Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий

Токарев, Юрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий
ВАК РФ 03.02.05, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий"

На правах рукописи

ТОКАРЕВ Юрий Сергеевич

ФИЛОГЕНИЯ И ПАРАЗИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ МИКРОСПОРИДИЙ

Шифр и наименование специальности

03.02.05 - энтомология 03.02.11 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург, 2013

2 4 СХТ 2013

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии)

Научный консультант:

ИССИ Ирма Викторовна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

ВИЛКОВА Нина Александровна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

заведующая лаборатории ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии

ФРОЛОВ Александр Олегович доктор биологических наук

ведущий научный сотрудник ФГБУН Зоологический институт РАН БЕНЬКОВСКАЯ Галина Васильевна

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Университет»

Защита состоится 27 декабря 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 006.015.01 на базе Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений по адресу:

196608, Санкт-Петербург, Пушкин, ш. Подбельского, д. 3. Факс: 8(812)4705110; e-mail: vizr@mail333.ru Веб-сайт: www.vizrspb.narod.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений

Автореферат разослан 10 октября 2013 г.

Учёный секретарь

совета, Q

Галина Анатольевна Наседкина

диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность и степень разработанности темы исследования

Основные группы возбудителей инфекционных заболеваний, оказывающих влияние на динамику численности массовых видов насекомых, представлены вирусами, бактериями, микроспоридиями, грибами и нематодами. Из них наиболее широко распространены в природе микроспоридии - облигатные внутриклеточные паразиты, интерес к которым в последнее время всё более возрастает. Это уникальный тип утративших митохондрии протистов (Исси, Воронин, 2007), имеющих общее происходение с грибами (Соколова, 2009; Capella-Gutierrez et al., 2012). Микроспоридии паразитируют в представителях всех крупных таксонов царства Animalia, включая человека, а также в некоторых протистах, при этом наибольшее число видов описано в членистоногих (Wittner, 1999). В зависимости от уровня численности популяции своего хозяина и условий окружающей среды проявление микроспоридиозов варьирует от минимального влияния на популяции хозяев до опустошительных эпизоотий, способных подавлять вспышки массового размножения вредных насекомых или уничтожать культуры искусственно разводимых насекомых (Weiser, 1961). Поэтому многие микроспоридии рассматриваются как важный фактор динамики численности и как основа микробиологических препаратов для борьбы с насекомыми -вредителями сельского и лесного хозяйства (Исси, 1986; Токарев и др., 2007; Solter et al., 2009; van Frankenhuyzen et al., 2011), а также с кровососущими переносчиками возбудителей заболеваний теплокровных животных (Andreadis, 2007). При этом биологическое разнообразие микроспоридий всё ещё мало изучено и при мониторинге природных популяций различных, даже хорошо изученных, животных обнаруживается все больше новых видов данных паразитов (Stentiford et al., 2010; Tokarev, 2010; Ardila-Garcia, Fast, 2012; Jones et al., 2012; Andeadis et al., 2012, 2013; Rode et al., 2013). В последнее время представления о методах систематизации видового разнообразия микроспоридий претерпели существенные изменения вследствие обнаружения несоответствия традиционного таксономического деления филогенетическим отношениям этих паразитов (Baker et al., 1997; Vossbrinck, Debrunner-Vossbrinck, 2005; Tokarev et al., 2012). В результате, с одной стороны, классические системы оказались устаревшими, а критерии для новой систематики, соответствующие данным молекулярной филогении, не разработаны, что затрудняет дальнейшие исследования в области диагностики и идентификации микроспоридий. Особенности паразито-хозяинных взаимоотношений детально изучены на нескольких примерах систем микроспоридии-насекомые, однако роль одного из ключевых факторов, определяющих характер их взаимодействий, а именно системы иммунитета хозяев, остаётся практически не исследованной. Изучение жизненных циклов, морфологии, ультраструктуры и основных свойств, определяющих адаптации микроспоридий к паразитированию в своих хозяевах, в сочетании с современными методами молекулярно-биологического анализа необходимы для определения вида и его положения в филогенетической

системе, для понимания путей эволюции микроспоридий и экологических связей между различными филогенетическими группировками этих паразитов, для дальнейшего усовершенствования современных подходов к диагностике, идентификации и таксономии паразитов, а также для оценки эффективности микроспоридий, перспективных в защите растений, и опасности заражения ими для человека.

Цель и задачи. В связи с изложенным выше, основная цель работы - изучить особенности взаимоотношений микроспоридий и насекомых, обеспечивающих устойчивость функционирования паразито-хозяинных систем, и проследить характер изменений этих взаимоотношений в филогенезе энтомопатогенных микроспоридий. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

(1) проанализировать взаимоотношения энтомопатогенных микроспоридий с защитными системами различных насекомых-хозяев на клеточном и организменном уровнях;

(2) провести ревизию таксономических признаков, используемых для систематики микроспоридий, с учётом их филогенетических отношений в свете новых данных молекулярной биологии;

(3) выявить взаимосвязь филогенетического положения энтомопатогенных микроспоридий с их паразитическими свойствами (гостальная специфичность, тканевый тропизм, патогенность, пути передачи и выживаемость в окружающей среде).

Научная новизна. При выполнении работы получены новые данные в области патологии насекомых. Впервые создана система культивирования in vitro гемоцитов сверчков и показана способность микроспоридий подавлять реакцию меланизации и активность фенолоксидазной системы насекомых-хозяев как in vivo, так и in vitro. Впервые использован филогенетический подход к анализу комплекса паразитических свойств микроспоридий наземных и водных членистоногих, что позволило выявить закономерности эволюционных преобразований при адаптации микроспоридий к паразитизму в этих хозяевах.

Описаны новые таксоны микроспоридий, в том числе 4 типовых вида новых родов и 2 новых вида; изменено родовое положение 4 ранее описанных видов. Для 26 описанных ранее и новых изолятов микроспоридий получены уникальные сиквенсы гена рибосомальной РНК (рРНК), анализ которых позволил установить их филогенетическое положение. Сочетание ультраструктурного и молекулярного подходов к таксономии микроспоридий позволило пересмотреть значимость ранее использованных таксономических признаков, а также предложить новые критерии с учётом филогенетических отношений видов, для создания универсальной системы микроспоридий. Получены новые данные, подтверждающие, что жизненные циклы микроспоридий представляют собой лабильную адаптивную функцию этих паразитов; впервые предложено использовать их особенности не для макросистематики, а для дифференциации таксонов видового уровня.

Методология и методы исследования. Для анализа особенностей паразитизма микроспоридий, заражающих членистоногих и других животных, использованы комплекс стандартных методов сбора материала, культивирования насекомых и их патогенов, микроскопического, биохимического, молекулярно-биологического, биоинформационного и статистического анализа. В ходе проведения работ накоплен большой фактический материал, позволивший усовершенствовать методы диагностики микроспоридий и адаптировать их к изучаемым объектам, а также разработать оригинальные методики стандартизации насекомых на различных этапах микроспоридиоза и моделирования микс-инфекций, а также оригинальную модель культивирования гемоцитов сверчков для паразитологических исследований ¡n vitro. Теоретическое и практическое значение. Новые данные, полученные в рамках проведённых исследований, позволили пересмотреть современные подходы к систематике микроспоридий и выявить адаптивные преобразования, произошедшие в процессе эволюции этих протистов. Расширены представления о паразито-хозяинных отношениях микроспоридий и членистоногих, в частности, показаны иммуносупрессивные свойства паразитов данной группы как результат адаптации к паразитизму в насекомых, а также особенности формирования внутриклеточных структур, обеспечивающих взаимодействие паразита и хозяина на клеточном уровне. Применение современных подходов морфологического и молекулярного анализа позволило усовершенствовать методы диагностики, охарактеризовать разнообразие и филогенетические отношения микроспоридий, паразитирующих в хозяйственно значимых насекомых из таких отрядов, как Orthoptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Coleóptera и Díptera.

Полученные материалы использованы при подготовке курсов «Основы научных исследований», «Биотехнологии в защите растений» и «Инфекционная патология членистоногих», читаемых на кафедре биологической защиты Санкт-Петербургского Государственного Аграрного Университета, а также в курсе «Молекулярно-генетические методы исследования вредных насекомых и их патогенов» для аспирантов ВИЗР. Защищаемые положения диссертации

1) Защитные реакции со стороны клеточной системы иммунитета (фагоцитоз, инкапсуляция, меланизация) насекомых-хозяев оказывают негативный эффект на развитие микроспоридий, которые, в свою очередь, используют механизмы как избегания (путём выстреливания инкапсулированных и фагоцитированных спор), так и подавления (путём ингибирования фенолоксидазной системы гемолимфы насекомых) этих реакций. Иммуносупрессивные свойства сильнее выражены у более патогенных форм микроспоридий и вызывают существенное повышение восприимчивости заражённых насекомых к другим патогенам.

2) Для разработки новой систематики микроспоридий, учитывающей их филогенетическое положение, необходимы критический анализ и оценка таксономической значимости традиционных критериев, и использование признаков, не применявшихся ранее. При этом следует учитывать, что

лабильность жизненных циклов микроспоридий позволяет использовать их особенности в качестве таксономического критерия только на видовом уровне. Для классификации таксонов ранга рода и выше пригодны такие особенности ультраструктуры, как строение органелл аппарата экструзии (отвечающего за внедрение паразита в клетку хозяина), и клеточной оболочки (определяющей взаимодействие с клеткой хозяина на протяжении развития паразита).

3) В процессе видообразования микроспоридий возможны перестройки жизненных циклов, происходящие по двум основным путям: а) морфогенетическое усложнение клеток с образованием функционально различающихся морфотипов спор, ведущее к формированию сложных жизненных циклов, и б) редукция одной из спорогоний сложного жизненного цикла с образованием простого жизненного цикла.

4) Эволюция энтомопатогенных микроспоридий шла по двум основным направлениям: по пути тесной коэволюции с двукрылыми насекомыми или по пути расширения круга потенциальных хозяев, занимающих самое разное систематическое положение и разнообразные экологические ниши.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности полученных данных определена статистическим анализом, воспроизводимостью экспериментов, сравнением выявленных закономерностей в разных паразито-хозяинных системах и их соответствием современным биологическим концепциям. Материалы диссертации представлены на 33 научных мероприятиях, среди которых: Съезды Русского Энтомологического Общества (Санкт-Петербург, 2002, 2012; Краснодар, 2007), Паразитологического Общества РАН (Москва, 1998; Петрозаводск, 2003; Новосибирск, 2013) и Общества Патологии Беспозвоночных (Хельсинки, 2004; Анкоридж, 2005; Ковентри, 2008; Трабзон, 2010); Европейские протистологические конгрессы (Эльсинор, 1999; Сан-Бенедетто дель Тронто, 2003; Санкт-Петербург, 2007); Международный энтомологический конгресс (Дурбан, 2008); III Съезд по защите растений (Санкт-Петербург, 2013); международные научные конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2006, 2008-2010), «Инфекционная патология членистоногих» (Санкт-Петербург, 2012) и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 102 печатные работы, из них 36 в журналах перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ (в том числе 26 статей в журналах, индексированных Thompson Reuters ISI), 14 - в других журналах и сборниках, 52-тезисы и материалы конференций. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах, содержит 76 иллюстраций и 12 таблиц, включает введение, 5 глав, заключение, выводы, список сокращений и условных обозначений, словарь терминов, список литературы. Библиография включает 378 литературных источников, из них 302 -иностранных.

Благодарности. Исследования проводились в рамках программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Российской академии сельскохозяйственных наук при поддержке ФЦП «Интеграция», INTAS,

DAAD, Совета по грантам Президента РФ и РФФИ (включая гранты №№ 13-0400693 и 12-04-00552) Выполнение исследований не было бы возможным без помощи В.В. Долгих, Г.Р. Леднёва, Ю.М. Малыш, А.Н. Фролова (ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии), В.Н. Воронина (ГосНИОРХ, Санкт-Петербург), Е.В. Селиверстовой (ИЭФиБ им. И.М. Сеченова, Санкт-Петербург), В.В. Глупова, Я.Л. Воронцовой, В.В. Мартемьянова (ИСиЭЖ СО РАН, Новосибирск), A.B. Симаковой (ТомГУ, Томск), Е.С. Насоновой (ИНЦ РАН, Санкт-Петербург), Р. Audiot, D. Bourguet, В. Pelissie (CBGP, Montpellier), R. Larsson (Lund University, Lund), J.J. Lipa (Institute of Plant Protection Polish Academy of Sciences, Poznan), R. Entzeroth (DTU, Dresden), которым автор выражает свою глубокую признательность.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Современные представления о микроспоридиях (обзор литературы).

В обзоре проанализированы данные классических и современных исследований, посвященных вопросам видового разнообразия, систематики, эволюции и экологии микроспоридий. Рассмотрен вопрос практического значения энтомопатогенных микроспоридий и затронута проблема опасности заражения ими теплокровных, включая человека. Глава 2. Методические подходы

Основными объектами исследований послужили микроспоридии, паразитирующие в водных и наземных членистоногих. Использовались собственные сборы, коллекция микроспоридий ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии и материалы, любезно предоставленные нашими коллегами. Сбор и консервация материала осуществлялись по методикам, общепринятым для данных животных-хозяев. Первичный скрининг на заражённость микроспоридиями проводили методами светлопольной и флюоресцентной микроскопии (Воронин, Исси, 1974; Токарев и др., 2004, 2009, 2012). При обнаружении микроспоридий материал фиксировали для ультраструктурного и молекулярно-генетического анализа, который проводили стандартными методами трансмиссионной электронной микроскопии (Гайер, 1974) и молекулярной биологии (Sambrook et al., 1989; Weiss, Vossbrinck, 1999; Ronquist, Huelsenbeck, 2003) адаптированными к изучаемым объектам (Tokarev et al., 2010abc). В качестве филогенетически информативного участка генома использовали последовательность гена малой субъединицы рибосомальной РНК (рРНК), так как для большинства исследованных микроспоридий мировой фауны депонированные в Генбанке сиквенсы ограничены данным локусом (Tokarev, 2010).

