Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые особенности внутриэритроцитарного развития возбудителей трехдневной и тропической малярии (P. vivax и P. falciparum) при различных условиях культивирования

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые особенности внутриэритроцитарного развития возбудителей трехдневной и тропической малярии (P. vivax и P. falciparum) при различных условиях культивирования"

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ 1 fi МАЙ 1S35 ИНСТИТУТ ЗООЛОГИИ

На правах рукописи

АЛИЕВА ШАХЛА НИХАН кызы

УДК 616 : 576. 8, 576. 89; 591. 69, 616. 9

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИЭРИТРОЦИТАРНОГО РАЗВИТИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТРЕХДНЕВНОЙ И ТРОПИЧЕСКОЙ МАЛЯРИИ (P. VIVAX И P. FALCIPARUM) ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.19 — паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

БАКУ—1995

Работа выполнена в Азербайджанском научно-исследовательском институте медицинской профилактики.

доктор биологических наук Я. Я. ЕЛЧИЕВ,

доктор медицинских наук, профессор А. Ю. НАДЖАФОВ.

Ведущая организация — Бакинский государственный университет им. М. Э. Расулзаде.

на заседании специализированного совета по защите докторских диссертаций (Д.004.03.01) при Институте зоологии АН Азербайджанской Республики по адресу: 370073, г. Баку, ГСП, проезд 1128, квартал 504.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института зоологии АН Азербайджанской Республики.

Научный руководитель: _ доктор меднцинскнх наук А. М. АЛЛАХВЕРДИЕВ.

Официальные оппоненты:

Защнга состоится

1995 г. в шо час.

Автореферат разослан « "У ■»

1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

X. А. АЛИЕВ

ОНЦАЯ ХАРЛКТЗИСтаКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Малярия относится к числу опасных паразитарных болезийй человека. Поэтому по социально-экономической и медико-биологической значимости она занимает особое « мзсто. В начале 60-х годаз казалось, что з самом скором времени малярию удастся полностью взять под контроль. Однако и сейчас, через 20 лет, проблема малярии остается в центре внимания Всемирной Организации Здравоохранения(ВОЗ ).

Эта проблема касается и налей молодой независимой республики из-за широких экономических в культурных связей со странами, в которых распространена малярия (особенно с Иранской Исламской йспубликой к ^ркэй). В настоящее время маляриоген-кая ситуация в Азербайджане крайне напряжена: с одной стороны в связи с миграцией населения, вызванной агрессией со стороны Ар.снии, с другой стороны - с ограниченной эффективностью штолст и средств борьбы с переносчиками, приобретши резистентность к хлорорганическим инсектицидам. Все это подтверждает тот Факт, что на сегодняпний день веста борьбу с малярией только используя известные методы кевозмскно. Следовательно, сегодня требуется разработка новых форм борьбы, в основу которых 'мспэ т лечь проведение (Ьундаглентвлькых исследований, в частности разработка метода культивирования эритроцитарных форм зозбудителей малярии человека.

В настояпре время из четырех видов возбудителя малярии человека получена только нэпрерывная культура возбудителя тропической малярии Р1авпос11ип Га1с1рагиш (Tгageг V/., Jenзen а.В., 1976). Следует отаетять,'что в течение многих лет во многих лабораториях мпра этот г.етод ге воспроизводился из-за шстандартности и слсгшосттт. ТЬлько п 1РЯ5 голу, в бываем Советском Со'озе, удалось полечить к'ль^п? Р.Га1с1рпгшп.

(Аллахв&рдкзв А.М;, 1985) .Однако данный .метод ю обеспечивает непрерывное ьУльтаьирозакпз возбудителя трездневкоХ малярии p.vivox . Имеются сведения лшь по ,<ратков ремгнноц? культизи-ровашпо эритроци тарной стадии р.vivax (Kitche- s.i'., 1939; Larxouy G. ,1931; Broclcelnan C.-R., 1985, 1287). По последки; литера турни л дашгта, азтораы удалось прокультивировать p.viva в течение 22 дней в эритроцитах Боливийских обезьян и 1-е зараженного чз лазе ка (Horbert banners Н., 1392 ). lis ж.! образом, вопрос получения кепрзравной 1ультури р.vivo?, до .сих пор остается нерешенным.. Видимо, одной из глазках причин швезжякоетп получения mnpepiranoíi культуры P.viva:-: к?яштея отсутстагэ знании, касающихся отличительных черт биохимии тайолкз:.;а p.vivox по сравЕзнтао с друишк врцзии кзлирзйзк паразитов. Эхо дает осноианга предположить, что пу^гл срезнитилького изучения вку три эрл трон а тарного развитая гогазлогияз в ¡-ладата^с условиях ¿улътквкроваккл 1,:а,:но выявить причину о;;:,;а:сю:>тл получайся шире físi.oü кульзури P.vivtx. Исход;: :.з гкизязло-кеиного были ояредзл?ш Дсль и задачи кеиото исследования.

Цель п "одпчи кссдвдоппкяя. Целью наатеУ.^,:го пссладог.ашш явилось сравнительпоз Езучошв зну трпэритрэпптирпого развития вогбудателзй срзхдапноЗ изижрма Р.viven и тролглзской игляри» P.falcipurua при рааигешх условних ¡-улыщирозаигд ( pasiva питаткльшо сродн и пх конЗлнацяз, газазгш фаза л т.д.) - е виявлзнкг условий, обаспачшакщй: -lanps какое развитие P.vivax Б культуре,

В сооею готики е цельу бнлк поояшлаш сладуищэ задачи:

I. Апробировать штоды шррэ'рывкого гудьтиБпрозашщ зрит-ропнтарной стадии возбудителя тротпчэской ыалярц« P.feiciparu в получпть культуру резня штзшаа.

2. Ср:-лп;:элъго жутсю дойота:» фтко-'шяиэскях факторов, илпагеллх :;а ва трнэратрседтарвсз раззатяз p.vivnx п

P^fclcipiin;;.-. vitro,

3. Ср.пзнлгал£Е0 изучать знутрторйтрсвдгарисв развита P.ví.va:: д ?.1"аХс1рагкт и рэзлкчшх шюазвльшх средах, и их ког.йг.есцпя" in vitro,

4. Изучить crajjanircspo Д5ЙС531В эукарногшх клвток раз-гах латай на _i?ivy трнзр'л'грсиитарзса раззявз р.vivas n.p.falci-рагur. лрп сакультгзпроаанйп in vitro.

