Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина

Мельниченко, Александра Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина"

На правах рукописи

Мельниченко Александра Александровна

АГРЕГАЦИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ. РОЛЬ В НАКОПЛЕНИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ХОЛЕСТЕРИНА

03.00.04 - биохимия 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава»

Научный руководитель: доктор биологических наук Панасенко Олег Михайлович Научный консультант: доктор биологических наук Орехов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна

кандидат биологических наук Деев Анатолий Иванович Ведущая организация: Институт биохимической физики им Н М Эмануэля РАН

Защита диссертации состоится «_»_2006 года в «_» часов на заседании

диссертационного Совета Д208.057.01 при ФГУ «НИИ физико-химической медицины Росздрава» по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ физико-химической медицины Росздрава»

Автореферат разослан «_»_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук

М А. Мурина

¿006/L IfâoT

Актуальность проблемы. В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания - наиболее распространенная причина инвалидности и смертности в России и других индустриально развитых странах Большинство сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов человека Одним из первых проявлений атеросклероза на клеточном уровне принято считать накопление липидов, в частности эфиров холестерина, в интиме артерий [Аничков, 1947, Smith,1974, Houst, 1978; Mahley, 1979, Fowler et al, 1979] Источником липидов, накапливающихся в интиме сосудов, являются циркулирующие в крови липопротеиды низкой плотности (ЛНП) [Alaupovic, 1971; Cookson, 1971] При этом нативные ЛНП не способны накапливаться в культивируемых клетках в значимых количествах, то есть они не атерогенны [Bates et al, 1976; Ross and Harker, 1976; Goldstein et al, 1979]. С другой стороны, многими исследователями [Goldstein et al, 1979, Fogelman et al., 1980; Khoo et al, 1990; Lopes-Virella et al, 1988] было продемонстрировано, что ЛНП, модифицированные различным образом m vitro (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, окисленные, гликозилированные и тд), эффективно захватываются субэндотелиальными и другими клетками-, то есть являются атерогенными Оставалось не ясным, почему модифицированные такими разными способами ЛНП в конечном итоге обладают одним и тем же свойством - повышенным атерогенным потенциалом

Тертов В.В с соавт в 1989 году изучали накопление липидов макрофагами после их инкубации с нативными, гликозилированными или окисленными ЛНП, а также с липопротеидами, модифицированными малоновым диальдегидом или нейраминидазой Удалось показано, что модифицированные любым способом ЛНП образуют ассоциаты, и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства Авторы предположили, что все ЛНП, модифицированные разными способами m vitro, объединяет одно и то же свойство - пониженная устойчивость к агрегации Была выдвинута гипотеза- без модификации ЛНП невозможна их ассоциация (агрегация), без ассоциации ЛНП не проявляют выраженные атерогенные свойства. Впоследствии эта гипотеза была подтверждена многими исследователями, изучающими захват клетками ЛНП, агрегация которых была инициирована in vitro разными способами- вортексирование [Buton et aj., 1999; Llorente-Cortes et al., 2000; Zhang et al, 2000], окисление медью [Hoff et al, 1992], окисление азо-инициатором [Kawabc et al., 1991; Tertov et al, 1998], обработка гипохлоритом [Hazell et al., 1994; Panasenko et al, 1997; Tertov et al., 1998; Панасенко с соавт, 2004], миелопероксидазой [Панасенко с соавт, 2004], фосфолипазой С [Zhang et al, 2000], сфингомиелиназой [Zhang et al, 2000; Marathe et al., 2000], протеазами [Lindstedt and Kovanen, 1995], гликозидазами [Панасенко с соавт , 2006] Тем не менее, в крови больных атеросклерозом так и не удалось обнаружить липопротеиды, аналогичные модифицированным in vitro.

В конце 80-х годов прошлого столетия усилиями группы Орехова А.Н и Тертова В В в крови больных ишемической болезнью сердца были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (цмЛНП), значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам, в частности, они имели пониженное содержание сиаловой кислоты, маннозы и других Сахаров. Примерно в то же время другими исследователями были обнаружены так называемые мелкие, плотные [Shen et al, 1981, La Belle and Krauss, 1990; Avogaro et al., 1991] и электроотрицательные [Avogaro et al, 1988] ЛНП, которые, как выяснилось позже, по сути представляют собой наряду с цмЛНП одну и ту же подфракцию близких по свойствам липопротеидных частиц, подвергшихся множественной модификации in vivo [Тертов, 1999]. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП обладали двум" свойствами:

стимулировали липоидоз на клеточном уровне и проявляли

сИЬйнВёйЧАИАЛДОивЯ!, причем, их БИБЛИОТЕКА. СИ

оэ

4БЛИОТЕКА ,

ЩЯУ-Р

атерогенный потенциал напрямую зависел от устойчивости к ассоциации и увеличивался с ее понижением [ОгекЬоу е1 а1, 1990; ТеПоу е1 а1., 1989-1998]

Однако оставалось не понятным, какие именно изменения должны произойти в частице ЛНП, чтобы она потеряла устойчивость к агрегации7 Каков механизм агрегации9 Как зависит эффективность поглощения клеткой частиц ЛНП от их размера9 Отличается ли клеточный метаболизм агрегатов ЛНП от не агрегированных частиц ЛНП?

Цель работы: изучить устойчивость к ассоциации циркулирующих в крови человека модифицированных ЛНП, выявить физико-химические изменения в ЛНП, благодаря которым липопротеиды приобретают склонность к ассоциации, изучить механизм накопления липидов в клетках, вызванного ассоциатами ЛНП

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить захват и деградацию ассоциатов ЛНП клетками с целью выявления механизма накопления внутриклеточного холестерина

• Исследовать особенности структурной организации склонных к агрегации ЛНП, используя метод спиновых и флуоресцентных меток и зондов, а также панель моноклональных антител к апо-В-100

• Изучить устойчивость ЛНП к ассоциации при изменении их сольватной оболочки и при дегликозйлировании.

Научная новизна работы. Впервые было продемонстрировано, что между степенью ассоциации цмЛНП и их атерогенным потенциалом существует прямая зависимость- чем более склонны к ассоциации цмЛНП, тем большего размера агрегаты они образуют и тем более интенсивное они вызывают накопление холестерина в клетках интимы Изучены процессы захвата и деградации агрегатов цмЛНП клетками интимы Оказалось, что захват агрегатов цмЛНП происходит значительно быстрее, чем их деградация, что и является причиной интенсивного накопления холестерина в клетках Установлено, что агрегаты цмЛНП захватываются клетками путем неспецифического фагоцитоза Использование панели моноклональных антител к апо-В-100 позволило обнаружить локальные изменения в белковой части цмЛНП по сравнению с нативными ЛНП, которые могут явиться причиной снижения их устойчивости к ассоциации. Впервые показано, что нарушение сольватной оболочки цмЛНП приводит к их необратимой агрегации. Липопротеиды, поверхность которых обеднена углеводами в результате ферментативного дегликозилирования (удаление сиаловой кислоты или маннозы, а также целых гликозидных остатков), теряют устойчивость к ассоциации и агрегируют, причем, между размером агрегатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в интимальных клетках существует прямая зависимость

Практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер, тем не менее, полученные результаты могут иметь практическое значение. Так в диссертации показано, что изменение физико-химических свойств частиц ЛНП, которое может происходить в организме под воздействием различных факторов (главным образом, ферментов), снижает их устойчивость к ассоциации, увеличивая тем самым атерогенный потенциал ЛНП. Данный вывод открывает перспективы разработки принципиально новых подходов и средств, направленных на стабилизацию и повышение устойчивости ЛНП к ассоциации с целью профилактики, замедления или предотвращения агрегации ЛНП, а вместе с ней и торможения процессов отложения липидов в сосудистой стенке, а значит и развития ранних стадий атеросклероза.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на. 13-м Международном симпозиуме по атеросклерозу (Киото, 2003), 5-м Международном конгрессе по сердечнососудистым заболеваниям (Флоренция, 2003); 74-м Конгрессе европейского атеросклеротического общества (Севилья, 2004), 3-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), 75-м Конгрессе европейского атеросклеротического общества (Прага, 2005), 12-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ в центральных академических, медицинских и международных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, трех глав с результатами экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 121 стр , содержит 14 таблиц, проиллюстрирована 13-ю рисунками и схемами Библиография включает 171 ссылку на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы рассмотрены современные представления о роли модифицированных разными способами ЛНП в развитии атеросклероза, охарактеризованы циркулирующие в крови человека множественно модифицированные ЛНП, показано, что любая модификация ЛНП т vitro приводит к снижению их устойчивости, увеличивая склонность к ассоциации Увеличенные в размерах ассоциаты ЛНП вызывают интенсивное накопление холестерина в культуре клеток интимы.

