконоервации оотаетоя недостаточно изученными. Способ криоконоервации, рекомендованный ВОВ, позволяет во9го лишь оохранить 35-40$ паразитов. В СССР исследования по криоконоервации проводились в аспекте видовых различай и стадийности развития паразита (Рахимов,1986). Поэтому новые теоретические подходы по криогенной консервации о учетом физиологического соотояния плазмодиев крайне необходимы. В атом плане перспективен поиск биохимического критерия жизне-опоообности малярийных паразитов после криоконоервации и транспортировки с целы) дальнейшего непрерывного культивирования.

Химиотерапия и химиопрофилактика малярии занимают также важное место в борьбе с малярией. Одной из актуальных проблем современной маляриологии являетоя предотвращение развития и преодоление ухе возникшей лекаротвенной устойчивости малярийных паразитов, что предусматривает поиск новых типов и классов противомалярийных препаратов и биологически активных веществ.

Культура паразитов in vitro может быть успешно использована для получения биомаосы - источника антигенного материала для отработки методов иммунодиагноотических теотов, материала для молекулярной гибридизации ДНК и олигонуклеотидных зондов.

Дхя медицинской науки эти задача конкретизированы постановлением Щ КШС к Совета Министров СССР от 27 ноября 1987 г. "Основные направления развития охраны здоровья населения и перестройки здравоохранения СССР в двенадцатой пятилетке и на пери-

од до 2000 года, а также постановлением Президиума АН СССР, в соответствующих документах Минздрава СССР (июль 1984 г.) и принятом в августе 1985 г. постановлении ЦК КГОС и Совета Министров СССР о дальнейшем развитии новых направлений"биологии, медицины и биотехнологии (1986-1990 гг.).

Цель и задачи исследования. Цальв исследований были разработка и оптимизация методов культивирования и криоконоерваши эри-троштарных форм возбудителей малярии человека и животных для получения бис.лассы паразитов, изучения биологии паразитов и поиока новых противомалярийных соединений, биологически активных веществ.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить физико-химические факторы, влияющие на развитие возбудителей в системе паразит эритроцит in vitro.

2. Разработать методы стимуляции развития паразитов в про-песое культивирования и оптимизации условий культивирования для получения биомассы.

3. Разработать модели персистенции эритроцигарных отадий

in vitro и выяснить механизмы, способствующие переходу плазмодиев в состояние покоя.

4. In vitro изучить особенности развития паразитов и ооо гояния покоя в эритроцитах здоровых и гетерозиготных носителей аномальных типов гемоглобина и энзимопатий.

5. Испытать разработанные культуральние модели развития различных штаммов возбудителя тропической малярии для предварительного отбора противомалярийных препаратов, биологически активных веществ изучения их влияния на эритроцитарный цикл плазмодиев.

6. Апробировать методы кратковременного культивнроъан/я эритроцигарных стадий возбудителя трехдневной малярии человека

p.viva* и малярийных паразитов грызунов P.berghel.

7. Изучать физико-химически а факторы, влиякциэ на *изнэ-опоообнооть, инфактивность и сохранность эритроцитарных отадий малярийных паразитов при различных режимах замораживания.

8. Определись биологичеокие критерии для оценки шзнеспо-ообнооти паразитов в культуре и отбора кропротекторов.

Научная новизна. Впервые в Советском Союзе разработаны и оптимизированы методы культивирования бесполых форм эритроцитарных стадий малярийных паразитов. Получена непрерывная культура хлорохинчувотвительных и хлорохинуотойчивых штаммов p*ía1-01рагш», кратковременная культура P. viva* и возбудителя малярии грызунов P.berghel. Вое вновь полученные культуры плазмодиев были использованы для изучения развития паразитов в эритроцитах здоровых и гетерозиготных носителей аномальных гемоглобинов и энзиыопатий, для биологических биохимических, иммунохимичеоких, биотвхнологических, криобиологических исследований, для предварительного отбора противомалярийных препаратов и биологически активных вещеотв.

Выявлен ряд фйзико-хишчеоких и биологичеоких факторов, влияющих на внутриэритроцитарноа развитие возбудителя тропической малярии (рН, ооотав, газовые фазы и др.), определены параметры адаптации и стабилизации различных штаммов in vitro.

Впервые в мире описано ооотояяиа покоя на ранних стадиях развития в цикле вритроцитарной шизогонии P.falciparum, что раоцевявавтоя как защитная реакция паразита на неблагоприятные условия. Изучены механизмы возникновения состояния покоя у плазмодиев, разработаны способы его моделирования и определены бюххшчвскне показатели (окорость гликолиза, синтеза белка, ДНК, втвдиЦюоть развития паразита). Экспериментально доказано аамед-

ленив или прекращение развития p.falciparum о появлением атипичных форм плазмодиев, которое наблюдается при изменении бйохимичаокого типа клеток хозяина, а именно в эритроцитах о нъас, HbAS и бета-таласоемией.

Разработаны и реализованы способы отимуляшш, стабилизации и получения биомассы p.falciparum о использованием колонки-капилляра, сокультивирования p.falciparum 0 клетками печени грызунов M.nataieneis или сокультивирования о клетками печени мыший линии balB/c На микроносителях отечественного производства на основе желатина.

Разработаны физиологические способы синхронизации отадийно-го развития p.falciparum в культуре.

Оптимизированы макро- и микрометоды определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам и биологичео-ки активным веществам с учетом исходного физиологического ооотоя-ния плазмодиев.

На моделях хлорохин чувствительных и хлорохинуотойчивых штаммов P.falciparum выявлена противомалярийная активнооть отечественных препаратов и ранее неиспытанных на противомалярийную активность биологически активных веществ.

Впервые осуществлена криоконсервапия плазмодиев о учетом ф*-зиологичеокого оостояния бесполых форм эритропитарных стадий малярийных паразитов и показано, что при этом сохранность плазмодии ев зависит не только от режима охлавдения и отадийности плазмодиев, но также от их (физиологического соотояния.

Впервые в криобиологии рекомендовано применять измерение скорости гликолиза в малярийных паразитах в качестве биохимического критерия для выбора криопротекторов, опенки жизнеспособности плазмодиев в пропассе культавирования и после размораживания.

Теоретическая значимость работы заключается в установлении ооо-тояния покоя в шкле эритроцитарной шизогонии Р.га1с1рагша, обеспечивающее длительное сохранение жизнеопособнооти плазмодиев в эритроцитах. Обнаружена их устойчивость к противомалярийным препаратам и действию криогенных факторов, что расширяет современные представления о оиологии возбудителей малярии человека и имеет большое практическое значение для культивирования, криобиологии, диагностики, эпидемиологии и химиотерапии.

Практическая значимость результатов. Полученные сведения по разработке и оптимизации методов культивирования и криокон-оврвации эритроцитарных стадий малярийных паразитов человека и животных явились основой создания моделей непрерывного развития возбудителя тропичеокой малярии Р.Га1с1раггш в сиотеме паразит-эритроцит и создания экспериментальной базы для накопления биомасоы возбудителя с целью изучения биологии, биохимии, цитохимии паразитов, получения антигенного материала, предварительного отбора противомалярийных препаратов и биологически активных веществ, криобиологических исследований, изучения внутриклеточного развития плазмодиев в мутантных эритроцитах.

Открытие состояния покоя в эритронитарной шизогонии малярийных паразитов имеет ванное практическое значение для эпидемиологии, химиотерапии, криоконсервавди, транспортировки и выделения штаммов от больного, а также при поддержании непрерывной культуры эритроцитарных стадий малярийных паразитов.

Установление ряда физико-химических факторов позволило на ®х оонове разработать и усовершенствовать опоообы кухыивирова-ажя и транспортировки малярийных паразитов. Б этом отношении имеет таксе большое значение предлогенное нами полуавтоматическое устройство, которое позволяет предварительно оценивать при-

'годвоать эритроцитов к заражении и одновременно поддерживать культуры в нескольких камерах. Предложенный опоооб уменьшает угрозу потери культуры, позволяет значительно экономить рабочее время и питательные среды. Разработаны различны* опоообы отиму-ляши развития паразитов: пропускание культуры через колонку-капилляр, сокультивирование p. falciparum о клетками печени крыс M.nataieneis, применение культуры гепатоцитов на микроносителях, что позволяет стабилизировать непрерывное поддержание культуры P.falciparum, увеличить выход биомасоы. Рекомендованный способ проверки целостности мембранных фильтров, позволил отказатьоя от закупки зарубежных доргостоящих уог-ройотв. Установлена пригодность отечественной питательной ореды rpmi-1640 для культивирования малярийных паразитов, в итоге получена возможность вести культуры целиком на отечественных средах и оборудовании, что открывает пути широкого практического использования непрерывной культуры плазмодиев в СССР. Доказана принципиальная возможность внедрения моделей плазмодиев для окрянинга противомалярийных препаратов и биологически активных веществ в относительно короткие ороки.

Использование культуры для предварительного отбора противомалярийных препаратов и биологически вктивних веществ позволили, впервые выявить противомалярийную вктивность отечественных цитоА отатиков - рубомипина, брунеомивдна, фторафура, фторурацила и препарата растительного происхождения - артемизинина, а также биологически активных веществ: антител к csp- пептиду, антатв* к эритроцитярной стадии плазмодиев и моноклонадьных антител против белков эритроцитов.