5. Полетать антагон из кулмура шстного штамма Р.vivas л проверить ого пригодность для постановки взпрз.юй реакции лгл.^но5люоресшп1яп ( пНй).

6. Изучить сохршзнвэ явзшспособностз и янфектзшноота эрптрсцлтар:-зпс йош Р.vivas и P.falciparum после краткосрочного и долгосрочного хрзпзкяя d падком азота и создать крио-банк различиях етсжоз малярийных паразитов.

7. Определить чувстзптзлькооть к хлорохину длительно под-изршвезшх в гулыурз эратротцмарннх форм р,vivas и P.falciparum -

Научная новизна.. Впервые в .области наляриологии разработана л получена непрерывная куль-сра возбудителя трехдневной малярии Р. vivas . Вкязлэн ряд ■физико-химических, биологических факторов( газезая фаза, разные. питательные среда а их комбинация, первичные и пе ревиваешэ платка ), влияющих иа внутриэрятроцитарноэ развитие возбудителя трехдневной а тропической малярпи. Впе шиз показано, что разные питательные среды - БТ!Л1-1в4Р, 199, Игла-ШМ, Цэребрат и их комбинации в определенных соотношениях обеспечивают длительное внутриэритро-питарное развитие Р.vivas и P.falciparum in vitro.

BnejBue внявлвно биологическое различие во вцутриэритро-цитарном разви-пш p.vivax и P.falciparum при длительном культивировании и показано, что через опредежкное время акпь-визация p.vivax в стандартных условиях, нэ связана с влиянием внешних Факторов, а определявтся сапой природой паразита.

Впервые выявлено, что стимулирующий эффект эукариотшх клеток в зависимости от вида к®ток и паразита шнязтся. Аыкио-тическая жидкость, полученная от матери во время родов, впехвые применялась в . составе комбинации питательных сред и показан ее сти^лигующий гзффект при поддеркании длительной культур! плазмодиев.. Определена и ■установлена чувствительность к хлорахину разных изолятав p.vivax , длительно поддерживаемых в культуре. Экспериментально пока' зкы различные варианта очищзгаш культура от бактериального загрязнения, йазработан способ криоконсе овации эритроцита риой стадии возбудителя трахдневной малярии. Впервые подучен йнтагек из непрерывной культуры ызстного штамма p.vivax и показана его пригодность к использованию в иммунологических реакциях.

. Практическая значимость работы. В результата проведенных исследований разработан мзтод получения бееполо£ эритроцитарной стадии возбудителя трехднгвной малярии P.vivax, что открывает широкие возмокности для изучения биологии, б:охимии паразитов, получения антигенного «атергала из кульоу|Ы о целко иымуноло-гичеехшх реакций, определения чувствительности плазмодиев к ентиыаляпийннм препаратам, а та Kite для создания вакцины. Для практики предложены различные питательные среды и их комбинац- и. Для стимуляции внл триэритроцитарпого развития p.vivax рекомендуется совместно культивировать паразита с эукариотныыи клетками l-929 и Ге р-2. Доказана пршщипиальная возмоккость

лрш.шепш культуры p.vivuz для определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам и получения высоко. качественного антигена" для иммунологических реакций (PIffi). Апро-блрованы и раз та бита га метода криоконсерзаиш эрптроцитарных . с>орм плазмодиев, в re 3J'ль та те чего создан криобанк малярийных пагг.зртоз человека. Кйтод получения не проравной 1^льтуш P.vi-vax г':!л рппобирозан зарубежной лабораторией (Турция, Адана, ушззгсптет курсов, медицинский факультет) , где и получит отражение в соотве тствуюгчих публикациях. У ниве роите ту Чукуроза бклл переданы 4 штамма ( I - из вд'льтухы Г.vivax ; 3 - из культур P.falciparuri ) н по.тучен ОТ ШГО I штамм (Tarsua.P.vivax). По материалам диссептании представлзна заявка на изобретение.

Нола--екия, выносимые на защиту.

- Получение непрерывной культур! эритроци тарных фоти p.vivax макет быть обеспечено за счет притгения комбинированной питательной среди с учетом биологических особенностей внутриэрктроцитарттого развития плазмодиев, газовой фазы, частоты enerar среды и стимулирования развития паразитов в едльтуре.

- Стимуляция b!iy триэритронитарного развития популяции в 17 ль ту ре достигнута путем соку ль газирования с клетками разных линяй с учетом вида паразита и клеток.

- Очглзние руль туры от бактериальной контаминации достигнуто путем пттамзпзния рпзличшх комбинаций антибиотиков в опте деле нноссоотначениях.

АлгЫгшт'я гяботн. Материалы диссертации долокеш и обсуд-дезт: на сове г,а или отдела эпидемиолог? и п на Ученом Совете 5131 спиде .'.нологкп, гигиены и пго'заболепаний (декабрь, IC9I). i'a коп"«гопгап молсршх учетшх П'1' ЭГ л ПЗ (май, 1992) , на когёе-ггчп'гч: о-!;истг«о бкохгмикш (сентябрь, IS93, г. Баку) , на XI

Ирагском конгресса Физиологии п фармакологии (май, 1993, г. Ti б риз, ИИР), на XXVI Турецком конгрессе Микробиологии (яшарь, 1994, г. Анталья, ^рция), на Ту редко:.', конгрессе "XII. Gevher ' Nesibs Tip Giinlori " (май, 1994, г. Кайсери, "¡урция ) и на VIII Международном конгрессе Паразитологии (октябрь, 1994, г. Измир, Турция).

Публикации. ГГо roitó диссертации опубликовано 8 работ, из них 5 - за. рубеком. Представлено заявление на изобретение и получен приоритет от 08 июля I9S3 года с входящим нрюроы 202-П, номер гос. регистрации 000069. ,

Объем п структура д:;зсертацкн. Диссертация изложена на 146 стр. машинспислсго текста, состоит из введения,' обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя ли тора туры. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель содержит.127 -наименований, в том числе 79 работ .зарубекних авторов.