2. Экспериментальная часть 2.1. Объекты исследования

Липопротеиды низкой плотности. Суммарную фракцию ЛНП выделяли из плазмы крови человека методом препаративного ультрацентрифугирования в градиенте плотности NaBr на центрифуге L8-55 (ротор 65Ti, Beckman Instuments, Inc , США), как описано в работе [Tertov et al, 1995]. Полученные ЛНП диализовали при 4°С в течение 15 ч против 2000 объемов изотонического фосфатного буфера (ИФБ, pH 7,4) и после этого стерилизовали фильтрацией (диаметр пор фильтра 0,45 мкм). Общую фракцию ЛНП разделяли на нативные и цмЛНП колоночной хроматографией на агглютинине Ricinus communis (РКА120), иммобилизованном на CNBr-активированной агарозе [Tertov et al, 1990]

Культура клеток. Моноциты выделяли из крови здоровых добровольцев и культивировали до их созревания в макрофаги [Adams, 1979]. В экспериментах использовали культуру на 14-й день культивирования

Клетки непораженной интимы выделяли с помощью коллагеназы и эластазы из аорт, взятых асептически спустя 1-4 часа после внезапной смерти людей [Orekhov et al, 1985] Клетки культивировали в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики, при 37°С в атмосфере воздух-СОг (95 5 по объему) Для экспериментов использовали 7-10-дневную первичную культуру клеток.

Инкубация клеток с ЛНП. В день эксперимента культуральную среду заменяли на свежую среду 199, содержащую 10% липопротеид-дефицитную сыворотку крови здоровых доноров, полученную ультрацентрифугированием (d>l,215 г/мл) [Lindgren, 1977], а также по 100 ед/мл

пенициллина и стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 2 мМ L-глутамин, и к ней добавляли исследуемые ЛНП в конечной концентрации 100 мкг/мл по белку Контрольные культуры клеток инкубировали в такой же среде, но без добавления ЛНП. После инкубации в течение 24 часов культуры тщательно отмывали от среды в ИФБ

Приготовление |251-меченых препаратов ЛНП проводили как описано ранее [Bilheimer et al, 1972] Связывание, захват и деградацию |251-меченных ЛНП клетками осуществляли по методике [Tertov et al, 1995].

2.2. Методы исследования

Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускания луча лазерного света длинной волны 780 нм на двухканальном агрегометре (модель LA220, НПФ БИОЛА, Россия) [Gabbasov et al., 1989, Tertov et al., 1989] Метод основан на том, что относительная дисперсия колебаний оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, отражает отклонения от их среднего размера, то есть степень их ассоциации Увеличение флуктуации светопропускания свидетельствует об увеличении взвешенного среднего оптического радиуса частиц Это дает возможность оценить изменения среднего размера частиц ЛНП в условных единицах Данный метод дает качественно схожие результаты с результатами, полученными методом квази-упругого светорассеяния, позволяющего непосредственно определять размер частиц ЛНП [Tertov et al, 1992]

ЭПР-исследования проводили на радиоспектрометре Е-4 (Varían, США) при комнатной температуре в режиме: микроволновая частота 9,1 ГГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1-0,4 мТл, микроволновая мощность 10 мВт, постоянная времени 0,3 с, скорость сканирования 1,25 мТл/мин В качестве спиновых зондов для исследования липидной фазы ЛНП использовали зонд 1, парамагнитный фрагмент которого локализуется на поверхности частиц ЛНП, парамагнитные аналоги стеариновой кислоты с радикальным фрагментом у 5-, 12- и 16-го С-атомов (зонды 2, 3 ч 4 соответственно), а также гидрофобный зонд 5, локализующийся в липидном ядре ЛНП Подвижность и полярность липидов в ЛНП характеризовали временем корреляции вращательной диффузии нитроксильного фрагмента зонда (т), параметром упорядоченности (S) и параметром гидрофобное™ (h) соответственно [Gaffney, 1975, Кузнецов, 1976]

Флуоресцентные измерения были проведены в лаборатории биофизических методов диагностики ФГУ НИИ ФХМ Росздрава (Г Е Добрецов и С К Гуларян) на спектрофлуориметре F-4000 (Hitachi, Япония) в квадратных кварцевых кюветах со стороной 1 см при 20°С О микровязкости липидного ядра ЛНП судили по эксимеризации пирена [Добрецов, 1989] Микровязкость ЛНП на границе липид/вода характеризовали, измеряя анизотропию флуоресценции зонда К-68 [Dobretsov et al, 1989] Подвижность окружения белковых аминогрупп на поверхности частиц ЛНП контролировали с использованием флуоресцентной метки - о-фталевого диальдегида [Enerbach, 1969; Chen et al, 1979] Определение расположения белка относительно липида осуществляли, измеряя перенос энергии с остатков триптофана апо-В-100 на зонд пирен, чокапизующийся в гидрофобном ядре ЛНП [Dobretsov et al, 1982; Добрецов, 1989]

Метод твердофазного иммуноферментного анализа использовали для выявления антигенных различий апо-В-100 нативных и цмЛНП Для этого были использованы 9 моноклональных антител, полученных методом гибридизации [Янушевская с соавт , 1999]

Рис. 1. Зависимость содержания эфиров холестерина в гладкомышечных клетках интимы (1) и макрофагах (2) через 6 часов их инкубации при 37°С в СОг-инкубаторе с нативными ЛНП или цмЛНП от их среднего размера Средний размер нативных ЛНП принят за 1 Изменение среднего размера цмЛНП достигали путем их фильтрации через фильтры с размером пор 0.45, 0,22 и 0,1 мкм Пунктиром указаны интервалы, соответствующие

содержанию эфиров холестерина в клетках, инкубированных без ЛНП

Аналитические методы. Содержание холестерина в клетках определяли при помощи раствора «Monotest» (Boehnnger Mannheim, Германия) после экстракции липидов смесью гексан -изопропанол (3'2 по объему) Раствор содержал 0,2 Ед/мл холестеринэстеразы, 0,1 Ед/мл холестериноксидазы, 0,1 Ед/мл пероксидазы хрена, 1 мМ 4-аминофеназон, 3 мМ фенол и 2 мМ 3,4-дихлорфенол в 50 мМ трис-буфере, pH 7,7. Концентрацию белка в клетках и ЛНП определяли методом Лоури [Lowry et al, 1951] Содержание сиаловой кислоты и нейтральных Сахаров в ЛНП определяли согласно [Warren, 1959] и [Dubois et al., 1956] соответственно. Степень пероксидации липидов ЛНП оценивали по содержанию в них продуктов карбонильной природы, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой [Yagi, 1984]

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью двустороннего f-теста Стьюдента; отличие считали достоверным при р<0,05.

3. Результаты исследования

3.1. Накопление холестерина гладкомышечными клетками аорты человека и макрофагами при инкубации их с агрегированными и не агрегированными ЛНП

3.1.1. Спонтанная ассоциация ЛНП вызывает накопление эфиров холестерина в клетках. Зависимость от размера агрегатов ЛНП

В настоящем разделе мы попытались ответить на вопрос, как спонтанная ассоциация ЛНП влияет на их атерогенносгь, и зависит ли атерогенный потенциал агрегированных ЛНП от размера агрегатов. Для этого из препаратов нативных ЛНП и цмЛНП удаляли образовавшиеся в процессе выделения ЛНП укрупненные частицы путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,1 мкм. Затем препараты инкубировали в течение 6 часов при 37°С в С02-инкубаторе Средний размер нативных ЛНП при этом достоверно не увеличивался, тогда как цмЛНП образовывали более крупные частицы, превышающие средний размер нативных ЛНП в 4,6 раза Для получения частиц цмЛНП с разным средним размером их повторно пропускали через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 или 0,10 мкм Такая процедура приводила к удалению части крупных ассоциатов и снижению среднего размера частиц (3,2, 2,1 и 1,3 отн. ед соответственно) Затем нативные ЛНП, а также

S2 80

<и §

20 -

1 2 3 4 5 Средний размер ЛНП, отн ед

цмЛНП, имеющие разный усредненный размер, добавляли в культуру клеток и инкубировали еще 6 часов, после чего анализировали внутриклеточное содержание эфиров холестерина

Результаты эксперимента приведены на рис 1 Видно, что содержание эфиров холестерина в клетках после их инкубации с ЛНП, размер которых не превышает размера нативных ЛНП, достоверно не увеличивается Увеличение среднего размера частиц ЛНП приводит к росту внутриклеточного холестерина Количество накопившегося в клетках эфиров холестерина напрямую зависит от размера агрегатов ЛНП и линейно возрастает с ростом их усредненного размера Такой эффект наблюдали как в случае инкубации ЛНП с гладкомышечными клетками интимы (рис 1, кривая 1), так и с макрофагами (рис 1, кривая 2)