Исследование по криоконсерваиии малярийных паразитов также имеет большое практическое значение. В результате проведена* яа-

правленного скрининга криопротекторов (интра-, эксграделлвляр-ного и смешанного механизмов действия), одноступенчатого и программного замораживания плазмодиев о учетом их физиологического ооотояния были предложены оптимальные, экономически более выгодные варианты криоконсервации плазмодиев.

Измерение скорости гликолиза в малярийных паразитах как бисхищ чес кого критерия позволяет быстро выбирать криопротекто-ры на основе их действия на метаболизм плазмодиев и определить жизнеспоообнооть плазмодиев в процесое культивирования.

Положения, выносимые на защиту

- Оптимизация методов непрерывного культивирования может быть обеспечена за счет стабилизации различных штаммов плазмодиев и параметров их адаптации, применения омешанной кулиуральной орвды, газовой смеои определенного состава и оовобовдения от нежизнеспособных эритроцитов.

- Стимуляция развития паразитов в культуре достигается путем сокультивирования с клетками печени грызунов, что расширяет возможность исследования взаимоотношений малярийных паразитов и клеток печени.

- Возможность p.falciparum в ходе зритроцитарной шизогонии in vitro переходить в состояние покоя без потери жиз-неспоообнооти, что обусловливает потенциальную опасность изменения шрулентнооти и антигенных овойотв штамма, его чувствительности к лекарственным препаратам.

Апробашя работы. Ооновные положения диооертации доложены ва заседании Московского отделения ВОПР (14 ноября 1985); на заседании Ученого совета ИМИ в ТЫ им. С.М.Кирова (1985, 1986) и Шютнтуза епндемиодогаи, гигиены и профзаболеваний КЗ Азерб.СОР Ш8Э); Всесоюзном оьезде протозоологов (Ленинград, 1987); на

II.

' ыездународном семинаре до малярии и лейшманиоэу (Мооква,1987); на оовмаотном межлабораторном оовещании ИМП и ТМ им. В.И.Мар-циновского и Института биоорганичаокой химии им. М.М.Шемякина (Москва, 1983); на симпозиума "Структура, биооивгез и функции молекулярных элементов иммунной сиотемын (2-4 июля 1987 г., ц.Пущино), на конференции молодых ученых социалистических отран по биоорганичаокой химии 21-28 августе 1988 г., на коллоквиумах лаборатории молекулярной биологии паразитов ИМЯ и ТМ им.Б.И.Ыар-циновокого.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы.

Объем и структура работы. Диооертация изложена на страницах машинопиои, состоит из введения, обзора литературы и 6 глав собственных исследований, указателя литературы и приложения. Работа иллюотрирована 23 таблицами и 52 риоункама. Библиографический указатель содержит отечественных и зарубежных источников.

Настоящая работа выполнялась в соответствии о планами НИР ИМП и 1"М им. Е.И.Марциновокого в лаборатории молекулярной биологии паразитов и в отделении биологии паразитов, методов диагностики и культивирования. Некоторые фрагменты работы выполнены оовмеотно о сотрудниками Института биологической и медицинской химии, о Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АШ СОСУ, о филиалом Института оиоорганической химии им. Ы.Ы.Шамя-кина, о Инотитутом молекулярной биологии АН СССР.

Автор считает овоим приятным долгом выразить глубокую бла-

годарность академику АМН СССР Ф.Ф.Сопрунову , а также доктору

биологических наук Г.Г.Акиншшой и доктору биологических наук Л.Н.Гринбергу за консультации и сотрудничество.

СОДЕРЖАНИЙ РАБОТЫ Материалы и основные методы

Настоящее исследование проведено на двух видах возбудителя малярии человека ( P.falciparum - возбудитель тропической малярш, P.viva* - возбудитель трехдневной малярии человека) и одром вида возбудителя малярии грызунов I p.berghei .штамм ANKA ). Использованы II штаммов: 9 - p.falciparum (6 - хло-рохилустойчивых и 3 - хлорохинчувствительных), I - Р.ViVax и I - p.berghei ; 8 штаммов получены из Швейцарии, Вьетнама и Индии. Один штамм выделен непосредственно нами из больного СЦОЛИУВ, кафедра тропических болезней).

Культивирование малярийных паразитов осуществляли по методу Trager и Jensen (1976) в эксикаторе со овечой в нашей модификации о использованием также проточной сиотемы, разработанной нами. При культивировании малярийных паразитов использовали питательную ореду RPMi-1640 ("Gibco" , США; "Plow" , Великобритания), буфер Нерее I "Sigma" , США), эритроциты, сыворотки человека разных групп получали оо станции переливания крови. Питательные ореды стерилизовали через мембранные фильтры "Millipore" о диаметром пор 0,22 мкм. Целостность мембранных фильтров и правильное их расположение в держателе проверяли по предложенному нами опоообу. Культивирование вели в плаотиковых, отеклянных чашках, в пенициллиновых флаконах оо отеклянной крышкой. Пораженные эритроциты фракционировали по степени зрелости паразитов по методу Гринберга (1984). Эритроцигарныв отадии малярийных паразитов грызунов p.berghei культивировали по методу Trager И Jensen (1976) и Bona et ai. (1983). В экспериментах использовали врио лжкки (Wietarj, ааражвнных p.berghei ■ (штамм ажа ).

Культуры поддерживали только о добавлением к ореде крови крыо, содержащей не менее 10-15$ ретикулоцитов. Рагикулоцитоз у экспериментальных животных индуцировали предложенным нами оповодом. Культивирование p.vivax ооущеотвляли о помощью метода Trager и jensen в нашей модификации. Кровь, содержащую ретикулоциты, получади от больного о бага-талассемией и аутоиммунной - гемолитической анемией. Развитие p.falciparum в эритроцитах о различной патологией изучали на резуо отрицательных (Rb") эритроцитах различных антигенных групп и о различными аномальными гемо-глобинами ( нъас, нъао, HbAS). Эритроциты о гемоглобинопатией были получены от студентов Университета Дружбы Народов им. П.Лумуыбы.

Ингибирущее действие соединений на рост и развитие паразитов в культуре оценивали в 24-28-часовых теотах, рекомендованных ВОЗ. Чувствительность плазмодиев к противомалярийным препаратам учитывали только в том олучае, если в контроле увеличение poors культуры составляло не менее чем в 2 раза по оравнению с опытом. Для криоконсервации биомагериала эритроцитарнцх стадий P.falcipa rum использовали 10$, 20/5,30$ растворы глицерина и диметилоульфок-сида (Д1Л30) в изотоническом солевом растворе (рН 7,4-7,6); экс-трацеллюлярные - поливинилпирролидон (ПВП) и смесь Роу ( Kowe et ai. , 1968), омешанного механизма дейотвия. Раотворы криопро~ текторов стерилизовали фильтрованием чераз мембранные фильтры ("Miiiipore") или автоклавированием. Программное заморажиьа-ние осуществлялось с применением уотройзтва программного охлаж-де1шя (УОП). Скорость гликолиза в малярийных паразитах определяли по методу Гринберга, Нуштаева (1987). Опиты проводили в отеклянном капилляра или в пенициллиновых флаконах, герметично закрытых резиновой пробкой с использованием солевого раотвора.

Гвматокрит суспензии вовгда ооотавлял 10$. Соотав газовой фазы (р02; р002) измеряли на биологичаоком микроанализаторе 0Р-2Ю/2 фирмы Раделкио (ВНР). Активность Г-6-ФД определялась о помощью метода Берншгейна.

Boa эксперименты по культивированию плазмодиев контролировались микроокопичеокими методами. Мазки фиксировали в метаноле, окрашивали по Романовекому-Гимза по общепринятой методике и просматривали на микроокопа МБИ-15 (с иммерсионной оиотемой, увеличение 90X7; 90X20). Микрофотографирование выполнялось при ув, 90X7. Статистическая обработка данных проведена по методу Фишара-Стццента (на ЭВМСМ-4).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Моделирование непрерывного эритроцигарного цикла развития хлорохинчувотвительных и хлорохинуотойчивых штаммов

P.falciparum

Ооновной задачей являлось изучение действия физико-химичео-ких факторов на выживаемость и еритроцитердый цикл плазмодиев в период транспортировки,, адаптации и непрерывного культивирования. Первоначальные эксперименты проводили по методу Trager и Jensen (1976) в отандартных чашках Петри (диаметр 35-65 мм) в экои-каторе оо овечой. Несмотря на соблюдение во ах уоловий, паразиты не развивались, а через 48-96 часов культивирования дегенерировали (рио. I). Посла погашения овачи содержание кислорода в закрытом эксикатора достигало 19,5+0,5$, углекислоого газа -1,4±0,5%, Однако при увеличении чиола свечей содержание кислорода ошшдооь и увеличивалось содержание углекислого газа. Наиоо-паа выраины эти различия в калом эксикаторе. В соответствии о пашнонази газовой фазы нзизнялся роот паразитемии в культуре.

