Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль лизосом клеток интимы аорты человека в атерогенезе и биохимическая оценка антиатеросклеротического действия различных природных и синтетических соединений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль лизосом клеток интимы аорты человека в атерогенезе и биохимическая оценка антиатеросклеротического действия различных природных и синтетических соединений"

лА

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи

ЛИ ХВА РЕН

УДК

роль лизосом клеток интимы аорты человека в атерогенезе и биохимическая оценка

антиатеросклеротического действия различных природных и синтетических соединений (клинико-экспериментальные исследования)

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1989

Работа выполнена в Институте питания АМН СССР (директор -член-корреспондент АМН СССР, профессор М.Н.Волгарев) и в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР (директор -член-корреспондент АН СССР и академик АМН СССР, профессор В.Н.Смирнов).

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор В.А.ТУТЕЛЬЯН

Официальные оппоненты: член-корреспондент АМН СССР, профессор П.В.Сергеев доктор медицинских наук, профессор А.*С.Ушаков доктор медицинских наук Н.Н.Маянская

Ведущее учреждение - Институт биологической и медицинской

хг.-'яа ¿КН СССР

Защита диссертации состоится "_"_19_г. в

" " часов на заседании специализированного Совета Д.001.02.01 при Институте питания АМН СССР (Москва, 109240, Устьинский проезд, д.2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания АМН СССР.

Автореферат разослан " "_1989г.

Ученый секретарь .Специализированного совета

кандидат медицинских наук В.М.Жминченко

Подп. к печати 198.5 г. Ф.П.Л. 3,0 Тираж 400

Типография ХОЗУ Миннефтепрома . За< "1772.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Ишемическая болезнь сердца я атеросклероз занимают ведущее место в структуре сердечно-сосудистой патологии, в связи с чем вопросы этиологии и патогенеза атеросклероза находятся в центре внимания клиницистов, патофизиологов и в настоящее время, прежде всего, специалистов в области биохимии и клеточной биологии, поскольку, несмотря на многочисленные исследования остается открытым вопрос о ключевых этапах нарушения метаболизма в патогенезе атеросклероза.

В последнее десятилетие приоритетное место занимают исследования, посвященные изучению клеточно-молекулярных механизмов участия липопротеидов в развитии атероматозного поражения, среди которых наибольшее внимание привлекают исследования, выполненные на культурах фибробластов и клеток интимы аорты человека В культуре (Репин B.C. ,1985-1987; ffoldatein , Brown, 1975-1984; Öhazov , ¡Smiraov , 1982-1986; Orekhov ,1983-1988; langhton, 1?88).

Однако, хотя и установлено, что источником холестерина в атеросклеротических бляшках являются ЛПНП, поступающие в клетки путем рецептор-опосредованного и/или рецептор-независимого эцдоцитоза, детально изучен их биосинтез и транспорт, процессы деградации этой группы "атерогенных" липопротеидоз изучены далеко не полно. В этом аспекте привлекают внимание отдельные сообщения (Шпикитер В.0.,1987; Sasahara Д988), свидетельствующие об участии лизооомального аппарата клеток интимы аорты и, в частности, протеолитических ферментов лизосом, в регуляции катаболизма ЛПНП и указывающие на взаимосвязь между функциональным состоянием лизосом клеток эндотелия артерий и атероге-

незом. Имеющиеся сведения позволяют рассматривать лизосомаль-шй аппарат клетки как одно из лимитирующих звеньев, регулирующих накопление ЛПНП в сосудистой стенке, а совокупность соответствующих биохимических характеристик функционального состояния ферментных систем лизосом и развития атероматозного поражения клеток интимы аорты человека как адекватные маркеры атероскле-ротического процесса. Вместе с тем поиск информативных критериев развития атеросклероза предполагает и возможность разработки системы оценки антнатероскдеротического и атерогенного действия отдельных компонентов пкаи, различных биологически активных соединений природного и синтетического происхождения, что будет в значительной мере способствовать разработке лечебных и профилактических мероприятий пра поиска наиболее эффективных путей борьбы с данной патологией»

Цапь и задачи исследования. Целью работы явилось выяснение роли лизосоаального аппарата клеток шш аорты человека и регуляции катаболиача нативных а модефацарозашшх форм ЛПНП; изучение взаимосвязи мезду функциональная состоянием протеоли-тической системы лизосом интимы аорты а развитием атероматозного поражения; разработка многофакторной система оценка анти-атерооклеротического действия различных синтетических и природных веществ, в том числе входящих в состав пищевых продуктов.

Основные задачи исследования:

I» Изучить взаимосвязь между различными структурными ыо-дафшшхщями ЛШШ и их атерогенностьо.

2. Исследовать роль аутофагоцятоза в регуляции рецептор-независимого эндоцитоза ЛПНП к развитии атероматозного пора-гения.

3. Исследовать роль протеолитической системы лизосом в катаболизме ЛШШ и развитии атерогенеза.

4. Разработать систему многофакторной оценки антиатеро-склеротического действия отдельных компонентов пищевых продуктов, некоторых природных и синтетических соединений по выявленным и существующим биохимическим маркерам атеросклероза.

Научная новизна. Впервые на культуре клеток интимы аорты человека установлено, что нарушение в функциональном состоянии лизосомального аппарата на уровне процессов аутофагоцитоза приводит к развитию атеросклеротического поражения клеток. Впервые выявлен факт обратной взаимосвязи между степенью накопления внутриклеточного холестерина в составе ЛШШ, пролиферативной активностью клеток и активностью комплекса карбоксильных и тио-ловых протеиназ лизосом. Впервые предложена и апробирована в эксперименте и клинике схема многофакторной оценки пнтиатеро-склеротического и антиатерогенного действия отдельных компонентов пищи (белков, жиров, углеводов растительного и животного происхождения), индивидуальных природных и синтетических препаратов (всего свыше 100 видов: продукты, ЭПК, катехин, ализол, феонол, феонифлорин, пропранолол и др.), включающая первичный скрининг на культуре клеток интимы аорты человека; вторичный скрининг в эксперименте на животных с последующей клинической апробацией.

Практическая значимость.

На основе полученных результатов разработаны комбинации различных индивидуальных соединений растительного происхождения, обладающие высокой антиатеросклеротической активностью; показана целесообразность использования в терапии сердечно-сосудистых заболеваний у? -блокаторов в комплексе с препаратами анти-

атеросклеротического действия; представлены рекомендации по использованию ряда природных соединений в качестве пищевых добавок с целью создания диетических продуктов для лечения и профилактики атеросклероза.

Апробация диссертации состоялась 9 июня 1989 года на межлабораторной научной конференции лабораторий энзимологии питания, углеводного и белкового обмена, липидного обмена и клинической биохимии Института питания АМН СССР. Диссертация рекомендована к защите.

Основные положения диссертации были доложены на: У-м Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), 1-м Республиканском съезде кардиологов ТССР (Ашхабад, 1987), УШ Международном симпозиуме по атеросклерозу (Рим, 1988), УШ Международном симпозиуме по питанию и атеросклерозу (Капри,1988), П-м Республиканском съезде кардиологов Узбекистана (Ташкент,

1988), Ш-м Всесоюзном совещании по химии и применению комплек-сонов (Челябинск, 1988); ХШ Международном конгрессе Всемирной ассоциации сердца (Мичиган,1989), I Международном симпозиуме по сердечной недостаточности - механизму и лечению (Иерусалим,

1989); Всесоюзном симпозиуме "Лечение и профилактика инфаркта миокарда" (Гагра, 1989 ).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, из которых 19 - в центральных и международных журналах.

Структура диссертации: Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов, 5 глав раздела собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Текст изложен на страницах машинописи, включая 25 рисунков и 49 таблиц. Список литературы содержит

названия 555 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные и условия опытов. Исследования проведены на 210 крысах-самцах линии Sparague-öawley и 45 кроликах-самцах шиншилла с исходной массой тела 1,5 кг.

У крыс экспериментальную гиперхолестеринемию вызывали путем включения в рацион 1% холестерина (Arakawa, 1977) •

У кроликов экспериментальный атеросклероз вызывали путем ежедневного введения орально ХС в дозе 250 мг/кг массы тела в течение 8 нед. (Аничков H.H.,1953). Перед началом эксперимента, а также к концу экспериментального периода в сыворотке крови животных определяли содержание общего холестерина (ХС) ( ZaJc, 1957), фосфолипидов (ФЛ) ( Zilversmit ,1960), триглицеридов (ТГ) ( Fletcher ,1968), ЛПВП и ЛПНП с помощью диагностических наборов (BoöhrInger Manheim , ФРГ), а также содержание

ХС и общих липидов (ОЛ) в печени ( Foich ,1957; Za3c ,1957) и площадь склеротического поражения аорты.

Методы клинического исследования. При клиническом изучении гиполипидемических свойств ЭПК обследовано 10 больных гиперлипопротеидемией типа П по классификации Predrickson (1972). Все больные - мужчины в возрасте от 50 дс 65 лет. В период исследования больные получали диету, построенную по принципу максимального удаления из пищевых продуктов полиненасыщенных жирных кислот ( Philipson ,1985). В течение экспериментального периода больным давали препарат 40$ ЭПК в суммарной дозе 9 г/день, три раза в день после еды. Перед началом эксперимента, а также к концу 2 и 4 недели исследования в сыворотке крови определяли ХС, ФЛ, ТГ, ЛПВП ( Б»Ь.11сь.у/а ,1976), ЛПНП

и содержание, малонового диальдегида (ВДА) ( Nnito Д975).

Для оценки антиатерогенных свойств сыворотки при действш препаратов ЭПК использовали кровь, 18 здоровых доноров и 15 больных ИБС (мужчины 40-60 лет), принимавших в течение 3 дней препарат 40% ЭПК - 15 г, Beyoung ЕРА - 15 г и отварной рыбы (горбуша) - 330 г в день с диетой. На 4-й день после приема натощак указанных препаратов и порции рыбы через 4 часа из локтевой вены забирали кровь.