С0ДЗШШВ РЛБ0М Г/я те риал и методы исследования. Б работе использовались ' паразитологичоскио, 1улътуральнш, цитологические, криобиологические и Емцунологическке метод?' исследования. Исследование проводилось на двух видах возбудителя малярии человека (p.vivax - возбудитель трехдневной малярии и P.fnlciparun - возбудитель тропической малярш). Использсюальсь 5 штаммов и 3 изолята.

P. falciparum (Г-25/Вьотнг.м, ШМ/87 .- хлорахинустой-чшше и M-25/Sa"p - хлорохпнчувствительшй) били получеш из России, Вьетнама и Заира, гстамш и пзоляти p.vivax (КЭБ-1-91, КЭБ—II—92, КЭБ—III—92, Tarcua) - из Биласуварского р-на Азербайджанской ре сиу блики, Нахичевакской АР, Афганистана и турщш. В работе келользеыалея метод Tragor-Jensen (1976 )в icnoTopíx

модификациях ( Лллахве рдшв А Л., 1989). Культквирозание малярийных плазмодиев проводилось при 37,0°С, в маленьких стеклян-1шх чалках с использованием различных питательных сред (И?,П-IG40, 199, iírvra-?,EM, Це ре брат ) , человеческой крови группы В+ и счпороткп кропи группы АВ+. Сдана питательной среди проводилась через кетдоз 2-ое суток. Пасоггки проводились в зависимости от состояния культ/рл. Зсе ОКСИОргайНШ ПО ф'ЛЬТЕЗИрОЗаПИЭ плазмодиев контролировались микроскопический! .методами, г.'дзкп фиксировались в да гона©, окраяивалиоь по Вэмановскому-Ггмза по общепринятой методике, просматривались и фотографировались з микроскопах Виолам Ломо ( Д12 СИ) и Reichert-Jung е илмер-сионной системой ( увеличение 90x7; 90x10). В течение г.сслздо-вания просматривалась более 7Г00 мазков, К) раз проводилась крлокогсетпашл, С5 раз рекриококсерадпя- кадяряйках паразнтез. При стаетстпчэской ocipauo-nr? данках аспатьзовалая мэтод Оишера-С'патента. Олредело^аю чувствительности малярийных паразитов к протавомаляряйпым препаратам in vitro проводилось по методу Riecmann ' ( 1978) в kj которых- модификациях ( ^ллахвордсав АЛ., 198Э).

Культивирование бесполой эратроцита.рной форш

возбудителя тропической малярии p. falciparum Анализ литературы показал, что для получения непраршкой культуры эритроцитарной стадии p.vivax . нудно провести с разните льпоэ изучение развития ?.vivas и P.falciparum в культуре. Поэтому в соответствия с нашей целью и задачами мы решили сначала получить {©прерывную культуру р.fnlcipnrun . Енло проведено 6 серий экспериментов. 3 из них проводились с культурой, полученной из Москвы и хранившейся в течение б месяцев в криобанке лаборатории (штамм Р-25/5ьетнам). Четвертая серия опытов прово-

дилась с культурой p.falciparum (шташ ИШ/Р7), полученной из Москвы в жидком азоте. В течение недели паразнтемия в эдльтурах составляла 0,2-0,3/S, но потом она постепенно снизилась и преобладали атипичные "сморивнные" паразиты Чсуюнъких размеров, в дояыЕйием в связи с отсутствием развития паразитов в ху ль ту pax ( на 20-й день) опыты были приостановлены. Пятая серия опытов проводилась с некриококсераирозанной культурой( штамм «'-25/ Вьетнам), порченной из Москвы. }^льтура была досташйка в лабораторию через 24 часа при температуре тела (Исходная псгази-темия - 1,0$). За время шире ¡явного поддержания культуры, па-разитемия составляла 3,&-4,5#. Через 2 месяца непрертного культивирования культура была криокоисервирована. В шестой раз из Москвы была получена культура P.falciparum ( штаммы F-25/Вьетнгм, ЮМ/87 и M-25/Заир). Культуру достазили поездом, в термосе с жидким азотом, в металлических криопробирках на 2,0 мл. Срок транспортировки - 3 суток. При осмотра мазков было видно, что паразита крайне видоизмешкы, паразитемия составляла 0,01$. После, центрифугирования надосадочную квдкость отбирали и к осевшим эритроцитам добавляли полную среду EFMI-IG40 с 20% человеческой сывороткой. Из-за появлвш.л сильного гемолиза питательная среда менялась 9 раз в течение 48 часов. В течение 20 дтвй не удалось стимулировать рост паразитов в культуре. Только через месяц со дня получения культуры паразите мия достигла 2,5-3,0£, но в дальне пнем она снизилась и дергалась в птедолтс 0,5-1,5"?. Через 9 месяцев культура была за-мог'хгена в криобание лаборатории. ТЪким образом, нал! удалось спробкгопать методы культивирования эритроцитарной формы возбудителя ттуяткчеокой малярии в Азербайджане и получить тпре-пппг'п f "/.<:;, туру раялпч; тх штаммов. Эта модель в дальнейшем

использопплась для сравнительного изучения биологических особенностей P.falciparum п P.vivax при ^льтивироваиии in vitro. Сравнительное изучение развития эритро-•цитррной стадии малярийных плазмодиев (Р.falciparum, P.vivax) в различных

нитательитх с те дох, и их комбинациях_

В нпстоягре время малярийные паразить культивируются только в среде 1?ГМ1-1М0, которая производится разными зарубежными Фирмами. Однпк'о эта среда обеспечивает только развитие p.falciparum . Анализ литерптури дает нам основание предполакить то, что одной из причин пег «мощности получения длительной культуры p.vivax .шляется питательная спэда. Поэтому, мы в своих исследованиях решили проверить развитие P.falciparum и P.vivax в рлз.тичи!х питательных средах и их комбинациях: РН.П-1М0, 199, Кгла-'.ЕМ и Церзбрат. Питательная среда ЯШ1-1Р40 приме ня-лась с различными концентрациями сыворотки (10; 20; 30; 40%). Ра втег.'я культизивования был проведен 21 пассаж и просмотрено свыше 750 мазков, ф ль тура эритроцита рной стадии возбудителя трехдневной малярии поддергивалась в различных питательных средах в течение 50 дней ( Рис. I), в результате чего было установлено, что оптимальной средой, способетвующэй развитию p.vivax in vitro , является комбинация 60$ 199 + 20/5 КШ1-1540 + 20% сквотютки. Подобный эохТект наблюдался таксе при изучении влияния предложенной среды на состав популяции паразитов. Поэтому в дальнейших исследованиях возбудители трехдневной малярии поддерживались га.кнно в этой комбинации. Д ту гая серия опытоз с теми же средам была проведена с культурой г,falciparum. йзультаи исследования пррдставлгш fea рис. 2. Полученные данные' показывают, что возбудителя тропической малярии

ч

1 s

ы я

ст «я о

ё

2,

2,0 -1,5'-

1.0 0,5

г i

1 4

8

32

36

i

В

12 16 20 ' 24 "28 Срок культивирования (сут.)