Активный рост наблюдался в малом эксикаторе с двумя овечами и в большом эксикатора с тремя свечами. Таким ооразом, при культивировании Р. falclparura по классическому методу Trager и Jensen 11976) на содержание кислорода и углекислого газа влиял объем эксикатора и число свечей. В данном методе pH культу-ральной срады не всегда уровновешивался только за очет огора-ния свечай (даже при наличии высокой концентрации С02 в газовой фаза - при использовании 3 овечай). По-видимому, при добавлении соды в слабокислой среде нейтрализация протекала медленно. В результата этого углекислый газ улетучивался, а среда подщелачивалась. Эти результаты говорят о том, что при выделении штаммов или посла их транспортировки, когда развитие плазмодиев замедлено и паразитемия низкая, необходимо учитывать количество бикарбоната натрия, добавляемого в питательную сраду. Наши результаты такжэ показали, что штаммы, транспортированные при температуре близкой к 37°tl, в культура развиваются и адаптируются быстрее, чем транспортированные при низкой температуре. Однако, если для доотавки траоуется оолае суток, то культуры можно транспортировать при низкой температура. Выявление ряда факторов, действующих на развитие паразитов, в дальнейшем способствовало культивированию плазмодиев в стандартных флаконах из-под антибиотиков, закрывающихся специальной стеклянной крышкой в эксикаторе со свачой, или разиновой пробкой (баз эксикатора), а гакяв в пластиковых капиллярах. Преимущество флаконов и капилляров состоит в том, что их можно использовать многократно, они доступны, позволяют экономить дорогостоящую питательную среду, тщательнее соблюдать правила асептики. В дальнейшем фчаконы и капилляры была использованы для транспортировки культур плазмодиев, Уотройзтво, сконструированное нами, обеспечивало автоматическое обновление

питательной среды о помощью таймера и^в отличие от известных приборов, позволило предварительно проверять пригодность эритроцитов к заражению, одновременно поддерживать культуры в нескольких камерах о различной паразитемией, экономить питательную среду и отказатьоя от употребления газовых баллонов, так как в предложенном способе источником углекислого газа служит 7,5$ раствор бикарбоната натрия (заявка на изобретение № 4338752/13 от 17.ХП.1987 г.).

В последующих опытах было установлено, что rpmi-1640 (партия - 5-23), изготовленная из отечественных ингредиентов, поддерживает развитие p.falciparum в культуре. В течение десяти пассажей паразкгемия I в момент пересева в культуре превышала Ъ% (при исходной паразигемии около 0,5-1,0$). Впервые была построена кривая роста культуры p.falciparum и определены фазы (лаг-фаза, фаза экспоненциального роста и др.), что позволило о учетом фазы роста культуры оптимизировать методы поддержания культуры, а также определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам и к биологичеоки активным вещеотвам. Большое значение имеет отказ, от использования химичеоких агентов для синхронизации культуры. Было обнаружено, что паразиты не развиваются полностью в средах, где отсутствуют некоторые необходимые компоненты (среда МЕМ-4, или rfmi-1640 ¿93 сыворотки); синхронизация P.falciparum путем разделения инфицированных эритроцитов по возраоту в стеклянном капилляре с последующим культивированием также является проотым и экономичным методом, который был применен впервые.

При непрерывном культивировании часто возникает необходимость стимуляции малярийных паразитов и увеличения их числа в культура. Основные подходы к решению этих вопросов включают ней-

. трализашш молочной кислоты, поддержание постоянства рН среды, обеспечение паразитов свежими эритроцитами. Однако эти способы не всегда обеспечивают успех. Оказалось, что присутствие в среда эритроцитов в предгемолитическом состоянии угнетает развитие плазмодиев. Для удаления таких эритроцитов был использован предложенный нами колонка-капилляр. Он представляет собой термостатированную стеклянную трубку о несколькими капиллярными сужениями диаметром 100 мк. При пропускании через колонку суспензии зараженных эритроцитов из культуры P.falciparum избирательно разрушаются те эритроциты, которые находятся в лредгемолитичес-ком состоянии. После пропускания культуры через колонку-капилляр гематокрит снижался за счет разрушения старых эритроцитов, наб-людалаоь активизация плазмодиев через 48-96 часов. В то же вре-ся добавление свежих эритроцитов в культуру без предварительной ее обработки через колонку-капилляр практически на стимулировало развитие плазмодиев и нередко заканчивались гибелью паразитов.

Таким образом, при пропускании через колонку с систамой капилляров культура очищается от эритроцитов, непригодных для нормального развития внутриклеточных паразитов. После добавления в культуру свежих эритроцитов происходит быстрое размножение паразитов, а это, в свою очередь, позволяет сэкономить дорогостоящую питательную среду, сыворотку, реактивы, а также раоочее время. Ц качестве возможного биостимулятора размножения эритроцитарных форм р.falciparum также были использованы клетки печени. Проведено три серии экспериментов и било показано, что клетки печени крыс М.natalensia стимулируют развитие ¡'. falciparum (игами

F-гЗпри нормальном развитии возбудителя и в случае его угнетения под влиянием различных факторон, а частности, после длительной транспортировки и др. (рис.2). Этот ытамм не адоптироиалс;! в

течение месяца,яри этом паразитемия сохранялась на уровне 0,5-1,02. В уоловиях 2-4-оуточного сокультивирования с клетками пачени размножение паразитов в культуре возросло. На 6-й день паразитемия составляла 6,1$, а в контроле - 2%. Эти различия сохранялись в течение трех последующих пассажей. Известно, что в короткий орок в результате контактного торможения, резкого изменения рН среды и т.д. культура клеток постепенно дегенерирует. Для устранения указанных ограничений в последние годы применяются различные микроносители в качестве поверхности для роста культур. В опытах были использованы клетки печени молодых мышей линии ваев/с и в качестве микроносителя желатин отечественного производства. Клетки в указанном микроносителе стимулировали развитие плазмодиев яри культивировании их в больших объемах и паразитемия в культурах о микроносителем увеличивалась в 2-3 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, применяя микроносители, можно сокультивиро-вать плазмодии и гепатоциты в больших объемах. Микроносители с гепатоцитами грызунов предотвращают контактное торможение в малом объема культуры. При использовании микроносителей развитие культуры легко контролируется, получаются воспроизводимые результаты, затрачиваетоя значительно маньше времени, уменьшается риск бактериального загрязнения культур, снижается число манипуляций при выращивании большого количества клеток в одном культуральном сооуде.

к

Исследование оостоянияцпокоя в процессе эритроцитарной

ЕН30Г0НИИ у Р.Ра1с1рагит

При длительном культивировании Р, Га1с1рагШ1 хлорохин-чувствительного штамма М-25/Заир и хлорохинуотойчивого штамма

PlB.Î. JJIUM «HTIII rilOIOI фии pilirtl» r.fllltHnB

(■tin »-¿S/3up) 4 »"га

По «6i epuiars ntpt - coons rawie» фим (I),

ira - i^iiihim (j)

• - соя petit* iMioptu ■ iriiiicjcrt rua • «ojiidi annirepa 10 210 n)i 9 - t luoi »««atropa (PI90 m). Chtim огоя0кп - eonfimii «»сироп, (итрахоаш-ut « jrmcien rtM < tnKia о mim * пц»** "M». Ийфри ROI OVQlOltMI - »1С« tlinl

Г«.], CTmjáipjwl >M««t qiküt« utm »t»n

l.uiiimli npa eti)i»i»r«iH» « о ijaktjpM r.fatelperai (atl« N¿)/h<ri«i) noca* трив-порта paart«

По oca BpiHitT - ««штм (t)

по ос* «ввинв - tpiaa qtitiii^iuii {tjl)

i;iift;iM ши - стммртвма foaoaaa.

cuhii« - miinin « UlttUI UtHtt ctpiai - провн в »4UIIIMI о на «i »patpaaawt

ta

а ? а t

Гав.э. Ctmjtm»» раиатм r.faietMM (atan

» куакгур« aaca« «ицшам -«та-«»-»» < тт '•» ч врав)

1*1 itfNf ян« ерш

i » чара* i «im <мм (Им ерш

S - «ара* « fjwa аосм <im ерчм

« - «pal • •!»«« INN ••••• tfw

Па аса • pautf - jewru aapuataa (t)

Chum с r«m au - nihii i«timi«im о тема -

• гИ*мп| ки«ш a ntiai • мми«

Гаа.4. >и»и1й /"•/ и muai • t .№««»

(avaa 1-41/íT) и a laaaa *•«•* «paaa. t • «мм ммм ipiat i - к мм «нам I • niwttnm i рагу» aar«.

la a«a >»i«fti мм - »»амгаач (I). «ми -•«•мам /Ji •/ тми ( Q ■ И**)

f-25 /Вьетнам чаото наблюдалось замедление роста. При этом размеры паразитов уменьшались прежде всего за счет цитоплазмы. Более того, по мара замедления эритроцитарного цикла развития в культура увеличивалось число атипичных форм паразитов на ранних стадиях развития - "сжавшиеоя" трофозоиты. Однако при добавлении в сраду свежих эритроцитов и питательной среды с человеческой оывороткой (20-25$) группы АВ? метаболическая активность паразитов и нормальный эритроцитарный.цикл развития восстанавливались. Повторение этого явления дало нам основание думать о возможном переходе плазмодиев в состояние покоя. Покоящимися называют такие клетки, которые выходят из митогического цикла на неопределенное время, оставаясь при этом жизнеспособными и полностью сохраняющими способность к размножению (Япифанова, I9B3). С целью проварки этого положения и моделирования состояния покоя было проведено несколько серий экспериментов. Были обнаружены различные изменения отроания и развития P.falciparum в зависимости от применяемых способов индуцирования возможного состояния покоя, что позволило разделить их на 2 группы. В I группа при поддержании культуры баз смены среды и выдерживании при t +4°С происходит прекращение роста паразитов в культуре, образование атипичных колец и грофозоигов и через 4-6 суток культивирования баз смены орады шизогония приостанавливалась (рис. 3). Однако паразиты на погибают. После перевода на среду оо овежими молодыми эритроцитами и повышенным содержанием сыворотки эритровд-тарная шизогония медленно возооновлялась и только на 6 оутки в культуре появлялись пизонты. Их численность составляла 4,4+0,07$. При действии низкой температуры 1+4°0) на эрятроцитаряую шизогонию малярийные паразиты оогаюгся живыми даже в течение 36 суток. Эритроцитарная шизогония при +37°0 возобновлялась примерно через

месяц, а через 40-45 дней культивирования паразитемия достигала 1%.