Таким образом, из полученных данных следует, что нативные ЛНП в условиях культивирования клеток (37°С, СОг-инкубатор) не образуют агрегатов, в то время как цмЛНП ассоциируют в более крупные частицы Удаление агрегатов цмЛНП путем фильтрации препятствует накоплению липидов в гладкомышечных клетках и макрофагах Существует прямая зависимость между размером агрегатов ЛНП и их способностью накапливать холестерин в клетках

3.1.2. Клеточный метаболизм агрегированных и не агрегированных ,251-ЛНП

Можно предположить, что обнаруженное в предыдущем разделе повышенное накопление липидов в клетках является следствием изменения метаболизма ЛНП, вызванного их ассоциацией

Мы изучили, чем отличается клеточный метаболизм ассоциированных ЛНП от метаболизма дисперсных, не агрегированных ЛНП. В частности, как захват и деградация ЛНП гладкомышечными клетками и макрофагами изменяется при ассоциации липопротеидов

Не агрегированные цмЛНП отделяли от агрегатов с помощью гель-фильтрации Из табл 1 видно, что захват и деградация гладкомышечными клетками и макрофагами как нативных, так и не агрегированных цмЛНП происходит примерно в равной степени В случае цмЛНП, содержащих агрегаты наблюдалось увеличение относительной скорости захвата частиц гладкомышечными клетками в 7 раз, а макрофагами - в 6 раз При этом скорость деградации возросла только в 5 и 3,5 раза соответственно Можно предположить, что цмЛНП накапливаются в клетках, благодаря тому, что метаболизм ассоциированных цмЛНП меняется Относительная скорость захвата ассоциированных цмЛНП возрастает в значительно большей степени по сравнению со скоростью их внутриклеточной деградации

Таблица 1. Захват и деградация агрегированных и не агрегированных 1251-ЛНП клетками

Захват ЛНП за 6 час, нмоль/мг Деградация ЛНП за 6 час, нмоль/мг

Препарат ЛНП белка белка

ГМК Макрофаги ГМК Макрофаги

Нативные ЛНП 302125 210+11 217±34 225117

Не агрегированные 356+41 276+29 205+27 198115

цмЛНП

Агрегаты цмЛНП 21371284* 1245+137* 10831172* 735174*

*, достоверное отличие от нативных ЛНП, р<0,05 ГМК - гладкомышечные клетки непораженной интимы аорты человека Нативные ЛНП и цмЛНП (5 мкг белка/мл) выделяли с помощью гель-фильтрации Данные представлены в виде среднего трех определений ± стандартное математическое отклонение.

3.1.3. Изучение механизма захвата агрегатов |251-ЛНП клетками

Возникает вопрос, почему так существенно изменяется скорость захвата цмЛНП в сравнении с нативными ЛНГР Существуют ли различия в механизме захвата нативных ЛНП и цмЛНГР

Известно, что ЛНП захватываются клетками рецептор-опосредовано [Goldstein and Brown. 1977]. Нативные ЛНП попадают в клетку через апоВ,Е-рецептор Модифицированные ЛНП, в частности, ацетилированные - через так называемый скэвенджер-рецептор [Goldstein et al, 1979] Мы исследовали, каким путем агрегаты цмЛНП попадают в клетку Конкурируют ли |251-меченные агрегаты цмЛНП с нативными и ацетилированными ЛНП за места связывания (апоВ,Е-рецептор и скэвенджер-рецептор соответственно)9 Результаты исследований приведены в табл 2

Таблица 2. Влияние различных агентов на захват и деградацию 1251-агрегатов нмЛНП клетками

Добавки Захват, % от контроля Деградация, % от контроля

ГМК Макрофаги ГМК Макрофаги

Нативные ЛНП, 79±7 85+4 86+5 83±8

100 мкг/мл

Ацетилированные 93+6 88±8 92±5 89±7

ЛНП, 100 мкг/мл

Цитохалазин В, 28±2* 19±1* 23±1* 22±2*

10 мкМ

Микросферы латекса, 39+4* 36+5* 24+3* 25±2*

109/мл

Не меченные 32±5* 25±3* 24±2* 19±2*

агрегаты цмЛНП,

100 мкг/мл

*, достоверное отличие от контроля, р<0,05 ГМК - гладкомышечные клетки непораженной интимы аорты человека мцЛНП (5 мкг белка/мл) выделяли с помощью гель-фильтрации. Данные представлены в виде среднего трех определений ± стандартное математическое отклонение

Видно, что добавление 20-ти кратного избытка нативных или ацетилированных ЛНП не оказывает достоверного влияния на захват и деградацию |251-меченных агрегатов цмЛНП Этот факт свидетельствует в пользу того, что захват агрегатов цмЛНП осуществляется ни через апоВ,Е-, ни через скэвенджер-рецепторы.

Мы предположили, что агрегаты цмЛНП попадают в клетку путем неспецифического фагоцитоза Для выяснения данного вопроса мы изучили, влияние цитохалазина В - ингибитора эндоцитоза - на захват цмЛНП клетками Из табл 2 следует, что цитохалазин В снижает скорость захвата и деградации ,251-меченных агрегатов цмЛНП как гладкомышечными клетками, так и макрофагами

Известно, что микросферы латекса захватываются клетками путем неспецифического фагоцитоза fPineto and White, 1977] Если наше предположение о неспецифическом фагоцитозе агрегированных цмЛНП верно, то микросферы, конкурируя за места связывания на поверхности клетки, должны снизить поступление ,251-меченных агрегатов цмЛНП в клетку Нам удалось показать (см табл 2), что при добавлении микросфер латекса (109/мл) в среду инкубации клеток с

цмЛНП относительная скорость захвата |251-меченных цмЛНП и скорость их внутриклеточной деградации снижались соответственно на 60% и 75%

Полученные данные позволяют заключить, что захват агрегатов цмЛНП как гладкомышечными клетками непораженной интимы аорты человека, так и макрофагами происходит, по всей вероятности, путем неспецифического фагоцитоза.

3.2. Изучение особенностей структурной организации склонных к агрегации цмЛНП

В предыдущем разделе было показано, что только цмЛНП, но не нативные ЛНП склонны к агрегации, благодаря чему способны вызывать накопление липидов в клетках Ранее Тертов В В с соавт установили [ТеПоу е1 а1, 1992], что цмЛНП имеют измененный липидный и углеводный состав по сравнению с нативными ЛНП. Вполне вероятно, что такие изменения химического состава влекут за собой изменения в структурной организации поверхности цмЛНП, что и является причиной их повышенной склонности к ассоциации. Для выяснения этого вопроса мы исследовали структуру цмЛНП и нативных ЛНП с помощью спиновых и флуоресцентных зондов и меток, а также используя панель моноклональных антител к различным эпитопам апо-В-100

3.2.1. Исследование структуры нативных ЛНП и цмЛНП с использованием спиновых и флуоресцентных зондов и меток

Для исследования расположения белка на поверхности нативных и склонных к агрегации цмЛНП использовали флуоресцентный зонд - пирен и метку - ортофталевый альдегид Перенос энергии с остатков триптофана апо-В-100 на флуоресцентный зонд пирен, расположенный в липидном ядре частицы ЛНП, характеризует расстояние апо-В-100 от липидного ядра ЛНП [ОоЬгегэоу й а1, 1982] Сползание белка, как это происходит, например, при пероксидации липидов РоЬге150У е1 а!, 1982], может приводить к частичному обнажению гидрофобных участков поверхности ЛНП, в результате чего частицы ЛНП теряют устойчивость к ассоциации и агрегируют

На рис 2 представлены результаты типичного эксперимента По мере добавления пирена к ЛНП начинается перенос энергии с остатков триптофана апо-В-100 на пирен, поэтому интенсивность флуоресценции белка снижается до величины Р Отношение начальной

1 6 -

и.

о и. с

08 -

1 2 -

Рис. 2. Перенос энергии флуоресценции с остатков триптофана апо-В-100 на пирен для нативных ЛНП (А) и цмЛНП (•) ? и Ро -интенсивность флуоресценции остатков триптофана апо-В-100 в присутствии и в отсутствие пирена соответственно

Пирен, мкмоль/мл

флуоресценции (Ро) к конечной (Р) при этом возрастает, и тем сильнее, чем легче идет перенос энергии, то есть, чем ближе располагается белок к липиду Как видно из рис 2, мы не обнаружили достоверной разницы между нативными и цмЛНП в переносе энергии с триптофана на пирен, а значит и в расположении белка относительно липидного ядра, в котором локализован зонд Аналогичные результаты были получены при сравнительном исследовании цмЛНП с нативными ЛНП, изолированными из крови других доноров.

