Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микроспоридии (Microsporidia) кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) Западной Сибири
ВАК РФ 03.02.04, Зоология
Автореферат диссертации по теме "Микроспоридии (Microsporidia) кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) Западной Сибири"
005537134
На правах рукописи
Симакова Анастасия Викторовна
МИКРОСПОРИДИИ (MICROSPORIDIA) КРОВОСОСУЩИХ КОМАРОВ
(DIPTERA: CULICIDAE) ЗАПАДНОЙ СИБИРИ (ВИДОВОЙ СОСТАВ, ЭКОЛОГИЯ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ)
03.02.04 - зоология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
7 НОЯ 2013
Томск 2013
005537134
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», на кафедре цитологии и генетики
Научный консультант: доктор биологических наук,
Сибатаев Ануарбек Карнмович
Официальные оппоненты:
Бабенко Андрей Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», кафедра защиты растений, заведующий кафедрой
Воронин Владимир Николаевич, доктор биологических наук, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», кафедра аквакультуры, болезней рыб и птиц, профессор
Комарова Людмила Алексеевна, доктор биологических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайская государственная академия образования им. В.М. Шукшина», кафедра биологии, профессор
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Зоологический институт Российской академии наук (г. Санкт-Петербург)
Защита состоится «19» декабря 2013 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.267.09, созданного на базе федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36 (Главный корпус).
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета.
Автореферат разослан « »_2013 г.
Ученый секретарь ¿¿¿К Середина
диссертационного совета, / / v Валентина Петровна
д.б.н., проф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Микроспоридии - это тип облигатных внутриклеточных спорообразующих паразитов. Они представляют собой одноклеточные эукариотические микроорганизмы, которые имеют минимизированные клетку и геном, и относятся к сестринской по отношению к грибам группе (Vavra, Luces, 2013).
Микроспоридиям свойственны разнообразие жизненных циклов и широкий охват в качестве хозяев почти всего царства животных, от простейших до позвоночных, включая млекопитающих, в том числе и человека, за исключением типично морских Spongia и Echinodermata. Самое большое число видов зарегистрировано у насекомых, наиболее разнообразны они у массовых видов — вредителей леса и культурных растений, а также у кровососущих насекомых (Исси, 1986; Воронин, 1999).
Микроспоридии способны вызывать гибель личинок комаров, и, следовательно, рассматривания как потенциальные агенты биологического контроля по снижению численности кровососов.
Кроме того, эти паразиты имеют медицинское и ветеринарное значение. В кишечнике личинок комаров была обнаружена микроспоридия Anncaliia algerae Исси, Крылова, Николаева, 1993 (прежде Nosema и Brachiolá) (Franzen et al., 2006), заражающая насекомых других отрядов и человека, вызывая при этом серьезные заболевания. Пути передачи ее человеку пока не известны. Возможно, комары являются одними из переносчиков этой инфекции при кровососании.
Вместе с тем, микроспоридии подавляют развитие малярийного плазмодия при совместном паразитировании, и, следовательно, косвенно способствуют снижению зараженности малярией как комаров, так и человека
(Anthony et al., 1972; Ward, Savage, 1972; Koella, Zaghloul, 2008; Koella et al.,
В настоящее время эти паразиты обнаружены у 13 родов комаров сем. Culicidae практически на всех континентах. Из кровососущих комаров описано более 150 видов микроспоридий, относящихся к 25 родам, признанным валидными. Последовательности нуклеотидов малой субъединицы рибосо-мальной ДНК получены для 14 родов и 47 видов.
Микроспоридии кровососущих комаров имеют различные жизненные циклы от простых до сложных с образованием одного, двух, трех, четырех типов спор, различающихся морфологически и функционально. Заражение организма происходит перорально, трансовариально или путем аутоинвазии (Andreadis, 2007).
В связи с вышеизложенным углубленное изучение видового состава, жизненных циклов, путей передачи, экологии и эпизоотологии, а также ультраструктурных особенностей и молекулярной филогении микроспоридий кровососущих комаров, рассмотрение филогении микроспоридий с позиции
2009).
их ко-эволюции с хозяевами, исследование на микроспоридиоз гидробион-тов, развивающихся совместно с комарами, являются необходимыми и актуальными.
В настоящее время изучение микроспоридий перешло на качественно новый уровень исследований с использованием электронно-микроскопических и молекулярно-генетических методов, открывающих огромное разнообразие в особенностях строения трофических стадий и спор, в характере их взаимоотношений с клеткой хозяина, в рассмотрении паразитов с позиции ко-эволюции с хозяином, смены хозяев и независимого видообразования. Уникальные свойства этих облигатных внутриклеточных паразитов из кровососущих комаров могут рассматриваться не только в качестве модельных объектов теоретической паразитологии, в том числе и в связи с их значительным биоразнообразием, но и потенциальных агентов биологического контроля злостных кровососов, что послужило основанием для проведенных нами исследований.
Цель исследования: выявить и описать на основе ультраструктурных особенностей и молекулярно-генетических данных виды микроспоридий, паразитирующих в комарах ceM.Culicidae Западной Сибири; изучить их жизненные циклы и особенности паразито-хозяинных отношений; связать филогенетические взаимоотношения выявленных видов и закономерности их коэволюции с насекомыми-хозяевами.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить распространение микроспоридий в популяциях кровососущих комаров, описать обнаруженные виды с использованием электронно-микроскопических и молекулярно-генетических методов.
2. Оценить степень корреляции морфологических критериев старой системы и молекулярно-генетических признаков филогенетической системы при описании новых видов и родов микроспоридий.
3. Определить положение микроспоридий кровососущих комаров в системах, основанных на морфологических и молекулярно-генетических признаках.
4. Изучть жизненные циклы микроспоридий из комаров сем. Culicidae с особым вниманием к особенностям развития триморфных микроспоридий родов Amblyospora, Trichoctosporea из моновольтинных комаров Aedes, Ochlerotatus в условиях Западной Сибири.
5. Дать анализ паразито-хозяинных отношений микроспоридий и кровососущих комаров на организменном и популяционном уровнях.
6. Рассмотреть филогению микроспоридий и кровососущих комаров с позиции коэволюции, возможности смены хозяев и независимого видообразования.
Данная работа по изучению микроспоридий кровососущих комаров была проведена в период с 1992 по 2012 годы на территории Западной Сибири.
Научная новизна работы. Впервые проведено сравнение ультраструктурных и молекулярно-генетических таксономических признаков при описании новых родов и видов микроспоридий из кровососущих комаров и доказано их соответствие друг другу. На территории Западной Сибири выделено и изучено 34 вида микроспоридий, относящихся к 8 родам, из них 33 вида и 5 родов впервые описаны как новые для науки. Впервые выявлены закономерности жизненного цикла для паразитов родов АтЫуозрога и ТпсИосЮзрогеа из моновольтинных комаров рода ОсЫегоШш и промежуточных хозяев - копепод рода Асап(Иосус1орз в условиях Западной Сибири. Для микроспоридий рода ТпскосШрогеа впервые установлен полный АтЫуозрога-подобный цикл развития с наличием вертикальной и горизонтальной передач и с участием промежуточных хозяев — низших ракообразных. Впервые проведен сравнительный анализ положения микроспоридий из комаров сем. СиНс1ёае в системах, основанных на морфологических и молекулярно-генетических признаках. Доказано наличие ко-эволюции основных групп микроспоридий и их хозяев - кровососущих комаров на родовом уровне, кроме того, впервые установлена возможность смены хозяев, а также другие пути эволюции этих паразитов.
Теоретическое значение. Использование нами современных элек-тронно-микроскопческиих и молекулярно-генетических методов для изучения микроспоридий из комаров сем. СиНс1(1ае позволило не только установить широкое морфологическое многообразие данных паразитов, что обусловлено спецификой хозяев — амфибионтных насекомых, но и точно определить положение в филогенетической системе и степень родства тех или иных микроспоридий. За исключением родов АппсаШа и Утгта, имеющих независимое происхождение, доказано, что микроспоридии из кровососущих комаров, для которых получены данные последовательностей нуклеотидов консервативных участков генов малой субъединицы рибосомальной ДНК, составляют отдельную монофилетическую группу в древе микроспоридий, они представлены близкородственными формами и имеют общего предка. Установлено, что наиболее примитивные формы, а также паразиты, развивающиеся в теле хозяина без контакта с внешней средой, образуют просто-устроенные споры. Далее в процессе эволюции у спор развиваются толстые многослойные оболочки для более длительного сохранения жизнеспособности во внешней среде, усложняется строение аппарата экструзии для надежного проникновения зародыша в клетку хозяина: образуется многочастный поляропласт, обязательным компонентом которого служит часть из плотно-уложенных ламелл; полярная трубка становится типично анизофилярной, количество ее витков увеличивается.
Для большинства изученных к настоящему времени видов микроспоридий установлена узкая специфичность, когда круг хозяев ограничен одним, реже двумя видами одного рода. Тем не менее, вопреки прежним представлениям, нами зафиксировано, что один вид комара могут заражать мик-
роспоридии нескольких родов и видов, которые могут быть как близкород-ственнми, так и имеющими разное происхождение.
Впервые установлены ко-эволюционные взаимоотношения паразит-хозяин. Установлена тесная экологическая сопряженность микроспоридий и их хозяев — кровососущих комаров. Показано, что сложные жизненные циклы паразитов, имеющих горизонтальную и вертикальную передачу и использующих в качестве промежуточных хозяев копепод, синхронизированы с циклами развития хозяев и экологическими факторами региона. Потеря или приобретение какого-либо звена в сложных полиморфных жизненных циклах, скорее всего, служит адаптацией к экологическим условиям хозяев для увеличения вероятности встречи микроспоридий с подходящими хозяевами, но не является свидетельством филогенетического родства. Большинство изолированных нами родов и видов микроспоридий — эндемики, встречающиеся только на территории Западной Сибири.
Исходя из положения о сопряженном развитии микроспоридий и их хозяев, нами показано наличие ко-эволюции микроспоридий и кровососущих комаров на родовом уровне.
Практическое значение. В результате нашей работы установлено наличие различных видов микроспоридий у массовых форм кровососущих комаров, а также случаи высокой зараженности хозяев в природных популяциях, что позволяет рассматривать этих паразитов в роли регуляторов численности комаров. Полученные нами данные о видовом составе, жизненных циклах, специфичности и эпизоотологии микроспоридий ценны и необходимы для разработки биологических методов снижения численности комаров сем. СиНаёае на территории Западной Сибири и могут быть использованы при планировании мероприятий по борьбе с кровососами.
Полученные нами новые данные о распространении микроспоридий, сложных жизненных циклах паразитов у моновольтинных комаров, данные по ультраструктуре, молекулярной филогении и эволюции, а также возможности использования морфологических и молекулярно-генетических признаков в систематике и таксономии могут быть использованы в учебных курсах.
Собранная нами в ходе работы постоянная коллекция из 34 видов микроспоридий, включающая мазки, микрофотографии и замороженные образцы ДНК, представляет ценность для изучения видового состава, морфологии, молекулярной филогении и систематики этих паразитов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Статус микроспоридий таких родов как АтЫушрога, АппсаШа, Апс1геаппа, СиИсоцюга, СиИсозрогеПа, Ес1кагагсИа, НагагсНа, НуаНпосузШ, ЫоуоЛеЬИата, РагМИеЬИата, Тг1с1юсЮ$рогеа, Уаугта, в системах, построенных на морфологических (ультраструктурных) или молекулярно-генетических признаках, тождественен и не противоречит одно другому.
2. Ультраструктура спор большинства микроспоридий комаров сем. Culicidae не может быть надежным критерием для определения таксономического статуса при идентификации родов и видов.
3. Полные триморфные жизненные циклы микроспоридий родов Amblyospora и Trichoctosporea синхронизированы с циклами развития хозяев — моновольтинных комаров рода Ochlerotatus и низших ракообразных - ко-пепод рода Acanthocyclops, встречающихся на протяжении всего сезона (адаптация к среде первого порядка); а также с экологическими особенностями региона - Западной Сибири (адаптация к среде второго порядка).
4. Основные направления эволюции микроспоридий кровососущих комаров: совместное видообразование паразита и хозяина (ко-эволюция), смена паразитом хозяина, перемещение в один вид комара потомков разных видов паразитов, дивергенция одного предкового вида микроспоридий из одного вида комара на несколько независимо эволюционирующих видов паразитов, переселение на комаров микроспоридий, паразитировавших у других видов членистоногих.
5. Микроспоридии кровососущих комаров возникли как обособленная группа паразитов, эволюционировавшая от паразитов низших ракообразных, представляющих собой не только промежуточных хозяев для видов родов Amblyospora, Hyalinocysta и Parathelohania, но и служащих хозяевами таксонов, сестринских к сем. Amblyosporidae.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на: 2-й региональной паразитологической конференции (Новосибирск, 1997); международной научной конференции, посвященной 110-летию начала регулярных зоологических исследований и зоологического образования в Сибири (Томск, 1998); международной конференции «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 1999); 2-й Республиканской научной конференции «Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России» (Великий Новгород, 2002); XII съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2002); First United Workshop on Microsporidia from Invertebrate and Vertebrate Hosts (Ceske Budejovice, Czech Republic, 2004); II, III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005; 2009); XXI, XXII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006, 2008); Всероссийском совещании по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, 2006); V European Congress of Protistology and XI European Conference on Ciliate Biology (St. Petersburg, 2007); IV, V Всероссийском съезде Паразито-логического Общества (Санкт-Петербург, 2008; Новосибирск, 2013); Международном симпозиуме «Паразиты Голарктики» (Петрозаводск, 2010); Международной конференции «Инфекционная патология членистоногих» (Санкт-Петербург, 2012); а также на семинарах кафедры цитологии и генетики и кафедры зоологии беспозвоночных ТГУ.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 39 работ, из них 9 изданий, рекомендованных ВАК, 6 в международных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы (326 наименований, из них 223 иностранных авторов) и двух приложений. Основная часть работы изложена на 299 страницах (включая список литературы), проиллюстрирована 10 рисунками и 18 таблицами. Приложения объемом 71 страница включают описания валидных родов микроспоридий кровососущих комаров, 34 рисунка и 2 таблицы. Общий объем диссертации 370 страниц.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту А.К. Сибатаеву за ценные советы в ходе работы. Автор особо признателен Т.Ф. Панковой (ТГУ, г. Томск) за постоянную и неоценимую помощь в исследованиях и обсуждении результатов. И.В. Исси (ВИЗР, г. Санкт-Петербург) за конструктивную критику, помощь в определении микроспоридий и обсуждении результатов; В.Н. Стегнию (ТГУ, г. Томск) за ценные советы в ходе работы. Автор искренне благодарит всех, кто помогал во время полевых и лабораторных исследований: А.А. Миллера (НПО «Вирион», г. Томск), Е.В. Моржину (ВИЗР, г. Санкт-Петербург) за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований; В.В. Лукьянцева (ТГУ, г. Томск), А.К. Сибатаева (ТГУ, г. Томск), Ю. А. Юрченко (ИСиЭЖ, г. Новосибирск) за помощь в сборе и определении материала; Т. G. Andreadis, С. F. Vossbrinck (Agricultural Experiment Station, CT, USA) за проведение молеку-лярно-генетических исследований и участие в обсуждении результатов. Автор благодарит заведующего кафедры зоологии беспозвоночных В.Н. Рома-ненко за ценные советы по структуре и оформлению диссертации, а также всех сотрудников кафедры.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 9604-50264, 97-04-63016, 98-04-63034, 07-04-00468-а, 08-04-01854-э_б, 08-0405052-6, 08-04-10049-к, 09-04-05028-6, 09-04-10055-к, 10-04-10025-к, ФЦП «Интеграция», ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность, теоретическая и практическая ценность работы, определены ее цели и задачи.
Глава 1. Микроспоридии кровососущих комаров
Глава представляет анализ научной литературы. В обзоре описана ультраструктура стадий развития и спор микроспоридий, разнообразие жизненных циклов этих паразитов из кровососущих комаров, экологические и эпизоотологические аспекты, а также рассмотрены современные подходы к
систематизации микроспоридий.
Глава 2. Материал и методы исследований
По литературным данным описаны физико-географические, климатические и гидрологические особенности Западной Сибири. На основании собственных исследований дана типизация водоемов, мест выплода кровососущих комаров. В результате они разделены на 4 основные группы: материковые постоянные, пойменные постоянные, материковые временные и пойменные временные водоемы.
Материал исследований. Материалом для работы послужили личинки и имаго комаров родов Aedes Meigen, Ochlerotatus Lynch Arribalzaga, Anopheles Meigen, Culex L., их паразиты - микроспоридии и сопутствующие личинкам комаров водные беспозвоночные, собранные на территории Западной Сибири. Выявление видового состава микроспоридий проведено у личинок и имаго 16 видов, относящихся к 4 родам кровососущих комаров. Всего собрано и проанализировано 54825 личинок кровососущих комаров сем. Culicidae, из них 40250 экз. — р. Aedes, Ochlerotatus, 21450 экз. — р. Anopheles и 487 экз. - р. Culex. Всего зараженных 498 экз.: р. Aedes, Ochlerotatus — 339 экз., р. Anopheles - 157 экз., р. Culex - 2 экз.