Ко П группе отнесены способы поддержания культуры в среде МЕМ-4 с сывороткой АВ+ и в среде RPMI-1640 йез оыворотки. Указанные среды, вызывали резкое угнетение роста паразитов с преобладанием трофозоитов, активизация паразитов наблюдалась через 2-3 дня после отимуляции. Реакция паразитов, находящихся в сос-огоянии покоя, на отимулирующиэ факторы зависала от опоооба индуцирования, и от длительности их пребывания в неблагоприятных условиях.

Таким образом, под воздействием различных неблагоприятных условий малярийные паразиты способны прекращать свое развитие в эритроцитарном шкла и переходить в состояние покоя. Длительно сохраняя жизнеспособность, они могут возобновить развитие под воздействием стимулирующих факторов. Этот феномен наблюдается в однослойной и суспензионной культурах клеток животных и в культурах микроорганизмов (Ь'пифанова, I9B3). Синтез белка и ДНК у плазмодиев в состоянии покоя в эритроцитарном цикле p.falciparum, вызванном культивированием без смены среды в течение 4-5 дней, был угнетен, так как отмечено резкое снижение включения как 35s-метиошна (рис. 4) и ( 2,в3н)- гилогоксантияа - предшественников синтеза протеина и ДНК. Однако пооле омвны орады метаболичеокая активность плазмодиев возобновляется.

Сравнительное изучение еще одного критерия метаболизма -окорости гликолиза показало, что в культуре p.falciparum при возможном состоянии покоя о паразитемией около Ъ% отсутствует гликолиз, хотя описано изменение скорости гликолиза при парази-гемии даже около 1% (Noosthaev et ai., 1986). Итак, представленные результаты свидетельствуют, что состояние покоя у шля-

рийных паразитов характеризуется низкой метаболической активностью по сравнению о нормально развивающимися, ингактнши па-разиташ. Снижение метаболизма при ооотоянии покоя описано и для других эукариот.

Развитие p.falciparum изучено также при оохранении условий культивирования, но о изменением свойств эритроцитов В опытах были использованы эритроциты от лиц о разной патологией, а именно:

- эритроциты с аномалией гемоглобиновой молекулы или еа сочетание с энзимопативй ( HbAD, HbAS, нъас. и их сочетание с дефицитом Г6-ОД);

- эритроциты, отличающиеся по группе и разус-фактору (Rh);

- эритроциты, имеющие гемоглобинопатии, обусловленные нарушением скорости синтеза глобиновых полипептидных цепей гемоглобина (бета-талаоремия).

Результаты опытов показали, что p.falciparum нормально развиваются в эритроцитах анп+ и aru". Морфологические изменения трофозоитов наблюдали в культура в течение нескольких недель при омене одной группы эритроцитов на другую. Развитие плазмодиев в эритроцитах о HbAD на отличалось от развития паразитов в эритроцитах о нормальным гемоглобином (ньаа).

Развитие малярийных паразитов в эритроцитах с бета-талассе-иией в течение 4-5 дней проходило нормально, затем рост плазмодиев замедлялся по сравнению с контрольными культурами, а примерно через 2 недели рост прекращался, лараллвльно со снижением роста культуры наблюдали изменение паразитов ("сжатые формы") и состава популяций паразита (рио. 5). Наши результаты согласуются с данными других авторов, которые показывают, что нормальное разви-

Совмвогао о Троицкой О.В.

t i

1 i-г

P«o,5,fiiiitil f.filclMNi > Kjiktjpi, cowpia«»« 9р»тро-im бошого 0it»~TU9coev>*l.

00 ooa opiillt: • - ntpeiiMei» (%)\ a - Пфмвга

1 - яоряшмвна »ригpe mm

2 - »piTpeaaru боаного («tnruiooniti Я - muai

a -rpo#a»a*m a-tiiotTH

отрет - nepton о юбв1л«1в«а ipirponroi

по сю» а?си*сс-рг«мя култавярорантНсут).

DT Ml

Г-25/Birr ним

кггам

Э

б

12

FBC.Ç, PtSIITBt f.f«lolptrwi ■ íjnrjf* 89 ap»?pon«TiX в i'piutia гооогловиов (ШЛ) /1/4 аноимкгаа гчио-riofluo« (ШС) /г/ i ЯВ1С > сетев■■ в а»4 «airo и /9/!

га оса оржши - naçiitT«!)*« m ос» вбоавсе * »рам ктаагаавроавмм (cjt) а - агаа« Н)/1итга в - mm 1-25/3lip

-2

150

(■■г/м)

Рш.в. (11ЯМ lintu Ж П9Г1Ш «I C!í i pí?f м рос г К7>»Т7РИ r.fftlelpwv« (arm Р-23) По оса opuatt • часао пяриатеаКиа тыс.эритроцитов) i ебсааес кониввтрвш* ам<г«ггм(икг/мл)

1 - lopatitiu кроавш arejioraoöya«**;

2 - unttat в oí m ад аа р!95; 8 • ait! to it > аоетвлу а csr

Hl

rh

rfi

É_

. &»»«**• IlflTttt 19 №|| Ш»? (М) II рек

r.fatolptra» (ata«« Г-25/lMfaa«) о i}i»m«. По ooa opauav - sapaairtvaa (*}; m ooa ateuoot

0 - ia<u»iM UfiutiiH

1 - n^iiifiiu «<pti ч «too» a емугепм' smtiu i - I npaoyronta nmiua • nitiirpaui 150 мг/и . 3 - i ffpwcyrcrtini ntirrtn* a ипт:»мтр*1Я» 300 » * • t пгисутст»** n»irr*a» в *они«1ггр«зт 4Ь0 * Смпм etoaoiu • nitpcitni oianj, «ж^тмЦи 00 IT Т1Д II IMV

тив плазмодиев в патологических эритроцитах (бета-талассамия) происходит в первые дни культивирования, а в конце недели в связи с появлением в культуре мишенавидных эритроцитов-замедля-етоя, появляются видоизменшный'Ъ жатые" молодые формы паразитов.

Активизация p.falciparum отмечалась через 2-3 дня в эритроцитах с ньас, а при сочетании с дефицитом Г-6-ОД -примерно через 10 дней (рис.6). Подобная картина наблюдалась также в эритроцитах о гемоглобином as при культивировании плазмодиев в условиях пониженного содержания киолорода (в эксикаторе со свечой развитие плазмодиев происходит как в эритроцитах о нъаа, так и о ньаз в течение 4 дней практически одинаково). Однако, в дальнейшем в течение b-IO дней в эритроцитах о гемоглооином as развитие нарушалось и паразигемия на превышала 2%. Примерно через 10 дней культивирования снова активизируется развитие плазмодиев в культуре. В ходе культивирования встречались также гамагоцигы. На основе полученных результатов предположили, что низкая паразигемия у носителей эригроцитрв о аномальным гемоглобином связана с тем, что в таких эритроцитах значительно замедляется развитие плазмодиев или они переходят в состояние покоя. При этом продолжительность шизогонии удлиняется и паразигемия не нараотает. В пользу такого предположения овидегэльогвует тот факт, что в этих эритроцитах паразиты встречаются в начальной стадии развития, из которой они могут переходить в состояние покоя.

Таким образом, полученные результаты позволяют дать новое толкование причин возникновения эритроцитарного рецидива при малярии. Сложность генома эукариог, к которым относятся малярийные паразиты, наличие клеточного цикла позволяют при неблагоприятных факторах регулировать активность метаболизма, в результата чего они, выходя из клеточного цикла, переходят в состояние

■ покоя, которое сопровождается фазовыми преобразованиями. Завершение отадин покоя характеризуется активизацией клеток. В пользу саморегуляции свидетельствует появление в культуре видоизмененных паразитов ("кризисное" соогояние , "диссоциация"); способность малярийных паразитов синтезировать фермент Г-6-ФД в эритроцитах с его дефицитом; изменение чувствительности плазмодиев к хлорохину при поддержании их в эритроцитах о Hbss и нъас и, наконец, изменчивость поверхностных антигенов у бесполых эритроцитарных форм P.falciparum и p.knowlesi.

