Полиамины и лизосомы как система опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста

Сяткин, Сергей Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиамины и лизосомы как система опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Полиамины и лизосомы как система опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста"

?Г б од 1 Д':Н

На правах рукописи

Сяткнн Сергей Павлович

ПОЛИАМИНЫ И ЛИЗОСОМЫ КАК СИСТЕМА ОПОСРЕДОВАННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ХИМИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ ПРОЦЕССОВ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

(03.00.04-биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена на кафедрах биохимии и патологической физиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Научные консультанты -

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Т.Т.Березов,

академик МАН ВШ, член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.А.Фролов

Официальные оппоненты —

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Е.С.Севернн

доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Петрович доктор биологических наук, профессор В.Н.Малахов Ведущая организация -

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « 4$» делсЛ^Я. 1998г. в^часов на заседании диссертационного совета'Д 053.12.02 в Российском Университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке

Российского Университета дружбы народов

по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «11» Нб> Л. 1998г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

В.Э.Торбек

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Молекулярные механизмы регуляции процесса клеточной пролиферации и роста исследуют с помощью самых различных подходов и очень интенсивно (Дж.Дингл, 1980; Н.К.Бердинских.С.П.Залеток, 1987; Т.А.Короленко, 1990; К.МзЬюка, 1996). Тем не менее, на данный момент многое в этой центральной проблеме современной биологии и медицины остается до конца не изученным. В частности, это касается возможности влиять на этот процесс опосредованно через лизосомную и полиаминовую системы. Поэтому разработка такого подхода стала целью настоящего исследования

В целом, данная работа базируется на концепциях, разрабатываемых академиками Т.Т.Березовым и В.А.Фроловым.- Так, в течение последних двух десятилетий на кафедре патологической физиологии под руководством В.А.Фролова изучается роль лизосом в инициации процессов клеточной репарации, регенерации и гипертрофии тканей. Хорошо известны также представления, развиваемые Т.Т.Березовым, о биологическом значении снижения или полной утрате клетками опухоли ряда регуляторных функций ферментов азотистого обмена вообще и обмена аминокислот, в частности.

Выбор лизосом и полиаминов (ПА) в качестве объекта исследований был обусловлен также следующими обстоятельствами. Так, индукция ор-нитиндекарбоксилазы (ОДК) - ключевого фермента синтеза ПА, оказалась одним из самых ранних молекулярных проявлений активирования метаболизма клеток, готовящихся к делению, росту и дифференцировке. Более того, окисленные до иминоальдегидов ПА ингибировали рост асцитного рака Эрлиха, инактивировали вирус гриппа и вирус болезни Ые\УсаБиа и БелсЫ, подавляя синтез белка и нуклеиновых кислот. Существует тесная взаимосвязь между синтезом ПА и процессами роста и дифференцировки злокачественных клеток, поскольку рост и пролиферация обеспечиваются высоким уровнем синтеза ПА, а переход клеток от пролиферации к дифференциации сопровождается снижением активности ОДК и внутриклеточной концентрации ПА. Общая направленность катаболизма азотистых веществ в сторону ослабления в пролиферирующих клетках (Т.Т.Березов, 1969) позволяет предположить, что в клетках опухолей два промежуточных процесса (усиленный синтез и ослабление катаболизма) направлены на поддержание высокой внутриклеточной концентрации ПА, которая необходима для быстрого роста и пролиферации опухолевых клеток (С.П.Ся-ткин, Т.Т.Березов, 1982). Однако молекулярные механизмы и значение изменений активности ферментов обмена ПА в опухолевых клетках для процессов пролиферации и дифференцировки в настоящее время полностью

еще не раскрыты и нуждаются в детальном исследовании.

Гидролитические ферменты лизосом также вовлекаются в плейоти-пический механизм индукции и регуляции пролиферации клеток. В низких концентрациях эти ферменты играют роль митогенных факторов. Лизосо-мотропные агенты, увеличивающие проницаемость лизосомных мембран способны стимулировать клеточную пролиферацию. При стабилизации лизосомных мембран тормозится синтез ДНК и митотическая активность. Лизосомотрошше амины ингибируют процесс митогенеза, индуцированный факторами роста. Предполагают, что ПА служат модуляторами мембранной текучести. Опосредованно через регуляцию плавления мембран ПА ,влияют, вероятно, на процессы клеточного роста и деления. Уменьшение концентрации ПА в клетках, приостанавливает деление и приводит к накоплению большого количества вакуолей. При добавлении ПА в культураль-ную среду вакуоли исчезают и клетки возобновляют деление. Вероятно, существует взаимосвязь между плавлением мембран и содержанием ПА в клетке при стимуляции их деления. Таким образом, ПА и лизосомы вовлечены в процессы регуляции клеточной пролиферации и роста путем прямого или опосредованного влияния на скорость синтеза нуклеиновых кислот и белка. Однако взаимосвязь и характер взаимодействия между этими биогенными поликатионами и лизосомным аппаратом почти не изучены.

Не менее важным аспектом этой проблемы следует признать разработку методических подходов к химическому регулированию обмена ПА и состояния лизосом. Так, при применении индукторов дифференциации наблюдали снижение внутриклеточного содержания путресцина (Пут) и спе-рмидина (Сд). Дифференцировка в эритролейкозных клетках мышей, вызванная диметилсульфоксидом и гексаметиленбисацетамидом (индукторами этого процесса), развивается на фоне снижения внутриклеточной концентрации этих ПА при применении дифторметилорнитина (ДФМО). Таким образом, ингибиторы биосинтеза ПА вызывают дифференцировку опухолевых клеток, а также подавляют рост и вызывают экспрессию дифференцированных функций (меланогенез) в растущих в культуре клетках меланомы мышей. Обработка культуры Ь 1210 аналогом Пут (2,5- диамино -3-гексином) вызывает быстрый, морфологически определяемый эффект вакуолизации, который возможно связан с ингибированием клеточного роста. Очевидно, что методология поиска и подходов разработки новых перспективных химиотерапевтических средств, обладающих направленным действием с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки, в частности обмена ПА и состояния лизосомного аппарата. Это позволит корректировать синтез и осуществлять конструирование новых противоопухолевых агентов.

Таким образом, данная работа проводилась на стыке двух биологических дисциплин: биохимий и патологической физиологии. Это определило специфику экспериментальных методов и подходов. Главной задачей было правильно выбрать ключевые показатели структурной целостности лизосом и обмена ПА и разработать высокочувствительные, специфические, ¡ш вместе с тем доступные для технического исполнения методы количественного анализа этих показателей. Отсутствие таких методов сильно затрудняло и делало недоступным исследование в этом направлении.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы была разработка принципов и методических подходов к химической регуляции, опосредованной через полиамииовую и лизосомную систему, процессов клеточной пролиферации и опухолего роста. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новые и модифицировать известные в литературе экспериментальные методы количественного анализа основных компонентов обмена ПА и показателей структурной целостности изолированных лизо-сом.

2. Изучить прямое влияние физико-химических факторов, лежащих в основе формирования ряда патологических состояний организма, на структурную целостность изолированных лизосом.

3. Исследовать механизмы регуляции обмена ПА в тканях с высокой скоростью пролиферации.

4. Провести скрининг химических соединений органического синтеза (аналогов ПА) в качестве потенциальных антипролиферативных агентов в модельных бесклеточных тест-системах из тканей с высоким митотичес-ким индексом.

Научная новизна

Разработаны модификации высокочувствительных и специфических микрометодов количественного анализа активности ди- и полиаминокси-даз, орнитиндекарбоксилазы (ОДК) (спектрофотометрический и флуороме-трический), кислой фосфатазы, лизосомных гликозидаз (общая, доступная, латентная и неседиментируемая формы активности), концентрации ПА (путресцина, спермидина и спермина), белка (в пробах с повышенным содержанием липо- и гликопротеинов), структурной целостности изолированных ли;осом: спектрофогомегрический (осморезис тентность, термотоле-ршпность и кисло!«устойчивость) и ферментативный (показатели целостности и лабилизации лизосомных мембран), а также модельные тест-системы для оценки прямого действия химических соединений на состояние изолированных лизосом и скорость обмена ПА (бесклеточные и клеточные системы).

Показана возможность прямого лабилизируещего действия на лизо-

сомы физико-химических факторов внутриклеточной среды. Полученные результаты подтверждают предположение о роли лизосом как об одном из ключевых звеньев молекулярных механизмов формирования ряда патологических состояний организма человека и животных, в основе которых лежит генерализованная гипертермия (ожоговая болезнь, тепловое поражение) и гипотермия (консервация тканей, обморожение), а также изменение внутриклеточного рН (ишемия и реоксигенация органов, опухолевый рост) и осмотического давления (отравление лизосомотропными химическими соединениями, перегрузка лизосом осмофильными веществами, химический канцерогенез).

Ди- и ПА тормозят лизис лизосом, вызванный сочетанным действием 1°(50°С), рН7.0 и п (0.75МПа) инкубационной среды, оказывая протекторное действие на мембраны лизосом.

Механизмы регуляции уровней ПА в тканях при нормальной и «патологически» ускоренной пролиферации различны. Повышение концентрации ПА и их аккумуляция при опухолевом росте обусловлено не столько повышением скорости биосинтеза, как это имеет место при регенерации в печени, сколько угнетением распада этих поликатионов. Снижение скорости окислительного дезаминирования ПА при гепатоканцерогенезе, вероятнее всего, является первичным, в то время как повышение скорости декар-боксилирования можно рассматривать как результат дисдифференцировки трансформированных гепатоцитов. Ди- и полиаминоксидазы, регулируя уровни ПА в животном организме, могут оказывать прямое или опосредованное влияние на процесс усиленной клеточной пролиферации, в том числе на опухолевый рост. Активность же самих ферментов на ранних этапах печеночной малигнизации может регулироваться высокими концентрациями ПА (субстратное ингибирование) и недостатком витамина Вб (экстренный тип регуляции). В заключительную фазу злокачественного перерождения регуляция активности диаминоксидазы (ДАО) может осуществляться на генетическом уровне путем прекращения синтеза апофермента (хронический тип регуляции).

Выдвинуто предположение, что ПА способны оказывать прямое и опосредованное, в частности через лизосомы, регуляторное влияние на процессы клеточной регенерации, пролиферации и роста.

Разработана система показателей структурного состояния лизосом и обмена ПА для количественной оценки регуляторных, антипролифератив-ных свойств химических соединений. Исследованы 26 новых веществ органического синтеза и два известных ингибитора биосинтеза ПА [дифтор-метилорнитин и метилглиоксальбис(гуанилгидразон)]. Разработанные тест-системы проявили высокую степень чувствительности к действию этих ингибиторов так же, как и Ь-клетки. Воздействие тестируемых веществ на

скорость синтеза Пут и ПА в системах из регенерирующей и опухолевой ткани различалось по эффективности и носило избирательный характер. Это указывает на разбалансированность з опухолевой ткани процесса поэтапного синтеза ПА и, вероятно, обусловлено изменениями в структуре и каталитических свойствах полиаминсинтезирующих ферментов. Высокая антипролиферативная активность тестируемых веществ была связана с такими особенностями их структуры, как наличие терминальной ОН-группы, длина алифатической цепи, присутствие остатков урацила.

Изменения в содержании ПА предшествовало моменту появления первичных гепатом при гепатоканцерогенезе, а также торможению скорости роста опухолевых Ь- и СаОу клеток в культуре ткани под действием ингибиторов синтеза ПА. Это подтверждает предположение о первичности изменений в обмене ПА в отношении процесса неопластической трансформации тканей.

Теоретическая ценность работы

Сформулировано, приоритетное направление по изучению направленного воздействия на состояние лизосом и обмен ПА с помощью химических соединений с целью регуляции процессов клеточной репарации, регенерации, пролиферации и роста.

Результаты скрининга химических соединений на разработанных модельных тест-системах для оценки их действия на состояние лизосом и обмен ПА могут служить теоретической базой для разработки критериев целенаправленного синтеза веществ, наделенных дротивоопухолевой активностью.

Практическая ценность работы

По результатам работы получены 12 авторских свидетельств и два акта внедрения изобретений. Высказано предположение о целесообразности применения ПАО в энзимотерапии опухолей. Положительный эффект при этом будет обусловлен устранением эссенциальных (т.е. ПА) факторов роста и образованием веществ с цитостатическим действием: иминоальде-гиды и Н2О2. Определение активности ДАО и ПАО может иметь диагностическое значение при оценке степени неопластической трансформации ткани. ПА участвуют в реализации антипролиферативного действия ДФМО и МГБГ и могут служить биохимическими маркерами эффективности такого действия для новых канцеростатиков. Показано, что потенциальные индукторы дифференцировки и (или) ингибиторы роста опухолевых клеток должны быть одновременно наделены способностью существенно снижать как суммарное содержание ди- и полиаминов, так и отношение Сд/См и уровень Сд до критического уровня (70%). Из числа исследованных соединений этим требованиям в большей степени удовлетворяли вещества 769 и 1694 из группы инденопиридинов, I, IV и V из числа алифа-

тических оксиамино-аналогов и бис(урацилил)-алкилдиамины (VII, VIII и IX). Последние три вещества были существенно эффективнее ДФМО. Это позволяет рекомендовать их для дальнейшего фармакологического исследования в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов.

Корреляционный анализ связи проявляемой активности тестируемых веществ в клеточной и бесклеточной тест-системах служит обоснованием возможности использования бесклеточных тест-систем вместо культуры ткани опухолевых клеток для первичного отбора и прогнозирования малотоксичных веществ с антипролиферативными свойствами. Это позволит существенно съэкономить время, трудовые и материальные ресурсы и повысит производительность труда.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработано приоритетное направление по изучению принципов химической регуляции, опосредованной через лизосомную и полиаминовую системы, процессов клеточной пролиферации и роста с помощью оригинальных количественных показателей состояния лизосом и обмена ПА на фоне действия потенциальных канцеростатиков.

2. Исследования термотолерантности, осморезистентности и кислотоус-тойчивости суспензии изолированных лизосом показали возможность прямого регуляторного действия физико-химических факторов внутриклеточной среды (t°C, тс и рН) на структурную целостность лизосом и, следовательно, возможность влияния на патогенез заболеваний, у которых реализация действия патогенетических факторов связана с участием лизосомного аппарата, в частности, при опухолевом росте и химическом канцерогенезе.

3. ПА в диапазоне физиологических значений концентраций оказывают регуляторное.действие на структурное состояние лизосом и, вероятно, могут служить центральным звеном в реализации регуляторных воздействий опосредованно через лизосомы в тканях с усиленной клеточной пролиферацией (регенерирующей, малигнизирующей, опухолевой), в которых уровни ПА специфически повышены.

4. Регуляция уровней ПА в тканях с контролируемым процессом клеточной пролиферации (репарация, регенерация) осуществляется за счет по-лиамин-синтезирующих ферментов, а в тканях с бесконтрольным клеточным делением и ростом (опухолевые) за счет ферментов окислительного дезаминирования (ДАО и ПАО).