На зараженность микроспоридиозом также исследованы сопутствующие личинкам кровососущих комаров гидробионты: личинки и взрослые особи водных насекомых из отр. Ephemeroptera - 1350 экз. (сем. Baetidae: р. Cloen Leach, сем. Ephemeridae), отр. Odonata - 144 экз. (сем. Coenagrionidae: р. Coenagrion Kirby, сем. Lestidae: р. Lestes Leach, сем. Aeschnidae: р. Aeschna F.); отр. Hemiptera — 224 экз. (сем. Notonectidae: р. Notonecta L.), отр. Coleóptera - 90 экз. (сем. Dytiscidae: р. Dytiscus L.); низшие ракообразные отр. Cladocera - 112200 экз. (сем. Daphniidae: р. Daphnia Mueller), отр. Calanoida - 12600 экз. (сем. Diaptomidae: р. Diaptomus Westwood), отр. Cyclopoida - 76660 экз. (сем. Cyclopidae: р. Mesocyclops Sars; р. Macrocyclops Claus, 1893; р. Acanthocyclops Kiefer; р. Eucyclops Claus); зараженными оказались личинки насекомых отрядов Ephemeroptera, Odonata и низшие ракообразные отрядов Cladocera, Calanoida, Cyclopoida.
Для изучения полных жизненных циклов микроспоридий проведено 16 вариантов опытов с 55 повторностями, по алиментарному заражению микроспоридиями родов Amblyospora Hazard et Oldacre, 1975, Trichoctosporea Larsson, 1994 и Parathelohania Codreanu, 1966 из комаров родов Aedes, Ochlerotatus и Anopheles гидробионтов из отрядов Cladocera, Cyclopoida, Ephemeroptera и Odonata; 2 варианта опытов в 12 повторностях по алиментарному заражению микроспоридиями Microsporidium sp. из ракообразных отрядов Cladocera и Cyclopoida личинок комаров р. Anopheles; 6 вариантов опытов в 10 повторностях по пероральному заражению Microsporidium sp. из ракообразных отряда Cyclopoida личинок комаров родов Aedes/Ochlerotatus и Anopheles. Всего в опытах использовано 2280 экз. природной популяции и
лабораторной культуры ракообразных отрядов Cladocera, Cyclopoida; 40 личинок стрекоз отр. Odonata природной популяции, 80 личинок поденок отр. Ephemeroptera природной популяции; 1200 личинок комаров Anopheles atroparvus L. лабораторной культуры; 103 личинок комаров Ап. messeae природных популяций; 20 зараженных микроспоридиями личинок Ochlerotatus-, более 300 личинок комаров Aedes, Ochlerotatus природных популяций.
В опытах по изучению жизненного цикла микроспоридий рода Senoma Simakova, Tokarev, Issi, 2005 использовалось 260 личинок комаров р. Anopheles, 500 имаго малярийных комаров, 30 низших ракообразных Daphnia pulex De G и D. magna Straus.
Для установления наличия трансовариальной передачи обследованы яичники у 600 взрослых самок комаров р. Anopheles. Прослежено развитие от яйца до 4 возраста 42000 личинок р. Anopheles, выплодившихся из 600 яйцекладок, полученных в лабораторных условиях.
Для идентификации микроспоридий, а также в целях определения зараженности природной популяции комаров и сопутствующих им гидробион-тов и особей, используемых в экспериментах, приготовлено 5780 мазков, сделано 2555 микрофотографий спор и стадий развития микроспоридий.
Для молекулярно-филогенетических исследований просеквенировано 88 изолятов, из них 40 изолятов микроспоридий, 6 изолятов копепод, 32 изо-лята кровососущих комаров.
Полевые исследования проведены на территории Западной Сибири. Сбор личинок комаров проводили по методу Е.Н. Павловского (1935) водным сачком. Учеты проводили раз в пятидневку на протяжении сезона.
Сбор взрослых самок комаров проводился пробиркой на дневках, расположенных вблизи исследуемых водоемов, на территории Томской обл.
Сбор ракообразных отр. Cladocera, отр. Cyclopoida, а также развивающихся совместно с личинками кровососущих комаров личинок насекомых отрядов Odonata, Ephemeroptera, Coleóptera и взрослых насекомых отрядов Hemiptera и Coleóptera проводили водным сачком с поверхности и в толще воды попутно в исследуемых водоемах, учетов численности не проводилось.
Лабораторные исследования. В лаборатории собранные экземпляры насекомых просматривали на темном фоне микроскопа МБС-9 для выявления особей, зараженных микроспоридиозом. Зараженных личинок глазным скальпелем разделяли на три части на пердметном стекле. Торакс фиксировали 70 % этанолом для проведения молекулярно-генетических исследований. Сегменты брюшка фиксировали в 2,5 % глютаровом альдегиде на 0,1 М какодилатном буфере для электронно-микроскопических исследований. Для постановки экспериментов по изучению жизненных циклов микроспоридий часть сегментов брюшка личинки помещали в микропробирки с дистиллированной водой. Мазки фиксировали метиловым спиртом 1-2 мин., затем красили азур-эозином по Гимза-Романовскому (Воронин, Исси, 1974).
Световая микроскопия проводилась при помощи микроскопа MB-30S
при увеличении 1000х и "Axiostar plus" (Zeiss, Германия) при увеличении 1200х. Размеры окрашенных спор, стадий развития и спорофорных пузырьков устанавливали при 25 измерениях с помощью окулярмикрометра или програмного обеспечения AxioVision.Rel.l.0.
Для электронного микроскопирования личинок и ракообразных использованы стандартные методы. Срезы готовили на ультрамикротоме Ultrotome-III (LKB) и Reichert-Jung. Перед просмотром их окрашивали 2 % раствором уранилацетата в 50 % этаноле и цитратом свинца по Рейнольдсу, а также 0,05 % раствором OTE (oolong tee extract) (Sato et al., 2003; Миллер, Симакова, 2009). Препараты просматривали в электронном микроскопе "JEM-100 СХП" ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Все размеры устанавливали при 30 измерениях.
Молекулярно-генетические исследования проведены стандартными методами (Vossbrinck et al., 1998). Филогенетические деревья были построены методами: максимальной экономии (Maximum Parsimony), максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) и связывания ближайших соседей (Neighbor Joining).
Эксперименты по изучению полных жизненных циклов проведены со спорами микроспоридий родов Amblyospora, Parathelohania, Trichoctosporea, Senoma, выделенными из личинок комаров родов Aedes, Ochlerotatus, Anopheles, которыми заражали науплиальные, копеподитные и взрослые стадии природной популяции и лабораторной культуры низших ракообразных отр. Cyclopoida и Calanoida, а также личиночные стадии стрекоз Coenagrion vernale L. и поденок Cloen dipterum L. Не идентифицированными спорами микроспоридий Microsporidium sp. из ракообразных отр. Cyclopoida и Calanoida заражали лабораторную культуру личинок кровососущих комаров Anopheles atroparvus\ а также личинок Aedes, Ochlerotatus, Anopheles из природных популяций. В опытах использовали свежие споры сразу же после их выделения; споры, хранившиеся в дистиллированной воде при Т +23 °С в течении месяца; и споры, хранившиеся в дистиллированной воде в холодильнике при Т 0-+4 °С от одного до шести месяцев. Эксперименты длились в течении 7-35 дней, либо до полной гибели гидробионтов при разных температурных режимах от +15 °С до +28 °С. Все опыты сопровождались контролем без внесения спор. Наблюдение за заражением в течение опытов вели по мазкам из погибших особей. По окончании экспериментов из оставшихся особей готовили мазки для световой микроскопии; часть особей была зафиксирована для электронно-микроскопических исследований с целью поиска ранних стадий развития паразита.
Для подтверждения наличия трансовариальной передачи микроспоридий p. Parathelohania у самок p. Anopheles после откладки яиц выделяли яичники и готовили мазки. Каждая яйцекладка помещалась в отдельный аквариум. Выплодившихся личинок содержали при комнатной температуре (+23-
+25 °С) до 4 возраста для выявления личинок с явными клиническими признаками микроспоридиоза.
Глава 3. Систематический обзор микроспоридий кровососущих комаров Западной Сибири (морфологические и молекулярно-филогенетические
аспекты)
Раздел 3.1 Видовой состав микроспоридий. В результате наших исследований обнаружено и изучено 34 вида микроспоридий, относящихся к 8 родам (.ЛтЫуоБрога, Апс1геаппа, Сгер1с1и1озрога, Бтеюзрога, Л'о\'о0ге1оката, РагаЛеЬНата, ТпсЪоМозрогеа, Бепота). Из них 33 вида и 5 родов (Ап&еаппа, Сгер1с1и1о5рога, Отеюярога, Коуо1}\е1оката, Бепота) описаны нами как новые для науки, для 23 видов получены данные последовательностей нуклеотидов консервативных участков генов малой субъединицы рибосомальной ДНК (таблица 1). В диссертации приведено краткое описание видов с указанием хозяина, локализации паразита, места и времени обнаружения, ультраструктурных особенностей, жизненного цикла, симптомов, эпизоотологии, номера, присвоенного ГенБанком. В приложении для каждого вида размещены электронно-микроскопические фотографии стадий развития и зрелых спор.
Раздел 3.2 Морфологические и молекулярно-генетические обоснования описания новых родов и видов. В разделе приводится сравнение значимости морфологических и молекулярно-генетических таксономических признаков в систематике микроспоридий и обоснование описания нами новых родов и видов этих паразитов.
Данные секвенирования последовательностей нуклеотидов мсрДНК изученных микроспоридий подтвердили валидность описанных на основании уникальных особенностей ультраструктуры новых родов и видов этих паразитов из кровососущих комаров Западной Сибири. Согласно молекуляр-но-филогенетическому анализу все они располагаются в одной кладе с ранее изученными микроспоридиями из комаров сем. СиНас1ае.
Таблица 1
Список видов микроспоридий комаров сем. СиНас1ае, обнаруженных на территории Западной Сибири (виды расположены в алфавитном порядке, жирным шрифтом выделены виды, для которых получены данные
Вид микроспоридин Хозяин
1. АтЫуоърога Ьакс/гапа АпскеасНБ, Бнпакоуа й а1., 2012 ОсЫего1аШ5 ехсгиЫат (\Valker, 1856)
Продолжение таблицы 1
2. Amblyospora bariíia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus cataphylla Dyar, 1916
3. Amblyospora bogashovia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus excrucians (Walker, 1856)
4. Amblyospora burlaki Панкова, Неси, Симакова, 2000 Culexpipiens Linnaeus, 1758
5. Amblyospora caspius Панкова, Ис-си, Симакова, 2000 Ochlreotatus caspius (Pallas, 1771), Oc. communis (De Geer, 1776)
6. Amblyospora chulymia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus caspius (Pallas, 1771)
7. Amblyospora flavescens Симакова, Панкова, 2005 Ochlerotatus flavescens (Muller, 1764), Oc. diantaeus Howard, Dyar et Knab, 1912
8. Amblyospora hristinia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus communis (De Geer, 1776)
9. Amblyospora jurginia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus excrucians (Walker, 1856)
10. Amblyospora kazankia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus diantaeus Howard, Dyar et Knab, 1912
11. Amblyospora kolarovi Симакова, Панкова, 2005 Ochlerotatus communis (De Geer, 1776), Oc. punctor (Kirby, 1837)
12. Amblyospora mavlukevia Andreadis, Simakova et al., 2012 Aedes cinereus Meigen, 1818
13. Amblyospora mocrushinia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus punctor (Kirby, 1837)
14. Amblyospora modestium Andreadis, Simakova et al., 2012 Culex modestus Ficalbi, 1889
15. Amblyospora orbiculata Симакова, Панкова, 2005 Ochlerotatus diantaeus Howard, Dyar et Knab, 1912
16. Amblyospora rugosa Симакова, Панкова, 2005 Ochlerotatus euedes Howard, Dyar et Knab, 1912; Oc. cantans (Meigen, 1818), Oc. cataphylla Dyar, 1916, Acanthocyclops venustus (Norman, Scott, 1906)
17. Amblyospora salairia Andreadis, Simakova et al., 2012 Aedes cinereus Meigen, 1818
18. Amblyospora severinia Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus excrucians (Walker, 1856)
19. Amblyospora shegaria Andreadis, Simakova et al., 2012 Aedes cinereus Meigen, 1818
Окончание таблицы 1_
20. Amblyospora timirasia Andreadis, Simakova et al., 2012 Aedes einereus Meigen, 1818
21. Amblyospora imdata Симакова, Панкова, 2005 Culexpipiens Linnaeus, 1758
22. Amblyospora urski Симакова, Панкова, 2005 Ochlerotatus communis (De Geer, 1776)
23. Andreanna caspii Simakova, Vossbrinck, Andreadis, 2008 Ochlerotatus caspius (Pallas, 1771)
24. Crepidulospora beklemishevi Симакова, Панкова, Исси (2003), 2004 Anopheles beklemishevi Stegnii, Kabanova, 1976
25. Dimeiosporapalustris Симакова, Панкова, Исси 2003 Ochlerotatus punetor (Kirby, 1837)
26. Novothelohania ovalae Andreadis, Simakova et al., 2012 Ochlerotatus caspius (Pallas, 1771)
27. Parathelohania divulgata Симакова, Панкова, 2004 Anopheles beklemishevi Stegnii, Kabanova, 1976; An. messeae, Falleroni, 1926
28. Parathelohania formosa Симакова, Панкова, 2004 Anopheles messeae Falleroni, 1926
29. Parathelohania sibirika Симакова, Панкова, 2004 Anopheles messeae Falleroni, 1926
30. Parathelohania teguldeti Симакова, Панкова, 2004 Anopheles beklemishevi Stegnii, Kabanova, 1976
31. Parathelohania tomski Симакова, Панкова, 2004 Anopheles messeae Falleroni, 1926
32. Senoma globulifera Simakova et al., 2005 Anopheles messeae Falleroni, 1926
33. Trichoctosporea colorata Симакова, Панкова, 2004 Ochlerotatus euedes Howard, Dyar, Knab, 1912, Oc. punetor Kirby, 1837, Aedes cinereus Meigen, 1818
34. Trichoctosporea pygopellita Larsson, 1994 Ochlerotatus flavescens (Muller, 1764), Oc. excrucians (Walker, 1856), Oc. cyprius Ludlow, 1919. Acanthocyclops reduetus (Chappuis, 1925)
Уникальные морфологические особенности строения мейоспор паразитов рода АтЫуозрога (яйцевидные или широко-яйцевидные, одноядерные споры, имеющие большую заднюю вакуоль, хорошо развитый полярный якорный диск, большой многочастный поляропласт, анизофилярную полярную трубку и толстую оболочку, состоящую, как правило, из экзоспоры, суб-экзоспоры, эндоспоры и плазматической мембраны), а также данные после-
довательностей нуклеотидов мер ДНК (приблизительно 1260 базовых точек), полученные для 17 новых видов Amblyospora, выделенных из личинок комаров, собранных в Западной Сибири, являются доказательством их описания как новых таксонов в пределах клады рода Amblyospora (Andreadis, et al., 2012).
Сравнение ультраструктурных признаков стадий спорогонии и зрелых спор близкородственных видов, а также видов, находящихся далеко друг от друга в филогенетическом древе в пределах клады микроспоридий рода Amblyospora показало, что самые незначительные отличия наблюдались между A. khaliulini из Ochlerotatus communis (США) и A. kolarovi из Ос. punctor (Западная Сибирь), которые составили 12 нуклеотидов. В небольшую субкладу с A. khaliulini и A. kolarovi попадает также A. hristinia из Ос. communis (отличия с A. kolarovi составили 40 нуклеотидов) (рисунок 1). Электронно-микроскопические исследования показали значительное морфологическое сходство этих трех близкородственных видов (наличие зернистого секрета в полости спорофорного пузырька, который заполняет почти все простарнство; форма спор, наличие субэкзоспоры, соотношение витков полярной трубки). Незначительные отличия наблюдаются в размере спор, толщине оболочки, числе витков полярной трубки, строении поляропласта, что позволяет рассматривать их как самостоятельные виды.
Наиболее близкородственными также оказались виды A. jurginia из Ос. excrucians (Западная Сибирь) A. weiseri из Ос. cantans (Чешская Республика), отличия между которыми составили 14 нуклеотидов. Ультраструктурные исследования показали, что оба вида имеют одинаковый мелкозернистый секрет в полости пузырька, образующий вокруг споронтов небольшие хлопьевидные скопления, удлиненно-яйцевидную форму спор, толстую оболочку и общее небольшое количество витков полярной трубки. Тем не менее, эти микроспоридии имеют несколько морфологических признаков, позволяющие рассматривать их как самостоятельные виды: разные размеры спор, количество витков полярной трубки, строение поляропласта.
Незначительные отличия также наблюдались между A. salairia из Ае. cinereus (Западная Сибирь) и A. cinerei из Ае. cinereus (США), которые составили 25 нуклеотидов. Данные ультраструктуры показали, что оба вида сходны по: размерам спор, толщине оболочки и строению поляропласта. Однако, они имеют несколько морфологических отличий: форма спор, число и соотношение витков полярной трубки.