Изменения биологических свойств плазмодиев в состоянии покоя, которые мы наблюдали в культуре, неоошенно, направлено на выживание паразита в неблагоприятных условиях и, можно ожидать, что при определенных, ситуациях (иммунитет, лечение и т.п.) ала-логичное состояние покоя возникает in vivo в организма хозяина.

Испытание противомалярийных соединений и биологически

активных веществ в культуре P.falciparum

Апробировали и оптимизировали методы определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным соединениям и биологически активным веществам в культуре P.falciparum. Подобные исследования были обусловлены тем, что существующие методы не всегда дают воспроизводимые результаты. Оптимизация этих метоДрв заключалась в учета физико-химических и биологичеоких факторов, связанных с развитием плазмодиев.

Добавление в культуру смешанной питательной среды создает более благоприятные условия для активного развития плазмодиев. Предлагаемый нами способ оценки биологической активности соединений требует 48-72 часов и позволяет получить точные, хорошо воспроизводимые результаты. В литературе подобный подход нами не обнаружен.

Полушкромагоды для определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам в пенициллиновых флаконах или в пластиковом капилляра позволяют значительно упростить существующие методы исследования (отказаться от свечей, эксикатора и т.д.). Для выяснения пригодности поддерживаемой культуральной линии для испытания антималярийной активности новых соединений было необходимо подтвердить эффективность известных клинических препаратов. С этой целью были использованы хлорохин и акрихин в концентрациях, близких к концентрациям препаратов в плазма крови при введении терапевтических доз. Действительно, препараты в -7 -7

концентрациях 1,25*10 М и 5,0-10 М полностью прекращали рост паразитов хлорохинчувотвительного штамма. Таким образом, культура штаммов p.falciparum могла служить моделью для испытания соединений с неизвестной антималярийной активностью, поэтому следующим этапом работы было исследование противомалярийной акгав-нроти ряда групп химичеоких соединений. Такие фармакопейные препараты ранее на были испытаны на антималярийную активность.,В 5 оериях опытов были испытаны i. соединения: антибиотики рубомицин и брунаомидан (полученные в Института новых антибиотиков АМН СССР); оинтегические фторсодаржащие штостатики - фторурацил и фторафур (разработанные в Институте органического синтеза АН СССР, Рига). Был иоследован диапазон концентраций от 50 нг/мл до 50 мкг/мл в стерильных водных раогворах. Вое 4 изученных препарата оказались активными в отношении эритроцитарных стадий малярийных паразитов P.falciparum. Расочитандые концентрации ооота-вили для рубомицина - 2 мкг/мл, для брунаомицина - 30 нг/мл, для фторафура - 70 мкг/мл, для фторурацила - 15 мкг/мл. Ю50 для рубомицина и брунеомицана близки к эффективным концентрациям хлоро-хина in vitro. Указанные препараты используют в клиника в качает-

ва цитостатиков при онкологических заболеваниях. Фармакологические свойства препаратов обусловливают их относительно высокую токсичность. Наши опыты на здоровых и зараженных мышах (P.berg-he 1) подтвердили данные справочной литературы о выоокой токсичности брунвошцина. В связи с этим трудно представить перспективы использования брунаомицина или рубомишша для лечения «злярии курсовыми дозами. В то же время нельзя исключить возможность однократного применения такого препарата для купирования тяжелых случаев тропичеокой малярии,связанных с выоокой паразитемией.

В Институте молекулярной биологии АН СССР (Мооква) синтези-

х)

рован ряд соединений на основа акрихина . Акрихин,иопользованный как интаркалятор ДНК,был связан с аминокислотами,имеющими самостоятельную биологическую активность. Предполагалось, что эти соединения должны связываться о ДНК плазмодия и обладать ангима-лярийной активностью. Строение веществ отвечает формуле 9-акриди-нил-гидрозид-R. В качеогва заместителей использовали различные

о л

аминокислоты. Диапазон концентраций (от 10 до ftP'M) был вы-Сран, исходя из того, что акрихин полностью подавлял развитие паразитов именно в этих концентрациях.

Как показали результаты опытов, вое испытанные соединения,в той или иной степени, обладали противомалярийной активностью,ин-

гибирующий эффект почти всех испытанных соединений проявлялся в

7

диапазоне концентраций от 10 до ЮМ. Как правило, этот диапазон совпадает с теми концентрациями ангималярийных соединений; производных акридина и хинояина, которые образуются in vivo при приема терапевтических доз препаратов. По сравнению о акрихином, испытанные соединения имеют активность примерно на порядок ниже. Однако предполагают, что снижение специфической активности

Препараты синтезированы Шибнавым В.А. и Финогеновой М.П.

может сопровождаться снижением токоичности, так что терапегичео-кий индеко препарата лежит в допустимых пределах, поэтому бета-ала ниновые и альфа-аминомасляные производные 6-хлор и 6-нейроак-ридина заслуживают дальнейшего изучения в опытах на животных.Оценена противомалярийная активность артемизинина и экдиотерона-пре-паратов раотительного происхождения (отечественного производства). Полученные результаты показали, что оба препарата ингибируют развитие плазмодиев в культуре, противомалярийная активность артемизинина была выше (Ю50 » 5.10"®М), чем экдистерона (Ю50 =

Л * • • • ;

■ 5«I0 М). Результаты опытов с аргемизинином in vitro под-твервдавт данные, полученные на мышах, зараженных P.berghel (Федорова, 1989). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о несомненной активнооти изучаемых соединений.

Исследование действия противомалярийных препаратов на выживаемость эритроцитарной стадии малярийных паразитов в состоянии покоя имеет большое теоретическое и практическое значение для понимания механизма возникновения эритроцитарных рецидивов. В связи о этим в опытах было изучено также действие хлорохина на P.falci-parum при возможном состоянии покоя в аритроштарной шизогонии, Результаты оценивали паразитологичеоки и на оонове определения включения (г.^Ьгипокоантина в ДНК паразита (рис.7). В отличив от контроля (культуры без добавления препарата) в опытной культуре после добавления хлорохина в концентрации 1,8-10 М в течение 48-чаоовой инкуоации происходит незначительная стимуляция

с

включения гипокоантина, а при концентрации 0,3.10 М стимуляция оинтеза ДНК в плазмодиях выше, хотя при такой концентрации препарата интактные раотущиа паразиты погибают.

Таким образом, результаты впервые проведенных исследований свидетельствуют о том, что бесполые формы эритроцитарных стадий P.falciparum при возможном состоянии покоя нечувствительны

к действию хлорохина.

Одной из задач наиай работы было использование культуры p.falciparum для предварительного отбора биологически активных веществ. Был изучен ингибирующий эффект антитела к олигомеру тетрапептида csp и shahp*'. Циркумспорозоитный белок icsp) является основным белком,синтезируемым спорозоитом.Малый гиотидин-аланин-богатый балок (sharp), вероятно,учаотвует в адгезии зараженных эритроцитов я клеткам эндотелия сооудов.Белок р195 является основным поверхностним белком паразитов и содержит икмунодо-

Совместно о Юровским В.В.

шшангяые детерминанты мерозоигов и стадий поздней шизогонии. На рио.8 показано влияние антител к пептидам из est и р195 на poor культуры P.falciparum (штамм F-25 ). Ингибирутаций эффект антител к пептиду из р195 незначителен. Антитела к пептиду из CSP ингибируют рост культуры. Однако при начальных коныенарациях происходит стимуляция развития, а повышение концентрации антител до 150 мкг/мл сильно угнетает рост по сравнению с нормальным IgO. Обнаруженная активность антител против пептида из CSP согласуется о данными литературы о наличии в белковой оболочке мерозоитов двух сходных тетрапептидных последовательностей и о связывании антител против кровяных стадий оо опорозоигом. Обратный эффект - взаимодействие антител против детерминант белка из CSP с мерозоитом - обнаружен наш впервые.

На рис,9 показано влияние антител к пептиду из sharp на рост культуры P.falciparum. Видно, что антитела к пептиду во воех испытанных концентрациях ингибируют рост паразитов. В культуре p.falciparum также было испытано действие гексапеп-тйда (Т-4) и додекапептида (Т-5) из sharp. Найдено, что Т-4, но на Т-5, ингибирует развитие плазмодиев. Был доказан ингиби-рующий эффект моноклональных антител против белков эригроштар-ных стадий.

Таким образом, имеющиеся в нашем распоряжении культуры p.falciparum позволили оценить прогивомаляриную активность ряда химических соединений и биологических препаратов.

Сравнительное изучение различных методов криоконоервации эритроцигарных стадий

P.falciparum

В последние годы аз различных лабораторий мира поступает информация, которая свидетельствует о возможном изменении исходных биологических овойств различных штаммов, поддерживаемых как in vivo, так и in vitro. Более того, достижения биотехнологии требуют достаточного количества биомасоы, что нельзя предотавить баз криоконоервации. Осуществление вышеуказанных требований реально лишь при оптимизации опособов криоконоервации. В.овяза о этим, перед наг,si стояла задача оптимизации условий криоконоервации беополых форм эритроцигарных стадий малярийных паразитов на основе изучения факторов, влияющих на их выживаемость и биологические овойотва.