При исследовании антиатеросклеротических свойств отдельных компонентов пищи .больные коронарным атеросклерозом (мужчины с возрастом 50-62 года) до курса лечения принимали однократно натощак 50 г подсолнечного масла, сливочного масла, трескового жира, глюкозы, фруктозы, крахмала, сухого пищевого молочного белка с содержанием казеинов и сывороточных белков в соотношении 60:40 или 22 г соевого белкового изолята 500 Е. Непосредственно до и через 1-3 ч и 2-6 ч после приема одного из указанных продуктов у больных из локтевой вены забирали кровь.

Культивирование клеток интимы аорты человека. Аутопсийный материал бьл получен спустя 1-3 ч после смерти у негоспитализи-ровашшх мужчин в возрасте 43-60 лет, умерших внезапно в основном от инфаркта гаокарда.

Клетки выделяли диспергированием атеросклеротической бляшки и/или нормальной части 0,15$ коллагеназой и 0,01$ эластазой, растворенной в фосфатном буфере ( ras ), рН 7,3, содержащем 0,1$ глюкозу, 25 вИ HEPES, 10% эмбриональную телячью сыворотку, 2,5 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл фуягизона, инкубацию проводили при 37°С постоянно встряхиванием до полного переваривания ткани, что занимало 3-4 ч. Клетки, полученные из пораженкой и/или непораженной части интимы, суспензировали в среде,

содержащей 10$ эмбриональную телячью сыворотку, 2 мМ ъ -глу-тамина и антибиотики, затем помещали в мультивал ( Gibco -Англия), содержащий 24 лунки с плотностью посадки 2-4«I04 клеток/1 см^ площади. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере С02/воздух (5:95), насыщенной водой. Среду меняли через день. На 7 день инкубации в среду добавляли I мкКи/мл 3Н-тимидина и препараты. Спустя 24 ч клетки отмывали 5 раз изотоническим фосфатным буфером ( FBS ), после чего экстрагировали клеточные липиды смесью гексан: изопропанол (3:2) по методу Нага (1978). Содержание ХС определяли по методу Siede} (1983) С помощью наборов фирмы Eoehringer Mannhelm , ФРГ), на автоанализаторе щ 580 (США).

Культивирование перитонвальных макрофагов мышей. Перито-неальные макрофаги получали от нестимулированных мышей-самцов по методу (Joldstein (1979).

Определение содержания внутриклеточных лттшгов. Липиды выделяли из суспензированных клеток по методу Bligh (1959). ФЛ определяли по липидаому фосфору, используя колориметрический метод ( Yaakovsijy ,1975). ТГ, ХС и эфиры ХС отделяли с помощью ТСХ на силикагеле в растворителе - гексан:эфир:уксусная кислота (75:23:2). Количество липидов определяли с помощью сканирующей денситометрии, методом абсорбции при 196 нм на денситометре РОМ-3 (ФРГ).

Оценка пролиферативной активности субэндотелиальных клеток интимы аорты человека. Для определения включения 3Н-тимидина к I мл суспензии клеток добавляли 2 глл охлажденного раствора 15% ТХУ. Осадок дважды промывали в 2 мл 10% ТХУ и растворяли в 200 мкл 0,5 N Naон . Раствор нейтрализовали 0,5 N таг и радиоактивность определяли на радиометре Hack beta-1215

( II® - v/elleo ), используя в качестве сцинциляционной жидкости смесь Брея ( Maniatie, 1982).

Энзимологические методы исследования. В исследуемом материале определяли активность 7 ферментов лизосом - катепсинов А, В, С, в , 1 , фосфолипаз Aj и Ag.

Активность катепсинов А, В, С определяли с использованием спектрофлуориметрического метода (Васильев A.B.,1983);

Активность катепсина в определяли с использованием спект-рофотометрического метода (Баррет А., Хит М., 1980), модифицированного в микро-метод на основе ультрамикросистемы биохимического анализа (Покровский A.A.,1969).

Активность катепсина L определяли с использованием спектрофдуориметрического метода ( Kirachke, 1962).

Активность лизосомальных фосфолипаз Aj и Ag определяли радиометрическим методом ( Stoffel ,1969) с использованием в качестве субстрата синтезированного ^С-лецитина ( Robertson, 1962).

Получение нерастворимых комплексов ЛШШ. Комплексы ЛШШ -гепарин-фибронектин-желатина получали по методу Falcone (1984).

Коллагеназа-резистентный дебрис выделяли из суспензии, образующейся в результате переваривания аорты человека 0,155? кол-лагеназой в течение 4 часов в условиях, применяемых для выделения клеток ( Chazov, I9S6)■

Эластин выделяли из аорты человека по методу Noma (1981).

Выделение липопротекдов низкой плотности методом последовательного препаративного ультраыентрийугирозания. Кровь забирали у доноров утром натощак в пластиковые пробирки без антикоагулянта. ЛПОНП были изолированы согласно lingren (1975)

ультрацентрифугированкем В роторе ВесктапбО Т ( Becknan S1V-60, Веокиап Instrumenta Inc., Pola Alto , CA ) В растворе JTaCl с плотностью 1,006 (40000 об/мин, 20 ч при 13°С). Центрифугирование осуществляли в том же режиме.

Полученные препараты ЛПШ подвергали дополнительному ре-центрифугированию и диализовали против изотонического фосфатного буфера. ЛПШ ацетилировали' при помощи уксусного ангидрида . по методу Bassu (1976). %

Выделение циркулирующих иммунных комплексов из сыворотки крови. ЦИК выделяли путем инкубации сыворотки с 5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) в соотношении 1:1 в течение 24 ч при комнатной температуре, последующим центрифугированием 5 мин при 4000 об/мин, 3-х кратным переосавдением полученных осадков 2,5% ПЭГ ( Szondy, 1983).

Выделение тромбоцитов из пельяой крови. Тромбоциты выделяли методом Haaiem (1972) с помощью последовательного центрифугирования в модификации Я.М.Соковниной (1984), используя в качестве среды разделения 6% раствор фиколла-400 с 76$ раствором верографина.

Другие методы исследования. Липосомы получали из яичного лецитина и стериламина по методу Szoka (1978).

Обогащенный препарат ЭПК получали из жира рыб ( АЪи-Nasn, 1954; Teahima ,1978).

Используемые препараты. В работе использовали глюкагон и конканавалин А ( Signa ,США), леупептин и пепстатин ( Serva, ФРГ), коллагеназа типа П ( worthington , США), эластаза типа Ш' ( fäigma , США), 3Н-тимидин (2ICi / млмоль, Amereham, UK)} стабильные аналоги простациклина и тромбоксана А2-карбациклин, и46619 , соответственно и простагландина Eg ( Upjohn Со,,

Kalamazo , MI, США) , 3-ИЗОбутил-1-метиЛКСантиП (MIX) ( Sigma, США), пропранолол (Обзидан, Щ*), шпщолол (Виксен, ВНР), ме-топролол, тимолол ( $igma ,США), верапамил ( Orion Pharm., Финляндия), нифедипш ( vsb Anzneim , ГДР), папаверин, дал-тиазем (St.Louie , МО, США), белковый изолят сои 500 Е ( Ralston Purina Со , США), препарат Щ ЭПК (Корея), 2Ъ% Beyoung ЕРА (Япония).

При получении экстрактов высших грибов_ использовали 20 представителей родов: Araricuo , Armillariella , Boletus , Collybia , Coriolus f Cortinariue ( Plammlina f Conoder-юа , Hirneola , lentinus _ , ïleurotus f Remaria f Sarcodon , Tremella, ïrioholoma.

При получении экстрактов лекарственных растений использо-. вали 40 представителей семейств: Alismataceae , Araliaceae, Asteraceaa , Berberidacsaa , Boraginaoeae r Campanulaceae, Caprifoliaoeae , Compoeitae , Euconmiceae , РаЪасеае^ labiatae , lauráceo» , Paeoniaceae , Polygonaoeao f Polyoraoeas . Renunoulaoeae , Roeaceae , ¿ohieandraoeae, ¿crophulariaoeaa . Solanaceae , Typhaoeae, Umbelliferae, Zingiboraoeae.

Индивидуальные соединения, выделенные из растений бербе-рин, ализол, фенол и др. были получены в Корее. ,

Статистический анализ. Значимость различий оценивали методом дисперсионного анализа с использованием пакета статистических программ ВЬШР 1У ( ßixon , 1977), Г -коррекция коэффициента ílsher'e Z -трансформации ( Aíifi,l979).

- II -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследовсише аккумуляции холестерина и пролиферативной активности клеток интимы аорты человека в первичной культуре при действии "атерогенных" факторов сыворотки

Включение в среду культивирования сыворотки крови больных шемической болезнью сердца (ИБС) и нерастворимых комплексов ЛПНП с компонентами внеклеточного матрикса приводит к накоплению в гладкомышечных клетках (ШК) ХС и ТГ ( Chasov ,1986; Xanghton ,1988). С целью ответа на вопрос, приводит ли подобный эффект "атерогенной" сыворотки и нерастворимых комплексов ЛПНП к увеличению пролиферативной активности 1Ж: что служит критерием развития атероматозного поражения, исследовали зависимость между степенью аккумуляции холестерина в клетках интимы аорты человека и изменение!«! их пролиферативной активности при включении в среду инкубации сыворотки больных ИБС с ан-гиографачески документированным коронарным артериостенозом и комплексов ЛПНП с эластином, гепарином, фибронектином и желатиной, а также с частицами коллагеназа-резистентного внеклеточного дебриса.

Культивирование клеток непораженной ийтймы аорты человека 5 хсчспне 24 i s срсде ЮЗ с 40¡? сывороткой крови больных ИБС, а затем в течение 24 ч в тех же условиях в среде с эмбриональной телячьей сывороткой вызывало 2-5-кратное увеличение внутриклеточного содержания суммарного ХС. Сыворотка крови практически здоровых лиц в тех же условиях не вызывала достоверного изменения уровня внутриклеточного ХС.