Рис. I. Сравнительное изучение вяутриэритроцитарного развития р.vivaz в различных питательных

оредах in vitro (изолят ИЗБ-1-91) '■

Питательные ореды, содержащие: '

I - 00=5 НЩ-1640 + 10% сизоdoтки: 2-83% ШШ-1640 + 20% сыворотки; 3-614 199 + 20% EPI.u-ICiO + 20% сыв.; 4-80^ 199 + 20/» сыв.;

•5 - 405? ШЯ-1640 + 40% Игла-I.E.',I + 20% сыв.; 6 - 40£ 199 + 2С$ BFMI-I640f2C$ Цер.+20£ скв.

2,0

1,5

В 1.0

3

0,5

ч'-. \ •.. ...

\ .....

\

-----

' •• • . - т.

-1-1-1-1-1-1-1-1-г

8 12 16 20 24 28 Cdok культивирования (сут.)

32

36

?ис. 2. Сравнительное изучение ЕнутризриЯроцитарюго развития . p.faiciparun в различных питательных средах in vitro (штамм 5'-25/Вьетяам) Питательнна ореды, содержащие:

I - 80$ TZPMI-I640 + 20$ сыворотки (Контроль); 2 - 60$ 5РЖ-1640 + 40?? сив.; 3 - 80£ 199 + 20% оыв.; 4 - 60% 199 + 20% 5РЖ-1640 + 20% сыв.;

5 - 405? EPMI-I640 + 40$ Игла-МЕМ + 20^ сыв.; 6 - 60$ Ж,11-1640 + 20% Цоребрат + 205 свз.

- 12 -

мелено культивировать как в среде ШЯ-1С40 с 20$ сывороткой, так и в комбинациях 199 + ИМЕ-1640 + сыворотка (6:2:2) и КНЯ-1(540 + Цзребрат + сыворотка (6:2:2).

В результате проведенного исследования мскно сказать, что для культуре Р.£а1с1рагит более оптимальной средой является ШП-1640, содершгрй 20$ сыворотки, а для культуры Р.у1уах -новая комбинированная питательная среда 199 + 20$ ШЖ-1640 -: 20$ сыворотки.

Получение непрерывной г^гльтур эритроцитарпой стадии возбуди те*ля трехдневной малярш р. у .¡.у ах_

После выбора болвр оптимальной среды для культур возбудителя трехдневной малярил нами была сделана попытка получить непрерывную культур? «ритроцитарной стадии р.уАуо* . С этой целью проводили- 4 серии опыте®, а источником штаммов служили: I. Кровь* шпосредетвенно полученная от больного. 2. культура Р.у1уах , замораже'нная в криобанка. 3. фльтура р.у1уах . полученная из другой страны (непосредственно из культуры, Турция). В не рой серии опытов кровь была доставлена из Биласуварского района Азербайджанской республики. Исходная паразитемия была 0,4%. В тегение месяца в культуре Р.у1уах рост паразитов не наблюдался. По приготов-е-кшм мазкам мскно было видеть единичных, видоизмегенных ж вышедаих из эритроцитов паразитов, но несмотря на это, культивирование продсдасалось. Через месяц в культуре отмечалась активизация плазмодиев. обычная паразитемия в культуре составляла 0,3-0,5$, в редких случаях достигала 1,6 и 2,5%.

ТЬким образом, впервые была получена культура эритроцитар-ной стадии р.ухуох и подкеркена непрерывно более 20 месяцев, после чего была криоконсерзирована. Культу ш трех других изоля-

таз p.vivax поддергивались непрерывно в течение 9; 5 и 3 месяцев и были заморачсеш. 5а время поддержания культур! тсколько раз наблюдалось рэзкое понгкенке и приостановка роста паразитов. ТЬкое состояние паразитоз длилось- гесколько дшй или ждель, потом па па srr темня начинала повышаться. Это происходило независимо от воздействия различных факторов.

Итак, для получения непрерывной культуры p.vivax , в отличие от других азтороз, ми в своих исследованиях зперзые использовали: I. Комбинацию питательных сред( в0% 199 + 20% Шй-1640 + 20/? сыворотки); 2. человеческую кровь группы В+; 3. полную питательную среду без бикарбоната натрия; и 4. при проведении опытов в объязательном порядке 'учитывали состояние покоя, раше обнаррсенное у эритроцитарной стадии P.falclparua ( Аллахвер-диев А.М., 1989).

Исследование физикскхимзческзх факторов, влияющих на вну триэритроцитарное развитие

"_малярийных паразитов .__

С целъю изучения влияния частоты замзш питательной среда на развитие p.vivax , было проведено 15 опытов. Эксперименты проводились в течение 45 дней с культурой р.vivas при начальной паразитами^ 0,32^. Как показали je-зуль'таш, замена срэды через каждые 2 суток способствует более высокому уровни парази-темии (0,6 ± 0,03fi), чем более частая (0 ,01 ±0,003$ ) или редкая baiena среды (0,03 ± 0,003^ ). Pj--5 > 0,002; Fg & 4. 0,05.

С целью изучения влияния температуры на эратроцитарнуп шизогонию Р.vivax проводили 3 серии опытов при разных темпера-турах( 24QC!, 37°0, 40^). Полученные результаты показали, что оптимальной температурой для культуры P.vivax явлжтся 37°С.