В качестве критериев структурной и функциональной сохранности плазмодиев, изучали соотав популяций штаммов до и после криогенной коноврвации, инфактивнооть и мзвдболичеокую активность плазмодиев. Последнюю определяли по скорости гликолиза у малярийнях паразитов и включения 353' — мети^нияа в белки паразита.

Первоначальные эксперименты были посвящены выбору контейнеров и криопротекторов для криоконоервации биоматериала. Наибольшая сохранность клеток наблюдалась в предложенном нами металлической контейнере (4?,8+2,3$),тогда как в пластиковой пробирке она составляла 29,5+3,9$ (Р < О,ООО, а в капилляре - 32,2+1,97$

(Р < 0,001). Сравнительное изучение криоконсерваиии бесполых форм малярийных паразитов с использованием различных криопротек-торов показало, что все испытанные криопрогакторы, независимо от механизма действия, обладают криозащитным эффектом (табл.1). При использовании в качества криопротектора смеси Rowe (1968), общая сохранность малярийных паразитов достигала максимума (43,0R+2,73/S) и была выоокой в случав 12% диметилсульфоксида (ДМСО) 37,2+2,86$. Экотрапеллюлярный криопротектор ПВП оказывал менбший криозащитный эффект. Смесь R°we и ДМЗО сохраняла паразитов на отадии кольца, трофозоитов и шзонтов, а ПВП-кольиа и трофозоитов. Общим свойством для всех изученных наш криопротек-торов являетоя высокая сохранность молодых форм паразитов-кольце-видных стадий и трофозоитов.

Была осуществлена также криоконсервация p.falciparum о помощью устройства программного охлаждения (УОП) Впервые показано, что большая выживаемость плазмодиев наблюдается пооле вцдарживания культуры в течение не менее 30 минут при температуре от -7 до (до и сразу пооле начала кристаллизации), о последующим немедленным паренооом в жидкий азот. При двухступенчатом замораживании, болеа эффективном по сравнению с одноступенчатым, образуются внеклеточные кристаллы, что создает осмотический градиент, следовательно, размеры клетки уменьшаются. Подобные мор-фологичеокие изменения наш наблюдались также при изучении состояния покоя в эритрошгарном цикле малярийных паразитов (при хранении культуры при +4^3 и при поддержании культуры без смены среды в течение 4-5 дней). Это дало нам основания предположить возможнооть криоконсервации бесполых форм эритроштарных стадий P.faloiparua в ооотоянии покоя.

Совмеотно о Журавлевым С .Ю.

Таблица I

Влияние различных условий на сохранность бесполых форм эригрошхарных стадий Р.£а1о1рагша при их криогенной консервации

№ ; пп ;

Условия инкубации до замораживания и состояние паразитов

Криолротектор!Общая сохран !ность па рази ! тов Ш

Сохранность различных эритроцитарных

фор.у

паразитов

КШШ

тро^оиты

шизонты

5 ЗОН

1.

2.

3.

4.

5.

20 мин. посла выдержи- Смесь йсте вания при +44; нормальные-

-"- -"- Раствор

дао 12%

пвп

24-48 при той же Смесь

температуре

нормальные

20 мин. после ввдержи- -"-вания при +4°С паразиты в-состоянии покоя_

43.08+2,73 а « "19

37,29+2,86 ' п = "17 32,71+4,3 ' а '

62,61+2,7 п -Т17

83,27±4,29 п ="11

73,64+5,81 35,83+4,03 16,41+4,79 а ="19 'а ='"19 ' а = 19

67,73+7,36 а =~17 ' 65,6+7,89

п « 7 83,25+6,82 а »'17

91,84+5,75 п -Т11

26,3+2,8 а = 17 27,73+5,0

а -"Ч 50,32+6,71 а «~17 '

59,6+12,6 а ¿11

12,45*4,12 в - 17

35,3+3,4 ' а" 17

Достоверность результатов:

Р?1'2 Р1*3

Р1'5 1.4

> 0,05 Р2-5 2,4 < 0,001

< 0,05 < 0,001

< 0,01 Р2,5 > 0,05"

< 0,001 ?4,5 < 0,01

< 0,001

п

и

н

Опыты о p.falciparum как поола предварительной инкубации в течение 24-48 чаоов при +4^3, так и после поддержания баз смены среды в течение 4-5 дней, показали, что общая выживаемость плазмодиев по сравнению со стандартным методом увеличивалась почти в 1,5-2 раза как с предварительной инкубацией плазмодиев при +4°С, так и после индуцирования состояния покоя перед замораживанием. Состав популяции плазмодиев также был различен. В отличие от стандартного метода после предварительной инкубации при замораживании плазмодиев в состоянии покоя преобладали только кольца и трофозоиты, которые обладали меньшей инфективностью. Большую инфактивность плазмодиев после предварительной инкубации, по-видимому, можно объяснить более постепенной адаптацией паразита к низкой температуре, в результате чего они лучше переносят глубокое охлаждение.

Таким образом, при криоконсарваши бесполых форм эритроцитарных стадий малярийных паразитов имеет важное значение не только вид возбудителей, но и стадийность паразитов, а также их исходное физиологическое состояние.

Влияние криопротекторов на жизнеспособность малярийных плазмодиев оцределяетоя, как правило, культуральными методами, которые требуют значительного времени и являются трудоемкими. Более того, известные методы не позволяют выявить ранние изменения,происходящие в метаболизме паразитов после воздействия криопротекторов. В связи о этим нами впервые приманено измерение скорости гликолиза в паразитах в качестве одного из биохимических критериев (Л.Н.Гринберг и Д.А.Нуштаев, 1984). В экспериментах изучено влияние на гликолиз в малярийных паразитах различных криопротекторов, отличапцихоя по механизму действия. С этой шлью в качестве крио-протектора эндоцеллюлярного механизма действия примоняли 10-30;" раотворы глицерина и ДЖО, а в качества криопротектори смешанно-

го механизма действия - смвоь Роу (Rowe et al.,1968)

(табл.2).

Эндоцеллголярные криопротекторы (глицерин, ДМЗО) в испытанных концентрациях не подавляли гликолиз в плазмодиях; более го-го, ДМЗО незначительно стимулировал метаболизм в паразитах.' Однако, в противоположность зндоцеллюлярным криопротекгорам,смвоь Rowe ингибирует скорооть гликолиза в плазмодиях приблизительно на 70$. Удаление из среды указанной смеси восстанавливает око-рость гликолиза. По-видимому, среди испытанных известных криопро-текторов, наиболее подходящим является омэоь Rovre, так как она обеспечивает выживаемость, сохранность клеток, обратимо ингибирует метаболизм в паразитах, что имеет важное практическое значение. Длительное хранение биообъектов становится возможным благодаря полному прекращению обмена клеток, существованию истинного анабиоза.

Моделирование кратковременного эритроцйтарного цикла

развития бесполых отадий других видов плазмодиев

(P.vlvax И p.berghei)

С целью получения антигенного материала, а такжа испытания противомалярийных препаратов попытались кратковременно культивировать возбудаталя трехдневной малярии p.vlvax и возбудителя малярии грызунов P.berghei.

Культивирование p.vivax проводилось по мзтоду Trager и Jensen (1976) в наией модификации, В одной и той же среда развитие плазмодиев во флаконе наблюдалось только на-2-10 день культивирования, при этом число паразитов нарастало п паразигамия достигала 1%. Видимо, развитие плазмодиев во флаконах связано о тем, что там, в отличие от эксикатора, не создаегоя отрицательного давления, которое приводит к преждевременному разрушению

Таблица 2.

Влияние различных криопротекторов на скорость P.falciparum In vitro Сштамм M-25/Заир). Средняя паразитемии 4,45? (К - 43JS, Т - 30$, Ш - 25,9?, Й - 2%) .....

Время инку- .'Без криопрогад-¡тора т--- -j Глице|ин тТоГв j W | ДЮО ! {Смесь Роу ;

бации ¡неинф. ; инф. ¡эритр. ¡эригр. ¡неинф. ¡инф. ; эригр.; эритр. неинф! инф. | неинф. i инф. эрит.{ эритр. j эритр. j эригр. ¡неинф. ¡инф. ¡эритр. ¡эритр. i неинф. j инф. j эритр.i эритр.

рН через 4 часа

рН через 8 щсов

0,11 +U.03

0,20 ¿0,01

0,57 +0,02

1,03 +0,12

0,13 0,58 0.12 0,57 0,13 0.64 +0,005 +0,02 +0,008 +0,02 +0,01 +0,22

а а Л ж а л

Р2(4> 0,05

Р2,6 >

0,17 0,63 0,18 0,30 +0,01 ±0,01 +0,01 +0,01

0,23 1,0 0,23 1,04 0,33 0,95 0,23 1,03 0,35 0,49 +0,01 +0,05 ¿0,01 ■ +0,03 +0,033 +0,03 +0,01 +0,02 +0,02 +0,03

Р2,4 > °'05 Р2,6 > °'05

Р2Д0>0,05 Р2Д2<0.001

се

<т>

инфицированных эритроцитов. Использование крови, содержащей ре-тикулоциты или крови (Зольных 'с бета-талаосемией и аутоиммунной гемолитической анемией, не привели к заметным улучшениям. Подобные исследования в нашей стране проводили Крайнова и соавт. (1983), которые не отмечали рост культуры и после 2-х циклов шизогонии наступало угнетение роста паразитов.