5. Разработанные модельные тест-системы проявили достаточную чувствительность для проведения количественной оценки регуляторных свойств химических соединений и позволили выявить из числа исследованных веществ соединения с сильными свойствами как активаторов, так и ингибиторов процесса клеточной пролиферации. В частности, бис(урацил-ил)-алкилдиамины действовали как потенциальные индукторы дифферен-

цировки и ингибиторы роста опухолевых клеток и превосходили по эффективности известные канцеростатики: дифторметилорнитин и метилглиок-саль-бис(гуанилгидразон).

Связь исследований с научной программой Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований следующих научных программ. Комплексная научно-техническая программа ГКНТ «Разработка эффективных методов воздействия на молекулярные структуры лизосомных мембран различных типов клеток животных и человека», шифр 0.74.05, № 300008. Программа «Каталитические и биологические свойства ферментов катаболизма аминокислот (лизин, орнитин, метионин, глутамин, аспарагин) как основа для разработки противоопухолевых агентов», № 305008. Проект № 4-62 «Химические основы регуляции биокаталитических процессов метаболизма аминокислот в нормальной и опухолевой клетке» по приоритетному направлению ГКНТ «Инженерная энзимология». Всесоюзная программа по разработке новых противоопухолевых препаратов по направлению «Поиск новых мишений для химиотерапии злокачественных новообразований, направленный синтез и выделение из природных источников новых противоопухолевых веществ с биологическим тестированием».

Апробация работы Отдельные фрагменты диссертационной работы были представлены для обсуждения на семинарах, совещаниях, конференциях, съездах и симпозиумах: Всесоюзный симпозиум «Энзимологические исследования при некоторых патологических процессах» (Волгоград, 1977), Всесоюзный Симпозиум «Регуляция активности генов и ферментов нормальных и опухолевых клеток» (Москва, 1979), Межвузовская конференция молодых ученых «Механизмы клеточной и функциональной регуляции» (Москва, 1979), XI Международный биохимический конгресс (Торонто, Канада, 1979), Всесоюзный симпозиум (Псков, 1980), 6-й Объединенный симпозиум биохимических обществ ГДР и СССР (Таллин, 1981), Международная конференция по полиаминам (Будапешт, Венгрия, 1984), Третий Всесоюзный симпозиум с международным участием «Структура и функции лизо-сом» (Москва, 1986), V Всесоюзная научная конференция «Проблемы и перспективы ферментного катализа» (Москва, 1987), 1-й Международный конгресс «Терапия аминокислотами и их аналогами» (Вена, Австрия,

1989), 6-й Европейский симпозиум по органической химии (Белград, Югославия, 1989), 15-й Международный раковый конгресс (Гамбург, ФРГ,

1990), XIV Международный конгресс по клинической химии (Сан-Франциско, США, 1990), Всесоюзный симпозиум «Биохимия опухолевой клетки» (Минск, 1990), Международная конференция «Современная энзимология: проблемы и перспективы» (Санкт-Петербург, 1992), 2-я Всероссийская на-

учная конференция «Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии» (Нальчик, 1994), 9-й Съезд по витамину Вб и карбонильному катализу и 3-й Съезд по РОС) и хинопротеинам (Капри, Италия, 1994), XVI Международный раковый конгресс (Нью-Дели, Индия,

1994), 4-й Международный конгресс по аминокислотам (Вена, Австрия,

1995), 23-й Съезд ФЭБС (Базел, Швейцария, 1995), Всероссийская научная конференция «Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии» (Москва, 1996), Российско-Германский симпозиум «Патология висцеральной регуляции и тканевого роста» (Москва, Россия,

1996), 9-й Международный симпозиум. Новые лекарства в раковой терапии (Амстердам, Голландия, 1996), 2-й Съезд биохимического общества Российской академии наук (Москва, 1997), 5-й Международный конгресс по аминокислотам (Греция 1997).

Внедрение результатов исследования Представления об особенностях и принципах регуляции обмена ПА в тканях с усиленной клеточной пролиферацией включены в курс лекций академика Т.Т.Березова по международной программе Сороса. Метод определения активности орнитиндекарбоксилазы из тканей животных используют в Киевском НИИ онкологии МЗ Украины в научных исследованиях по изучению особенностей обмена ПА в нефробластомах и злокачественных лимфомах у детей. Метод определения лизиноксидазы применяют в отделе физико-химической энзимологии НПО «Фермент».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 69 работ, в том числе получено 12 авторских свидетельств на изобретения.

Объем и структура диссертации Дисертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа изложена на страницах текста, содержит таблиц и_рисунков. Список литературы включает источников,

из них__на иностранных языках. -и г.,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ .

Объекты и методы исследования

Спектрофотометрические исследования физико-химических свойств изолированных из печени крыс лизосом проводили по методу В.А.Фролова и С.П.Сяткина (1990). Обогащенную фракцию лизосом получали дифференциальным центрифугированием ^аЬп Л., Ма1ег К.Р., Напшг^ К., 1970) и с использованием градиента сахарозы (БашаШ Р.Н., БЫЬко Б., КипИа и .Б.

et al., 1964). Величину оптической плотности стандартного препарата суспензии обогащенной фракции лизосом регистрировали как функцию от времени по методу (Ngaha Е.О., Fry Iví., Plummer D .Т., 1979). Определение показателей термотолерантности, осморезистентности и кислотоустойчи-вости осуществляли по методам С.П.Сяткина, В.А.Фролова,(.1986, 1987 и 1989), соответственно.

Из экспериментальных опухолей были использованы перевиваемые гепатомы 22а, 61, 60, 48 и 46, первично индуцированные у мышей линии СЗНА ортоаминоазотолуолом (В.И.Гельштейн, 1971),. и гепатома Г-27, первично индуцированная у нелинейных белых крыс нитрозодиэтилами-ном (НДЭА) (И.Н.Швембергер, 1966). Гепатоканцерогенез индуцировали НДЭА (А.И.Быкорез и В.Г.Пинчук, 1976). Нитрозопиперидин (НП) вводили внутрибрюшинно 3 раза в неделю в течение 3 месяцев (Druckrey, 1967). Частичную гепатэктомию производили по методу Higgins и Anderson (1931). Процедуру подготовки образца ткани для анализа унифицировали таким образом, что это позволило определять активность ДАО, ПАО, ОДК и содержание ПА одновременно. Активность ДАО и ПАО определяли спе-юрофотометрическим микрометодом (С.П.Сяткин и Т.Т.Березов, 1979). Активность ОДК определяли спектрофотометрическим (С.П.Сяткин и Т.Т.Березов, 1980) и флюорометрическим (Т.Т.Березов и С.П.Сяткин,

1986) микрометодами. Определение уровней Пут, Сд и См проводили флюорометрически, применяя тонкослойную хроматографию дансильных производных ПА (С.П.Сяткин и Т.Т.Березов, 1981). Количество белка в пробах исследуемых тканей определяли по Lowry(1951) в модификации СП.Сяткина (1980). Все тестируемые вещества были кристаллическими порошками и хорошо растворялись в теплой дистиллированной воде или среде Игла. В работе использовали известные цитостатики: дифторметил-орнитин (ДФМО) и метилглиоксальбис(гуанилгидразон) (МГБГ) - коммерческие препараты фирмы «Sigma».

Исследовали влияние ингибиторов полиаминсинтезирующих ферментов на скорость роста трансформированных фибробластов мышей линии СЗН и на содержание в этих клетках ПА. Количественное определение Пут и ПА проводили методом внешних стандартов путем высокоэффективной жидкостной хроматографии дансильных производных этих веществ (С.П. Сяткин, Т.Т.Березов, Н.Я.Гридина и др., 1991). Клетки линии L выращивали на питательной среде Игла с глутамином и 10% сывороткой крови крупного рогатого скота (А.Н.Шляховенко, Л.С.Бундюк, Н.Я.Гридина и др.,

1987). Для клеток карциномы яичника человека (линии CaOv) в суточных культурах заменяли питательную среду 199 средой Игла с 10% сывороткой крупного рогатого скота без глутамина и вместе с ней вносили тестируемые вещества. ' '

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента (Афифи, Эйзен, 1982). Различия считались достоверными при р<0.05. Корреляционный анализ проводили с использованием компьютерной техники.

Результаты и их обсуждение Разработка новых и модификация известных методов количественного анализа.

В силу специфичности задач данного исследования возникла необходимость разработки или модифицирования соответствующих методов биохимического анализа.

Для определения скорости окислительного деза-'минирования ди- и ПА из большого числа различных методов в качестве прототипа выбрали спекгрофотоме-трический метод измерения активности гистидазы в плазме крови кролика (P.N Aarsen, A.Kemp, 1964) в модификации Gordon и Peters (1967). Замена о-дианизиди-ного основания на его гидрохлоридное производное позволило использовать этот краситель в водном растворе. Установили оптимальные условия определения активности ди- и полиаминоксидазы. Максимальной скорость окисления Пут была при рН9.5, а Сд и См при рГО.2. В трис-HCl буфере (А) окисление аминов проходило быстрее, чем в глициновом (Б) (рис.1) и карбонатном (2,рис.2).Оптимальными оказались концентрации 20 мМ для Пут (1 и 2,рис.2) и 10 мМ для Сд и См (3 и 4,рис.2). При более высоких концентрациях ПА наблюдали торможение ферментативной реакции (3 и 4,рис.2). Образование Н2О2 в данных условиях проходило линейно в течение 60 минут при разных способах инкубации. Стабилизацию развивающегося окрашивания и депротеинизацию проб осуществляли добавлением концентрированной HCl. В итоге повысилась чувствительность метода и

Рис. 1

Влияние рН на активность аминоксидаз в гомогенате печени мышей.

Буферные растворы: А -трис-НС1-буфер Б - глициновый буфер Субстраты:

1 -тирамин, 10 мМ

2 - путресцнн, 10 мМ

3 - спермиднн, 1 мМ

4 - гистамин, 10 мМ

5 - спермин, 1 мМ

сократилось время анализа.

Модификация метода определения микробной ОДК (В.И.Закревский, 1973) с динитрофторбензолом заключалась в следуюшем. В буфер для гомогенизации ввели дитиотреитол и пири-доксальфосфат для стабилизации фермента. Реакцию останавливали и депротеи-низацию проб проводили хлорной кислотой. Среду перед динитрофенилирова-нием защелачивали до рН9.0 кристалличеким NaiCOj • ЮН2О. Качественный состав и количественное соотношение компонентов инкубационной среды подобраны заново. Зависимость оптической плотности от концентрации ДНФ-путресци-на в пробе сохраняло линейный характер в диапазоне от 0 до 150 нмоль на мл. Ощйбка метода менее 3%, чувствительность составляет ±0.1нмоль, воспроизводимость результатов близка к 100%, поскольку возврат Пут из пробы составил 103%±2%. Оптимум для ОДК оставался постоянным в узкой зоне значений от 6.4 до 6.8 и не зависел от рН буфера для гомогенизации. Удельная активность при рНб.б этого буфера была ниже, чем при рН7.2.

В оригинальный метод (N.Seiler, M.Wicehman, 1965) определения ПА внесли следующие изменения. Оптимальное объемное соотношение пробы и бензола для экстрагирования было 1.25. Проводили одномерную хроматографию двухкратно. Пролин для связывания избытка ДАНС-С1 не использовали. Проводили прямое сканирование пятен (ПРОТВА-С). Применили коммерческие силуфольные хроматографические пластинки. Подобрали простую, двухкомпонентную систему и соотношение этих компонентов (бензол.триэтиламин, 5:1). Очистили фракции ПА от примесей Х[ и Хг- В итоге время анализа сократилось в 4 раза. Калибровочные графики дансильных производных См, Сд и Пут сохраняли линейность в пределах 0-120 нмоль на пробу. Полученную хроматографически чистую фракцию дансил-Пут в дальнейшем использовали для флюориметрического метода определения ОДК. Относительная чувствительность этого метода повыси-

Рис. 2. Влияние концентрации субстратов на активность аминоксидаз в гомогенате печени мышей.

1 - путресцин (трис-НС1-буфер), 2-таже (карбонатный буфер), 3 - спермидин, 4 -спермин. [8](мМ) - концентрация субстратов.

лась в итоге в 23 раза.

В связи с высоким содержанием липо- и гликопротеинов в опухолевой ткани метод определения белка по Лоури модифицировали следующим образом. Применили дезоксихолат. Это сократило время анализа и исключило потерю белка, входящего в состав липо- и гликопротеинов. Для более полного растворения белка концентрацию ЫаОН увеличили с 0.1 М до 1 М. Заменили тартрат на цитрат натрия. Стабильность реактива С повышали тем, что реактив А готовили на воде, а не на 0.1 М ИаОН. Оптимальным соотношение концентраций детергента и белка в пробе было 1:100. Калибровочная зависимость сохраняла линейный характер до концентрации 250 мкг/мл белка в пробе.

С целью повышения чувствительности определения кислой фосфата-зы использовали в качестве восстанавливающего реагента аскорбиновую кислоту и вместо 4-нитрофосфата применили глицерол-2-фосфат в качестве субстрата. Чувствительность метода возросла в 1.5 раза. Стандартное отклонение не превышало 1%. Метод опробовали, определяя активность различных форм ферментов (общую, доступную и свободную). Расчет основных метрологических характеристик показал высокую чувствительность, точность и надежность определения. Калибровочная зависимость сохраняла линейный характер до 50 мкМ. ' ^

При определении активности гликрзидаз в качестве останавливающего реакцию реактива применяли 0.135% раствор дезоксихалата в 0.5 М ИаОН вместо 3.3% ТХУ. Это позволило проводить спектрофотометрию без депротеинизации проб. При этом соотношение детергента к белку должно превышать 1.5:1000. Спектрофотометрию проводили при 405 нм вместо 420 нм. Это в 1.24 раза повысило коэффициент инструментальной чувствительности и точность определения в целом. Зависимость оптической плотности от агликона (п-нитрофенола) в пробе сохраняла линейный характер в диапазоне от 0 до 50 нмодь. Это показывает, что соотношение компонентов реакционной смеси подобрано оптимально. Метод опробовали, определяя активности р-глюкозидазы, р-галактозидазы и Р-К-ацетилглю-козаминидазы в печени интактных животных. Надежность, точность и воспроизводимость результатов анализа модифицированным способом были выше, чем в прототипе. Ошибка метода была 0.7%, чувствительность -0.26 мкМ, степень рассеивания менее 2.5%.