Для изучения молекулярной подвижности апо-В-100 свободные аминогруппы белка были ковалентно помечены флуоресцентной меткой - ортофталевым диальдегидом (ОФА) Степень поляризации флуоресценции метки в ЛНП составляет около 0,15 Погрешность измерений анизотропии поляризованной флуоресценции в экспериментах с ОФА составляла ±0,006 В пределах такой погрешности не было отмечено достоверных различий между нативными ЛНП и цмЛНП Не замечено различий и между ЛНП от разных доноров

Таким образом, как молекулярная подвижность аминогрупп апо-В-100, так и расположение апо-В-100 на поверхности частицы, оказались практически одинаковыми в нативных и цмЛНП

На следующем этапе была исследована структура липидного ядра и поверхностной фосфолипидной части нативных и склонных к агрегации цмЛНП Для этого мы использовали несколько спиновых и флуоресцентных зондов, характеризующих изменения в структуре липидной части ЛНП на различном расстоянии от поверхности частицы У спиновых зондов, находящихся в липидном окружении в липопротеидах, форма спектров ЭПР определяется вращательной диффузией зондов, которая, в свою очередь, напрямую зависит от молекулярной упаковки и подвижности окружающих липидов [Смит, Бутлер, 1979] При встраивании каждого из использованных зондов в липопротеидную частицу его «информативные» парамагнитные группы (нитроксильные группы N-0) оказываются в определенной области, различной для разных зондов Нитроксильная группа зонда 1 располагается на поверхности частицы (см рис 3) Зонды 2, 3 и 4 представляют собой спинмеченую жирную кислоту 5-, 12- и 16-доксилстеариновую кислоту соответственно Их нитроксильные группы оказываются в поверхностном липидном монослое примерно на той же глубине, что и 5-я (в случае зонда 2), 12-я (в случае зонда 3) или 16-я (в случае зонда 4) метиленовая группа ацильной цепи фосфолипида Гидрофобный зонд 5 погружается во внутреннее липидное ядро Таким образом, использование данного набора зондов позволило получать информацию с разной глубины липидного домена липопротеидов

Спиновый зонд 1

Вязкость липидов липидного

нейтральных в глубине ядра

исследовали с помощью флуоресцентного зонда пирена и спинового зонда 5 Схема расположения

флуоресцентных и

спиновых зондов в ЛНП приведена на рис 3

Спиновый зонд 4

Рис. 3. Схема расположения флуоресцентных и спиновых зондов в ЛНП.

Пирен нековалентно связывается с нейтральными липидами и неполярными цепочками фосфолипидов. распределяясь по ним сравнительно равномерно [Dobretsov et al, 1982; Добрецов, 1989] При возбуждении молекулы пирена светом она диффундирует в липиде, сталкивается с невозбужденными молекулами пирена и образует с ними возбужденный димер («эксимер») [Forster, 1960] Чем меньше вязкость липида, тем чаще столкновения, а значит, тем больше образуется эксимеров Контролировать долю образовавшихся эксимеров и оставшихся мономеров можно по их флуоресценции мономеры флуоресцируют при 385 нм, а эксимеры - при 475 нм

В табл 3 показано соотношение F(475)/F(385), полученное двумя способами' если возбуждать флуоресценцию при 310 нм, то можно следить за основной массой пирена Если же возбуждать ее при 286 нм, то в результате переноса энергии с белка на пирен будут флуоресцировать не все молекулы пирена, а преимущественно те, которые расположены в поверхностном слое частицы, ближе к белку

Таблица 3. Степень эксимеризации пирена (обратно пропорциональна вязкости липидной части) в нативных ЛНП и цмЛНП на поверхности частицы (возбуждение при 286 нм) и по всей частице (возбуждение при 310 нм).

Донор ЛНП Флуоресценция F(475)/F(385)

Возбуждение при 310 нм Возбуждение при 286 нм

Донор 1 нативные ЛНП 0,48 0,43

цмЛНП 0,41 0,36

Донор 2 нативные ЛНП 0,45 0,40

цмЛНП 0,46 0,41

Данные табл 3 показывают, однако, что эксимеризация пирена идет примерно одинаково в нативных и цмЛНП Различий между разными донорами не обнаружено Нет и достоверных различий во флуоресценции эксимеров пирена, локализованных в поверхностном слое частицы или по всей частице Спиновый зонд 5 также характеризует микровязкость в липидном ядре, но время его корреляции вращения в нативных и цмЛНП не различается. На основании приведенных выше данных можно сделать вывод о том, что структурная организация липидного ядра в нативных ЛНП и цмЛНП сходна.

Далее мы изучили микровязкость липидной части ЛНП на различном расстоянии от границы раздела фаз фосфолипид/вода, то есть на различном удалении от поверхности частицы липопротеида Для этого были использованы спиновые зонды 1-4, флуоресцентная метка К-68 и флуоресцентный зонд пирен Зонд К-68 имеет гидрофобную алифатическую цепочку из 15 звеньев СНг, погруженную в липид, и положительно заряженный четвертичный азот, который служит якорем для флуоресцентного хромофора, расположенного на поверхности раздела липид/вода Регистрируя поляризованную флуоресценцию К-68 в липидах, можно определять скорость вращательной диффузии хромофора К-68 на поверхности раздела липид/вода, или, другими словами, микровязкость на поверхности фосфолипидного монослоя ЛНП. Поляризацию выражают в виде параметра, называемого анизотропией, который изменяется от 0 при очень быстром вращении зонда до 0,4 в очень вязкой среде, когда зонд практически не вращается Флуоресценция К-68 в ЛНП довольно сильно поляризована (0,19-0,25), и вращение зонда происходит значительно

медленнее, чем, например, в фосфолипидном бислое, где поляризация равна 0,146 [Добрецов, 1989] Тем не менее, как показали результаты эксперимента, степень поляризации флуоресценции зонда К-68 одинакова (в пределах ошибки эксперимента) во всех исследованных ЛНП разных доноров

В табл 4 представлены время корреляции вращений х, параметр упорядоченности Б и параметр гидрофобности Ь, рассчитанные из спектров ЭПР зондов, встроенных в нативные ЛНП и цмЛНП Видно, что среди серии гомологичных зондов 2, 3 и 4 наиболее заторможенное и анизотропное движение парамагнитного фрагмента наблюдается в случае зонда 2, а наиболее быстрое и хаотачное - в случае зонда 4. Это говорит о том, что в поверхностном липидном монослое ЛНП внутримолекулярная подвижность сегментов жирнокислотных цепей, окружающих зонды, возрастает в направлении от 5-ого атома углерода к 16-ому атому углерода, тек концевой СНз-группе Значения параметра гидрофобное™ 11 возрастают, когда свободнорадикальный фрагмент перемещается от С-5 к С-12 и, наконец, в положение С-16 на углеводородной цепи молекулы зонда Следовательно, окружение группы N-0, находящейся в положении С-5 липидного монослоя, наиболее полярно, а по мере увеличения расстояния от поверхности липопротеидной частицы полярность в поверхностном липидном монослое уменьшается. Эти результаты совпадают с данными, полученными ранее для нефракционированных ЛНП [Панасенко с сотр , 1988]

Таблица 4. Время корреляции вращений т, параметр упорядоченности в и параметр гидрофобное™ Ь. измеренные из спектров ЭПР спиновых зондов в нативных ЛНП и цмЛНП

ЛНП т, не в 11 Зонд №

Нативные ЛНП 3,91±0,08 - - ]

цмЛНП 3,84+0,04 - -

Нативные ЛНП - 0,747+0,002 0,30+0,03 2

цмЛНП - 0,746±0,003 0,32+0,01

Нативные ЛНП - 0,679±0,004 0,51 ±0,04 3

цмЛНП - 0,681 ±0,002 0,50±0,03

Нативные ЛНП 2,08±0,03 0,204±0,003 1,91 ±0,03 4

цмЛНП 2,07±0,02 0,202+0,004 1,93±0,02

Нативные ЛНП 2,76+0,02 - -

цмЛНП 2,78+0,06 - - 5

Данные представлены в виде среднего трех определений ± стандартное математаческое отклонение. Температура измерения 22°С.