Следовательно, все близкородственные виды имеют сходную ультраструктуру (в частности подобное строение секрета в спорофорных пузырьках, содержащих делящиеся споронты). Отличия в основном заключаются в числе и соотношении витков полярной трубки и строении поляропласта мейоспор. Исключение составляет лишь вид A. flavescens, который значительно отличается по морфологии от вышеупомянутых видов.
100 I_
И I-1_
ill I_
Amblyospora Severinia Amblyospora flavescens Amblyospora stimuli Amblyospora baritia Amblyospora cinerei Amblyospora salairia
100.
-Q=
J--
I-Amblyospora mavlukevia
- Amblyospora shegaria
-Amblyospora canadensis
- Amblyospora timirasia
- Amblyospora creniferis
-Amblyospora connecticus
Amblyospora kolarovi Amblyospora khaliulini Amblyospora hristinia Amblyospora jurginia Amblyospora weiseri Amblyospora bogashovia Amblyospora stictici Amblyospora excrucii Edhazardia aedis Amblyospora rugosa Amblyospora mocrushinia Amblyospora kazankia Amblyospora bakcharia Trichoctosporea pygopellita Amblyospora chulymia Amblyospora modestium Amblyospora indicóla Intrapredatorus barri Amblyospora opacita Amblyospora salinaria Amblyospora californica Culicospora magna
-Amblyospora ferocis
i- Culicosporella lunata
'- Hyalinocysta chapmani
- Andreanna caspii
-- Hazardia milleri
1- Senoma globulifera
Parathelohania anophelis Parathelohania obesa Parathelohania divulgata Parathelohania tomski Novothelohania ovalae
Ochlerotatus stimulans Ochlerotatus excrucians• Ochlerotatus punctor ■ Ochlerotatus communis Ochlerotatus abserratus Ochlerotatus cantator ■ Ochlerotatus aurifer Ochlerotatus diantaeus Ochlerotatus cataphylla Ochlerotatus canadensis • Ochlerotatus sticticus Ochlerotatus caspius Aedes aegypti Aedes ciñere us
Culex territans Culex salinarius Culex restuans Culex modestus Culex quinquefasciatus Culex pipiens Culiseta melanura Psorphora ferox
Anopheles messeae Anopheles quadrimaculatus
Рисунок 1. Филогенетическое древо, демонстрирующее родство микроспоридий и кровососущих комаров на основе последовательностей мсрДНК (древо построено методом связывания ближайших соседей (Neighbor Joining).
Наименее близкородственными среди видов Amblyospora, секвениро-ванных к настоящему времени оказались A. excrucii из Ochlerotatus excrucians (США) и A. criniferis из Ос. crinifer (США), отличия между которыми составили 193 нуклеотида. Эти виды также имеют существенные морфологические отличия: по форме и размерам спор, строению поляропласта, числу и соотношению витков полярной трубки; их споры сходны только по толщине оболочки.
Значительные как молекулярно-генетические (отличия составили 190 нуклеотидов), так и морфологические отличия наблюдаются между видами A. mavliikevia из Ае. cinereus (Западная Сибирь) A. criniferis из Ос. crinifer (США). Оба вида имеют толстую оболочку, но отличаются по форме и размерам спор, строению поляропласта, числу и соотношению витков полярной трубки.
Среди секвенированных Западносибирских видов рода Amblyospora, наибольшие отличия наблюдались межу A. flavescens из Ос. diantaeus и А. rugosa из Ос. cataphylla (отличия составили 188 нуклеотидов). При сравнении ультраструктурных особенностей очевидны значительные морфологические отличия между этими видами: по строению секрета в полости споро-форного пузырька, форме и размерам спор, строению оболочки, поляропласта, числу и соотношению витков полярной трубки. У других видов этого рода, также имеющих значительные генетические отличия, наблюдаются существенные различия в ультраструктуре стадий развития и мейоспор.
Очевидно, что в данном случае морфологические данные подтверждают генетические отличия между видами. Морфологическое сходство между видами заключается только в наличие у всех микроспоридий (исключение A. flavescens) субэкзоспоры. Кроме того, все виды, имеющие значительные генетические отличия выделены из разных не близкородственных хозяев.
В филогенетическом древе микроспоридий рода Amblyospora из комаров Aedes, Ochlerotatus можно четко выделить три субклады, содержащие разные виды (рисунок 1).
В первой субкладе находится 9 видов: Amblyospora severinia, А. flavescens, A. stimuli, A. baritia, A. cinerei, A. salairia, A. mavlukevia, А. shegaria, A. canadensis. 4 вида выделены из комаров Aedes cinereus (A. cinerei, A. salairia, A. mavlukevia, A. shegaria), остальные паразитируют в разных хозяевах. Каждый вид имеет свой набор уникальных морфологических признаков, однако есть ряд ультраструктурных особенностей, присущих всем видам этой группы: мейоспоры имеют толстую оболочку, содержащую субэкзоспо-ру; полярная трубка длинная и образует много витков (11-20), расположенных в несколько рядов (кроме A. flavescens, A. canadensis, у которых витки расположены в один ряд). Мейоспоры этих видов имеют типичное Amblyospora-подобное строение, исключение составляет A. flavescens, имеющая Trichoctosporea-подобую ультраструктуру.
Во второй субкладе находится 8 видов микроспоридий: Amblyospora kolarovi, A. khaliulini, A. hristinia, A. jurginia, A. weiseri, A. bogashovia, А. stictici, A. excriicii (рисунок 1). A. kolarovi, A. khaliulini, A. hristinia выделены из комаров Ochlerotatus communis-, A. jurginia, A. weiseri, A. bogashovia, А. excrucii из Ос. excrucians; A. weiseri из Ос. cantans; A. stictici из Ос. sticticus. Сравнение морфологических особенностей мейоспор показали, что все споры из этой субклады имеют приблизительно одинаковую форму и толстую оболочку, содержащую субэкзоспору. Размеры спор колеблются в широком диапазоне (5,4-7,8x3,3-5,5 мкм), поляропласт от одночастного, до трехчаст-ного, полярная трубка от 5 до 12 витков.
Наибольший интерес представляет третья субклада, содержащая род Trichoctosporea с видом Т. pygopellita (рисунок 1). Она включает 5 видов Amblyospora: A. rugosa, A. mocrushinia, A. kazankia, A. bakcharia, A. chulymia. Ультраструктурный анализ стадий развития и зрелых спор показал, что большинство видов этой субклады имеют Trichoctosporea-nojioñ\\y\o ультраструктуру. Тем не менее, все виды этих микроспоридий имеют разных хозяев, не являющихся близкородственными.
Изучение видов рода Amblyospora из комаров рода Culex показало, что они составляют отдельную субкладу в кладе видов Amblyospora из кровососущих комаров в филогенетическом древе (рисунок 1). При изучении морфологических особенностей этих видов очевидна значительно меньшая вариабельность в морфологии стадий развития и зрелых мейоспор, в отличие от микроспоридий Amblyospora из комаров родов Aedes, Ochlerotatus. Отмечено, что все мейоспоры из комаров рода Culex имеют толстую оболочку, содержащую субэкзоспору, трехчастный поляропласт (пластинчатая, крупнокамерная, пластинчатая части) и анизофилярную полярную трубку с небольшим количеством витков (не более 9), расположенными в один ряд. Отличия между видами заключаются в основном в числе и соотношении витков полярной трубки.
Нами замечены отличия в длине полярной трубки между видами, заражающими группу комаров Aedes, Ochlerotatus и группу рода Culex. Сравнительный анализ 17 видов Amblyospora, выделенных из комаров Aedes, Ochlerotatus и Culex, собранных в России с 26 дополнительными видами из других географических регионов (Andreadis, 1994а; Garcia, Becnel, 1994; Micieli et al., 2000; Симакова, Панкова, 2005), показал измеримые различия среди видов, паразитирующих в этих двух родах комаров. Виды, паразитирующие в группе комаров Aedes/Ochlerotaus, обладают занчительно более длинными полярными трубками (р = 0.005), (среднее число витков = 12, количество витков- варьирует в пределах 5-20), нежели виды, паразитирующие в комарах рода Culex (среднее число витков = 9, количество витков варьирует в пределах ЗУт-16 витков).
Вероятно, длинные полярные трубки необходимы для заражения отдаленных от споры клеток в организме хозяина. В случае с родом
АтЫуозрога, это объясняет тот факт, что у копепод, перорально зараженных мейоспорами из личинок комаров, поражается только овариальная ткань во всех случаях, известных к настоящему времени, независимо от вида паразита, комара, или промежуточного хозяина - ракообразного (АпёгеасНз, 1988; Веспе1, 1992; Веспе1, ЛпскеасШ, 1998; 1УПаеН с1 а1., 1998, 2000а,б; АпскеасИз, Энпакоуа е! а1., 2012).
Таким образом, очевидно, что у видов рода АтЫуоярога из кровососущих комаров наблюдается корреляция между морфологическими и моле-кулярно-генетическими признаками. На основании полученных данных по молекулярной филогении и ультраструктуре можно утверждать, что наиболее консервативным морфологическим признаком микроспоридий рода АтЫуоярога, подвергающимся минимальной вариабельности является строение оболочек зрелых спор (наличие или отсутствие субэкзоспоры). Очевидно, что большинство секрета спорофорного пузырька расходуется на формирование оболочек зрелых спор, если в пузырьках со споронтами секрета мало, значит, споры будут иметь тонкую оболочку, если же секрета много, у мейоспор формируются толстые оболочки, содержащие субэкзоспору (Бтакоуа, 2007).
Вторым консервативным признаком является наличие анизофилярной полярной трубки для всех видов, и только варианты ее строения представляют собой изменчивый признак. Это такие особенности как: общее число витков, соотношение толстых и тонких витков, расположение витков в один или несколько рядов. Так как этот признак обладает значительной вариабельностью, он может быть рассмотрен как один из основных морфологических признаков при идентификации видов микроспоридий рода АтЫуозрога.
Не было выявлено зависимости строения поляропласта от толщины оболочки, числа и соотношения витков полярной трубки. Однако, у всех видов АтЫуоьрога в поляропласте обязательно присутствует часть, состоящая из плотноупакованных пластин. Но наличие участков с другой структурой (крупные камеры, везикулы) входит в таксономические критерии видового уровня.
Новый род с типовым видом Апс1геаппа сазри располагается в одной кладе с микроспоридиями из кровососущих комаров (рисунок 1). Отличия Апс1геаппа са.чрИ от других родов и видов, расположенных в этой кладе, составляют от 17,1 % до 23,9 %, что достаточно для рассмотрения ее как нового рода. Несмотря на то, что Апс1геаппа сахри выделена из комаров ОсЫего1аШ саБршя, она не попадает в субкладу с микроспоридиями из комаров Аес1ез/ОсМего1М№, и составляет отдельную ветвь в филогенетическом древе. Эта микроспоридия значительно отличается от упомянутых родов рядом характерных морфологических признаков. Так, крупные стадии спорогонии Апс1геаппа с акр и занимают практически всю полость спорофорных пузырьков, имея при этом ровные, не волнистые оболочки. Споры овальные без шипов и вогнутостей, полярная трубка слабоанизофилярная (Бтакоуа й
al., 2008).
Следующий новый род с типовым видом Novothelohania ovalae, паразитирующий в комарах Ochlerotatus caspius, наиболее близко связан с кла-дой, содержащей виды рода Parathelohania из комаров рода Anopheles (уровень достоверности 100 %) с расхождением в последовательностях в пределах 14—15 %, в то время как отличия в последовательностях между видами рода Parathelohania отмечаются на уровне 2-7 % (рисунок 1). Различия в последовательностях с его самым близким родственником P. divulgata составляет 14% (176 нуклеотидов). Споры этой микроспоридии не обладают диагностическими морфологическими особенностями, присущими мейоспо-рам рода Parathelohania. Так, овальные споры Novothelohania имеют сла-боанизофилярную полярную трубку, полярный якорный диск, "имеющий форму зонтика" (Andreadis et al., 2012).
На территории Западной Сибири у комаров рода Anopheles описано пять морфологически различных видов Parathelohania (P. divulgata, Р. formosa, P. sibirika, P. teguldeti, P. tomski) (Симакова, Панкова, 2004), и подвид P. illinoisensis var. messeae (Панкова и др., 1991). Данные по последовательностям мсрДНК получены для двух видов Parathelohania (P. divulgata и P. tomski) выделенных из An. messeae. Эти виды разместились в кладе, содержащей виды рода Parathlohania (рисунок 1). Идентичность последовательностей между P. divulgata и P. tomski составила 97,7 % (примерно 29 нуклеотидов), и отличалась на 6,0 % и 7,6 % от P. anophelis и Р. obesa соответственно. Таким образом, молекулярные данные доказывают, что Р. divulgata и Р. tomski являются разными видами (Andreadis et al., 2012).
Наши исследования показывают, что для Р. divulgata и Р. tomski генетическое отличие между ними намного больше, чем морфологическое, наблюдаемое в строении мейоспор. Так, мейоспоры Р. divulgata имеют немного больший размер (Р. divulgata 4,6-5,3x2,4-3,2 мкм; Р. tomski 4,4-4,9x2,1-2,5 мкм) и обладают незначительно меньшим количеством витков полярной трубки (Р. divulgata: 2 толстых и 4,5 тонких витков; Р. tomski: 2 толстых и 5 тонких витков). Сравнение ультраструктуры этих видов с другими видами, описанными на изученной территории также показывает их незначительные морфологичекие отличия внутри рода Parathlohania (Симакова, Панкова, 2004).
Споры микроспоридии Senoma globulifera из эпителиальных клеток кишечника комаров Anopheles messeae обладают несколькими отличительными от остальных родов и видов диагностическими морфологическими признаками: овальные споры погружены наполовину в электронноплотную глобулу с однородынм содержимым по две (реже по одной или по четыре). Они имеют тонкую экзоспору и очень толстую эндоспору, пластинчатый поляропласт и слабоанизофилярную полярную трубку (Simakova et al., 2005). Согласно данным ДНК-анализа S. globulifera наиболее близко связана с Hazardia milleri Hazard, Fucuda, 1974 из комаров Сх. pipiens (идентичность
последовательностей между ними 86,9 %) (рисунок 1). Микросопоридии рода Hazardia Hazard, Fukuda, 1974 формируют два типа спор в жировом теле хозяина (Hazard, Fukuda, 1974; Canning, Vavra, 2000), в то время как у S. globulifera образуется один тип спор. Отличие в последовательностях между видом Senoma globulifera и ближайшими родственниками из того же хозяина - комара Anopheles messeae: P. divulgata и P. tomski значительное и составляет 22,7 %. Споры этих микроспоридий не обладают ни одной из диагностических морфологических особенностей, присущих мейоспорам рода Parathelohania (Andreadis, Simakova et al., 2012).
Сравнительный анализ морфологических и генетических таксономических признаков изученных нами микроспоридий позволяет заключить:
1. не наблюдается противоречий между морфологическими и молеку-лярно-генетическими таксономическими данными,
2. уникальные морфологические характеристики стадий развития и зрелых спор, а также данные последовательностей мсрДНК, полученные для монотипичных родов Andreanna, Novothelohania и Senoma, а также 16 видов Amblyospora, 2 видов Parathelohania и 1 вида Triehoctosporea, выделенных из личинок комаров, собранных на территории Западной Сибири, Россия служат доказательством правомерности их выделения как новых таксонов в пределах клады, содержащей микроспоридий из комаров сем. Culicidae,
3. для видов рода Parathelohania генетическое отличие намного больше, чем морфологическое, наблюдаемое в строении мейоспор, в то время как у видов рода Amblyospora морфологические и генетические отличия являются хорошо выраженными. Близкородственные виды имеют сходную ультраструктуру мейоспор,
4. наименее вариабельными (консервативными) признаками для видов Amblyospora служат строение оболочки (наличие или отсутствие субэкзоспо-ры) и анизофилярный тип полярной трубки, наиболее вариабельными - тонкие особенности строения полярной трубки (число, соотношение, расположение витков). Виды, мейоспоры которых имеют тонкую оболочку, близкородственны с Trichoetosporea и располагаются в одной субкладе с этим родом,
5. виды рода Amblyospora из комаров Aedes/Ochlerotatus обладают намного большим диапазоном отличительных морфологических признаков, чем виды из комаров рода Culex. В общей сложности у микроспоридий из Aedes, Ochlerotatus полярные трубки длиннее, чем у видов из Culex,
6. секрет спорофорных пузырьков служит строительным материалом для оболочек зрелых спор, и его структура может быть использована в качестве одного из таксономических признаков при идентификации видов,
7. для идентификации и описания новых видов рода Amblyospora из жирового тела личинок комаров достаточно знание только морфологических ультраструктурных особенностей, таких как: строение секрета спорофорного пузырька, размеры зрелых мейоспор, толщина экзо- и эндоспоры, количе-
ство, соотношение и расположение широких и узких витков полярной трубки, строение поляропласта.
Глава 4. Жизненные циклы и пути передачи микроспоридий кровососущих комаров в условиях Западной Сибири
Жизненные циклы микроспоридий, паразитирующих у комаров сем. Culicidae, отличаются большим многообразием: от простых с пероральной передачей и одним типом спорогонии до сложных с наличием трансовари-альной передачи, полового процесса, сменой хозяев и двумя-тремя спорогониями с образованием спор, различающихся морфологически и функционально.