Оценить степень лабилизадии лизосомных мембран как результат действия физико-химических факторов среды опосредованно через расчет баланса различных форм маркерных кислых гидролаз оказалось невозможным, поскольку сами ферменты были чувствительными к действию этих же факторов. Исследовали спектральные характеристики суспензии изолированных лизосом (Рис.3). В видимой области длин волн характерных и

собственных пиков на спектре поглощения не обнаружили. Спектры поглощения суспен-ции изолированных лизосом при действии различных детергентов показали, что при полном разрушении лизосом тритоном Х-100 (3, рис. 3) величина экстинкции снижалась практически до базовой линии, а дА в диапазоне длин волн от 500 до 550 нм была максимальной. Это позволяет принять ее за меру количества разрушенных лизосом, равную 100%. Таким образом, наиболее удобным для оценки структурного состояния лизосом оказалось измерение оптической плотности суспензии этих частиц при длине волны 520 нм. Раствор 0.7 М сахарозы с 1 мМ ЭДТА служил раствором сравнения, а его спект поглощения принимали за базовую линию. Из трех использованных детергентов менее эффективным в сравнении с тритоном Х-100 и додецилсульфатом натрия (4) был дезок-сихалат натрия (5, рис.3). В сравнении с ферментативным данный метод сокращает время анализа с 5-6 часов до 30 минут, сберегает дефицитные реактивы, повышает специфичность и универсальность определения.

Осморезистентность, кислотоустойчивость, термотолерантность и лизосомотропность изолированных лизосом определяют опосредованно через баланс различных форм активности маркерных кислых гидролаз. К недостаткам метода следует отнести существенную продолжительность и трудоемкость анализа, расход дефицитных дорогостоящих реактивов и низкую специфичность определения. О структурной целостности лизосом судили по величине абсорбции суспензии лизосом при 520 нм в течение 35 минут инкубации. Количественно оценивать осморезистентность, кислотоустойчивость, термотолерантность и лизосомотропность можно в процентах от исходного уровня A52Q или по начальной скорости разрушения. В сравнении с ферментативным методом общее время анализа сокращается с 5-6 часов до 30 мин.

Лизосомотропность - важный показатель оценки регуляторного действия химических веществ на структурную целостность лизосом. Суспензию лизосом инкубировали в 0.7 М р-ре сахарозы с 1 мМ ЭДТА при 50°С и

изолированных лизосом при действии различных детергентов.

По оси абсцисс - значения оптической плотности,; по оси ординат - длина волны (в нм). 1 - интактные лиюсомы, 2 - раствор 0.7 М сахарозы с 1 мМЭДТА, 3, 4, 5-лизосом ы, обработанные тритоном Х-100, додецилсульфатом натрия и дезоксихолатом натрия, соотеетст-

рН 7 с исследуемым веществом в течение 5 мин. Процесс термолизиса носил линейный характер и через 5 мин его величина составила 26%. Добавление в пробу кадаверина до конечной концентрации 1 мМ и 0.1 мМ снижало степень повреждения лизосом в 4 и 2 раза и тормозило скорость лизиса в 3.7 и 2.7 раза, соответственно. Кадаверин не проявлял протекторного эффекта при 0.01 мМ концентрации. Таким образом, варьируя условия среды инкубации, можно оценивать силу лабилизируюшего и стабилизирующего действия лизосомотропных веществ, а также определять характер действия на лизосомы биологически активных веществ. По сравнению с ферментативными прототипами разработанные способы определения ос-морезистентности, кислотоустойчивости, термотолерантности и лизосомо-тропности химических соединений существенно сокращают время анализа и его трудоемкость,сберегают дорогостоящие реактивы, повышают специфичность и универсальность определения.

Существующие способы количественной оценки регуляторных свойств антипролиферативных агентов требуют больших затрат материальных средств (очистка ферментов, тканевое культивирование), времени и дают противоречивые результаты. Разработка аналогичного способа, но лишенного перечисленных недостатков, стало целью данного этапа работы. Использовали ткани с высоким митотическим индексом: регенерирующую печень крыс как «нормально» пролиферирующую ткань с усиленным синтезом ПА и нормальной активностью аминоксидаз ПАО и ДАО, а также солидную гепатому крыс Г-27 с «патологической» пролиферацией клеток, усиленным синтезом ПА и с полным отсутствием аминоксидазной активности. Для приготовления ферментного препарата ткань регенерирующей печени брали через 12 ч после операци, а гепатому - в логарифмическую фазу роста. Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозоль-ную фракцию (20 ООО g х 20 мин при 4°С) 33% гомогената тканей с добавлением необходимых компонентов для проявления активности ОДК. Таким образом, модельная система содержала все необходимые компоненты для синтеза ПА. Для запуска цепи последовательных реакций биосинтеза ПА добавляли субстрат и кофактор ОДК. Инкубация в течение 1ч при 37°С без исследуемых веществ приводила к увеличению уровней Пут и ПА приблизительно в 2 раза. Количество реально образующегося в системе Пут рассчитывали с учетом прироста ПА, а для рассчета количества Сд учитывали прирост См относительно исходного уровня. ДФМО и МГБГ как наиболее изученные канцеростатики и ингибиторы ключевых ферментов биосинтеза ПА применяли для определения разрешающей способности (калибровки) данных тест-систем при анализе эффективности действия новых химических соединений. Бесклеточные и клеточные тест-системы проявили высокую степень чувствительности к этим веществам. Таким образом,

разработанные тест-системы позволяют с большой долей вероятности судить об эффективности действия химических соединений на рост клеток в условиях целостного организма.

Регуляция структурной целостности изолированных лизосом.

Целью этого раздела работы было изучение непосредственного, прямого влияния осмотического давления, рН и температуры внутриклеточной среды на структурную целостность лизосом. Результаты исследования динамики осмотической лаби-лизации изолированных лизосом приведены на рис.4 и 5. Процесс ос-молизиса моделировали путем инкубирования суспензии лизосом при 37°С, рН7 в течение 5 мин. Моляр-ность растворов сахарозы варьировали в диапазоне от 0.7 до 0.25 М. Распад лизосом носил линейный характер при концентрации сахарозы 0.7 М. Уменьшение концентрации сахарозы в пробе до 0.25 М приводило к 80% уровню распада лизосом уже через 1 мин. Зависимость оптической плотности суспензии ин-тактных лизосом от молярности раствора сахарозы (рис.4) выявила различную чувствительность к изменению этого фактора. Наиболее резкие изменения в устойчивости лизосом к осмотическому давлению были выявлены в интервале от 0.7 до 0.6 и от 0.3 до 0.25 М. Величина повреждения лизосом оставалась постоянной в интервале от 0.6 до 0.3 М и зависела только от времени инкубации. Эта закономерность сохранилась в зависимости скорости распада изолированных лизосом от осмотического давления среды инкубации

О ОI 0,1 0.3 ОМ 0.1 Об 0.7

Рис. 4. Зависимость оптической плотности суспензии интактных лизосом от молярности раствора сахарозы в различные сроки инкубации. По оси абсцисс - концентрация сахарозы (мМ). по оси ординат - процент от начальной величины Аца 1-5 - пробы инкубировали соответственно в течение 1, 2, 3, 4 и 5 мин.

Рис. 5. Зависимость скорости, распада изолированных лизосом от осмотического давления среды инкубации и сроков хранения.

По оси абсцисс- величина осмотического давления (в МПа). по оси ординат - скорость снижении А ¡20 (в лА 12(/мин). Пробы хранили при 0-1 "С 16 ч (1) и 40 ч(2).

(рис.5). В интервале от 1.4 до 0.7 Мпа величина скорости распада лизосом оставалась практически на одном уровне. Это, вероятно, связано с гетерогенностью фракции лизосом и позволяет выделить долю органелл с высокой, средней и низкой осморезистен-тностью, каждую из которых определяют на графике границы «стационарного» участка. Дополнительное инкубирование исходной суспензии в течение 24ч при 4°С повышало осмотическую чувствительност, вероятно, за счет поступления сахарозы внутрь лизосом. Таким образом, осморезистентность будет зависеть от количества осмоактив-ных веществ, накапливающихся в лизосомах на фоне лабилизации их мембран.

Динамику процесса лабилизации изолированных лизосом в зависимости от рН инкубационной среды изучали, добавляя исходную суспензию к 0.6 М р-ру сахарозы с 1 мМ ЭДТА и с различными значениями рН. Линейным процесс был при рН 6. Увеличение или уменьшение концентрации Н* в инкубационной среде резко меняло устойчивость лизосом. Наиболее

существенные изменения в структурной целостности лизосом были при рН 3, когда распад лизосом достигал 50% уже через 30 секунд. Наиболее стабильна суспензия лизосом была в узком диапазоне значений рН, близком к 6 (рис.6) Более наглядно эта закономерность проявилась в зависимости скорости распада лизосом от рН-инкубационнной среды (рис.7). Минимальной скорость разрушения лизосом была в узком интервале значений рН и возрастала по мере изменения рН от 6 до 3 или

? V

Рис.6. Рис.7.

Рис.6. Зависимость оптической плотности суспензии интактных лизосом от рН инкубационной среды.

По оси абцисс - величина рН инкубационной среды, по оси ординат -%от начальной величины А«» Время инкубации проб: I мин (1), 2 мин (2) и 3 мин (3).

Рис 7 Зависимость скорости разрушения лизосом от концентрации Н+ в инкубационной среде и от сроков хранения при 0-4 °С. По оси абсцисс - величина рН инкубационной среды, по оси ординат - скорость снижения ■ Ала (в лАно'мин). Пробы хранили при 0-4 "С ¡6 ч (1) и 40 ч (2)

интактных лизосом при разных температурных режимах инкубирования. По оси абсцисс - время инкубации проб (в мин), по оси ординат - величина Ащ> (в % от исходного значения). 1 - 7 - пробы инкубировали соответственно при 10.3, 11.4, 20, 30. 45 и 50 °С.

8. Дополнительное инкубирование исходной суспензии в течение 24ч при 4°С снижало чувствительность лизосом к рН среды. Характер данной зависимости при этом не менялся. Вероятно, регу-ляторное значение этого фактора может проявляться не только при генерализованном, но и при локальном внутриклеточном изменении рН.

Процесс термолизиса изучали, добавляя исходную суспензию к предварительно нагретому до заданной температуры 0.6 М р-ру сахарозы рН7 с 1 мМ ЭДТА (рис.8): 1-7, соответственно, 10.3, 11.4, 20, 30, 37, 45 и 50°С. Характерно, что наиболее существенные изменения структурной целостнотности лизосом (50% и более) просходят уже через 5 мин при температуре инкубационной среды выше 37°С (рис.8). Это хорошо согласуется с положительным терапевтическим эффектом гипертермии на опухолевую ткань и может быть: одним из механизмов такого действия. Зависимости степени разрушения и скорости распада лизосом имели однотипный характер. Повреждение частиц было наименьшим при 10°С, незначительно увеличивалось при температуре от 10 до 30СС и резко возрастала при дальнейшем повышении температуры инкубационной среды (рис.9 и 10). После дополнительного инкубирования исходной суспензии в течение 24ч при 4°С (рис.10) терморезистентность лизосом повысилась на 30% в интервале от 10 до 30°С и оставалась практически неизменной при температуре выше 37°С. Зависимость логарифма скорости лизиса изолированных лизосом от обратной величины температуры (рис.11) объясняет причину нивелирования различий в термоустойчивости лизосом при гипертермии (рис.10). Так, при температуре38.5°С и выше лизосомные мембраны полностью переходят в расплавленное состояние и различия в термотолерантности лизосом сглаживаются. Термолабилизация, вероятно, инициирует осмотичекое повреждение этих органелл так, как это было показано

ю ю зс <•£ so о ю го JO ы ;о Рис.9. Рис.10.

Рис.9. Зависимость оптической плотности суспензии интактных лизосом от температуры инкубационной среды в различные сроки инкубации. По оси абсцисс - температура инкубационной среды (в "С), по оси ординат - проценты от исходного значения А ¡¡о 1 - 5 - время инкубации проб соответственно 1, 2, 3, 4 и 5 мин.

Рис.10. Зависимость скорости разрушения лизосом от температуры инкубационной среды и сроков хранения исходной суспензии при 0-4 °С. По оси абсцисс - температура инкубационной среды (в °С), по оси ординат - скорость снижения Ацо (в Мао на мин). Пробы хранили при 0-4 "С 16 ч (1) и 40 ч (2).

для эритроцитов. Рассчитанные значения температуры фазового перехода и энергии активации можно также использовать в качестве динамических показателей структурного состояния лизосомных мембран. Влияние ди- и ПА на структурную целостность лизосом исследовали, добавляя исходную суспензию к предварительно нагретому до 50°С раствору 0.7 М сахарозы рН 7 с различными концентрациями ПА (рис.12 и 13). Степень разрушения лизосом соответствовала понижению оптической плотности проб, выраженному в процентах от исходной величины. Предварительно полученные спектры поглощения тестируемых веществ не выявили пиков поглощения, в частности, при 520 нм. Вещества применяли в интервале фармакологических и физиологических значений концентраций: от 10'5 до 1 М. Все они проявили протекторные свойства, но в различной степени, которая возрастала в ряду: Пут, кадаверин, Сд и См. Например, при концентрации 10 мМ в пробе они тормозили лизис лизосом на 13, 14, 84 и 97%, соответственно. Таким образом, ПА действовали эффективнее диаминов. Можно предположить, что эти вещества стабилизируют мембраны данных ор-ганелл путем образования сольватных комплексов с фосфолипида-ми и другими кислыми компонентами лизосомных мембран. Следовательно, регулируя уровни ПА в клетке можно опосредованно влиять на состояние лизосомного аппарата и на активность клеточных про-

рифма скорости лизиса изолированных ингактных лизосом от обратной величины температуры. По оси абсцисс: вверху — температура ("С), внизу-значения обратной абсолютной температуры (1/Т-КУ2, К'), по оси ординат - значения логарифма скорости распада лизосом в процессе инкубации проб в 0.7Мр-ре сахарозы.

Рис.12. Оптическая плотность суспензии лизосом при инкубации в среде 0.7 М сахарозы рН 7 с различными концентрациями путресцина (А) и кадаверина (Б). По оси абсцисс указано время инкубирования проб (мин), по оси ординат приведены проценты от начальной величины оптической плотности (Ацц)- Концентрации диаминов и температура инкубационной среды были 10РСи IМ (I), Д0°Си 1М(1), ¡0°С иО.Ш¡0°С и 0.01М(4) и 50°Сбез диамина (5).

цессов, в которых они ; участвуют. Регуляция уровней ПА в тканях с высокой скоростью пролиферации

С целью выяснения особенностей регуляции уровней ПА в тканях с нормальной и «патологически» усиленной пролиферацией исследовали обмен ПА в перевивных гепато-мах Г-27, 22а, 60, 61, 46 и 48 в процессе ге-патоканцерогенеза в сравнении с нормальной и регенерирующей печенью, а также печенью животных-опухоленоси-телей. Во всех исследованных гепатомах уровни ПА и Пут были повышены, кроме медленно растущей гепатомы 48 (табл.1). Это оказалось характерным признаком данных опухолей. Активность ОДК, кроме гепатомы

Таблица 1

Содержание ПА и путрес^ина_^перевнвных_геп^^ _

Исследуемый объект Число тканей ПА, мкмоль/г сырой массы ,

Пугресцин | Спермидин Спермин

Нормальная печень крысы 10 0.21+0.03 0.64М.03 0.45+0.001

Нормальная печень мыши 10 0.35Ю.02 1.12±0.07 0.99±0.06

Гепатома: Г-27 10 1.55±0.02* 2.06+0.44' 1.16+0.14'

22а 8 0.5б±0.09* 1. !6±0.14 1.43+0.15'

60 8 0.70+0.11' 1.77+0.13' 1.81Ю.30'

61 8 0.44±0.06 1.37±0.23 2.09+0.20"

48 8 0.41 ±0.03 1.5110.18 I. П±0.17

46 8 0.71 ±0.12* 2.07+0.13* 2.58+0 31*

Примечание *- }'<0. ОУ.