Что касается сравнения натавных ЛНП и цмЛНП, то не установлено достоверного различия между ними в параметрах Б, т и Ь В табл. 4 приведены данные, полученные для липопротеидов из крови одного донора Такая же картина наблюдалась в случае липопротеидов, выделенных из крови

других доноров (п = 6) Значения параметров S, т или h различались от донора к донору, но для каждого из доноров не было различия в этих параметрах между нативными ЛНП и цмЛНП

Итак, результаты, полученные тремя независимыми методическими подходами, показали, что тепловое движение трех уровней - в глубине частицы, в поверхностном липидном монослое, на границе раздела липид/вода и на поверхности белка апо-В-100 - оказалось примерно одинаковым в нативных ЛНП и цмЛНП Другими словами, мы не обнаружили различий в структуре как липидной, так и белковой составляющей нативных и склонных к агрегации цмЛНП

3.2.2. Исследование структуры нативных ЛНП и цмЛНП методом иммуноферментного анализа

Использованные спиновые и флуоресцентные зонды согласно своим физико-химическим свойствам равномерно распределяются в определенных частях ЛНП (липидная фаза на поверхности частицы, гидрофобное липидное ядро, апо-В-100 на поверхности) Такой методический подход позволяет регистрировать лишь усредненные характеристики свойств соответствующих сравнительно больших участков ЛНП и не дает возможности выявить локальные различия в физико-химических свойствах нативных ЛНП и цмЛНП. На следующем этапе работы мы применили более чувствительный метод иммуноферментного анализа с использованием панели мопоклональных антител к апо-В-100 для исследования возможных локальных изменений в структуре этого белка на поверхности цмЛНП

Было изучено связывание девяти моноклональных антител к апо-В-100 с нативными и цмЛНП По различиям в связывании антител с нативными ЛНП и цмЛНП судили об изменении в поверхности изучаемых липопротеидов, предполагая, что именно эти изменения в структуре поверхности являются причиной дестабилизации частиц цмЛНП, которая вызывает их ассоциацию Па рис 4 представтены данные по связыванию моноклональных антител с нативными и цмЛНП Видно, что 2G8, 5F8, 4С11 (антитела против нативных ЛНП) а также 3G4 (антитело против ЛНП, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА)) в равной степени взаимодействуют с нативными и цмЛНП Это свидетельствует о том, что поверхность нативных ЛНП и цмЛНП имеет общие участки, то есть изменения в структуре поверхности цмЛНП не носят драматический характер

Клоны 2G8 и 2ЕЗ являются антителами к одному и тому же участку апо-В-100 (с 3728 по 4306 аминокислотный остаток) Поскольку мы наблюдали различие в связывании нативных ЛНП и цмЛНП с этими антителами (2ЕЗ лучше связывается с цмЛНП, а 2G8 одинаково связывается с нативными ЛНП и цмЛНП), можно сделать вывод о том, что в этом участке апо-В-100 наряду с одинаковыми фрагментами существуют фрагменты белка, различные у цмЛНП и нативных ЛНП

Антитела клонов 2G1 и 7С2 получены против ЛНП, модифицированных МДА. Оба антитела показали лучшее связывание с цмЛНП по сравнению с нативными ЛНП. Это значит, что цмЛНП и ЛНП, модифицированные МДА, имеют общие участки белка, отличные от нативных ЛНП Антитела клонов ЗС8 и 6Е2, напротив, интенсивнее взаимодействовали с апо-В-100 нативных ЛНП, нежели с цмЛНП.

Видно, что цмЛНП связываются как с антителами против ЛНП, модифицированных МДА, так и с антителами против нативных ЛНП. Следовательно, изменения в структуре поверхности цмЛНП по сравнению с нативными ЛНП имеют место, но в то же время, очевидно, что они носят локальный характер.

1 10 100

0.1 1 ю 100 Концентрация ЛНП, мкг/мл

100

Рис. 4. Взаимодействие нативных ЛНП (-•-) и цмЛНП (-■-) с моноклональными антителами к апо-В-100 человека По горизонтальной оси отложена концентрация белка ЛНП, исходно добавленного в лунку, по вертикальной - оптическая плотность (при 492 нм) продуктов реакции с пероксидазой, пропорциональная количеству связанных с ЛНП моноклональных антител Показаны данные типичного эксперимента с антителами клонов 2ЕЗ, 203, 7С2, ЗС8, 6Е2, 208, 5Р6, 4С11 и 304, результаты которого представлены как среднее трех определений ± стандартное отклонение *, достоверное отличие цмЛНП от нативных ЛНП (р < 0,05)

Таким образом, результаты данного раздела позволяют сделать вывод о том, что в цмЛНП. наряду с установленными ранее [Tertov et al, 1992] изменениями углеводного и липидного состава, происходят нарушения конформации определенных фрагментов апо-В-100 Такая локальная модификация апо-В-100 может явиться причиной повышенной склонности к ассоциации цмЛНП и приобретения ими способности вызывать накопление лгогадов в клеточной культуре

3.3. Изучение агрегации ЛНП при изменении их сольватной оболочки

Частица ЛНП, как любая другая заряженная частица в вводно-солевом растворе окружена сольватной оболочкой, сформированной их противоионов и молекул воды Формирование сольватной оболочки зависит от физико-химических свойств поверхности частицы и является важным фактором, стабилизирующим частицы ЛНП, предохраняя их от столкновения и ассоциации В таком случае тенденция ЛНП к агрегации может быть следствием не только изменения структуры их липидной или белковой части, но и нарушением их сольватной оболочки Это дает основание предполагать, что цмЛНП могут обладать отличной от нативных ЛНП устойчивостью к ассоциации в условиях нарушения сольватной оболочки при изменении ионной силы среды или воздействии полиэтиленгликоля (ПЭГ).

3.3.1. Изучение полиэтиленгликоль-индуцироваиной агрегации ЛНП

Известно, что ПЭГ - синтетический водорастворимый полимер, изменяет физико-химические свойства (структуру) сольватной оболочки природных белок-липидных комплексов, в том числе и ЛНП [Arnold et al., 1987-1989; Ohki and Arnold, 1990], стимулируя их ассоциацию Мы изучили различия в характере ассоциации нативных и цмЛНП при изменении сольватной оболочки под действием ПЭГ Была исследована динамика изменения флуктуации светопропускания суспензии ЛНП при различных концентрациях ПЭГ. На рис. 5 приведены типичные кинетические кривые спонтанной и ПЭГ-индуцированной ассоциации нативных ЛНП и цмЛНП. Видно, что в процессе инкубации при 37°С цмЛНП в отличие от нативных ЛНП ассоциируют. За 6 ч инкубации в присутствии 2% ПЭГ флуктуация светопропускания суспензии цмЛНП (пропорциональна относительному размеру частиц) увеличивалась в 2,5 раза, тогда как для нативных ЛНП она достоверно не изменялась (кривые 2 и 5, рис. 5). С ростом концентрации ПЭГ (до 6%) увеличивалась скорость ассоциации ЛНП. Так флуктуация светопропускания за 6 ч инкубации в случае цмЛНП возрастала в 4,5 раза, тогда как в случае нативных ЛНП - лишь в 3,4 раза (кривые 3 и 6 , рис 5)

Мы задались вопросом, является ли ПЭГ-индуцированная агрегация нативных и цмЛНП обратимым процессом Нативные ЛНП или цмЛНП, предварительно профильтрованные через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм для удаления возможных центров ассоциации инкубировали в присутствии ПЭГ После инкубации ЛНП диализовали с целью освобождения инкубационной среды 01 ПЭГ Если ПЭГ-индуцированная ассоциация ЛНП является обратимой, то удаление ПЭГ должно приводить хотя бы к частичной дезагрегации образовавшихся ассоциатов ЛНП Однако эксперименты показали, что диализ не только не способствовал дезагрегации ЛНП, но и увеличивал их агрегацию Причем, цмЛНП при прочих равных условиях агрегировали интенсивнее нативных ЛНП Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что ЛНП ассоциируют при инкубации с ПЭГ. цмЛНП менее устойчивы к ассоциации в условиях нарушения сольватной оболочки по сравнению с нативными ЛНП, причем процесс ассоциации как нативных, так и цмЛНП носит необратимый характер.

с; в

80 -

40 -

Рис. 5. Кинетические кривые изменения флуктуации

светопропускания суспензии нативных ЛНП (Л 2, 3) и цмЛНП {4, 5, 6) в отсутствие (7, 4) ив присутствии 2% (2, 5) или 6% ПЭГ (3, 6) Концентрация ЛНП 0,2 мг белка/мл, температура инкубации 37°С

2 4

Время инкубации, ч

3.3.2. Агрегация ЛНП при понижении ионной силе

Как указывалось выше, устойчивость дисперсных систем в водных средах во многом определяется наличием сольватной оболочки, стабильность которой, в свою очередь, зависит от ионной силы среды [Зонтаг, Штренге, 1973]. Используя этот факт, мы в данной работе попытались сравнить устойчивость нативных ЛНП и цмЛНП к образованию ассоциатов при понижении ионной силы среды, а также выяснить, является ли этот процесс обратимым

Мы исследовали агрегацию ЛНП при различных значениях ионной силы (от 2 мМ до 160 мМ) Ни нативные ЛНП, ни цмЛНП, находясь в изотонической среде (изотонический фосфатный буфер, рН 7,4), не подвергались заметной ассоциации в течение 6 ч инкубации Однако снижение ионной силы среды приводило к тому, что флуктуация светопропускания, а значит и средний размер частиц начинали возрастать по мере инкубации как нативных ЛНП, так и цмЛНП Причем, при одних и тех же значениях ионной силы среды цмЛНП ассоциировали быстрее нативных Так при ионной силе 1,1 мМ за первый час инкубации размер цмЛНП возрастал в среднем в 1,8 раза, тогда как нативные ЛНП в этих же условиях увеличивались в размере только в 1,4 раза

Итак, снижение ионной силы (нарушение сольватной оболочки) приводит к агрегации липопротеидов, причем цмЛНП обладают повышенной склонностью к образованию ассоциатов по сравнению с нативными ЛНП Для того чтобы выяснить, является ли этот процесс обратимым, нативные ЛНП или цмЛНП, предварительно профильтрованные через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, диализовали в течение 6 или 24 ч при 4°С против дистиллированной воды Затем диализат заменяли свежим изотоническим фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 1 мг/мл ЭДТА, и вновь диализовали в течение 24 ч при 4°С Таким образом, мы сначала уменьшали ионную силу среды, а затем возвращались к исходным параметрам До и после завершения диализа в образцах ЛНП регистрировали флуктуацию светопропускания

В период диализа против дистиллированной воды снижение ионной силы среды инициировало ассоциацию ЛНП Так, через б ч диализа нативные ЛНП и цмЛНП увеличивались в размере в среднем в 2,9 и 3,4 раза соответственно Увеличение ионной силы среды до исходного значения путем диализа против изотонического фосфатного буфера (рН 7,4) не приводило к снижению флуктуации светопропускания, а значит и к уменьшению среднего размера ассоциатов как нативных ЛНП, так и цмЛНП Напротив, флуктуация светопропускания во всех случаях достоверно возрастала Особенно это было заметно для цмЛНП Данный факт указывает на необратимость ассоциации как нативных ЛНП, так и цмЛНП в условиях пониженной ионной силы среды.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что цмЛНП менее устойчивы к ассоциации по сравнению с нативными ЛНП в условиях нарушения их сольватной оболочки путем снижения ионной силы среды или инкубации с ПЭГ, причем процесс ассоциации, по крайней мере, в условиях нашего эксперимента является необратимым.

3.4. Дегликозилирование липопротеидов низкой плотности способствует их ассоциации

Тертов В В с соавт [Tertov et а), 1992, 1996] показали, что цмЛНП характеризуются сниженным содержанием сиаловой кислоты, маннозы и других Сахаров Действительно, потеря различных гликозидных остатков может явиться причиной изменения физико-химических свойств поверхности цмЛНП, обнаруженного нами с использованием моноклональных антител к апо-В-100, равно как и привести к нарушению сольватной оболочки частиц ЛНП, а значит повысить склонность ЛНП к агрегации Для проверки данного предположения мы изменяли углеводный состав ЛНП с помощью гликозидаз и изучали склонность к ассоциации полученных дегликозилированных ЛНП, а также их способность вызывать накопление липидов в клетках

ЛНП были обработаны в течение 2-х часов при 37°С а2-3-сиалидазой из Newcastle Disease virus, специфичной к 2-3 связанной сиаловой кислоте и а2-6-сиалидазой из Arthrobacter ureafaciens, специфичной к 2-6-связи Обработка 2-3-сиалидазой вызывала достоверное снижение сиаловой кислоты в липидной части, а 2-6-сиалидазой - в белковой части ЛНП до уровня, сопоставимого с содержанием сиаловой кислоты в цмЛНП. Был измерен относительный размер частиц ЛНП до и после шести часов инкубации с сиалидазами Средний размер ЛНП, обработанных 2-3-сиалидазой вырос в 8 раз, а обработанных 2-6-сиалидазой - в 6 раз Для сравнения следует упомянуть, что цмЛНП (также имеющие сниженное содержание сиаловой кислоты) после 6 часов инкубации при 37°С были крупнее нативных ЛНП в 10 раз.

Обработка нативных ЛНП маннозидазой из Jack bean приводила к 30% снижению содержания маннозы в ЛНП. Деманнозилированные ЛНП, как и десиалированные проявляли повышенную склонность к агрегации. Образованные ими ЛНП были крупнее нативных ЛНП в среднем в 9 раз.

Далее мы исследовали влияние удаления целых N-связанных цепей апобелков липопротеидов на их способность вызывать отложение внутриклеточного холестерина В экспериментах были использованы три фермента: эндогликозидаза F], эндогликозидаза F2 и пептид-N-гликаназа F Обработка нативных ЛНП эндогликозидазой Ff, гидролизующей pi-4 связь между двумя N-ацетилглюкозаминами преимущественно полиманнозных аспарагин-связанных цепей, приводила к удалению 57% суммарных углеводов в ЛНП и 58% маннозы Эндогликозидаза F2, гидролизующая предпочтительно биантенные углеводные цепи комплексного типа, удаляла из

ЛНП 55% суммарных углеводов и 46% сиаповой кислоты Псптид-Ы-гликанача Р, гидролизующая связь аспарагина с Ы-ацетилглюкозамином, удаляла большую часть нейтральных Сахаров, в том числе и маннозы Этот фермент, снижал содержание сиаловой кислоты в ЛНП на 54%, маннозы -на 45%, а общее содержание углеводов снизилось на 55% Относительный размер частиц ЛНП, обработанных эндогликозидазой Р1 и пептид-Ы-гликаназой Р, увеличился в 9 раз, а ЛНП, обработанных эндогликозидазой ¥2 - в 8 раз.

Нами было изучено, в какой степени дегликозилирование ЛНП влияет на их способность вызывать накопление липидов в клетках. Агрегаты дегликозилированных различным образом ЛНП инкубировали с клетками, выделенными из интимы аорты человека, после чего измеряли накопление внутриклеточного холестерина На рис 6 видно, что нативные ЛНП (1) не вызывают накопления липидов, в то время как цмЛНП (2) и дегликозилированные ЛНП (3-7) проявляют атерогенные свойства. Причем существует прямая зависимость между атерогенностью липопротеидов (способностью накапливать холестерин в клетках) и их средним размером (г = 0,93, р<0,05).

Рис. 6. Зависимость содержания внутриклеточонго холестерина после инкубации гладкомышечных клеток с нативными ЛНП (/), цмЛНП (2), ЛНП, обработанными а2-3-сиалидазой (3), маннозидазой (4), эндогликозидазой Р1 (5), эндогликозидазой Р2 (б) или пептид-Ы-гликаназой Р (7) от размера частиц липопротеидов Средний размер нативных ЛНП принят за 1 Содержание холестерина в клетках,

инкубированных в отсутствие ЛНП составило 20,7±1,8 мкг/мг белка

Таким образом, липопротеиды, поверхность которых обеднена углеводами т vitro (удаление как сиаловой кислоты и маннозы, так и целых гликозидных остатков), теряют устойчивость к ассоциации и агрегируют подобно циркулирующим в крови множественно модифицированным ЛНП Образующиеся агрегаты крупнее нативных частиц в 6-9 раз Между размером агрегатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в клетках существует прямая зависимость

4. Заключение

Суммируя полученные в работе данные, можно заключить, что снижение устойчивости модифицированных ЛНП к ассоциации и образование агрегатов ЛНП является если не

обязательным, то, по крайней мере, важным звеном в приобретении ЛНП атерогенных свойств, то есть способности накапливать в клетках интимы холестерин Атерогенность ассоциатов ЛНП напрямую зависит от степени их агрегации и возрастает с увеличением среднего размера частиц ЛНП Причина снижения устойчивости ЛНП к ассоциации кроется в локальных нарушениях топографии апо-В-100 на поверхности частиц ЛНП В свою очередь, это приводит к нарушению сольватной оболочки, окружающей заряженную частицу ЛНП и выполняющую роль ее стабилизатора Одна из вероятных модификаций ЛНП т vivo - дегликозилирование углеводных остатков апо-В-100 и/или гликолипидов. Захват агрегатов ЛНП клеткой происходит путем неспецифического фагоцитоза, причем, скорость захвата достоверно превосходит скорость деградации, что и приводит к накоплению холестерина в клетках, перерождению их в пенистые клетки и способствует развитию ранних стадий атеросклероза

Выводы:

1 Нативные ЛНП в период инкубации при 37°С в С02-инкубаторе не образуют агрегатов, в то время как цмЛНП в аналогичных условиях ассоциируют в более крупные частицы Удаление агрегатов цмЛНП путем фильтрации препятствует накоплению липидов в гладкомышечных клетках или макрофагах. Способность клеток накапливать холестерин зависит от степени агрегации цмЛНП и возрастает с увеличением среднего размера частиц цмЛНП

2 Установлено, что относительная скорость захвата и внутриклеточной деградации агрегатов цмЛНП гладкомышечными клетками непораженной интимы аорты человека или макрофагами возрастает по сравнению с захватом и деградацией не агрегированных ЛНП Однако скорость захвата достоверно превосходит скорость деградации, что приводит к накоплению холестерина в клетках Полученные данные позволяют заключить, что захват агрегатов цмЛНП клетками происходит путем неспецифического фагоцитоза.

3 Использование спиновых и флуоресцентных зондов и меток, дающих усредненные характеристики частиц ЛНП, не позволило выявить достоверных различий в физико-химических свойствах нативных ЛНП и цмЛНП.

4 Связывание моноклональных антител к апо-В-100 с поверхностью частиц липопротеидов показало существование локальных различий в расположении отдельных фрагментов апо-В-100 на поверхности цмЛНП в сравнении с нативными ЛНП.