. . Клетки культивировали 24 часа с 10% делипвдированной сывороткой (ЛДС) и указанными добавками, затем 24 часа с 10$ сывороткой (табл. I) . Контрольные клетки интимы инкубировали

- 12 -

24 часа с Ю% ЛДС, затем 24 часа с 10% сывороткой. При этом включение 3Н-тимидина в клетки, культивируемые с сывороткой крови больных ИБС было в 1,5-3 раза.выше, чем в контрольных культурах.

Инкубация клеток с нерастворимыми ЛПНП-содержащими комплексами вызывало как и в случае с сывороткой больных ИБС, увеличение содержания внутриклеточного ХС (табл.1).

Таблица I

Влияние комплексов ЛПНП с компонентами соединительнотканного матрикса на содержание ХС и включение 3Н-ти-мидина в культивируемых клетках интимы аорты человека

Содержание Включение

холестерина, % от контроля ^Н-тимидина, % от контроля

ЛПНП - 100 мкг/мл 105 ± 8 98 ± 7

ЛПНП - дебрис 221 ± 17х 158 ± IIх

Дебрис 120 ± 14 100 ± 9

ЛПНП-эластин 204 ± 15х 148 ± 7х

Эластин III ± 13 108 ± 8

ЛПНП-Геп-Фч-Жел. 414 ± 45х 230 ± 20х

Фибронектин 97 ± 6 105 ± 5

Желатина 102 ± 12 108 ± II

Примечание: х - Р <0,05.

Так, было установлено, что клетки, культивированные в присутствии комплексов ЛПНП-гепарин-фибронектин-желатина, ЛПНП-элас-тин, ЛПНП-дебрис отличались от контрольных в 2-4 раза большим содержанием общего ХС. Следует особо отметить, что при данных условиях возрастала в 1,5-2,3 раза степень включения 3Н-тимиди-

на в кислотонерастворимуга фракцию клеток. В то же время отдельные компоненты этих комплексов в отсутствии ЛПНП не влияли на уровень ХС и включение 3Н-тимидина в клетки. При этом установлена прямая корреляционная зависимость между внутриклеточной аккумуляцией ХС и включением 3Н-тимидина при культивировании клеток в присутствии сыворотки больных ИБС и ЛПНП-с одержащих нерастворимых комплексов ( Г = 0,89 для сыворотки больных . ИБС и Г = 0,92 для ЛПНП-содержащих нерастворимых комплексов).

Исследование роли лизосомального аппарата перитонеальных макрофагов мышей в аккумуляции внутриклеточного холестерина

Как видно из результатов, представленных на рис.1, введение в культуру перитонеальных макрофагов атерогенной сыворотки больных ИБС через 12 ч и 24 ч приводило к значительному накоплению в них ХС - до 122,5-11,0 и 150,0-13,6 мкг/мл белка, соответственно, что в 2,5-3,0 раза превышало уровень внутриклеточного ХС в контрольных культурах макрофагов, инкубированных с делшщдированной сывороткой. Включение в среду инкубации совместно с атерогенной сывороткой глюкагона приводило к менее интенсивному (на 34$) накоплению ХС.

В экспериментах с конканавалином А, выполненных на культуре макрофагов, удалось показать потеяциирущее действие этого препарата на внутриклеточное накопление ХС. Так, предварительное введение в культуру макрофагов конканавалина А с последующим включением в среду инкубации атерогенной сыворотки, приводило к увеличению содержания ХС в макрофагах в 4-5 раз.

Привлекают внимание результаты исследования действия ко11 канавалина А на поглощение макрофагами нативных и модифициро-

о«200

X < ш ш ^ X = 150

5 £ ¥ * * 5

% юо о о

50

1.2-ЛС02.24Ч) 3,4-АС(1г,24 Ч) 5,6-ДС + ГЛ

А*

1-ДС

2-ДС

3-3-ДС+К.Д

1- КОНТРОЛЬ

2-ЛПНП

3- оц-ЛПНП

4-ЛПНП +К.А

5-оц-ЛПНП+КА

I

I23456

I 2345

I 2345

Рис.1. Влияние глюкагона и конканавалина А на накопление ХС в перитонеальных -макрофагах мышей при введении в культуру атерогенной сыворотки, ' нативных и ацетшшрованных ЛПНП

ванных ЛПШ. Степень включения адетилированных ЛПНП в отсутствии конканавалина А была почти в 2 раза выше, чем нативных ЛПНП. В свою очередь, если для нативных ЛПНП црактически не было обнаружено различий в степени включения в макрофаги как в отсутствии, так и в присутствии конканавалина А, то для адетилированных ЛПШ предварительная инкубация с конкаяавалином А вызывала некоторое увеличение (на 27%) содержания в клетках ХС.

Результаты энзиматических исследований, полученные при включении в среду культивирования макрофагов высокоспецифического ингибитора катепсика о -пепстатпна или ингибитора тио-ловых протеиназ - леупептина, в сочетании с атерогенной сыво-

i

i

I

I

Таблица 2

Влияние пепстатина и леупептина на активность лизосомальных протеиназ и накопление холестерина в перитонеальных макрофагах мышей

Условие эксперимента Активность катепсинов, мкмоль/мин/г белка Содержание холестерина,

В ъ С мкг/мг белка

Делипидированная' сыворотка 1,44±0,09 6,00*0,70 53,7*7,7 44,6*6,0

Атерогенная сыворотка 1,70±0,06 6,20*0,80 66,9*8,0* 110,4*12,7

Пепстатин, 5x10~% 1,51±0,07 0,82*0,61 21,6*2,7* 139,6*18,8

Леупептин, 10-5М 0,28±0,03х 1,72*0,31 60,0*5,5 144,7*11,0

Примечание: Время культивирования - 12 ч. Представлены средние данные М* м из 5-8 опытов, х - Р <0,05.

- 16 -

роткой, представлены в табл.2. Как видно, включение в культуру макрофагов пепстатина приводило к снижению активности ка-тепсина и на 68$ с одновременным увеличением содержания внутриклеточного ХС на 27$. В случае использования леупептина отмечено снижение на 83$ активности катепсина В и на 73$ - ка-тепсина Б . Содержание ХС при данных экспериментальных условиях возрастало на 32$.

Таким образом, на модели перитонеальных макрофагов мыши показано, что нарушение аутофагической функции лизосом, равно как и нарушения в системе внутрилизосомального протеолиза сопровождаются усилением процесса внутриклеточной аккумуляции ХС.

Исследование роли лизосомального аппарата клеток интимы аорты человека в аккумуляции внутриклеточного холестерина

На первом этапе в данном разделе работы было проведено исследование активности лизосомальных протеиназ в гомогенате клеток интимы аорты (рис.2). При этом было установлено, что если в области липидной полосы в гомогенате аорты обнаружено увеличение активности практически всех ферментов на 60-150$ по сравнению с непораженным участком, то в зоне атеросклероти-ческой бляшки, напротив, активность большинства лизосомальных протеиназ была ниже в среднем на 24-44$. Эти данные находятся в определенном соответствии с результатами, полученными на культуре непораженных клеток аорты с включением в среду культивирования атерогенной сыворотки. Как видно на рис.3, по мере увеличения времени культивирования в период с 24 до 48 ч параллельно степени включения ХС увеличивалась активность катепсииов А, В, 3) на 23-48$. Однако при увеличении времени культивирования до 72 ч активность лизосомальных протеиназ существенно

Рис. 2. Общая активность лизосомалъных протеиназ в клетках интимы аорты человека

ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ С АТЕРОГЕННОЙ СЫВОРОТКОЙ. ЧАСЫ

Рис. 3. Влияние сыворотки крови больных ИБС на атероскле-ротические параметры и активности лизосомалъных протеиназ нормальных клеток интимы аорты человека

- 18 -

снижалась. Подобная динамика изменения активности протеиназ в определенной степени отражает распределение активности ферментов в нормальном участке аорты, липидной полосе и атероскле-ротической бляшке; поскольку в случае энзиматического анализа в клетках интимы через 72 ч после культивирования с атероган-ной сывороткой мы имели модель типичной атеросклеротической клетки. Включение в среду культивирования свободного пепстати-на приводило к снижению активности катепсина D на 51$ и увеличению содержания внутриклеточного ХС на 51%. Параллельно с этим было отмечено и некоторое увеличение пролиферативной активности клеток интимы. Введение в культуру свободного леупеп-тина вызывало в клетках интимы снижение активности катепсина В на 80% и катепсина ъ на 40$. Введение ингибиторов в среду культивирования в составе липосом приводило к полному ингибиро-ванию активности катепсина в случае пепстатина, а при введении леупептина - практически к 80-100$ ингибированию активности исследованных тиоловых протеиназ. Следует подчеркнуть, что и степень аккумуляции ХС в клетках равно как и интенсивно включения 3Н-тимидина в данных экспериментальных условиях была значительно выше. Полученные данные дают основание считать, что во внутриклеточном катаболизме атерогенных ШШП принимает участие не только катепсин ю , на что указывали модельные эксперименты ряда авторов in vitro (Шпикетер В.£3., 1987), но и комплекс кислых тиоловых эндопептидаз. Введение в среду культивирования датиотреитола вызывало закономерную активацию ка- ■ тепсинов В и I с одновременным снижением уровня внутриклеточного ХС и пролиферативной активности атеросклеротических клеток интимы аорты человека на 40 и 34$, соответственно. Введение метионина, являющегося предшественником цистеина, вызы-

Рис. 4. Влияние пепстатина и леу-пептина на активность ка-тепсинов о я В, накопление ХС и пролиферацию клеток интимы аорты человека

НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Рис. 5. Влияние глюкагона и конканавалина А на накопление ХС клеток интимы аорты человека

200

к <

о

100

о * 50

кдтепсин о

• ХОЛЕСТЕРИН Орн|-ТИМИДИН

/л

КДТЕПСИН

в

ПЕПСТДТИН

5'Ю М ЛИПОС. ЛЕУПЕПТИН

400

о < ш<300

< ш .и

200

АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИЕ НЕПОРАЖЕННЫЕ

КЛЕТКИ (БЛЯШКА) КЛЕТКИ (НОРМА)

1

* ' 1

т/Г

' т ' тЛ

\ * /

\1 * т/1

(

1 1 < 1 . I __1_1_I-

510° Ю= Ю'С.М 510 10 10 С.М ГЛЮКАГОН КОНКАНАВАЛИН А

вало сходный, но выраженный в меньшей степени характер изменения активности ферментов и показателей развития атеросклеротического процесса в клетках интимы.