22а, была достоверно увеличена. Это указывает на возможность участия ОДК в регуляции концентрации ПА в этих опухолях (табл. 2). Однако наиболее значительные изменения были обнаружены в способности исследованных гепатом к окисению ПА и Пут. Установлено полное, или близкое к этому, отсутствие окислительного дезаминирования ПА и Пут в этих гепатомах (табл.3).;

Таким образом, полная или почти полная утраты активности ДАО и

»_,_,___I—— ° —---—---—-

0 12 3 4 5 г.-я 0 1 а , Э 4 1 '.-и

Рис. 13. Влиянне спермидина (А) и спермина (Б) на суспензию лизосом во время инкубации в среде 0.7 М сахарозы рН 7 при 50°С.

По оси абсцисс дано время инкубации проб (мин), по оси ординат указаны проценты от начальной величины оптической плотности (А ¡к). Концентрации ПА в пробах для спермидина: 1 м(\). о.ша). о.о1 м(3/1 ш(V- о. 1 ша).

0.01 мМ (6) и без амина О): для спермина■ 1 М(\), 0.01 М П). 1 Ш (3). 0.1.Ш (4). 0.01 мМ (5) и без амина (6).

ПАО, вероятно, способствует увеличению уровня ПА в данных опухолях в большей степени, чем повышение активности ОДК.

Таблица 2

1 Исследуемый объект Число тканей Метод определения

А Б

Нормальная печень крысы 10 0.35+0.05 0.67+0.10

Нормальная печень мыши 10 0.25±0.0б 0.49±0.12

Гепатома: Г-27 10 2.06±0.35* 5.39+0.82'

22а 8 0.11+0.08 0.88Ю.20

60 8 1.12+0.14* 0.89±0 12*

61 8 0.16+0.03 1.80+0.51'

48 8 2 65+0.31' 1.39±0.32*

46 8 0.56+0.13' 2.46+0.82'

Примечании. А - спсктрифотимстрический. Ь - флнюрометрическии. * -1'<1).05

Таблица 3

Активность ДАО (в нмоль/мг белка/ч) в перевивных гепатомах_

Исследуемый объект Число тканей Субстрат

Путресцин Спермидин Спермин

Печень крысы 10 10.03+0.84 7.0Ш.79 5.27+0.80

Нормальная печень мыши 10 9.76±1.48 7.15±0.67 3.76±0.33

Гепатома: Г-27 10 0.00 0.00 0.00

22а 8 0.00 0.00 0.00

60 8- 0.97+0.30 0.73±0.32 0.64+0.14

61 8 0.07+0.02 0.02±0.01 0.00

48 8 0.14±0.12 0.00 0.00

1 46 8 0.00 0.00 0.00

Примечание. Дм опытной (ткань гепатомы) и контрольной (нормальная печень) групп биологических объектов в опытах с каждым из исследованных субстратов Р<£. 001.

Чтобы выяснить ие только направленность и сущность, но также и последовательность изменений основных показателей обмена ПА при неопластической трансформации гепатоцитов, исследование специфичности обмена ПА проводили при гепатоканцерогенезе. Уровни ПА в малигнизи-рующей печени крыс превысили контрольные значения на 4-5-й месяцы после прекращения введения гепатотропного канцерогена: НДЭА. По времени это совпало с появлением первичных гепатом (рис.14). В тот же период скорость декарбоксилирования орнитина была выше контрольного уровня (рис.15). Скорость окислительного дезаминирования ПА оказалась близкой к нулю уже через 1.5 месяца и Пут - через 3 месяца (рис.16). Таким образом, в процессе гепатоканцерогенеза изменения активности ПАО и ДАО были более ранними и существенными, чем нарушения активности ОДК, предшествовали моменту появления гепатом и, вероятно, являются

£ 3

6 t/lHC/

одним из главных факторов увеличения уровня ПА в неоплазме. При хроническом введении канцерогена нит-розопиперидина (не печеночной тропности) таких изменений в печени животных не наблюдали. Это доказывает специфичность ответа в обмене ПА на опухолевый рост при исследованном ге-патоканцерогене-зе.

В регенери-рущей печени уровни ПА повышались через 6ч после операции (рис.14). Активность ОДК оказалась значительно выше контрольной уже через 1.5ч после операции (рис. 15). Незначительные снижения активности

ДАО и ПАО произошли лишь на вторые сутки (рис.16). Обнаруженное возрастание концентрации ПА и особенно активности ОДК предшествовало началу митотической активности в регенерирующей печени. Таким образом, в процессе регенерации печени наиболее характерные изменения в обмене ПА касаются активности ОДК, а не ДАО и ПАО. С целью выясне-

0' 2 4 6" ¿4 48 72 ^чао/

Рис.14. Концентрация ПА в малигнизирующей (А) и регенерирующей (Б) печени.

По оси абсцисс дано время в месяцах (А) и часах (Б), по оси ординат - концентрация (нМ/мг белка). Субстраты: спермидин (I), спермин (I) и путресцин (3).

б^ТГ 48 72 <Учас/

Рис.15. Активность ОДК в малигнизирующей (А) и регенерирующей (Б) печени.

По оси абсцисс дано время в месяцах (А) и часах (Б), по оси ординат представлена активность (нМ/мг белка/ч).

ния механизмов регуляции активности ПАО в процессе малигнизации печени исследовали действие ПФ на скорость окислительного дезаминиро-вания См в ткани гепато-мы, в печени животного-опухоленосителя и инта-ктного животного. Добавление ПФ к препаратам гепатомы Г-27 не вызывало восстановления активности ПАО (рис.17). Активность фермента из печени животного-опухо-леносителя при добавлении ПФ достигала контрольного уровня. Это позволяет предположить, что полная потеря активности ПАО в ткани гепатомы Г-27, вероятно, связана с отсутствием апо-фермента и не зависит от недостатка витамина В6. Таким образом, повышение концентрации ПА в тканях при опухолевом росте обусловлено не столько активированием процессов ' биосинтеза, как при регенерации печени, сколько угнетением процессов катаболизма ПА.

Химическая регуляция процесса биосинтеза ПА в бесклеточных системах из быстро пролиферирующих тканей Целью данного этапа работы было исследование эффективности действия химических соединений (аналогов ПА) на процесс биосинтеза Пут и ПА в условиях, максимально приближенных к внутриклеточным. Первую группу веществ составили производные гидрированных инденопиридинов, любезно предоставленных ГЛ.Дубуром совместно с сотрудниками Инсти-

Рис.16. Активность диаминоксидазы в малигни-зирующей (А) и регенерирующей (Б) печени. По оси абсцисс дано время в месяцах (.А.) и часах (В), по оси ординат - активность ДАО и ПАО (иМ/мг белка/ч). Субстраты: путресцин (1), спермидин (1) и спермин (3).

Рис.17. Зависимость активности ДАО гепатомы Г-27, печени интактного животного и животного-опухоленосителя от концентрации ПФ.

В качестве субстрата использовали спермин. По оси абсцисс - концентрация ПФ (в мкмоль), по оси ординат - активность ДАО (в нмолъ/мг белка/ч). 1 - печень животного-опухоленосителя, 2 - нормальная печень, 3 -гепатома Г-27.

туга органического синтеза Латвийской АН. Такой выбор обусловило химическое сродство этих соединений с пиридоксалевым кофактором ОДК. Производные различались радикалами в положении 3 и 4 пиридинового кольца. 2-Днфто-рметоксифенил был в 4-м положении у 765, 1140 и 1185 соединений. 2-Нитрофенил был в том же положении у 1696, 1704, 1000 и 994. В положении 3 находились сложноэфирные заместители у 769, 1000 (ментиловый), 1185 (Н-додециловый), 1704 (циклогекси-ловый) и у 1696 [(пропокси)-эти-ловый], а также амидная группа у 1140 и 994 (2-пиридиламид) . Сравнивали эффективность и характер действия указанных веществ на процесс образования ПА в двух тест-системах с контролируемой и "бесконтрольной" скоростью пролиферации. В разной степени, но почти все тестируемые вещества активировали биосинтез ПА в обеих модельных систе-

1140

И,:-0С2Н40С3Н7;-0-О:_0'

994

1696 1704 1000

Рис.18. Производные 2-метил-5-оксо-1,4-дигидроиндено[1,2-Б]-пиридин-3-карбоновой кислоты.

769: ментиловый эфир 2-метил-4-(2-дифторметоксифенил)-3-оксо-

1,4-дигидроиндено [1,2-Б] пиридин-3-карбоновой кислоты, 1140:2-пиридиламид 2-метил-4-(2-дифторметоксифенил)-5-оксо-

1,4-дигидроиндено [1,2-Б]пиридин-3-карбоновой кислоты, 1185: н-додециловый эфир 2-метип-4-(2-дифторметоксифенил)-5-

оксо-1,4-дигидроиндено [1.2-Б] пиридин-3-карбоновой кислоты, 1696: 2-(н-пропокси)зтиловый эфир 2-метил-4-(2-нитрофенил)-5-оксо-

1,4-дигидроиндено [1,2-Б] пиридин-3-карбоновой кислоты, 1704: циклогексиловый эфир 2-метил-4-(2-нитрофенил)-5-оксо-1,4-дигидроиндено [1,2-Б] пиридин-3-карбоновой кислоты, 1000: ментиловый эфир 2-метил-4-(2-нитрофенил)-5-оксо-

1,4-дигидроиндено [1,2-Б] пиридин-3-карбоновой кислоты, 994: 2-пиридиламид 2-метил-4-(2-нитрофенил)-5-оксо-

1,4-дигидроиндено [1,2-Б] пиридин-3-карбоновой кислоты

Таблица 4

Влияние инденопиридинов на скорость биосинтеза лутресцина и ПА в бесклеточнон тест-системе т регенерирующей печени крыс

| Веще | -ство одк Эффект в% Синтез спермидина Эффект в% Синтез спермина Эффект в%

| 2.4Ю.2 0 0.4+0.01 0 0.2+0.02 0

769 3.6±0.1 +51* 0.1Ю.01' 72 0.05Ю.01* 76

1140 8.710.6* +262 0.610.05 +32 0.310.03 +50

1185 3.8±0.2 +57 0.610.07 +43 0.35Ю.04 +75

1694 8.010 2* +234 3.1 ±0.2' +628 0 5+0.05* + 180

1696 7.8+0.2' +223 3.6+0.2' +733 0.2+0.02 +30

1704 5.310.1* + 119 4.010.2' +828 0.4+0.05' +110

| 1000 7.2Ю.З' +200 3.0+0.2* +603 0.7М.04* +240

|994 6.8Ю.З' +180 3.7М.2* +760 0.8Ю.09* +290

Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в мккат/кг белка. Результаты даны в eu.de М±т для <5 параллельных измерений. *- достоверные отличия от контроля, Р<0.05. а)-знак "+ " обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.

Таблица 5

Влияние инденопиридинов на скорость биосинтеза путресцина и ПА в

Веще одк Эффект Синтез Эффект Синтез Эффект

-ство в % спермидина в % спермина в%

- 12.410.2 0 4.0Ю.З 0 1.0Ю.1 0

769 8.4+0.4* 32 0.9Ю.05* 78 0.5+0.03* 56

1140 11.7Ю.З 6 3.9Ю.2 9 2.3Ю.1* +121

1185 11.5Ю.6 7 6.7Ю.З* +68 2.8Ю.1* +175

1694 9.3Ю.7* 26 2.510.2* 36 0.6Ю.05* 45

1696 17.1+0 Г. +38' 4.5Ю.4 +12 4.1Ю.4* +300

1704 38.3+3.9" +208 2.7+0.2* 32 1.1+0.1 +12

1000 21.0+0.1* +69 8.7Ю.5* +120 3.5+0.2* +247

994 18.010.4* +45 2.3Ю.Г 42 1.710.05* +67

Примечание. Обозначения см. в табл. 4. мах, кроме вещества 769, которое тормозило образование ПА в той и другой системе, а также вещества 1694, которое умеренно ингибировало синтез Пут и ПА в опухолевой ткани (табл.4). Активирование биосинтеза ПА в опухолевой ткани было в существенно меньшей степени, чем в регенерирующей. Эти различия могут быть обусловлены изменениями в структуре и каталитических свойствах полиаминсинтезирую щих ферментов.

О-замещенные гидроксиламины (1-1У) были синтезированы в Институте органической химии им.Н.Д.Зелинского АН СССР и любезно предоставлены для исследования А.Р.Хомутовым. Химические соединения (У-Х) были синтезированы в Институте физической химии АН СССР. Оба известные ингибитора (ДФМО и МГБГ) проявили существенное и специфичес-

Таблица б

Химические аналоги декарбоксилированного орнитина и Б-аденозилметионнна

Название Индекс Структура

а -дифторметилорнитин 1 -аминоокси-3-аминопропзн 1,2-диаминооксиэтан 5-(5 -дезоксиаденозил)-8- тиоэтилгидроксиламин 5-(5 -дезоксиаденозил)-8-метил-Р - тиоэтилгидроксиламин ДФМО I и III IV Н2МСН2СН2СН2ССООН Жн2 2НС1Ш2ОСН2СН2СН2КНг 2НС1Ш2ОСН2СН2ОШ2 Н2504Ш20СН2СН25А(1е 2Н2504Ш20СН2СН28*А(1е СНз

Химические аналоги полиаминов

Название Индекс Структура

Этилендиамин 1,3-диаминопропан 1,5-диамино-З -азапентан 1,9-диамино-З.б-диазанонан 1,9-диамино-3,7-диазанонан Метнлглиоксаль-бис(гуанилгидразон) V VI VII VIII IX МГБГ Н2МСН2СН2Ш2 Н2КСН2СН2СН2Ш2 Н2К(СН2)2МН(СН2)М^ Н2М(С112)2КН(СН2)Ш(СН2)3Ш2 Н2Ы(СН2)2КН(СН2ЬШ(СН2)2МН2 «Н НзС-9=К-МН-С-Шг НС=К-Ш-С-Ш2

кое действие как в опытах с опухолевой, так и регенерирующей тканью. Это свидетельствует о том, что данные бесклеточные модельные системы функционируют адекватно поставленным задачам. Эффективность анти-пролиферативного действия соединений оценивали по степени торможения синтеза Пут и ПА, а также дополнительно рассчитывали коэффициент молярного отношения спермидина к спер-, мину (СД/См) и величину суммарного пула ПА (]£ПА) после одного часа инкубации. Показатель Сд/См положительно коррелирует со скоростью пролифе-

Рис.19. Содержание пугресцина и ПА в Ь-клетках в процессе роста культуры ткани. Здесь и на рис.20, 21,22 и 23 по оси абсцисс дано время культивирования Ъ-клеток (дни), по оси ординат: слева - число Ь-клеток (¡0* на 1 мл культуральной среды), справа - содержание поликатионов (рМна 1С? клеток). 1 - ¡.-клетки, 2 - Сд, 3 - См и 4 - путресцин. Рис.20. Содержание пугресцина и ПА в Ь-клетках в процессе роста культуры ткани на фоне действия ДФМО.