Известно, что малярийные паразиты относятся к обллгатным шкроаэрогчигам. Роль карбон диоксгла (С0?)В метзболизг.е

паразита относительно Езвестна, однако до сих пор неизвестна роль кислоре..a (0^) в обшнэ у малярийных паразитов. С учетом важности изучения данного вопроса, мы решили выяснить влияние COg на раззитие p.vivax в культуре. Для этого иыло поставлено 4 серии отытов, результаты которых показали, что паразиты в услав лях отсутствия кислорода не развиваются. Так как, в опыте отмечались только дегёшрирозанше паразит и паразитемия состав лила 0,01$, а в контроле паразитемия была между 0,3 и 0,4% и преобладали взрослые трофозоитм.

bîa в своих исследованиях изучали влияние глюкозы на развитие малярийных паразитов in vitro . Было поставлено 16 опытов, прозедэно 15 пассажей, просмотрено более £00 мазкоз. Результат показали, что добавленная в среду глюкоза в шзначительней степени сот^лярует развитие паразитов в культуре, эффективность глюкозы поДтве ркдается как по динамике развития, •гад и по стадийности паразитов, "йк как, в культурах p.vivax и p. falciparum в среда с добавлением глюкозы число шизоитов было 2 раза болыпе по сравнению с контрожм.

J/л впервые в своих исследованиях в целях .повышения пара-эитемни.и стимуляции роста малярийных паразитов в ль туре 1ЕСИЛИ проверить действие амниотт ¡ческой жидкости человека. Из литературы нам известно, что амкиотическая кидкость содерклт белки, лшиды, углеводы, калий, кальций, натрий, микроэлементы гор,юш, серпенты, гекоторые из которых играют вакцую роль р метаболизме маляргс-яых паразитов. Эксперимент проводился в течение шсяиа с культурой P.vivax и P.falciparum. Было просмотрено более 600 мазков, поставлено 25 опытов, проведено 12 пассаяей. l'a культуре проверяли различные концентрации амнио-ткческой жидкости (($, 11%, I&, 22%, 2%). Результаты опытов

показали, что из 5 испытанных концентраций майю выбрать среду, содержащую 11$ и 16$ амниоютеской яидкости, которая симулирует рост паразитов. В отлячга от р,falciparum , стимулиэдщий эффект вышеуказанной среды в культуре р.vivaz оказался более продолжительным. 1Ьк как, в культуре P.vivax в течение 20 Д1ей в среде, .содеркацзй.ашшотичесфю жидкость паразитсмия составляла 0,15-0,5$, а в контроле 0,1-0,2$. В 1ультурз P.falciparum на в-й день в опыте паразитемпя достигла 3,2$ и превышала контрольную ( 3,0$.). Анализ состава популяции таюа показывает, что в среде с амнкоткческой жидкостью количество шизонтав 2 раза больше, чем в стандартных условиях.

Сокультнвирование малярийных плазмодиев (P.vivax л P. falciparum) с зукараотшми

клетками различных линий_

В последние годы с целью стимулирования развития мадлрий-них плазмодиев в культур проводится соку ль газирование паразита; с различными клетками (Mazier D. et al., I9P4; Аллахвэддиэв A.M. с соазт., I9PP ). В отличие от дхугих авторов, ма в своих исследованиях использовали слвдугацие клетки: Еер-2 (клетки карциномы эпидермы человеческой гортани X Vero , 4047 (клетки почки мартышки, зеленой африканской), FL (клетки, вкделзьше г-з человеческого амниона), 1-929 (фибробластные клзтки, выделэкшс из подневной ткани мшей )и гепатощпы (клетки печо;ш белых беспородных милей) . С о культивирование с гепатоцнтами продлилось 4 дня, а с другими клетками - 45 дгои. Было поставлено 25 опытов, просмотре но более 1400 мазпоь. т^сульташ опытов показали, что клетки Vep-2 и L-029 стнмулй jyот рост P.vivax в культуре. При сокультаяироваиш клеток печени белзпе милей с p.vivax стимулир7Г):';иЛ э"|"ект гепатоиптов ш выявлен. В результате со-

культивирования P.falciparum с клетками выяснилось, что клетки Нер-2, Vero и ¿епатоциты не стащу лируют развитие возбудителя тропической малярии, а клетки L -929 ингибируют рост паразитов.

1&ким образом, результаты исследования показали, что стимулирующий кТйект хдаток в завксшости от вида клеток и паразита менязтся, так как, эукарлотные клетки 1-929 стивдли,уют развит® г.vivaz , но ингибируют рост P.falciparum в культур. Изучение чувствительности малярий»« плазмодиев к хлорохину in vitro и очипэнне культур

Р.vivas от бактериального загрязнения_

В доступной литературе мы не встречали методов опрделения чувствительности возбудителя трехдневной малярии к хлорохину in vitro . Поэтому ш ршили проверить приюдность прдлокен- . кого нами условия едльттсвирования для отрделвн&я чувствительности p.viva* к хлорохину. О этой целы) приготовили 10М раствор хлорокзша в физиологическом рствор и рзбавили в 100 рз ( Ю-® М ). В опытах использовали возрстающие концентрации хлорохина. Опыты проводили о тремя изолятами p.vivax (ЮБ-1-91, ИЭБ-И-92, ИЭБ-Ш-92), которе непррвно поддери-вались в культур несколько месяндв и с трмя штаммами P.falciparum ( 1-25/Вьетнам, ;ПМ/87, M-25/Заир). Ингибиэдюире действие хлорохина в культур оденизали черз 48 часов. (Рис. 3.) Как видно из рисунка 3, с увеличением концентрации хлорохина прк-рацается созрвание плазмодиев до стадии шизонта. Отсутствие гаизонтов при концентрации хлорохина 0,6 • I0~® М свидетельствует о чувствительности плазмодиев (P.vivax) к хлорохину. Итак, изсхлятк P.vivax , полученные из разных ргионав Азербайджана и Афганистана являются хлорохинчувствительнымн.