Для культивирования P.berghel использовали ретикулоциты крови. Источником ретикулоцитов служили крысы (wistar) ретику-лоцитоз индуцировали одноразовым взятием 1,0-1,5 мл крови из сердца. Смена среды проводилась 2 раза в сутки, через казвдые 48-50 чаоов в культуру добавляли суспензию клеток крови, содержащую 10-15$ ратикулоцитов. В ходе исследований яри определении количества ретикулоцитов имелоя ряд методических трудностей, особенно при подборе животных о повышенным ретикулоцигозом, что обусловило в дальнейшем разработку способа количественного определения ретикулоцитов в крови. Во воах опытах (проведено 5 оерий) наблюдали развитие плазмодиев, а в последнем опыте, где гемато-крит составлял 3,5-5%, паразитемия достигала 4-6$ при исходной - -- 1%. Было получено 8-9 циклов развития паразитов в культуре.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современной маляриологической ситуации фундаментальныа исследования биологии возбудителя малярии являются основой для разработки новых, более эффективных методов в борьбе о этим заболеванием. Известно, что культивирование малярийных паразитов открывает широкие возможности для изучения различных аспектов биологии паразитов, его взаимоотношении с эритроцитом и, в конечном итоге, разработки рациональных методов профилактики и терапии.

В связи с изложенным,была решена задача получения непрарнв-

ной культуры различных штаммов p.falciparum, а также кратковременной культуры других видов малярийных паразитов (p.viva* и p.berghei).

На основа этих исследований наш впервые разработаны модели пероиотенции эритроцигарных стадий p.falciparum и установлено возможное ооотояние покоя в эритроцитарном цикле малярийных паразитов о последующей саморегуляцией. Это совершенно новое явление для эритроцигарных отадий малярийных паразитов, не описанное ранее в литературе, и открывающее большие перспективы для понимания одной из причин и возможных механизмов возникновения эритроцигарных рецидивов.

Установленное ооотояние покоя в эритроцитарном цикла малярийных паразитов и механизм его возникновения способствовали оптимизации условий культивирования малярийных паразитов, методов определения чувотвительнооти плазмодиев к противомалярийным препаратам.

Работа завершилась кратковременным культивированием других видов малярийных паразитов p.viva* и p.berghei. Показано,что каждый вид малярийных паразитов требует своеобразных методических подходов.

Получена новая информация о биологических особенностях малярийных паразитов в культуре, что является перспективным для разработки современных подходов к профилактике и лечению этого заболевания.

В Ы В О Д Н

I. Получаны непрерывные культуры эритроцитарных форм хлоро-хинчувотвитальных и хлорохинустойчивых штаммов во^удитвля тропи-чеокой малярии Р.falciparum, кратковременная культура возбудителя трехдневной малярии p.vlvax и возбудителя малярии грызунов P.berghei.

Иопытаны различные питательные среды, соотоящие из отечественных ингредиентов, и среда •ВРМХ-1640 рекомендована для непрерывного поддержания развития плазмодиев в культуре.

Сконструировано полуавтоматическое устройство для поддержания Р.*а1с1рагит в культуре. Предложены полумикроматоды культивирования и транспортировки плазмодиев в пластиковом капилляре и пенишллиновом флаконе.

2. Обнаружено новое биологическое свойотво р.£а1с1рагиа -способность перехода в состояние покоя на ранних отадиях эритро-цитарной шизогонии. Это овойство возбудителя реализуется при неблагоприятных условиях культивирования: снижение температуры, обеднение ореды, приостановка пересевов. Паразиты на этой стадии имеют атипичную морфологию, характеризуются резко сниженным метаболизмом, резистентностью к противомалярийным препаратам и крио-поврезвдеяиям.

3. Разработаны и реализованы: различные способы отимуляции, стабилизации и получения биомаосы Р.га1о1рагип-, сокульгивирова-ние о клетки печени крыс м.:иИ;а1епв1в в качестве подложки; сокультивирование плазмодиев о клетками печени мышей линии ваш/о на микроносителях отечественного производства.

Показано, что гепатопиты йа микроносителях способствуй увеличению выхода биомассы почти в 2-3 раза по сравнению о контролем. Предложен совершенно новый способ.стимуляции развития паразитов в культуре с применением колонки-капилляра,позволяющий удалять из ореды эритроциты, находящиеся в предгемолитичаском состоянии,и стимулировать рост и размножение паразитов в культуре.

4. Разработаны различные способы синхронизации культуры р.га1с1рагиш: . разделение паразитов по возраоту в стеклянном капилляре о последующим культивированием; поддержание плазмодиев в' ореде баз сыворотки или без факторов роста о последующим культа-

вированием в обычном режиме.

5. Обнаружено, что внутриклеточное развитие p.fiaciparum нарушается при использовании эритроцитов с гемоглобинопатии

(ньас, ньаб и бета-талассемией), в то же время в эритроцитах о hh~ и нъаю развитие паразита не отличается от такового в норма (эритроциты arh+, brh+).

6. Оптимизированы макро- и микроматоды определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам и биологически активным веществам. В культура хлорохинчувогвитальяьк и хлоро-хинустойчивых штаммов P.fiaciparum установлена противомалярийная активность ряда химических соединений и биологически активных веществ: отечественного препарата растительного происхождения артемизинина, фармакопейных препаратов антибиотиков-цито-статиков (рубомицин, бурнеомицин, фторафур, фторурацил), ряда акридиновых производных гидраэидов аминокислот, антител к эритроци-гарной стадии плазмодиев, полученных при иммунизации кроликов

синтетическим гекоа- и додекапептидом из белка sharp, моно-

195

клональных антител к белку р эритроцитарных стадий плазмодиев.

7. Разработаны оптимальные режимы криоконсерации эритроцитарных форм P.falciparum, обеспечивающие высокую сохранность паразитов:предварительная инкубация культуры при в течение 1-2 суток до погружения в жидкий азот (криопротекторы 12^-15$ ди~ метилоульфоксид (ДМЗО) или смесь Rowe) j использование программного охлавдения на установке (УОП) со стабилизацией температурного рввдма-7-12°и (со скороотью 1^3/мии) в течение 30 шн до или сразу после криоталлизаши о последующим немедленным переносом биопробы в жидкий азот.

в. В качестве биохимического хритврля для выбора крлонротек-торов, их концентрации, комбинации, а также для оценка дазнаспо-

опобнооти плазмодиев после размораживания и в хода дальнейшего культивирования предлагается'определение скорости гликолиза малярийных паразитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Были разработаны оледующие методы и модификации, которые рекомендованы в практику: получение и поддержание непрерывной культуры p.falciparum? выделение изолятов от больных тропической малярией после лечения их противомалярийными препаратами о учетом соотояния покоя и применения способов отимуляции роста паразитов в культуре; определение чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам и биологически активным веществам <о учетом <|азы роста культуры, с использованием омешанной питательной среды);поддержания оптимальной газовой фазы; криоконсервация плазмодиев о учетом их исходного физиологического состояния; синхронизация культуры P.falciparum. •

Разработаны и реализованы способы получения биомаооы и предотвращения замадлания роста или перехода плазмодиев в ооотояниэ покоя путем стимуляции развития плазмодиев'в культура о применением колонки-капилляра и сокультивированиам falciparum 0 клетками печени грызунов как на'микроносителях, так и без.

В целях усовершенствования методов культивирования малярийных паразитов предложено следующее: полуавтоматическое устройство для поддержания непрерывной культуры плазмодиев; полумикромагоды культивирования и способы транспортировки плазмодиев в пластиковом капилляра и пенициллиновом флакона; способ проварки целостности мембранных фильтров; способ, индуцирования ретикулоцитоза-у крыс; способ количественного определения ретикулоцитов в крови. Помимо вышеуказанных, для практики рекомендуется среда RPHI-1640,

сготовленная из отечественных ингредиентов, смешанная питательная среда, состоящая из попользованной и неиспользованной среды.

Для клинического испытания рекомендуются следующие препараты, которые обнаружили противомалярийную активность как in vivo, так и in vitro. Препараты цитоогатики: антибиотики,-рубомицин, брунеомишш, цитоогатики синтетические фторсодержащие - фторафур, фторурацил й препарат отечественного растительного происхождения - артемизинин.

Для криоконсврвации бесполых форм эригропигарных стадий малярийных паразитов предложено измерение скорости гликолиза как биохимического критерия для выбора криопротакторов, оценки жизнеспособности плазмодиев в ходе культивирования и пооле размораживания. Пооле оттаивания немедленное отмывание клеток от криолротек-торов в отличие от существующего положения рекомендуется только в том олучае, если они являютоя ингибиторами окорости гликолиза плазмодиев. В качестве оооудов необходимо попользовать металли-чеокиа нержавеющие контейнеры и плаотиковые капилляры, позволяющие после размо^живания продолжать в них кулвгивирование без отмывания клеток;.рекомендуется: криоконсервация плазмодиев с использованием программного охлаждения на установке (УОП) со окороотью охлаждения 1°С/мин и выдерживанием биоматериала в течение не менее 30 минут до или сразу после криоталлизации, а затем немедленно перенооят в жидкий азот; криоконсервация плазмодиев в состоянии покоя иди о предварительной инкубацией при t +4% в течение 24-48 часов; стимуляция развития плазмодиев после размораживания о использованием повышенной концентрации сыворотка и смешанной питательной ореды.