Таблица 7

Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксилированин орннтина и

Вещество одк Эффект в% Синтез спермидина Эффект в% Синтез спермина Эффект в%

- 2.6Ю.2 0 1.1 ±0.04 0 0.4Ю.01 0

ДФМО 2.0±0 Г 23 1.1+0 1 0 0.210.01* 50

МГБГ 2.710:2 4 - 0.97+0.02.' . 22 0.35Ю.02* 25 .

1 2.0+0.1' 23 1.210.04' ■ +9" 0.35+0.02* 25

II 2.ЭЮ.З 12 1.010.2 9 0.4М.01* 0

III 2.4+0.3* 8 0.9+0 1 18 0.3+0.04* 25 м

IV 1.5+01* 42 0.8+0.01* 27 0.4Ю.01* 0

V 1.610 Г 38 0.45+0.01* 59 0.2+0.03* 50

VI 4.3+0.5' +65 0.6Ю.02* 45 0.16+0.02* 17

VII 4.8+0.4* +85 1.0+0.2 9 0.2Ю.02* 50

VIII З.ЗЮ.2* +27 0.810 Г 27 0.4+0.02 0

IX 3.510.1* +35 1.2+0.1 +9 0.45+0.03 + 12

X 3.410.2* +31 0.9+0.1 18 0.210.05* 50

Примечание Скорость 'биосинтеза путресцина и ПА представлена к мккат кг белка. Результаты даны в виде Ы±т для б параллельных измерений. *- достоверные отличия от контроля. Р<0 05. а) - знак "+ " обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.

Таблица 8

Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксилированин орнитнна н S-

Веще- одк Эффект Синтез Эффект Синтез Эффект

ство в% спермидина в% спермина в %

- 2.7Ю.1 0 1.29Ю.04 0 0.48+0.01 0

ДФМО 1.7+0. Г 37 0.87Ю.02* 33 0.2110.0 Г 56

МГБГ 2.7Ю.1 .0 0.9Ю.02* 26 0.31+0.01* 35

I 1.1+0.1* 59 0.57+0:01' 56 0.1+0.01* 79

II 2.2Ю.1* 19 0.88Ю.06* 32 0.25+0.08* 48

III 3.7±0.2* +37* 0.92+0.03* 29 0.2410.07* 50

IV 1.7Ю.1* 37 0.63Ю.02* 51 0.26Ю.07* 46

V 2.3+0.1* 15 0.98+0.02* 24 0.32Ю 09 33

VI 2.8+0.1 +4 1.0+0.02* 22 0.19Ю.04* 60

VII 2.5Ю.1 7 0.74+0.02* 43 0.2Ю.05* 58

VIII 2.4+0.1 11 0.78+0.04* 40 0.18Ю.04* 62

IX 2.5Ю.1 7 0.63Ю.02* 50 0.28Ю.06* 42

X \.7±0Л* 37 0.9+0.2* 22 0.5Ю.06 +4

Примечание. Обозначения см. в табл. 7. рации как нормальной, так и опухолевой ткани (Н.К.Бердински, С.П.Залет-

Рис.21.

Рис.22.

Рис.21. Влияние МГБГ на концентрацию путресцина и ПА в Ь-клетках в процессе роста культуры ткани. Рис.22. Сов'местное действие ДФМО и МГБГ на уровень путресцина и Г1А в Ь-клетках в процессе роста культуры ткани. Обозначения см. рис.19.

AMA

Рис.23. Влияние 1-аминоокси-З-аминопропана (АРА) и 5-дезо-ксиаденозил-5-метилтиоэтилгидроксиламин (AMA) на внутриклеточные уровни ПА и рост L-клеток в культуре ткани. Обозначения см. рис. 19.

ок, 1987). Целесообразность применения показателя £ПА обусловлена возможностью процесса интерконверсии, а также функциональной замены одного поликатиона другим. Со скоростью клеточной пролиферации функционально связан также уровень Сд. Вещества I и IV не уступали по активности ДФМО и МГБГ. Соединения второй группы ингибировали синтез ПА в обеих системах с разной степенью эффективности. В опухолевой модели это приводило к резкому, почти двухкратному, возрастанию фракции Пут. Только этилен-

АРА+АМА

Рис.24. Влияние ДФМО, МГБГ, АРА и AMA на скорость роста L-клеток в ку-льтуреткани.

По оси абсцисс дано время роста L-клеток в культуре ткани (дни), по оси ординат -отношение количества клеток в опытной к контрольной группе (%). 1 - ДФМО. 2 -МГБГ, 3 -ДФМО*МГБГ, 4-АРА. 5-AMA. 6-АРА+АМА.

диамин (V) проявил сильные анти-пролиферативные свойства по всем выбранным показатеям: Сд/См, ЕПА. и уровень Сд, - в особенности по отношению к опухолевой ткани. Направленность действия всех исследованных веществ в основном совпадала в обеих системах, однако глубина торможения биосинтеза ПА в модели из регенерирующей ткани была больше., Из числа исследованных соединений в большей . степени антипролиферативными свойствами обладают вещества I, IV и V. Соединения первой и второй групп различались по химической структуре и возможному меха-

низму действия. Реакционная способность аминооксигруппы соединений I и IV обусловлена реакцией образования оксимов пиридоксаль-5 '-фосфата (P.M. Хомутов, Г.Ф.Денисова, А.Р. Хомутов и др., 1985). Гомологическая серия веществ второй группы варьировала в длине углеродной цепи, разделяемой различным местоположением иминогруппы на ди- и триметиленовые фрагменты. Как химические аналоги Пут и ПА они, вероятно, могли бы действовать по типу ретроингибирования или по конкурентному механизму.

Задача следующего этапа работы состояла в выяснении роли ПА в реализации антипролиферативного действия ДФМО и МГБГ в процессе роста культуры опухолевой ткани. Исследовали действие ДФМО и МГБГ на внутриклеточное содержание ПА и рост клеток в культуре. Результаты суммированы на рис.19, 20, 21 и 22. Выявили сильную положительную связь между количеством клеток и внутриклеточным содержанием Сд. Добавление ингибиторов тормозило скорость роста L-клеток на четвертые сутки в 4 и б раза: ДФМО и ДФМО+ МГБГ, соответственно. При этом, изменения в концентрации ПА при действии ДФМО опережали на двое суток сдвиги в количестве клеток в культуре. Связь между этими величинами была сильной и положительной. Таким образом, ПА участвуют в реализации антипролиферативного действия ДФМО и МГБГ и могут служить биохимическими маркерами эффективности такого действия. В этих же условиях исследовали вещества I и IV (рис.23). Характер их действия индивидуально и в сочетании одного с другим был сходным с эффектом ДФМО и МГБГ, но менее выражен. Так, торможение роста L-клеток на четвертые сутки достигало 50 и 60%, соответственно, и носило обратимый характер в отличии от действия ДФМО и МГБГ (рис. 24). Выявлено наличие тесной

Рис.25. Аналоги ПА, модифицированные азотистыми основаниями. 1:8-(2-оксиэтил)амино-9-^-0-ксилофуранозиладенин, II: 8-(3-оксипропил)амино-9-Р-0-ксилофуранозиладенин, III: 8-(2-аминоэтил)амино-9-/}-0-ксилофуранозиладенин, IV: 8-(4-аминобутил)амино-9-р-0-ксилофуранозиладенин, V: 8-(5-аминопентил)амино-9-^-1)-ксилофуранозшаденин, VI: 8-(б-аминогексил) амино-Я-Р-й-ксшофуранозиладенин, VII: 1,3-бис(урацилш1-5-метилен)триметилендиамин, VIII: 1,3-бис(урацилил-5-метилен)тетраметилендиамин, IX: 1,3-6ис(урацилил-5-метилен)гексаметилендиамин.

Таблица 9 Влияние ДФМО и химических аналогов ПА,

модифицированных азотистыми основаниями, на уровни путресцина и ПА в бесклеточной

тест-сист еме из регене рирующен печени крыс

Вещество Путресцин Спермидин Спермин

- 7.910.8** 22.912.4 10.6±0.7

Инкубация 18.1±1.6* 23.8+1.1 ■ 12.111.5

ДФМО 14.610.8*'*' 23.311.3 11.4±0.8

I 13.710.6*'" 26.7±2.6 19.512.2'-"

II 8.4+0.4" 30.411.0''" 13.1+0.3*

III 17.6+1.5* 25.4±0.4 8.9±2.2

IV 19.4±0.2* 32.5+0.8*-" 12.4±0.04*

V 10.1+0.8** 27.510.8*' 14.2±0.8*

VI 19.0±1.0* 31.312.0*'" 9.6+1.1

VII 10.1 ±0.5** 24.2+1.1 9.2+0.7

VIII 6.6±0.2" 37.912.2''" 7.1+0.3*'**

IX 7.5±0.4" 24.2+1.0 11.7+0.4

Примечание.Концентрация путресцина и ПА-в нмолях/кг белка. Результаты даны в виде М±т для 6 па-

раллельных измерений. Достоверные отличия (Р<0.05) от исходного уровня путресцина и ПА (*) и от значений в контроле (инкубация) (**).

Таблица 10 Влияние ДФМО и химических аналогов ПА, модифицированных азотистыми основаниями, на уровни путресцина и ПА в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27 крыс'

Вещество Путресцин Спермидин Спермин

- 3.2±0.1" 4.2±0.2" 4.1+0.2"

Инкубация 5.310.2* 8.2Ю.2* 9.3±0.4*

ДФМО 3.710.4*' 8.4±0.4* 8.110.2*'"

I 3.2+0.2" 4.7±0.l" 6.6+0.02**'

II 9.110.4*" 11.4+0.4*" 15.3Ю.7*"

Ш 9.7Ю.9*" 12.9±0.7*'" 10.Ш.6

IV 7.610.3*'" 8.4±0.02* 13+0.02''"

V 9.4Ю.2*'" 4.0+0.2" 9.410.1*

VI 4.2±0.2*'" 7.1+0.5' 8.310.7*

VII 3.710.2*'" 4.8+0.2" 3.510.02*'"

VIII 3.7±0.3" 1.5+0.1'" 7.2+0.2*'"

IX 3.710.02*'" 2.010.2''" 5.8+0.8"

Примечание. Обозначения он. табл. 9

положительной связи между уровнями как биосинтеза ПА, так и пролиферации Ь-клеток, а также хорошее совпадение результатов по ингибирова-нию Пут и ПА в бесклеточной системе и по торможению скорости роста опухолевых клеток в культуре. Таким образом, используемая тест-система позволяет с большой долей вероятности судить об эффективности действия веществ на рост клеток в условиях целостного организма.

Следующая группа веществ была любезно предоставлена профессором М.Ю.Лидак и синтезирована в Институте органического синтеза Латвийской АН. В первую группу вошли окси-(I, II) и амино-аналоги (III-VI), модифицированные аденозином, с различной длиной углеродной цепи. Вторую составили вещества VИ-IX, модифицированные двумя остатками урацила, и также, с различной длиной алифатической цепи (рис.25). Наиболее удобными для оценки ингиби-торного действия веществ оказались показатели суммарных уровней

Таблица 11 Влияние ДФМО н химических аналогов ПА, модифици-

роваинык уровни пут азотистыми основаниями, на суммарные lecuntia и ПА в бесклеточных тест-системах

j Тестируемое Полиамины3 Общие полиамины0 ]

вещество Печень Гепатома Печень Гепатома ]

- 33.5±3.1 8.3±0.4* 41.4+3.9* 11.510.5* ]

Инкубация 35.9+2.6 17.5+0.7 54.0+4.2 22.810.9

ДФМО 34.7±2.1 16.510.6 49.3+2.8 20.2+0.9

I 46.2+4.8 11.3+0.3' 59.9+5.4 14.510.5*

И 43.5+1.3' 27.2+1.0* 51.9+1.8 36.311.4'

III 34.2±2.6 23.0+1.3* 51.9±4.2 32.712.2* 1

IV 44.9±0.9* 21.3+0.04* 64.3+1. Г 28.910.3* 1

1 V 41.7+1.6 13.4+0.3' 51.812.4 22.810.4

! VI 40.9+3.1 15.411.3 59.9+4.0 19.411.4

VII 33.4+1.8 8.3±0.2* 43.5±2.3* 12.0+0.4* 1

VIII 45.0±2.5* 8.8±0.5* 51.6+2.8* 12.210.7*

IX 3 5.9±1.4 7.5±0.9* 43.41!.S* ¡ 1.5+1.(Г_|

Примечание. Обозначения см. в табл. 9. а) - Пол счермидин и спермин, б) - Общие полиачины: путресци дин и спермин. иамины: и сперми-

ПА и ПА с Пут (табл.9, 10 и И). По этому показателю наиболее сильными ингибиторами оказались бис(ураци-лил)-аналоги О/НЫХ). Эти вещества были более мощными ингибиторами, чем ДФМО, и практически полностью подавляли синтез Пут и ПА (табл.12, 13) Эти же вещества значительно активировали ДАО и ПАО в тест-сис-Таблица 12

Влияние ДФМО и химических аналогов ПА, модифицированных азотистыми основаниями, на скорость образования путресшша и ПА в бесклеточной тест-

Веще- одк , .Эффект Синтез Эффект Синтез Эффект

ство в% спермидина в% спермина в%

- 12.6+1.3 0 2.4+1.4 0 1.511.1 0

ДФМО 7.911.0* 37.3 1.211.3 50 0.810.7 47

I 18.511.3* +47* 12.712.0" +429 8.911.5* +493

и 10.5+0.9 17 10.+1.1* +317 2.510.5 +67

! П! 12.211.0 3 2.5+0.7 +4 <0.001 100

IV 22.5+0.8* +79 П.411.0* +375 1.810.4 +20

! V 10.4+1.0 18 8.2+1.2* +242 3.610.7 + 140

VI 19.5+1.0* +55 8.4+1.1* +250 <0.001 100

VII 3.5+0.8 72 1.3+0.9 46 <0.001 100

VIII 15.0+0.6 + 19 15.011 Л' +525 <0.001 100

IX 2.410.6* 81 2.411.1 0 1.110.5 27

Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в нмолях/кг белка/ч. Результаты даны в виде М±т для 6 параллельных изме- рений. *- достоверные отличия от контроля, PsO.OS. а/ -знак "- " обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.