Таким образом, рзульта-ш показали, что прдлскешше нами

1 2 3 4 5 6 7

Концентрация хлорохина (M )

Рпс. 3. Определение чувствительности эритроцитарных стадии р. vivax к хлорохкну послз 48-гЧасавсй инкубации in vitro ( изолят ИЭБ-1-91 )

I - 0,15 • 10'

-6

2 - 0,3 • ID

-6

3-0,6 5 - 1,2

10

10

-fi -S

4 - 0 ,9 • 10 G - 1,5 -10

-6 -е

7 - I, В -10'

-в

■

— молодые тропозойты

— полувзроелне трап, - взрослые •пм'озокты

□

шизонты

остатки

погибшие

паразитов

условия культивирования p.vivax пригодны таксе для определения чувствительности малярийных паразитов к хлорохину, что мскно рекомендовать в практику. А результат определения чувствительности P.falciparum к хлорохину показали, что несмотря на долговременное сохранение плазмодиев в криобанке, а такте на длительное культивирование, возбудители тропической малярии ке меняли чувствительность к хлорохину. -

В опытах также были сделаны попытки очищзния фльтуры малярийных плазмодиев от бактерий с помощью антибиотиков -гентамицина сульфат (0,08 г.), бензилпеницшшша калиевая соль (I ООО ООО ед.)ч стрептомицина сульфат' (0,5 г.) и их различных комбинаций. Из всех применяемых оптимальной мсешо считать комбинацию гентамнцина сульфат (0,25$) + бензилпеницпл-лкка калиевая соль ( 0,25$), употребляемую вперзке наш. С.помощью этой шлбинашш мскно очистить культуру за короткий срок (4 дня) , через 7 суток после которого паразите мия достигает 0,3-0,5$.

З&зработка методов криоконсарващш зритро-вдтаршх стадий P.vivux . Исслвдоаанш выкиваамостя и инфективности p.vivax и P.falciparum послз различных сроков

. хранения в жидком азоте_

В период длительного культивирования возбудителей болезшй постоянно существует возможность изменения первоначальных свойств исследуемых язодятов, штаммов и клонов, таких, как иное к тивность, вирулентность, ишуногенность. В зтой связи большое значение приобретает изучение вопросов криогенкой консервации, позволяйте?. сохранить первоначальные свойства возбудителей. Лпгоратурше данше о криоконсервации p.vivax мало-

- 19 -

численны (Saunderg G.M. et al., 1947, 1948 ). Поэтому m, в своих исследованиях, впервые поставили задачу разрабо'тать метод криоконсерзапии эритроцитарной стадии P.vlvax, а также изучить выживаемость п кнТектквиость плазмодиев в зависимости от срока храшния в кпд ком азоте. Опыта проводились с использованием культур р.vivas и P.falciparum. В качестве кришроте ктора был использован 15^-ннй раствор глицерина. За время поддержания культуры P.vlvax 34 раза проводился процесс замораживания (были заморакёш 74 криопробы), 22 раза - процесс размораживания (размораяени 42 криопробы). Вгзультаты показали, что выживаемость плазмодиев зависит от срока их храшния в кидком азотв. йк как, после 15-дтввной криоконсерзации выживаемость паразитов составляет 30,0 ± 3,3%, после 6-месячыой - 13Л ±1,0/2, а после длительной( 17 месяцев) - 2,8 i 0,($. За время флыквировашш P.falciparum 26 раз проводился процесс заморакивакия (55 крио-проб), 13 раз - процесс размораживания( 33 криопробы). 3 рэзуль-тате исследования выяснилось, что P.falciparum сохраняет свою жизгеспособность посда храшния в жидком азоте более 5 лет. Однако выживаемость паразитов значительно падает в зависимости от срока храпения в жидком азоте. После 40-днэвпой криоконсервации выживаемость паразитов составляет ЭОЛ ±1,1$, после 4-шсячвой - 22,0 ± 1,5Й, а посла Б-лэ-пей -2,5 ±2,2$.

Результата по изучения адаптации плазмодиев в культуре после р&нриоконсервашш показали, что если в первый день после р&зморгплвания среду менять 2 раза, а затем оставить ее на 3-4 дня( до. появления признаков гемолиза), то в таких условиях ак-тевизрдил паразптоз в культуре происходит интенсивнее, чем при етедгавноЗ замзке срсды.

ТЬккч образом, в результате изучения методов кпиоконоар-

.виош эритрицитарной стадии ыа'шрийннх паразитов человека разработаны способы криоконсе рации P.vivax : показано сохрашние выживаемости плазмодиев более 17 ivíckhob, а исследование влияния длительного хранения паразитов (r.faiciparum) в еидком азоте ' на их вняиваемость показало, что малярийные паразит сохраняют яизяеспособность после хранения в жидком азоте баше 5 лет. Приготовление антигенного материала из культур p.vivax и проверка его пригодности для иммунологической ракции трехдшпноп маляры:_

Получение культур »ри троки-арной стадия возбудителя трех-д1Евной малярии играет валкую роль при приготовлении антигенного материала. Из-за отсутствия культуры p.vivax во многих лабораториях мира в качестве антггеиного материала ' использу-' ютея аналоги P.vivax , которые, с одной стороны, являются неспецифичными, а с другой - экономически невыгодными. Исходя из этого, мы поставили перед собой задачу проверить пригодность антигенного материала, полученного из культуры P.vivax. Проводилось более 35 опытов. В начале опытов использовали ш-ожлщеитрированнуго кровь с паразитешей 0,4f>. Была использована иммунная сыворотка больнгх трхднэвной малярией и ее различные титры ( 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:100, 1:320). Во всех пробах получали полскительную реакцию. В титре 1:40 наблэдали более интенсивную флюоресценцию. Рёзультаты опытов показали, что пш паразитемии ниже 0,4% ни в одном титр имцунной сыво-pol.ai re происходит нэпрямой ракции иммуьофлюорсцен'ди (не®). Кроне того, было выявлено, что следует зыбирть те рультур, где проблацают взрослые тройозоил! и шизонш. С молодыми па-рзитями Ш> не наблюдался. С целые устрнежя i. гих огрш-ченкй, мы попытались конце нтргровать и разделить паразитов го

возрасту, з результате чего во всех пробах получали положительную рориипэ. В татге 1:40 флпорэсценция была болзе яркой, чем п остальных тктпах. По поелод!¡им литературным данным известно, что титр 1:Г4 является диагностическим титром (Elmer w. et al., 1992).

Ihi'.ic! образом, полученные результаты показывают, что 1уль-туру p.vivax маню ре коме вдов а ть в качестве источника антигена для пмму пологиче с гак реакций, а в случае низкой па разите шт или малого количества зрелых иизонтов в культуре, требуется концентрирование инфицированной крови в капилляре.

ВЫВОДЫ

1. Апробированы методы непрерывного культивирования орит-роцитаршх торм возбудителя тропической малярии P.falciparum и разработаны методы непрерывного культивирования эритроцитар-ш форм возбудителя трехдневной малярии P.vivax. с использованием зтих методов получена непрершная культура различных штаммов P.falciparum И P.vivax..