Паразито-хозяинные отношения микроспоридий и насекомых на клеточном и организменном уровне изучали, используя лабораторные модели паразито-хозяинных систем: (1) Paranosema grylli - Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae), (2) Paranosema locustae - Locusta migratoria (Orthoptera, Acrididae), (3) Vairimorpha ephestiae - Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae). Споры микроспоридий выделяли из заражённых тканей, очищали центрифугированием в градиенте плотности перколла или в глицерине с последующей отмывкой водой

и использовали для перорального заражения личинок насекомых (Воронцова и др., 2004; Dolgikh et al., 1997; Sokolova, Lange, 2002). Для изучения патологического процесса насекомых вскрывали, состояние внутренних тканей оценивали визуально, заражённость паразитами оценивали с помощью световой микроскопии. Моделирование микс-инфекций проводили на личинках перелётной саранчи путём дозированного заражения спорами микроспоридии Р. locustae с последующим кратковременным погружением личинок на 3, 6 и 9 сутки после заражения в суспензию конидий анаморфного аскомицета Metarhizium anisopliae (5 х 107 конидий/мл), наработанных в поверхностной культуре на твёрдой питательной среде. Смертность учитывали ежедневно, погибших насекомых вскрывали для микроскопирования или помещали во влажные камеры для инициации образования конидий.

Для выявления фенолоксидазной (ФО) активности в гемоцитах сверчков использовали гистохимические тесты (Глупов и др., 1997). Для оценки воздействия микроспоридий на клетки гемолимфы насекомых разработана оригинальная система культивирования in vitro гемоцитов сверчков (Tokarev et al., 2001, 2005). Интернализацию спор микроспоридий фагоцитирующими клетками и ацидификацию фаголизосом оценивали методом флюоресцентной микроскопии с использованием флюорохрома акридиновый оранжевый (Zanetti et al., 1987). Статистический анализ проводили с помощью пакетов приложений STATISTICA 7.0 и SigmaStat, используя критерий Стьюдента для выявления статистически достоверных различий между вариантами. Для оценки характера взаимодействий патогенов при микс-инфекциях определяли выживаемость насекомых в вариантах по показателю LT50 и проводили logrank test (Bland, Altman, 2004).

Глава 3. Взаимодействие микроспоридий с защитными системами насекомых-хозяев на клеточном и организменном уровнях

3.1. Особенности формирования пограничной зоны между клетками паразита и хозяина

Развитие микроспоридий в заражённой клетке хозяина протекает либо в прямом контакте с её цитоплазмой, либо в пределах паразитофорной вакуоли (ПВ). Прямой контакт клетки паразита с цитоплазмой клетки животных-хозяев, без формирования ПВ - распространённый тип паразито-хозяинных отношений микроспоридий и животных-хозяев (Canning, Vavra, 2000). Можно предположить, что данный способ развития способствует непосредственному обмену метаболитами между паразитом и хозяином. Развитие в прямом контакте с цитоплазмой клетки хозяина отмечено для Metchnikovella incurvata (Sokolova et al., 2013) и Nematocida parisii (Troemel et al., 2012), что позволяет считать этот признак плезиоморфным для микроспоридий. Характерная особенность, часто наблюдаемая у различных видов микроспоридий — образование тесных контактов с различными компартментами клетки хозяина, отвечающими за

энергетические и синтетические процессы. Наиболее часто это касается митохондрий и эндоплазматического ретикулюма, которые окружают клетки паразитов многих видов (Исси, 1986; Simakova et al., 2005). В непосредственной близости поверхности клеток микроспоридий, в том числе к спорофорному пузырьку, в цитоплазме заражённых клеток часто наблюдается образование разнообразных структур - трубочек, филаментов, везикулярных и везикулярно-трубчатых образований. Иногда удаётся наблюдать непосредственную связь этих структур с оболочкой паразита, что можно трактовать как адаптацию паразита, направленную на увеличение зоны контакта с клеткой хозяина для более эффективной эксплуатации её ресурсов. В митохондриях клетки хозяев, контактирующих с клетками ряда микроспоридий, мы наблюдали патологические изменения, а именно вакуолизацию, что предположительно связано с перенапряжением энергетических систем клетки хозяина, интенсивно эксплуатируемых паразитом, а также филаменты, возможно, связывающие митохондрии клетки хозяина с клеткой паразита (Рисунок 1).

ПВ может существовать на протяжении всего внутриклеточного развития паразита, либо формироваться на определённых стадиях развития, обычно при переходе к спорогонии (Исси, Воронин, 2001). Начало ПВ наиболее часто дают цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулюма (ЭР). Многие виды, образующие ПВ, развиваются в энтероцитах животных различных таксонов, однако есть паразиты, которые заражают клетки других тканей (Canning et al., 2005), например, адипоциты, как в случае с Helmichia lacustris из Chironomus plumosus (Tokarev et al., 2012). Остаётся неясным, как именно мембранные структуры клетки хозяина включаются в формирование оболочки вокруг клеток паразита у разных видов (Fassnauer et al., 2005). По нашим наблюдениям, мембраны ЭР адипоцитов С. plumosus постепенно окружают клетки микроспоридии на этапе мерогонии, в результате чего на более позднем этапе спорогонального плазмодия вокруг гладкой оболочки спорофорного пузырька возникает покрытая рибосомами мембрана ПВ (Рисунок 2).

Нами впервые обнаружено формирование ПВ микроспоридий за счёт мебранных структур комплекса Гольджи (КГ) клетки хозяина. При проникновении Crispospora chironomi в энтероциты личинок Chironomus plumosus клетки паразита окружаются мембранами КГ, изолирующими паразитов полностью с образованием толстостенной капсулы (Рисунок ЗА-В), или частично (Рисунок ЗГЕ). Необычное участие КГ в защитной реакции клетки хозяина на внедрение паразита можно объяснить тем, что энтероциты относятся к клеткам, в которых структуры аппарата Гольджи наиболее многочисленны и активно участвуют во всех присущих этим клеткам процессах (транспорт слизи, белков).

Рисунок 1. Митохондрии клетки хозяина (МКХ), трубчатые (ТС), везикулярные (ВС) и вакуолярио-трубчатые структуры вокруг клето< АпЬо/ИогкПо сЫгопотI, окруженных оболочкой спорофорного пузырька (ОСП). Б, Г - увеличенные фрагменты А и В, соответственно. Стрелки -филаменты, пронизывающие МКХ. __

Рисунок 2. Эндоплазматический ретшулюм (ЭР) СЫгопотш рЬтоиы вокруг стадий развития Не1ткЬю 1асиИги А, мероит; Б, фрагмент А. окружение клетки паразита мембранами ЭР (стрелка); В, спорогональный плазмодий; Г, фрагмент В, смыкание мембран ЭР (двойная стрелка) вокруг спорофорного пузырька паразита (стрелка). Масштабная линейка = 1.92 мкм.

.«и

О.»'

Рисунок 3. Структуры комплекса Гольджи (КГ) адипоцитов СЫгопопня р1ито%и$ вокруг микроспоридии Стртрога сЫгопотг А-В, отложение аморфного злектронно-плотиого материала (стрелка) на внутренней стороне ларазитофорной вакуоли, содержащей споронты (А), споробласты (Б) и споры паразита (В), при участии КГ с наружной стороны (двойная стрелка); Г—€, диплокариотические споры, окруженные отдельными стопками (Г, Д) или массой (Е) мембран КГ (стрелка) Масштабная линей« = 0.76 мкм.

3.2. Взаимодействие микроспоридий с системой иммунитета насекомых-хозяев Основной объём исследований взаимодействия микроспоридий с иммунной системой хозяев выполнен на лабораторных моделях микроспоридиозов позвоночных животных (Didier et al., 1994; Didier, Bessinger, 1999). Накопленные данные о функционировании паразито-хозяинных систем микроспоридии-насекомые в этом отношении ограничены наблюдениями симптоматики естественных заболеваний у насекомых различных отрядов (Weiser, 1969) и исследованиями экспериментального микроспоридиоза пчелиной огнёвки Galleria mellonella (Лозинская, 2002). В настоящей работе в качестве основных моделей использованы микроспоридиозы прямокрылых насекомых. При вскрытии сверчков отмечено накопление меланиновых гранул в жировом теле, заражённом микроспоридией Paranosema grylli. Появление гранул совпадает по времени с созреванием спор в очагах заражения, и их накопление прогрессирует на финальном этапе микроспоридиоза при массовом накоплении спор в заражённых тканях. Доля имаго сверчков с признаками меланотической инкапсуляции на финальном этапе заболевания достигает 90%, при этом доля особей, характеризующихся меланизацией на среднем и высоком уровне, превышает 80%. Напротив, у перелётной саранчи в ответ на заражение микроспоридией Paranosema locustae реакция меланотической инкапсуляции наблюдалась только на низком уровне (образование одиночных крупных или диффузных мелких гранул) у 2.5% особей лабораторной популяции и у 30% особей природной популяции (Рисунок 4).

Захваченные гемоцитами споры интенсивно окрашивались в красный цвет в присутствии акридинового оранжевого, что свидетельствует о закислении содержимого фагосом, обычно происходящем при их слиянии с лизосомами. На электронограммах в фагосомах, содержащих споры, наблюдаются картины, предположительно свидетельствующие о фаголизосомальной деградации, активно происходящей при фагоцитировании спор микроспоридий. Часть фагоцитированных и инкапсулированных (в очагах меланотической инкапсуляции заражённых микроспоридиями клеток жирового тела сверчков) спор, судя по электронограммам, выстреливает, что, очевидно, служит одним из механизмов избегания защитных реакций насекомых-хозяев (Рисунок 5).

Рисунок 4. Степень меланизации заражённых микроспоридиями тканей сверчков и саранчи лабораторной культуры (лаб), а также потомства саранчи из природной популяции (природн.). Разными латинскими буквами указаны варианты, значения которых статистически отличаются друг Сверх« саоаича саранче 0Т Друга,

(лаб) (лрмроои) (лаб)

С другой стороны, среди спор микроспоридий Р. дгуШ и Р. /осиМае, выделенных из очагов мелзниззции соответствующих насекомых-хозяев, по сравнению с немеланизированными участками наблюдалось статистически достоверное повышение содержания аберрантных форм, рассматриваемых нами как тератоспоры, образовавшиеся в результате нарушения деления споронта (Рисунок б. Таблица 1). Данное наблюдение свидетельствует о токсическом эффекте продуктов меланогенеза, образующихся при активации лрофенолоксидазного (проФО) каскада в ответ на заражение. Очевидно, что при внутриклеточном развитии паразит избегает данной защитной реакции хозяина, однако появление массы зрелых спор ведёт к разрушению заражённых клеток (Исси, 1986), выпадению спор в полость тела и активации иммунных реакций гемолимфы с неблагоприятными последствиями для ещё созревающих спор в соседних клетках. Это предполагает активное участие проФО каскада в защитных реакциях организма насекомых на заражение микроспоридиями.

Важно заметить, что скорость и степень меланизации гемолимфы как у прямокрылых (Токагеу, Боко1оуа, 2005), так и у чешуекрылых насекомых (Воронцова и др, 2004; Токагеу е1 а1., 2004) оказалась понижена у особей на финальном этапе микроспоридиоза.

j , 53S Щ fe

Рисунок 5. Инкапсулированный адипоцит сверчка, заражённый спорами микроспоридии Рагапоъета дгуШ. Стрелками отмечены споры, имеющие характерный вид выстреливших. Масштабная линейка = 10 мкм.

Рисунок 6. Тератоспоры (стрелки) микроспоридий Paronosema grylli (А, В) и Paranosema locustae (Б, Г) при окрашивании ДАФИ (А, Б) и калькофлюором (В, Г). Масштабная линейка = 5 мкм.

Гистохимический анализ показал снижение доли гемоцитов, дающих положительную реакцию на фенолоксидазу (ФО) у имаго сверчков на финальном этапе микроспоридиоза (Рисунок 7) и у гусениц Gallería mellonella на сроки.

соответствующие пикам массовой спорогонии микроспоридии Vairimorpha ephestioe (Лозинская, 2002; Tokarev et al., 2003). Напротив, при заражении сверчков другим облигатным внутриклеточным паразитом, кокцидией Adelina grylli, накопление значительного количества инфекционных стадий паразита в жировом теле хозяина приводило к существенному повышению доли ФО-положительных гемоцитов сверчков (Соколова и др., 2000).

Таблица 1. Накопление тератоспор микроспоридий в меланизированных тканях

Вид насекомого, происхождение Доля тератоспор среди спор микроспоридий, % ± ошибка%

в меланизированных тканях в немеланизиро ванных тканях

Gryllus bimaculatus, лабораторная культура 4.13 ± 0.290 0.9 ± 0.208

Locusta migratoria, лабораторная культура 6.7010.629 1.05 ± 0.524

Locusta migratoria, потомство особей из дельты Волги 5.89 ±0.737 0.60 ±0.270

Рисунок 7. Доля

фенолоксидазо(ФО)-положительных гемоцитов сверчков одного возраста на этапах раннего микроспоридиоза первой (РМ I) и второй стадии (РМ II), конечного микроспоридиоза (КМ) и в контроле. * - вариант, достоверно отличающийся от контроля.

Использование первичной культуры гемоцитов сверчков позволило изучить непосредственный эффект спор микроспоридий на состояние популяции свободно-циркулирующих клеток насекомых-хозяев, что значительно затруднено в условиях паразито-хозяинной модели in vivo. Во всех вариантах контакта спор микроспоридий с гемоцитами сверчкоз в сравнении с контрольными вариантами наблюдалось достоверное снижение доли ФО-положительных клеток. Корреляционный анализ выявил налиме тесной связи между степенью снижения доли ФО-положительных клеток и уровнем инфекционности спор, коэффициент корреляции R=0.92, достоверный на 99%-ном уровне вероятности. В частности.

! »»

I 70

ко

i м

1 ? 40

; i 9» ['»

' i» i .