При сочетанном введении различных количеств глюкагона и ате-ротиной сиворигхм в кульгуру атероскябротическкА клеток лягай удалось обнаружить, что в диапазоне концентраций I х Ю-5 - 5 х Ю^М глюкагон практически в 2 раза снижал накопление внутриклеточного ХС, а также степень включения 3Н-тимидина на 30-3455 (рис.5).

Введение конканавалина А в культуру клеток интимы в возрастающих концентрациях от I х Ю~7М до 5 х Ю^М вызывало прямопропор-циональное увеличение содержания ХС в клетках: от 56$ до 204$. Одновременно с этим в диапазоне концентраций конканавалина А от —7 -б

5 х 10 М до 5 х 10 М было обнаружено увеличение пролиферативной активности клеток на 42-51$.

- 20 -

Введение ацетилированных ЛПШ в сочетании с конканавалином А в культуру клеток интимы аорты на 36$ увеличивало содержание внутриклеточного ХС по сравнению с клетками, в культуру которых вводили только ацетилированные ЛПШ, и в 2,9 раз по сравнению с нативными ЛПШ, введенными совместно с лектином. Аналогичным образом изменялась и скорость включения 3Н-тимидина в ДНК - на 22$ и 65%, соответственно.

Полученные результаты дают основание предполагать, что, во-первых, лизосомальный аппарат клеток интимы участвует в процессе атерогенеза. Это может реализоваться на стадии нарушения функции аутофагоцитоза и этапе образования вторичных лизосом. Кроме того, полученные результаты позволяют считать, что про-теолитическая система лизосом клеток интимы является важным функциональным звеном в регуляции катаболизма ЛПШ, а суммарная активность кислых эвдопептидаз различных групп в существенной мере определяет интенсивность процесса атерогенеза в сосудистой стенке.

Оценка антиатерогенного и антиатеросклеротического эффекта различных пищевых воздействий

Оценка антиатеоогенных и актиатеросклеоотических свойств высших грибов. Как ввдно из представленных результатов, от 9 до II экстрактов (в зависимости от среды экстракции) обладали большей или меньшей антиатеросклеротической активностью в культуре, заключающейся в снижении содержания внутриклеточного общего ХС на 24-38$ и (или) подавлении клеточной пролиферации (включения 3Н-т:1'.йэдипа) ка 15-35$ (табл.3). При этом 6 спиртовых экстрактов влияли как на 'содержание ХС, так и на интенсивность пролиферации, тогда как из исследованных водных экстрактов толь-

Таблица 3

Влияние экстрактов грибов на накопление холестерина и пролиферацию атеросклеротических клеток интимы аорты человека

Вид грибов

Содержание холе- ! Включение Н-

стерина, ! тимидина, I

мкг на I мг белка ! имп на I мг белка

_!_

спиртовой! водный Iспиртовой¡водный экстракт ¡экстракт¡экстракт ¡экстракт

Контроль 250*26 250*26 165*18 165*18

Agarlcus campestres 255*30 240*18 150*16 156*12

Armillariella sp. 230*15 245*16 I20*IIX Д9*14х

Armillariella matusutake 178*15X 169^10* 135*16 138*13

Boletua sp. 268*17 281*20 165*15 160*17

Boletus bovinus 275*25 263*23 260*28 255*18

Collybia valutipaa I75*I5X 178*10х 136*16 139*17

Coriolua pub escena I90*I3X • - I20*I0X -

Cortinarius elatior 230*15 238*15 121*12х 123*10х

FlammuljLna velutipas I92*I3X 187*13х 135*14 140*15

Canodenna lucldum ■ 155*10X 167*12х Ю8±9Х П2*8Х

Hirneola polytricha 286*37 277*35 169*15 170*15

Lentirius edodas 210*18 217*13 140*10 138*18

Pie uro tus sp. 170*10х 169*15х 138*12 138*10

Pleurotus sornucopioides 190*1Iх 185*8Х 125*10х 139*13

Pleurotus ostraatus 270*15 260*13 149*8 151*8

Kamaria sp. 265*20 258*Т8 165-15 160*16

Sarco don sp. ' 185*15х 180*18х 148*18 145*10

Sarco don aspratus 180*12х _ II0*I5X _

Iremella fuciformis 240*15 251*26 150*16 160*8

Tricholoma sp. 175*10х 180*10х 98*10х III±I2X

Tricholoma conglobatum 180*10х 185*16х I05*IIX 110*10х

Примечание. Здесь представлены средние М + т. данные из 15 опытов, х - р < 0,05.

ко 3 оказывали подобное сочетанное действие. Следует отметить, что в большинстве случаев по крайней мере по одному из анти-атеросклеротических показателей были эффективны как спиртовые, так и водные экстракты.

Спиртовые экстракты из грибов испытывались с целью выявления их антиатерогеняой активности. 15 из 20 исследованных экстрактов препятствовали накоплению внутриклеточного ХС, вызываемого атерогенной сывороткой, что выражалось в снижении содержания холестерина на 25-40$. 10 из них подавляли на 20-32$ усиление пролиферативной активности клеток, сопровождающее накопление внутриклеточного холестерина.

Как показала специальная серия исследований, изменение содержания- внутриклеточного общего ХС при атерогенной или анти-атеросклеротическом действии испытуемых экстрактов грибов определялось изменением содержания эстерифицированного ХС (рис.6).

На основе оценки антиатеросклеротических свойств экстрактов грибов в экспериментах на культурах клеток, для исследования влияния потребления грибов на аятиатеросклеротич ескпо свойства крови больных ИБС и здоровых доноров были выбраны Conodenaa lucidun , IiOntinus electee , Plsurotue comuoopioidoo И Tricholoma conglotiatum.

Из результатов, представленных на рис.7 следует, что введение в культуру атеросклеротических клеток сыворотки, полученной от здоровых ладей после однократного приема грибов (экстракта 1,5г) не вызывало изменений в скорости включения 3Н-тимцди-на, но приводило к достоверно значимому (на 13-25$) снижению содержания внутриклеточного ХС.

Исследования влияния потребления грибов на антиатерогенные свойства сыворотки крови позволяют с достаточной степенью уве-

[22 ЭФИР ХС I I ТРИГЛИЧЕРИД

^СВОБОДНЫЙ ХС ДОН ФОСФОЛИПИД

Рис. 6. Влияние экстракта грибов на содержание липидов в атеросклеротических клетках интимы аорты человека

-внутриклеточный ХС

N -т

о

6апос1егта !uc¡dum 1_впМпи* Р1еиго№* С0ГГШС0р1<Н<1в5 Тг1сЬо1ото сопд!оьо1ит

Vi.--.i-: » ' * *

3,5

3.3 5 ЗЛ . 5

ВРЕМЯ, ЧАСЫ

3.5

Рис. 7. Влияние сыворотки здоровых доноров, принимавших грибы, на накошгание-ХС и пролиферацию атероск-леротических клеток интимы аорты человека

ренности сделать заключение об антиатеросклеротическом действии danoderma lucidum , Xentinus edodee , Trlcholoma cong-lobatum И Pleurotue cornucopioides , поскольку именно для этих грибов получены однозначные результаты как с использованием экстрактов в экспериментах на культуре клеток, так и при непосредственном потреблении грибов и последующей оценке действия сыворотки на содержание внутриклеточного ХС. Следует отметить, что отсутствие влияния сыворотки на пролиферацию клеток интимы аорты человека может быть обусловлено выраженным митогенным эффектом самой сыворотки. Весь комплекс полученных данных дает основание рассматривать высшие грибы как перспективный объект для поиска и идентификации биологически активных веществ антиатеросклеротического действия, предполагает возможность использования различных видов грубых экстрактов грибов в фармакологических целях как терапевтическое средство при профилактике и лечении атеросклероза. Кроме того, учитывая высокую биологическую ценность грибов, представляется обоснованным и рациональным их использование в качестве пищевых добавок к широкому перечню продуктов питания и при разработке композиций диет, применяемых в лечебном питании в целях профилактики атеросклероза в пределах значительных групп населения.

Оценка антиатерогенных и антиатеросклеротических свойств эйкозапентаеновой кислоты, Как видно из результатов исследования, представленных на рис.8, введение кроликам ХС приводило к выраженным нарушениям липидного обмена, характерным для атеро склероза. Так, через 4 недели после начала эксперимента содержание ХС в сыворотке крови возрастало в 6,3 раза, ФЛ - в 3 раза, Л1ПШ - в 7,4 раза и ОЛ - в 7,1 раза. К концу 12-й недели эксперимента оти показатели возрастали по сравнению с контролем

- 25 -

в '0,7; 4,4; 7,1 и 6,5 раз. У животных, получавших нагрузку ХС в сочетании с препаратами ЭПК в дозе 0,6 г, выявленные изменения были выражены в существенно меньшей степени. В этом случае, хотя и отмечалось увеличение содержания ХС, ФЛ, ЛПНП.и ОЛ в сыворотке крови, оно было на 18-29$, 21-70$ и 16-48$ ниже к 4-й, 8-й и 12-й неделе эксперимента соответственно по сравнению с группой животных, получавших ХС.

Следует отметить, что в печени кроликов данной экспериментальной группы к концу эксперимента содержание ХС и ОЛ составляло соответственно 65 и 71$ от уровня, определенного у животных с холестериновой нагрузкой. Заслуживают внимания и результаты морфологических исследований, свидетельствующие о выраженном склеротическом поражении стешет аорты при нагрузке ХС (49,8*5,2$ площади сосуда) и значительно менее интенсивном процессе бляшкообразования у животных, получавших на фоне атероген-ного рациона 0,6 г препарата ЭПК (площадь склеротического поражения на 55$ меньше, р< 0,001).

Таким образом, введение кроликам на фоне индуцированного атеросклероза умеренных (200 мг/кг массы тела) доз ЭПК в определенной степени приводит к нормализации показателей липидного обмена, препятствует развитию атеросклеротического поражения сосудистой стенки.

Это дало предпосылки рассматривать ЭПК как терапевтическое средство при сердечно-сосудистых заболеваниях, обусловленных нарушением липидного обмена. С этой целью в следующей серии исследований была поставлена задача оценить влияние ЭПК на больных гиперлипидемии и свойства сыворотки крови человека с использованием в качестве модели культуры нормальных и атеросклеротических клеток интимы аорты человека.

600 300

о

./г—-'1

о-лп

1Л 1.0 ол о

2000

КОНТРОЛЬ

—о—хс + эпк

ПЕЧЕНЬ

(=□"< ЕЗхс щахс/фл

ВРЕМЯ. НЕДЕЛИ

Рис. 8. Содержание липидов в сыворотке крови и печени кроликов при введении препарат ЭПК на фоне нагрузки холестерином

МГ/ДЛ 400

* р<О.Об I-1

вой

> р <0.05

НМОЛЬ МДА/МЛ р>0.05

ДО ПОСЛЕ ХС

ДО , ПОСЛЕ ОЛ

ДО ПОСЛЕ ПОЛ

АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

ВЗВ ХОЛЕСТЕРИН I I 0>н] -ТИИИДИН

Рис. 9. Влияние препарат ЭПК на содержание липидов и интенсивность ПОЛ в сыворотке крови больных гиперлипадемией

х'во

40% В«уопд РЫБА . ЭПК ЕрА

Рис.10.Влияние сыворотки здоровых доноров, принимавших ЭПК и рыбу на накопление ХС и пролиферацию атероскле-ротических клеток интимы аорты

- 27 -

Как видно из результатов исследований, представленных ва рис.9, потребление большая гаперлипопротеидемзай в течение 2-х недель препарата ЭПК приводило к достоверному снижению в сыворотке крови 1С ва 24$ и ТГ - ка 28$. К заключительному периоду эксперимента уровень содержания ХС, ТГ, ЛПНП и ОЛ был снижен по сравнению с исходным на 36, 32, 28 и 22$ соответственно. Вместе с тем содержание МДА. в сыворотке на протяжении всего времени эксперимента практически не изменялось. Таким образом длительный прием препарата ЭПК в сочетании с -токоферолом не вызывает интенсификации процессов ПОЛ.

Таблица 4

Влияние сыворотки больных ИБС , принимавших препарат ЭПК и рыбу, на накопление холестерина и пролиферацию нормальных клеток интимы аорты человека

Условие опыта Показатель До^цэиема После приема ЭПК

Препарат 405? ЭПК •Холестерин мкг/мг белка Включение 3Н-ти-мидина, имп/мкг белка 155±18 I08±I5 IQ5±IIX 96*8

Рыба (Oncho— rhynoue masu) Холестерин мкг/мг белка - ■а— .включение "а-йш-дина, имп/мкг белка 161*13 II3±I8 II5±I5X 101*12

Примечание: Представлены средние данные Mim из 10 опытов; х - Р <0,05.

При оценке антиатеросклеротического действия препаратов ЭПК было установлено, что введение в культуру атеросклеротиче-

- 28 -

ских клеток сыворотки, полученной от здоровых доноров после приема препаратов ЗЕК или рыбы, вызывало снижение содержания внутриклеточного ХС на 23-29$ и в равной степени уменьшение включения 3Н-тимидина (рис.10).

В овою очередь из результатов по влиянию атерогенной сыворотки, полученной от больных ИБС до и после приема препарата ЭПК, на накопление ХС и интенсивность пролиферации нормальных клеток интимы видно, что в этом случае можно говорить о частичной утрате атерогенных свойств сыворотки (табл.4).

Влияние птзостагландинов и эйкозапентаеновой кислоты на аккумуляцию холестерина и пролисЬеративную активность клеток интимы аорты человека. Задачей настоящего раздела исследования явилось изучение влияния различных эйкозаноидов в сочетании с сывороткой здоровых людей и больных ИБС на процесс накопления холестерина в субэндотелиальных клетках интимы аорты человека в культуре с целью дальнейшей разработки подходов для оценки эффективности комплексной терапии атеросклероза.

Практически здоровые люди и больные ИБС в течение 3-х дней получали ежедневно по 10 г препарата ЗЕК.' На 4-й день через 2 ч после приема ЭПК из локтевой вены забирали кровь и получали сыворотку. Прием здоровыми донорами в течение 4-х дней препарата ЭПК приводил к увеличению содержания ЭПК в составе общих жирных кислот (ОЖК) сыворотки в 3,4 раза. При этом содержание арахидоновой кислоты (АК) в составе ОЖК не менялось и концентрация ОЖК в сыворотке сохранялась на исходном уровне. В этих условиях соотношение ЭПК/АК возрастало в 3,1 раза.

В дальнейшем исследовали влияние сыворотки с повышенным содержанием ЭПК на культуру клеток интимы аорты человека в со-

У-

о а. о ш л о

о X X ш

о

150

100

50

250г

гоо<-

НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

i

га*

i

й

ХОЛЕСТЕРИН

I 1[зн] -тимилин

эпк

эпк ш

эпк

эпк

1146619 (ТХ Аг)

КАРЬАЦИКЛИН (Рв 1г'

рд£2

Рис. II. Влияние эйкозаноидов и сыворотки больных ИБС, принимавших препарат ЭПК, на содержание ХС и пролиферацию непораженных клеток интимы аорты человека

четании с различными эйкозаноидами. Введение аналога ТХ/^- и 4661$ в сочетании с контрольной сывороткой больных ИБС приводило к резкому накоплению холестерина в нормальных клетках интимы и степени включения в них 3К-тимидина (в 2,5 и 1,5 раза соотватствен-но). Напротив, введение и 46619 в сочетании с сывороткой, полученной от больных после приема препарата ЭПК в значительной степени ограничивало атерогенный эффект данного эйкозаноида. В свою очередь, если карбациклин и pgI2 в сочетании с контрольной сывороткой практически не оказывали влияния на уровень холестерина и интенсивность включения 3Н-тимидина в клетки интимы, то их введение в культуру совместно с сывороткой с повышенным содержа-

нием ЗЕК вызывало некоторое снижение этих показателей (рис.П).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности оценки эффективности антиатеросклерогаческих свойств отдельных компонентов пищи и продуктов питания, богатых Э1Ж, по совокупности стандартных клинико-биохимических показателей липидного спектра крови и изучения антиатерогенных свойств сыворотки на культуре клеток интимы. . .

. Опенка антиатерогенных и антиатеросклвротических свойств отдельных компонентов чая. Поскольку в состав чая входят биологически активные соединения, действие которых связано с нормализацией микроциркуляции, снижением процессов перекисного окисления липидов ( Ка31то1;о ,1988), имелись основания считать, что одним из компонентов биологического действия чая может являться наличие антиатеросклвротических свойств.,

В культуре нормальных и атеросклеротических клеток водный экстракт чая проявлял антиатеросклеротическую активность на модели пораженных клеток и антиатерогеннув - при включении в культуру нормальных клеток интимы в сочетании с атерогенной сывороткой, полученной от больных ИБС. Однако в первом случае аффект водного экстракта проявлялся лишь при дозе экстракта 300 мкг/мя, а во втором - при дозе 100 ыкг/мл (уменьшение содержания ХС на 30$) и носил дозозависимый характер - при дозе 300 мкг/мл накопление ХС в клетках снижалось на 43$. Следует отметить, что наряду со снижением содержания ХС в пораженных клетках и уменьшением степени его аккумуляции в нормальных, и в том и в другом случае обнаружено уменьшение пролиферативной активности в среднем на 30$ при дозе экстракта чая 300 мкг/мя.

При оценке антиатерогенных свойств указанных препаратов

Рис. 12. Влияние сыворотки крови больных ИБС, принимавших общий экстракт, катехин, эпигалокатехин галат и сапонин чая, на содержание ХС и пролиферацию непораженных клеток интимы аорты человека

использовали кровь больных ИБС, принимавших в течение 3-х дней общий экстракт чая 6 г, катехин - 2 г, эпигалокатехин галат -1,5 г и сапонин - 0,5 г в день. На 4-й день после приема натощак указанных пргпарахсг юрсз 3,5 2 5 ч из локтяяой вены забирали кровь и отделяли сыворотку центрифугированием. До окончания исследования (в течение 5 ч) испытуемые не получали иной пищи.

Как видно из рис.12, наиболее отчетливое действие исследуемых препаратов проявлялось спустя 5 ч после их приема. В этом случае все образцы взятой от доноров сыворотки, введенной

в культуру клеток, проявляли шракеннув антиатеросклеротичвскую активность, о чем свидетельствовало снижение уровня внутриклеточного ХС ва 29-33$, а также степени включения 3Н-тимидина на 27 и 30$ в случае приема донорами (-) эпигалокатехин галата и сапонина, соответственно.

Обобщая полученные результаты по оценке влияния общего экстракта индийского зеленого чая на свойства сыворотки, модно сделать, во-первых, вывод о целесообразности применения использованной экспериментальной схемы оценки антиатеросклерощических свойств различных биологически активных соединений, поскольку сходные данные были получены и в предыдущих разделах исследования. Во-вторых, возможной практической аппликацией результатов работы может явиться создание на основе комбинаций индивидуальных цриродных соединений различного биохимического действия (антиоксидантного, гиполипидемического) специализированных продуктов питания для широкомасштабной профилактики атеросклероза.

Оценка антиатеоогенных и антисклеротических свойств отдельных компонентов пиши. В настоящем разделе работы была предпринята попытка провести комплексную оценку гиполипидемического и антиатеросклеротического действия различных пищевых веществ белковой, углеводной и жировой природы.

Полученные результаты позволили разделить исследованные компоненты пищи в зависимости от характера их действия на изучаемые показатели, на 3 группы. В первую группу входят глюкоза, фруктоза и крахмал, потребление которых не вызывало каких-либо изменений в активности лизосомных гидролаз тромбоцитов, содержании холестерина в сыворотке крови и ЦИК. Ко второй груп- | пе относятся те компоненты пищи, однократный прием которых при- "

Активность В ТРОМБОЦИТАХ ХС СЫвОРОТКИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ

КАТЕПСИНОв ВиС "РОСФОЛИПАЭ А, U Аг И ХС 11ИК ХС

ВРЕМЯ. ЧАСЫ - БЕЛКОВЫЕ ИЗОЛЯТЫ СОИ ---БЕЛКИ МОЛОКА

Рис. 13. Характеристика гиполипидемических и антиатерогенных ■ свойств белкового изолята сои 500 Е

водил к возрастанию активности кислых протеиназ и фосфолипаз тромбоцитов и изменению содержания ХС в сыворотке крови или в составе ЦИК в сторону увеличения. К третьей группе относятся те компоненты пищи, потребление которых в виде однократной пищевой нагрузки вызывало снижение большинства показателей по сравнению с исходным уровнем. К ним относятся белковый изолят сои 500 Е, подсолнечное масло и тресковый жир. В этом случае обнаружено снижение, в среднем, активности катепсина В на 20$, катепсина С на 24-39$, фосфолипазы Aj на 27-61$. В то же время, снижение уровня ХС в сыворотке крови (на 22$) было выявлено только в случае потребления подсолнечного масла, а уменьшение ХС в составе ЦИК (на 30$) только при использовании в качества пищевой нагрузки белкового изолята сои 500 Е. Полученные результаты совпадают с известными данными о гипо- или гипэрдипкдеми-

- 34 -

ческом, пшерхолестеринемическом действии таких компонентов пищи, как белки и жиры различного происхождения С йооап±&Ы, 1982; &д£опо ,1983; НыЧов ,1987). В свою очередь об адекватности используемых показателей свидетельствуют как результаты, полученные в предыдущих разделах работы, так и экспериментальные и клинические исследования других авторов (Васильев А.В.,1988,1987,1988; Тутельян В.А.,1987).

Для сравнительной оценки влияния исследуемых компонентов пищи на антиатерогенные свойства сыворотки крови были выбраны белковый изолят сои 500 Е и йолочные белки. Подобный выбор определяется имеющимися сведения об их противоположном действии на обмен ХС ( китоу ,1985). Как видно из рис.13, введение в культуру атеросклеротических клеток интимы сыворотки, полученной от больных после приема молочных белков, не вызывало значимых изменений в содержании ХС. В свою очередь, введение в культуру клеток сыворотки больных, принимавших белковый изолят сои 500 Е, приводило к достоверному снижению уровня внутриклеточного ХС на 30$.

Полученные результаты в совокупности с данными биохимических исследований крови позволяют сделать вывод, что, во-первых, потребление белкового изолята сои 500 Е сопровождается приобретением сыворотки антиатерогенных свойств, и во-вторых, о достаточной информативности используемых показателей для оценки анти-или атеросклеротического действия отдельных компонентов пищи. Подобный подход, реализуемый с использованием более широкого метаболического скрининга, характеризующего состояние обмена лииидов и липопротеидов, может служить основой для "конструирования" рационов, используемых, в профилактике и дието-

- 35 -

терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Оценка антиатерогенных и антиатеросклеротических свойств биологически активных соединений растительного происхождения

Оценка антиатерогенных и антиатеросклеротических свойств растений. Целью настоящего раздела работы явилась сравнительная ьшогофакторная оценка антиатеросклеротических свойств отдельных представителей лекарственных растений на модели гиперхоле стеринемии и индуцированного атеросклероза на животных, культуре атеросклеротических клеток интимы аорты человека и в клюшке.

С целью оценки возможного влияния некоторых препаратов лекарственных растений на антиатерогенные свойства сыворотки крови были выбраны те виды, которые как в культуре пораженных клеток зштиш аорты человека, так и на модели экспериментального атеросклероза у кроликов проявили свою антиатеросклерстическую активность. Введение в культуру атеросклеротических клеток сыворотки, полученной от здоровых лиц после приема экстрактов, приводило к достоверному снижению содержания внутриклеточного ХС на 23-30$ и пролиферативяой активности на 22-25$.

TaKütó образе™, результаты лсслсдс^ашй по гнявлен^ антгт-атеросклеротических свойств у ряда лекарственных растений, проведенных на различных экспериментальных моделях и функциональных уровнях, позволяют выделигь по совокупности данных лак наиболее эффективные Четыре В2ДЗ - Gano doma lucidum, lycidtm chinesis Killer, Crataegus pirmatifida Bunga И Cassia ottussifiüae. Пожало этого детальный анализ предстазлэннных результатов позволяет считать, что в большинстве случаев данные

к к т Тч к к Н н н в1

* а

к к г Гх V

• * * •

Ч; * * »1 4 ц ь Ц • Ч н --1

1. Со981 о оЫимИоГюе

2. 1усшт сЫпепзи МШег

3. СгсНоедив ртпаМПйо Випдв

4.Сапо<1егто 1ис№ит

5. А*1годо1ив 4оЬипситРаИ

6.ТурЬо ог|«пГоИя С. рвг»1.

7.АЛвто р1ап»одо-адиоГ|СОи.

8.$о№а и.

9.£рип«<Нит Мака> Ю.^*ег«ол1ав диЫа Веп1Ь •! Иоок И. $сиГ«Ыапа Ьа'1са1еп81» Сеогд* 12.5сгорЬи1опа о1йЬотм ОКу«г

Рис. 14. Сравнительная оценка гилохолестеринемических свойств лекарственных растений - содержание ХС в сыворотке крови крыс, кроликов и клетках интимы аорты человека

АЛКАЛОИД (БЕРБСРИН) ГЛИКОЗИДЫ

ПОЛИСАХАРИДЫ

КОМБИНАЦИЯ ПРЕПАРАТ08(А,6)

ш к

50

>1 х аз

ы °

I" <1

а

^ т ■ т -

^ Т г—?" и * чь Т • т

- т * 1—— —Ад —т6

* -1- -. 1 1 » ■ * • 1.1 1 * | ' •

Ю 30

100 Ю 30

100 10 30

100 10 30

100 с.мкг/мл

1-] аНегсогпае <]иЫаВепШ«Г Ноок

2-Ровоп1а лШгоПсозо Апйго«

3-Рапох бЬвепд*

4-Е1«и»«соеосси& *«писо»и» Мах1т

5-АгаМа «1а)а вавтап

6-Риегопа 1оЬаю «¡11(1

7-АНгада1и« йаЬипсит Ра11

Рис. 15. Влияние природных соединений растительного проис-ховдения на содержание 1С атеросклеротических

клеток интимы аорты человека

по гипохолестеринемичному эффекту in vivo и антиатеросклеро-тическому действию в культура клеток в основном носят сходный характер (рис.14).

Все изложенное позволяет сделать вывод об адекватности использованной многофакторной оценки для выявления антиатеро-склеротических свойств лекарственных растений. Это раскрывает возможность их широкого применения для профилактики и лечения атеросклероза, а также создает предпосылки для выделения и идентификации биологически активных соединений, обладающих выраженным антиатеросклеротическим эффектом.

Оценка антиатерогенных и антиатеросклероткчесгглх свойств некоторых компонентов лекарственных растений. Как видно из результатов, представленных на рис.15, введение исследуемых ■ соединений в среду инкубации атеросклэротических клеток интимы аорты человека в концентрации 50-100 мкг/мл в подавляющем большинстве случаев приводило к снижению уровня внутриклеточного ХС на 28-49$, тогда как при введении фуерарина из íueraxia Lobata v/uid . интенсивность накопления ХС возрастала на 28$. При этом в большинстве случаев было обнаружено снижение скорости включения 3Н-тимидина в клеточную ДНК на 27-33$. Вместе с тем, их комбинации оказывают более эффективно антиатеросклеро-тические действия, причем при низкой дозе - 30 мкг/мл. Так, в случае комбинации А на 52$, комбинации Б - на 54$ вызывало снижение ХС. Существенно, что помимо прямого антиатеросклеротиче-ского действия исследуемые препараты обладали и антиатерогенны-ми свойствами. В частности, введение берберина, феонола я фео-нифлорина в культуру нормальных клеток интимы аорты человека в сочетании с сывороткой больных ИБС, перенесших инфаркт миокар-

- 38 -

да, в значительной степени снимало атерогенное действие последней, что выражалось в снижении уровня внутриклеточного ХС на 30-45$ . При этом в 37$ случаев было отмечено уменьшение пролиферации клеток. Полученные результаты послужили основанием предпринять попытку оценить действие наиболее эффективных по отношению к культуре клеток препаратов - берберина и феонифло-рина на свойства сыворотки практически здоровых людей с точки зрения ее антиатерогенного потенциала. Как оказалось, однократный прием указанных препаратов приводил к увеличению антиатеро-генных свойств сыворотки, что» выражалось в снижении уровня накопления внутриклеточного ХС в атеросклеротических клетках интимы аорты человека в среднем на 30$ (доза препаратов - 0,9г).

Подвода итоги настоящего раздела исследований, можно отметить целесообразность используемой схемы скрининга лекарственных растений для. оценки их гиполипидемических и антиатеро-склеротических свойств с последующим отбором для углубленного исследования и поиска биологически активных соединений с анти-атеросклеротическими свойствами.

Оценка антиатеросклёротических и атерогенных свойств сердечно-сосудистых лекарственных препаратов

Влияние Р-блокаторов и антагонистов кальция на аккумуляцию холестерина и пролисберативную активность клеток интимы аорты человека. Как видно из результатов, представленных на рис. 16, введение в.среду культивирования атеросклеротических клеток интимы аорты человека верапамила, вифедипина, папаверина и дилтиазема приводило к достоверному снижению уровня внутриклеточного ХС на 65 , 50 , 34 и 29$.соответственно. В свою оче-

IПП)

Рис. 16. Влияние природных соединений, некоторых синтетических лекарственных препаратов и их комбинаций на содержание ХС и пролиферацию атеросклеро-тических клеток интимы аорты человека

редь, одновременно со снижением степнни аккумуляции ХС отмечено и уменьшение пролиферативной активности атеросклеротических клеток интимы соответственно на 64, 46, 45 и 30$.

При изучении¡прямого влияния на атеросклеротические клетки интимы р -блокаторов удалось установить, что все исследованные соединения: пропраншюл, ¡«ехопролол, ппндслол еызнвяди увеличение содержания в .клетках ХС на 31-40$ и интенсивность включения 3Н-тимидина на 39-75$.

Комбинированное введение в культуру клеток представителей двух групп сердечно-сосудистых препаратов - нифедиплна и глето-пролола сопровождалось как уменьшением уровня внутриклеточного ХС, так и снижением пролиферативной активности.

Привлекают вникание данные по исследованию ко^биннроззпного

ПЕРВИЧНЫЙ СКРИНИНГ

Атерогенная сыворотка

ВТОШЧНЫЙ СКВШИНР

ПИЩЕВАЯ ИЛИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ НАГРУЗКА

ХРОНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА НА МОДЕЛИ ИНДШИРОВАННОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА КЛИНИЧЕСКАЯ АПРОБАЦИЯ ИСПЫТУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Рис. 17. Схема многофакторной оценки антиатеросклеро-тических свойств пищевых веществ и индивидуальных биологически активных соединений

действия комплекса антиатеросклеротических препаратов (комбинация экстракта гриба Ganodenna íucidum , эпигалокатехин галата ИЗ чая, полисахарида ИЗ Laminaria japónica aresh, полисахарида из Atractyiodes icoreana и гликозида, поли-, сахарида из Panax Ginseng тъеа и j3 -блокаторов на атеро-склеротические клетки интимы аорты человека). Как видно, одновременное введение в среду культивирования изучаемых препаратов полностью снимало атерогенный эффект как пропранолола, так и пиндолола, что в равной степени относится и к процессу накопления внутриклеточного ХС и к пролиферативной активности клеток (рис.16).

Следует подчеркнуть, что подобный эффект наблюдался преимущественно при использовании именно комплекса указанных природных соединений, в основном, растительных, тогда кап антиатеро-генное действие индивидуальных соединений на фоне введения в культуру J3 -блокатора было выражено в меньшей степени. Это совпадает с практикой традиционной фармакологии, указывающей на высокую эффективность комплексной лекарственной терапии ( Feng Yus ,1983).

Общим результатом изложенных исследований может явиться

л •«т-тго 'ГУ « »Ti /■N-n/^rfxo тгггу/*--г\Т1Г\"т ст^тдто-плг» VTTQT^^TT^'írQ-« HUiV* v^A«* V^tiw» w —, Л4..Д4 ..........

ских и антиатерогенных свойств отдельных компонентов пищи, включающую первичный скрининг на культуре клеток интимы аорты человека с последующей детальной характеристикой на экспериментальных моделях и при клинических исследованиях (рис.17).

Используемая схема была апробирована в наших исследованиях в дальнейшем и при оценке антиатеросклеротических свойств экстрактов ряда лекарственных растений и некоторых индивидуаль-

ных биологически активных соединений, входящих в их состав.

Анализ проведенных исследований позволяет заключить, что независимо от химической структуры отдельных компонентов пищи, индивидуальных природных и синтетических соединений, независимо от характера их специфического биохимического действия на различных этапах метаболизма, общим эффектом антиатеросклеротиче-ского или атерогенного действия каждого из них является коррелятивное изменение содержания внутриклеточного ХС и пролифера-тивной активности клеток интимы аорты человека. В свою очередь, нами установлено, что различшй по своему механизму характер модификаций функционального состояния лизосомального аппарата клеток интимы также сопровождается изменением данных показателей. Кроме того, как следует из данных литературы, одним из компонентов биохимического действия большинства наиболее изученных соединений (сапонина, р -блокаторов, простагландинов) является их влияние на ферментные системы и мембрану лизосом, причем атерогенные соединения вызывают дисфункцию лизосомального аппарата. Наряду с этим полученные нами результаты указывают, что на фоне атерогенного воздействия сыворотки больных ИБС природные экстракты, проявляющие антиатеросклеротическую активность, вызывают нормализацию функционального состояния протео-литической системы лизосом. Это позволяет рассматривать лизосо-малышй аппарат клетки интимы как весьма важное структурцо-ме-таболическое звено в патогенезе атеросклероза и предполагает необходимость учитывать данное обстоятельство как при изучении атерогенных воздействий, так и при разработке и поиске средств лечения и профилактики данной патологии.

- 43 -

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлена роль аутофагаческой функции лизосом в процессе атерогенеза на модели перитонеалышх макрофагов и клеток интимы аорты человека в культуре. Индукция процессов ■ аутофагоцитоза глюкагоном приводила к снижению уровня внутриклеточного холестерина в 2 раза и степени включения 3Н-тимидина на 30-34$. Ингибирование аутофагоцитоза конкадавалином А в 2-5 раз увеличивало накопление в макрофагах и клетках интимы холестерина и вызывало возрастание пролиферативной активности последних на 42-51$.

2. Нерастворимые комплексы ЛПШ1 с компонентами соединительно-тканного матрикса и сыворотка больных ИБС при введении в культуру клеток интимы аорты человека вызывают усиление аккумуляции холестерина и пролиферативной активности клеток. При этом установлена прямая корреляционная зависимость между увеличением содержания ЛПНП и степенью включения 3Н-тимидина.

3. Установлено, что модифицированные ЛПНП поступают в клетки интимы аорты человека преимущественно по пути неспецдфиче-ского эндоцитоза. Введение в культуру клеток интимы ацетилиро-ваяных ЛПНП на фоне действия конканешалияа А приводило к 2,3 раз более высокому содержанию внутриклеточного холестерина и увеличению на 65$ скорости включения 2Н-тимадина. по сравнению с на-тлвными ЛПНП.

4. Впервые установлена роль лизосомальных эндопептидаз -катепскнов В, £ и ц в развитии атеросклеротического процесса. Включение в культуру перитонеальных макрофагов и клеток интимы аорты человека специфичных ингибиторов указанных протекназ -пепстатина и леупептина в составе липосом приводило к увеличению содержания внутриклеточного холестерина на 30-190$ и пролифера-

тивной активности клеток интимы на 40-50$. Активация тиоловых лизосомалъных эядопептидаз серусодеркащими соединениями приводит к снижению внутриклеточного холестерина и пролиферативной активности атеросклеротических клеток интимы аорты человека на 25-40$.

5. На модели культуры клеток интимы аорты человека, экспериментального атеросклероза у кроликов и в клинике на больных ИБС и здоровых донорах приведена оценка антиатерогенных и анти-атеросклеротических свойств 20 видов высших съедобных грибов

и некоторых компонентов чая. Остановлено, что наиболее выраженными антиатеросклеротическими свойствами обладают виды грибов -

Ganodarma lecidum , Trioholoma conglobatum , Pleurotuu oornuoopioidea и компоненты чая (эпигалокатехин галат, сапонин).

6. На модели культуры клеток интимы аорты, экспериментального атеросклероза у кроликов и в клинике на больных ИБС проведена оценка антиатерогенных и антиатеросклеротических свойств препарата 40$ ЭПК, выделенной из рыбы. Впервые установлено,что включение в культуру клеток интимы сыворотки больных ИБС с высоким содержанием ЭПК снимает прямое атеросклеротическое действие стабильного аналога тромбоксана А2 - и 46619 и потенцирует адтиатеросклеротическое действие стабильного аналога простаглан-дина 12 - карбациклина и простагландина

7. На модели культуру клеток интимы аорты человека, крыс, кроликов и в клинике на больных ИБС проведена оценка атеросклеротических и антиатеросклеротических свойств 40 видов лекарственных растений и ряда индивидуальных соединений растительного происхождения. Наиболее выраженными антиатеросклеротическими свойствами обладают виды растений - lycium chinensie muer, Crotaögus pirmatiíida Bunge, Caseia obtuseifoliae, Aetragalu«

- 45 -

<1аЬиг1сит Ра11, а также такие индивидуальные соединения растительного происхождения как ализол, феонол, феонифлорин.

8. На модели культуры клеток интимы аорты человека проведена оценка атерогенных и антиатерогенных свойств синтетических лекарственных препаратов, принимаемых больными ИБС: -блокато-ров (пропранолол, метопролол, пиндолол и тимолол), антагонистов кальция (нифедипин, верапамил, папаверин), кальцийсвязывающих комплексонов (З-диметил-1-оксипропилидея-бис-фосфоновая кислота, оксиэтилидендифосфоновая кислота). Установлено, что ^-блока-торы увеличивают атерогенный потенциал сыворотки больных ИБС

и вызывают усиление аккумуляции холестерина в клетках и их про-лиферативной активности, тогда как антагонисты кальция и кальций связывающие препараты проявляется антиатеросклеротические свойства. Впервые предложены эффективные комбинации природных соединений с -блокаторами и установлена принципиальная возможность компенсации атеросклеротического действия последних.

9. Проведена клиническая оценка антиатеросклеротических свойств отдельных компонентов пищи (белков, жиров, углеводов растительного и животного происхождения). Показано, что наиболее выраженным антиатеросклеротическим: действием обладает белковый изолят сои 500Е. При этом установлена информативная ценность таких показателей, как содержание холестерина в состав ЦИКов, активность лизосомальных протеиназ и фосфолипаз тромбоцитов, накопление холестерина и включение 3Н-тимидина в клетках интимы аорты человека при введении в культуру сыворотки больных ИБС после однократной пищевой нагрузки.