теме из регенерирующей печени (табл . 14). Напротив, все вещества, моди-

Таблица 13

Влияние ДФМО и химических аналогов ПЛ, модифицированных азотистыми основаниями, на скорость образования путресцнна и ПЛ в бесклеточной тест-снстеме из гепятомы Г-27 крыс

Вещество одк Эффект в % Синтез спермидина Эффект в% Синтез спермина Эффект в%

- 11.3±0.2 0 9.2±0.3 0 5.2+0.3 0

ДФМО 8.7±0.2* 23 8.2±0.2* И 4.0+0 2* 23

I 3.0+Ö.1* 74 3.0±0.Г 67 2.5±0.1* 52

II 24.8+0.3' + 120" 18.9+0.4' + 101 11 2+0.4' + 115

III 21.2+0.5' +88 14.7+0.4' +60 6.0+0.4 + 15

IV ' 17.0±0.1* +50 13.о±о.Г +41 8.8+0.1* +69

V П. 3+0.2 0 5.1+0.2' 42 5.3+0.1 +2

VI 8.1+0.3* 28 7.1 ±0.4* 23 4.2±0.5 19

VII 1.1+0.7' 90 Ö 6±0.4* 94 <0 ооГ 100

VIII 3.4+0.7* 70 3.2±0.7' 63 3.2±0.3* 39

IX 2.2+0.6* 81 1.7±0.9* 82 1.7±0.5* 67

Примечание. Обозначения см. табл. 12

Таблица 14

Влияние химических аналогов ПА, модифицированных азотистыми основаниями, на скорость окислительного дезаминирования путресцнна и ПА в бесклеточной

тест-системе из регенерирущей печени крыс

1 Веще- ПАО Эффект ПАО Эффект ДАО Эффект

| ство спермидин в% спермин в% путресцин в% 1

| 16.4±0.2 0 44.0+0.8 0 23.2+0.7 0

I 5.6±0.1* 66 25.4±О.Г 42 13.6+0.1* 41

II 57.0+0 Г +24 8а 20.8±0,Г 53 2 8±0.1 * 88

III 6.8+0.2* 59 17.0±0 4* 61 5.0±0. Г 78

IV 32.210.3' ' +96 32.8±0.7' 26 8.0+0.3* 66

V 25.4±0.1* +55 30.9±0. Г 31 17.4±0.1* 25

VI 13.б±0 Г 17 31.7+0. Г 28 20.4±0. Г 12

VII 94.2±0.1* +474 98.8+0.1' +125 30.4+0.1* +31

VIII 120.5Ю.З* +635 111.6+0.2* +154 69.4±1.5* +199

1 1х 150.1+0.1' +815 163.9Ю.4* +273 138.8Ю.Г +498 1

Примечание, ('корость окисления путресцнна и ПА представлена я нмолях Н/)} .иг белка/ч. Результаты даны в виде М±т для б параллельных измерений. *- достоверные отличия от контроля, Г<0.05. а) - знак "+ " обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.

фицированные аденозином, ингибировали ДАО и ПАО. Способность бис-(урацилил)-аналогов подавлять синтез ПА и активировать их распад в бесклеточных тест-системах позволяет предположить сильную противоопухолевую активность у этих веществ. Существенное ингибирующее действие на синтез ПА наблюдали на третьи сутки инкубации клеток CaOv с вещее-

твами VIII и IX (рис.26). Проверка их цитотоксической активности на основании данных по синтезу ДНК, в частности по включению меченного ти-мидина в ДНК опухолевых клеток (табл.15), показала отсутствие цитотоксической активности у бис(ураци-лил)-алкилдиами-нов. Это выгодно выделяло данный класс аналогов в свете современного поиска малотоксичных противоопухолевых агентов (М.Ю.Лидак, 1989; В.А.Горбунова, 1991). Цитотокси-ческая активность по отношению к клеткам CaOv была выявлена у двух ок-сианалогов ПА, модифицированных аденозином: вещества I и II (CEjb = 40 20 Мкг/мл, соответственно). В ответ на введение в куль-туральную среду веществ I, VIII и IX наблюдали индукцию синтеза ПА (рис.26). Существенное ингибируюшее действие на синтез ПА наблюдалось лишь на третьи сутки инкубации раковых клеток яичника с веществами VIII и IX, в то время как вещество I в этих же условиях не вызывало заметного снижения

Таблица 15

Показатели цитотоксической активности химических аналогов ПА, модифицированных азотистыми основаниями, для культуры опухолевыхклеток СяОу человека

Веще Темп роста Включение метки CEjo

-ство Время.ч Ч> Доза 1 Эффект2 Мкг/мл

I 24 -0.14 0.0326 8.50 40±25

48 0.44*' 0.326 24.10

72 0.59* 3.26 32.6 32.30 45.85

II 24 0.16* 0.034 0 20±4 20.0

48 -0.12* 0.340 21.75

72 0.67* 3.40 34.40 38.50 49.60

111 24 0.16* 0.034 20.40 >1000

48 0.78* 0.340 16.80

72 -0.27* 3.40 34.0 25.20 41.20

IV 24 -0.37 0.0353 11.60 »1000

48 0.60* 0.353 18.30

72 0.32* 3.53 21.50

V 24 -0.43 0.0367 21.10 «100

48 0.79* 0.367 25.30

72 0.14 3.67 35.40

VI 24 -0.05* 0.0381 25.60 «130

48 0.34* 0.381 31.95

72 -0.44 3.81 37.60

VII 24 -1.06* 0.0322 24.35 =150

48 1.42* 0.322 32.75

72 -0.32* 3.22 35.80

VIII 24 0.04* 0.0336 28.10 »1000

48 0.35* 0.336 35.80

72 -0.03* 3.36 33.20

IX 24 -0.50 0.0364 25.50 »1000

48 0.83* 0.364 28.25

72 0.12* 3.64 29.60

Примечание, а) - торможение включения метки в ДНК. %. *) - достоверные отличия от контроля, р<0.05. <р) -разность Ы(количество клеток в момент времени I) и ¡»(начальное количество клеток), деленная на 1.

уровней ПА в клетках (рис.26). Наблюдаемое снижение уровней ПА и торможение . клеточной пролиферации культуры СаОу под влиянием бис-(урацилил)-аналогов (рис. 26) можно, очевидно, объяснить как ингибиру-ющим действием этих веществ на синтез ПА в опухолевой клетке, так и возможным участием этих аналогов в «летальном синтезе» ДНК.

Корреляционный анализ связи проявляемой активности аналогов в клеточной и бесклеточой тест-системах показал, что чем меньше цитоток-сичность испытуемого вещества, тем выше его способность подавлять синтез ПА в бесклеточной тест-системе из ткани опухоли (г=0.8). Такая же зависимость для цитотоксичес-ких веществ была слабо выраженной. Следовательно, разработанные тест-системы можно использовать для первичного отбора и прогнозирования малотоксичных веществ с потенциальной антипролиферативной активностью.

ВЫВОДЫ

1. Выбраны основные параметры структурной целостности изолированных лизосом и обмена полиаминов (ПА) и разработаны специфические, оригинальные микрометоды количественного анализа этих показателей, защищенные авторскими свидетельствами.

2. Зависимости, характеризующие термотолерантность, осморезис-

Полизмины (кмоль/105 клеток) Количество клеток

130 А | В 800

160 '/00

140 уд 600

120 ТГ/ | 500

100 400

80 60 Г А М У т * г 1 300 200

40 100

20 РЧ 0

0 * « . N 900 800

180 с 0

160 700

140 600

120 1 1 500

100 и-4 ■ А 400

80 60 40 ш т Л ' й\ ' ' V» уд 300 200 100

20 у * О

0 ||<|

0 1 2 3 0 1 2 3 Время инкувздии (сутки)

Рпс.26. Уровни ПА в процессе роста культуры опухолевых клеток СаОг под влиянием веществ I (А), VIII (В) и IX (С). Контроль (0). Уровни ¡ТА: Пут. (Д), Сд. (□) и См. (•). Клетки (0).

тентность и кислотоустойчивость, выявили значения t°C > 37°С, осмотического давления < 0.75 МПа и рН (меньше 3 и больше 7) инкубационной среды, вызывающие разрушения лизосом до 50% и более.

3. Путресцин, кадаверин, спермидин и спермин, в частности, при концентрации 10 мМ в пробе тормозили лизис изолированных лизосом, моделируемый сочетанным действием't°C=50°C, рН=7 и тс=0.75 МПа инкубационной среды на 13, 14, 84 и 97%,.'соответственно. Протекторное действие ПА в диапазоне физиологических значений концентраций оказалось более выраженным, чем у диаминов.

4. Механизмы регуляции содержания ПА в тканях с контролируемой и «бесконтрольной» скоростью пролиферации различны. В исследованных опухолях и малигнизирующей печени полная или почти полная утрата тканью ди- и полиаминоксидазной активности обусловливает повышение уровней ПА в большей степени, чем умеренная активация орнитиндекарбок-силазы. Напротив, в регенерирующей ткани печени ведущую роль в повышении концентрации ПА играет резкое увеличение скорости синтеза этих соединений при незначительном понижении интенсивности' процессов окислительного распада путресцина и ПА.

5. Опережающие изменения в обмене ПА при гепатоканцерогенезе, предшествующие моменту появления первичных гепатом, а также при торможении скорости роста опухолевых L- и CaOv клеток в культуре ткани под действием ингибиторов синтеза ПА, указывают на первичность изменений в обмене ПА по отношению к процессу неопластической трансформации клеток.

6. Различная эффективность и избирательность характера действия тестируемых веществ на скорость образования путресцина и ПА в системах из регенерирующей и опухолевой ткани указывают на расбалансиро-ванность в опулевой ткани процесса поэтапного синтеза ПА и на изменения в структуре и каталитических свойствах полиамин-синтезирующих ферментов.

7. Из числа исследованных соединений свойства потенциальных индукторов дифференцировки и (или) ингибиторов роста опухолевых клеток проявляют вещества из группы бис(урацилил)-алкилдиаминов: 1,3-бис-(урацилил-5-метилен)триметилендиамин (VII), 1,3-бис(урацилил-5-мети-лен)тетраметилендиамин (VIII) и 1,3-бис(урацилил-5-метилен)гексамети-лендиамин (IX).

Основные публикации по теме диссертации

1. Храмов В.А., Спасов А.А., Сяткин С.П. К методике электрофоре-тического деления белков на полосках ацетата целлюлозы //Лабораторное дело. - 1976. - Т. 10, № 3. - С. 584-586.

2. Сяткин С.П., Галаев Ю.В. Окисление путресцена, спермиднна, спермина диаминоксидазой печени мышей // Биохимия. - 1977. - Т. 42, № 6. -С. 1010-1013.

3. Галаев Ю.В., Сяткин С.П. Перспективы определения диаминокси-дазной активности в клинической практике // Тез. докл. Всесоюз. симп. -Волгоград, 1977. - С. 61-63.

4. Syatkin S.P., Berezov Т.Т. Mechanism for the regulation of diamine-oxidase activity in liver in the course of malignization // XI International Congr. of Biochemistry: Absracts. - Toronto, Canada, 1979. i- P. 669. ,

5. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Окислительное дезаминирование полиаминов в гепатомах с различной скоростью роста // Вопр, мед. химии. -1979.-Т. 25,№5.-С. 611-617. ч ' ''

6. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Окислительное дезаминирование полиаминов в быстрорастущих гепатомах // Энзимология опухолей/ Под ред. Т.Т.Березова. - М., УДН, 1979. - С. 83-89.

7. Сяткин С.П. Окислительное дезаминирование полиаминов в медленнорастущих гепатомах // Энзимология опухолей/ Под ред. Т.Т.Березова. - М, УДН, 1979. - С. 90-95.

8. Сяткин С.П. Регуляция уровней полиаминов в гепатомах с различной скоростью роста // Механизмы функциональной и клеточной регуляции/ Под ред Т.Т.Березова. - М., УДН, 1980. - С. 26-27.

9. Сяткин С.П. Регуляция активности диаминоксидазы при гепато-канцерогенезе // Механизмы функциональной и клеточной регуляции/ Под ред. Т.Т.Березова. - М„ УДН, 1980. - С. 28-29.

10. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Активность орнитиндекарбоксилазы в злокачественных опухолях И Вопр. мед. химии. - 1980. - Т. 26, № 1. - С. 121-124.

11. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Быстрый спектрофотометрический метод определения орнитиндекарбоксилазы с помощью 2,4-динитрофторбсн-зола // Вопр. мед. химии. - 1980. - Т. 26, № 4. - С. 561-564.

12. Сяткин С.П. Синтез хлоргидратов полиаминов и их окислительное дезаминирование диаминоксидазой из быстрорастущих тканей // Вопр. мед. химии. -1980. - Т. 26, № 3. - С. 322-325.

13. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Обмен полйаминов в процессе гепато-канцерогенеза, индуцированного нитрозодиэтиламином II Биологический эффект канцерогенных N-нитрозосоединений. Тез. докл. Всесоюз. симп.

11-12 сентября 1980 г. - Ленинград, 1980. - С. 49.

14. Сяткин С.П. Модифицированный метод определения белка в пробах с повышенным содержанием липо- и гликопротеидов // Вопр. мед. химии. - 1981. - Т. 27, № 1. - С. 136-138.

15. Syatkin S.P., BerezovT.T. Metabolism of polyamines in normal and malignant tissue // 6-th Joint Symposium of the Biochemical societies of the GDR and USSR "Regulation in metabolism and bioenergetics": Abstracts. -Tallin, 1981.-P. 196.

16. Сяткин С.П. Микрометод флуорометрического определения полиаминов и путресцина тканей животных тонкослойной хроматографией на пластинках Силуфола УВ-254 Н Вопр. мед. химии. - 1981. - Т. 27, № 6. -С. 848-851.

17. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Обмен полиаминов в злокачественных опухолях//Вестник АМН СССР,- 1982.-№3,-С. 10-21.

18. Смирнова И.П., Березов Т. Т., Сяткин С.П. Спектрофотометриче-ский микрометод определения L-лизин-а-оксидазы И Вопр. мед. химии. -1984. -Т. 30,№1._с. 133-136.

19. Syatkin S.P., Berezov Т.Т. Metabolism of polyamines in normal and malignant tissue // International conference on polyamines. 6-10 August: Abstracts. -Budapest, Hungery. - 1984. - P.76.

20. Фролов B.A., Чибисов C.M., Казанская T.A., Сяткин С.П. Влияние геомагнитной бури на состояние митохондрий миокарда и их роль в энергетическом обеспечении сократительной функции сердца // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -1986. - Т. С И. - № 5. - С. 546- 548.

21. Сяткин С.П., Фролов В.А. Новый спектрофотометрический метод определения свободных жирный кислот в плазме крови. - М„ 1986. - 16 С. - Деп. в ВИНИТИ АН СССР от 08.10.86, №7088-В86.

22. Сяткин С.П., Фролов В. А. Быстрый спектрофотометрический метод определения лизосомных гликозидаз. - М., 1986. - 11 С. - Деп. в ВИНИТИ АН СССР от 08.10.86, № 7081-В86.

23 Сяткин С.П., Фролов В.А. Модифицированный высокочувствительный спектрофотометрический метод определения активности кислой фо-сфатазы из печени животных II Вопросы медицинской химии. - 1986. - Т. 32, №6.-С. 136-138.