ШВДРЕНИВ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПРАКТИКУ По материалам диссертации внедрены: I."Способ получения биомассы возбудителя малярии P.falciparum" (изобретение Ji4372255/13 приоритет or 7.04.1987 г. о положительным решением от 29.08.1988 г.) - в ИМП и ТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР; 2. "Способ количественного определения ратикулоцитов в крови" (изобретение, авг.овид. й 1439500, Бюлл.изоб.,1988,й 43) - в НИИ гематологии и переливания крови МЗ Азерб.ССР; 3."Упрощенный способ контроля целостности и герметичности установки держателя милли-порских культурных оред" (рац.предл.№ 76 выдано 14.05.1985 г.) -в ИМП и ТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР; 4."Способ культивирования эритроцитарных стадий возбудителя тропической малярии" (рац. предл.й 80 выдано 8.10.1986 г.) - в ИМП и ТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР; 5."Способ индуцирования регикулоцитоза у экспериментальных животных" (рац.предл.й 81 выдано 8.10.1985 г.) - в ИМП и ТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР.

По результатам исследований подготовлены методичеокиа пособия "По криогенному консервированию штамюв и изолягов возбудите- „ лей малярии человека и животных" и "По адаптации и длительному культивированию штаммов возбудителя тропической малярии P. falciparum"-, которые внедрены в ряд профильных учрввдений.Методики по поддержанию культуры и криогенной консервации были оовоены представителями ряда соцотран (Чехословакия, Венгрия, ГДР, Болгария

t

и Вьетнам) при стажировка в ИМП и ТМ им.Е.И.Марциновского.Методы поддержания культуры освоили также ряд сотрудников института.Для научных цалай культура передана в ГДР,Болгарию и Чехословакию. В качестве антигенного материала.культура также передана профильным институтам г.Роотов-на-Дону, Ташкента и Баку, а также регулярном передавалась в филиал Института биоорганичвокой химии.

им. М.М.Шемякина АН СССР (г.Пущино). Культура была использована также для отработки методов диагностики малярии при помощи молекулярной гибридизации ДНК и олигонуклеотидов-зондов и для предварительного отбора противомалярийных и биологически активных вещеотв.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Аллахвердиев A.M. Способы синхронизации возбудителя тропической малярии Plasmodium falciparum // I Воесоюзн.оовещ. по пробл. эоокультуры. Тез.докл. Ч.Ш, -М., 1986. - С.97.

2. Аллахвердиев A.M. К волрооу синхронизации культуры возбудителя тропической малярии P.falciparum // X конф. Укр.общ-ва паразитологов. - Киев, 1986. - 4.1. - С.20.

3. Аллахвердиев А.М. Опыт длительного культивирования чувствительных и устойчивых штаммов возбудителя тропической малярии P.falciparum // X конф. Укр. общ-ва паразитологов. - Киев, 1986. - 4.1. - С.19.

4. Аллахвердиев A.M., Нуштаев Д.А. Методы концентрирования эритрош'-ов, пораженных малярийным паразитом, и "свободных" паразитов (обзор литературы) // Лабораторное дело. - 1986. - № 5. -С. 259-261.

5. Аллахвердиев A.M., Журавлев С.Ю. Сравнительное изучение сохранности эритроштарных стадий возбудителей тропической малярии пооле криогенной консервации / У1 нашон.конгресс по инфек-циозни и паразятни болести с международно участие. 17, 18, 19 октоиври, - Coc^iflJ986.C.258-259.

6. Аллахвердиев A.M. Некоторые физико-химические факторы, влияющие на культивирование in vitro эритроыитарных стадий возбудителя тропической малярии // Мед.паразитология и паразитарные болезни. - 1987. - JS 2. - С.65-68.

7. Аллахвардиев А.М. Кратковременное культивирование эрит-роштарных стадий возбудителя'малярии грызунов P.berghei

tn vitro // Акт.вояр.мед.паразит, и тропич.мед. -Баку, 1987. - С.32-34.

8. Аллахвардиев A.M. Адаптация культур малярийных паразитов после длительной транспортировки // У национ. конф. по паразитол. -Варна. 1-3 .X. 1987, - Болгария, 1987. - С. 258-259.

9. Аллахвердиев A.M. Стимуляция развития возбудителе тропической малярии P.falciparum в культура in vitro посла длительного хранения в жидком азоте // У Закавказская конф.по паразитологии: Тез.докл. 18-20 мая 1987. - Ереван; 1987. - С.23-25.

10. Аллахвердиев A.M. Непрерывное культивирование эритроци-тврных стадий возбудителя тропической малярии Р-falciparum

// Акт.вопр.мед.паразит и троп.мед. - Баку, 1987. - Вып.7. -С.29-32.

11. Аллахвердиев A.M. Способ культивирования возбудителя тропической малярии p.falciparum in vitro // У Национальная конф. по паразитол. - Варна, 1-3.10.87 г. - Болгария, 1987. -С.80-81.

12. Аллахвердиев A.M., Спаранская И.Д., Попова В.Д. Культивирование малярийных паразитов в ореде rpmi-1640 . состоящей из отечественных ингредиентов // Совр.пробл.паразитологии. - Л., 1987. - С.34.

13. Акиншина Г.Т., Федянина Л.В., Аллахвердиев A.M. Основные факторы, способствующие адаптации штаммов P.falciparum после транспортировки // Актуальные вопросы медицинской паразитологии и тропичаокой медицины. -Баку, 1987.-Вып.7,-С.19-22.

14. Юровский В.В., Окунева Т.О., Иванов Б.Б., Гринберг Л.Н., Аллахвардиев A.M. Использование синтетического олигопептида для

изучения иммунодоминантного эпигона белка оболочки возбудителя тропической малярии // Многостороннее научное сотрудничество. Академия наук социалистических стран. Сипозиум. - Пущино, 1987,-С. 91.'

15. Нуштаев Д.А., Аллахвердиев A.M., Гринберг Г.Н. Скорость гликолиза как биологический критерий жизнеспособности малярийных паразитов// Современные проблемы протозоологии.-Л.,1987. -С.43.

16. Аллахвердиев A.M. Споооб количественного определения ре-тикулоштов в крови. - Авг.овид. № 1439500. - Бюлл.изобр. - 1988. - № 43.

17. Аллахвердиев A.M., Саргачева Ю.Ю. Очищение культуры возбудителя тропической малярии P.falciparum от бактерий // Вопр. эпидемиологии, микробиологии и паразитологии. Мат. У1 съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Азерб. - Баку, 25-26. XI.88 г. - Баку, 1988. - T.I. -C.I6I-I62.

18. Аллахвердиев A.M., Сопрунов Ф.Ф. Возможность состояния покоя в цикле эритроштарной шизогонии у P.falciparum , культивируемом in vitro // Мед.паразитол.паразитар.б-ни. - 1988. -* I. - С.67-73.

19. Аллахвердиев A.M., Юровский В.В. Изучение метаболизма возбудителя тропичеокой малярии P.falciparum При разных условиях культивирования // Акт.вопр.науки и техн. в стратегии ускорения соц.-эконом.разв.соц.общ-ва: Тез.докл. I Международной науч. конф. чехословацких аопирантов и студентов в СССР с участием молодых ученых соц.отран. - М., 1988. - С.69-70.

20. Аллахвердиев A.M., Юровский В.В. Изучение биосинтеза белков возбудителя тропической малярии p.falciparum при возможном ооотояяии покоя в культуре // Мед.паразитол. и паразит, б-ни.-I9B8. - * 4. -С.10-13.

21. Аллахвердиев A.M., Акиншина Г.Т. Стимуляция развития чувствительных и устойчивых к'хлорохину штаммов P.falciparum

при оокультивировании о клетками M.nataiensls Ц мвд. паразитология и паразитарные болезни. - 1988. -ИЗ,- С.70-72.

22. Петров O.S., Ивановокая М.И., Кузнецова С.А., Аллахвар-диевА.М., Шабарова З.А. Диагностика малярии на ооновв молекулярной гибридизации ДНК и олигонуклеогидных зондов: Тез.докл. Бое-союзн.конф. / Современные направления создания медицинских диаг-ностикумов, 13-14 декабря 1988. - M., 1988. - С.73,

23. ШибниевВ.А., Финоганова Ы.П., Гринберг Д.Н., Аллахвер-диев A.M. Синтез акридиновых производных гидразидов // Биоорган, химия. - M., 1988. - T.I4, - й II. - C.I565-I566.

24. Юровский В.В., Тертышникова С.М., Окунвва Т.О., Иванов Б.Б., Макаров Б.А., Аллахвердиев A.M. Синтез и иммунологическое изучение антигенных детерминант белков оболочки возбудителя тропичеокой малярии / б-я конф. молодых ученых ооц.отран по биоорганичеокой химии (21-28 августа 1988 г., г.Пущино). -Тез.докл. - Пущиной 1988. - С.73-74.