2. Показано развитие эритроцитарных форм малярийных плазмодиев в разных питательных средах и их комбинациях. Выявлено, что малярийные паразит развиваются в среде ЩШ-1640, содержаний 20$ сыворотки и в комбинировашшх средах 60$ 199 + 20$ ТОЯ-1М0 + 20$ сыв.; 40$ 199'+ 20$ ЕНЯ-1640 + 20$ Це ре брат + 20$ сыв. и (ТК ШП-1?Ж) + 20$ Церебрат + 20$ сыв. Установлено, что для культу рн P.falciparum более оптимальней средой является .rai-L'MO, содеркапэй 20$ сыворотки, а для ic/льтуры p.vivax - новая комбига^гаванкая питательная среда Щ$ 199 + 20$ КЛЯ-КЛО + 20$ сыворотки.

3. Выявлен ряд физико-химических факторов, влияющих на

пну тривритроци тарное развитие P.vivax ( гпзозая фаза (00.-,, 0?) ,

температура, частота замены среда) и выбраны более оптямалышо условия для непрерывного поддержания развития r.vivax в культуре.

4. Осуцрствлено еокультивиравание эритроцптаргых форм • 'малярийных паразитов с эукарпотными клетками íbp-2, Vero ,

4647, pl , L -929 и гепатоцитами белых беспородных мышей. Выявлено, что стимулирующий эффект эукариотнцх клеток в зависимости ог вида клеток и паразита меняется. При тпрерывноы культивировании с целью стимуляции развития P.vivax рекомендуется со^льтивирозапие с L -S29 и Нзр-2.

5. Сравнительно изучено развитее P.vivax и Р.falciparum в непрерывной культуре^и выявлено их биологическое различие. Установлено, что в стандартных условиях, в-отличие от p.falciparum , периодическая активность P.vivax определится самой природой паразита, а ш регулируется вшшшми факторами.

6. Разработаны и реализованы различные варианты очищения культур! малярийных плазмодиев от бактериального загрязнения.

7. В результате рпрэделвгая чувствительности малярийных паразитов к хлорохину выявлена чувствительность ig льтивирусмых изолятов P.vivax к хлорохину.

6. Приготовлен антигенный материал из культуры p.vivax и показана его пригодность для серодиагностики трехдневной малярии.

9. Изучена криоконсервация P.vivax и показано сохранение выживаемости оритропитарных форм p.falciparum после хранения в жидком азоте более 5 лет. На основе проведенных исследований создан криобанк малярийных паразитов человека, ПРАКТИЧЕСКИЕ ЖКШЕВДАЦШ

I. Методы получения и поддеркания непрерывной культуры возбудителя трехдневной малярии P.vivax.

- 23 -

2. Способ определения чувствительности возбудителя трех-дзввной малярии к хлорохину.

3. Питательная среда и ее различные комбинации для непрерывного поддержания культур! малярийных паразитов ( для P.vivo* : Ю/, 199 + 78% КРЯ-1640 + 20$ сыворотки, для P.falciparum : ЕПЯ-1640 с 20/з сыэ •) •

■1. Сокультпзпрозанпа зулариотных клеток Ь-929 и Взр-2 с возбудителем трехдгавной малярии в качестве биостимулятора.

5. Получение из культург P.vivas антигена для использо-вр.нтп! в тунологттчесktdc реакциях.

6. Способ криокопсетаациа и рэ крлоконсе ^вации V. vis ах.

7. Способ очипрнпя культуры маляряйшгх паразитов человека от контаминации.

о

- 24 - ' Список научных работ, опубликованных по теш диосе 1тации

1. Аллахверциев A.M., Алиева U.H., Ханмирд_х;в O.K. Получение эритроцитарной стадии возбудителя трехдневной малярии P.vivax in vitro // Материалы II республиканской биохимической конференции. Баку, IS93, с. 32.

2. AXlahverdiyev A.M., Aliycva Sh.H., Khanmirzoyev p.i. Obtaining the continuous culture of asexual bloodstages

of Plasmodium vivax in Azerbaijan // Материалы XI Иранского конгресса Физиологии и фармакологии. Т&'бриз,, 1993, с. 0-183.

3. Allahverdiyev A., Kasap li., Kasap М., Aliycva Sh., Pazarbafi A., Ceber К. The biological particularities of p.vivax in the continuous cultivation in vitro //Материалы YI Интернационального конгресса по иифевдионным болезням.

Прага, 1994.

4. Аллахверд.ев A.M., Алиева Ш.Н. С о культивирование эрит-роцитарной стадии малярийных плазмодиев о эукариозными клетками различных линий ( на турец.) // Материалы XXVI турецкого конгресса микробиологии. Анта~ья, 1994, с. 205.

5. 'Алиева Ш.Н., Аллахверциев A.M., Хакмирзоев Ф.И. Приготовление антигена из культур эритроци тарной стадии возбудителя трехдневной малярии P.vivax и использование его для реакнии иг, !муноЛлюоре сне гаии (на турец.) //Материалы Турецкого конгресса "XII. Cevher Neaibe Tip Giinleri" Кайсери, 1994, с. Р-23.

в. Allahverdiyev a.M., Aliyeva Sh.N. Comparative atudj of intraerythrocytar development of P.vivax in Ihe different nutritious nedia and their combinations // Материалы VIII Интернационального конгресса по паразитологии. ИсМир, 1994.

С. т'о ?4.С'Р.Г1Г..

7. Алзгахветднев АЛ., Алиева Ш.Я. Получэвзк 1п т1Ъгэ непрерывной зультуув беспалой зрятрацитарзой стадии возбудителя тропической каяярш Р.Га1с1рагст в Азербайджане ( на азерб. ) // Аз-. 1.бд. зурнал, 1994", (в печаля).

8. Аллахведдиев А.М., Алиева Ц, ИзучеЕзе воадеЕезвия различных питательных'сред, их отнбзвадаШ и зугаргогянх юэток СЛЕЗ на развита эратрсцитвршзЗ стадии возбудителя тропической малярии Р.тсАрагша 1а т!*го С кз азерб. ) // Труда Бац. ЕИЙ "гдидилсксЗ Профилактика, (з ггз^атз).