24 Березов Т.Т., Сяткин С.П. Флюорометрический метод определения активности орнитиндекарбоксилазы из тканей животных // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1986. - Т.СИ, № 7. - С. 119-122.

25. Сяткин С.П., Фролов В.А. Быстрый спектрофотометрический метод определения терморезистентности лизосом из тканей животных // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1986. - Т.СИ, № 9. - С. 379-381.

26. Сяткин СП. Исследование терморезистентности изолированных

из печени крыс лизосом И Структура и функции лизосом: Тез. докл. Третьего всесоюз. симп. с междунар. учас. 17-21- ноября 1986 г. - М., 1986. -С.195-196.

27. Сяткин С.П., Фролов В.А. Спектрофотометрический метод определения осморезистентности изолированных из тканей животных лизосом // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1987. - Т. CIV, № 11. - С. 564567.

28. Сяткин С.П., Фролов В.А. Спектрофотометрический метод определения структурной целостности лизосом из тканей животных. - М., 1987. - 17 С. - Деп. в ВИНИТИ АН СССР от 26.11.87, № 8330-В87.

29. Сяткин С.П., Гридина Н.Я., Хомутов А.Р. и др. Некоторые подходы к химическому регулированию биосинтеза полиаминов // Химия физиологически активных веществ/ Под ред. Т.Т.Березова. - Нальчик, 1988. -С. 52-53.

30. Березов Т.Т., Сяткин С.П. Некоторые особенности обмена полиаминов в тканях с усиленной клеточной пролиферацией II Химия физиологически активных веществ/ Под ред.Т.Т.Березова.. - Нальчик, 1988. - С. 54-55.

31. Syatkin S.P., Berezov Т.Т. Regulation peculiarities of poiyamine metabolism in tissues with enhanced proliferation // Poiyamine in Biochemical and clinical Research: Abstracts. - Sorrento, Italy, 1988. - P.96.

32. Berezov T.T., Syatkin S.P. Determination of the ornithine decarboxylase activity in mammalian tissues by thin-layer chromatography // Poiyamine in Biochemical and Clinical Research: Abstracts. - Sorrento, Italy, 1988. - P. 95.

33. Сяткин С.П., Фролов B.A. Спектрофотометрический метод определения стабильности лизосом из тканей животных в зависимости от концентрации йонов водорода // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -1989,-№2.-С. 184-186.

34. Березов Т.Т., Сяткин С.П. Н.К.Бердинских, С.П.Залеток. Полиамины и опухолевый рост. - Киев: Наукова думка. - 1987. - 140 С // Вопр. мед. химии.-1989,-Т,№4.-С. 138-139.

35. Syatkin S.P., Berezov Т.Т., Khomutov A.R. et al. Chemical analogues of decarboxylated ornithine and S-adenosylmethionine as potential antitumor agents // Therapy with Amino Acids and Analogues. 1-st Intern. Cong.: Abstracts. - Viena, Austria, 1989. - P. 102.

36. Berezov T.T., Syatkin S.P., Khomutov A.R., Greedina N.Ja. Some approaches to the chemical regulation of poiyamine synthesis in vitro // Sixth European Symp. on Organic Chemistry: Abstracts. - Belgrade, Yugoslavia, 1989. - P.87.

37. Berezov T.T., Syatkin S.P., Khomutov A.R., Greedina N.Ja. Poiyamine's test-system for preclinical antiproliferative agents evaluation // 15-th

Intern. Cancer Cong.:.Abstracts. -Hamburg, 1990. - P.l 15.

38. Berezov T.T., Syatkin S.P., Frolov V.A., Greedina N.Ja. Polyamine as biochemical markers in antiproliferative effect of inhibitors on putrecine and polyamine biosynthetic enzymes in tissue culture of L-cells // XIV Intern, cong. of Clinical Chemistry: Abstracts. - San-Francisco, California, USA, 1990. - P. 215

39. Syatkin S.P., Berezov T.T. Cell-free test-system for the assessment of inhibiting carcinogenesis and tumor growth II XIV Intern. Cong, of Clinical Chemistry; Abstracts. - San-Francisco, California, USA, 1990. - P.216.

40. Дрогова Г.М., Чибисов C.M., Сяткин С.П., Матыев Э.С. Сезонно-суточная динамика изменения проницаемости лизосомных мембран печени кролика и возможные факторы ее регуляции // Известия АН Киргизской ССР. Серия «Медицинские и биологические науки». - 1990. -!№4. - С. 5257.

41. Сяткин С.П., Березов Т.Т., Гридина Н. Я., и др. Полиамины как биохимические маркеры антипролиферативного действия ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов и путресцина в культуре L-клеток // Биохимия опухолевой клетки: Тез. докл. Всесоюз. симп. 1990 г. - Минск, 1990.-С. 99.

42. Фролов В.А., Сяткин С.П. Спектрофотометрическое исследование физико-химических свойств изолированных из печени крыс лизосом // Вопр. мед. химии. - 1990. - Т. 36, № 6. - С. 36-39.

43. Сяткин С.П., Фролов В.А. Особенности термического воздействия на стабильность лизосом печени крыс // Патологич. физиология и экс-перим. терапия. - 1990. -№ 4. - С. 13-15.

44. Сяткин С.П., Березов Т.Т., Гридина Н.Я. и др. Полиамины как биохимические маркеры антипролиферативного действия ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов и путресцина в культуре L-клеток // Вопр. мед. химии. - 1991. - Т.37, № 6. - С. 77-81.

45. Федорончук Т.В., Сяткин С.П., Лулле И.Ж. и др. Влияние химически модифицированных аналогов полиаминов на биосинтез полиаминов и путресцина в бесклеточной тест-системе из гепатомы крыс // Бюлл. экс-перим. биологии и медицины. - 1993. - № 9. - С. 265-269.

46. Сяткин СЛ., Федорончук Т.В., Березов Т.Т. Особенности влияния модифицированных аналогов полиаминов на биосинтез полиаминов и путресцина в бесклеточных системах из быстро пролиферирующих тканей // Функциональные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии/ Под ред. Т.Т.Березова. - Нальчик, 1994. - С. 129-134.

47. Syatkin S.P., Berezov Т.Т., Greedina N.Ja., Fedorontchouk T.V. The effect of carbonyl dependent enzymes inhibitors on the growth of L-cells in tissue culture // 9-th Meeting on Vitamine B6 and Carbonyl Catalysis: Abstracts.

-Capri, Italy, 1994.-P. 211.

48. Fedorontchouk T.V., Syatkin S.P., Berezov T.T. Effect of new poly-amineanalogs on the biosynthesis of polyamines in rat hepatoma // XVI International Cancer Cong: Abstracts. - New-Delhi, India, 1994. - P.l 07.

49. Syatkin S.P., Fedorontchuk T.V., Lidack-M.Yu., Berezov T.T. Effect of synthetic polyamine analoge on polyamine metabolism in cell-free system of regenerating rat liver // Modern Enzymology;' Problems and Trends. Ed.

B.I.Kurganov, S.N.Kochetkov and V.I.Tishkov. - Nova Science Publishers, Inc., N.Y., USA, 1994. - P. 747-751.

50. Fedoronchouk T.V., Syatkin S.P., Lidack M.Yu., Berezov T.T. The biosynthesis of polyamines and putrescine in cell-free system of rat hepatoma as a result of treatment with chemically modified analogs // Modern Enzymology: Problems and Trends. Ed. B.I.Kurganov, S.N.Kochetkov and V.I.Tishkov. -Nova Science Publishers, Inc., N.Y., USA, 1994. - P. 753-757.

51. Syatkin S.P., Fedorontchouk T.V., Berezov T.T. Synthetic polyamine analogs as antiproliferative agents // Springer-Verlag. Wien. N.Y. - Amino Acids. - V.9, № 1. - 1995. - P.65.

52. Syatkin S.P., Berezov T.T., Greedina N.Ya. et. al. Polyamine biosynthesis inhibitors as potential antitumor agents // 23-rd Meeting FEBS: Abstracts. -Basel, Switzerland, 1995. -P.262.

53. Berezov T.T., Syatkin S.P., Fedorontchouk T.V. Polyamines and malignant growth // Pathology of the visceral regulation and tissue growth. Russian-German Symp.: Abstracts. - Moscow, Russia, 1996. -P.8-10.

54. Федорончук T.B., Николаева Т.Г., Добрынин 51.В., Сяткин С.П. и др. Влияние модифицированных аналогов полиаминов на пролиферацию и синтез полиаминов в опухолевых клетках CaOv // Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии/ Под ред. Д.И.Медведева. - Москва, 1996. - С. 321-325.

55. Berezov Т.Т., Fedorontchouk T.V., Syatkin S.P. New synthetic modified polyamine analogs with potent antitumor activity // 9-th NCI-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy: Abstracts. - Amsterdam, Netherland, 1996.-P.91.

56. Сяткин С.П., Федорончук T.B. Новые синтетические аналоги полиаминов как потенциальные регуляторы активности генов: Тез. докл. Второго съезда биохим. общества РАН 19-23 мая, 1997. - Пущино, 1997. -

C.467.

57. Berezov Т.Т., Fedorontchouk T.V., Syatkin S.P. Bis(Uracilyl)-polyamine analogs as potent antitumor agents // 5-th Intern. Cong, on Amino Acids: Abstracts. - Chalkidiki, Greece, 1997. - P.172.

Авторские свидетельства на изобретения

58. A.c. 826244 СССР М.Кл/1 G 01 33/62, 1981. Способ количественного определения белка в пробах/ С.ПСяткин (СССР). - 3 е.: ил.

59. A.c. 859440 СССР М.Кл3 С 12 N 9/88, 1981. Способ определения орнитиндекарбоксилазной активности/ С.ПСяткин (СССР). - 3 е.: ил.

60. A.c. 1047957 СССР А С 12 Q 1/00, 1983. Способ определения L-лизин-а-оксидазы (основная)/ Т.Т.Березов, И.П.Смирнова, С.П.Сяткин (СССР). - 3 е.: ил.

61. A.c. 1091069 СССР А G 01 N 33/48, 1984. Способ определения полиаминов/ С.П.Сяткин, Т.Т.Березов (СССР). - Зс.: ил.

62. A.c. 1163268 СССР А G 01 N 33/48; С 12 Q 1/00, 1983. Способ определения L-лизин-а-оксидазы (дополнительная)/ И.П.Смирнова, Т.Т. Березов, С.П. Сяткин (СССР). - 3 е.: ил.

63. A.c. 1294771 СССР AI G 01N 33/48, 1986. Спектрофотометричес-кий способ определения кислой фосфатазы/ С.П.Сяткин, В.А.Фролов (СССР).-5 е.: ил.

64. A.c. 1320750 СССР AI G 01 N 33/48, 1987. Способ определения кислых гликозидаз из тканей животных/ С.П.Сяткин, В.А.Фролов (СССР).

- 5 е.: ил.

65. A.c. 1409926 СССР AI G 01 N 33/483, 1988. Способ определения терморезистентности изолированных из печени крыс лизосом/ С.П.Сяткин, В.А.Фролов (СССР). -Зс.: ил.

66. A.c. 1462193 СССР AI G 01 N 33/48, 1988. Способ определения токсичности лизосомотропных химических веществ/ С.П.Сяткин, В.А. Фролов (СССР). - 2 е.: ил.

67. A.c. 1487657, ДСП, 1989. Способ определения токсичности химических веществ/ С.П.Сяткин, В.А.Фролов (СССР).

68. A.c. 1686373 СССР AI G 01 N 33/573; 1991. Способ определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных/ С.П.Сяткин, Т.Т.Березов (СССР). - 5 е.: ил.

69. A.c. 1702312 AI G 01 N 33/52, 1991. Способ определения чувствительности лизосом к pH среды/ Сяткин С.П., Фролов В.А. (СССР).

- 5 е.: ил. ' • • - ■ ,

Список использованных сокращений

ОДК - орнитиндекарбоксилаза ПА - полиамины ПАО - полиаминоксидаза Пут - путресцин Сд - спермидин Сп - спермин

ДАО - диаминоксидаза ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДФМО - дифторметилорнитин JIC - лизосомы МТБ Г - мети л гл ио ксал ь-б и с(гу а н ил гидразо н) НДЭА - нитрозодиэтиламин

Сяткин Сергей Павлович (Россия)

«Полиамины и лизосомы как система опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста»

Спектрофотометрическими методами исследованы физико-химические свойства интактных ли-зосом (ЛС) из печени крыс. Скорость лизиса ЛС существенно возрастала при температуре 37°С, рН ниже 3 и выше 7, а также при осмотическом давлении (к) выше 0.75 МРа. Температуру фазового перехода при 12. 5 и 38.5*С рассчитывали по графику Аррсниуса. Энергия активации термолизиса ЛС равна 50, 2 и 18 ккал/моль для твердой, смешанной и жидкой фаз лизосомных мембран, соответственно. Исследовали действие путресцина, кадаверина, спермидина и спермина на структурную целостность изолированных из печени крыс ЛС. Полиамины (ПА) защищали ЛС от лизиса эффективнее диаминов. Следовательно, ПА могли бы регулировать активность процессов, в которые ЛС вовлекаются. Осморезистентностъ, кислотоустойчивость, тср-мочувствительность и лизосомотропизм можно использовать в качестве доступных динамических показателей состояния этих частиц. Исследовали метаболизм ПА в перевивных гепатомах 27, 22а, 60, 61, 46, 48 и в процессе гепатоканцерогенеза, индуцированного диэтилнитрозами-ном, в сравнении с нормальной и регенерирующей печенью. Полученные данные предполагают существование двух различных механизмов увеличения уровней ПА в указанных тканях. Так, аккумулирование ПА в опухолевых тканях, вероятно, происходит благодаря резкому снижению или утрате диаминоксидазной (ДАО) активности в большей степени, чем изменениям в активности орнитиндекарбоксилазы (ОДК). В регенерирующей печени крыс это зависит от возрастания активности ОДК, поскольку активность ДАО остается постоянной. Оценивали способность 26 новых химически модифицированных аналогов ПА ингибироваггь биосинтез ПА и вызывать распад ПА в двух бесклеточных тест- системах, а также при росте L- и CaOv опухолевых клеток. Бис(урацилил) ПА аналоги оказались наиболее активными и могли быть рекомендованы для дальнейших исследований в качестве соединений, обладающих потенциальными противоопухолевыми и антипролиферативными свойствами.

