Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия липопротеидов с компонентами матрикса аорты человека и его роли в клеточных проявлениях атеросклероза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия липопротеидов с компонентами матрикса аорты человека и его роли в клеточных проявлениях атеросклероза"

РГ6 од

2 5 ЯЕН

На правах рукописи

СУПРУН Игорь Валерьевич

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕИДОВ С КОМПОНЕНТАМИ МАТРИКСА АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО РОЛИ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЯВЛЕНИЯХ АТЕРОСКЛЕРОЗА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в группе клеточной патологии атеросклероза Научно-исследовательского института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздрава Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник В .В. Тертов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Лопина О.Д. кандидат биологических наук Домагатский С.П.

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Минздрава Российской Федерации.

Защита диссертации состоится "_29_" ноября_2000 г. в iA. час.

На заседании диссертационного совета Д 074.22.02 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15А, корпус 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК МЗ РФ (Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15А).

Автореферат разослан " 27 " октября_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

РЧ!°

/

V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и инвалидности людей в России и других развитых индустриальных странах. Большинство сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклеротического поражения магистральных сосудов человека. Поэтому исследование механизмов развития атеросклероза является важнейшей задачей в борьбе с сердечнососудистыми заболеваниями.

Одной из наиболее ранних и ярких черт атеросклеротического поражения сосудов человека является накопление внутри- и внеклеточных липидов. В настоящее время имеется большое количество данных, указывающих на важную роль основных компонентов внеклеточного матрикса, а именно: эластина, протеогликанов и коллагена - в отложении липидов в стенке сосудов. Установлено, что источником липидов, накапливающихся в стенке, являются циркулирующие в кровотоке липопротеиды (Wessler 1976, Hoff 1978, Stender and Hjilms 1984, Hoffand O'Neil 1991, Stenberger et. al. 1992). Рядом исследователей описано взаимодействие липопротеидов с эластином и протеогликанами из аорты человека (Kramsch et.al. 1973, Srenivasan et. al. 1975, Camejo 1982, Guyton et. al. 1985). Практически отсутствуют данные о взаимодействии липопротеидов с коллагеном аорты. До настоящего времени изучение взаимодействия липопротеидов с эластином и протеогликанами проводились на препаратах, выделенных из целой стенки сосудов без подразделения на субслои и различные области поражения. Таким образом, в настоящее время отсутствуют сравнительные данные о связывании липопротеидов с компонентами матрикса различных слоев непораженной аорты, а также областей начальных поражений, жировых полос и липофиброзных бляшек.

Ранее в нашей лаборатории и ряде других лабораторий было показано, что циркулирующие в крови различные классы липопротеидов не являются гомогенными, но состоят из подфракций, различающихся по химическому составу и физическим характеристикам. Мы обнаружили в крови человека

циркулирующие модифицированные липопротеиды низкой плотности ("десиалированные" ЛНП) (Orekhov et. al. 1989, Orekhov et. al. 1991). Циркулирующие модифицированные ЛНП (цмЛНП), в отличие от нативных, вызывали накопление липидов в клетках интимы аорты человека и макрофагах, то есть являлись атерогенными. Одной из основных характеристик циркулирующих модифицированных ЛНП является низкое содержание сиаловой кислоты. ЦмЛНП характеризуются также низким содержанием нейтральных сахароз и пониженным уровнем нейтральных липидов и фосфолипидов. Для них хараетерен более высокий отрицательный заряд, большая плотность, уменьшенный размер и изменение третичной структуры апобелка (Tertov et. al. 1989, Tertov et. al. 1992). Недавно нами было описано наличие в плазме крови человека нативных и циркулирующих модифицированных липопротеиды очень низкой плотности (ЛОНП), липопротеиды промежуточной плотнисти (ЛПП) и липопротеиды высокой плотности (ЛВП), которые, как и подфракции ЛНП, имеют различные свойства (Tertov and Orekhov 2000). Следовательно, детальное изучение взаимодействия липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса должно включать в себя сравнительное изучение связывания нативных и модифицированных липопротеидов.

Морфологические исследования, проведенные Аничковым (1947), а также другими исследователями, выявили, что отложение внеклеточных липидов в сосудистой стенке позднее сочетается с появлением пенистых клеток, наполненных липидными включениями. Можно предположить, что внеклеточное отложение липидов может являться причиной внутриклеточного накопления липидов. Srenivasan et. al. (1989) показали, что комплексы липопротеидов с суммарными протеогликанами аорты быка вызывают накопление холестерина в макрофагах мыши. Однако, отсутствуют данные о влиянии комплексов других классов липопротеидов с протеогликанами, эластином и коллагеном аорты человека на накопление липидов в клетках сосуда.

В настоящее время все большее внимание уделяется воспалительной реакции при атеросклерозе. Показано, что количество гематогенных клеток, компонентов комплимента, экспрессия провоспалительных цитокинов

значительно возрастают в атеросклеротических поражениях, по сравнению с непораженными участками артерий (Libby and Hansson 1991, Rosenfeld and Pectel, 1994). Однако, вопрос о том, может ли внеклеточное и внутриклеточное отложение липидов быть связано с инициацией воспалительной реакции в атеросклеротическом сосуде, остается открытым.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование механизмов внеклеточного накопления липидов, его роли во внутриклеточном отложении липидов, а также изучение связи между клеточным липоидозом и воспалительной реакцией при атеросклерозе.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1) Изучить взаимодействие липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса из протеогликанового и мышечно-эластического слоев интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека;

2) Определить влияние комплексов липопротеидов и компонентов соединительнотканного матрикса на накопление липидов в интимальных клетках аорты человека;

3) Выявить влияние внутриклеточного накопления липидов на экспрессию маркеров воспаления в гладкомышечных клетках интимы аорты человека и макрофагах.

Научная новизна работы. Практически все основные результаты работы получены впервые. В диссертации изучено взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с эластином, протеогликанами и коллагеном протеогликанового и мышечно-эластического субслоев интимы, а также медии непораженной и атеросклеротической аорты человека, Исследован состав глюкозаминогликанов протеогликанов из субслоев непораженной и атеросклеротической аорты.

Обнаружено, что циркулирующие модифицированные липопротеиды взаимодействуют с компонентами соединительнотканного матрикса эффективнее, чем нативные липопротеиды. При этом, десиалирование липопротеидов in vitro с помощью нейраминидазы усиливает их связывание с компонентами соединительнотканного матрикса.

Показано, что комплексы липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса вызывают накопление липидов в клетках.

Установлено, что накопление холестерина в клетках стимулирует в них экспрессию маркеров воспаления.

Практическая значимость работы. В настоящей работе показано, что циркулирующие модифицированные липопротеиды взаимодействуют с компонентами соединительнотканного матрикса эффективнее, ' чем нативные липопротеиды, что может приводить к отложению липидов в сосудистой стенке. Полученные данные позволяют предполагать о существовании принципиальной возможности уменьшения риска возникновения атеросклероза путем фармакологической коррекции взаимодействия липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на симпозиуме "Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза" в рамках конференции кардиологов СНГ ' '(Москва 2000); Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва 2000); 12 Международном симпозиуме по атеросклерозу (Stockholm, Sweden 2000). Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы) и экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение (3 главы), выводы и список литературы. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 167 ссылок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования.

Эластин из нормальной и атеросклеротической аорты человека получали по методу Noma et. al. (1979). Препараты протеогликанов экстрагировали гуанидинхлоридом и очищали последующим ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCI (Oegema et. al. 1979). Образцы коллагена получали путем гидролиза ткани аорты пепсином в кислой среде с последующей очисткой преципитацией в NaCI (O'Driscoll et. al. 1985).

Основные классы липопротеидов получали из свежевыделенной плазмы крови доноров ультрацентрифугированием (Tertov et. al., 1995). Подфракции нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов разделяли с использованием колоночной аффинной хроматографии на агглютинине Ricinus communis (РКА120), иммобилизованном на CNBr-активированной сефарозе (Tertov et al., 1990). Липопротеиды йодировали проводили по методу Bilheimer et. al. (1972).

Содержание сиаловой кислоты в ЛНП определяли колориметрически (Warren, 1959). Концентрацию белка в липопротеидах и клетках измеряли по Lowry et. al. (1951). Измерение количества уроновой кислоты выполняли по модифицированному методу Bitter and Muir (1962). Состав глюкозаминогликанов протеогликанов определяли методом ВЖХ (Macek et. al. 1987).

Интенсивность взаимодействия липопротеидов с коллагеном, протеогликанами и эластином оценивали по количеству связанных 1251-меченых липопротеидов и методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Гладкомышечные клетки из непораженной интимы аорты человека выделяли и культивировали, как описано ранее (Orekhov et al., 1985). Макрофаги крови человека изолировали и культивировали, согласно Berger (1979). Для определения способности ЛНП вызывать накопление внутриклеточных липидов клетки непораженной интимы культивировали 24 часа в среде 199, содержащей 10% липопротеиддефицитной сыворотки здорового донора и 100 мкг/мл ЛНП или их комплексов (Tertov et. al., 1988). Липиды из клеток экстрагировали, согласно Нага and Radin (1978). Содержание холестерина определяли с помощью набора "Monotest" (Boehringer Mannheim, ФРГ).

Экспрессию маркеров воспаления: фактора некроза опухоли (ФНО), интерлейкина 1 (ИЛИ) и молекулы гистосовместимости II типа (МГС II) в гладкомышечных клетках и макрофагах определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа.

б

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Взаимодействие липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса из интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека.

1.1. Взаимодействие липопротеидов с эластином.

1.1.1. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с эластином.

Как следует из данных, представленных в таблице 1, связывание нативных ЛНП с эластином протеогликанового субслоя начальных поражений и жировых полос выше, а с эластином фиброатеромы ниже, чем в норме. При этом, связывание циркулирующих модифицированных ЛНП с эла'стином из всех исследованных областей было достоверно выше/ чем связывание нативных ЛНП. Сходная картина связывания нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП наблюдалась и для эластина мышечного субслоя непораженной и' атеросклеротической интимы. Связывание нативных и циркулирующих- модифицированных ЛНП'с эластином медии, лежащей под нормальными и пораженными участками было сходным по величине.

1.1.1.1. Прочность комплексов ЛНП с эластином.

Для того, чтобы оценить прочность образуемых комплексов, мы исследовали вытеснение 1251-ЛНП, связанных с эластином избытком немеченых липопротеидов (рис. 1). Можно видеть, что циркулирующие модифицированные ЛНП слабее вытесняются из образовавшегося комплекса, что свидетельствует о его большей прочности.

1.1.2. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП и ЛПП с эластином.

Связывание нативных ЛОНП и ЛПП с эластином различных субслоев интимы и медии непораженных и атеросклеротических зон аорты было, в целом, сходным со связыванием нативных ЛНП, хотя и меньшим по величине (таблицы 2 и 3). Связывание нативных ЛОНП со всеми исследованными препаратами эластина было значительно менее эффективным, чем связывание нативных ЛНП. При этом, для эластина протеогликанового субслоя

Таблица 1.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с

_эластином из интимы и медии аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛНП, связавшихся с эластином, пг апоВ/лунка Протеогликановый Мышечно- Медия

субслой эластический

субслой

Норма

Нативные ЛНП 595±44 287±14 244±24

ЦмЛНП 964+74* 446±50* 289+18

Начальное поражение

Нативные ЛНП 634±52& 339+14& 319+32

ЦмЛНП 1269+60&* 497±32* 378+27

Жировая полоса

Нативные ЛНП 1181+104& 561±20& 333+30

ЦмЛНП 1826±137*& 969+18*& 396+43

Фиброатерома

Нативные ЛНП 418±11& 389±8* 296±24

ЦмЛНП 637±51*& 829+15*& 317±27

Результаты представлены как среднее четырех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛНП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

Концентрация ЛНП, мг/мл

Рис.1. Вытеснение нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП из комплексов с эластином. Десять мкг/мл 1251-меченых нативных ЛНП и цмЛНП инкубировали 2 часа при 37°С в лунках с иммобилизованным эластином протеогликанового субслоя интимы жировой полосы. После промывки в лунки добавляли указанное количество немеченных нативных липопротеидов и инкубировали в течение 2 ч. После инкубации лунки промывали и измеряли радиоактивность. Каждое значение - среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛНП, р<0,05.

также наблюдалось увеличение связывания- ЛОНП и ЛПП в ряду: норма, начальные поражения, жировые полосы - и низкое связывание липопротеидов с эластином протеогликанового субслоя интимы фиброатеромы. ЦмЛПП связывались с эластином интимы эффективнее, чем нативные ЛПП. ЦмЛОНП связывались с эластином интимы фиброатеромы эффективнее, чем нативные ЛОНП.

Таблица 2.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП с

_эластином из интимы и медии аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛОНП, связавшихся с эластином,

_пг апоВ/лунка_

Протеогликановый Мышечно-эластический Медия

_субслой_субслой_

Норма

Нативные ЛОНП 116±10 50±2 44+4

ЦмЛОНП 120+5 54+2 37+3

Начальное поражение

Нативные ЛОНП 140+9 58+4 41 ±3

ЦмЛОНП 137±12 61+2 41 ±1

Жировая полоса

Нативные ЛОНП 178И6& 47±4 43±4

ЦмЛОНП 189+13& 42±2 41 ±3

Фиброатерома

Нативные ЛОНП 19+2& 22+2& 7±1&

ЦмЛОНП 134+14*& 48+3* 37+2*

Результаты представлены как среднее четырех определений + стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛОНП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

1.1.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с эластином.

Связывание с эластином ЛВП отличалось от связывания апоВ-содержащих липопротеидов (таблица 4). Связывание нативных ЛВП с эластином протеогликанового субслоя всех исследованных областей поражения было ниже, чем в норме. Связывание цмЛВП с эластином непораженной и атеросклеротической аорты человека было значительно выше, чем связывание нативных ЛВП.

Таблица 3.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с

_эластином из интимы и медии аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛПП, связавшихся с эластином, пг апоВ/лунка Протеогликановый Мышечно-эластический Медия

_субслой_субслой_

Норма

Нативные ЛПП 189+15 190+14 243±4

ЦмЛПП 257+14* 236+21* 240+16

Начальное поражение

Нативные ЛПП 281+12& 188+9 229+21

ЦмЛПП 358+28*& 229+13* 281+21

Жировая полоса

Нативные ЛПП 314+16& 192+16 217+14

ЦмЛПП 415±32*& 247+7* 225+17

Фиброатерома

Нативные ЛПП 301±17& 176,6+18,0 193+24

ЦмЛПП 394+12*& 174,9+12,6 233+16

Результаты представлены как среднее четырех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛПП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

Таблица 4.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с

_эластином из аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛВП, связавшихся с эластином,

_пгапоА-1/лунка_

Протеогликановый Мышечно-эластический Медия

субслой субслой

Норма

Нативные ЛВП 24.1+1.5 6.8+0.3 6.1+0.7

ЦмЛВП 128 0+3.2* 36.1+4.0* 36.7+2.3*

Начальное поражение

Нативные ЛВП 15.4±1.4& 7.1+0.6 7.0±0.8

ЦмЛВП 148.0+6.8*& 40.2+2.4* 40.2+2.5*

Жировая полоса

Нативные ЛВП 17.3±0.7& 5.6±0.9 7.2+0.8

ЦмЛВП 273.6+11.2*& 47.8±3.3* 44.6±4.5*

Фиброатерома

Нативные ЛВП 4.1+0.1& 4.3+0.4& 9.4±1.3

ЦмЛВП 84.0±4.4*& 23.4±2.2*& 60.1+5.6*&

1.2. Взаимодействие липопротеидов с протеогликанами.

• 1.2.1. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с протеогликанами.

'" ~ Связывание нативных ЛНП с протеогликанами протеогликанового субслоя всех атеросклеротических поражений было ниже, чем в норме (таблица 5). ЦмЛНП связывались с протеогликанами из непораженных и атеросклеротических участков аорты эффективнее, чем нативные ЛНП. Такая же картина связывания нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП была обнаружена нами и для протеогликанов мышечно-эластического субслоя и медии.

Таблица 5.

Связывание нативных ЛНП и цмЛНП с протеогликанами из субслоев интимы и

_медии аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛНП, связавшихся с протеогликанами,

_пг алоВ/лунка_

Протеогликановый Мышечно-эластический Медия субслой_субслой_

Норма

Нативные ЛНП 1603±49 1542±70 497+13

ЦмЛНП 3799+64* 2764+73* 1002+59*

Начальное поражение

Нативные ЛНП 744±31& 534±40& 330+21 &

ЦмЛНП 3326+117*& 2405+59*& 890±40*

Жировая полоса

Нативные ЛНП 716+76& 425±42& 316+138.

ЦмЛНП 1783±60*& 1312±30*& - 574+26*&

Фиброатерома

Нативные ЛНП 252±22& 211+18& 334+21&

ЦмЛНП 642+38*& 610±24*& 641±27*&

Результаты представлены как среднее четырех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛНП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

1.2.1.1. Прочность комплексов ЛНП с протеогликанами.

Как и в случае с эластином, прочность комплексов, образуемых цмЛНП с протеогликанами, была выше, по сравнению с нативными ЛНП (рис. 2).

1.2.2. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП, ЛПП и ЛВП с протеогликанами.

Связывание ЛОНП, ЛПП и ЛВП с протеогликанами протеогликанового субслоя было сходным со связыванием ЛНП и снижалось в начальных

поражениях, жировой полосе и фиброатероме, по сравнению с нормой (таблицы 6 - 8). Нативные ЛОНП обладали наименьшим сродством к протеогликанам, по сравнению со всеми изученными типами липопротеидов. Циркулирующие модифицированные ЛОНП, ЛПП и ЛВП взаимодействовали с протеогликанами эффективнее, чем нативные липопротеиды. Связывание ЛОНП, ЛПП и ЛВП с протеогликанами из мышечно-эластического субслоя и медии аорты человека было также сходно со связыванием ЛНП.

Конпентрация ЛНП, мг/ил

Рис. 2. Вытеснение нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП из комплексов с протеогликанами. Десять мкг/мл 1251-меченых нативных ЛНП и цмЛНП инкубировали 2 часа при 37°С в лунках с иммобилизованными протеогликанами протеогликанового субслоя непораженной интимы аорты человека. После промывки в лунки добавляли указанное количество немеченных липопротеидов и инкубировали в течение 2 ч. После инкубации лунки промывали и измеряли радиоактивность. Каждое значение - среднее трех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛНП, р<0,05.

Таблица 6.

Связывание нативных ЛОНП и цмЛОНП с протеогликанами из аорты человека.

Липопротеиды Количество ЛОНП, связавшихся с протеогликанами,

пг апоВ/лунка

Протеогликановый Мышечно-эластический Медия

субслой субслой

Норма

Нативные ЛОНП 297±20 226+12 176±10

ЦмЛОНП 550+5* 340±42* 304±26*

Начальное поражение

Нативные ЛОНП 249+13 203+18 159+10

ЦмЛОНП 602+93* 393±26* 294+37*

Жировая полоса

Нативные ЛОНП 91±12& 77±5& 74+4&

ЦмЛОНП 214+5*& 149+12*& 115+10*&

Фиброатерома

Нативные ЛОНП 47±2& 81±9& 88+8&

ЦмЛОНП 152+3*& 172±12*& 161±11*&

Результаты представлены как среднее четырех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛОНП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

Таблица 7.

Связывание нативных ЛПП и цмЛПП с протеогликанами аорты человека. Липопротеиды Количество ЛПП, связавшихся с протеогликанами,

пг апоВ/лунка

Протеогликановый Мышечно-эластический субслой субслой Медия

Нативные ЛПП Норма 594+16 416±32 122+18

ЦмЛПП 78814* 672±52* 414±46*

Нативные ЛПП Начальное поражение 354+16& 388±32 98±10

ЦмЛПП 630+50*& 836+92* 454+12*

Нативные ЛПП Жировая полоса 164+5& 156±8& 48±5

ЦмЛПП 227±12*& 210+20& 105±8*&

Нативные ЛПП Фиброатерома 94+3& 84±8& 58±5

ЦмЛПП 160±8*& 116±5*& 74+3*&

Таблица 8.

Связывание нативных ЛВП и цмЛВП с протеогликанами из аорты человека. Липопротеиды Количество ЛВП, связавшихся с протеогликанами ,

пгапоА-1 /лунка

Протеогликановый Мышечно-эластический субслой субслой Медия

Норма

Нативные ЛВП 404+6 288±7 150±13

ЦмЛВП 2070±21* 1128±109* 477+21 *

Начальное поражение

Нативные ЛВП 298+15& 195±6& 143±13

ЦмЛВП 562±31&* 763+48&* 455±12*

Жировая полоса

Нативные ЛВП 258+19& 219+198. 149±4

ЦмЛВП 1115+25&* 1101±90* 521+39*

Фиброатерома

Нативные ЛВП 184+25& 207+4& 194+5

ЦмЛВП 1080±90&* 890±100* 574±44*

Результаты представлены как среднее четырех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛВП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

1.2.3. Состав протеогпиканов.

Для выяснения возможных механизмов снижения связывания липопротеидов с протеогликанами атеросклеротической аорты мы изучили состав глюкозаминогликанов полученных препаратов (таблица 9). С помощью метода ВЖХ было показано, что содержание хондроитинсульфатов снижается, а доля дерматансульфата возрастает в препаратах из атеросклеротического поражения.

Таблица 9.

Содержание глюкозаминогликанов в препаратах протеогпиканов из

_протеогликанового субслоя интимы аорты человека._

Поражение _Содержание ГАГ, %_

Хондроитинсульфат Дерматансульфат Хондроитинсульфат

А С

Норма 22 11 67

Начальное 21 23 56

поражение

Жировая полоса 4 40 56

Фиброатерома 3 51 46

Связывание нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов прямо коррелировало с содержанием в препаратах протеогликанов хондроитинсульфатов А и С и отрицательно коррелировало с долей дерматансульфата (таблица 10). Таким образом, сниженная адсорбционная способность протеогликанов из атеросклеротических поражений объясняется, по всей видимости, существенными изменениями их гликоконъюгатов.

1.3. Взаимодействие липопротеидов с коллагеном.

1.3.1. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с коллагеном.

Мы обнаружили, что связывание всех классов нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с коллагеном, выделенным из различных слоев непораженных участков, начальных поражений и жировых полос, существенно не различалось (таблицы 11 - 14). Циркулирующие модифицированные липопротеиды взаимодействовали с коллагеном фиброатеромы эффективнее, чем нативные липопротеиды.

Таблица 10.

Корреляция между связыванием липопротеидов и содержанием _глкжозаминогликанов в препаратах протеогликанов._

Липопротеиды Глюкозаминогликаны

Хондроитинсульфат Дерматансульфат Хондроитинсульфат

А С

Протеогликановый субслой

Нативные ЛНП 0.91* 0.95* -0.99*

ЦмЛНП 0.95* 0.88 -0.98*

Нативные ЛОНП 0.98* 0.84 -0.98*

ЦмЛОНП 0.99* 0.70 -0.92*

Нативные ЛВП 0.91* 0.92* -0.97*

ЦмЛВП 0.98* 0.84 -0.98*

Таблица 11.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с

_коллагеном из аорты человека._"

Липопротеиды Количество ЛНП, связавшихся с коллагеном,

_пг апоВ/лунка_

Протеогликановый Мышечно-эластический Медия субслой_субслой_

Норма -

Нативные ЛНП 507+27 331 ±8 408±13

ЦмЛНП 416+47 350+10 353±15

Начальное поражение

Нативные ЛНП 363+18& 373+12 426±14

ЦмЛНП 374+14 374+7 517±7

Жировая полоса

Нативные ЛНП 277+5& 332+26 356+17

ЦмЛНП 290+5 317+17 403+12

Фиброатерома

Нативные ЛНП 460+11& 365+13 458+15

ЦмЛНП 539±16* 508±13* ' 527+15

Результаты представлены как среднее четырех определений ± стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛНП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

Таблица 12.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП

_с коллагеном из аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛОНП, связавшихся с коллагеном,

_пг апоВ/лунка_

Протеогликановый Мышечно-эластический Медия _субслой_субслой_.

Норма

Нативные ЛОНП 414±37 143+10 150+4*

ЦмЛОНП 650+58* 299+20* 328+4

■ Начальное поражение

Нативные ЛОНП 435+10 126±10 120+12*

ЦмЛОНП 598±18* 310+20* 304+15

Жировая полоса

Нативные ЛОНП 135+11 & 113+10 130+7

ЦмЛОНП 233±10*& 339±10* 332+8*

Фиброатерома

Нативные ЛОНП 180+12& 127+3 165+4

ЦмЛОНП 383±20*& 336+30* 440±9*

Таблица 13.

Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с

_коллагеном из аорты человека._

Липопротеиды Количество ЛПП, связавшихся с коллагеном,

_пг апоВ/лунка_

Протеогликановый Мышечно-эпастический Медия субслой_субслой_

Норма

Нативные ЛПП 512+21 325+27 385+27

ЦмЛПП 559±61 393±12 418+19

Начальное поражение

Нативные ЛПП 547±27 270±32 237+19

ЦмЛПП 554+18 287+19 229+7

Жировая полоса

Нативные ЛПП 214+4& 236±6 234±14

ЦмЛПП 243±17& 296±13 258±14

Фиброатерома

Нативные ЛПП 331±18& 187+16 260+18

ЦмЛПП 419±19*& 238±2* 276±12

Результаты представлены как среднее четырех определений + стандартное математическое отклонение. *, достоверное отличие от нативных ЛПП, р<0,05. &, достоверное отличие от непораженных участков, р<0,05.

1.4. Влияние десиалирования на связывание липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса.

Полученные нами данные указывают на то, что циркулирующие модифицированные липопротеиды связываются с компонентами внеклеточного матрикса эффективнее, чем нативные липопротеиды. Одной из основных характеристик циркулирующих модифицированных липопротеидов является сниженное содержание сиаловой кислоты. Мы предположили, что связывание липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса может определяться сиаловой кислотой. Для проверки этого предположения мы обработали нативные липопротеиды нейраминидазой, что привело к снижению содержания сиаловой кислоты в липопротеидах на 60-70%. Можно видеть, что десиалирование резко усиливает связывание всех классов липопротеидов с эластином, коллагеном и протеогликанами аорты человека (рис. 3).

Os 700

с; о

о.

£ 500 О

Q 300 100

Рис. 3. Влияние обработки нейраминидазой на связывание липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса. Нативные липопротеиды обрабатывали 2 ч при 37°С с 2 м11/мл нейраминидазы из Arthrobacter ureafaciens (Oxford Glycoco Sciences, Oxford, UK) в 50 мМ ацетатном буфере (рН 5.0). ЛНП отделяли ультрацентрифугированием и диализовали против 2000 объемов ИФБ; Липопротеиды использовали в концентрации 10 мкг/мл. *, достоверное отличие от необработанных ЛНП, р<0.05.

2. Влияние комплексов липопротеидов и компонентов соединительнотканного матрикса на аккумуляцию липидов в клетках интимы аорты человека.

В первой части нашей работы мы установили, что нативные и, особенно, циркулирующие модифицированные липопротеиды способны образовывать комплексы со всеми компонентами матрикса сосудистой стенки. В дальнейшей работе мы попытались выяснить, могут ли эти комплексы вызывать внутриклеточное накопление липидов (рис. 4). Было показано, что комплексы липопротеидов с эластином, коллагеном и протеогликанами вызывают 1,5-7 кратное увеличение содержания внутриклеточного холестерина в гладкомышечных клетках (ГМК) интимы аорты человека.

Другими словами, именно комплексы липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса стимулируют значительное накопление холестерина в культивируемых гладкомышечных клетках интимы непораженной аорты

ЭЛАСТИН

КОЛЛАГЕН

ПРОТЕОГЛИКАНЫ

человека. Таким образом, можно предположить, что такие комплексы способны формировать пенистые клетки in vivo.

500 -S

■ КОМПЛЕКС С ЛНП

□ КОМПЛЕКС С ЛОНП

□ КОМПЛЕКС с лвп

к *■ ^ тш

•к

ДЕБРИС

ЭЛАСТИН КОЛЛАГЕН ПРОТЕОГЛИКАНЫ

Рис. 4. Влияние комплексов липопротеидов и матрикса на накопление холестерина в гладкомышечных клетках непораженной интимы аорты. *, достоверное отличие от контроля, р<0,05.

3. Влияние внутриклеточного накопления липидов на экспрессию провоспалительных цитокинов макрофагами и гладкомышечными клетками интимы аорты человека.

До настоящего времени не выяснено существует ли взаимосвязь между такими проявлениями атеросклероза, как отложение липидов в сосудистой стенке и протекание в ней воспалительного процесса. Поэтому мы решили изучить. влияние внутриклеточного накопления липидов на экспрессию маркеров воспаления в культуре интимальных клеток. Клетки инкубировали с нативными ЛНП или комплексами цмЛНП и измеряли в них содержание внутриклеточного холестерина и экспрессию ФНО, ИЛ-1 и МГСП.

Было установлено, что инкубация клеток с нативными ЛНП не вызывала увеличения внутриклеточного содержания липидов и экспрессии маркеров воспаления (таблица 15). С другой стороны, .комплексы цмЛНП вызывают значительное накопление внутриклеточного холестерина, сопровождающееся увеличением экспрессии маркеров воспаления. Схожие данные были получены нами и в культуре макрофагов (МФ).

Было обнаружено, что экспрессия всех исследованных маркеров воспаления прямо коррелирует с увеличением содержания внутриклеточного холестерина в культивируемых ГМК и МФ (таблица 16).

Таблица 15.

Влияние накопления липидов на экспрессию провоспалительных цитокинов в гладкомышечных клетках интимы аорты человека.__

Экспрессия цитокина, % от контроля Содержание

внутриклеточного

ФНО-сх ИЛ-1 МГС I! холестерина, % от

контроля

Контроль 100±2 100±12 100±12 100±12

Нативные ЛНП 110±8 115±10 107±4 105±7

ЦмЛНП 142±4* 156±4* 167±6* 201±27*

Представлены данные одного из трех сходных экспериментов. Каждое значение является средним трех определений ± стандартное математическое отклонение.

* - достоверное отличие от контроля, р< 0,05.

Таблица 16.

Корреляция между внутриклеточным накоплением холестерина и синтезом провоспалительных цитокинов в макрофагах и гладкомышечных _клетках интимы аорты человека._. -

Клетки Цитокины

ФНО-а ИЛ-1 МГС II

Макрофаги 0,898* 0,971* -

Гладкомышечные 0,986* 0,968* 0,934*

клетки

*- статистически значимая корреляция, р< 0,05.

Таким образом, внутриклеточное накопление липидов стимулирует экспрессию маркеров воспаления. Можно предположить, что in vivo внутриклеточное накопление липидов, вызванное модифицированными липопротеидами и их комплексами с матриксом, играет важную роль в инициации воспаления в сосудистой стенке.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в модели in vitro ЛНП обладали наибольшим, а ЛОНП и ЛВП наименьшим сродством к эластину и протеогликанам аорты человека. Связывание всех исследованных нативных липопротеидов с коллагеном, выделенным из аорты человека, было сходным.

2. Липопротеиды связываются с протеогликанами и коллагеном из субслоев непораженной интимы с большей эффективностью, по сравнению с пораженными участками. Взаимодействие липопротеидов с эластином в начальных поражениях и жировой полосе выше, а в фиброатероме ниже, чем в норме.

3. Компоненты внеклеточного матрикса из протеогликанового субслоя интимы аорты человека обладают наибольшим сродством к липопротеидам, по сравнению с мышечно-эластическим субслоем и медией.

4. Все изученные типы циркулирующих модифицированных липопротеидов связываются с компонентами матрикса более эффективно, чем нативные липопротеиды. Десиалирование липопротеидов с помощью нейраминидазы in vitro существенно увеличивает их связывание с компонентами матрикса аорты человека.

5. Комплексы липопротеидов с основными компонентами внеклеточного матрикса: эластином, протеогликанами и коллагеном, вызывают значительное накопление холестерина в культивируемых гладкомышечных клетках интимы непораженной аорты человека.

6. Внутриклеточное накопление липидов стимулирует экспрессию маркеров воспаления: фактора некроза опухоли-а, интерлейкина 1, молекулы гистосовместимости II типа в культивируемых клетках интимы аорты человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Супрун И.В., Тертов В.В., Скалбе Т.А,, и др. Ассоциация нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности с коллагеном, протеогликанами и эластином субслоев интимы и медии аорты человека. II Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза. Материалы симпозиума. Москва, 1 июня 2000. С. 39.

2. Супрун И.В., Тертов В.В., Скалбе Т.Д., и др. Взаимодействие липопротеидов низкой плотности с коллагеном, протеогликанами и эластином интимы и медии непораженной и атероскперотической аорты человека. II Российский национальный конгресс кардиологов. Тезисы докладов. Москва, 10-12 октября 2000. С. 287.

3. Тертов В.В., Супрун И.В., Медведева Л.А. Взаимодействие липопротеидов низкой плотности с эластином интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т.129. N 2. С. 180-182.

4. Tertov V.V., Suprun I V., Medvedeva L.A. Association of native and naturally occurring multiple-modified LDL with proteoglycans from intimal sublayers and media of unvolved and atherosclerotic human aorta. II In: 12th International Symposium on Atherosclerosis., 25-29 June. 2000: Abstracts of the 12th International Symposium on Atherosclerosis. Atherosclerosis 2000. V.151. P.120.

5. Tertov V.V., Suprun I.V., Scalbe T.A. Binding of native and naturally occurring multiple-modified LDL with elastin of unvolved and atherosclerotic human aorta. In: 12th International Symposium on Atherosclerosis., 25-29 June. 2000: Abstracts of the 12th International Symposium on Atherosclerosis. Atherosclerosis 2000. V. 151. P. 120.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Супрун, Игорь Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Сосудистый внеклеточный матрикс и его взаимодействия с липопротеидами.

1.1. Эластин непораженной и атеросклеротической аорты.

1.1.1. Содержание и состав эластина.

1.1.2. Взаимодействие эластина с липопротеидами.

1.2. Протеогликаны непораженной и атеросклеротической аорты.

1.2.1. Содержание и состав протеогликанов.

1.2.2. Взаимодействие протеогликанов с липидами и липопротеидами.

1.3. Коллаген непораженной и атеросклеротической аорты.

1.3.1 Содержание и состав коллагена.

1.2. Взаимодействие коллагена с липопротеидами.

Глава 2. Модифицированные липопротеиды низкой плотности плазмы крови человека.

Глава 3. Иммунные механизмы в атеросклерозе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4 Материалы и методы.

4.1. Выделение эластина из аорты человека.

4.2. Выделение протеогликанов из аорты человека.

4.3. Выделение коллагена из аорты человека.

4.4. Выделение липопротеидов из плазмы крови человека.

4.5. Получение нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов из плазмы крови человека.

4.6. Приготовление иод-меченых препаратов липопротеидов.

4.7. Приготовление комплексов ЛНП с эластином, протеогликанами и коллагеном.

4.8. Получение коллагеназа-резистентного дебриса.

4.9. Определение содержания белка.

4.10. Измерение содержания сиаловой кислоты.

4.11. Измерение уроновой кислоты.

4.12. Измерение содержания гидроксипролина.

4.13. Определение состава протеогликанов.

4.14. Измерение взаимодействия липопротеидов с внеклеточным матриксом.

4.14.1. Измерение связывания ЛНП, ЛОНП, ЛПП с матриксом.

4.14.2. Измерение связывания ЛВП с матриксом.

4.14.3. Измерение связывания липопротеидов с матриксом радиоизотопным методом.

4.14.4. Измерение обратимости связывания ЛНП с внеклеточным матриксом.

4.15. Выделение и культивирование гладкомышечных клеток интимы аорты человека.

4.16. Выделение белых клеток крови человека.

4.17. Культура макрофагов человека.

4.18. Культивирование клеток с исследуемыми липопротеидами низкой плотности и их комплексами.

4.19. Определение содержания внутриклеточного холестерина.

4.20. Измерение клеточного белка.

4.21. Измерение экспрессии молекулы гистосовместимости II типа.

4.22. Измерение экспрессии интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли-а.

4.23. Статистическая обработка данных.

Глава 5. Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса из интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека.

5.1 Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с эластином, выделенным из интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека.

5.1.1. Эластин непораженной и атеросклеротической аорты человека.

5.1.2. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с эластином.

5.1.2.1. Прочность комплексов ЛНП с эластином.

5.1.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП с эластином.

5.1.4. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с эластином.

5.1.5. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с эластином.

5.1.6. Взаимосвязь между аминокислотным составом эластина и связыванием липопротеидов.

5.1.7. Влияние десиалирования на связывание липопротеидов с эластином.

5.1.8. Обсуждение результатов.

5.2. Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с протеогликанами из интимы и медии непораженной и агеросклеротической аорты человека.

5.2.1. Протеогликаны непораженной и атеросклеротической аорты человека.

5.2.2. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с протеогликанами аорты человека.

5.2.2.1. Прочность комплексов ЛНП с протеогликанами.

5.2.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП с протеогликанами.

5.2.4. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с протеогликанами.

5.2.5. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с протеогликанами.

5.2.6. Взаимосвязь между составом глюкозаминогликанов протеогликанов и связыванием липопротеидов.

5.2.7. Влияние десиалирования на связывание липопротеидов с протеогликанами.

5.2.8. Обсуждение результатов.

5.3. Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с коллагеном, выделенным из интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека.

5.3.1. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛНП с коллагеном.

5.3.2. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП с коллагеном.

5.3.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с коллагеном.

5.3.4. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с коллагеном.

5.3.5. Влияние удаления сиаловой кислоты на связывание липопротеидов с коллагеном.

5.3.6. Обсуждение результатов.

Глава 6. Влияние комплексов липопротеидов и компонентов соединительнотканного матрикса на аккумуляцию липидов в клетках интимы аорты человека.

6.1. Обсуждение результатов.

Глава 7. Влияние внутриклеточного накопления липидов на экспрессию провоспалительных цитокинов макрофагами и гладкомышечными клетками интимы аорты человека.

7.1. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия липопротеидов с компонентами матрикса аорты человека и его роли в клеточных проявлениях атеросклероза"

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и инвалидности людей в России и других развитых индустриальных странах. Большинство сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклеротического поражения магистральных сосудов человека. Поэтому исследование механизмов развития атеросклероза является важнейшей задачей в борьбе с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Одной из наиболее ранних и ярких черт атеросклеротического поражения сосудов человека является накопление внутри- и внеклеточных липидов. В настоящее время имеется большое количество данных, указывающих на важную роль внеклеточного матрикса в отложении липидов в стенке сосудов при атеросклерозе. Аничков (1947) с сотрудниками описали первичное отложение жира вдоль эластиновых волокон аорты кроликов, получающих холестериновую диету, и человека (Аничков 1947). Ассоциацию сосудистых липидов с эластином позднее описали также Smith et al. (Smith 1967, Smith et al. 1974). Guyton et al., используя электронную микроскопию, установили, что более 74 % липидов может быть связано с эластином аорты человека (Guyton et. al. 1985, Bokan et. al. 1986). Kramsch et al. показали, что эластин, выделенный из аорты человека, содержит липиды (Kramsch et. al. 1971, Kramsch et.al. 1973). В настоящее время установлено, что основным источником липидов в стенках сосудов являются липопротеиды (Wessler 1976,

Hoff 1978, Stender and Hjilms 1984, Hoff and O'Neil 1991, Stenberger et. al. 1992). Поэтому в последнее время активно изучается взаимодействие липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса. Tokita et al. (1977) обнаружили, что подфракции эластина, выделенные из интимы-медии аорты человека с помощью эластазы, способны связывать липиды липопротеидов низкой плотности. Noma et. al. (1979, 1981) показали, что эластин, выделенный из объединенной интимы атеросклеротической аорты человека, способен связывать липиды из липопротеидов очень низкой (ЛОНП), промежуточной (J11111), низкой (ЛЕИ) и высокой (ЛВП) плотности, изолированные из плазмы крови. Mawhinney et. al. и Srenivasan et. al. показали наличие комплексов протеогликанов и ЛНП в аорте кроликов, содержащихся на холестериновой диете, и атеросклеротической аорте человека (Mawhinney et. al. 1978, Srenivasan et. al. 1975). Vijayagopal et.al. выделили фракцию протеогликанов из аорты быка и человека, характеризующуюся высоким сродством к ЛНП, комплексы липопротеидов с этими протеогликанами, стимулируют накопление эфиров холестерина в макрофагах человека. (Srenivasan et. al. 1989, Vijayagopal et. al. 1996). Hoff et. al., используя иммунногистихимические методы, установили, что апоВ в артериях человека колокализован с фибриллами коллагена (Hoff et. al. 1976). Claire et. al. обнаружили, что в интиме-медии аорты человека существует фракция липидов, прочно ассоциированных с волокнами коллагена и эластина (Claire et. al. 1976). Однако, до настоящего времени исследования взаимодействия липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса проводились на препаратах, выделенных из объединенных интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты, без подразделения на субслои и начальные поражения. Кроме того, в предшествующих работах использовали суммарные препараты липопротеидов, полученные из плазмы крови здоровых лиц. Таким образом, механизмы приводящие к внеклеточному отложению липидов}остаются не выясненными.

Недавно мы обнаружили в крови человека циркулирующие модифицированные ЛНП ("десиалированные" ЛНП) (Orekhov et. al 1989, Orekhov et. al. 1991). Циркулирующие модифицированные липопротеиды, в отличие от нативных, вызывали аккумуляцию липидов (в частности эфиров холестерина) в клетках интимы аорты человека и макрофагах, т.е. являлись атерогенными (Tertov et. al. 1992). Одной из основных характеристик циркулирующих модифицированных ЛНП (цмЛНП) является низкое содержание сиаловой кислоты - терминального углевода биантенных цепей апоВ и углеводных цепей ганглиозидов (Tertov et. al. 1989, Tertov et. al. 1992). Это свойство циркулирующих модифицированных липопротеидов позволяет выделить их из суммарной фракции с помощью лектин-хроматографии на Ricinus communis agglutinin (RCA12o)-arapo3e (Tertov et. al 1990). ЦмЛНП характеризуются низким содержанием нейтральных Сахаров и пониженным уровнем нейтральных липидов и фосфолипидов. Для них характерен более высокий отрицательный заряд, большая плотность, уменьшенный размер и повышенная предрасположенность к окислению, за счет пониженного содержания витаминов антиоксидантов (Tertov et. al. 1989, Orekhov et. al. 1991, Tertov et. al. 1992, Tertov et. al. 1993). Недавно нами было описано наличие в плазме крови человека нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП, ЛПП и ЛВП, которые как и подфракции ЛНП имеют различные свойства (Tertov and Orekhov 2000). Однако, до настоящего времени не было исследовано взаимодействие циркулирующих модифицированных липопротеидов с соединительно-тканным матриксом.

В настоящее время исследователи, работающие над изучением механизмов формирования и прогрессирования атеросклеротических поражений у человека, все большее внимание уделяют воспалительному компоненту атеросклеротических поражений. Показано, что количество гематогенных клеток, компонентов комплимента, экспрессия провоспалительных цитокинов значительно увеличивается в атеросклеротических поражениях по сравнению с непораженными участками артерий (Libby and Hansson 1991, Rosenfeld and Pectel, 1994). Подробно охарактеризованы клеточные популяции гематогенных клеток и описаны различные медиаторы воспаления, экспрессируемые этими клетками в очагах атеросклеротических поражений (Kovanen et al. 1995, Katsuda et al. 1993, Gown et al. 1986, Emeson and Robertson 1988; Libby and Hansson 1991, Rosenfeld and

Pectel 1994). Однако, вопрос о том, может ли увеличение количества липидов в сосудистой стенке быть инициирующим моментом для развития воспалительной реакции при атеросклерозе, окончательно не решен.

Целью данной работы явилось исследование механизмов внеклеточного отложения липидов, его роли во внутриклеточном накоплении липидов, и связи между клеточным липоидозом и инициацией воспалительной реакции в сосудистой стенке.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1) Изучение взаимодействия нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с эластином из протеогликанового и мышечно-эластического субслоев интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека;

2) Исследование взаимодействия нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с протеогликанами из протеогликанового и мышечно-эластического субслоев интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека;

3) Изучение взаимодействия нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с коллагеном из протеогликанового и мышечно-эластического субслоев интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека;

14

4) Определение влияния комплексов липопротеидов и компонентов соединительно-тканного матрикса на аккумуляцию липидов в клетках интимы аорты человека;

5) Выявление влияния внутриклеточного накопления липидов на синтез провоспалительных цитокинов в гладкомышечных клетках интимы аорты человека и макрофагах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Супрун, Игорь Валерьевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе мы показали, что в модели in vitro ЛНП обладали наибольшим, а ЛОНП и ЛВП наименьшим сродством к эластину и протеогликанам аорты человека. Связывание всех исследованных нативных липопротеидов с коллагеном, выделенным из аорты человека было схожим. При этом липопротеиды связываются с протеогликанами и коллагеном из непораженной интимы с большей эффективностью, по сравнению с пораженными участками. Взаимодействие липопротеидов с эластином в начальных поражениях и жировой полосе выше, а в фиброатероме ниже, чем в норме. Установлено, что эластин, протеогликаны и коллаген из протеогликанового субслоя интимы непораженной и атеросклеротической аорты человека обладают наибольшим сродством к нативным и циркулирующим модифицированным липопротеидам, по сравнению с мышечно-эластическим субслоем и медией аорты человека. Обнаружено также, что циркулирующие модифицированные липопротеиды взаимодействуют с компонентами внеклеточного матрикса с большей эффективностью, чем нативные липопротеиды. Кроме того, циркулирующие модифицированные липопротеиды образуют более прочные комплексы с матриксом, чем нативные, и таким образом могут задерживаться в сосудистой стенке. Было показано, что комплексы липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса

151 эластином, протеогликанами и коллагеном - вызывают значительное накопление внутриклеточного холестерина в интимальных клетках. Таким образом, можно предположить, что такие комплексы способны формировать пенистые клетки in vivo. Мы также установили, что внутриклеточное накопление липидов, индуцируемое комплексами липопротеидов, стимулирует экспрессию маркеров воспаления: фактора некроза опухоли-а, интерлейкина 1, молекулы гистосовместимости II типа в интимальных клетках. Это наблюдение позволяет предположить, что in vivo внутриклеточное накопление липидов, вызванное модифицированными липопротеидами и их комплексами с матриксом, играют важную роль в инициации воспаления в сосудистой стенке.

1. Показано, что в модели in vitro ЛНП обладали наибольшим, а ЛОНП и ЛВП наименьшим сродством к эластину и протеогликанам аорты человека. Связывание всех исследованых нативных липопротеидов с коллагеном, выделенным из аорты человека было схожим.

2. Липопротеиды связываются с протеогликанами и коллагеном из субслоев непораженной интимы с большей эффективностью, по сравнению с пораженными участками. Взаимодействие липопротеидов с эластином в начальных пораженях и жировой полосе выше, а в фиброатероме ниже, чем в норме.

3. Эластин, протеогликаны и коллаген из протеогликанового субслоя интимы непораженной и атеросклеротической аорты человека обладает наибольшим сродством к нативным и циркулирующим модифицированным липопротеидам, по сравнению с мышечно-эластическим субслоем и медией аорты человека.

4. Все изученные типы циркулирующих модифицированных липопротеидов связываются с эластином, протеогликанами и коллагеном более эффективно, чем нативные липопротеиды. Десиалирование липопротеидов с помощью нейраминидазы in vitro существенно увеличивает их связывание с эластином, протеогликанами и коллагеном аорты человека.

153

5. Комплексы липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса, эластином, протеогликанами и коллагеном, вызывают значительное накопление холестерина в культивируемых клетках гладкомышечных клетках интимы непораженной аорты человека.

6. Внутриклеточное накопление липидов стимулирует экспрессию маркеров воспаления: фактора некроза опухоли-а, интерлейкина 1, молекулы гистосовместимости II типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Супрун, Игорь Валерьевич, Москва

1. Аничков Н.Н. Сердце и сосуды. / В кн.: Частная патологическая анатомия. М.-Л.: Медгиз, 1947. Том 2. С. 262-558.

2. Тертов В.В., Каплун В.В., Собенин И.А. и др. Липидный состав множественно-модифицированных (десиалированных) липопротеидов низкой плотности // Бюллетень эксп. биол. и мед. 19966. Т.122. N 7. С.37-39.

3. Тертов В.В., Каплун В.В., Собенин И.А. и др. Множественно-модифицированные (десиалированные) липопротеиды низкой плотности: физико-химические свойства // Бюллетень эксп. биол. и мед. 1996а. Т. 121. N 1. С.42-43.

4. Alavi MZ, Richardson М, Moore S. The in vitro interactions between serum lipoproteins and proteoglycans of the neointima of rabbit aorta after a single baloon catheter injury// Am. J. Pathol. 1989. V.134. P.l 87-294.

5. Alves C.S., Mourao P.A.S. Interaction of high molecular weight chondroitin sulfate from human aorta with plasma low density lipoproteins // Atherosclerosis. 1988. Y. 73. P. 113-124.

6. Anber V, Griffin BA, McConnel M et. al. Influence of plasma lipid and LDL-subfractions profile on the interacion between low density lipoprotein with human arterial wall proteoglycans // Atherosclerosis. 1996. Y.124. P. 261-271.

7. Anber V, Millar JS, McConnel M et. al. Interaction of very-low-density, intermediate-density, and low-density lipoproteins with human arterial wall proteoglycans // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. V. 17. P. 2507-2514.

8. Aqel N.M., Ball R.Y., Waldmann H et. al. Identification of macrophages and smooth muscle cells in human atherosclerosis usingmonoclonal antibodies // J. Pathol. 1985. V. 146. P. 197.

9. Avogaro P., Bittolo Bon G., Cazzolato G. Presence of a modified low density lipoprotein in humans // Atherosclerosis. 1988. V.8. P.79-87.

10. Avogaro P., Cazzolato G., Kramsh D.M., et al. Oxidative damage to circulating LDL. / In: Drugs affecting lipid metabolism. Kluver: Dordrecht, 1993. P. 183-190.

11. Barath P., Fishbein M.C., Cao J., et al. Detection and localization of tumor necrosis factor in human atheroma // Am. J. Cardiol. 1990a. V 65. P. 297-302.

12. Barath P., Fishbein M.C., Cao J., et al. Tumor necrosis factor gene expression in human vascular intimal smooth muscle cells detected by in situ hybridization // Am. J. Pathol. 19906. V. 137. P. 503-509.

13. Barnes M.J., Gordon J.L., Maclntyre D.E. Platelet-aggregating activity of type I and type III collagens from human aorta and chicken skin // Biochem. J. 1976. V. 160. P. 647-651.

14. Barnes M.J. Collagens in atherosclerosis // Coll. Relat. Res. 1985 V. 5 P. 65-97.

15. Bihari-Varga M., Vegh M. Quantitative studies on the complex formed between aortic mucopolysaccarides and serum lipoproteins // Biochim. Biophys. Acta. 1967. V. 144. P. 202-210.

16. Bihary-Varga M, Gruber E, Rotheneder M, et al. Interaction of Lp(a) and low density lipoprotein with glycosaminoglycans from human aorta // Atherosclerosis. 1988. V.8. P. 851-857.

17. Bilheimer DW, Eisenberg S, Levy RI. The metabolism of very low density lipoprotein proteins. I. Preliminary in vitro and in vivo observations // Biochim. Biphys. Acta. 1972. V. 260. P. 212-224.

18. Camejo G. The interaction of lipids and lipoproteins with the intercellular matrix of arterial tissue: its possible role in atherogenesis // Adv. Lipid Res. 1982. V. 19. P. 1-53

19. Camejo G., Lalaguna F., Lopez F., et. al. Characterization and properties of a lipoprotein-complexing proteoglycan from human aorta // Atherosclerosis. 1980. V. 35. P. 307-320.

20. Camejo G., Lopez A., Lopez F., et. al. Interaction of low density lipoproteins with arterial proteoglycans. The role of charge and sialic acid content // Atherosclerosis. 1985V. 55 P. 93-105.

21. Camejo G., Ponce E., Lypez F., et. al. Partial structure of the active moiety of a lipoprotein complexing proteoglycan from human aorta // Atherosclerosis. 1983. V. 49. P. 241-254.

22. Camejo G., Waich S., Quintero G., et.al. The affinity of low density lipoproteins for an arterial macromolecular complex A study in ishemic heart disease patients and controls // Atherosclerosis. 1976. V. 24. P. 341-355.

23. Cardoso L.E.M., Mourao P.A.S. Glycosaminoglycan fractions from arteries presenting diverse susceptibilities to atherosclerosis have different binding affinities to plasma LDL // Arterioscler. Thromb. 1994. V. 14. P. 115-124.

24. Cazzolato G., Avogaro P., Bittolo-Bon G. Characterisation of a more electronegatively charged LDL subfraction by ion-exchange HPLC // Free Radical Biol. Med. 1991. V.ll. P.247-253.

25. Chen Q., Wei E., Chen X., et. al. Interactions between macrophages and oxidized low density lipoprotein in the presence of type I collagen // Biofactors. 1997. V. 6. P. 131-138.

26. Cherchi G.M., Coinu R., Demuro P., Formato M., et. al. Structural and functional modifications of human aorta proteoglycans in atherosclerosis // Matrix. 1990. V. 10. P. 362-372.

27. Christner J.E, Baker J.R. A competitive assay of lipoprotein: proteoglycan interaction using a 96-well microtitration plate // Anal. Biochim. 1990. V.184. P.388-394.

28. Chung E., Miller E.J. Collagen polymorphism: characterization of molecules with the chain composition (alpha 1 (3)03 in human tissues // Science. 1974. V. 183. P. 1200-1201.

29. Chung E., Rhodes R.K., Miller E.J. Isolation of three collagenous components of probable basement membrane origin from several tissues // Biochim. Biophys. Res. Comm. 1976. V. 71. P. 1167-1174.

30. Claire M., Jacotot В., Robert L. Characterization of lipids associated with macromolecules of the intercellular matrix of human aorta // Connect. Tissue. Res. 1976. V.4.P. 61-71.

31. Curwen K.D., Smith S.C. Heparitin sulfates (heparan sulfates) of atherosclerosis-susceptible and atherosclerosis-resistant pigeon aortas // Atherosclerosis. 19776. V. 27. P.l 13-117.

32. Curwen K.D., Smith S.C. Aortic glycosaminoglycans in atherosclerosis-susceptible and -resistant pigeons // Exp. Mol. Pathol. 1977a. V. 27. P. 121-133.

33. Dejana E., Ji-Ming W., Mantovani A. The recruitment of leukocytes and their interaction with the vessel wall: the role of interleukin-1 and tumor necrosis factor // Scand. J. Rheumatol. 1987. V. 66. P. 19-28.

34. Dinarello C.A. Biology of interleukin 1 // FASEB. J. 1988. V 2. P. 108-115.

35. Emeson E.E., Robertson A.L.Jr. T lymphocytes in aortic and coronary intimas // Am.J.Pathol. 1988. V. 130. P. 369-376.

36. Emeson E.E., Robertson A.L. T lymphocytes in aortic and coronary intimas. Their potential role in atherogenesis // Am. J. Pathol. 1988. V. 130. P. 369-376.

37. Falcone D.J., Mated N., Shio H., et. al. Lipoprotein-heparin-fibronectin-denatured collagen complexes enhance cholesteryl ester accumulation in macrophages // J. Cell. Biol. 1984. V. 99. P. 1266-1274.

38. Filipovic A., Schwarczmann E., Mraz W., et. al. Sialic acid content of low density lipoproteins controls their binding and uptake by cultured cells // Eur. J. Biochem. 1989. V.93. P.51-55.

39. Fukumoto Y., Shimokawa H., Ito A., et. al. Inflammatory cytokines cause coronary arteriosclerosis-like changes and alterations in the smooth-muscle phenotypes in pigs // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1997. V 29. P 222-231.

40. Gardais A., Picard J., Hermelin B. Glycosaminoglycan (GAG) distribution in aortic wall from five species // Сотр. Biochem. Physiol. 1973. V. 44B. P. 507-515.

41. Gown A.M., Tsukada Т., Ross R. Human atherosclerosis II. Immunocytochemical analysis of the cellular composition of human atherosclerotic lesions // Am. J. Pathol. 1986. V. 125. P 191-207.

42. Greilberger J., Schmut O., Jergens G. In vitro interactions of oxidatively modified LDL with type I, II, III, IV, and Y collagen, laminin, fibronectin, and poly-D-lysine //Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. V. 17. P. 2721-2728.

43. Guyton J.R., Bocan T.M., Schifani T.A. Quantitative ultrastructural analysis of perifibrous lipid and its association with elstin in nonatherosclerotic human aorta // Arteriosclerosis. 1985. V. 5. P. 646-652.

44. Hanson A. N., Bentley J.P. Quantitation of type I to type III collagen ratios in small samples of human tendon, blood vessels, and atherosclerotic plaque // Anal. Biochem. 1983. V. 130. P. 32-40.

45. Hansson G.K., Jonasson L., Holm J., et. al. Class IIMHC antigen expression in the atherosclerotic plaque: smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ and the invariant gamma chain // Clin. Exp. Immunol. 1986. V. 64. P. 261-268.

46. Hara A., Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent // Anal. Biochem. 1978. V. 90. P. 420-426.

47. Haust M.D. Complications of atherosclerosis in the human abdominal aorta // Monogr. Atheroscler. 1986. V.14.V. 43-48.

48. Hoff , O'Neil. Lesion-derived low density lipoprotein and oxidized low density lipoprotein share a lability for aggregation, leading to enhanced macrophage degradation//Artheroscl. Thromb. 1991. V. 11. P. 1209-1222.

49. Hoff H.F. ApoB concentration in normal human aorta // Biochem. Biophis. Res. Com. 1978. V. 85. P. 1424-1438.

50. Hoff H.F., Kavagas M., Heideman C.L., et. al. Correlation in the human aorta of apoB fractions with tissue cholesterol and collagen content // Atherosclerosis. 1979. V. 32. P. 259-267.

51. Hoff H.F., Clevidence B.A. Uptake by mouse peritoneal macrophages of large cholesteryl ester-rich particles isolated from human atherosclerotic lesions // Exp. Mol. Pathol. 1987. V. 466. P. 331-344.

52. Hoff H.F., Heideman C.L., Noon G.P., et. al. Localization of apo-lipoproteins in human carotid artery plaques // Stroke. 1975. V. 6. P. 531-534.

53. Hoff H.F., Jackson R.L., Gotto A.M. Jr. Apo-lipoprotein localization in human atherosclerotic arteries //Adv. Exp. Med. Biol. 1976. V. 67. P. 109-120.

54. Hoff H.F, Wagner W.D. Plasma low density lipoprotein accumulation in aortas of hypercholesterolemic swine correlates with modifications in aortic glycosaminoglycan composition // Atherosclerosis. 1986. V. 61. P. 231-236.

55. Hoover G. A., McCormick S., Kalant N. Interaction of native and cell-modified low density lipoprotein with collagen gel // Arteriosclerosis. 1988. V. 8. P. 525534.

56. Hurt E., Bondjers G., Camejo G. Interaction of LDL with human arterial proteoglycans stimulates its uptake by human monocyte-derived macrophages // J. Lipid Res. 1990. V. 31. P. 443-454.

57. Hurt-Camejo E., Olsson U., Wiklund O., et. al. Cellular consequences of the association of apoB lipoproteins with proteoglycans. Potential contribution to atherogenesis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. V. 17. P. 1011-1017.

58. Hurt-Camejo E., Rosengren В., Lopez F., et. al. Differential uptake of proteoglycan-selected subfractions of low density lipoprotein by human macrophages // J. Lipid Res. 1990. V. 31. P. 1387-98.

59. Jaakkola О., Solakivi Т., Tertov V.V., et al. Characteristics of low density lipoprotein subtractions from patients with coronary artery disease // Coron. Artery Dis. 1993. Y.4. P.379-385.

60. Jimi S., SakataN., Matunaga A., et. al //Atherosclerosis. 1994. V. 107. P. 109-116.

61. John R., Thomas J. Chemical compositions of elastins isolated from aortas and pulmonary tissues of humans of different ages // Biochem. J. 1972. V. 127. P. 261269.

62. Jonasson L., Holm J., Skalli O., et. al. Regional accumulations of T cells, macropfages, and smooth muscle cells in the human atherosclerosis plaque // Atherosclerosis. 1986. V. 6. P131-142.

63. Kagan H., Lerch R.M. Amidated carboxyl groups in elastin // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V 434. P 223-232.

64. Katsuda S., Coltrera M.D., Ross R., Gown A.M. Human atherosclerosis. IV. Immunocytochemical analysis of cell activation and proliferation in lesions of young adults // Am. J. Pathol. 1993. V. 142. P. 1787-1793.

65. Keeley F.M., Partridge S.M. Amino acid composition and calcification of human aortic elastin//Atherosclerosis. 1974. V. 19. P. 287-296.

66. Kovanen P.T., Kaartinen M., Paavonen T. Infiltrates of activated mast cells at the site of coronary atheromatous erosion or rupture in myocardial infarction // Circulation. 1995. V. 92. P. 1084-1088.

67. Kramsch D. The role of connective tissue in atherosclerosis // Adv. Exp. Med. Biol. 1978. V. 109. P. 55-67.

68. Kramsch D.M., Franzblau C., Hollander W. Components of the protein-lipid complex of arterial elastin: Their role in the retention of lipid accumulation in atherosclerotic lesions // Adv. Exp. Med. Biol. 1974. V. 43. P. 193-210.

69. Kramsch D.M., Franzblau C., Hollander W. The protein and lipid composition of arterial elastin and its relationship to lipid accumulation in the atherosclerotic plaque // J. Clin. Invest. 1971. V. 50. P. 1666-1672.

70. Kramsch D.M., Hollander W. J. The interaction of serum and arterial lipoproteins with elastin of the arterial intima and its role in the lipid accumulation in atherosclerotic plaques // Clin. Invest. 1973. V. 5. P. 236-47.

71. La Belle M., Krauss R.M. Differences in carbohydrate content of low density lipoproteins associated with low density lipoprotein subclass patterns // J. Lipid Res. 1990. V.31. P.1577-1588.

72. Libby P., Hansson G.K. Biology of disease. Involvement of the immune system in human atherosclerosis: current knowlege and unanswered questions // Lab.Invest. 1991. V. 64. P. 5-15.

73. Lin R.C., Dai J., Lumeng L., et al. Serum low dencity lipoprotein of alcoholic patients is chemicaly modified in vivo and induces apolipoprotein E synthesis in macrophages // J. Clin. Invest. 1995. V.95. P.1979-1986.

74. Loppnow H., Libby P. Comparative analysis of cytokine induction in human vascular endothelial and smooth muscle cells // Lymphokine Res. 1989. V. 8. P. 293-298.

75. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., et. al. Protein mesurement with the Folin reagent // J.B.C. 1951. V. 193. P. 265-275.

76. Macek J., Krajickova J., Adam M. Rapid determination of disaccharides from chondroitin and dermatan sulfhates by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1987. V. 414. P. 156-160.

77. Mawhinney T.P., Augustyn J.M., Fritz K.E. Glycosaminoglycan lipoprotein complexes from aortas of hypercholesterolemic rabbits: Part 1. Isolation and characterization // Atherosclerosis. 1978. V. 31. P. 155-169.

78. Mayne R., Zettergren J.C., Mayne P.M., et. al. Isolation and partial characterization of basement membrane-like collagens from bovine thoracic aorta // Artery. 1980. V. 4. P. 262-280.

79. McCullagh K.G. Increased type I collagen in human atherosclerotic plaque // Atherosclerosis. 1983. V. 46. P. 247-258.

80. McCullagh K.G., Balian G. Collagen characterisation and cell transformation in human atherosclerosis //Nature (Lond.) 1975. V. 258. P. 73-75.

81. Millar J.S., Anber V., Shepherd J., Packard C.J. Sialic acid-containing components of lipoproteins influence lipooprotein-proteoglycan interactions // Atherosclerosis. 1999. V. 145. P. 253-60.

82. Morton L.F., Barnes M.J. Collagen polymorphism in the normal and diseased blood vessel wall. Investigation of collagens types I, III and V // Atherosclerosis. 1982. V. 42. P. 41-51.

83. Mourao P.A., Skreekumar P., DiFerrante V. The binding of chondroitin 6-sulfate to plasma low density lipoprotein // Biochim. Biophys. Acta 1981. V. 674. P. 178187.

84. Mourao P.A., Bracamonte C.A. The binding of human aortic glycosaminoglycans and proteoglycans to plasma low density lipoproteins // Atherosclerosis. 1984. V. 50. P. 133-46.

85. Nakashima Y., Nakamura M., Kikuchi Y. Cerebral atherosclerosis in Japanese part 6: the interaction of plasma lipoproteins with glycosaminoglycans isolated from the cerebral arteries and aortas // Artery. 1981. V. 9. P. 151-155.

86. Newman R.E., Logan M.A. The determination of hydroxyproline // J. Biol. Chem. 1950. V. 184. P. 299-305.

87. Noma A., Hirayama Т., Yachi A. Inhibitory effect of high density lipoprotein subfractions on the in vitro binding of low density lipoproteins to arterial elastin // Atherosclerosis. 1983a. V. 49. P. 171-175.

88. Noma A., Hirayama Т., Yachi A. Studies on the binding of plasma low density lipoproteins to arterial elastin // Connect. Tissue Res. 19836. V. 11. P. 123-133.

89. Noma A., Takahashi Т., Yamada K., et.al. Elastin lipid interaction action in arterial wall. Parti. Extraction of elastin from human aortic intima // Atherosclerosis. 1979a. V. 33. P. 29-39.

90. O'Driscoll S.W., Salter R.B., Keeley F.W. A method for quantitative analysis of ratios of types I and II collagen in small samples of articular catrilage // Anal. Biochem. 1985. V. 145. P. 277-285.

91. Oegema T.R., Hanscall V.C, Eisenstein R. Characterization of bovine aorta proteoglican extracted with guanidine hydrochloride in the presence of protease inhibitors // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1312-1318.

92. Olsson U., Camejo G., Bondjers G. Binding of a synthetic apolipoprotein B-100 peptide and peptide analogues to chondroitin 6-sulfate: effects of the lipid environment // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1858-1865.

93. Olsson U., Camejo G., Olofsson S-O., et. al. Molecular parameters that control the association of low density lipoprotein apo B-100 with chondroitin sulphate // Biochem. Biophys. Acta. 1991. У 1097. P 37-44.

94. Ooshima A. Collagen В chain: Increased proportion in human atherosclerosis // Science. 1981. V. 213. P. 666-668.

95. Orekhov A.N. Tertov V.V. Novikov I.D., et. al. Lipids in cells of atherosclerotic and uninvolved human aorta. I. Lipid composition of aortic tissue and enzyme-isolated and cultured ceils // Exp. Mol. Pathol. 1985. V. 42. P. 117-137.

96. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N. Desialylated low density lipoprotein naturally occuring lipoprotein with atherogenic potency // Atherosclerosis. 1991. V.86. P.153-161.

97. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin V. et. al. // Biochem. Biophys. Acta. 1987. V. 928. P. 251-258.

98. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin V. et. al. //Atherosclerosis. 1989. V.79. P. 59-70.

99. Orekhov A.N., Tertov V.V., Sobenin I.A. et al. Sialic acid content of human low density lipoproteins affects their interaction with cell receptors and intracellular lipid accumulation // J. Lipid Res. 1992. V.33. P.805-807.

100. Parthasarathy S., Quinn M.T., Schwenke D.C., et. al. Oxidative modification of beta-very low density lipoprotein. Potential role in monocyte recruitment and foam cell formation // Arteriosclerosis. 1989. V. 9. P. 398.

101. Podet E.J., Shaffer D.R., Gianturco S.H., et. al. Interaction of low density lipoproteins with human aortic elastin // Arterioscler. Thromb. 1991. V. 11. P. 116-22.

102. Quinn M.T., Parthasarathy S., Fong L.G., et. al. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 2995.

103. Rosenfeld M.E., Pestel E. Cellularity of atherosclerotic lesions // Coronary Artery Dis. 1994. V. 5. P. 189-197.

104. Ross R., Bornstein P. The elastic fiber. I. The separation and partial characterization of its macromolecular components // J. Cell Biol. 1969. V 40. P. 366-381.

105. Saito H., Yamagata Т., Suzuki S. Enzymatic methods for the determination of small quantities of isomeric chondroitin sulfates // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 1536-1542.

106. Salisbury B.G., Falcone D.J., Minick C.R. Insoluble low-density lipoprotein-proteoglycan complexes enhance cholesteryl ester accumulation in macrophages // Am. J. Pathol. 1985. V. 120. P. 6-11.

107. Saulnier J.M., Hauck M., Fulop T. Jr., et. al. Human aortic elastin from normal individuals and atherosclerotic patients: lipid and cation contents; susceptibility to elastolysis // Clin. Chim. Acta. 1991. V. 200. P. 129-36.

108. Shen M.M.S., Krauss R.M., Lindgren F.T., et al. Heterogenity of serum low density lipoproteins in normal human subjects // J. Lipid Res. 1981. V.22. P.236-244.

109. Shi C., Lee W-S., He Q., et. al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 4051-4056.

110. Shimokawa H., Ito A., Fukumoto Y., et. al. Chronic treatment with interleukin-1 beta induces coronary intimal lesions and vasospastic responses in pigs in vivo. The role of platelet-derived growth factor// J. Clin. Invest. 1996. V. 97. P. 769-76.

111. Shiomi M., Ito Т., Tsukada Т., et. al. Cell compositions of coronary and aortic atherosclerotic lesions in WHHL rabbits differ. An immunohixtochemical study // Arterioscler. Thromb. 1994. V. 14. P. 931-937.

112. Smith EB, Evans PH, Downham MD. Lipid in the aortic intima. The correlation of morphological and chemical characteristics. //J. Atheroscler. Res. 1967. V. 7. P. 171-186.

113. Smith E.B., Massie LB., Alexander K.M. The release of an immobilized lipoprotein fraction from atherosclerotic lesions by incubation with plasmin // Atherosclerosis. 1976. V. 25. P. 71-84.

114. Smith E.B. The relationship between plasma and tissue lipids in human atherosclerosis // Adv. Lipid. Res.1974. V. 12. P. 1-49

115. Smith J.D., Trogan E., Grinsberg M., et. al. Decreased atherosclerosis in mice deficient in both macrophage colony-stimulating factor (op) and apolipoprotein E //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 8264-8268.

116. Spina M., Garbin G. Age-related chemical changes in human elastins from non-atherosclerotic areas of thoracic aorta// Atherosclerosis. 1976. V. 24. P. 267-275.

117. Srenivasan S.R., Dolan P., Radhakrishnamurthy В., et. al. Lipoprotein acid mucopolysaccharide complexes of human atherosclerotic lesions // Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 388. P. 58-72.

118. Srenivasan S.R., Vijayagopal P., Eberle K., et. al. Low-density lipoprotein binding affinity of arterial wall proteoglycan subtraction // Biochem. Biophys. Acta. 1989. V. 1006. P. 159-166.

119. Srinivasan S.R., Dolan P., Radhakrishnamurthy В., et. al. Isolation of lipoprotein acid mucopolysaccharide complexes from fatty streaks of human aortas // Atherosclerosis. 1972. V. 16. P. 95-104.

120. Srinivasan S.R., Yost C., Radhakrishnamurthy В., et. al. Lipoprotein-elastin interactions in human aorta fibrous plaque lesions // Atherosclerosis. 1981. V. 38. P. 137-47.

121. Steele R.H., Wagner W.D., Rowe H.A., et. al. Aretery wall derived proteoglycan-plasma lipoprotein interaction: lipoprotein binding properties of extracted proteoglycans // Atherosclerosis. 1987. V.65. P. 51-62.

122. Steinberger P., Loughead . // Atheroscl. Thromb. 1992. V. 12. P. 608.

123. Stender S., Hjelms E. In vivo influx of free and esterifed plasma cholesterol into human aortic tissue without atherosclerotic lesions // J. Clin. Invest. 1984. V. 74. P. 1871-1881.

124. Stevens R.L., Colombo M., Gonzales J.J., et. al. The glycosaminoglycans of the human artery and their changes in atherosclerosis // J. Clin. Invest. 1976. Y. 58. P. 470-481

125. Szymanowicz A.G., Bellon G., Laurain-Guillaume G., et. al. An evaluation by sequential extraction of the proportions of collagen types from medium sized arteries // Artery. 1982. V. 10. P. 250-265.

126. Taniguchi Т., Ishikava Y., Tsunemitsu M., et al. Stimulation of cholesteryl ester synthesis in human monocyte-derived macrophages by asialo low density lipoproteins //Arteriosclerosis 1989. V.9. P.767-769.

127. Tertov V.V., Bittolo-Bon G., Sobenin I.A. et al. Naturally occuring modified LDL are similar if not identical: more electronegative and desialylated lipoprotein subfraction // Exp. Mol. Biol. 1995. V.62. P. 166-172.

128. Tertov V.V., Orekhov A.N. Deglycosylation is an atherogenic modification of ApoB-containing lipoproteins //Atherosclerosis. 2000. V. 151. P. 288.

129. Tertov V.V., Orekhov A.N. Metabolism of native and naturally occuring multiple modified low density lipoprotein in smooth muscle cells of human aortic intima // Exp. Mol. Pathol. 1997. V.64. P.127.

130. Tertov V.V., Orekhov A.N., Sobenin I.A. et al. Carbohydrate content of protein and lipid components in sialic acid-rich and -poor low density lipoproteins from subjects with and without coronary artery disease // J. Lipid Res. 1993. V.34. P.365-375.

131. Tertov V.V., Orekhov A.N., Sobenin I.A. et al. Three types of naturally occuring modified lipoproteins induce-intracellular lipid accumulation due to lipoprotein aggregation // Circ. Res. 1992. Y.71. P.218-228.

132. Tertov V.V., Sobenin I.A., Gabbazov Z.A. et al. Multiple-modified desialylated LDL that cause intracellular lipid accumulation. Isolation, fractionation and characterisation//Lab. Investigation. 1992. У.67. P.665-675.

133. Tertov V.V., Sobenin I.A., Orekhov A.N. Similarity between naturally occuring modified desialylated, electronegative and aortic low density lipoprotein // Free Rad. Res. 1996. V.25. P.313-319.

134. Tertov V.V., Orekhov A.N., Martsenyuk O.N., et. al. Low density lipoproteins isolated from the blood of patients with coronary heart disease induce the accumulation of lipids in human aortic cells // Exp. Mol. Pathol. 1989. V. 50. P. 337-348.

135. Tokita K., Kanno K., Ikeda K. Elastin sub-fraction as binding site for lipids // Atherosclerosis. 1977. V. 28. P. 111-119.

136. Toledo O.M.S., Mourao P.A.S. // Artery .1980. V. 6. P. 341-353.

137. Trelstad R.L. Human aorta collagens: evidence for three distinct species // Biochim. Biophys. Res. Comm. 1974. V. 57. P. 717-725.

138. Van der Wal A.C. Atherosclerotic lesions in human. In situ immunophenotypic analysis suggesting an immune mediated response // Lab. Invest. 1989. V 61. P 166.

139. Vassalli P. The pathophysiology of tumor necrosis factor // Ann. Rev. Immunol. 1992. V. 10. P. 411-452.

140. Vedie В., Mayra I., Pech M.A., et al. Fractionation of charge-modified low density lipoproteins by fast protein liquid chromatography // J. Lipid. Res. 1991. V.32. P.1359-1369.

141. Velican D., Velican C. Histochemical study on the glycosamoniglycans (acid mucopolysaccharides) of the human coronary artery // Acta Histochem. Bd. 1977. V. 59. P. 190-200.

142. Vijayagopal P., Srinivasan S.R., Xu J.H., et. al. Lipoprotein-proteoglycan complexes induce continued cholesteryl ester accumulation in foam cells from rabbit atherosclerotic lesions // J. Clin. Invest. 1993. V. 91. P. 1011-1018.

143. Virella G., Munoz J.F., Galbraith G.M., et. al. Activation of human monocyte-derived macrophages by immune complexes containing low-density lipoprotein // Clin. Immunol. Immunopathol. 1995. V. 75. P. 179-89.

144. Volker W., Schmidt A., Buddeke E. Cytochemical changes in a human arterial proteoglycan related to atherosclerosis // Atherosclerosis. 1989. V. 77. P. 117-130.

145. Wagh P.V., Roberts B.I., White H.J., et. al. Changes in the content of human aortic glycoproteins and acid mucopolysaccharides in atherosclerosis // Atherosclerosis. 1973. V. 18. P. 83-91.

146. Wagner S.J.C., Libby P. Human vascular smooth muscle cells: Targent for and source of tumor necrosis factor // J. Immun. 1989. V. 142. P. 100.

147. Walton K.W., Morris C.J. Studies on the passage of plasma proteins across arterial endothelium in relation to atherogenesis // Prog. Biochem. Pharmacol. 1977. V. 13. P. 138-152.

148. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids // J. Biol. Chem. 1959. V. 234. P. 1971-1975.

149. Wessler . "Abnormalities of arterial wall and its metabolism in atherogenesis." Prog. Card. Dis. 1976. V 18. P 341177

150. Wight Т. Cell biology of arterial proteoglycans // Arteriosclerosis. 1989. V. 9. P. 1-20.

151. Williams K.J., Tabas I. The responce-to-retention hypothesis of early atherogenesis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. V. 15. P. 551-561.

152. Yla-Herttuala S., Solakivi Т., Hirvonen J., et. al. Glycosaminoglycans and apolipoproteins В and A-I in human aortas. Chemical and immunological analysis of lesion-free aortas from children and adults // Arteriosclerosis. 1987. V. 7. P. 333-40.