Нами проведено изучение жизненных циклов и путей передачи микроспоридий широко распространенных родов Amblyospora и Trichoctosporea из комаров Aedes, Ochlerotatus, а также Parathelohania и Senoma - паразитов малярийных комаров, обнаруженных на территории Западной Сибири.
4.1. Изучение трансовариальной передачи. Экспериментальным путем нами было подтверждено наличие трансовариальной передачи для микроспоридий р. Parathelohania из комаров p. Anopheles на примере паразитов P. tomski из комаров An. messeae и P. teguldeti из An. beklemishevi (Симакова, Панкова, 2008).
Заключение о наличие трансовариальной передачи для микроспоридий родов Amblyospora, Trichoctosporea у комаров Aedes, Ochlerotatus на территории Западной Сибири сделано, прежде всего, из полевых наблюдений. В исследованных водоемах наблюдается большое видовое разнообразие микроспоридий рода Amblyospora у личинок комаров. Так в нескольких водоемах, территориально отдаленных и не сообщающихся между собой нами обнаружены одни и те же виды микроспоридий такие как: Amblyospora severinia из Ochlerotatus excrucians; A. salairia из Aedes cinereus; A. mavlukevia из Ae. cinereus; Trichoctosporea pygopellita из Ос. excrucians. Данные по ультраструктуре и ДНК-анализу показали, что два изолята вида Trichoctosporea pygopellita обнаружены в водоемах, отдаленных территориально и не сообщающихся между собой. Таким образом, взрослые самки комаров распространяют микроспоридий по территории Сибири посредством откладки зараженных яиц в разные водоемы. Кроме того, благодаря этому способу передачи паразитов в одном водоеме одновременно могут развиваться личинки одного вида комара, зараженные микроспоридиями разных видов рода Amblyospora. Так у личинок Ochlerotatus excrucians в одном водоеме обнаружено 2 вида: Amblyospora jurginia, A. severinia', у Aedes cinereus в одном водоеме выявлено 4 вида: Amblyospora salairia, А. mavlukevia, A. shegaria, А. timirasia.
Таким образом, экспериментально и путем анализа распространения микроспоридий в естественных водоёмах нами доказано наличие трансова-
риальной передачи для паразитов родов Amblyospora, Trichoctosporea и Parathelohania из кровососущих комаров Западной Сибири.
4.2. Экспериментальное изучение полных жизненных циклов и поиск промежуточных хозяев микроспоридий родов Amblyospora, Trichoctosporea, Parathelohania из кровососущих комаров. Нами проведена серия экспериментов по перекрестному заражению микроспоридиями (родов Amblyospora, Trichoctosporea и Parathelohania из личинок комаров и неиден-тифицированных Microsporidium sp. из низших ракообразных) лабораторной культуры и природных популяций личинок кровососущих комаров родов Aedes, Ochlerotatus, Anopheles и сопутствующих им гидробионтов: низших ракообразных отрядов Cyclopoida, Calanoida, личинок насекомых отрядов Odonata и Ephemeroptera. При постановке экспериментов нами были учтены такие факторы как: сроки проведения экспериментов (сезонность и длительность опытов), возраст использованных в опытах особей (личинок комаров первого и второго возраста и ракообразных всех стадий развития: наупли-альные, копеподитные, взрослые), различные сроки хранения спор при разных температурных режимах, доза спор при заражении, совместное развитие личинок комаров и ракообразных в природных условиях. В экспериментах были использованы споры из гидробионтов, собранных как во временных, так и в постоянных водоемах.
Все варианты опытов сопровождались контролем без внесения спор паразита. Визуальные наблюдения, а также свето- и электронно-микроскопический анализ личинок комаров, стрекоз, поденок и низших ракообразных, погибших во время проведения всех экспериментов и фиксированных по их окончании, не выявили зараженных особей. На мазках и ультратонких срезах стадии мерогонии и спорогонии, а также зрелые споры микроспоридий не обнаружены (Васильева (Симакова), 1997; Симакова, 2003; Прохорова и др., 2004).
Таким образом, многочисленные экспериментальные исследования полных жизненных циклов микроспоридий родов Amblyospora, Parathelohania, Trichoctosporea из кровососущих комаров не выявили промежуточных хозяев для этих родов паразитов. Отсутствие перорального заражения, возможно, объясняется невосприимчивостью данных хозяев к использованным видам микроспоридий или влиянием каких-либо неучтенных нами факторов в экспериментах как на паразита, так и на хозяина.
4.3. Описание полного жизненного цикла микроспоридий родов Amblyospora, Trichoctosporea на основании данных морфологии, ДНК-анализа и экологии на территории Западной Сибири. В связи с тем, что эксперименты по перекрестному пероральному заражению микроспоридиями кровососущих комаров и сопутствующих им гидробионтов дали отрицательный результат, нами были проведены электронно-микроскопические и молекулярно-генетические исследования микроспоридий, выделенных из низших ракообразных с целью поиска промежуточных хозяев другими мето-
дами, а также для определения таксономического статуса исследуемых паразитов из ракообразных на изучаемой территории.
Данные секвенирования получены для 6 изолятов микроспоридий из копепод, собранных на территории Западной Сибири. Проведенные нами молекулярно-генетические исследования показали, что эти паразиты из рачков могут быть как видами, свойственными именно этим хозяевам, так и представлять собой часть сложных триморфных циклов некоторых микроспоридий кровососущих комаров.
Впервые в России с помощью ДНК-анализа найдены два потенциальных промежуточных хозяина микроспоридий из комаров р. Ochlerotatus. Это низшие ракообразные рода Acantocyclops. Данные по последовательностям нуклеотидов мсрДНК микроспоридий из копепод Acantocyclops venustus идентичны микроспоридиям Amblyospora rugosa из комаров Ochlerotatus cataphylla. Таким образом, микроспоридии A. rugosa используют в качестве основного хозяина комаров Ос. cataphylla и могут использовать в качестве промежуточного хозяина копепод Ас. venustus.
В свою очередь установлено, что последовательности нуклеотидов мсрДНК микроспоридий из копепод Ас. reductus идентичны последовательностям микроспоридии Trichoctosporea pygopellita, паразита комаров Ос. excrucians. Этот факт говорит о том, что у микроспоридии Т. pygopellita из комаров Ос. excrucians промежуточным хозяином могут быть низшие ракообразные Ас. reductus (Симакова и др., 2011).
Основываясь на данных секвенирования генов мсрДНК микроспоридий из комаров и копепод, а также на многочисленных экологических наблюдениях, можно заключить, что на территории Сибири микроспоридии родов Amblyospora и Trichoctosporea имеют сложные триморфные циклы развития, где основными хозяевами являются моновольтинные комары р. Ochlerotatus и промежуточными хозяевами - копеподы р. Acanthocyclops (рисунок 2).
Жизненный цикл паразитов сопряжен с фенологией хозяев. Микроспоридии зимуют на ранних стадиях (меронты) в копеподах и в зараженных яйцах комаров. В вышедших из диапаузы копеподах в середине-конце апреля паразит начинает быстро развиваться в яичниках и/или гемоцеле, достигая зрелого состояния и приводя к гибели рачков в конце апреля, начале мая (рисунок 2). В это время наблюдается самая высокая экстенсивность заражения микроспоридиями природных популяций копепод как во временных, так и в постоянных водоемах (до 2,5 %). В результате в водоем высвобождаются одноядерные споры, инвазионные для личинок комаров.
Рисунок 2. Схема жизненного цикла микроспоридий родов Amblyospora и Trichoctosporea из моновольтинных комаров рода Ochlerotatus и копепод рода Acanthocyclops в сезонных условиях Западной Сибири
В этот же период водоемы заселяются личинками моновольтинных комаров родов Aedes, Ochlerotatus, которые при поедании свежих спор, высвободившихся из копепод, заражаются микроспоридиями. Такие личинки способны окукливаться, доживать до взрослого состояния. В них микроспоридии осуществляют цикл трансовариальной передачи. В эноцитах личинок паразит претерпевает половой процесс (плазмогамию). После кровососания в овариях выплодившихся самок происходит формирование двуядерных спор (рисунок 2). Зараженные самки откладывают инфицированные яйца в различные водоемы. Так происходит распространение инфекции по территории Сибири. Это способствует увеличению частоты встреч паразита с хозяином.
Кроме того, параллельно в весенний период в водоемах происходит развитие микроспоридий в клетках жирового тела личинок комаров, зараженных трансовариально предыдущей весной. После мерогонии клетки микроспоридии претерпевают мейотическое деление, и затем в результате спорогонии образуются октомейоспоры. Такие личинки не способны окукливаться. Они погибают на стадии 4 возраста, когда в водоемах происходит массовое окукливание и вылет здоровых имаго (конец мая - начало июня). В этот период наблюдается максимальная зараженность личинок с явными клиническими признаками микроспоридиоза (0,05-6,5 %). Мейоспоры инва-зионны для ракообразных (при заглатывании спор рачки заражаются), численность которых в этот период бывает значительной. В дальнейшем временные водоемы начинают пересыхать, и зараженные копеподы уходят в диапаузу с ранними стадиями развития паразита до следующего весеннего сезона (рисунок 2). В постоянных непересыхающих водоемах максимальная
зараженность рачков также наблюдалась в конце апреля, начале-середине мая (Симакова и др., 2011).
Мы не обнаружили рачков с явными признаками микроспоридиоза в поздне-летний и осенний периоды во всех типах водоемов. Вероятно, в зараженных копеподах микроспоридии приостанавливают свое развитие до выхода хозяев из диапаузы в следующем сезоне. Таким образом, паразит стремится максимально сохранить жизнеспособность, переживая неблагоприятные условия в теле хозяина.
Нахождение зараженных ракообразных в летний период в постоянных водоемах объясняется развитием в них специфичных микроспоридий или циркуляцией инфекции с участием микроспоридий из поливольтинных комаров p. Anopheles и ракообразных (как промежуточных хозяев), дающих несколько генераций в течение сезона, когда паразит за сезон может проходить несколько полных жизненных циклов. Однако, на данном этапе этот вопрос остается открытым.
Наши данные полностью подтверждают предыдущие исследования по жизненным циклам микроспоридий рода Amblyospora (Andreadis, 1985, 1989, 2005, 2007), однако впервые полный цикл развития микроспоридий р. Amblyospora установлен и описан нами для паразитов моновольтинных комаров p. Ochlerotatus и рачков p. Acanthocyclops, а также впервые установлен полный жизненный цикл для паразитов рода Trichoctosporea. Благодаря триморфному циклу развития и наличию основного и промежуточного хозяев микроспоридии хорошо адаптированы к экологическим условиям обитания хозяев (Симакова и др., 2011).
Адаптации этих паразитов заключаются в следующем.
1. Наличие в жизненном цикле микроспоридий вертикальной и горизонтальной передачи. Трансовариальная трансмиссия является надежным способом передачи от поколения к поколению; поддерживает существование микроспоридий на протяжении нескольких поколений хозяина; обеспечивает распространение микроспоридий в новые места обитания.
Горизонтальная передача увеличивает вероятность встречи спор паразита с восприимчивыми хозяевами - личинками комаров в окружающей среде, а также, когда каждый из хозяев (комары и копеподы) имеет неперекрывающиеся во времени генерации; служит микроспоридиям для поддержания своего существования на протяжении большей части жизненного цикла в живых хозяевах, а не во внешней среде.
2. Три условия обеспечивают микроспоридиям возможность существования в неблагоприятных условиях среды: переживание в диапаузирую-щих копеподах, зараженных яйцах и/или в самках комаров.
3. Жизненный цикл паразита не только синхронизирован с циклами развития хозяев, но и адаптирован к экологическим особенностям региона, что позволяет паразиту длительно существовать в популяциях хозяев, не вызывая эпизоотий.
4.4. Изучение жизненного цикла микроспоридий рода Senoma.
Многолетние экологические и эпизоотологические исследования позволили предположить отсутствие трансовариальной и наличие пероральной передачи у типового вида S. globulifera этого рода. При исследовании взрослых комаров, собранных на дневках, нами не обнаружено стадий развития и зрелых спор S. globulifera во всех органах и тканях самок. Полученные из яйцекладок личинки также были здоровыми. Нами проведены многочисленные све-тооптические исследования постоянных и временных препаратов из личинок, собранных в окрестных водоемах. Однако, зараженных особей в других водоемах не зарегистрировано. Таким образом, можно предположить, что трансовариальная передача у типового вида этого рода отсутствует.
Вероятно, в жизненном цикле этих паразитов должны присутствовать пероральная передача личинкам комаров (так как паразит локализуется только в клетках эпителия кишечника личинок и куколок) и/или промежуточные хозяева - низшие ракообразные (о чем говорит близкое филогенетическое родство Senoma с микроспоридиями из рачков). Однако эксперименты по пероральному заражению личинок малярийных комаров и ракообразных р. Daphnia спорами из зараженных S. globulifera личинок Anopheles messeae дали отрицательный результат. Следовательно, до сих пор остается открытым вопрос о путях передачи и полном жизненном цикле этого рода с типовым видом S. globulifera.
Глава 5. Экологические и эпизоотологические аспекты паразитирования микроспоридий у комаров сем. Culicidae на территории Западной Сибири
5.1. Специфичность микроспоридий. Гостальная специфичность -это адаптация определенных видов паразитов к развитию в определенных же видах хозяев. Преимущественное большинство микроспоридий, выделенных из комаров сем. Culicidae используют в качестве хозяев только кровососущих комаров. Исключение составляют лишь: Anncaliia algerae (паразит, в экспериментальных условиях заражающий широкий круг хозяев разных систематических групп беспозвоночных и позвоночных животных). Виды рода Duboscqia узкоспецифичны, но заражают самых разных насекомых (типовой вид Dubosqia legeri Kudo, 1942 - паразит термитов Reticulotermis lucifugus (Kudo, 1942), Duboscqia chironomi Voronin, 1975 - паразит жирового тела личинок Chironomus plumosus L. (Воронин, 1975). Представители рода Amblyospora также паразиты не только комаров сем. Culicidae. Некоторые виды этого рода используют в качестве хозяев различные группы водных и амфибионтных беспозвоночных: низших ракообразных, ручейников, поденок и др. (Hazard, Oldacre, 1975).
Согласно литературным данным, из 25 родов микроспоридий, описанных из кровососущих комаров, 17 являются монотипичными, и только 8 ро-
дов включают по несколько видов, паразитирующих у комаров сем. Culicidae (Aedispora - 2 вида, Amblyospora >100 видов, Cristulospora 3 вида, Duboscqia 2 вида, Parathelohania 22 вида, Pilosporella 2 вида, Polydispyrenia 2 вида, Trichoctosporea 2 вида).
На изученной территории наблюдается высокая степень сопряженности между родами хозяев-кровососущих комаров и родами их паразитов-микроспоридий. Самые распространенные и близкородственные рода Amblyospora, Trichoctosporea - паразиты комаров Aedes, Ochlerotatus, Culex; а рода Parathelohania, Senoma — паразиты p. Anopheles. Монотипичные рода Andreanna, Crepidulospora, Dimeiospora, Novothelohania и Senoma являются узкоспецифичными. Каждый вид паразита перечисленных родов имеет только по одному виду комара-хозяина. Представители родов Amblyospora, Trichoctosporea и Parathelohania, содержат по нескольку видов поражающих комаров на исследованной территории и имеют широкий круг хозяев.
Нами установлено, что один вид рода Amblyospora может паразитировать в нескольких видах комаров-хозяев (согласно электронно-микроскопическим исследованиям); в одном виде комара-хозяина может паразитировать несколько видов рода Amblyospora (согласно электронно-микроскопическим и молекулярно-генетическим исследованиям) (таблица 1) (Симакова, Панкова, 2005; Симакова и др., 2008; Andreadis et al., 2012). Это противоречит предыдущим исследованиям, проводимым во всем мире, когда считалось, что каждый вид данного рода способен паразитировать только в одном определённом виде комара. Наши исследования показывают, что узкая специфичность свойственна не всем видам этого рода.
Изучение специфичности микроспоридий близкородственного рода Trichoctosporea показало, что эти паразиты также имеют широкий круг хозяев и могут поражать несколько видов комаров (таблица 1).
Изучение рода Parathelohania показало, что микроспоридия Р. divulgata использует в качестве хозяев 2 вида комаров: Anopheles messeae и An. beklemishevi. Остальные виды — паразиты комаров An. messeae (таблица 1) (Симакова, Панкова, 2004, 2008; Andreadis et al., 2012).
При изучении распределения среди комаров сем. Culicidae родов и видов микроспоридий получены следующие данные. Из комаров р. Aedes (Ае. cinereus) нами выделено 4 вида микроспоридий рода Amblyospora (14 % от общего количества) и 1 вид рода Trichoctosporea (Симакова, Панкова, 2004; Andreadis, Simakova et al., 2012).
У комаров p. Ochlerotatus зарегистрировано наибольшее количество (24) видов микроспоридий (69 %). Из них 2 вида p. Trichoctosporea, 16 видов рода Amblyospora, 1 вид р. Andreanna, 1 вид р. Dimeiospora, 1 вид Novothelohania (Симакова и др., 2003; Симакова, Панкова, 2004, 2005; Simakova et al., 2008; Andreadis et al., 2012). Такое биоразнообразие паразитов объясняется тем, что моновольтинный р. Ochlerotatus содержит большее количество видов, а значит, с учетом адаптации определенных видов микро-
споридий к конкретным видам комаров имеет большее количество видов паразита.