Sergey P. Syatkin (Russia)

"Polyamines and lysosomes as the system of mediated regulation of cell proliferation and tumor growth processes by chemical compounds"

Physico-chemical properties of intact lysosomes (LS) from rat liver tissue were studied using spectrophotometric methods. The rate of LS lysis was distinctly increased at temperature above 37 С at pH below 3.0 and above 7.0 as well as in osmotic pressure (л) exceeding 0.75 MPa. The temperature of phase conversion at 12.5 and 38.5*C was calculated from Arrhenius plot. Activating energy of the LS thermolysis was equal to 50,2 and 18 kcal/mol for solid, mixed and liquid phases of lysosomal membranes, respectively. The effect of putrescine, cadave- rine, spermidine and spermine on structural integrity of isolated tai liver LS were studied. Polyamines (PA) were more effective in protecting LS from lysis than diamines. Consequently PA would regulate the activity of cell processes in wich LS is involved. Osmos-resistance, acid-stability, thermotolerance and lyso- somotropism may be used as available dinamic parameters of the particles state. The metabolism of PA were studied in transplated hepatomas 27, 22a, 60, 61,46, and 48 and in the course of hepatocarcinogenesis induced by nitrosodiethyl- amine in comparison with normal and regenerating livers. The data obtained suggest that there are different mechanism of elevation of PA levels in indicatig tissues. Thus the accumulation of PA in tumor tissues are probable due to the sharp decrease or loss of diamine oxidase (DAO) activity rather than that by alterations of ornithine decarboxylase (ODC) activity. In regenerating rat liver it depends from the increasing activity of ODC, while the DAO activity remined constant. 26 novel chemically modified PA analogs were evaluated for their ability to inhibit the PA biosynthsis and to promote the PA degradation in two cell-free systems as well as on the growth of L- and CaOv tumor cells. Bis- (uracilyl) PA analogs were the most active and it was proposed to further investigation as substances having potential antitumor and antiproliferative properties.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сяткин, Сергей Павлович, Москва

Президиум ВАК России

от" Л^." .....г., №

еуДйА ученую степень ДОКТОРА

_______________________________________________________ .. __ к'.г-'гл п

НЭТ&ШШ& упрюлешш ВАК Рос«

") а У

Л/ </ , у

На правах рукописи

Сяткин Сергей Павлович

ПОЛИАМИНЫ И ЛИЗОСОМЫ КАК СИСТЕМА ОПОСРЕДОВАННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ХИМИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ ПРОЦЕССОВ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И

ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

(03.00.04 - биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Т.Т.Березов,

академик МАН ВШ, член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.А.Фролов

Москва -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................6

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ..................................................................7

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................17

Роль полиаминов в процессах клеточной пролиферации........17

Деление и рост клеток в норме.....................................................17

Регенерирующая и эмбриональная ткани животных...........................19

Опухолевый рост.......................................................................21

Механизм действия полиаминов...................................................27

Взаимодействие с субклеточными структурами.........................27

Регуляция синтеза РНК...................,..........................................29

Влияние на синтез ДНК.............................................................29

Действие на синтез белка....................................................30

Молекулярные механизмы регуляции обмена полиаминов.....31

Биосинтез полиаминов................................................................31

Орнитиндекарбоксилаза......................................................31

Аденозилметиониндекарбоксилаза.........................................33

Спермидин- и сперминсинтазы.............................................36

Окислительное дезаминирование полиаминов.................................37

Диаминоксидаза.......................................................................37

Спермидин/спермин-^-ацетилтрансфепаза. (ССАТ).................39

Полиаминоксидазы...................................................................39

Регуляция обмена полиаминов химическими реагентами.......42

Канцерогены............................................................................43

Ингибиторы биосинтеза полиаминов.............................................44

Дифторметилорнитин.......................................................45

Метилглиоксалъ-бис(гуанилгидразон).....................................47

Алифатические аналоги и гомологи спермидина и спермина........49

Участие лизосом в процессах клеточной пролиферации.........52

Состояние лизосомных мембран..................................................53

Ферменты лизосом...................................................................53

Активация ядерного хроматина...................................................55

Ингибиторы биосинтеза ПА.......................................................56

Мембрано- и лизосомотропизм химических соединений........58

Действие ПА на мембраны.........................................................59

Механизм повреждающег одействия лизосомотропных агентов...........61

Лизосомы опухолевых клеток.....................................................62

Показатели количественной оценки структурной целостности лизосом.......................................................................63

Традиционные методы исследования лизосом.................................64

Осморезистентность изолированных лизосом.................................66

рН-чувствительность изолированных лизосом................................67

Термотолерантность изолированных лизосом.................................70

Резюме..........................................................................71

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................73

Спектрофотометрические методы исследования лизосом...................73

Опухолевая и регенерирующая ткани печени...................................74

Определение активности ДАО и ПАО............................................75

Количественное определение содержания ПА..................................75

Определение активности ОДК.....................................................76

Бесклеточные тест-системы........................................................77

Культуры опухолевых клеток......................................................77

Фибробласты мышей линии СЗН..........................................78

Клетки карциномы яичника человека.....................................78

Радиометрическая индикация цитотоксичности веществ....................79

Показатель темпа роста культуры (ф).............................................79

Статистический анализ...............................................................79

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.................................81

Разработка новых и модификация известных методов количественного анализа..........................................................81

Спектрофотометрический микрометод определения активности

ДАОиПАО.............................................................................81

Быстрый спектрофотометрический метод определения орнитин-

декарбоксилазы........................................................................84

Количественный микрометод определения ПА.................................86

Флуорометрический микрометод определения орнитиндекарбок-

силазы....................................................................................88

Определение белка в пробах с повышенным содержанием липо-

и гликопротеинов......................................................................89

Модифицированный спектрофотометрический метод определения активности кислой фосфатазы.................................................91

Быстрый спектрофотометрический метод определения лизосом-

ных гликозидаз.........................................................................93

Спектрофотометрический метод определения структурной целостности лизосом из тканей животных.............................................95

Спектрофотометрический метод определения осморезистентно-

сти изолированных из тканей животных лизосом..............................97

Спектрофотометрический метод определения кислотоустойчи-

вости лизосом из тканей животных...............................................100

Быстрый спектрофотометрический метод определения терморезистентности лизосом из тканей животных.....................................103

Способ определения лизомотропности химических веществ...............105

Бесклеточные тест-системы для оценки регуляторных свойств

антипролиферативных агентов....................................................108

Регуляция структурной целостности изолированных лизосом.................................................................................111

Осморезистентность изолированных из печени крыс лизосом.............112

Чувствительность изолированных из печени крыс лизосом к

рН среды................................................................................115

Особенности термического воздействия на стабильность

лизосом печени крыс.................................................................118

Регуляция структурной целостности изолированных

лизосом ди- и полиаминами........................................................122

Регуляция уровней ПА в тканях с высокой скоростью пролиферации.........................................................125

Регуляция уровней ПА в гепатомах с различной

скоростью роста.......................................................................126

Динамика изменений основных показателей обмена

ПА в процессе гепатоканцерогенеза..............................................131

Специфичность обмена ПА в регенерирующей печени.......................135

Регуляция активности ДАО в ткани опухоли...................................136

Резюме...........................................................................137

Химическая регуляция процесса биосинтеза ПА в бесклеточных системах из быстро пролиферирующих тканей............140

Производные гидрированных инденопиридинов..............................141

Бесклеточные тест-системы из опухолевой и регенерирующей ткани печени............................................................141

Алифатические амино- и оксипроизводные ПА...............................145

Скрининг химических соединений в бесклеточных тест-

системах из быстро пролиферирующих тканей печени.....................146

Культура ткани L-клеток..................................................149

Производные ПА, модифицированные азотистыми основаниями.........154

Скрининг тестируемых соединений в бесклеточных тест-

системах из опухолевой и регенерирующей ткани печени...................156

Исследование биологических свойств модифицированных аналогов ПА в клеточной тест-системе..................................165

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................169

ВЫВОДЫ..............................................................................171

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................173

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМДК - аденозилметиониндекарбоксилаза ДАО - диаминоксидаза ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДФМО - дифторметилорнитин ЛС - лизосомы

МГБГ - метилглиоксаль-бис(гуанилгидразон)

НДЭА - нитрозодиэтиламин

ОДК - орнитиндекарбоксилаза

ПА - полиамины

ПАО - полиаминоксидаза

Пут - путресцин

Сд - спермидин

См - спермин

ССАТ - спермидин/спермин-^-ацетилтрансфераза ЭДТА - этилендиаминтетраацетат СНО - Chinese hamster ovary DENSPM - N1 ,N] 1 -диэтилнорспермин

ГЛАВА 1

ВВЕДЕНИЕ

Проблема изучения и выработки подходов к направленному влиянию на механизмы регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки в настоящее время остается центральным вопросом фундаментальных и прикладных исследований биологии и медицины. Наиболее актуальным аспектом этой проблемы можно считать исследования роли низкомолекулярных эндогенных соединений таких, как 3',5'-цАМФ (С.Е.Северин, В.Н.Кулин-ский, 1976), простагландинов (И.С.Ажгихин, 1978), кейлонов {Х\У.Нагпз е1 а1., 1975) и других внутриклеточных медиаторов в регуляци клеточного метаболизма. Особое место в этом ряду биорегуляторов занимают полиамины (ПА), необходимые вещества для нормального течения процесса обновления полимерных молекул белка и нуклеиновых кислот (и.Вас1згас11 1973).

Молекулярные механизмы регуляции процесса клеточной пролиферации и роста исследуют с помощью самых различных подходов и очень интенсивно (Дж.Дингл, 1980; Н.К.Бердинских,С.П.Залеток, 1987; Т.А.Короленко, 1990; К.МзЫока, 1996). Тем не менее, на данный момент многое в этой ценральной проблеме современной биологии и медицины остается до конца не изученным. В частности, это касается возможности влиять на этот процесс опосредованно через лизосомную и полиаминовую системы. Поэтому разработка такого подхода стала целью настоящего исследования

В целом, данная работа базируется на концепциях, разрабатываемых академиками Т.Т.Березовым и В.А.Фроловым. Так, в течение последних двух десятилетий на кафедре патологической физиологии под руководст вом В.А.Фролова изучается роль лизосом в инициации процессов клеточной репарации, регенерации и гипертрофии тканей. Хорошо известны также представления, развиваемые Т.Т.Березовым, о биологическом значении

снижения или полной утрате клетками опухоли ряда ферментов азотистого обмена вообще и обмена аминокислот, в частности.

Выбор лизосом и полиаминов (ПА) в качестве объекта исследований был обусловлен также следующими обстоятельствами. Так, индукция ор-нитиндекарбоксилазы (ОДК) - ключевого фермента синтеза ПА, -одно из самых ранних молекулярных проявлений активированного метаболизма клеток, готовящихся к делению, росту и дифференцировке. Более того, окисленные до иминоальдегидов ПА ингибируют рост асцитного рака Эр-лиха, инактивировали вирус гриппа и вирус болезни Ыел^сазНа и БелсЫ, подавляя синтез белка и нуклеиновых кислот. Существует тесная взаимосвязь между синтезом ПА и процессами роста и дифференцировки злокачественных клеток, поскольку рост и пролиферация обеспечиваются высоким уровнем синтеза ПА, а переход клеток от пролиферации к дифференциации сопровождается снижением активности ОДК и внутриклеточной концентрации ПА. Общая направленность катаболизма азотистых веществ в сторону ослабления в пролиферирующих клетках (Т.Т.Березов, 1969) позволяет предположить, что в клетках опухолей два промежуточных процесса (усиленный синтез и ослабление катаболизма) направлены на поддержание высокой внутриклеточной концентрации ПА, которая необходима для быстрого роста и пролиферации опухолевых клеток (С.П.Сяткин, Т.Т.Березов, 1982). Однако молекулярные механизмы изменений активности и синтеза ферментов катаболизма ПА в опухолевых клетках, значение этих изменений для процессов пролиферации и дифференцировки в настоящее время полностью еще не раскрыты и нуждаются в дальнейшем изучении.

мотропные агенты, увеличивающие проницаемость лизосомных мембран способны стимулировать клеточную пролиферацию. При стабилизации лизосомных мембран тормозится синтез ДНК и митотическая активность. Лизосомотропные амины ингибируют процесс митогенеза, индуцированный факторами роста. Предполагают, что ПА служат модуляторами мембранной текучести. Включаясь в регуляцию плавления мембран, ПА влияют на процессы клеточного роста и деления. Уменьшение концентрации ПА в клетках, приостанавливает деление и приводит к накоплению большого количества вакуолей. При добавлении ПА в культуральную среду вакуоли исчезают и клетки возобновляют деление. Вероятно, существует взаимосвязь между плавлением мембран и содержанием ПА в клетке при стимуляции их деления. Таким образом, ПА и лизосомы вовлечены в процессы регуляции клеточной пролиферации и роста путем прямого или опосредованного влияния на скорость синтеза нуклеиновых кислот и белка. Однако взаимосвязь и характер взаимодействия между этими биогенными поликатионами и лизосомным аппаратом почти не изучены.

Таким образом, ингибиторы биосинтеза ПА вызывают дифференци-ровку опухолевых клеток, а также подавляют рост и вызывают экспрессию дифференцированных функций (меланогенез) в растущих в культуре клетках меланомы мышей. Обработка культуры Ь 1210 аналогом Пут (2,5- ди-

амино-3-гексином) вызывает быстрый, морфологически определяемый эффект вакуолизации, который возможно связан с ингибированием клеточного роста. Очевидно, что методология поиска и подходов разработки новых перспективных химиотерапевтических средств, обладающих направленным действием с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки, в частности, обмена ПА и состояния лизосомного аппарата. Это позволит корректировать синтез и осуществлять конструирование новых противоопухолевых агентов.

Таким образом, данная работа проводилась на стыке двух биологических дисциплин: биохимии и патологической физиологии. Это определило специфику экспериментальных методов и подходов. Главной задачей было правильно выбрать ключевые показатели структурной целостности лизо-сом и обмена ПА и разработать высокочувствительные, специфические, но вместе с тем доступные для технического исполнения методы количественного анализа этих показателей. Отсутствие таких методов сильно затрудняло и делало недоступным исследование в этом направлении.

Целью данной работы была разработка принципов и методических подходов химической регуляции процессов клеточной пролиферации и роста, опосредованной через полиаминовую и лизосомную систему.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

3. Исследовать механизмы регуляций обмена ПА в тканях с высокой скоростью пролиферации.

Научную новизну определяют следующие результаты.

Разработаны модификации высокочувствительных и специфических микрометодов количественного анализа активности ди- и полиаминокси-даз, орнитиндекарбоксилазы (ОДК) (спектрофотометрический и флуороме-трический), кислой фосфатазы, лизосомных гликозидаз (общая, доступная, латентная и неседиментируемая формы активности), концентрации ПА (путресцина, спермидина и спермина), белка (в пробах с повышенным содержанием и гликопротеинов), структурной целостности изолированных лизосом: спектрофотометрический (осморезистентность, термотолерантность и кислотоустойчивость) и ферментативный (показатели целостности и лабилизации лизосомных мембран), а также модельные тест-системы для оценки прямого действия химических соединений на состояние изолированных лизосом и скорость обмена ПА (бесклеточные и клеточные системы).

Показана возможность прямого лабилизирующего действия на лизо-сомы физико-химических факторов внутриклеточной среды. Полученные результ

Информация о работе

Сяткин, Сергей Павлович
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.04

Диссертация

Полиамины и лизосомы как система опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы