Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль модифицированных липопротеидов и интимальных клеток в развитии атеросклероза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Орехов, Александр Николаевич, Санкт-Петербург

Ч<: 99-3/№-&

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

РОЛЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ И ИНТИМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В РАЗВИТИИ АТЕРОСКЛЕРОЗА

п

; ;

03.00.04 - биохимия

НАУЧНЫЙ ДОКЛАД ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ

ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ -1998

Работа выполнена в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Официальные оппоненты:

академик Российской академии медицинских наук, доктор медицинских наук, профессор Климов Анатолий Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Гуревич Виктор Савельевич

доктор биологических наук, профессор Панкин Вадим Зиновьевич

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 26 ноября 1998 г. в 11:00 на заседании специализированного совета Д001.23.01 Ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, 197376 - - уЛ акад. Павлова, 12.

С диссертаг ься в библиотеке Научно-

исследовате оиментальной медицины

Российской /к.

Л -л

Автореферат

. г.

Ученый секретаре специализированного соъ^а доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания, в основе многих из которых лежит атеросклероз, являются главной причиной заболеваемости и смертности в России (Оганов и др., 1984-1997). Лечение и профилактика этих заболеваний осложняется отсутствием лекарственных средств прямого антиатеросклеротического действия, а также простых и надежных способов диагностики атеросклероза. Это, в свою очередь, определяется тем, что многие стороны патогенеза атеросклероза остаются неясными.

Исследования последних 10-20 лет были направлены в основном на изучение молекулярно-клеточных механизмов атерогенеза с использованием современных научных подходов (Климов и др., 1974-1996; Лопухин и др., 1979-1994; Смирнов и др., 1980-1998; Gotto et al., 1977-1998; Ross et al., 1973-1998). Несмотря на существенные достижения в этой области, остались невыясненными такие основополагающие вопросы, как: причины накопления внутриклеточных липидов, роль клеточного липоидоза в атерогенезе, причины разрастания внеклеточного соединительнотканного матрикса и увеличения числа клеток в атеросклеротическом поражении. Другими словами, основные механизмы формирования атеросклеротического поражения остаются нераскрытыми.

Наиболее заметные атеросклеротические изменения затрагивают главным образом внутренний - интимальный слой артерии, который при атеросклерозе локально утолщается, в котором происходит накопление липидов, увеличивается число клеток, наблюдаются другие серьезные изменения (Аничков и др., 1947). Атерогенные проявления связаны в основном с функционированием клеток интимы, причем самые выраженные изменения затрагивают клетки, расположенные в субэндотелиальном пространстве между эн-i сальной выстилкой и медией (Ross etat., 1973-1998). Этим обстоятель-определился предмет исследования настоящей работы - роль субэн-■1лиальных клеток интимы в формировании атеросклеротического nopain ,п|я. В атеросклеротическом поражении интимальные клетки насыщены t; шидами, цитоплазма многих из них имеет пенистый вид из-за большого

£

■ лЬ липидных гранул и капель (Geer & Haust, 1972). Появление пенистых

I'

'■фо "-интиме - самое яркое проявление атеросклероза на клеточном -.Наиболее вероятным кандидатом на роль источника избыточных ли* 3

пидов, накапливаемых в интимальных клетках являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП), циркулирующие в крови и являющиеся основным переносчиком липидов (СоКо ef а/., 1977-1998).

Цель работы. Целью исследования явилось изучение возможной роли в атерогенезе взаимодействия субэндотелиальных клеток интимы аорты человека с ЛНП, приводящего к отложению липидов в клетках, а также установление взаимосвязи между накоплением внутриклеточных липидов и другими проявлениями атеросклероза на клеточном уровне, прежде всего усилением пролиферации и синтеза компонентов внеклеточного матрикса.

Поскольку субэндотелиальные клетки аорты человека ранее подробно не изучались, предстояло ответить на следующие основополагающие вопросы: какие клетки заселяют субэндотелиальную интиму в норме и при атеросклерозе, какие условия необходимы для накопления внутриклеточных липидов под влиянием ЛНП, к каким изменения приводит клеточный липоидоз, как эти изменения участвуют в формировании атеросклеротического поражения? В связи с этим, задачи работы были определены следующим образом:

1) Изучить клеточный состав нормальной и атеросклеротически измененной интимы аорты человека.

2) Установить возможность накопления липидов в клетках интимы под влиянием ЛНП.

3) Выявить морфологические и функциональные изменения клеток в атеро-склеротическом поражении и при накоплении липидов, вызванном ЛНП.

4) Установить связь между атеросклеротическими изменениями клеток и основными проявлениями атеросклероза - накоплением липидов и утолщением интимы.

Научная новизна. Было установлено, что в интиме аорты взрослого человека субэндотелиальные клетки образуют трехмерную клеточную сеть. Впервые показано, что такая клеточная организация в области поражения нарушается, а в фиброзной покрышке бляшки единая клеточная сеть отсутствует. Установлено, что клетки, формирующие единую сеть в интиме, имеют признаки плюрипотентных перицитоподобных мезенхимальных клеток. Про-лиферативная активность интимальных клеток, а также синтез ими коллагена в начальных поражениях, жировой полосе и липофиброзной бляшке значительно выше, чем в непораженной интиме. Именно перицитоподобные клетки накапливают избыточное количества жира, превращаясь в пенистые клет-

ки. Источником внутриклеточного жира являются модифицированные липо-протеиды низкой плотности (ЛНП). В настоящей работе в крови больных с документированным атеросклерозом впервые была обнаружена подфракция атерогенно модифицированных ЛНП и установлен характер химической модификации, а именно - десиалирование, т.е. снижение содержания сиаловой кислоты в частице ЛНП. Впервые продемонстрировано, что добавление в культуру десиалированных ЛНП вызывает не только накопление внутриклеточных липидов, но также стимуляцию пролиферации и усиление синтеза внеклеточного матрикса. Исследованиями в культуре и in situ впервые было установлено, что наблюдаемые при атеросклерозе нарушения в единой клеточной сети интимы и разрыв межклеточных контактов являются следствием накопления внутриклеточных липидов, вызванного модифицированными ЛНП. На первичных культурах клеток, имеющих разную степень контактной коммуникации, впервые выявлено, что основные функции интимальных клеток, имеющие отношение к атеросклерозу, зависят от степени контактной коммуникации между ними. Эта зависимость не прямая и для пролиферативной активности и синтеза белка имеет колоколообразный характер. Накопление внутриклеточных липидов не зависит от степени контактной коммуникации, но падает при полном разрыве межклеточных связей. In vivo с развитием атеросклероза в интиме по мере разрушения клеточной сети и обособления клеток клеточные функции также претерпевают колоколообразные изменения.

Данные, полученные в настоящей работе, позволяют по-новому представить клеточные механизмы атерогенеза на уровне субэндотелиальных клеток. В крови появляются атерогенные модифицированные ЛНП, которые проникают в субэндотелиальное пространство интимы и вызывают накопление липидов в субэндотелиальных клетках. Первичное накопление липидов приводит к стимуляции пролиферации и синтезу внеклеточного матрикса. Такие изменения можно наблюдать в зонах начальных поражений и в жировой полосе. По мере усугубления перегрузки клеток липидами наступает разрыв контактов между субэндотелиальными клетками, единая клеточная сеть интимы нарушается. Происходит дальнейшая стимуляция пролиферативной активности, а также синтеза и секреции внеклеточного матрикса. Это свойственно выраженным жировым поражениям интимы (жировая полоса, липо-фиброзная бляшка). Секретируемый коллаген и другие компоненты матрикса,

окружая клетку их синтезировавшую, еще в большей степени обособляют ее от соседей, что в конечном счете приводит к полной изоляции отдельных клеток и исчезновению клеточной сети. При этом активность основных атеро-генных процессов резко падает: снижается накопление липидов в клетках, их пролиферативная активность, синтез внеклеточного матрикса. Такое наблюдается в фиброзной бляшке.

Практическая значимость. Исследования клеточных механизмов ате-рогенеза на субэндотелиальных клетках аорты человека не носили прикладного характера, однако они дали основу некоторым практическим разработкам, из которых можно отметить следующие. (1) Разработан метод диагностики атеросклероза, основанный на определении содержания ЛНП в циркулирующих иммунных комплексах. Этот диагностический показатель имеет значительно большую точность по сравнению с применяемыми в настоящее время для диагностики атеросклероза показателями липидного обмена. (2) Разработан и апробирован в ограниченном клиническом исследовании метод экстракорпорального удаления анти-ЛНП из крови больных. Метод основан на применении сорбента, содержащего аутологичные ЛНП. Регулярное удаление анти-ЛНП в течение 2-х лет позволило снизить атерогенность крови больных до очень низкого уровня, что сопровождалось замедлением развития коронарного атеросклероза по сравнению с естественным его течением. (3) Метод первичной культуры субэндотелиальных клеток аорты человека, разработанный в настоящей работе, широко и с успехом используется в области фармакологии атеросклероза для скрининга потенциальных антиатеро-склеротических лекарственных препаратов, изучения механизмов их действия, разработки и оптимизации антиатеросклеротической лекарственной и диетотерапии.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих научных мероприятиях: V Всесоюзная конференции "Физиология и патология соединительной ткани" (Новосибирск, 1980), I Всесоюзная конференция "Поражение сосудистой стенки и гемостаз" (Полтава, 1981), IX Всемирный конгресс кардиологов (Москва, 1982), I Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982, IV Всесоюзный симпозиум "Циклические нуклеотиды" (Минск, 1982), II Всесоюзный симпозиум "Метаболизм, структура и функция сердечной клетки" (Ташкент, 1983), 16-я Конференция Федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984), Международная конференция по

профилактической кардиологии (Москва, 1985), V Всесоюзный симпозиум "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций" (Рязань, 1985), III Симпозиум "Метаболизм, структура и функция сердечной клетки" (Баку, 1986), IV Всесоюзный съезд кардиологов (Москва, 1986), II Съезд терапевтов ТССР (Ашхабад, 1986), Всесоюзный симпозиум "Синтез и исследование простагландинов" (Таллин, 1986), Международный симпозиум "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986), Научная конференция "Современные вопросы кардиологии" (Тбилиси, 1986), Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), II Съезда кардиологов Узбекистана (Ташкент, 1988), Всесоюзный симпозиум "Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран" (Благовещенск, 1989), Всесоюзная научной конференция "Человек-океан" (Махачкала, 1990), Научная конференция "Биохимия - медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний" (Ленинград, 1988), Научно-практическая конференция с международным участием "Актуальные вопросы профилактики неинфкцион-ных заболеваний" (Москва, 1993), 1-ый Конгресс кардиологов Центральной Азии (Бишкек, 1993), Научно-практическая конференция "Проблемы атеросклероза" (Воронеж, 1994), Международный симпозиум "Биологически активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях" (Тюмень, 1995), Симпозиум "Полиненасыщенные жирные кислоты N-6 и N-3 семейств: медико-биологические, биохимические и биотехнологические аспекты" (Владивосток, 1995), Симпозиум, посвященный 110-летию со дня рождения академика Н.Н. Аничкова "Липопротиды и атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995), V Всероссийский Съезд кардиологов (Челябинск, 1996), Научно-практическая конференция "Актуальные вопросы лечения хронических форм ИБС" (Жуковский, 1996), Научно-практическая конференция "Современные аспекты кардиологии" (Воронеж, 1996), Международная конференция "Реабилитация и принципы комплексной консервативной терапии больных с заболеваниями сосудов нижних конечностей" (Кисловодск, 1997), III Международный симпозиум "Биологически активные добавки - нутрицевтики и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях" (Тюмень, 1997), 6th International Symposium on Atherosclerosis (West Berlin, 1982), Fourth International Symposium on Prostaglandins, Thromboxanes and Leukotrienes (Halle, 1984), 4th

7

Congress of the Hungarian Pharmacological Society with International Participation (Budapest, 1985), 7th International Symposium on Atherosclerosis (Melbourne, 1985), International Symposium. Immune and Metabolic Aspects of Therapeutic Blood Purification System (Trondheim, 1985), Sixth International Washington Spring Symposium Cardiovascular Disease'86. Molecular & Cellular Mechanisms, Prevention, Treatment (Washington, 1986), 6th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds (Florence 1986), 11th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Heidelberg, 1986), X Wold Congress of Cardiology (Washington, 1986), 18th FEBS Meeting (Ljubljana, 1987), International Atherosclerosis Congress (Vienna, 1989), 4th International Symposium on Calcium Antagonists: Pharmacology and Clinical Research (Florence, 1989), First Meeting of the International Society for Applied Cardiovascular Biology (Gothenburg, 1989), 10th Scandinavian Symposium on Atherosclerosis Research (Stockholm, 1989), 25th Anniversary Meeting of the European Atherosclerosis Society (Linkoping, 1989), 15th World Congress of the International Union of Angiology (Rome, 1989), 7th International Meeting: Atherosclerosis and Cardiovascular Disease (Bologna, 1989), 2nd International Conference on Preventive Cardiology and the 29th Annual Meeting of the AHA Council on Epidemiology (Washington, 1989), X International Symposium on Drug Affecting Lipid Metabolism (Houston, 1989), Xlth World Congress of Cardiology (Manila, 1990), 7th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds (Florence, 1990), 55th Annual Meeting of the European Atherosclerosis Society (Brugge, 1990), 12th European Workshop on Inflammation (Halle, 1990), 56th EAS Meeting: Recent Advances in Atherosclerosis Research (Santa Margherita di Pula, 1990), 9th Congress of the Hungarian Arteriosclerosis Society (Sopron, 1990), Third International Symposium: Treatment of Severe Dyslipoproteinemia in the Prevention of Coronary Heart Disease (Munich, 1990), International Symposium on Multiple Risk Factors in Cardiovascular Disease (Washington, 1990), 40th ACC Annual Scientific Session (Atlanta, 1991), 4th Interscience World Conference on Inflammation: Antirheumatics, Analgesics, Immunomodulators (Geneva, 1991), Twelfth Annual European Conference on Vascular Biology and Eleventh Scandinavian Symposium on Atherosclerosis Research (Gilleleje, 1991), 14th International Diabetes Federation Congress (Washington, 1991), 7th Dresden Lipid Symposium. International Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis (Dresden, 1991), 9th International Symposium on

8

Atherosclerosis (Rosemont, 1991), 5th International Symposium on Calcium Antagonists: Pharmacology and Clinical Research (Houston, 1991), 1st International Mediterranean Symposium on Hypertension "Toward a Future without Risk" (Seville, 1991), XI International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metaboilism (Florence, 1992), 59th EAS Congress (Nice, 1992), The Second International Symposium on Multiple Risk Factors in Cardiovascular Disease (Osaka, 1992), 62nd EAS Congress of the European Atherosclerosis Society (Jerusalem, 1993), Annual Copenhagen Atherosclerosis Conference (Humlebaek, 1994), 8th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis (Dresden, 1994), XlVth Washington International Spring Symposium: Cardiovascular Disease'94: Cellular and Molecular Mechanism, Prevention, Treatment (Washington, 1994), 3rd International Symposium: Multiple Risk Factors in Cardiovascular Disease, Vascular and Organ Protection (Florence, 1994), XII the World Congress of Cardiology (Berlin, 1994), 15th International Diabetes Federation Satellite Symposium on "Diabetes and Macrovascular Complications" (Osaka, 1994), 5th Rappaport Symposium on Modified Lipoproteins, Antioxidants and Atherosclerosis (Shavei Zion, 1995), XII International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Houston, 1995), 68th Scientific Sessions of the American Heart Association (Anaheim, 1995), 66th Congress of the European Atherosclerosis Society (Florence, 1996), 9th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis (Dresden, 1997), 7th International Symposium on Cardiovascular Pharmacotherapy (Jerusalem, 1997), 68th Meeting of the European Atherosclerosis Society (Brugge, 1997), Xlth International Symposium on Atherosclerosis (Paris, 1997), XIII International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Florence, 1998), 70th European Atherosclerosis Society Congress (Geneva, 1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 обзоров и 168 статей, из них 61 в отечественных и 143 в международных изданиях, получено авторское свидетельство СССР и патент Российской Федерации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал. В качестве основного объекта исследований была выбрана аорта, поскольку это самая крупная и наиболее подробно изученная артерия. Вся работа была проведена на аутопсийном материале аорты человека, взятом в течение 1-3 часов после внезапной смерти. С целью максимального

приближения к реальной ситуации в сосуде клеточные функции изучались в первичной культуре интимальных клеток аорты человека, специально приготовленной для каждого отдельного эксперимента и культивируемой в течение минимального срока. Несмотря на объективные трудности, неудобство, трудоемкость и высокую стоимость работы с первичной культурой и со свежим аугопсийным материалом человека, был использован именно этот подход, поскольку экспериментальные модели атеросклероза существенно отличаются от атеросклеротических поражений сосудов человека, а при длительном культивиро