Из комаров p. Culex выделено 3 вида, относящихся к p. Amblyospora (9 % от общего количества). Вероятно небольшое количество видов микроспоридий у данных комаров связано с незначительным распространением этих комаров в природных водоемах исследованного региона (Панкова и др., 2000; Симакова, Панкова, 2005; Andreadis et al., 2012).
У комаров p. Anopheles нами зарегистрировано 7 видов микроспоридий (20 %), относящихся к 3 родам: Crepidulospora, Parathelohania и Senoma (Симакова, Панкова, Исси (2003), 2004; Симакова, Панкова, 2004; Simakova et al., 2005; Симакова, Панкова, 2008). Большое разнообразие родов и видов микроспоридий у малярийных комаров может быть связано с тем, что данные комары размножаются на протяжении всего полевого сезона с мая по сентябрь, имеют за сезон генерации, что облегчает встречу хозяина, как со специфичными, так и с неспецифичными паразитами.
5.2. Симтомы заболевания и локализация паразита в теле хозяина. Локализация в теле хозяина и симптомы проявления заболевания у микроспоридий кровососущих комаров Сибири не отличаются большим разнообразием. Паразитам свойственно два типа локализации: ограниченная определенным типом клеток, не объединенных в какую-либо ткань (эноциты, ооциты) и ограниченная определенной тканью (жировое тело, эпителий кишечника). В связи с этим симптомы заболевания либо не проявляются внешне, либо имеют типичные признаки заражения микроспоридиями, образующими мейоспоры.
Наиболее выразительные внешние симптомы возникают при поражении жирового тела личинок паразитами, образующими в конце развития мейоспоры (рода Amblyospora, Andreanna, Crepidulospora, Dimeiospora, Novothelohania, Trichoctosporea), когда сегменты груди и брюшка личинок 4 возраста увеличиваются в размерах и к моменту созревания спор приобретают матово-белую окраску. Белое окрашивание дает толстая оболочка созревших спор. Заражение завершается гибелью личинок перед окукливанием. При развитии микроспоридий в эпителии кишечника (Senoma globidifera), эноцитах личинок или яичниках самок (рода Amblyospora, Parathelohania, Trichoctosporea) внешние признаки заражения отсутствуют.
Зараженные самки копепод, промежуточные хозяева микроспоридий родов Amblyospora и Trichoctosporea, имеют оранжевую или матово-белую окраску, паразит локализован в овариях или гемоцеле. Размножение микроспоридий препятствует развитию яиц и в конечном итоге ведет к гибели ракообразных и высвобождению зрелых спор, инвазионных для личинок комаров (Симакова и др., 2011).
Характер локализации паразита в тканях хозяина, а значит и симптомы проявления микроспоридиозов зависят от особенностей жизненных циклов и путей передачи микроспоридий. Если микроспоридии формируют спо-
ры ответственные за пероральную передачу, они приводят к гибели личинок или копепод и высвобождению спор во внешнюю среду. Если споры ответственны за трансовариальную передачу, паразиту не выгодна смерь хозяина, он вызывает легкие инфекции, не приводящие к гибели. Тем самым паразит способен поддерживть свою жизнеспособность в течение длительного периода.
5.3. Биотопическое распространение. Микроспоридии кровососущих комаров в исследованном регионе зарегистрированы практически во всех типах водоемов, кроме пойменных временных водоемов (Симакова, Панкова, 2005). Наибольшее родовое и видовое разнообразие паразитов наблюдается в материковых временных водоемах (25 видов паразитов, относящихся к 5 родам), отличающихся видовым разнообразием хозяев-кровососущих комаров (зараженных: 11 видов p. Aedes, Ochlerotatus); а так же в пойменных постоянных водоемах (9 видов микроспоридий, относящихся к 4 родам), отличающихся наибольшим разнообразием, распространением и количеством и длительным временем существования (зараженных комаров: 5 видов родов Ochlerotatus, Anopheles, Culex). В материковых постоянных водоемах (наиболее благоприятных для выплода поливольтинных видов кровососущих комаров) наблюдается меньшее биоразнообразие. В них нами обнаружено 5 видов микроспоридий, относящихся к 3 родам (3 вида зараженных комаров родов Ochlerotatus, Anopheles, Culex).
Микроспоридии родов Amblyospora, Andreanna, Dimeiospora, Novothelohania и Trichoctosporea (паразиты комаров родов Aedes, Ochlerotatus и Culex) в основном связаны с материковыми временными водоемами, а микроспоридии p. Parathelohania, Crepidulospora, Senoma (паразиты комаров p. Anopheles) - с постоянными материковыми и пойменными водоемами, что связано с выплодом их хозяев в определенных типах водоемов. Микроспоридии Amblyospora severinia, Trichoctosporea pygopellita, Т. colorata зарегистрированы как в постоянных, так и во временных водоемах. Показано, что влияние факторов внешней среды опосредовано хозяином.
При анализе ареалов видов микроспоридий на территории Западной Сибири установлено, что виды родов Amblyospora, Andreanna, Crepidulospora, Dimeiospora, Novothelohania, Parathelohania и Senoma встречаются только в изученном регионе и представляют собой эндемичные Западносибирские Азиатские виды, кроме рода Trichoctosporea, зарегистрированного также в Европе (Швеция, Larsson, 1994). Таким образом, на территории Западной Сибири основное число видов микроспоридий из кровососущих комаров являются эндемиками.
5.4. Сезонная и многолетняя динамика микроспоридиозов. При изучении сезонной динамики зараженности микроспоридиями в природных популяциях кровососущих комаров выявлено, что в условиях Западной Сибири самая высокая зараженность микроспоридиями p. Amblyospora наблюдалась у моновольтинных личинок комаров родов Aedes, Ochlerotatus обита-
ющих во временных водоемах (до 6,5^0 %), однако, это были единичные случаи. Преимущественно экстенсивность заражения природных популяций комаров стабильно низкая во все годы исследования и составляет 0,05-1 %.
Зараженные микроспоридиями p. Parathelohania личинки p. Anopheles встречаются на протяжении всего сезона в постоянных водоемах. Показатель экстенсивности заражения природных популяций во все годы исследования довольно стабилен, зараженность не превышает 2,6 %, что свидетельствует о образовании в таких биотопах стабильных экосистем, где сформировались постоянные многолетние очаги микроспоридиозов (Симакова, Панкова, 2008).
Зараженность микроспоридиями Senoma globulifera колеблется в пределах 0,5-10 %, Andreanna caspii и Novothelohania ovalae - 0,5 %. Микроспоридии других родов и видов встречаются единично.
Очевидно, что на изученной территории экстенсивность заражения микроспоридиозом природных популяций комаров сем. Culicidae невысокая и колеблется в незначительных пределах как в течение сезона, так и по годам. Микроспоридии могут вызывать энзоотии в природных популяциях кровососущих комаров. Эпизоотии наблюдаются крайне редко во временных водоемах и носят случайный спорадический характер. В постоянных водоемах создаются многолетние очаги микроспоридиоза, в которых не наблюдается резких колебаний экстенсивности заражения (Панкова, 1988; Симакова, Панкова, 2005, 2008; Simakova et al., 2008; Andreadis et al., 2012). Это говорит о том, что система паразит-хозяин у микроспоридий кровососущих комаров в природных условиях устойчивая и стабильная. Это результат длительной ко-эволюции паразита и хозяина. В процессе эволюции сформировались механизмы, ограничивающие вспышки массового заболевания. Они направлены на стабилизацию системы таким образом, чтобы паразит смог завершить полный жизненный цикл, не вызывая при этом эпизоотий, приводящих к массовому вымиранию хозяина. В таком жизненном цикле присутствует вертикальная и горизонтальная передача и обязательно наличие промежуточного хозяина. Вертикальная трансмиссия служит надежным способом сохранения и передачи паразита в популяциях комаров в течение длительного времени. При этом паразит продуцирует небольшое количество спор. Споры, ответственные за горизонтальную передачу образуются в теле хозяина в большом количестве и приводят его к гибели. Однако непременное условие заражения ими промежуточного хозяина представляет собой механизм, ограничивающий быстрое горизонтальное распространение паразитов. Следовательно, сложный жизненный цикл может рассматриваться как адаптация, направленная на сохранение и паразита, и хозяина, то есть на стабилизацию паразито-хозяинной системы.
Адаптации, выработанные в результате ко-эволюции микроспоридий и кровососущих комаров:
- наличие сложного гетероксенного жизненного цикла паразитов, его
синхронизация с жизненными циклами основных и промежуточных хозяев;
- наличие у большинства видов микроспоридий вертикальной и горизонтальной передач с обязательным присутствием промежуточного хозяина, обуславливающих регуляторный механизм сохранения паразита в популяциях хозяина на стабильном уровне без массовых вспышек заболевания, приводящих к массовой гибели хозяев;
- узкая специфичность паразитов;
- способность генетически отдаленных родов и видов микроспоридий использовать в качестве хозяина один и тот же вид комара;
- стабильно низкие показатели экстенсивности заражения природных популяций комаров;
- наличие структур, повышающих плавучесть спор и удержание их у поверхностной пленки воды;
- все виды, выявленные на территории Сибири, являются эндемичными (исключение Trichoctosporea pygopellita), адаптированными к условиям окружающей среды, её абиотическим и биотическим факторам.
Столь тесная связь говорит об очень длительных взаимоотношениях паразита и хозяина, сложившихся в процессе эволюции.
Глава 6. Молекулярная филогения микроспоридий комаров сем. Culicidae
6.1. Положение микроспоридий кровососущих комаров в системах, основанных на морфологических и молекулярно-генетических признаках. В настоящее время среди микроспоридий, выделенных из комаров сем. Culicidae, существуют рода (5 из 25), описанные только по оригинальному строению спор, которые возможно образуются лишь в одной из спорогоний сложного жизненного цикла данных паразитов, поэтому отнесение их к каким-либо семействам и определение положения в современной системе условное (Crepidulospora, Cristulospora, Dimeiospora, Tricornia сем. Amblyosporidae и Polydispyrenia сем. Duboscqiidae), что требует дальнейшего изучения этих паразитов для определения их таксономического статуса.
К мономорфным родам (9 из 25), для которых описан только один тип спор, относятся: Aedispora, Andreanna, Anncaliia, Crepidulospora, Novothelohania, Polydisperina, Senoma, Tricornia, Vavraia. Данные ДНК-анализа получены для 5 из них {Andreanna, Anncaliia, Novothelohania, Senoma, Vavraia).
Возможно, что истинно мономорфными являются лишь микроспоридии Anncaliia и Vavraia. Молекулярно-филогенетический анализ показал, что каждая из этих микроспоридий имеет значительные генетические отличия от остальных родов, поражающих комаров сем. Culicidae, и образует отдельные филогенетические ветви в древе. Отличия между этими родами составляют
33,8 %. Значительные отличия наблюдаются и самым ближайшим родственником - родом Hazardia (идентичность последовательностей с Anncaliia 65,3 %, с Vavraia 66,1 %). Показано, что представители этих родов стали паразитировать в комарах сем. Culicidae независимо от представителей других родов, выделенных из кровососущих комаров, и в другое время; они имеют независимое происхождение (Vossbrinck et. al., 2004; Andreadis, 2007). Оба рода этих микроспоридий заражают широкий круг хозяев-комаров в отличие от представителей других родов, которые используют в качестве хозяев 1 или 2-3 вида комаров. В жизненном цикле этих паразитов отсутствует мейоз, различия заключаются в том, что у Anncaliia на протяжении всего жизненного цикла стадии диплокариотические, в то время как у Vavraia монокариоти-ческие. Значительные отличия наблюдаются и в ультраструктуре зрелых спор.
Таким образом, все это подтверждает таксономическую индивидуальность каждого из этих родов и правильность отнесения Anncaliia к сем. Nosematidae, а рода Vavraia к сем. Plestophoridae в системе микроспоридий, построенной на морфологических и ультраструктурных таксономических критериях (Симакова, 2013).
Монотипичные рода Andreanna и Novothelohania - паразиты Ochlerotatas caspius, отнесены в сем. Amblyosporidae. Микроспоридии выделены в эти рода на основании отличительных особенностей ультраструктуры мейоспор, вероятно представляющих собой лишь часть сложного полиморфного жизненного цикла, и данных секвенирования мсрДНК.
Согласно этим данным Andreanna caspii расположена в одной кладе с группой видов Amblyospora, а также с Culicospora magna, Edhazardia aedis, Intrapredatorus barri, Culicosporella и Hyalinocysta. Однако, отличия от перечисленных таксонов составляют в среднем 19,6 %, что позволяет рассматривать этот род как самостоятельный в сем. Amblyosporidae (Рисунок 1) (Simakova et al., 2008). Род Novothelohania из Oehlerotatus caspius, наиболее близко связан с кладой, содержащей виды рода Parathelohania из малярийных комаров. Однако, различия в последовательностях с самым ближайшим родственником P. divulgata (14 %), а также особенности строения мейоспор достаточны для рассмотрения этой микроспоридии в качестве отдельного рода в сем. Amblyosporidae (рисунок 1), (Andreadis et al., 2012).
К самому большому по числу видов в сем. Amblyosporidae относится род Amblyospora. Семнадцать видов Amblyospora, один вид Trichoetosporea обнаруженных нами составляют отдельную монофилетическую группу с ранее описанными видами Amblyospora (10 видов) из комаров Aedes/Ochlerotatus, содержащую три хорошо выраженных субклады (100%, 94 % и 82 % уровни достоверности). Amblyospora modestium из Culex modestus вместе с ранее описанными видами Amblyospora из комаров рода Culex (5 видов) составляют отдельную четвертую сестринскую кладу (уровень достоверности 99 %) (рисунок 1) (Andreadis et al., 2012).
Наши филогенетические исследования показывают, что монотипичные рода Culicospora, Edhazardia и Intrapredatorus так же как Trichocíosporea попадают в кладу с видами рода Amblyospora. Так, Culicospora magna (хозяин — Culex restuans) и Intrapredatorus barri (хозяин — Culex fuscanus), располагаются в монофилетической кладе вместе с другими видами рода Amblyospora из комаров рода Culex. В свою очередь Edhazardia aedis (хозяин - Aedes aegypti) и Trichocíosporea pygopellita (хозяин - Ochlerotatus excrucians) попадает в кладу с видами Amblyospora из комаров Aedes/Ochlerotatus (рисунок 1).
Филогенетическое положение микроспоридии I. barri приводит доводы в пользу перевода этого вида в род Amblyospora. Эта микроспоридия имеет жизненный цикл, почти идентичный Amblyospora trinus, паразита Culex halifaxi (Becnel и Sweeney, 1990). Отличие заключается в формировании в жировом теле личинок второго типа спор. Наши исследования показали, что идентичность последовательностей нуклеотидов I. barri с видами рода Amblyospora из комаров рода Culex находится в пределах от 93,7 % до 85,7 %. I. barri отличается на 80 нуклеотидов от ближайшего родственника Amblyospora opacita (Andreadis, Simakova et al., 2012).
Trichocíosporea pygopellita расположена в одной субкладе с Amblyospora bakcharia, A. mocrushinia, A. rugosa (идентичность последовательностей в пределах от 88,7 % до 89,4 %) (рисунок 1). Эти микроспоридии имеют Amblyospora-поцобтлс жизненные циклы с участием промежуточных хозяев - копепод, но образуют морфологически отличные от Amblyospora мейоспоры, что позволяет нам сохранить статус рода для Trichocíosporea (Симакова, Панкова, 2005; Симакова и др., 2010; Andreadis et al., 2012; Симакова, 2013).
Culicospora magna и Edhazardia aedis сем. Culicosporidae имеют жизненные циклы, отличные от циклов развития микроспоридий рода Amblyospora (Becnel, 1994). Эти два рода располагаются в разных субкладах (рисунок 1). Расхождение в последовательностях между ними составляет 15 %, а с ближайшими родственникми, видами Amblyospora в пределах 1013 %. Таким образом, наши филогенетические исследования показывают, что различия в жизненных циклах таких паразитов как Amblyospora, Culicospora, Edhazardia, Inirapredaiorus, по молекулярным данным представляющим близкородственные формы, скорее всего, представляют адаптации паразитов к насекомому-хозяину и к среде его обитания для увеличения вероятности встречи паразита с хозяином и развития в нем (Andreadis, Simakova et al., 2012). Эти различия между микроспоридиями позволяют нам рассматривать их как самостоятельные рода внутри сем. Amblyosporidae, за исключением вида Inirapredaiorus barri, который мы переводим в род Amblyospora как Amblyospora barri, comb.nov.
Монотипичные полиморфные рода Hyalinocysta и Culicosporella -родственны роду Amblyospora. Но они имеют достаточно отличий (в морфо-
логии, молекулярной биологии и в жизненных циклах) для обоснования их таксономического статуса как валидных родов (Andreadis, Vossbrinck, 2002).
Виды родов Parathelohania, Hazardia и Senoma относятся к разным семействам, но являются родственными группами. При этом представители данных родов - паразиты комаров p. Anopheles, кроме Hazardia milleri - паразита p. Culex (рисунок 1).
Микроспоридии рода Parathelohania логично располагаются в сем. Amblyosporidae. Они имеют Amblyospora-подобные триморфные жизненные циклы. Отличия заключаются в морфологии мейоспор, развивающихся в жировом теле личинок комаров. Виды этого "рода составляют отдельную мо-нофилетическую группу в филогенетическом древе микроспоридий из комаров сем. Culicidae (рисунок 1). Отличия в последовательностях между видами этого рода отмечаются на уровне 2-7 %.
Ближайший родственник Hazardia (сем. Golbergiidae) - мономорфный и монотипичный род и вид Senoma globulifera. Различия в последовательностях между ними составляет 13,1 %, что позволяет рассматривать их как отдельные рода (рисунок 1). Микроспоридии рода Hazardia - димрофные. Дву-ядерные споры имеют толстую экзоспору, что сходно с разросшейся экзо-спорой микроспоридий рода Senoma. По морфологическим таксономическим признакам и особенностям цикла развития Senoma отнесена в сем. Nosematidae совместно с родом Anncaliia. ДНК-анализ показал, что эти микроспоридии не близкородственные и находятся далеко друг от друга в фило-гнетическом древе (идентичность последовательностей между ними составляет 64,7 %) (Andreadis et al., 2012)
На основании полученных нами данных по морфологии, жизненным циклам и молекулярной филогении мы пересмотрели диагноз сем. Amblyosporidae и включили в него следующие рода: Amblyospora, Andreanna, Culicospora, Culicosporella, Edhazardia, Hazardia, Hyalinocysta, Novothelohania, Parathelohania, Senoma, Trichoctosporea. Согласно данным по молекулярной филогении в монофилетической группе микроспоридий из кровососущих комаров четко выделяется две подгруппы, что позволяет нам выделилить в сем. Amblyosporidae два подсемейства Amblyosporinae и Parathelohaniinae.
Сем. Amblyosporoidea Weiser, 1977 Монофилетическая группа микроспоридий с двумя-тремя типами спорогонии и образованием двух-трех типов спор, различающихся морфологически и функционально. Ряду форм свойственно наличие сложных жизненных циклов со стадиями трансовариальной передачи, половым процессом и участием промежуточных хозяев. Характерно наличие мейоза, который у большинства родов происходит во время октоспоробластической спорогонии с образованием мейоспор. Мейоспоры имеют толстую оболочку, хорошо развитый аппарат экструзии, анизофилярную полярную трубку и преимущественно многочастный поляропласт, обязательным компонентом которого
служит часть из плотноуложенных пластин.
п/сем. Amblyosporinae Развитие паразита происходит с образованием двух-трех морфологически и функционально различных типов спор и с возможным участием промежуточных хозяев - копепод. В жизненном цикле обязательно наличие мейоза, полового процесса и трансовариальной передачи. В основном хозяине формируются споры одного-двух типов: толстостенные мейоспоры с анизофилярной полярной трубкой; и/или ланцетовидно-грушевидные одноядерные споры с тонкой оболочкой, крупнокамерным поляропластом и изо-филярной полярной трубкой. Образование этих спор приводит к гибели хозяина. Во взрослом хозяине формируются одиночные диплокариотические тонкостенные споры с изофилярной полярной трубкой, ответственные за трансовариальную передачу. В промежуточном хозяине образуются одноядерные ланцетовидные споры с крупнокамерным поляропластом и изофилярной полярной трубкой.
Рода отличаются по жизненным циклам и ультраструктуре спор, формирующихся в жировом теле личинок комаров (по форме спор и строению аппарата экструзии).
Род: Amblyospora, Culicospora, Edhazardia, Trichoctosporea. п/сем. Parathelohaniinae Микроспоридии с двумя-тремя типами спорогоний. Предполагается мейоз. Споры двух или трех морфологических типов: овальные двуядерные споры, тонкостенные ланцетовидные двуядерные споры; а также окто-мейоспоры. Иногда в жизненном цикле присутствует половой процесс и промежуточные хозяева - низшие ракообразные копеподы.
Рода отличаются по строению спор, а также по жизненным циклам. Род: Andreanna, Culicosporella, Hazardia, Hyalinocysta, Novothelohania,
Parathelohania, Senoma Необходимо отметить, что рода Andreanna, Novothelohania, Senoma были помещены в это подсемейство условно на основании молекулярно-генеитческих данных, так как для них полные жизненные циклы пока не установлены. Поскольку в настоящее время мы имеем данные по небольшому числу видов, для многих из которых не известны полные жизненные циклы данные по последовательностям мсрДНК, очевидно, что в дальнейшем с накоплением информации, сем. Amblyosporidae приобретет ранг отряда с выделением в нем нескольких самостоятельных семейств.
Таким образом, данные по молекулярной филогении позволяют заключить, что изначально микроспоридии изученных нами родов из кровососущих комаров имели сложные жизненные циклы с тремя спорогониями, в которых присутствовала трансовариальная, пероральная передача и промежуточные хозяева (ракообразные - копеподы). По нашим представлениям микроспоридии комаров сем. Culicidae, использующие в качестве промежуточных хозяев копепод, произошли от микроспоридий низших ракообраз-
ных, которые адаптировались к развитию в кровососущих комарах. Микроспоридии кровососущих комаров изначально имели сложные жизненные циклы с трансовариальной и пероральной передачами и наличием промежуточных хозяев-низших ракообразных. Впоследствии часть жизненного цикла некоторых микроспоридий могла быть утрачена вследствие потери одного из хозяев или приобретена в процессе приспособления к новым хозяевам. Процесс утраты или приобретения части жизненного цикла происходит у микроспоридий достаточно быстро относительно времени эволюционного развития (Baker et al. 1997, 1998, Vossbrinck et al. 2004; Andreadis, 2007; Andreadis et al., 2012; Симакова, 2013).
Эволюция микроспоридий сначала шла по пути адаптации паразитов к заражению и развитию в организме нового хозяина и затем по пути совершенствования этих адаптаций, направленных на максимальное использование ресурсов организма хозяина для своего развития и размножения. Наиболее примитивные формы микроспоридий образуют споры с просто устроенным аппаратом экструзии и тонкой оболочкой. Удлинение периода возможных контактов паразита с хозяином в водной среде достигалось путем формирования у спор толстых многослойных оболочек, имеющих складки, шипы, выросты, «хвосты», а также хорошо развитый мукокаликс.
Появление толстых оболочек, способных выдержать высокое внутри-споровое давление, обусловило дальнейшее развитие аппарата экструзии. Оно заключалось в уплощении камер поляропласта и появлении длинных анизофилярных полярных трубок.
Так, споры микроспоридий кровососущих комаров родов Amblyospora, Duboscqia, Hyalinocysta, Parathelohania, формирующиеся в промежуточных хозяевах - копеподах и передающиеся горизонтально личинкам комаров, имеют простое строение. Оболочка спор тонкая, поляропласт крупнокамерный (геликоидальный), полярная трубка изофилярная.
Споры полиморфных родов микроспоридий (Edhazardia, Culicospora, Culicosporella, Hazardia), способные заражать личинок комаров перорально и формирующиеся в части жизненного цикла, проходящего в личинках, также просто организованы. Они имеют тонкую оболочку, крупнокамерный поляропласт и изофилярную полярную трубку.
Мейоспоры сложноустроены. Они имеют преимущественно толстую многослойную экзоспору; многочастный поляропласт, расположенный по всей длине полярной трубки, обязательным компонентом которого служит часть из плотноуложенных ламелл; анизофилярную полярную трубку.
Сравнивая ультраструктуру сестринских родов, образующих мейоспоры в жировом теле личинок (Amblyospora, Andreanna, Novothelohania, Trichoctosporea, Parathelohania) и имеющих общего предка, логично предположить, что такие морфологические признаки как овальная форма спор с равномерной толщиной оболочки по всему периметру и слабоанизофилярная полярная трубка у Andreanna и Novothelohania могут быть плезиоморфными,
оставшимися от общего предка. Далее в процессе эволюционного развития споры приобретали яйцевидную форму с сохранением тонкой оболочки на переднем полюсе. Полярная трубка становилась типично анизофилярной с хорошо выраженными толстыми и тонкими витками.
Более сложное морфологическое строение мейоспор, формирующихся в жировом теле личинок комаров, может рассматриваться как результат процесса адаптации как к переходу паразита из одного вида хозяина в совершенно другой вид, так и к новым экологическим условиям, и говорит о более позднем их происхождении.
Следовательно, для определения положения микроспоридий в системе и изучения родственных связей необходимо знать совокупность всех признаков вида: особенности ультраструктуры стадий развития и спор, половых и жизненных циклов, филогенетические отношения с другими видами. Изучение основных направлений эволюции этих внутриклеточных паразитов будет возможным по мере накопления материалов по разным группам паразитов.
6.2. Обоснование ко-эволюции микроспоридий и их хозяев комаров сем. Culicidae. Изучение филогенетического положения микроспоридий кровососущих комаров сем. Culicidae. позволяет судить о ко-эволюции микроспоридий и их хозяев комаров на основании высокой степени корреляции между видообразованием паразитов - микроспоридий и их хозяев - кровососущих комаров (рисунок 1) (Симакова и др., 2012; Andreadis et al., 2012).
Филогенетический анализ убедительно демонстрирует, что виды рода Amblyospora, паразитирующие у комаров родов Aedes, Ochlerotatus и Culex, составляют отдельные монофилетические группы как и их хозяева. Виды родов Amblyospora, Culicospora - паразиты комаров р. Culex, образуют четко обособленную группу; так же как и виды родов Amblyospora и Edhazardia из Aedes/Ochlerotatus. Микроспоридии рода Parathelohania из комаров рода Anopheles составляют сестринскую кладу к Amblyospora, также как и малярийные комары - сестринская клада к группе кулицин. Amblyospora ferocis из Psorophora ferox и Hyalinocysta chapmani из Culiseta melanura являются отдельными группами сестринскими к Amblyospora clade из комаров Aedes, Ochlerotatus и Culex, также как их хозяева являются сестринскими группами к комарам рода Culex. Рода Senoma и Hazardia сестринские, также как и их хозяева - комары родов Anopheles и Culex. Не было выявлено филогенетических параллелей между микроспоридиями рода Amblyospora и их хозяевами — Aedes, Ochlerotatus на уровне вида.
Наши филогенетические исследования — очевидное доказательство коэволюции паразита и хозяина на родовом уровне. Однако имеются исключения, показывающие возможность перехода паразита к хозяину неродственного таксона. Самое известное исключение - комар Ochlerotatus caspius, в котором нами найдено три родственно далеких вида микроспоридий: Amblyospora chulymia, Andreanna caspii и Novothelohania ovalae (рисунок 1).
Вероятно, эти виды паразитов из Ос. caspius сформировались в изоли-
рованных местах обитания их хозяина. Поскольку сейчас нет информации относительно полных жизненных циклов этих микроспоридий, мы можем лишь предположить, что они могли перейти на комаров от близкородственных видов симпатрических популяций копепод.
Сравнительный анализ морфологии сестринских амблиоспорам микроспоридий, образующих в конце развития мейоспоры и паразитирующих в комарах разных родов показывает значительные различия в ультраструктуре спор. В то же время не близкородственные рода паразитов из одного вида комара имеют несколько схожих морфологических таксономических признаков. Это позволяет нам предположить наличие влияния хозяина на морфологию мейоспор, возникшее в результате ко-эволюции. Радиация хозяина ведет к радиации паразита.
Полученные нами данные по молекулярной филогении 23 видов микроспоридий, изолированных на территории Западной Сибири, подтверждают (Vossbrinck et al., 2004; Vossbrinck, Debrunner-Vossbrinck, 2005), что микроспоридии кровососущих комаров возникли как отдельная обособленная группа паразитов, эволюционировавшая от паразтитов ракообразных, которые являются не только промежуточными хозяевами для видов родов Amblyospora, Hyalinocysta и Parathelohania, исследованных к настоящему времени, но и служат хозяевами форм, сестринских к Amblyosporidae (Симакова и др., 2012; Andreadis et al., 2012).
6.3. Пути эволюции микроспоридий кровососущих комаров. Частичное несоответствие, наблюдаемое между «ветвями» филогенетического древа микроспоридий, содержащими виды родов Amblyospora и Parathelohania и ветвями древа кровососущих комаров (рисунок 1) показывает, что кроме совместного видообразования с последующей дивергенцией комаров-хозяев и микроспоридий-паразитов происходило заражение комаров микроспоридиями, ранее паразитировавшими у каких-то других организмов.
В пределах субклады микроспоридий из комаров р. Culex полное соответствие между филогениями этих комаров и паразитов рода Amblyospora является подтверждением совместного видообразования паразита и хозяина (рисунок 1).
С другой стороны среди близкородственных паразитов комаров Aedes/Ochlerotatus и Anopheles наблюдаются случаи, когда один вид комара служит хозяином для нескольких видов микроспоридий. Шесть видов рода Amblyospora (Amblyospora mavlukevia, A. salairia, A. shegaria, A. timirasia, А. cinerei) выделенные из Aedes cinereus, сгруппированы вместе, образуя небольшую субкладу в древе Amblyospora (рисунок 1), и за исключением А. timirasia, идентичность их последовательностей составляет более 95 %. Вероятно эти виды произошли от общего предка. Анализ ультраструктуры этих микроспоридий показал, что они сходны только наличием субэкзоспоры и анизофилярной полярной трубки у всех мейоспор. Так же виды Amblyospora hristinia и A. khaliulini выделенные из комаров Oehlerotatus communis (рису-
нок 1), имеют общего предка (последовательности идентичны на 96,8 %), несмотря на морфологические отличия. Amblyospora khaliulini генетически и морфологически наиболее близка к A. kolarovi (последовательности идентичны на 99 %). Эти виды выделены из разных хозяев (Ochlerotatus communis и Ос. punctor), которые генетически близки между собой. В этом случае очевидно совпадение генетических и морфологических признаков на уровне вида, как паразита, так и хозяина. Таким образом, на примере родственных видов микроспоридий рода Amblyospora из одного вида комара {Aedes cinereus, Ochlerotatus communis) мы наблюдаем дивергенцию одного предко-вого вида паразита на несколько независимо эволюционирующих видов в одном хозяине - кровососущем комаре. Очевидно, что эти виды микроспоридий произошли независимо от общего предка в пределах изолированных популяций своих хозяев.
Микроспоридии (Amblyospora bakcharia, A. bogashovia, A. jurginia, А. severinia, A. excrucii, Trichoctosporea pygopellita), выделенные из личинок комаров Ochlerotatus excrucians генетически разные виды, что доказывает их расположение в трех субкладах, содержащих виды паразитов из комаров Aedes/Ochlerotatus (рисунок 1). Согласно данным секвенирования уровень родства этих видов в среденем 88,4 %. Сравнение ультраструктурных особенностей этих видов микроспоридий показало, что они морфологически разные виды и различаются целым рядом ультраструктурных признаков.
Виды Amblyospora flavescens и Amblyospora kazankia, выделенные из Ochlerotatus diantaeus, (последовательности идентичные на 85,7 %), а также Amblyospora kolarovi и Amblyospora mocrushinia, выделенные из Ос. punctor (идентичность последовательностей равна 87,7 %), находятся далеко друг от друга в родственных кладах в филогенетическом древе в пределах большей группы Aedes/Ochlerotatus/Amblyospora (рисунок 1). Анализ морфологических особенностей показал, что они различаются между собой целой совокупностью морфологических признаков. Из комаров Ochlerotatus cataphylla нами выделено также 2 вида микроспоридий: Amblyospora baritia и Amblyospora rugosa, различающихся морфологически и генетически (идентичность последовательностей 89,3 %).
Очевидно, что у одного вида комара могут паразитировать несколько видов микроспоридий рода Amblyospora, имеющих значительные морфологические и генетические отличия. Эти виды паразитов не близкородственные, имеют разное происхождение, что свидетельствует в пользу перехода на один вид комара в разных точках его ареала потомков разных видов паразитов. Мы можем предположить, что они перешли к паразитированию на комарах независимо, в разное время, и в настоящее время используют в качестве промежуточных хозяев разные виды ракообразных. Так как сейчас отсутствует информация по филогении копепод как промежуточных хозяев, мы можем предполагать, что эти микроспоридии могли произойти от близкородственных предковых видов микроспоридий из копепод.
Анализ показывает, что близкородственные виды рода Amblyospora, находящиеся в одной субкладе, могут использовать в качестве хозяев генетически-отдаленные виды комаров (рисунок 1). В одном виде комара могут паразитировать микроспоридии, имеющие большое количество разнообразных ультраструктурных таксономических признаков; виды микроспоридий, сходных морфологически, могут иметь генетически отдаленных комаров-хозяев.
Данные по последовательностям мсрДНК микроспоридий из малярийных комаров показывают отсутствие у них узкой специфичности. Так, у Anopheles messeae паразитируют как близкородственные виды СParathelohania divulgate и P. tomski), так и неблизкородственный вид Senoma globulifera (идентичность последовательностей с P. divulgate и P. tomski 76,9 % и 76,7 %).