10. Впервые установлена взаимосвязь между функциональным состоянием протеолитической системы, внутриклеточной системы лизосом, внутриклеточной аккумуляцией холестерина и пролифера-

тивной активностью клеток интимы аорты человека при действии антиатеросклеротических факторов, что предполагает ведущую роль лизосомального аппарата в механизме рецептор-независимого эндо- . цитоза при атерогенезе.

II. Разработана многофакторная система оценки антиатероген-ных и антиатеросклеротических свойств отдельных компонентов пищи, природных биологически активных соединений и синтетических средств, включающая первичный скрининг препаратов на культуре клеток интимы аорты человека; вторичный скрининг сыворотки здоровых доноров и больных ИБС на культуре клеток интимы аорты . после одно- или многократной пищевой и фармакологической нагрузки; детальной оценки физиологических эффектов испытуемых средств на хронической модели индуцированного атеросклероза с последующей клинической апробацией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильев A.B., Ли Хва Рен, Погожева A.B., Тутельян В.А. Активность лизосомальных гидролаз в нормальных и атеросклеро-тически измененных участках аорты человека. - Тезисы докладов У Всесоюзного симпозиума по биохимии липидов. Алма-Ата, 1987, 16-19 октября,- с. 154-155.

2. Ли Хва Рен, Погожева A.B., Васильев A.B., Чарыев Х.Э.,Мухин Д.Н., Тертов В.В. Активность лизосомальных ферментов в ате-росклеротической аорте человека. - Тезисы докладов 1-го съезда кардиологов ТССР. Ашхабад, 1987, 26-28 октября, с.105.

3. Orekliov A.N., Ruda W.Ya., Baldenlcov G.N., Tertov V.Y., KhaehimoY Kh.A., Ii Hwa Ryong, Lyakishey A.A., Koilov S.G'., ïiracbuk V.À., ÖmimoY V.N. Atherogenic effects of beta ЪЗоск.егв on cells cultured from normal and atherosclerotic aorta. Aoerican Journal of Cardiology, 1988, 61 (13), pp. III6-III7.

4. OraVbov A.n., Tertor V.V., Baldenkov C.N., Ii Hwa Eyong, Koslov s.c., lyakishav A.A., Mcachuk V.A., Ruda M .Ya. СаЗ>-

diovascular drugs and atherosclerosis. — Abstracts. Vlllth International Symposium on Atherosclerosis. Ноше (Italy) October 9-13 1988, p.694.

5. Ли Хва Рен, Васильев А.В., Орехов А.Н., Тертов В.В., Тутельян В.А. Антиатеросклеротические свойства лекарственных растений. - Химико-фармацевтический журнал, 1988, И 10,

с. 1236-1241«

6. Orekhov А.Н., II Hwa Ryong, lertov V.V. Antiatherogenic and entiatherosclerotic effects of mushroom in humsn aoritic intima cell culture. — Abstracto.-Vlllth International Symposium. Nutrition and Atherosclerosis. Capri (Italy), October 14-15, 1988, p.25.

7. Ли Хва Рен, Васильев А.В., Тутельян В.А. Оценка антиатеро-сялеротичвских свойств гликозидов и полисахаридов растительного происхождения в культуре клеток интимы аорты человека.-Тезисы докладов П-го Съезда кардиологов Узбекистана. Ташкент, 1988, 11-12 ноября, с. 167.

8. Orekhov А.Н., Baldenkov G.IT., Tertov V.V., Li Kwa Ryong, Kozlov S.G., lyakishev A.A., Ikachuk V.A., Ruda Ii.Ya., Smirnov V.M. Cardiovascular drugs end atherosclerosis: ST— fects of calcium antagonists, beta blockers and nitrates on atherosclerotic characteristics of human aortic cells..— Journal of cardiovaxcular Pharmacology, 1988, 12 (2uppl.6), pp . s66—s68.

9. Васильев A.B., Ли Хва' Рен, Тутельян В.А. Антиатеросклеротические свойства некоторых дифосфанатов. - Тезисы докладов 3-го Всесоюзного совещания по химии и применению комплексо-

. нов. Челябинск, 1988, 5-8 ноября, с. 264.

10. Baldenkov O.K., Akopov S.S., И Kwa Ryong, Orekhov A.K. Prostacyclin, thronboisna ^ end calcium antagonists: ST-fects on atherosclerotic characteristics of vascular cells.— Biomed. Biochim. Acta, 1988, 47 (10/11), pp .324-327.

11. Ли Хва Рен, Васильев А.В., Тутельян В.А. Влияние эйкозапев-таеновой кислоты на лшщдвый обмен у кроликов при экспериментальном атеросклероза. - Вопросы питания, 1988, Я б, с. 40-43.

12. Tertov Т.Т., Orekhov А .ТТ., Ii Hwa Ryong, £mirnov V.JT. Intracellular- cholesterol accumulation is acconpanied_by enhanced proliferative activity of human aortic intimal cells.—

Tissue & Cell, 1988, 20 (6), pp.849~S54.

X3. IA Hrn Ryong, Tertov V.V., Vasilyev A.V., Tutelyan V.A.,.

Orekhov A.N. Antiatherogenic end entiatherosclerotic effects of mushroom «tracts revealed in human aortic intima cell culture. - Drug Development Research, 1989, 17, pp.689—693.

14. Ли Хва Рен, Васильев А.В., Орехов А.Н., Тертов В.В., Ту- . тельян В.А. Антиатеросклеротические свойства высших грибов клинико-экспериментальное исследовавие. - Вопросы питания, 1989, № I, с. 16-19.

15. Ли Хва Рен, Васильев А.В., Орехов А.Н., Тутельяя В.А.Влия-ние эйкозапентаеновой кислоты и простагландинов различного ряда на аккумуляцию холестерина и пролиферацию клеток интимы аорты человека. - Вопросы медицинской химии, 1989, № 2, с. II2-J:i5.

16. Orekhov V.V., Tertov V.V., Baldenkov C.N., IA Hwa Ryong, Kozlov S.G., lyakishev A.A., Ruda II.Уа. Cardiovascular drugs end atheroeclerosie; atharosclerosie—related pharmacodynamics of calcium antagonists and beta blockers. — Abstracts. XIII CongreaSInternational Society for Heart research the University of Michigan aim arbor, Michigan (USA), May 14-18 1989, P.28. ■

17. Orekhov A.N., lertov V.V., IA Hwa Ryong, Kozlov S.G., lyakishev A.A., Ruda li.Ya. Influence of food and drug consumption on atherosclerosis-related properties of blood plasma. — Abstracts. 1st International Symposium on Heart Eailure-mechanisms and managenent. I era al am (Israel), May 21-25 1989, p.125.

18. Ли Хва Рен, Васильев А.В., Орехов А.Н., Тутельян В.А. Ан-тиатеросклеротические свойства эйкозапентаеновой кислоты -клинико-экспериментальное исследование. - Вопросы питания, 1989 , № 3, с. 20-22.

19. Орехов А.Н., Козлов С.Г., Вадценков Г.Н., Тертов В.В., Ха-шимов Х.А., Ли Хва Рен, Дякишев А.А., Бочарова О.И., Ткачук

B.А., Руда М.А. Атерогенные свойства -адреноблокаторов, проявляемые на клетках сосудистой станки. - Кардиология, 1989, № 6, с. 19-21.

20. Орехов А.Н., Табагари С.И., Тертов В.В., Ли Хва Реи, Козлов

C.Г., Лякишев А.А., Руда Ы.А. Сердечно-сосудистые лекарст-

венные препараты и атеросклероз: исследование эффектов антагонистов кальция, бета-|блокаторов и нитратов на культуре атеросклеротических клёпок. - Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Лечение и i/рофилактика инфаркта миокарда". -Гагра, 1989, 14-16 июня, с. 394.

21. Тутельян В.А., Васильев A.B., Ли Хва Рен, Автиатерогенные свойства белкового изолята сои 500 Е - клинико-эксперимен-тальное исследование. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 1989, J6 4, с. 62-65.

22. Ли Хва Рен, Васильев А,В.» Орехов А.Н., Тертов В.В., Тутельян В.А. Антиатеросклеротические и атерогенные свойства нетоторых природных соединений и 0ета-<5локаторов. - Химико-фармацевтический журнал, 1989, № 9, с. II -II •

23. Васильев A.B., Ли Хва Рен, Орехов А.Н., Тертов В.В., Ким •Хан Джон, Тутельян В.А/ Протеиназы лизосом интимы аорты чело.. века и атерогенез. - Вопросы медицинский химии, 1989, № 4,

' с.124-127.

24. Васильев A.B., Ли Хва FeH, Орехов А.Н., Ким Хан Джон, Тертов В.В., Ли'Сын Гын, Тутельян В.А. Антиатеросклэротаческпв свойства некоторых компонентов чая. - Химико-фармацевтический журнал, 1989, № 9, с. II -II .

25. Васильев A.B., Ли Хва Рен, Орехов А.Н., Тертов В.В., Тутельян В.А. Влияние глюкагона и конканавалина А на аккумуляцию холестерина перитонеальными макрофагами мыши и клетками интимы аорты человека. - Вопросы медицинской химии, 1989, № 5, с.

26. Васильев A.B., Ли Хва Рев, Покровская Г.Р., Погожева A.B., Шимановская Н.П., Самсонов М.А., Тутельян В.А. Антиатеросклеротические свойства некоторых компонентов пищи - клинико-экспериментальное исследование. - Вопросы питания, 1989, А 5, с.

27. Ли Хва Рен, Васильев A.B., Орехов А.Н., Тертов В.В., Тутельян В.А. Оценка антиатеросклеротических свойств некоторых природных соединений растительного происхождения на культуре клеток интимы аорты человека. - Фармакология и токсикология, 1989,

* 5,.с.

28. Tutelyan Y.A., Vasilyev A.V., II Hwa Ryong. Antiatherogenic characters . of the albuminous soya isolate 500 В - Clinical experimental study.