Kcmipm РМ I

J=B

РМ II №

снижение доли ФО-положительных гемоцитов под действием спор Paranosema locustae было почти в 10 раз сильнее в сравнении с Р. grylli (Рисунок 8).

Изменение доли ФО-положительных клеток в монослое гемоцитов в условиях описанного эксперимента мон-ет быть вызвано различными факторами. В частности, помимо иммуносупрессивного эффекта, предполагаемого для инфекционных стадий развития (спор) микроспоридий, причиной снижения доли ДОФА-реактивных клеток могла послужить частичная дегрануляция иммунокомпетентных клеток, вызванная контактом с чужеродным объектом (Götz, Boman, 1985). Однако эта при«-ина не объясняет наличия корреляции между уровнем инфекционносги спор и степенью снижения доли ФО-положительных гемоцитов. В связи с этим представляется более вероятным предположение наличия у активных спор микроспоридий механизма ингибирования того или иного звена ФО-активирующего каскада.

I ,о

гп

ь pH

Ксмтропь

P»t»nos»m» Рягапохетл gryft кхиМав

Рисунок 8.

Доля фенолоксидазо(ФО)-положительных клеток в монослое гемоцитов сверчков через 1 час после инкубации со спорами микроспоридий Paranosema дгуШ и Р. /осшгае в соотношении 1:10. Разными латинскими буквами указаны варианты, значения которых статистически отличаются друг от Друга.

Это свойство можно рассматривав как приспособление микроспоридий к паразитированию в насекомых, так как именно споры контактируют с иммунокомпетентными клетками животных-хозяев на различных этапах инфекционного процесса. Адаптивное преимущество такой иммуносупрессивной способности подтверждает тот факт, что продукты меланогенеза при защитных реакциях прямокрылых насекомых оказывают тератогенное воздействие на микроспоридий р. Рагапозета, наруиая нормальный процесс спорогенеза (Токагеу е1 а1., 2007). Выявленная в настоящей работе способность спор микроспоридий негативно влиять на ФО систему гемоцитов объясняет подавление реакции меланизации (Воронцова и др., 2004), снижение доли ФО-положительных гемоцитов (Соколова и др., 2000) и ФО активности плазмы гемолимфы (Лозинская, 2002) у заражённых насекомых при массовом накоплении спор паразита, а также у насекомых, в полость тела которых были инъецированы споры микроспоридий (Токагел/ с г а1., 2003). Кроме того, спорогенез Р. /осинае при развитии микроспоридий в перелётной саранче сопровождается значительно более сильным подавлением реакции меланизации насекомого-хозяина по сравнению с микроспоридиозом двупятнистого сверчка.

вызываемого Р. дгуШ (Рисунок 8). Указанное различие в подавлении спорами микроспоридий реакции меланизации насекомых-хозяев соответствует таковому в уровне снижения доли ФО-положительных клеток в монослое гемоцитов, выявленному для данных видов паразитов в настоящей работе.

Поскольку проФО каскад занимает ключевое место в системе иммунитета насекомых ^¡ПерБЮ е1 а1., 1997), подавление его активности может значительно влиять на восприимчивость насекомых к другим неблагоприятным факторам окружающей среды, прежде всего к патогенам. Для изучения взаимодействия микроспоридий с другими патогенами при микс-инфекции было проведено инфицирование личинок саранчи конидиями энтомопатогенного анаморфного аскомицета МеМапгшт ап1зорНае на 3, 6 и 9 сутки, после заражения микроспоридиями. В варианте инфицирования саранчи грибом на 3 сутки микроспоридиоза, когда происходило массовое размножение внутриклеточных стадий развития паразита (меронтов), наблюдался временный антагонизм между патогенами, выражавшийся в замедлении гибели насекомых от микс-инфекции по сравнению с расчётной ожидаемой смертностью (Рисунок 9). Данный эффект может быть объяснён с позиций временного повышения жизнеспособности и устойчивости к патогенам насекомых при раннем микроспоридиозе (Исси, Онацкий, 1984), однако в целом изменений в средней продолжительности жизни насекомых (определённой с помощью теста Каплана-Мейера) в вариантах микоза и микс-инфекции не наблюдалось.

При заражении личинок саранчи грибом на 6 сутки микроспоридиоза, когда наблюдался переход микроспоридий к спорогенезу (образование споронтов и споробластов), отличий в фактических и ожидаемых показателях смертности заражённых насекомых практически не было (Рисунок 10). Наконец, при заражении грибом на 9 сутки микроспоридиоза, когда началось созревание спор, фактическая смертность насекомых от микс-инфекции наступала значительно раньше, чем ожидалось (Рисунок 11). Средняя выживаемость при микс-инфекции была значительно ниже, чем при микозе. Таким образом, синергизм двух патогенов выражен только в варианте заражения личинок саранчи грибом на финальном этапе микроспоридиоза, характеризующемся различными негативными эффектами на организм насекомых-хозяев, включая снижение иммунного статуса (Токагеу, Боко1оуа, 2005). Микроскопическое исследование показало, что созревание спор микроспоридий замедлено в варианте микс-инфекции, когда заражение грибом проводили на 3 сутки микроспоридиоза. Антагонизм в данном случае может быть объяснён, в частности, конкуренцией за питательные вещества и негативным воздействием на организм насекомого вырабатываемых грибным патогеном токсинов, что опосредованно может сказываться и на развитии микроспоридий.

Накопленные экспериментальные данные свидетельствуют о неоднозначности характера взаимоотношений микроспоридий с другими энтомопатогенами при микс-инфекциях. Тем не менее, в работах, выполненных на разных тест-системах, прослеживается основная закономерность:

опережающее заражение микроспоридиями значительно усиливает эффективность последующего применения вирусных, бактериальных и грибных препаратов (Исси, Онацкий, 1984; Ефименко, 1989; Bauer et al., 1998; Pierce et al., 2001; Tounou et al., 2008ab), что следует учитывать при разработке стратегий интегрированной защиты растений.

дней после заражения грибами

Рисунок 9. Динамика смертности личинок перелётной саранчи при микроспоридиозе, микозе и минс-инфекции. Заражение грибами через 3 суток после 1аражения микроспоридиями. Ожидаемая смертность (расчёт) при микс-инфекции рассчитана, исходя из суммирования показателей смертности от моно инфекций за вычетом контроля. Биноминальный тест на антагонизм/аддитивность/синергизм проведён по Tounou et al., 2008b.

дней после заражения грибами

Рисунок 10. Динамика смертности личинок перелётной саранчи при микроспоридиозе, микозе и микс-инфекции. Заражение грибами через 6 суток после заражения микроспоридиями. Обозначения как на рисунке 9.

дней после 'заражения грибами

Рисунок 11. Динамика смертности личинок перелётной саранчи при микроспоридиозе, микозе и микс-инфекции. Заражение грибами через 9 суток после заражения микроспоридиями. Обозначения как на рисунке 9.

Глава 4. Молекулярная филогения и систематика микроспоридий

Систематика одноклеточных эукариот подвергнута в настоящее время существенному пересмотру, в основе которого лежит применение методов молекулярной филогении (Boenigk et al., 2012), что затронуло и такую группу паразитических протистое, как микроспоридии (Vossbrinck, Debrunner-Vossbrinck, 2005; Keeling, 2009; Capella-Gutterrez et al., 2012). Следует отметить, что основные классификационные системы, основанные на морфологических признаках, и прежде всего на особенностях жизненных циклов микроспоридий, существенно расходятся в трактовке деления типа Microsporia на макротаксоны (Исси, 1986; Welser, 1977; Sprague, 1977; Sprague et al., 1992). Первый филогенетический обзор, основанный на анализе сиквенсов гена рРНК 125 видов микроспоридий (Vossbrinck, Debrunner-Vossbrinck, 2005), показал их деление на пять основных филогенетических ветвей, соответствующих трём классам филогенетической системы: Aquasporidia (ветви I, II и V; паразиты пресноводных хозяев), Marinosporidia (ветвь III; паразиты морских хозяев) и Terresporidia (ветвь IV; паразиты сухопутных хозяев). При этом было обнаружено, что ряд традиционных крупных таксонов типа Microsporidia носит полифилетический характер.

В ходе выполнения работы существенно расширена база данных о видовом и генетическом разнообразии микроспоридий. Так, получены данные по ультраструктуре для 15 видов этих паразитов и 26 уникальных сиквенсов гена рРНК. Энтомопатогенные микроспоридии, исследованные в настоящей работе, обнаружены во всех пяти ветвях филогенетического дерева, упомянутых выше. Обнаружен полифилетический характер ряда таксонов, в частности, семейств Mrazekiidae (см. далее) и Thelohaniidae. Сочетание данных молекулярной

филогении и ультраструктуры паразитов способствовало верификации установленных ранее и выявлению новых закономерностей эволюционных преобразований, важных с точки зрения систематики микроспоридий. Так, на примере разных видов паразитов найдены новые подтверждения сделанному ранее заключению (Baker et al., 1997; Vossbrinck, Debrunner-Vossbrinck, 2005) о том, что такие основополагающие таксономические критерии морфологической системы микроспоридий (используемые на уровне характеристик семейств, отрядов и даже классов), как строение ядерного аппарата (монокариотический или диплокариотический), особенности ядерных преобразований (со сменой или без смены ядерной фазы) и спорогонии (ди- или полиспоробластическая), наличие (или отсутствие) спорофорного пузырька и типы жизненных циклов (простой или сложный) весьма лабильны, то есть быстро меняются у близкородственных видов и не могут использоваться для выделения таксонов высокого ранга в системе, построенной на филогенетических отношениях микроспоридий (Malysh et al., 2008; Tokarev, 2010; Issl et al., 2012a). С другой стороны, у филогенетически близких форм микроспоридий выявляется высокий уровень сходства в тонком строении органелл аппарата экструзии спор, а также в строении оболочки спор и внутриклеточных стадий развития, то есть структур, ответственных как за проникновение паразита в клетку хозяина, так и за формирование зоны контакта клеток паразита и хозяина, соответственно. В результате, для таких видов, паразитирующих в личинках одного вида хозяев, Chironomus plumosos (Díptera: Chironomldae), как Ыеорегегю chironomi, Semenovaia chironomi и Evlachovoia chironomi, ранее относимых к разным семействам и отрядам (Исси, 1986), а также для нового вида Neoperezia sp. выявлены ультраструктурные и молекулярные признаки, характерные для представителей одного рода, а сравнение с представителями близкородственных родов позволило обосновать выделение таксона ранга семейства (Токарев и др., 2012; Ksi et al., 2012а). Внутреннее строение как моно-. так и диплокариотических спор видов рода Neopereiia практически одинаково, основные различия между ними заключаются в размерах спор и особенностях жизненного цикла (Рисунок 12). Это отличает группу паразитов из личинок хирономид от микроспоридий из кровососущих комаров семейства Culicidae, тоже со сложным жизненным циклом развития, у которых при смене типа спорогонии наблюдаются кардинальные различия в морфологии и тонком строении спор (Andreadis, 2007). Микроспоридии хирономид из ветви V занимают базальное положение на филогенетическом дереве по сравнению с микроспоридиями кулицид из ветви I, в связи с чем гетероксенный жизненный цикл последних (с участием циклопов в качестве промежуточных хозяев) можно считать эволюционным преобразованием на основе жизненного цикла микроспоридий анцесгральной группы в результате морфогенетического усложнения спор, образующихся в одной из спорогоний (Рисунок 13). В пользу последнего предположения говорит сходство внутреннего строения спор, образующихся в результате спорогонии двух разных типов у диморфных микроспоридий родов MetchnikoveUa и Chytridiopsis,

которые рассматриваются как плезиоморфные формы типа Микроспоридии (Исси, 1986).

1.00/100 1 ооноо

Нсорегсна ъp.VH2^ ^Evlachoval¿l сГигопопп) + .

Ысорогспаяр МН22 (*)

\ + ]

- Ыеорегепа сЫгопот) '

Вгуогювенпа р1итаМкю (+ - всЬгооОсга р1ита1еИое /*/

ЗсЛгоойогз ауПЫву1 ф

Janacekií> ЬеЬо^зюих!

Рисунок 12. Филограмма, показывающая филогенетические отношения микроспоридий рода Ыеорегег1а, молекулярные гаплотипы которых получены в настоящей работе (выделены полужирным шрифтом), и родственных таксонов, построенная методом Байесовского заключения. Поддержка ветвей указана в виде значений постериорной вероятности. Виды микроспоридий отмечены пиктограммами, демонстрирующими особенности жизненного цикла.

Рисунок 13. Схематическое изображение возможных путей преобразования жизненных циклов при видообразовании микроспоридий. А -морфогенетическое усложнение за счёт изменения ультраструктуры спор, образующихся в одной из спорогоний. Б - разрыв жизненного цикла с сохранением одной спорогонии у разных, вновь образовавшихся видов.

В то же время, обнаружено, что микроспоридии, имеющие сходство общего плана строения спор на ультраструктурном уровне и на этом основании отнесённые к одному семейству, могут быть филогенетически далеки друг от

друга. Например, микроспоридии Mrazekia macrocylopis и Bacillidium vesiculoformis обладают палочковидными спорами и укороченной полярной трубкой, основание которой образует расширение, называемое манубрием (manubrium). Изначально микроспоридии родов Mrazekia и Bacillidium были описаны в рамках одного рода Bacillidium (leger, Hesse, 1916; V^vra, 1962), а после его разделения оба рода были отнесены к семейству Mrazekiidae (Larsson et al., 1993). Однако филогенетический анализ, проведённый нами, выявил принадлежность этих двух паразитов к различным ветвям филогенетического древа, что говорит о полифилетичном характере семейства Mrazekiidae и о конвергентном сходстве основных черт ультраструктуры спор. Более внимательный анализ позволил выявить уникальные черты в строении полярной трубки, четко различающиеся у Mrazekia и Bacillidium (Рисунок 14).

Аналогично описанному выше, микроспоридии рода Tubulinosema (Franzen et al., 2005; Issi et al., 2008) и неидентифицированная микроспоридия Microsporidium sp. из Prostepbanus truncatus обладают сходством строения спор (слабо анизофилярная полярная трубка, слой трубчатых структур на поверхности споры, пластинчатый поляропласт и зубчатый выступ на переднем полюсе фиксированной споры), при этом филогенетически эти микроспоридии далеки друг от друга и отличаются в деталях строения спор, старыми системами не учитываемыми. В частности, паразит из P. truncatus характеризуется таким уникальным признаком, как асимметричное расположение лоляропласта, обусловленное наличием крупной органеллы в передней части споры.

Существенное преобразование ультраструктуры спор микроспоридий, характеризующихся высокой степенью специализации, чаще всего происходит при их переходе к паразитизму в хозяевах иного систематического положения или занимающих другие экологические ниши. Это наблюдение иллюстрируется, во-первых, описанным ранее преобразованием жизненного цикла микроспоридий кулицид при заражении промежуточного хозяина (копепод), во-вторых, изменением строения спор при освоении первоначально пресноводными микроспоридиями второй ветви филогенетического дерева сухопутных хозяев, при котором, в частности, значительно увеличивается толщина эндоспоры как адаптация к выживанию в наземных биотопах.

Другим примером филогенетического преобразования ультраструктуры служит группировка микроспоридий с короткой изофилярной полярной трубкой.

Рисунок 14. Схематическое изображение строения спор ВосШМшт \zesiCuloformis (А; №1$еп, 1999) и Мгагекю тасгосус1ор!$ (6; !$$■ е1 а1., 2010). Стрелка указывает изменение диаметра полярной трубки, характерное для МгагеШа

не свёрнутой в спираль, находящаяся в кроне филогенетического дерева (Рисунок 15). Одна из них, Euplotespora binucleata, паразитирует в инфузориях Euplotes woodrufi (Fokin et al., 2008), и формирование короткой полярной трубки логично рассматривать как адаптацию к заражению одноклеточных хозяев. Ближайшие известные родственники Е. binucleata, а именно Helmichia lacustris и Microsporidium sp. ex Mallochohelea sp., также имеющие короткие полярные трубки, паразитируют во внутренних тканях многоклеточных животных-хозяев -личинках двукрылых. Вполне вероятно, что при переходе от одноклеточных хозяев к многоклеточным укороченная полярная трубка, возникшая на более раннем этапе эволюции, сохраняется как консервативный признак (Грушецкая и др., 2012; Токарев и др., 2013).

I Endoretlculatus schubergl - Vittaforma corneae

о ,«ли1— Microsporidium s р. ex Mallochohelea sp. Д "»да! I— Euplotespora binucleata Д

-Helmichia lacustris Д

■ Críspospora chlronomt

- Anisofilariata chlronomi

Рисунок 15. Филограмма для микроспоридий, обладающих прямой изофилярной полярной трубкой, (отмечены треугольником). Обозначения, как на рисунке 12.

Совместное применение двух подходов - ультраструктурного и молекулярно-филогенетического анализа данных близкородственных видов -позволило сформулировать некоторые положения разрабатываемой нами универсальной системы микроспоридий. В частности, указанные выше особенности строения аппарата экструзии спор и оболочки клеток паразитов позволяют охарактеризовать таксоны на уровне рода и семейства, что вполне соответствует данным молекулярной филогении. К сожалению, применение молекулярных критериев, основанных на секвенировании генов рибосомальной РНК, для идентификации видов выполнено лишь для небольшой доли от общего числа уже известных видов микроспоридий, но ожидается описание ещё множества новых форм. Тем не менее, имеющихся данных вполне достаточно для обоснования пересмотра значимости критериев, применяемых для систематики микроспоридий (Таблица 2). При этом различия между отдельными видами внутри родов с высоким уровнем сходства гаплотипов (выше 98-99%) сводятся к одному-двум признакам; обычно это размерные характеристики спор (на светооптическом уровне) и/или детали тонкого строения оболочки спор, такие как наличие дополнительных слоев или выростов на поверхности экзоспоры (на электронно-микроскопическом уровне). Ультраструктурные отличия у близкородственных видов не всегда удаётся найти, например, Glugea gasterostei и Glugea anómala идентичны в тонком строении спор и их дифференциация основана на размерах спор и характере формирования ксеном в организме хозяина (Воронин, 1974). Молекулярно-генетический анализ в

данном случае служит подтверждением, с одной стороны, высокого уровня родства видов, а с другой стороны, их принадлежности разным видам. Напротив, два вида, отнесённые к роду Schroedera, обладают сходством по данному показателю на уровне 90%. Данные по ультраструктуре спор этих двух паразитов мшанок, имеющиеся в опубликованных работах (Morris, Adams, 2002; Morris et al., 2005a), недостаточны для их анализа и разделения на два рода. Объединение определённых видов микроспоридий рамками одного рода не может быть, таким образом, унифицировано на основе только молекулярных критериев и требует тщательного анализа всего комплекса признаков, часто отсутствующих в работах других авторов (Токарев, 2011).

Таблица 2. Значимость таксономических критериев традиционной и современной систематики микроспоридий применительно к таксонам различного ранга._

ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ РАНГ ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ

ТРАДИЦИОННАЯ СИСТЕМАТИКА СОВРЕМЕННАЯ СИСТЕМАТИКА

вид 1) Морфометрия спор 2) Количественные признаки УС 3) Видовая принадлежность хозяина 1) Сиквенс гена рРНК 2) Морфометрия спор 3) Количественные признаки УС 4) Особенности ЖЦ

РОД 1) Качественные признаки УС 1) Сиквенс гена рРНК 2) Качественные признаки УС

СЕМЕЙСТВО 1) Качественные признаки УС 2) Особенности ЖЦ 1) Сиквенс гена рРНК 2) Качественные признаки УС

ОТРЯД 1) Особенности ЖЦ X

КЛАСС 1) Особенности ЖЦ 1) Сиквенс гена рРНК

Цифры указывают порядок приоритета критериев; УС - ультраструктура, ЖЦ -жизненный цикл, Х-критерии не разработаны.

Предполагается, что в универсальной системе объединение родов в рамках семейств будет основано на сходстве ультраструктуры и филогенетическом родстве видов микроспоридий (Ргапгеп е1 а1., 2006; 1551 е1 а1., 2012а). Деление типа микроспоридий на таксоны более высокого ранга до настоящего времени не проведено, за исключением трёх классов, предложенных на основании первого обобщающего филогенетического анализа, проведённого на относительно небольшой выборке (не более 10% описанных к настоящему времени видов). Это деление, как показывают накопленные с 2005 года данные, носит временный характер и уже требует пересмотра (\Zossbrinck, 0еЬгиппег-\/о55Ьгтск, 2005; Токагеу, 2010). Необходимы дальнейшие исследования для расширения и упорядочения данных, используемых в современной систематике микроспоридий.

Глава 5. Филогения и паразитические свойства микроспоридий

Особенности взаимоотношений паразитов со своими хозяевами определяются такими свойствами паразитов как (1) способность к развитию в определённом круге хозяев (гостальная специфичность), (2) пути заражения хозяина и тканевый тропизм, (3) характер нарушений, вызванных паразитом в различных системах организма хозяина (патогенность) и (4) выживаемость в окружающей среде вне организма хозяина. Взаимоотношения паразита и хозяина претерпевают двусторонние преобразования в процессе как микро- и макроэволюционного развития. Хорошо известна тенденция к сглаживанию антагонизма между паразитом и хозяином в результате их коэволюции и значительно более напряжённый характер взаимоотношений в эволюционно более молодых системах (Догель, 1947). К сожалению, сведения о паразитических свойствах большинства описанных видов микроспоридий носят фрагментарный характер и лишь для некоторых паразито-хозяинных систем выполнены детальные исследования. В частности, привлечение полученных в настоящей работе данных о взаимоотношениях в двух паразито-хозяинных системах, где в качестве паразитов выступают два близкородственных вида, Paranosema locustae и P. grylli, а в качестве хозяев - насекомые из одного отряда (Orthoptera), позволяет оценить выраженность паразитических свойств этих микроспоридий и сравнить их с другими системами с участием неродственных видов микроспоридий.

5.1. Гостальная специфичность микроспоридий

Анализ гостальной специфичности показывает две основные тенденции в эволюции микроспоридий. С одной стороны, паразиты, составляющие ветви I и II, класс Aquasporidia, а также ветвь III, класс Marinosporidia, адаптированы к развитию в хозяевах определённых систематических групп: для Aquasporidia это пресноводные личинки двукрылых (Culicidae, Simulidae, Psychodidae) и/или ракообразные (Cyclopidae, Daphniidae), для Marinosporidia - морские, пресноводные и проходные рыбы, морские (Portunidae, Cancridae) и пресноводные ракообразные (Gammaridae, Talitridae). В каждой из этих трёх ветвей филогенетического дерева паразиты иных хозяев, кроме двукрылых и пресноводных ракообразных, образуют лишь по одной филогенетической линии, состоящей из немногочисленных микроспоридий наземных членистоногих. С другой стороны, микроспоридии, принадлежащие двум другим филогенетическим ветвям, а именно ветви IV, класс Terresporidia, и ветви V, класс Aquasporidia, характеризуются широким кругом хозяев разного систематического положения и занимающих различные экологические ниши (Рисунок 16).

Представители ветви IV заражают животных-хозяев наиболее широкого круга (инфузорий, моллюсков, членистоногих и позвоночных), что связано не только с тем, что в данной группе описано наибольшее число видов, образующих разнообразные филогенетические группировки, но и адаптацией близкородственных паразитов к систематически далёким хозяевам. Например,

Tubulinosema spp. паразитируют в прямокрылых, чешуекрылых, жесткокрылых и двукрылых насекомых (Малыш и др., 2012; Franzen et al., 2005; Issi et al., 2008; Bj0rnson et al., 2011), а один вид, Tubulinosema acridophagus, выявлен как в саранче, так и в двух независимых случаях заболеваний человека на фоне иммуносупрессивного состояния, вызванного ВИЧ-инфекцией (Choudhary et al., 2011; Meissner et al., 2012). Относящиеся к этому же семейству микроспоридии рода Anncaliia демонстрируют не менее широкий круг хозяев, включающий (а) жесткокрылых насекомых, (б) двукрылых насекомых, (в) человека, (г) как двукрылых насекомых (кровососущих комаров), так и человека (Franzen et al., 2006а).

Таким образом, две основные филогенетические группировки микроспоридий (ветви I, II и III, с одной стороны, и остальные ветви, с другой стороны) существенно различаются по степени коэволюционных связей со своими хозяевами. Особенно тесны коэволюционные связи микроспоридий ветви I со своими хозяевами - комарами семейства Culicidae. Микроспоридии, специфичность которых выражена в меньшей степени, оказались способны к смене хозяев не только по систематическому положению, но и по занимаемой экологической нише, за счёт чего стали возможны множественные переходы из одной среды обитания в другую (Tokarev, 2010). Заражение новых видов хозяев происходит, прежде всего, в отношении экологически близких форм, обитающих в одном биотопе или связанных паразито-хозяинными отношениями (перепончатокрылые и двукрылые паразитоиды и их чешуекрылые-хозяева, членистоногие гематофаги и их теплокровные прокормители, эктопаразитические копеподы и рыбы-хозяева). Логично предположить, что способность заражать хозяев разных систематических групп позволила микроспоридиям освоить принципиально новую экологическую группу хозяев - сухопутных животных, а также перейти к паразитизму на теплокровных. Механизмы таких переходов, однако, остаются совершенно невыясненными; рассмотренные выше данные свидетельствуют о том, что процесс перехода с одних хозяев на других динамичен и может происходить в любое время. С одной стороны, это позволяет рассматривать данную группу микроспоридий как потенциальных регуляторов численности и продуцентов микробиологических препаратов, с другой - требует большого внимания к вопросу биологической безопасности микроспоридий, применяемых против вредных членистоногих.

Рисунок 16. Схематическое изображение филогенетических отношений между микроспоридиями, паразитирующими в пресноводных (овал), морских (треугольник) и наземных (прямоугольник) хозяевах. Латинскими цифрами обозначены основные филогенетические ветви (УоБзЬппск, ОеЬгиппег-\/о55Ьппск, 2005). Переходы к паразитизму в хозяевах других экологических групп обозначены дополнительными линиями, отходящими от основных ветвей, где указаны названия (а) родов микроспоридий, (б) неидентифицированных изолятов микроспоридий (МхгозрогШ'шт Брр., впервые описанных в настоящей работе, выделено полужирным шрифтом) или (в) филогенетических группировок паразитов («М ех ...») с указанием основных таксонов их хозяев.

5.2. Тканевый тропизм и пути передачи микроспоридий

Тканевый тропизм микроспоридий весьма разнообразен и определяется многими факторами, и прежде всего систематическим положением хозяина. Так, у позвоночных с развитой системой специфического иммунитета часто поражаются клетки и ткани, исключённые из системы постоянного иммунологического надзора, например, нервная ткань и глаза (Didier, Bessinger, 1999). У беспозвоночных основное значение для развития микроспоридий приобретают ткани, обладающие высокой физиологической активностью: жировое тело, слюнные железы, питающие клетки яичников, кишечник и мышцы. Существенный отпечаток на тканевый тропизм накладывает способ передачи паразитов. При пероральном заражении первым органом - местом контакта паразита и хозяина становится кишечник, при этом для одних видов он служит

основным местом локализации в организме хозяина, а для других - лишь барьером на пути к заражению внутренних тканей. Микроспоридии, заражающие эпителиальные клетки кишечника своих хозяев, принадлежат к 24 родам и за несколькими исключениями на всём протяжении жизненного цикла развиваются в паразитофорной вакуоли, формируемой мембранами ЭР или КГ. Представители 6 родов микроспоридий насекомых и ракообразных - СпэроБрога, Суз^рогодепез, ЕпдогеИси1аЮБ, в!идоШе$, ЕМегозрога и АповКасоБрога, формируют общую филогенетическую группировку в «кроне» филогенетического дерева микроспоридий, ветвь IV, класс ТеггеБропсПа. При этом паразиты, занимающие соседнее к ним положение, заражают другие ткани животных-хозяев. Другие микроспоридии, развивающиеся в эпителиальных клетках кишечника, относятся к различным филогенетическим группам ветвей IV (ЕпсерЬаГЛогооп, ЕМегосуЮгооп, ЦеЬегтапп/а, Ыозета/\/тптогрИа, Огс]оБрога) и II (ОаоБрогеа, Е1аЬеШ/огта) (Рисунок 18).

Enterocytozoon

Liebermannia Nosema/Vairímorpha

Г Flabelliforma lOctosporea

Ordospora Encephalitozoon

"Crispospora Glugoides Endoreticulatus Cystosporogenes Enterospora Anostracospora

Рисунок 17. Схематическое изображение расположения на филогенетическом дереве

микроспоридий,

паразитирующих в клетках кишечника животных хозяев. Обозначения, как на рисунке 16.

Таким образом, освоение определённой ткани животных-хозяев не было единым филогенетическим событием; паразитирование микроспоридий в кишечном эпителии не является плезиоморфным признаком, как предполагалось ранее на основании общих представлений об эволюции паразито-хозяинных отношений (Воронин, 1999). Аналогично, приспособление к трансовариальной передаче возникает в эволюции неоднократно и обеспечивается различными механизмами, от инфицирования микроспоридиями, развивающимися в стенках яичников, яиц в процессе их откладки чешуекрылыми насекомыми (Исси, 1986) до развития микроспоридий исключительно в тканях яичников хозяев - амфипод (Ironside et al., 2003) и моллюсков. Близкородственные формы микроспоридий также существенно различаются по способности к трансовариальной передаче, например, P. locustae заражает яичники, что способствует передаче инфекции потомству, а для P. grylli это не характерно (Селезнёв, 1997; Семёнов и др., 1999; Raina et al., 1995).

5.3. Патогенность микроспоридий

Проявления патогенных свойств микроспоридий крайне разнообразны. В разных паразито-хозяинных системах эффект микроспоридий варьирует от незаметного присутствия до полной дисфункции всех основных систем организма, ведущей к повышенной смертности. Один из важных показателей, косвенно отражающих уровень патогенности микроспоридий - скорость их развития от момента заражения до наступление финальной фазы заболевания. Близкородственные виды рода Paranosema резко различаются по данному признаку - если Р. locustae способна к быстрому развитию, и между заражением и наступлением финального этапа заболевания, сопровождающегося массовым отмиранием заражённых особей, обычно проходит 15-30 дней, то у Р. grylli этот период составляет свыше 60 дней.

Патологические процессы, служащие причиной гибели и снижения численности насекомых при микроспоридиозах, включают (а) дисфункцию клеток, тканей и органов, массово заселённых паразитами, что вызывает отравление организма продуктами метаболизма; (б) истощение энергетических и пластических субстратов (в связи с их потреблением паразитами, а также расходованием на активированные инфекцией репаративные и компенсаторные процессы), особо востребованных в энергоёмкие периоды развития (линька, метаморфоз, овогенез); (в) дисбаланс гормональной системы, спровоцированный изменением активности регулирующих её работу ферментов; (г) иммуносупрессивное воздействие паразитов, ведущее к резкому повышению восприимчивости к негативному воздействию факторов окружающей среды; д) снижение плодовитости, стерилизация и паразитическая кастрация (Исси и др., 2005).

Массовое развитие спор микроспоридий, замещающих собой гипертрофированную заражённую ткань, наблюдается на конечном этапе микроспоридиоза у большинства насекомых, паразиты которых в основном распространяются горизонтальным путём, для успеха которого решающее значение имеет количество инфекционных спор, способных заразить новых особей хозяина (Исси, 1986; Weiser, 1961). Можно лишь предполагать, что истощение энергетических и пластических ресурсов клетки и организма хозяина -универсальное свойство микроспоридий, обусловленное особенностями их метаболизма, полностью зависящего от клетки хозяина. Этот феномен подробно изучен на примере Р. grylli (Aquasporidia) при заражении двупятнистого сверчка (Долгих, 1997; Долгих и др., 2011); данные о резком снижении пластических и энергетических ресурсов в гемолимфе насекомых получены также в отношении комара Aedes aegyptl при заражении Vavraia culicis (Marinosporidia) (Rivero et al., 2007), непарного шелкопряда при заражении Vairimorpha sp. (Hoch et al., 2002) и медоносной пчелы при заражении Nosema ceranae (Terresporidia) (Mayack, Naug, 2010; Aliferis et al., 2012). Важно отметить, что в последнем случае паразит развивается только в эпителии кишечника, то есть истощение ресурсов организма хозяина не обязательно связано с заражением запасающих тканей.

Дисбаланс гормональной системы отмечен у насекомых различных таксонов и имеет самые разнообразные проявления. По современным представлениям, его наступление при микроспоридиозах опосредовано подавлением активности карбоксилэстераз гемолимфы заражённых насекомых, метаболизирующих ювенильный гормон (Ефименко, 1989; Исси, Токарев, 2002; Исси и др., 2005; Karlhofer et al., 2012). Последствия нарушения гормонального баланса насекомых могут иметь как неблагоприятные (в связи со снижением выживаемости заражённых насекомых в критические для паразито-хозяинной системы моменты), так и благоприятные последствия для паразита (например, задержка развития насекомых способствует передаче инфекционного начала следующему поколению алиментарным путём). Способность вызывать гормальнальный дисбаланс насекомых-хозяев обнаружена у филогенетически далёких микроспоридий: представителей родов Vairimorpha и Paranosema (Исси, Токарев, 2002; Karlhofer et al., 2012). Аналогично, снижение активности иммунной системы, опосредованное подавлением ФО гемолимфы, как приспособление к паразитированию в насекомых, обнаружено у микроспоридий родов Vairimorpha и Paranosema (Рисунок 18), при этом способность снижать ФО активность гемоцитов сверчков in vitro различается на порядок у двух видов последнего рода (см. главу 3), будучи выражено сильнее у более патогенного вида - P. locustae. Остаётся неясным, является ли способность к подавлению меланизации заражённых тканей насекомых-хозяев универсальной для энтомопатогенных микроспоридий или независимо возникла у отдельных таксонов, таких как Paranosema и Vairimorpha, однако факт отсутствия реакции меланизации насекомых в ответ на заражение микроспоридиями в большинстве известных паразито-хозяинных систем свидетельствует в пользу первого предположения.

На популяционном уровне паразито-хозяинных отношений о патогенности микроспоридий можно судить по их способности вызывать массовую гибель хозяев. В связи с этим следует отметить, что опустошительные эпизоотии, вызываемые микроспоридиями в популяциях насекомых, регистрируются у чешуекрылых при заражении различными представителями группы Nosema ¡Vairimorpha (Исси, 1980; Wilson, 1970; Franz, Huger, 1971; Solter, McManus, 2003; Lewis, 2009; van Frankenhuyzen et al., 2011). Эти микроспоридии

Рисунок 18. Схематическое изображение расположения на филогенетическом дереве трёх видов микроспоридий, для которых обнаружено свойство подавлять реакцию меланизации гемолимфы насекомых-хозяев (серый ромбик). Обозначения, как на рисунке 16.

' - Vairimorpha ephestiae Q

находятся в кроне филогенетического дерева (класс Terresporidia), что позволяет считать их эволюционно более молодой группировкой, для которой характерна повышенная агрессивность по сравнению с паразитами водных членистоногих (Aquasporidia и Marinosporidia), для которых даже при сильной степени заражения своих хозяев острые летальные заболевания и эпизоотии нехарактерны (Dunn et al., 2001; Andreadis, 2007). По-видимому, коэволюция этих микроспоридий, как эволюционно более древних, со своими хозяевами (особенно у паразитов первой филогенетической ветви, ассоциированных с комарами семейства Culicidae) способствовала стабилизации паразито-хозяинных отношений на популяционном уровне.

5.4. Способность спор микроспоридий к персистированию и активации

Одно из важных свойств спор ряда микроспоридий, а именно способность сохранять инфекционность при высыхании, можно рассматривать как одну из адаптаций к существованию в наземных хозяевах, способствующую накоплению инфекционного материала в окружающей среде. Попадание высушенных спор в водную среду, моделирующую условия кишечника насекомого-хозяина, также вызывает их экструзию. В связи с этим интересно проявление этого признака у микроспоридий рода Paranosema, все виды которого паразитируют в наземных насекомых. Споры P. locustae и P. whitei выдерживают высушивание и способны сохранять инфекционность в этом состоянии на протяжении нескольких лет (по крайней мере, в лабораторных условиях при хранении в отсутствие резких перепадов температуры и влажности). Споры P. grylli, напротив, не выдерживают высушивания и сразу гибнут. Также споры P. locustae способны сохранять инфекционность при хранении в виде водной суспензии при +4°С не менее трёх лет, тогда как споры P. grylli почти полностью утрачивают инфекционность в течение 12 месяцев.

Таким образом, на примере двух близкородственных видов рода Paranosema можно наблюдать существенные различия по целому комплексу признаков, характеризующих их паразитические свойства (Таблица 3). Эти различия логично увязываются с биологическими особенностями насекомых-хозяев - саранчи и сверчков. Популяции саранчовых характеризуются высокой разреженностью (у нестадных видов) либо миграционной активностью (у стадных видов), многие их виды обитают в аридных биотопах. Это требует со стороны паразитов выработки таких приспособлений, обеспечивающих их эффективное распространение, как длительная выживаемость вне организма хозяина в засушливых условиях, способность к трансовариальной передаче и быстрое прохождение жизненного цикла. Сверчки, напротив, предпочитают более влажные биотопы, обитая в подземных норках без склонности к миграциям, что снижает критичность выживания спор микроспоридий в окружающей среде. Длительное развитие микроспоридиоза способствует созреванию большого количества спор паразита на фоне паразитарной кастрации, что с одной стороны, обеспечивает метаболические потребности паразита дополнительными

ресурсами, не расходуемыми на вителлогенез, а с другой - препятствует трансовариальной передаче, которая, впрочем, не столь важна для распространения паразита в данных условиях.

Таблица 3. Сравнение основных паразитических свойств у двух видов микроспоридий - паразитов прямокрылых насекомых (а, по литературным данным; б, по собственным наблюдениям)__

Паразитические свойства Рагапо5вта дгуШ Рагапоьета 1оси$1ае

Круг хозяев (а,б) вГуИиБ Ытаси1а(и5 Свыше 100 видов семейства АспсМае

Заражение яичников (а,б) нет есть

Трансовариальная передача (а,б) нет есть

Патогенность (а,б) низкая высокая

Скорость развития (а,б) низкая высокая

Подавление иммунитета хозяев (б) среднее высокое

Паразитарная кастрация хозяев (а,б) есть Нет

Устойчивость спор к высыханию (а,б) нет Есть

Сохранность спор при +4°С (а,б) до 12 месяцев более трёх лет

В целом, можно заключить, что возникновение и модификация основных признаков, характеризующих паразитические свойства микроспоридий, не закреплены в эволюционной истории этих паразитов и могут быть контрастно представлены у близкородственных форм, а также сходно выражаться у форм филогенетически далёких. Лабильность паразитических свойств - важное свойство паразитов вообще, позволяющее им быстро адаптироваться к изменяющимся условиям среды первого и второго порядков в ходе как индивидуального, так и исторического развития (Бочков и др., 2004; Kaltz, Koella, 2003; Vizoso, Ebert, 2005; Padilla-Vaca, Anaya-Velázquez, 2010; Mideo et al., 2012). Тем не менее, степень коэволюционных связей микроспоридий и их хозяев, определяющая диапазон гостальной специфичности, существенно различается в двух основных филогенетических линиях микроспоридий. Длительный период совместного развития двукрылых насекомых и микроспоридий привёл к формированию тесных коэволюционных связей, а возникновение способности заражать других хозяев стало предпосылкой к освоению новых экологических ниш, что связано, прежде всего, с выходом на сушу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполнения настоящей работы получены новые данные, характеризующие филогенетические отношения и видовое разнообразие микроспоридий и их отношения с насекомыми-хозяевами на клеточном и организменном уровне. Исследования микроспоридий, паразитирующих в членистоногих, показали противоречие между их положением в системах, построенных на морфологических признаках, и степенью родства паразитов в

филогенетической системе. Эти наблюдения соответствуют результатам молекулярно-филогенетических исследований одноклеточных эукариот в целом, показывающих их несоответствие традиционной систематике и таксономии, что объясняется невозможностью выбора адекватных морфологических критериев при работе с одноклеточными организмами на светооптическом уровне. Однако, тщательный анализ позволил выделить ультраструктурные признаки, проявление которых чётко связано с филогенией микроспоридий. Это позволяет снять существующие противоречия между традиционной систематикой и результатами современных исследований и создаёт предпосылки для создания универсальной системы, в которой два основных подхода - ультраструктурный и молекулярный - будут дополнять друг друга.

Общеизвестно, что микроспоридии обладают уникальным способом проникновения, инъецируя содержимое споры непосредственно внутрь клетки хозяина. Эксплуатируя энергетические и синтетические системы клетки хозяина, микроспоридии вызывают патологические изменения в соответствующих органеллах и вступают с ними в тесный контакт, по-видимому, заставляя их работать «на себя». Это касается не только митохондрий и эндоплазматического ретикулюма (что зарегистрировано в отношении широкого круга микроспоридий), но и комплекса Гольджи заражённой клетки, что впервые обнаружено нами (Issi et al., 2012b), а позднее выявлено в независимом исследовании другой паразито-хозяинной системы (Sokolova et al., 2013). Данная органелла не только снабжает паразита продуктами синтеза белка, но и вовлекается в построение паразитофорной вакуоли в виде толстостенной капсулы, заключающей массу спор паразита (Issi et al., 2012b). Выявление тесных контактов между клетками паразита и комплексом Гольджи клетки хозяина не только у Crispospora chironomi из кроны филогенетического дерева (Tokarev et al., 2010), но и у Metchnikovella incurvata, представителя предполагаемой анцестральной группы микроспоридий (Sokolova et al., 2013), указывает на возможность широкого распространения этого феномена среди представителей разных филогенетических группировок этих паразитов, хотя до сих пор других подобных примеров не описано.

Выбрасывание зародыша при выстреливании спор (приводящее к заражению клеток хозяев) позволяет паразитам избежать своего уничтожения при фагоцитозе, а также при инкапсуляции заражённых клеток хозяина. Тем не менее, внутриклеточная локализация стадий развития паразита не исключает возможности активации клеточной системы иммунитета хозяина, а меланизация заражённых тканей ведёт к нарушению процесса созревания спор. Вполне вероятно, что именно это ведёт к возникновению у микроспоридий такой адаптации, как подавление активности проФО каскада, что свойственно микроспоридиям на этапе массового спорогенеза в организме хозяина и наблюдается при контакте зрелых с пор паразита с гемоцитами насекомых in vitro. Это явление показано в независимых паразито-хозяинных системах (Соколова и др., 2000; Лозинская, 2002; Воронцова и др., 2004; Tokarev et al., 2003; Alaux et al.,

2012), что предполагает либо независимость возникновения данной адаптации у микроспоридий к паразитированию в насекомых, либо универсальность данного свойства.

Одним из последствий иммуномодуляции организма насекомых при микроспоридиозе становится изменение чувствительности к заражению другими патогенами, в частности, анаморфными аскомицетами, устойчивость к которым, как известно, во многом зависит от активности проФО каскада (Глупов и др., 2001). Эти результаты можно с определённой долей вероятности экстраполировать и для объяснения феномена снижения резистентности заражённых микроспоридиями насекомых в других паразитарных системах (Исси, Онацкий, 1984; Ефименко, 1989; Hoch et al., 2000; Bauer et al., 1998; Pierce et al., 2001). Таким образом, выраженность иммуносупрессивных свойств паразитов -это не только маркер их вирулентности, но и предиктор характера взаимодействий с другими патогенами в природных популяциях членистоногих.

Анализ всей информации о патогенезе микроспоридиозов насекомых, полученной в рамках настоящей работы и доступной в мировой литературе, позволяет заключить, что возникновение и модификация основных фенотипических признаков, характеризующих паразитические свойства микроспоридий (в частности, способность к иммуносупрессии и индукции гормонального дисбаланса, высокая патогенность, агрессивность и эпизоотологический потенциал, а также выживаемость в окружающей среде) могут быть контрастно представлены у близкородственных форм, а также сходно выражаться у форм филогенетически далёких. Лабильность паразитических свойств - важное свойство паразитов вообще, позволяющее им быстро адаптироваться к изменяющимся условиям среды первого и второго порядков в ходе как индивидуального, так и исторического развития (Бочков и др., 2004; Kaltz, Koella, 2003; Vizoso, Ebert, 2005; Padilla-Vaca, Anaya-Velázquez, 2010; Mideo et al., 2012). Тем не менее, степень коэволюционных связей микроспоридий и их хозяев, определяющая диапазон гостальной специфичности, существенно различается в двух основных филогенетических линиях микроспоридий. Длительный период совместного развития водных членистоногих и микроспоридий класса Aquasporidia привёл к формированию тесных коэволюционных связей, одно из следствий которого - низкий уровень патогенности, проявляющийся, в частности, в том, что эпизоотии, ведущие к снижению численности хозяев, в данных паразито-хозяинных системах практически не наблюдаются. Одна из специфических адаптаций, наблюдаемая у ряда видов микроспоридий первой ветви класса Aquasporidia - сложный гетероксенный жизненный цикл, разрыв которого, по всей вероятности, служит одним из механизмов видообразования, при котором филогенетически родственные, но морфологически несхожие виды паразитов заражают либо комаров, либо ракообразных.

Возникновение способности заражать других хозяев стало предпосылкой к освоению новых экологических ниш, что связано, прежде всего, с выходом на

сушу (что всегда сопровождалось утратой гетероксенного жизненного цикла, так как ни у одной микроспоридии из наземных животных промежуточных хозяев не выявлено). Одним из последствий этого направления эволюции стала способность заражать теплокровных хозяев, и в частности, человека, с возникновением специализированных видов, способных вызывать заболевания у людей как с ослабленным иммунитетом, так и здоровых. Сохранение способности заражать кровососущих насекомых, по-видимому, определяет трансмиссивный потенциал микроспоридий человека (Weidner et al., 2001), кроме того, широкий круг хозяев, включающий человека, возможен и для микроспоридий, которые считаются типичными паразитами насекомых-фитофагов, в частности, Tubulinosema acridophagus из саранчовых (Choudhary et al., 2011; Meissner et al., 2012).

Дальнейшие перспективы разработки данной темы могут заключаться в совершенствовании методов и подходов (а) диагностики, идентификации и систематики микроспоридий, (б) учёта, прогноза и контроля численности вредных насекомых, (в) профилактики заболеваний полезных насекомых, (г) оценке биологической безопасности энтомопатогенных микроспоридий для теплокровных, включая человека.

ВЫВОДЫ

1) Проведённые исследования подтвердили, что для насекомых как в природных экосистемах, так и в агроценозах характерны широкое распространение и высокое разнообразие заражающих их микроспоридий из всех основных филогенетических группировок.

2) Патологическое воздействие, оказываемое микроспоридиями на клетки насекомых-хозяев, проявляется в увеличении количества и в структурных изменениях митохондрий, контактирующих с клетками паразитов, а также в их окружении мембранами эндоплазматического ретикулюма или комплекса Гольджи, что служит основой для формирования паразитофорной вакуоли.

3) Развитие микроспоридий в клетках насекомых-хозяев может вызывать адгезию свободно-циркулирующих гемоцитов к заражённым клеткам с последующей инкапсуляцией и меланизацией. Заметное на организменном уровне проявление этих реакций отмечается крайне редко, и главным образом для паразитов, вызывающих хронические инфекции, а также при заражении ими высокоустойчивых или несвойственных хозяев.

4) Возникновение очагов меланизации в заражённых тканях насекомых оказывает цитотоксический эффект на развитие микроспоридий, приводя к шести-десятикратному увеличению доли аберрантных спор (тератоспор).

5) При адаптации к паразитизму в насекомых микроспоридии приобрели способность подавлять защитные реакции иммунной системы хозяев, опосредуемые профенолоксидазным каскадом; у более патогенных и агрессивных видов это свойство выражено сильнее.

6) Вмешательство микроспоридий в физиологические процессы организма насекомых-хозяев, и в частности, иммуносупрессивное воздействие, вызывает повышение чувствительности последних к другим патогенам, отрицательные последствия которого наиболее сильно выражены на этапе массового спорогенеза микроспоридий.

7) Противоречия между традиционными таксономическими системами микроспоридий, а также их несоответствие данным молекулярной филогении, объясняются тем, что для макросистематики этих паразитов в качестве основных критериев привлекались признаки, характеризующиеся высокой лабильностью, что свидетельствует о необходимости пересмотра их значимости и выбора новых критериев.

8) Особенности тонкого строения органелл паразита, ответственных за заражение клеток хозяев (аппарат экструзии спор) и формирование зоны контакта клеток паразита и хозяина (оболочка клеток паразита), могут быть положены в основу разграничения таксонов ранга рода и семейства в систематике микроспоридий, будучи более консервативными, чем особенности жизненных циклов, которые, в свою очередь, являются лабильными, резко изменяясь у близкородственных форм, и могут быть использованы только как таксономический критерий на видовом уровне.

9) Перестройки жизненных циклов микроспоридий могут осуществляться путём а) усложнения простых жизненных циклов, сопровождающегося морфогенетическим усложнением спор, образующихся в одной из спорогоний, с формированием сложного гомоксенного жизненного цикла; б) разделения функций между различными морфотипами спор с преобразованием гомоксенного цикла в гетероксенный и в) разрыва гетероксенных жизненных циклов с расхождением филогенетически близких, но морфологически несходных форм паразитов в неродственных хозяевах.

10) Переход к паразитированию в наземных животных происходил в эволюции микроспоридий неоднократно; необходимыми условиями для выживания в наземных биотопах стало расширение круга потенциальных хозяев, включая млекопитающих, и приобретение способности к разнообразным способам передачи инфекционного начала.

11) Основные паразитические свойства микроспоридий, определяющие особенности их взаимодействий с насекомыми-хозяевами, могут быть контрастно представлены у близкородственных видов, что вызвано их адаптацией к хозяевам с разными биологическими и экологическими особенностями.

12) Высокий уровень видового разнообразия и широкое распространение микроспоридий у насекомых, требуют применения методов генотипирования для диагностики и идентификации этих паразитов, в том числе из-за встречаемости в популяциях насекомых одного вида нескольких видов микроспоридий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) При работе с энтомопатогенными микроспоридиями следует оценивать их филогенетическое положение по отношению к известным формам, поскольку принадлежность к определённым филогенетическим группировкам характеризует уровень гостальной специфичности паразитов, применяемых для снижения численности членистоногих, и их потенциальную опасность для человека.

2) Для эффективной диагностики заражённости членистоногих микроспоридиями следует использовать световую микроскопию с применением флюорохрома ДАФИ в сочетании с молекулярной диагностикой на основе ПЦР.

3) При разработке биологических препаратов на основе энтомопатогенных микроспоридий следует определять иммуносупрессивные свойства паразитов для прогнозирования их возможных взаимодействий с другими средствами снижения численности вредителей в системах интегрированной защиты растений.

Список публикаций автора по теме диссертации Публикации в журналах из перечня ВАК

1. Соколова, Ю.Я. Морфофункциональный анализ гемоцитов сверчка Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae) в норме и при остром микроспоридиозе, вызываемом Nosema grylli/Ю.Я. Соколова, Ю.С. Токарев, Я.Л. Лозинская, В.В. Глупов // Паразитология. — 2000. — Т. 32. — С. 408-419.

2. Nassonova, E.S. Phagocytosis of Nosema grylli (Microsporida, Nosematidae) spores in vivo and in vitro / E.S. Nassonova, Y.S. Tokarev, T. Trammer, R. Entzeroth, Y.Y. Sokolova //J. Euk. Microbiol. — 2001. — V. 49. — P. 83S-84S.

3. Tokarev, Y.S. Short-term in vitro cultivation of Gryllus bimaculatus (Orthoptera: Gryllidae) haemocytes / Y.S. Tokarev, E.S. Nassonova, R. Entzeroth //Tsitologiya. — 2001.—V. 43.— P. 896.

4. Исси, И.В. Влияние микроспоридий на гормональный баланс насекомых / И.В. Исси, Ю.С. Токарев // Паразитология. — 2002. — Т. 36. — С. 405-421.

5. Воронцова, Я.Л. Микроспоридиоз пчелиной огнёвки Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae), вызываемый Vairimorpha ephestiae (Microsporia: Burenellidae) / Я.Л. Воронцова, Ю.С. Токарев, Ю.Я. Соколова, В.В. Глупов // Паразитология. — 2004. — Т. 38, вып. 3. — С. 239-250.

6. Токарев, Ю.С. Первая находка микроспоридий в иксодовых клещах Ixodes ricinus L. (Acariña: Ixodidae) на территории СНГ, Республика Молдова / Ю.С. Токарев, A.A. Мовилэ // Паразитология. — 2004. — Т. 38, вып. 6. — С. 552-556.

7. Исси, И.В. Факторы патогенности микроспоридий - внутриклеточных паразитов насекомых / И.В. Исси, В.В. Долгих, Ю.Я Соколова, Ю.С. Токарев // Вестник сельскохозяйственной науки. — 2005. — № 3. — С. 17-26.

8. Nassonova, Е. On the species concept for Microsporidia: Paranosema grylli and Paranosema locustae are closely related but yet distinct species / E. Nassonova, V.

Dolgikh, Y. Tokarev, E. Cornillor, G. Metenier, C.P. Vivares, Y. Sokolova, I. Issi 11 Folia parasitologies. — 2005. — V. 52. — P. 8A.

9. Sokolova, Y.Y. Ultrastructural analysis supports transferring Nosema whitei Weiser 1953 to the genus Paranosema and creation a new combination, Paranosema whitei / Y.Y. Sokolova, I.V. Issi, E.V. Morzhina, Y.S. Tokarev, C.R. Vossbrink // J. Invertebr. Pathol. — 2005a. - V. 90. - P. 122-126.

10.Tokarev, Y.S. Cellular immune reactions of orthopteran insect host to microsporidia / Y.S. Tokarev, Y.Y. Sokolova // Folia Parasitol. — 2005. — V. 52. — P. 12-13A.

11.Tokarev, Y.S. Establishment of a primary culture of haemocytes isolated from Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae) and their interactions with two intracellular parasites: Paranosema grylli (Microsporidia) and Adelina grylli (Coccidia) / Y.S. Tokarev, Y.Y. Sokolova, R. Entzeroth // Tsytologiya. — 2005. — V. 47. — P. 478-486.

12.Kopecna, J. Phylogenetic analysis of coccidian parasites from invertebrates: search for missing links / J. Kopecna, M. Jirku, M. Obornik, Y.S. Tokarev, J. Lukes, D., Modry// Protist. - 2006. - V. 157. - P. 173-183.

13.Безнусенко, Г.В. Сравнительный анализ ультраструктурных изменений комплекса Гольджи, индуцированных действием фторида алюминия и NEM в клетках млекопитающих, насекомых и в микроспориях / Г.В. Безнусенко, И.С. Сесорова, В.В. Долгих, Е.В. Моржина, Ю.С. Токарев // Морфология. — 2006. — Т. 129, № 4. — С. 21-22.

14.Токарев, Ю.С. Значение микроспоридий для микробиологического контроля численности вредных членистоногих / Ю.С. Токарев, Ю.М. Малыш, Е.В. Дубинина, А.Н. Алексеев, А.Н. Фролов, И.В. Исси // Защита и карантин растений. — 2007а. — №12. — С. 14-16.

15.Beznoussenko, G.V. Analogs of the Golgi complex in microsporidia: structure and avesicular mechanisms of function / G.V. Beznoussenko, V.V. Dolgikh, E.V. Morzhina, P.B. Semenov, Y.S. Tokarev et al. // J. Cell Sci. — 2007. — V. 120. — P. 1288-1298.

16.Tokarev, Y.S. Microsporidia-insect host interactions: teratoid sporogony at the sites of host tissue melanization / Y.S. Tokarev, Y.Y. Sokolova, R. Entzeroth // J. Invertebr. Pathol. — 2007c. — V. 94. — P. 70-73.

17.Фролов, А.Н. Особенности биологии лугового мотылька (Pyrausta sticticalis L.) в период его низкой численности в Краснодарском крае / А.Н. Фролов, Ю.М. Малыш, Ю.С. Токарев // Энтомологическое обозрение. — 2008. — Т. 87, вып. 2. — С. 291-302.

18.Issi, I.V. Specified ultrastructural data on Tubulinosema maroccanus comb. nov. {Nosema maroccanus Krilova et Nurzhanov 1987) (Microsporidia) from the Moroccan locust Dociostaurus maroccanus (Orthoptera) / I.V. Issi, Y.S. Tokarev, E.V. Seliverstova, E.S. Nassonova // Acta Protozool. — 2008. — V. 47. — P. 125133.

19.Simakova, A.V. Pankovaia semitubulata gen. et sp. n. (Microsporidia: Tuzetiidae) from nymphs of mayflies Cloeon dipterum L. (Insecta: Ephemeroptera) in Western

Siberia / A.V. Simakova, Y.S. Tokarev, I.V. Issi // Eur. J. Protistol. — 2009. — V. 45.

— P. 13-20.

20.Игнатьева, A.H. Видовое разнообразие возбудителей нозематоза медоносной пчелы / А.Н. Игнатьева, Ю.С. Токарев, З.Я. Зинатуллина // Изв. СПбГАУ. — 2010. — № 20. — С. 61-64.

21.Токарев, Ю.С. Молекулярная диагностика нозематоза / Ю.С. Токарев, А.Н. Игнатьева, З.Я. Зинатуллина // Пчеловодство. — 2010. — № 5. — С. 18-19.

22.Фролов, А.Н. Луговой мотылек: цикличность многолетней динамики численности / А.Н. Фролов, М.И. Саулич, Ю.М. Малыш, Ю.С. Токарев//Защита и карантин растений. — 2010. — № 2. — С. 49-54.

23.Issi, I.V. Ultrastructure and molecular phylogeny of Mrazekla macrocyclopis sp.n. (Microsporidia, Mrazekiidae), a microsporidian parasite of Macrocyclops albidus (Jur.) (Crustacea, Copepoda) / I.V. Issi, Y.S. Tokarev, V.N. Voronin, E.V. Seliverstova, О .A. Pavlova, V.V. Dolgikh // Acta Protozool. — 2010. — V. 49. — P. 75-84.

24.Pélissié, В. Did the introduction of maize into Europe provide enemy-free space to O. nubilalis? - parasitism differences between two sibling species of the genus Ostrinia / B. Pélissié, S. Ponsard, Y.S. Tokarev, Ph. Audiot, C. Pélissier, R. Sabatler, S. Meusnier, J. Chaufaux, M. Délos, E. Campan, J.M. Malysh, A.N. Frolov, D. Bourguet // J. Evo I. Biol. - 2010. - V. 23. - P. 350-361.

25.Tokarev, Y.S. Molecular phylogeny of entomopathogenic microsporidia, a review of the last five years of study / Y.S. Tokarev // Euroasian Entomol. J. — 2010. — V. 9.

— P. 571-576.

26.Tokarev, Y.S. Ultrastructure and molecular phylogeny of Anisofilariata chironomi sp.n. g.n. (Microsporidia: Terresporidia), a microsporidian parasite of Chironomus plumosus L. (Díptera: Chironomidae) /Y.S. Tokarev, V.N. Voronin, E.V. Seliverstova, V.V. Dolgikh, O.A. Pavlova, A.N. Ignatieva, I.V. Issi // Parasitol. Res. — 2010. — V. 107. — P. 39-46.

27.Tokarev, Y.S. Life cycle, ultrastructure and molecular phylogeny of Crispospora chironomi g.n. sp.n. (Microsporidia: Terresporidia), a microsporidian parasite of Chironomus plumosus L. (Díptera: Chironomidae) / Y.S. Tokarev, V.N. Voronin, E.V. Seliverstova, O.A. Pavlova, I.V Issi ¡I Parasitol. Res. — 2010. — V. 107. — P. 13811389.

28.Зинатуллина, З.Я. «Азиатский» нозематоз в России / З.Я. Зинатуллина, А.Н. Игнатьева, О.Н. Жигилева, Ю.С. Токарев // Пчеловодство. — 2011. — № 10. — С. 24-26.

29.Исси, И.В. Можно ли называть спору микроспоридий покоящейся стадией? / И.В. Исси, В.В. Долгих, Ю.С. Токарев // Паразитология. — 2011. — Т. 45, вып. 4.

— С. 324-337.

30.Малыш, Ю.М. Заражённость микроспоридиями стеблевых мотыльков рода Ostrinia (Lepidoptera: Crambidae) в Краснодарском крае / Ю.М. Малыш, Ю.С. Токарев, Н.В. Ситникова, А.Г. Конончук, Т.А. Грушецкая, А.Н. Фролов // Паразитология. — 2011. — Т. 45, вып. 3. — С. 234-244.

31.Tokarev, Y.S. Interactions of two insect pathogens, Paranosema locustae (Protista: Microsporidia) and Metarhizium acridum (Fungi: Hypocreales), during a mixed infection of Locusta migratoria (Insecta: Orthoptera) nymphs / Y.S. Tokarev, M.V. Levchenko, A.M. Naumov, I.V. Senderskiy, G.R. Lednev // J. Invertebr. Pathol. —

2011. — V. 106. — P. 336-338.

32.Токарев, Ю.С. Особенности окрашивания спор энтомопатогенных микроспоридий диамидинфенилиндолом / Ю.С. Токарев, Ю.М. Малыш, Ю.А. Захарова, Н.В. Мунтяну, И.К. Тодераш, А.Н. Фролов // Паразитология. — 2012. - Т. 46. - С. 139-153.

33.Frolov, A.N. "From Russia with lobe": genetic differentiation in trilobed uncus Ostrinia spp. follows food plant, not hairy legs / A.N. Frolov, P. Audiot, D. Bourguet, A.G. Kononchuk, J.M. Malysh, S. Ponsard, R. Streiff, Y.S. Tokarev // Heredity. —

2012. — V. 108. — P. 147-156.

34.lssi, I.V. Taxonomy of Neoperezia chironomi and Neoperezia semenovaiae comb, nov. (Microsporidia, Aquasporidia): lessons from ultrastructure and ribosomal DNA sequence data / I.V. Issi, Y.S. Tokarev, E.V. Seliverstova, V.N. Voronin // Eur. J. Protistol. — 2012a. — V. 48. — P. 17-29. 35.Issi, I.V. The parasite-host interface between Crispospora chironomi (Microsporidia, Terresporidia) and Chironomus plumosus (Diptera, Chironomidae) enterocytes / I.V. Issi, Y.S. Tokarev, E.V. Seliverstova, V.N. Voronin // Euroasian Entomol. J. — 2012b. - V. 11. - P. 795-400.

36.Tokarev, Y.S. Ultrastructure and molecular phylogenetics of Helmichia lacustris, a microsporidium with an uncoiled isofilar polar filament / Y.S. Tokarev, V.N. Voronin, E.V. Seliverstova, T.A. Grushetskaya, I.V. Issi // Parasitol. Res. — 2012. — V. 110. — P. 1201-1208.

Статьи в других периодических изданиях и сборниках

37.Токарев, Ю.С. Применение флюоресцентной микроскопии для диагностики энтомопатогенных протистов / Ю.С. Токарев, К.В. Владимиров, Р.И. Аль-Шехадат // РЭТ-Инфо. — 2004. — № 49. — С. 54.

38.Simakova, A.V. New genus of microsporidia Senoma gen. n. with type species Senoma globulifera comb. n. (syn. Issia globulifera Issi, Pankova, 1983) from malaria mosquito Anopheles messae Fall. / A.V. Simakova, T.F. Pankova, Y.S. Tokarev, I.V. Issi I I Protistology. — 2005. — V. 4. — P. 134-145.

39.Poddubnaya, L.G. A new microsporidium Paratuzetia kupermani gen. et sp. n. (Microsporidia) - a hyperparasite of the procercoid of the cestode Khawia armeniaca Choi. 1915 (Cestoda: Caryophyllidea) / L.G. Poddubnaya, Y.S. Tokarev, I.V. Issi // Protistology. — 2006. — V. 4. — P. 269-277.

40.Malysh, Yu.M. Dynamics of microsporidian infection in the populations of harmful arthropods / Yu.M. Malysh, Y.S. Tokarev // Protistology. — 2007. — V. 5. — P. 52.

41.Tokarev, Yu.S. Diagnosis of microsporidian infections in arthropod hosts / Yu.S. Tokarev, Yu.M. Malysh, N.V. Munteanu, Yu.A. Fefelova, I.V. Senderskii // Protistology. — 2007a. — V. 5. — P. 79-80.

42.Tokarev, Yu.S. Microsporidian infection in a natural population of Ixodes persulcatus Schulze (Acarina: Ixodidae) in north-western Russia / Yu.S. Tokarev, I.K. Toderas, H.V. Dubinina, A.N. Alekseev, A.A. Movila // Buletinul Academiei de Stiinte a Moldovei. Stiintele Vietii. Chisinau. — 2007b. — V. 302. — P. 69-75.

43.Игнатьева, A.H. Молекулярная диагностика микроспоридии Nosema sp. (Microsporidia, Nosematidae) - паразита медоносной пчелы Apis mellifera L. / A.H. Игнатьева, Ю.С. Токарев, П.С. Горбунов 11 Науч. тр. каф. зоол. РГПУ, СПб.

- 2008. - Т. 8, - С. 50-54.

44.Malysh, J.M. Beet webworm Pyrausta sticticalis L. during the period of its low density / J.M. Malysh, Y.S. Tokarev, A.N. Frolov // Ent. Tidskr. — 2008b. — V. 129.

- P. 217.

45.Lednev, G.R. Virulence of new strains of entomopathogenic hyphomycetes to Leptinotarsa decemlineata Say. / G.R. Lednev, M.V. Levchenko, E.Ch. Yakimenok, L.L. Novokhatskaya, Y.S. Tokarev 11 Ent. Tidskr. — 2008. — V. 129. — P. 230.

46.Токарев, Ю.С. Современные методы диагностики микроспоридий насекомых на примере лугового мотылька Pyrausta (=Loxostege) sticticalis L. / Ю.С. Токарев, Ю.М. Малыш, А.Н. Фролов // Высокопроизводительные и высокоточные технологии и методы фитосанитарного мониторинга. — СПб, ООО «ИЦЗР». — 2009. — С. 20-23.

47.Токарев, Ю.С. Методика диагностики вируса ядерного полиэдроза кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis Hbn (Lepidoptera, Pyralidae) на основе ПЦР / Ю.С. Токарев, А.Г. Дубровина, Ю.М. Малыш, В.Б. Митрофанов, А.Н. Фролов // Высокопроизводительные и высокоточные технологии и методы фитосанитарного мониторинга. — СПб, ООО «ИЦЗР». — 2009. — С. 24-27.

48.Фролов, А.Н. К вопросу о периодичности массовых размножений лугового мотылька (Pyrausta sticticalis L.) / А.Н. Фролов, Луо Личжи, Ю.М. Малыш, Хуан Шаоже, Ю.С. Токарев, Дзян Шиньфу // Тр. Ставропольск. отд. Русского энтомол. об-ва. — 2009. — Вып. 5. — С. 242-248.

49.Tokarev, Y. Microsporidia PCR detection artifacts due to non-specific binding of the universal microsporidia primers to the rDNA of arthropod hosts / Y. Tokarev, N. Sitnikova, D. Pistone, Lizhi Luo, Huang Shaozhe, A. Ignatieva, I. Senderskiy, I. Toderas, A. Frolov// Buletinul ASM. Stiintele Vietii. — 2010. — V. 310. — P. 72-77.

50.Токарев, Ю.С. Современные подходы к диагностике энтомопатогенов при работе с имаго чешуекрылых насекомых / Ю.С. Токарев, Ю.М. Малыш, А.Н. Фролов // Методы фитосанитарного мониторинга и прогноза. Спб.: ООО «Инновационный центр защиты растений». — 2012. — С. 15-21.

Подписано к печати 23 сентября 2013 г. Формат 21x14,85 (А5) Печать трафаретная. 2,0 усл. печ. л.

Тираж 100 экз. Договор № 14 от 24 сентября 2013 г. Отпечатано с оригинал-макета заказчика в ООО "ОНИКС", 198216, Спб, бульвар Новаторов, д. 13, лит. А, пом. 104.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Токарев, Юрий Сергеевич, Санкт-Петербург

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии

сельскохозяйственных наук

На правах рукописи

05201450282

ТОКАРЕВ Юрий Сергеевич

ФИЛОГЕНИЯ И ПАРАЗИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ

МИКРОСПОРИДИЙ

03.02.05 - энтомология 03.02.11 - паразитология

Диссертационная работа на соискание степени доктора биологических наук

Научный консультант: д.б.н., проф. И.В. Исси

Санкт-Петербург, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение..........................................................................................................................................................3

Глава 1. Современные представления о микроспоридиях (обзор литературы)............................12

1.1. Положение микроспоридий в системе эукариот....................................................................14

1.2. Микроспоридии как паразиты членистоногих........................................................................20

1.3. Практическое значение микроспоридий....................................................................................25

1.4. Проблемы безопасности микроспоридий членистоногих для человека..........................33

Глава 2. Методические подходы...............................................................................................................36

2.1. Материалы и методы исследований........................................................................................36

2.2. Культивирование гемоцитов двупятнистого сверчка in vitro...........................................50

2.3. Совершенствование методов диагностики энтомопатогенных микроспоридий......60

2.4. Лабораторные модели микроспоридиозов прямокрылых насекомых..............................80

Глава 3. Взаимодействие микроспоридий с защитными системами насекомых-хозяев на клеточном и организменном уровнях.....................................................................................................89

3.1. Особенности формирования пограничной зоны между клетками паразита и хозяина............................................................................................................................................................

3.2. Взаимодействие микроспоридий с системой иммунитета насекомых-хозяев............103

Глава 4. Молекулярная филогения и систематика микроспоридий.................................................140

4.1. Филогенетическая система микроспоридий: новые данные..............................................143

4.2. Морфологические преобразования в филогенезе микроспоридий.................................... 159

4.3. Значение молекулярных критериев в систематике микроспоридий...............................178

Глава 5. Филогения и паразитические свойства микроспоридий.....................................................183

5.1. Гостальная специфичность микроспоридий............................................................................184

5.2. Тканевый тропизм и пути передачи микроспоридий............................................................188

5.3. Патогенность микроспоридий....................................................................................................194

5.4. Способность спор микроспоридий к персистированию и активации..............................198

Заключение.....................................................................................................................................................203

Выводы.............................................................................................................................................................207

Практические рекомендации.....................................................................................................................209

Список сокращений и условных обозначений.......................................................................................210

Словарь терминов.........................................................................................................................................211

Список использованной литературы........................................................................................................213

Список иллюстративного материала.........................................................................................................245

Приложение I. Таблицы...............................................................................................................................253

Приложение II. Описания таксонов микроспоридий............................................................................256

-3-ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Микроспоридии - облигатные внутриклеточные паразиты, интерес к которым в последнее время всё более возрастает. Это уникальный тип утративших митохондрии протистов (Исси, Воронин, 2007), родственных грибам (Keeling, McFadden, 1998; Соколова, 2009; Capella-Gutierrez et al., 2012). Микроспоридии паразитируют в многоклеточных животных всех крупных таксонов (ранга класса и выше), включая человека, а также в некоторых протистах (грегаринах, инфузориях), при этом наибольшее число видов описано в членистоногих (Wittner, 1999). Многие виды микроспоридий насекомых, особенно способных к массовым размножениям, высоко патогенны и вызывают заболевания, микроспоридиозы, существенно влияющие на животных-хозяев на клеточном, организменном и популяционном уровнях, что определяет их большое практическое значение. Теоретический интерес представляет то, что микроспоридии характеризуются предельно допустимой для эукариот минимизацией клетки и генома и максимальным возложением многих своих функций на клетку хозяина (Katinka et al., 2001; Keeling, Fast, 2002; Dolgikh et al., 2011), что и представляет основу их патогенного воздействия на хозяина. Способ проникновения паразита в клетку хозяина и характер эксплуатации её обменных процессов уникальны для внутриклеточных паразитов (Исси, 1986; Долгих и др., 1996, 2010; Cuomo et al., 2012), а проявления патогенных свойств на клеточном, организменном и популяционном уровнях максимально разнообразны в различных паразитарных системах. В зависимости от уровня численности популяции своего хозяина и условий окружающей среды проявление микроспоридиозов варьирует от минимального влияния на популяции хозяев до опустошительных эпизоотий, способных подавлять вспышки массового размножения вредных насекомых или уничтожать культуры искусственно

разводимых насекомых (Weiser, 1961). Поэтому многие микроспоридии рассматриваются как важный фактор динамики численности и как основа микробиологических препаратов для борьбы с насекомыми - вредителями сельского и лесного хозяйства (Исси, 1986; Исси, Токарев, 2012; Токарев и др., 2007; Solter et al., 2009; van Frankenhuyzen et al., 2011), а также с кровососущими переносчиками возбудителей заболеваний теплокровных животных (Andreadis, 2007). Некоторые виды микроспоридий, паразитирующие в членистоногих, имеют ветеринарное и медицинское значение, так как способны заражать позвоночных (Ribeiro, Guimaraes, 1998; Nylund et al., 2010), включая человека (Koudela et al., 2001; Choudhary et al., 2011; Meissner et al., 2012), или демонстрируют высокую степень родства (на уровне представителей одного рода) с микроспоридиями человека (Franzen et al., 2006b; Lange et al., 2010). При этом биологическое разнообразие микроспоридий всё ещё мало изучено и при мониторинге природных популяций различных, даже хорошо изученных, животных обнаруживается всё больше новых видов данных паразитов (Stentiford et al., 2010; Tokarev, 2010; Tokarev et al., 2010bc; Ardila-Garcia, Fast, 2012; Jones et al., 2012; Andreadis et al., 2013; Rode et al., 2013).

Представления о методах систематизации видового разнообразия микроспоридий в последнее время претерпели существенные изменения после обнаружения несоответствия традиционного таксономического деления и данных о филогенетических отношениях этих паразитов, полученных молекулярно-генетическими методами (Baker et al., 1997; Vossbrinck, Debrunner-Vossbrinck, 2005; Tokarev et al., 2012). В результате, с одной стороны, классические системы оказались устаревшими, а критерии для новой систематики, соответствующие современным представлениям о филогенетическом подходе в таксономии, не разработаны. Отсутствие единой универсальной системы затрудняет дальнейшие исследования в области диагностики, идентификации и анализа биологических свойств микроспоридий.

Как указано выше, паразито-хозяинные отношения микроспоридий и животных сложны и разнообразны. В научных работах прежде всего зафиксированы различные неблагоприятные последствия заражения микроспоридиями для животных-хозяев (Гробов и др., 1983; Исси, 1986; Долгих, 1997; Weiser, 1961; Becnel, Andeadis, 1999; Didier, Bessinger, 1999; Wittner, 1999). В то же время, известны случаи, когда микроспоридиозы не приносят существенного вреда при заражении своих хозяев, а отрицательные эффекты, очевидные на организменном уровне, нивелируются на популяционном (Whittington, Winston, 2003), как характерно многим паразитам. Особенности паразито-хозяинных отношений детально изучены на нескольких примерах систем микроспоридии-членистоногие, однако роль одного из ключевых факторов, определяющих характер их взаимодействий, а именно системы иммунитета хозяев, остаётся практически не исследованной. Вторгаясь в организм хозяина, микроспоридии должны преодолеть его защитные барьеры для успешного заражения и дальнейшего развития. Очевидно, что внутриклеточная локализация позволяет избежать паразитам непосредственного контакта с клетками гемолимфы, осуществляющими иммунологический надзор за состоянием внутренней среды организма (Beverley, 1996), однако о том, что происходит с иммуногенетической системой на начальном этапе заражения, когда паразит только проникает в организм хозяина, а также в конце цикла спорогенеза, когда заражённые клетки разрушаются, и споры паразитов выходят в полость тела для заражения новых клеток и тканей хозяина, практически ничего не известно (Weiser, 1961; David, Weiser, 1994).

Изучение жизненных циклов, морфологии, ультраструктуры и основных свойств, определяющих адаптации микроспоридий к паразитизму в своих хозяевах, в сочетании с современными методами молекулярно-биологического анализа необходимо для определения вида и его положения в филогенетической системе, для понимания путей эволюции микроспоридий и экологических связей

между различными филогенетическими группировками этих паразитов, для дальнейшего усовершенствования современных подходов к диагностике, идентификации и таксономии паразитов, а также для оценки эффективности и опасности заражения для человека микроспоридиями, перспективными в защите растений.

Цель и задачи

В связи с изложенным выше, основная цель работы - изучить особенности взаимодействий, обеспечивающих устойчивость функционирования паразито-хозяинных систем микроспоридии-членистоногие, и проследить характер изменений этих взаимоотношений в филогенезе этих паразитов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

(1) определить филогенетическое положение изучаемых видов микроспоридий и оценить значение молекулярных и морфологических признаков в качестве критериев универсальной таксономической системы;

(2) проанализировать взаимоотношения микроспоридий с защитными системами различных насекомых-хозяев на клеточном и организменном уровнях;

(3) выявить взаимосвязь филогенетического положения микроспоридий с их паразитическими свойствами (гостальная специфичность, тканевый тропизм, патогенность, пути передачи и выживаемость в окружающей среде).

Научная новизна

Впервые использован филогенетический подход к анализу комплекса свойств микроспоридий, определяющих их способность к паразитизму в членистоногих, что позволило выявить закономерности эволюционных преобразований при адаптации микроспоридий к паразитизму в этих хозяевах.

Описаны новые таксоны микроспоридий, в том числе 4 новых рода и 2 новых вида; изменено родовое положение 4 видов, описанных ранее. Для 25 описанных ранее или новых изолятов микроспоридий получены уникальные гаплотипы гена рибосомальной РНК (рРНК), анализ которых позволил установить их филогенетическое и систематическое положение. Сочетание ультраструктурного и молекулярного подходов к таксономии микроспоридий позволило пересмотреть значимость ранее использованных таксономических критериев, а также предложить новые критерии с учётом филогенетических отношений видов, для создания универсальной системы микроспоридий. Получены новые данные, подтверждающие, что особенности жизненных циклов микроспоридий представляют собой лабильную адаптивную функцию паразитов; впервые предложено использовать их не для макросистематики, а для дифференциации таксонов видового уровня.

Впервые создана система культивирования in vitro гемоцитов сверчков и показана способность микроспоридий подавлять реакцию меланизации и активность фенолоксидазной системы насекомых-хозяев как in vivo, так и in vitro.

Систематизированы данные об особенностях биологических свойств микроспоридий, обеспечивающих их успешную адаптацию к различным хозяевам. Проведено сравнение степени проявления этих свойств у филогенетически близких и далёких видов паразитов. Показаны возможные пути эволюции микроспоридий при адаптации к водным и наземным хозяевам, в частности, неоднократность выходов этих паразитов на сушу и вторичное освоение пресноводных хозяев микроспоридиями отдельных филогенетических линий.

Методология и методы исследования

Для анализа особенностей паразитизма микроспоридий, заражающих членистоногих и других животных, использованы методы сбора материала в природных условиях и культивирования насекомых в условиях лаборатории, биотестов на инфекционность энтомопатогенов, световой и электронной микроскопии, гистохимического выявления ферментативной активности, культивирования клеток in vitro, экстракции, амплификации, клонирования и секвенирования ДНК, биоинформационного и статистического анализа. В ходе проведения работ накоплен большой фактический материал, позволивший усовершенствовать методы диагностики микроспоридий и адаптировать их к изучаемым объектам, а также разработать оригинальные методики стандартизации насекомых на различных этапах микроспоридиоза и моделирования микс-инфекций, а также оригинальную модель культивирования гемоцитов сверчков для паразитологических исследований in vitro.

Теоретическое и практическое значение

Новые данные, полученные в рамках проведённых исследований, позволили пересмотреть современные подходы к систематике микроспоридий, выявить адаптивные преобразования, возникшие в процессе эволюции паразитических протистов, расширить представления о паразито-хозяинных отношениях микроспоридий и членистоногих, в частности, показать иммуносупрессивные свойства паразитов как результат адаптации к паразитизму в насекомых, а также особенности формирования внутриклеточных структур, обеспечивающих взаимодействие паразита и хозяина на клеточном уровне.

Применение современных подходов морфологического и молекулярного анализа позволило усовершенствовать методы диагностики, охарактеризовать разнообразие, филогенетические отношения и распространённость микроспоридий, паразитирующих в таких хозяйственно значимых членистоногих,

как перелётная саранча Locusta migratoria, марокканская саранча Dociostaurus marrocanus, двупятнистый сверчок Gryllus bimaculatus (Insecta: Orthoptera); луговой мотылёк Loxostege sticticalis, стеблевые мотыльки Ostrinia nubilalis и Ostrinia scapulalis, пчелиная огнёвка Galleria mellonella, хлопковая совка Helicoverpa armígera и озимая совка Agrotis segetum (Insecta: Lepidoptera); медоносная пчела Apis mellifera, шмели Bombus terrestris и Bombus sp. (Insecta: Hymenoptera); большой зерновой капуцин Prostephanus truncatus, малый мучной хрущак Tribolium castaneum, грушевый трубковёрт Byctiscus betulae, листовой слоник Phyllobius contemptus (Insecta: Coleóptera); комары-звонцы Chironomus plumosus и Chironomus obtusidens, малярийный комар Anopheles messae (Insecta: Díptera); иксодовые клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus (Parasitoformes: Ixodida) и др.

Защищаемые положения диссертации

1) Лабильность жизненных циклов микроспоридий позволяет использовать их особенности в качестве таксономического критерия только на видовом уровне, а для таксонов ранга рода и выше пригодны такие особенности ультраструктуры, как строение органелл аппарата экструзии (ответственного за внедрение паразита в клетку хозяина), и клеточной оболочки (ответственной за взаимодействие с клеткой хозяина на протяжении развития паразита).

2) При видообразовании микроспоридий возможны перестройки жизненных циклов, происходящие по двум основным путям: а) морфогенетическое

усложнение клеток с возникновением новых морфотипов спор и разделением спорогональных последовательностей, ведущее к формированию сложных жизненнх циклов, и б) редукция жизненных циклов с сохранением разных спорогоний в разных хозяевах или с потерей одной спорогонии.

3) Защитные реакции со стороны клеточной системы иммунитета (фагоцитоз, инкапсуляция, меланизация) насекомых-хозяев оказывают негативный эффект на развитие микроспоридий, которые используют механизмы избегания (путём выстреливания инкапсулированных и фагоцитированных спор) и подавления (путём ингибирования фенолоксидазной системы гемолимфы насекомых) этих реакций. Иммуносупрессивное воздействие микроспоридий вызывает существенное повышение чувствительности заражённых насекомых к другим патогенам.

4) В ходе эволюции микроспоридий произошло разделение на две основные филогенетические линии, разви

Информация о работе

Токарев, Юрий Сергеевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.02.05

Диссертация

Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий ВАК РФ 03.02.05, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Токарев, Юрий Сергеевич, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Филогения и паразитические свойства энтомопатогенных микроспоридий
ВАК РФ 03.02.05, Энтомология