9. Адлахвердвгв АЛ., Алиева И»Н« Способ э^ль^Евиравания бгсполой эратрсшитарнай стадия возбудителя ^вадшвпой малярил

Р1аато(Ишз чгЛтах // Заявка ва жзобрэтеню в входящим вода-рои 202-И от-08 июля 1933 г. Лсшер гос. звгвстрвции ООСОБ9.

И.Н. блидсванын бполокида сл:.:лорн намизод!: алимлик доре-чоси алмаг учун тогдм стдидн "Нухтэлим култура иэрайт-лоринде учпгнлук во тропик малдарида тородпчилоршшн (Р.vivax во Р.faiciparum) сритроситдахили инкиск'пнын ба"зи хусусиддзтлэри" повзусунда дпссертаспда ииинкн

А Н Н О Т А С И J к С Ы

Тедгигат иши мили елни-тодгпгат Тибби Профилактика институт унда девина детнрилиб.- * " ( ISSI-I994 ) Елми х)эЬбэр: тибб елмлорк доктору А.-У.Аллаппердидев.

Кнсан иалдаридасы торэдичилзришш 4 невУндан далнь^ бирикин,

тропик ¡.¡алдаридаиын торвцичиси олан P.folciparuK-ун ( Р.f.) ерит-

роситар мерЬэлзсинин сТвсилвсиз ку'лтурасы алиг.мизднр ( Trager -

Jensen, 1976). Узун иллор арзиндо а пар план тедгигатлара бахма-

дараг, учкунлук мал^ари^апын торадичиси олан P.vivax -ын ( P.v,)

йасилосиз културасына алмаг myukyh олмашшды.

Диссертасида ищинин всас цегседи мухтолий култура пэраит-

лориндз (гидалы шгЬитлзр во онларнн комбинасидаларп, газ фазасы '

во с.) i.v. ве p.f.-ун еритроситдахшш иикишафынын i.!Yraj исоли

ejpentumaoii ва култура. а P.v.-ын фасилесиз инкипафкны та"мин .

сдои шераитин ашкар едшшвсн олиуидур.-.

Апарылан тодгигатлар нвтичасиндо илк дэфэ олараг, p.v. -ын

еритрооитар иерЬэлосинин ¿¡аоиласкз «ултурарц алшшиш.во м-геллиф-

Л11К пеЬадвтнаиэси алнаг учун еризв тагдкп едклиисдир (гэбул &

202-П, 08.07.1993,. девлэт ге;]дид;)аты £ 000069).. Аскар едилаишдир

кн, p.v. -ш фасилесиз културасыкнн алыншсы I.гадали urhirr кои-

бинасидасиндак котифадо етиокло;: 2.плазмодиуиларин еритроситда-

хили инкисафинын биодоки хусуспдj етлеринп позере алнаг шзрти'кло

мумкундур. Бир сыра физики-ктувви факторларкн ызл^арида паразпт-

леринкн еритросотдахили инкипафина ?8"снринин нуга;) по о ли едренил-

иеси нотичссиндэ Р.f. вэ p.v.-uh in vitro инкиаафьщда биолози

форглер апкара чыхарылмышды. Практика учун иу;телиф гидалы му-

Ьитлер во онларын комбинас^алары таклиф олуш.! у и, е унарно? hy-

че^релерин малдар^а паразитлоринш културасында стимулеедичи

еф(1ектинин Ьучедре вэ паразит невуидзн асалы олдугу шгеддэнлеи-

диршшишдн. Тодгигат просеоинда Азорбадчанин цухтолиф рскионла-

рындан вэ бфганыстандан алыниыш P.v. изолЗатларынын хлорохино-

Ьзссаслыгы ашкар едшшии, P.v. културасындан илк дэфо антиквн

Ьазирланшш во оцун учкунлук цал^ар^аныи серодиагностикасы

учун дарарли олдугу ityajjan едшшишдир. P.v. -ын криоконсерва-

сидасшшн ojpomiraacvi кэтичесинде лабораторидада учкунлук

малдарида торедичплоринии криобанкы japajttuiutiniÄU.

- -¿ч ~

к К 15 О I A I I О В

for dissertation of Aliyeva Sh.S. to receive academic degree of candidate of biological ccienceo (Ph D) on the next there: "Sor.e peculiarities of intraerythrocy-tar development of three-day ar.d trooical malaria pathogenou (P.vivax and P.falciparum) under different conditions of cultivation."

Work is carried out in national research institute of Prophylactic I.'edicine. (1991—1 9У4 >

Chief: Prof. Dr. A.M.Allahverdiyev.

From four species of human'з malaria pathogenes only continuous culture of tropical nalaria pathogene Plasmodium falciparum (P.f.) ia obtained (Irager-Jenoen, 1976). In apite of otudiec of иолу yearo one could not obtain continuous culttzre of e^ythro-cytar stage of 'thrcc-day malaria pathogeno Plasmodium viva:-: (P.v.) up to nor,-.

Purpose of present investigation was comparative study of intraerythrocytar development of P.v, arid P.f. under different conditions of cultivation (different nutritious media and thejr combinations, /;аз phace cnc во en) and determination the conditions providing continuous development of P.v, in the culture.

Aa a i-'juuVt of investigations conducted, at the first tine was obtained continuous culture oi i.-ryIhrocytar гЛс^а of P.v, ar.d done application fo-4 the. invention (prioritet from July 8, with incoming nur.'ber £¡02-1', ntate regiatx-ation number 000069). It was determined that obtaining of continuouc culture of P.v. can be provided by: 1. use of combined nutritious medium; 2. taking into consideration biological peculiarities of intraerythrocytar uevelopir.cnt of pla3nodiu;:.c. ?hej.-s were determined biological differences of P.v. and P.f. development in vitro no a result of comparative study the influence of number of physical chemical factors on intraerythrocytar development of malarial parasites. Different nutritious media and their combinations are offered for practical uses. It ia determined that under co-cultivation with malarial paraaitori stimulation effect of cucariotic cells changes according to cell species and to parasite. For the time of investigation chlorochynf3ensitivene3n of P.v. isolates got from the different regions of Azerbaijan and.Afganistan was found out. At the first time antigen material from the culture of P.v. was prepared and its suitability for the aorodyagnostica of three-day malaria -.vas shown. Au a result of study of cryoconoervation of P.v. erythrocytar stage was crnatea cryobank of malarial paraaiten.