Три совершенно различных филогенетически и морфологически рода и вида микроспоридий {Andreanna caspii, Amblyospora chulymia и Novothelohania ovalae), обнаруженные у комара Ochlerotatus caspius, вероятнее всего отражают результат реальной смены хозяев, реагируя так на доступность (наличие) хозяев. Положение A. caspii и N. ovalae в основе филогенетического древа предполагает раннюю радиацию микроспоридий на эти виды микроспоридий вслед за радиацией комаров, подобно тому, что произошло с видами Parathelohania у анофелесов (Andreadis, Simakova et al., 2012; Симакова, 2013).
Это говорит о том, что смена хозяев в природе осуществляется чаще, чем ранее предполагалось, и наиболее вероятно происходит в случаях для близкородственных хозяев, наиболее соответствующих экологическим и/или физиологическим особенностям хозяев-предшественников (Andreadis et al., 2012).
Наши исследования показали, что микроспоридии кровососущих комаров могли эволюционировать от близкородственных предковых видов микроспоридий из копепод и фромировались как отдельная обособленная группа паразитов. В процессе эволюции паразитов - микроспоридий и их хозяев - кровососущих комаров наблюдается несколько путей эволюционного развития: видообразование паразитов совместно с видообразованием их хозяев (радиация видов комаров с радиацией видов микроспоридий); или при смене хозяев; а также при перемещении в один вид комара потомков разных видов паразитов; дивергенции одного предкового вида микроспоридий из одного вида комара на несколько независимо эволюционирующих видов паразитов; переходе к паразитированию на комарах микроспоридий, паразитировавших у других видов членистоногих.
42
ВЫВОДЫ
1. В ходе исследований микроспоридий комаров сем. Culicidae нами собрано и изучено 34 вида паразитов, отнесенных к 8 родам. Из них 33 вида и 5 родов признаны новыми для науки и эндемиками Западной Сибири. Видовое разнообразие микроспоридий - внутриклеточных паразитов кровососущих комаров на территории Западной Сибири обусловлено биоразнообразием и высокой численностью популяций насекомых-хозяев.
2. Выяснено, что для описания и идентификации микроспоридий самого многочисленного по числу видов рода Amblyospora достаточно таких ультраструктурных признаков как: строение секрета спорофорного пузырька, размеры зрелых спор, количество и соотношение толстых и тонких витков полярной трубки, толщина экзо- и эндоспоры, тонкое строение частей поля-ропласта.
3. В ходе исследований установлено, что наименее вариабельные (консервативные) признаки для видов рода Amblyospora - анизофилярное строение полярной трубки и толщина оболочки спор (наличие субэкзоспоры), наиболее вариабельные - число, соотношение и расположение витков полярной трубки. У микроспоридий из Aedes, Ochlerotatus полярные трубки длиннее, чем у видов из Culex. Виды, мейоспоры которых имеют тонкую оболочку (без субэкзоспоры), близкородственны с Trichoctosporea и располагаются с ней в одной субкладе.
4. Сравнительный анализ морфологических и молекулярно-генетических таксономических признаков у родов Andreanna, Amblyospora, Novothelohania, Parathelohania, Senoma и Trichoctosporea, паразитирующих в личинках кровососущих комаров на территории Западной Сибири, выявил отсутствие противоречий между положениями паразитов в морфологической системе и в кладе филогенетического древа, определенными этими таксономическими признаками.
5. На территории Западной Сибири микроспоридии родов Amblyospora и Trichoctosporea характеризуются триморфными циклами развития, в которых основные хозяева представлены моновольтинными комарами р. Oclerotatus, а промежуточные - копеподами p. Acanthocyclops. В циклах развития паразиты имеют три звена, обеспечивающие им длительное существование в неблагоприятных условиях: диапаузирующие копеподы, зараженные яйца и/или самки комаров. Жизненный цикл паразита синхронизирован с циклами развития хозяев и экологическими факторами региона, что позволяет микроспоридиям длительно существовать в популяциях хозяев, не вызывая эпизоотий.
6. Для большинства микроспоридий кровососущих комаров установлена гостальная специфичность - развитие паразита только в определенном виде комара. Рода Andreanna, Crepidulospora, Dimeiospora, Novothelohania и Senoma содержат только по одному виду микроспоридий, каждый из которых
поражает свой единственный вид комара-хозяина. У кровососущих комаров родов Aedes, Ochlerotatus может паразитировать несколько видов микроспоридий рода Amblyospora. Они могут иметь как общего предка, так и независимое происхождение. Но перемещения определенных родов и видов паразитов между таксонами комаров наблюдаются крайне редко.
7. Нами выявлено, что в процессе эволюции происходило усложнение строения спор как адаптации микроспоридий к развитию в организме хозяина. Для удлинения периода возможных контактов паразита с хозяином в водной среде у спор формировались толстые многослойные оболочки, имеющие складки, шипы, выросты, «хвосты», хорошо развитый мукокаликс. Появление толстых, прочных оболочек обусловило дальнейшее развитие аппарата экструзии: увеличение числа и уплощение пластин поляропласта, формирование длинных анизофилярных полярных трубок с большим количеством витков.
8. На основании данных мсрДНК показано, что большинство родов микроспоридий, паразитирующих у кровососущих комаров, {Amblyospora, Edhazardia, Trichoctosporea, Cidicospora, Culicosporella, Hyalinocysta, Andreanna, Hazardia, Senoma, Parathelohania, Novothelohania), представляют отдельную монофилетическую группу в древе микроспоридий, как близкородственные формы, имеющие общего предка. Рода Anncaliia и Vavraria входят в отдельные группы микроспоридий из кровососущих комаров.
9. Филогенетические исследования, проведенные нами, выявили наличие ко-эволюции паразита и хозяина, отмечаемое на родовом уровне. Виды рода Amblyospora, паразитирующие у комаров родов Aedes, Ochlerotatus и Culex, составляют отдельные монофилетические группы, как и их хозяева. Виды родов Amblyospora, Culicospora - паразиты комаров p. Culex, образуют обособленную группу как и виды родов Amblyospora и Edhazardia из Aedes, Ochlerotatus. Микроспоридии рода Parathelohania из комаров рода Anopheles составляют отдельную кладу, сестринскую кладе Amblyospora, также как их хозяева, малярийные комары - сестринская клада к группе кулицин. Hyalinocysta chapmani и Amblyospora ferocis представлены отдельными группами, сестринскими к кладе видов Amblyospora из комаров Aedes, Ochlerotatus и Culex, так же, как их хозяева Culiseta melanura и Psorophora ferox - сестринские группы к комарам рода Culex. Рода Senoma и Hazardia сестринские, так же, как и их хозяева - комары родов Anopheles и Culex.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Публикации в журналах списка ВАК:
1. Панкова Т.Ф., Исси И.В., Симакова A.B. Новые виды микроспоридий рода Amblyospora из кровососущих комаров семейства Culicidae // Паразитология. 2000. Т. 34, вып. 5. С. 420-427.
2. Симакова A.B., Панкова Т.Ф., Исси И.В. Crepidula beklemishevi gen.et sp. nov. и Dimeiospora palustris gen.et sp. nov. (Microspora: Amblyosporidae) - новые микроспоридии из кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) юга Западной Сибири // Паразитология. 2003. Т. 37, вып. 2. С. 145— 153.
3. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Микроспоридии p. Parathelohania (Microspora: Amblyosporidae) из комаров p. Anopheles (Diptera: Culicidae) юга Западной Сибири // Паразитология. 2004. Т. 38, вып. 5. С. 457-469.
4. Симакова A.B., Панкова Т.Ф., Исси И.В. Crepidulospora - новое название для младшего гомонима, (переоккупированного родового имени) Crepidula II Паразитология. 2004. Т. 38, вып.5. С. 477-478.
5. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Шесть новых видов микроспоридий p. Amblyospora (Microspora: Amblyosporidae) из кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) Западной Сибири // Паразитология. 2005. Т. 39, вып. 5. С 371-385.
6. Симакова A.B., Лукъянцев В.В. Описание нового типа поляропла-ста микроспоридий из копепод Mesocyclops leukartii (Copepoda: Cyclopida) // Цитология. 2007. том 49, №8. С. 652-655.
7. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Экология и эпизоотология микроспоридий малярийных комаров (Diptera: Culicidae) юга Западной Сибири // Паразитология. 2008. Т. 42, вып. 2, С. 139-149.
8. Миллер A.A., Симакова A.B. Использование метода ОТЕ-контрастирования ультратонких срезов на примере микроспоридий (Protozoa: Microsporidia)// Цитология. 2009. Т 51, № 9. С 741-747.
9. Симакова A.B., Лукьянцев В.В., Vossbrinck C.R., Andreadis T.G. Выявление Amblyospora rugosa и Trichoctosporea pygopellita (Microsporidia: Amblyosporidae), микроспоридий - паразитов кровососущих комаров, у Acanthocyclops venustus и Acanthocyclops reductus (Copepoda: Cyclopoidae), основанное на анализе малой субъединицы рибосомальной ДНК // Паразитология. 2011. Т.45, №2. С. 140-146.
Публикации в международных изданиях:
1. Simakova A.V., Pankova T.F., Tokarev Y.S., Issi I.V. Senoma gen. п., а new genus of microsporidia, with the type species Senoma globulifera comb. n.
(syn.. Issia globulifera Issi, Pankova, 1983) from the malaria mosquito Anopheles messeae Fall. // Protistology. 2005. V. 4, №2, P. 135-144.
2. Simakova A.V., Vossbrinck C.R., Andreadis T.G. Molecular and ultrastructural characterization of Andreanna caspii n. gen., n. sp. (Microsporidia: Amblyosporidae), a parasite of Ochlerotatus caspius (Diptera: Culicidae) // J. Invertebrate Pathology. 2008. 99 (3). P. 302-311.
3. Simakova A.V., Tokarev Y.S., Issi I.V. Pankovaia semitubulata gen. et sp. n. (Microsporidia: Tuzetiidae) from nymphs of mayflies Cloeon dipterum L. (Insecta: Ephemeroptera) in Western Siberia// European Journal of Protistology. 2009. №45(1), P. 13-20.
4. Simakova A.V., Tokarev Y.S., Issi I.V. Tuzetia dualis sp. n. (Microsporidia, Tuzetiidae) from the mayfly Cloeon dipterum L. (Insecta, Ephemeroptera) in Western Siberia // Protistology. 2009. V.6, № 2, P. 92-97.
5. Miller A.A., Simakova A.V. Application of Method of OTE Staining of Ultrathin Sections Based on Example of Microsporidia (Protozoa: Microsporidia) // Cell and Tissue Biology. 2010. №. 4 (1), P. 109-115.
6. Andreadis T.G., Simakova A.V., Vossbrinck C.R., Shepard J.J., Yurchenko Y.Y. Ultrastructural characterization and comparative phylogenetic analysis of new microsporidia from Siberian mosquitoes: Evidence for coevolution and host switching // J. Invertebrate Pathology. 2012, № 109 (1), P. 59-75.
Другие публикации по теме диссертации:
1. Панкова Т.Ф., Бурлак В.А., Васильева А.В. (Симакова А.В.), Jly-кьянцев В.В., Лукьянцев С.В., Миллер А.А., Сибатаев А.К. Изучение ультраструктуры, циклов развития и распределения в популяциях хозяев микроспоридий (Protozoa; Microsporidia) кровососущих комаров и низших ракообразных // Информационный бюллетень РФФИ. 1996. Т.4. Вып.4. С. 695.
2. Васильева А.В. (Симакова А.В.). Изучение низших ракообразных как альтернативных хозяев микроспоридий из кровососущих комаров юга Западной Сибири // Регуляция численности беспозвоночных и фитопатоге-нов. Новосибирск, 1997. С.69-73.
3. Панкова Т.Ф., Васильева А.В. (Симакова А.В.), Лукьянцев В.В. К изучению микроспоридий гидробионтов Томского Приобья // Паразиты и вызываемые ими болезни Сибири: Материалы 2 региональной паразитологи-ческой конф. Новосибирск, 1997. С. 90-91.
4. Симакова А.В., Панкова Т.Ф. Места выплода кровососущих комаров в водоемах г. Томска // Биоразнообразие: Материалы международной науч. конф., посвященной 110-летию начала регулярных зоологических исследований и зоологического образования в Сибири. Томск, 1998. С. 218219.
5. Pankova T.Ph., Lukiantsev V.V., Simakova A.V., Burlak V.A., Grigorjeva S.B., Rasskasova A.O. Microsporidiosis of hydrobionts in western
Siberia // Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia: Book of Abstracts Conf. 21-26 August, 2000. Novosibirsk, Russia. P. 271-273.
6. Панкова Т.Ф., Симакова A.B., Истраткина C.B., Панкина Т.М. Анофелогенные водоемы на территории г. Томска и его окрестностях // Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России: Материалы 2 Республ. научн. конф. Великий Новгород, 2002. С. 83-84.
7. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Основные особенности ультратонкой организации спор микроспоридий кровососущих комаров (Díptera, Culicidae) юга Западной Сибири // XII съезд Русского энтомологического общества ЗИН РАН: Тез. докл. 19-24 августа. Санкт-Петербург. 2002. С. 318-319.
8. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Распространение микроспоридий среди кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) юга Западной Сибири // XII съезд Русского энтомологического общества ЗИН РАН: Тез. докл. 19-24 августа. Санкт-Петербург. 2002. С. 319.
9. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Влияние антропогенной деятельности на развитие личинок кровососущих комаров в условиях Томского При-обья // Тез. Докл. Борок. 2002. С 15.
10. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Тонкая морфология микроспоридий кровососущих комаров юга Западной Сибири // Вестник Томского государственного университета (приложение). Томск. 2003. № 8. С. 205-208.
11. Прохорова М.Л., Панкова Т.Ф., Симакова A.B. К изучению жизненных циклов микроспоридий из кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) // Мат. конференции молодых учёных Томского государственного педагогического университета. 2004. С. 23.
12. Simakova A.V. Microsporidia of blood-sucking mosquitoes of Russia // First United Workshop on Microsporidia from Invertebrate and Vertebrate Hosts. Book of Abstracts Conf. 12-15 July Ceské Budëjovice, Czech Republic, 2004. P. 51.
13. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Микроспоридии p. Trichoctosporea (Microspora: Thelohaniidae) из кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) Западной Сибири // Вестник Томского государственного университета (приложение). Томск, 2004. № ю. С. 116-122.
14. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Биотопическое распространение микроспоридий (Protozoa: Microsporidia) кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) юга Западной Сибири // Материалы II межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока 15-20 сентября Новосибирск, 2005. С 193-195.
15. Симакова A.B. Ультраструктура поляропласта микроспоридий кровососущих комаров Сибири // XXI Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, июнь 2006. С. 269.
16. Симакова A.B., Панкова Т.Ф. Эпизоотология микросопоридиозов в природных популяциях малярийных комаров Западной Сибири // Всерос-
сийское совещание по проблемам изучения кровососущих насекомых, Санкт-Петербург, октябрь, 2006. С. 191-193.
17. Simakova A.V. Ultrastructural features of sporogony of some microsporidia parasitizing blood-sucking mosquitoes in Siberia // Protistology.
2007. V. 5, № 7. P. 72-73.
18. Симакова A.B., Миллер А.А. Ультраструктура оболочек зрелых спор микроспоридий из личинок комаров сем. Culicidae Сибири // XXII Российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, июнь
2008. Черноголовка, 2008. С.323.
19. Симакова А.В., Воссбринк Ч.Р., Андреадис Т.Г. Противоречивые данные по ультраструктуре и молекулярной филогении рода Amblyospora (Microsporidia: Amblyosporidae) и родственных изолятов микроспоридий из кровососущих комаров Сибири // IV Всероссийский съезд Паразитологиче-ского Общества, Санкт-Петербург, октябрь 2008. С. 146-149.
20. Миллер А.А., Симакова А.В. Сравнительный анализ ультраструктуры стадий развития и зрелых спор внутриклеточных паразитов - микроспоридий (Microsporidia: Amblyosporidae) при разных методах контрастирования// Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока 15-20 сентября. Новосибирск, 2009. С. 196-197.
21. Лукьянцев В.В., Симакова А.В., Воссбринк Ч.Р., Андреадис Т.Г. Изучение микроспоридий низших ракообразных (Copepoda, Cladocera) на территории Западной Сибири// Материалы III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока 15-20 сентября. Новосибирск, 2009. С. 175-177.
22. Симакова А.В. Специфичность паразито-хозяинных связей микроспоридий с кровососущими комарами сем. Culicidae // Сборник научных статей Международного симпозиума Паразиты Голарктики. 4—8 октября 2010. Петрозаводск, 2010. С. 91-93.
23. Симакова А.В., Андреадис Т.Д., Шепард Д.Д. Доказательство коэволюции паразитов - микроспоридий и их хозяев - кровососущих комаров // Материалы Международной молодежной конференции «Инфекционная патология членистоногих». Санкт-Петербург, март 2012. С. 61-62.
24. Симакова А.В. Положение микроспоридий кровососущих комаров в системах, основанных на морфологических и молекулярно-филогенетических признаках // V Всероссийский съезд Паразитологического Общества, Новосибирск, сентябрь 2013. С. 178.
Отпечатано на участке оперативной полиграфии Издательского Дома Томского государственного университета
Заказ № 51 от «21» октября 2013 г. Тираж 100 экз.
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Симакова, Анастасия Викторовна, Томск
ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
0520145023ч
На правах рукописи 1 -
Симакова Анастасия Викторовна
МИКРОСПОРИДИИ (MICROSPORIDIA) КРОВОСОСУЩИХ КОМАРОВ (DIPTERA: CULICIDAE) ЗАПАДНОЙ СИБИРИ (ВИДОВОЙ СОСТАВ, ЭКОЛОГИЯ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ)
03.02.04 - зоология
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант д.б.н. А.К. Сибатаев
Томск - 2013
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение 4
Глава 1. Микроспоридии кровососущих комаров (обзор литературы) 12
1.1. Видовой состав и жизненные циклы микроспоридий комаров
сем. Си1кпс1ае 16
1.2. Экология и эпизоотология 24
1.3 .Современные подходы к систематизации микроспоридий 43
Глава 2. Материал и методы исследований 50
2.1. Физико-географическое описание района исследований 50
2.2. Материал 57
2.3. Методы исследований 5 8
2.3.1. Методы полевых исследований 59
2.3.2. Методы лабораторных исследований 59 Глава 3. Систематический обзор микроспоридий кровососущих комаров Западной Сибири (морфологические и молекулярно-филогенетические аспекты) 72
3.1. Видовой состав микроспоридий 72
3.2. Морфологические и молекулярно-генетические обоснования описания новых родов и видов 122
Глава 4. Жизненные циклы и пути передачи микроспоридий кровососущих комаров в условиях Западной Сибири 143
4.1. Изучение трансовариальной передачи 144
4.2. Экспериментальное изучение жизненных циклов и поиск промежуточных хозяев микроспоридий родов АтЫуозрога, Тп-скос^5рогеа,РагШке1оката из кровососущих комаров 151
4.3. Описание полного жизненного цикла микроспоридий родов Ат-Ыуоврога, Тпскос^рогеа на основании данных морфологии, ДНК-анализа и экологии на территории Западной Сибири 161
4.4. Изучение жизненного цикла микроспоридий рода Senoma 174 Глава 5. Экологические и эпизоотологические аспекты паразитирова-ния микроспоридий у комаров сем. Culicidae на территории Западной Сибири 182
5.1. Специфичность микроспоридий 182
5.2. Симптомы заболевания и локализация паразита в теле хозяина 195
5.3. Биотопическое распространение 197
5.4. Сезонная и многолетняя динамика микроспоридиозов 210 Глава 6. Молекулярная филогения микроспоридий комаров сем.
Culicidae 222
6.1. Положение микроспоридий кровососущих комаров в системах, основанных на морфологических и молекулярно-генетических признаках 223
6.2. Обоснование ко-эволюции микроспоридий и их хозяев комаров сем. Culicidae 245
6.3. Пути эволюции микроспоридий кровососущих комаров 250 Заключение 262 Выводы 264 Список литературы 267 Приложение 1 300 Приложение 2 323 Приложение 3 357 Приложение 4 370
ВВЕДЕНИЕ
Микроспоридии - это тип облигатных внутриклеточных спорообразующих паразитов. Они представляют собой одноклеточные эукариотические микроорганизмы, которые имеют минимизированные клетку и геном, и относятся к сестринской по отношению к грибам группе (Vavra, Luces, 2013).
Микроспоридиям свойственны разнообразие жизненных циклов и широкий охват в качестве хозяев почти всего царства животных, от простейших до позвоночных, включая млекопитающих, в том числе и человека, за исключением типично морских Spongia и Echinodermata. Самое большое число видов зарегистрировано у насекомых; наиболее разнообразны они у массовых видов - вредителей леса и культурных растений, а также у кровососущих насекомых (Исси, 1986; Воронин, 1999).
В настоящее время эти паразиты обнаружены у комаров сем. Culicidae 13 родов на всех континентах. Из комаров описано более 150 видов микроспоридий, относящихся к 25 родам, признанным валидными. Последовательности нуклеотидов мер ДНК получены для 14 родов и 47 видов.
Микросопридии из кровососущих комаров имеют различные жизненные циклы от простых до сложных с образованием одного, двух, трех, четырех типов спор, различающихся морфологически и функционально. Заражение организма происходит перорально, трансовариально или путем аутоинвазии (Andreadis, 2007).
Рода, имеющие простой жизненный цикл с пероральной передачей спор, демонстрируют широкий круг хозяев, в то время как рода со сложными жизненными циклами, как правило, узкоспецифичны.
Микроспоридии способны вызывать массовую гибель личинок комаров, и, следовательно, рассматриваются как потенциальные агенты биологического контроля по снижению численности кровососов.
Данные паразиты имеют медицинское и ветеринарное значение. В кишечнике личинок комаров была обнаружена микроспоридия Anncaliia algerae Исси, Крылова, Николаева, 1993 (прежде Nosema и Brachiola) (Franzen et al., 2006), заражающая насекомых других отрядов и человека, вызывая при этом серьезные заболевания. Пути передачи ее человеку пока не известны. Возможно, комары являются переносчиками этой инфекции при кровососании.
Вместе с тем, микроспоридии подавляют развитие малярийного плазмодия при совместном паразитировании, и, следовательно, косвенно способствуют снижению зараженности малярией как комаров, так и человека (Anthony et al., 1972; Ward, Savage, 1972; Koella, Zaghloul, 2008; Koella et al., 2009).
В связи с этим углубленное изучение видового состава, жизненных циклов, путей передачи, экологии и эпизоотологии, а также ультраструктурных особенностей и молекулярной филогении микроспоридий кровососущих комаров, рассмотрение филогении микроспоридий с позиций их ко-эволюции с хозяевами, исследование на микроспоридиоз гидробионтов, развивающихся совместно с комарами, являются необходимыми и актуальными.
В настоящее время изучение микроспоридий перешло на качественно новый уровень исследований с использованием электронно-микроскопических и молекулярно-генетических методов, открывающих огромное разнообразие в особенностях строения трофических стадий и спор, в характере их взаимоотношений с клеткой хозяина, в рассмотрении паразитов с позиции коэволюции с хозяином, смены хозяев и независимого видообразования. Уникальные свойства этих облигатных внутриклеточных паразитов из кровососущих комаров могут рассматриваться не только в качестве модельных объектов теоретической паразитологии, в том числе и в связи с их значительным биоразнообразием, но и потенциальных агентов
биологического контроля злостных кровососов, что послужило основанием для проведенных нами исследований.
Цель исследования: выявить и описать на основе ультраструктурных особенностей и молекулярно-генетических данных виды микроспоридий, паразитирующие в комарах сем. Culicidae Западной Сибири, изучить их жизненные циклы и особенности паразито-хозяинных отношений, связать филогенетические взаимоотношения выявленных видов и закономерности их ко-эволюции с насекомыми-хозяевами.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить распространение микроспоридий в популяциях кровососущих комаров, описать обнаруженные виды с использованием электронно-микроскопическических и молекулярно-генетическиих методов.
2. Оценить степень корреляции морфологических критериев старой системы и молекулярно-генетических признаков филогенетической системы при описании новых видов и родов микроспоридий.
3. Определить положение микроспоридий кровососущих комаров в системах, основанных на морфологических и молекулярно-генетических признаках.
4. Изучить жизненные циклы микроспоридий из комаров сем. Culicidae с особым вниманием к особенностям развития триморфных микроспоридий родов Amblyospora, Trichoctosporea из моновольтинных комаров Aedes, Ochlerotatus в условиях Западной Сибири.
5. Дать анализ паразито-хозяинных отношений микроспоридий и кровососущих комаров на организменном и популяционном уровнях.
6. Рассмотреть филогению микроспоридий и кровососущих комаров с позиции ко-эволюции, возможности смены хозяев и независимого видообразования.
Научная новизна работы. Впервые проведено сравнение ультраструктурных и молекулярно-генетических таксономических признаков при описании новых родов и видов микроспоридий из кровососущих комаров
и доказано их соответствие друг другу. На территории Западной Сибири выделено и изучено 34 вида микроспоридий, относящихся к 8 родам, из них 33 вида и 5 родов впервые описаны как новые для науки. Выявлены закономерности жизненного цикла для паразитов родов АтЫуоярога и Тпскос^рогеа из моновольтинных комаров рода ОсЫего1Шш и промежуточных хозяев - копепод рода Асап№осус1ор8 в условиях Западной Сибири. Для микроспоридий рода ТпскоМоярогеа впервые установлен полный АтЫуозрога-подобный цикл развития с наличием вертикальной и горизонтальной передач и с участием промежуточных хозяев - низших ракообразных. Впервые проведен сравнительный анализ положения микроспоридий из комаров сем. СиНЫёае в системах, основанных на морфологических и молекулярно-генетических признаках. Доказано наличие ко-эволюции основных групп микроспоридий и их хозяев - кровососущих комаров на родовом уровне, кроме того, впервые установлена возможность смены хозяев, а также другие пути эволюции этих паразитов.
Теоретическое значение. Использование нами современных электронно-микроскопческиих и молекулярно-генетических методов для изучения микроспоридий из комаров сем. СиНс1с1ае позволило не только установить широкое морфологическое многообразие данных паразитов, что обусловлено спецификой хозяев - амфибионтных насекомых, но и точно определить положение в филогенетической системе и степень родства тех или иных микроспоридий. За исключением родов АппсаШа и Va.vra.ia, имеющих независимое происхождение, доказано, что микроспоридии из кровососущих комаров, для которых получены данные последовательностей нуклеотидов консервативных участков генов мсрДНК, составляют отдельную монофилетическую группу в древе микроспоридий, они представлены близкородственными формами и имеют общего предка. Установлено, что наиболее примитивные формы, а также паразиты, развивающиеся в теле хозяина без контакта с внешней средой, образуют простоустроенные споры. Далее в процессе эволюции у спор развиваются толстые многослойные
с
оболочки для более длительного сохранения жизнеспособности во внешней среде, усложняется строение аппарата экструзии для надежного проникновения зародыша в клетку хозяина: образуется многочастный поляропласт, обязательным компонентом которого служит часть из плотноуложенных ламелл; полярная трубка становится типично анизофилярной, количество ее витков увеличивается.
Для большинства изученных к настоящему времени видов микроспоридий установлена узкая специфичность, когда круг хозяев ограничен одним, реже двумя видами одного рода. Тем не менее, вопреки прежним представлениям, нами зафиксировано, что один вид комара могут заражать микроспоридии нескольких родов и видов, которые могут быть как близкородственнми, так и имеющими разное происхождение.
Впервые установлены ко-эволюционные взаимоотношения паразит-хозяин. Установлена тесная экологическая сопряженность микроспоридий и их хозяев - кровососущих комаров. Показано, что сложные жизненные циклы паразитов, имеющих горизонтальную и вертикальную передачу и использующих в качестве промежуточных хозяев копепод, синхронизированы с циклами развития хозяев и экологическими факторами региона. Потеря или приобретение какого-либо звена в сложных полиморфных жизненных циклах, скорее всего, служит адаптацией к экологическим условиям хозяев для увеличения вероятности встречи микроспоридий с подходящими хозяевами, но не является свидетельством филогенетического родства. Большинство изолированных нами родов и видов микроспоридий - эндемики, встречающиеся только на территории Западной Сибири.
Исходя из положения о сопряженном развитии микроспоридий и их хозяев, нами показано наличие ко-эволюции микроспоридий и кровососущих комаров на родовом уровне.
Практическое значение. В результате нашей работы установлено наличие различных видов микроспоридий у массовых форм кровососущих комаров, а также случаи высокой зараженности хозяев в природных
популяциях, что позволяет рассматривать этих паразитов в роли регуляторов численности комаров. Полученные нами данные о видовом составе, жизненных циклах, специфичности и эпизоотологии микроспоридий ценны и необходимы для разработки биологических методов снижения численности комаров сем. СиНаёае на территории Западной Сибири и могут быть использованы при планировании мероприятий по борьбе с кровососами.
Полученные нами новые данные о распространении микроспоридий, сложных жизненных циклах паразитов у моновольтинных комаров, данные по ультраструктуре, молекулярной филогении и эволюции, а также возможности использования морфологических и молекулярно-генетических признаков в систематике и таксономии могут быть использованы в учебных курсах.
Собранная нами в ходе работы постоянная коллекция из 34 видов микроспоридий, включающая мазки, микрофотографии и замороженные образцы ДНК, представляет ценность для изучения видового состава, морфологии, молекулярной филогении и систематики этих паразитов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Статус микроспоридий таких родов как АтЫуоярога, АппсаШа, Апс1геаппа, СиИсоБрога, СиНсозрогеИа, ЕсПаагагсНа, НагагсНа, Нуа1тосу$1а, Иоуо1ке1оката, РагШке1оНата, Тпскос^рогеа, Уаугша, в системах, построенных на морфологических (ультраструктурных) или молекулярно-генетических признаках, тождественен и не противоречит одно другому.
2. Ультраструктура спор большинства микроспоридий комаров сем. СиНс1с1ае не может быть надежным критерием для определения таксономического статуса при идентификации родов и видов.
3. Полные триморфные жизненные циклы микроспоридий родов АтЫуоБрога и ТпскосШрогеа синхронизированы с циклами развития хозяев -моновольтинных комаров рода ОсЫе^Шш и низших ракообразных -копепод рода АсаМкосусЬря, встречающихся на протяжении всего сезона (адаптация к среде первого порядка); а также с экологическими
особенностями региона - Западной Сибири (адаптация к среде второго порядка).
4. Основные направления эволюции микроспоридий кровососущих комаров: совместное видообразование паразита и хозяина (ко-эволюция); смена паразитом хозяина; перемещение в один вид комара потомков разных видов паразитов; дивергенция одного предкового вида микроспоридий из одного вида комара на несколько независимо эволюционирующих видов паразитов; переселение на комаров микроспоридий, паразитировавших у других видов членистоногих.
5. Микроспоридии кровососущих комаров возникли как обособленная группа паразитов, эволюционировавшая от паразитов низших ракообразных, представляющих собой не только промежуточных хозяев для видов родов Amblyospora, Hyalinocysta и Parathelohania, но и служащих хозяевами таксонов, сестринских к Amblyosporidae.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту А.К. Сибатаеву, за ценные советы в ходе работы. Автор особо признателен Т.Ф. Панковой (ТГУ, г. Томск) за постоянную и неоценимую помощь в исследованиях и обсуждении результатов. И.В. Исси (ВИЗР, г. Санкт-Петербург) за конструктивную критику, помощь в определении микроспоридий и обсуждении результатов; В.Н. Стегнию (ТГУ, г. Томск) за ценные советы в ходе работы. Автор искренне благодарит всех, кто помогал во время полевых и лабораторных исследований: A.A. Миллера (НПО «Вирион», г. Томск), Е.В. Моржину (ВИЗР, г. Санкт-Петербург) за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований; В.В. Лукьянцева (ТГУ, г. Томск), А.К. Сибатаева (ТГУ, г. Томск), Ю. А. Юрченко (ИСиЭЖ, г. Новосибирск) за помощь в сборе и определении материала; Т. G. Andreadis, С. F. Vossbrinck (Agricultural Experiment Station, CT, USA) за проведение молекулярно-генетических исследований и участие в обсуждении результатов. Автор благодарит заведующего кафедры зоологии
беспозвоночных В.Н. Романенко за ценные советы по структуре и оформлению диссертации, а также всех сотрудников кафедры.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 96-0450264, 97-04-63016, 98-04-63034, 07-04-00468-а, 08-04-01854-э_б, 08-04-05052-б, 08-04-10049-к, 09-04-05028-6, 09-04-10055-к, 10-04-10025-к, ФЦП «Интеграция», ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007— 2013 годы».
ГЛАВА 1. МИКРОСПОРИДИИ КРОВОСОСУЩИХ КОМАРОВ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Микроспоридии - одноклеточные эукариоты, все они являются внутриклеточными облигатными паразитами.
В настоящее время описано более 140 родов данных паразитов, наибольшее количество видов выделено из членистоногих и рыб.
Трофические стадии микроспоридий имеют простое строение, их клетки развиваются в прямом контакте с цитоплазмой клетки хозяина, у них отсутствуют митохондрии, лизосомы и жгутики. В свою очередь споры имеют сложное строение и представляют собой единственную стадию, способную существовать вне клетки хозяина. Их отличают небольшие размеры (2-20 мкм), толстая оболочка (состоящая из экзоспоры, эндоспоры и плазматической мембраны) и наличие уникального комплекса органелл для заражения клетки хозяина - аппарата экструзии. Он состоит из
-
Симакова, Анастасия Викторовна
-
доктора биологических наук
-
Томск, 2013
-
ВАК 03.02.04
- Микроспоридии (Protozoa: Microsporidia) кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) лесной зоны юга Западной Сибири
- Кровососущие комары (Diptera, Culicidae) антропогенных территорий юго-востока Западной Сибири на примере городов Томска и Стрежевого
- Кровососущие комары (Diptera, Culicidae) юга Тюменской области
- Диагностические признаки комаров рода Aedes фауны России (Diptera, Culicidae)
- Фауна и экология двукрылых насекомых комплекса гнуса на территориях, прилегающих к Финскому заливу