5 Циркулирующие модифицированные ЛНП менее устойчивы к ассоциации по сравнению с нативными ЛНП в условиях нарушения их сольватной оболочки путем снижения ионной силы среды или инкубации с полиэтиленгликолем, причем процесс ассоциации является необратимым.

6 Липопротеиды, поверхность которых обеднена углеводами в результате ферментативного дегликозилирования (удаление как сиаловой кислоты или маннозы, так и целых гликозидных остатков), теряют устойчивость к ассоциации и агрегируют. Между размером агрегатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в интимальных клетках существует прямая зависимость.

Список публикаций по теме диссертации

1 Panasenko О.М , Suprun 1 V , Melnitshenko A.A., Sobenin I А , Orekhov A.N Identification of antigenic diversity of apo-B native and naturally occurring modified low density lipoproteins. 5'h International Congress on Coronary Artery Disease, Florence, Italy, October, 19-22,2003. Abstract. 62

2. Melnichenko A , Aksenov D , Sobenin 1, Panasenko О , Orekhov A. Different types of enzymatic modification cause aggregation of low density lipoprotein and intracellular cholesterol accumulation. 74th Congress of European Atherosclerosis Society, Seville, Spam, April 17-20, 2004 Atherosclerosis, 2004, 5, 76-77

3 Аксенов Д В , Мельниченко A A , Собенин И A , Панасенко О М , Орехов А Н Ферментативно модифицированные липопротеиды низкой плотности: протеиназы и фосфолипазы 3-й Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 9-12 ноября 2004 г Тезисы докладов, 133

4 Мельниченко А А , Тертов В В , Собенин И А , Орехов А Н Роль агрегации липопротеидов низкой плотности в индуцировании атерогенеза на клеточном уровне 3-й Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 9-12 ноября 2004 г Тезисы докладов, 140.

5 Панасенко О М., Мельниченко А А , Аксенов Д В , Вахрушева Т.В., Супрун И.В., Янушевская Е В , Власик Т.Н., Собенин И А , Орехов А Н Миелопероксидаза, модифицируя поверхность и снижая устойчивость к ассоциации липопротеинов низкой плотности крови человека, повышает их атерогенный потенциал. Биологические мембраны, 2004,21, 498-505.

6. Супрун И В., Мельниченко А А , Янушевская Е.В , Власик Т Н , Собенин И А , Панасенко О.М , Орехов А Н Выявление антигенных различий апо-В нативных и циркулирующих модифицированных ЛПНП Бюлл эксперим 6иол мед , 2004,138, 50-53

7 Панасенко О М , Супрун И В , Мельниченко А А , Собенин И А , Орехов А Н Циркулирующие модифицированные ЛПНП крови человека склонны к ассоциации в условиях пониженной ионной силы Бюлл эксперим биол мед , 2004,138, 280-283.

8 Супрун И.В., Мельниченко А А , Собенин И А , Панасенко О.М., Орехов А Н. Сравнение устойчивости к ассоциации нативных и циркулирующих модифицированных ЛПНП крови человека .Бюлл эксперим биол мед., 2004, 138, 428-431.

9 Aksenov D, Melnichenko А , Suprun I, Sobenin I, Panasenko O., Orekhov A. ApoB-100 antigen structure of naturally occurring modified and enzymatically modified low density lipoprotein 75'h Congress of the European Atherosclerosis Society, Prague, Czech Republic, April 23-26, 2005. Atherosclerosis, 2005, 6, 61-62

10 Melnichenko A., Aksenov D, Sobenin I, Panasenko О , Orekhov A. Low density lipoprotein enzymatic modification results in its aggregation and intracellular cholesterol deposition 75'h Congress of the European Atherosclerosis Society, Prague, Czech Republic, April 23-26, 2005. Atherosclerosis, 2005,6,71.

11. Мельниченко A A , Супрун И В , Собенин И А , Орехов А.Н Сравнение устойчивости к ассоциации нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности крови человека при изменении их гидратной оболочки XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 18-22 апреля 2005 Тезисы докладов, 682-683.

] 2 Аксенов Д В , Мельниченко А А , Супрун И В , Собенин И,А , Панасенко О М , Орехов А Н Изучение антигенной структуры апо-В-100 белка циркулирующих модифицированных и ферментативно-модифицированных липопротеидов низкой плотности XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 18-22 апреля 2005 Тезисы докладов, 730-731

13 Мельниченко А А , Тертов В В., Иванова О.А , Аксенов Д В , Собенин И А , Попов Е В , Каплун В В , Супрун И В , Панасенко О М , Орехов А Н Десиалирование снижает устойчивость апо-В-содержащих липопротеидов к ассоциации, повышая их атерогенный потенциал Бюлл эксперим биол мед , 2005,140, 60-64.

14. Аксенов Д.В., Мельниченко А.А., Супрун И.В., Янушевская Е.В., Власик Т Н., Собенин И А , Панасенко О М., Орехов А.Н Гидролиз фосфолипидов фосфолипазами А2 и С нарушает конформацию аполипопротеина В-100 на поверхности липопротеидов низкой плотности, снижая их устойчивость к ассоциации. Бюлл эксперим биол мед., 2005.140, 418-422

15 Панасенко О М , Аксенов Д В , Мельниченко А.А , Супрун И В , Янушевская Е В , Власик Т Н . Собенин И А, Орехов АН Протеолиз апопротеида В-100 нарушает его топографию на поверхности ЛПНП, снижая их устойчивость к ассоциации Бюлл эксперим биол мед , 2005, 140, 530-534.

16 Вахрушева Т В , Панасенко О М , Мельниченко А А , Орехов А Н Сравнительное исследование липидной фазы в нативных и циркулирующих множественно модифицированных липопротеинах низкой плотности крови человека методом спиновых зондов Биофизика, 2005, 50, 652-659.

17. Панасенко О М , Тертов В.В., Мельниченко А А., Аксенов Д В , Собенин И.А , Каплун В В , Супрун И.В., Орехов А.Н. Связь размера дегликозилированных различными ферментами апо-В-содержащих липопротеидов с их атерогенным потенциалом. Биологические мембраны, 2006, 23, 43-52.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мельниченко, Александра Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

• 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль модифицированных ЛНП в развитии атеросклероза

1.2. Модифицированные ЛНП, циркулирующие в крови человека

1.3. Усиление атерогенности модифицированных in vitro ЛНП в 18 результате их ассоциации

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Выделение липопротеидов из плазмы крови человека

2.1.2. Получение нативных и циркулирующих 26 щ модифицированных липопротеидов из плазмы крови человека

2.1.3. Выделение белых клеток крови человека

2.1.4. Выделение и культивирование клеток интимы аорты 28 человека

2.1.5. Культура макрофагов человека

2.1.6. Инкубация клеток с ЛНП

2.2. Методы исследования

2.2.1. Определение содержания внутриклеточного холестерина

2.2.2. Определение клеточного белка

2.2.3. Определение содержания белка в ЛНП

2.2.4. Определение относительного размера ЛНП (метод флуктуации светопропускания)

2.2.5. Приготовление I-меченых препаратов липопротеидов

2.2.6. Инкубация клеток с 1251-меченными ЛНП в 33 экспериментах по изучению их связывания, захвата и деградации

2.2.7. Исследование деградации I-меченных ЛНП 34 культурами клеток

2.2.8. Исследование ЛНП методом спиновых зондов

2.2.9. Исследование ЛНП методом флуоресцентных зондов и меток

2.2.10. Определение продуктов пероксидации липидов в ЛНП

2.2.11. Определение содержания сиаловой кислоты в ЛНП

2.2.12. Определение содержания углеводов в ЛНП

2.2.13. Метод твердофазного иммуноферментного анализа

2.2.14. Статистическая обработка данных 44 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Накопление холестерина гладкомышечными клетками аорты 45 Ф человека и макрофагами при инкубации их с агрегированными и не агрегированными ЛНП

3.1.1. Спонтанная ассоциация ЛНП вызывает накопление 45 эфиров холестерина в гладкомышечных клетках и макрофагах. Зависимость от размера агрегатов ЛНП

3.1.2. Клеточный метаболизм агрегированных и не 47 агрегированных 1251-ЛНП

3.1.3. Изучение механизма захвата агрегатов 1-ЛНП

3.2. Изучение особенностей структурной организации склонных к 51 агрегации циркулирующих множественно модифицированных

• ЛНП

3.2.1. Исследование структуры нативных и цмЛНП с 52 использованием спиновых и флуоресцентных зондов и меток

3.2.2. Исследование структуры нативных и цмЛНП методом 62 иммуноферментного анализа

3.3. Изучение агрегации ЛНП при изменении их сольватной оболочки

3.3.1. Изучение полиэтиленгликоль-индуцированной агрегации

3.3.2. Агрегация ЛНП при понижении ионной силы

3.4. Дегликозилирование ЛНП способствует их ассоциации

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина"

В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания - наиболее распространенная причина инвалидности и смертности в России и других индустриально развитых странах. Большинство сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов человека. Одним из первых проявлений атеросклероза на клеточном уровне принято считать накопление липидов, в частности эфиров холестерина, в интиме артерий [Аничков, 1947; Smith, 1974; Houst, 1978; Mahley, 1979; Fowler et al., 1979]. Источником липидов, накапливающихся в интиме сосудов, являются циркулирующие в крови липопротеиды низкой плотности (ЛНП) [Alaupovic, 1971; Cookson, 1971]. При этом нативные ЛНП, не накапливаются в культивируемых клетках в значимых количествах, то есть они не атерогенны [Bates et al., 1976; Ross, Harker, 1976; Goldstein et al., 1979]. С другой стороны, многими исследователями [Goldstein et al., 1979; Fogelman et al., 1980; Khoo et al., 1990; Lopes-Virella et al., 1988] было продемонстрировано, что ЛНП, модифицированные различным образом in vitro (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, окисленные, гликозилированные и т.д.), эффективно захватываются субэндотелиальными и другими клетками, то есть являются атерогенными. Оставалось не ясным, почему модифицированные такими разными способами ЛНП в конечном итоге обладают одним и тем же свойством - повышенным атерогенным потенциалом.

Тертов В.В. с соавт. в 1989 году изучали накопление липидов макрофагами после их инкубации с нативными, гликозилированными или окисленными ЛНП, а также с липопротеидами, модифицированными малоновым диальдегидом или нейраминидазой. Удалось показано, что модифицированные любым способом ЛНП образуют ассоциаты, и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства. Авторы предположили, что все ЛНП, модифицированные разными способами in vitro, объединяет одно и то же свойство - пониженная устойчивость к агрегации. Была выдвинута гипотеза: без модификации ЛНП невозможна их ассоциация (агрегация), без ассоциации ЛНП не проявляют выраженные атерогенные свойства. Впоследствии эта гипотеза была подтверждена многими исследователями, изучающими захват клетками ЛНП, агрегация которых была инициирована in vitro разными способами: вортексирование (интенсивное встряхивание) [Buton et al., 1999; Llorente-Cortes et al., 2000; Zhang et al., 2000], окисление медью [Hoff et al., 1992], окисление азо-инициатором [Kawabe et al., 1991; Tertov et al., 1998], обработка гипохлоритом [Hazell et al., 1994; Tertov et al., 1998; Панасенко с соавт., 2004], миелопероксидазой [Панасенко с соавт., 2004], фосфолипазой С [Zhang et al., 2000], сфингомиелиназой [Zhang et al., 2000; Marathe et al., 2000], протеазами [Lindstedt and Kovanen, 1995], гликозидазами [Панасенко с соавт., 2006]. Тем не менее, в крови больных атеросклерозом так и не удалось обнаружить липопротеиды, аналогичные модифицированным in vitro.

В конце 80-х годов прошлого столетия усилиями группы А.Н. Орехова и В.В. Тертова в крови больных ишемической болезнью сердца были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (цмЛНП) [Orekhov et al., 1989; Tertov et al., 1990], значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам, в частности, они имели пониженное содержание сиаловой кислоты, маннозы и других Сахаров. Примерно в то же время другими исследователями были обнаружены так называемые мелкие, плотные [Shen et al., 1981; La Belle and Krauss, 1990; Avogaro et al., 1991] и электроотрицательные [Avogaro et al., 1988] ЛНП, которые, как выяснилось позже, по сути представляют собой наряду с цмЛНП одну и ту же подфракцию близких по свойствам липопротеидных частиц, подвергшихся множественной модификации in vivo [Тертов, 1999]. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП обладали двумя общими свойствами: стимулировали липоидоз на клеточном уровне и проявляли склонность к ассоциации, причем, их атерогенный потенциал напрямую зависел от устойчивости к ассоциации и увеличивался с ее понижением [Orekhov et al., 1990; Tertov et al., 19891998].

Однако оставалось не понятным, какие именно изменения должны произойти в частице ЛНП, чтобы она потеряла устойчивость к агрегации? Каков механизм агрегации? Как зависит эффективность поглощения клеткой частиц ЛНП от их размера? Отличается ли клеточный метаболизм агрегатов ЛНП от не агрегированных частиц ЛНП?

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение устойчивости к ассоциации циркулирующих в крови человека модифицированных ЛНП, поиск физико-химических изменений в ЛНП, благодаря которым липопротеиды приобретают склонность к ассоциации, изучение механизма накопления липидов в клетках, вызванного ассоциатами ЛНП.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить захват и деградацию ассоциатов ЛНП клетками с целью выявления механизма накопления внутриклеточного холестерина.

2. Изучить особенности структурной организации склонных к агрегации ЛНП, используя метод спиновых и флуоресцентных меток и зондов, а также панель моноклональных антител к апо-В-100.

3. Изучить устойчивость ЛНП к ассоциации при изменении сольватной оболочки и при дегликозилировании.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения является внутриклеточное и внеклеточное отложение липидов, преимущественно эфиров холестерина, в интиме сосудов [Аничков, 1947; Smith, 1974; Houst, 1978; Mahley, 1979; Fowler et al., 1979]. Образование наполненных липидными включениями пенистых клеток является инициирующим моментом патогенеза атеросклероза, однако, механизмы накопления внутриклеточных липидов изучены недостаточно.

Было установлено, что источником липидов, накапливающихся в клетках сосудов, являются ЛНП, циркулирующие в крови человека [Bates et al., 1976; Ross, Harker, 1976; Wissler et al., 1976; Chen et al, 1977; Goldstein et al., 1979]. Частица ЛНП состоит из гидрофобного ядра, которое покрыто оболочкой из фосфолипидов, холестерина и одной молекулы апо-В-100. Каждая частица ЛНП содержит примерно 1600 молекул этерифицированного холестерина, 700 молекул фосфолипидов, 600 молекул неэтерифицированного холестерина и 170 молекул триглицеридов [Esterbauer et al., 1992]. Фосфолипиды представлены главным образом фосфатидилхолином (500 молекул) и сфингомиелином (200 молекул). Установлено, что апо-В-100 связывается в основном с молекулами фосфатидилхолина [Lund-Katz and Phillips., 1986; Sommer et al.,1992; Murphy et al.,1997], в то время как холестерин в большей степени связывается со сфингомиелином [Lund-Katz et al.,1988; Mattjus et al., 1996].

Было показано, что инкубация нативных ЛНП с различными типами клеток не приводит к накоплению липидов [Fogelman et al., 1981; Brown et al., 1983; Haberland et al., 1987,1988]. Причиной служит то, что они попадают в клетку через специфические ЛНП-рецепторы, которые обладают механизмом отрицательной обратной связи [Goldstein and Brown, 1977]. Это дает возможность клетке регулировать ее внутриклеточное содержание холестерина. При обследовании больных с семейной гиперхолестеринемией, при которой наблюдается частичное или полное отсутствие специфических ЛНП-рецепторов, было показано, что липопротеиды низкой плотности все же попадают в клетки и накапливаются, образуя пенистые клетки. В поиске альтернативных рецепторов Браун и Гольдштейн [Goldstein et al., 1979] обнаружили рецептор для ацетилированных ЛНП или скэвенджер-рецептор, через который осуществляется неконтролируемый захват ЛНП клетками. Позднее было показано, что ацетил-ЛНП-рецептор - один из многих так называемых скэвенджер-рецепторов, присутствующих у макрофагов и других типов клеток [Krieger et al., 1993]. Скэвенджер-рецепторы к ацетилированным ЛНП подразделяются на А1 и А2 [Kodama et al., 1990]. Известно также, что другие рецепторы, такие как CD68, CD36, SR-B1 и LOX-1, проявляют те же свойства, что и скэвенджер-рецепторы [Krieger., 1997].

Семейная гиперхолестеринемия - достаточно редкое заболевание. В гомозиготной форме им болеет 1 человек на миллион, в гетерозиготной - 1 человек на 300 тысяч. Атеросклероз же наблюдается у каждого мужчины после сорока лет и у большинства женщин после наступления менопаузы. Следовательно, накопление липидов в интиме сосудов нельзя объяснить наличием скэвенджер-рецепторов, так как нативные ЛНП попадают в клетку через специфические апоВ,Е-рецепторы, а не через скэвенджер-рецепторы [Fogelman et al., 1981; Brown et al., 1983; Haberland et al., 1987,1988]. Была выдвинута гипотеза о необходимости изменений свойств ЛНП в результате некой химической модификации, обязательной для того, чтобы произошло накопление липидов в клетках.

В интиме артерий и кровеносном русле существуют протеолитические и липолитические ферменты, способные модифицировать ЛНП. Во внеклеточном пространстве интимы были обнаружены химаза и триптаза, две нейтральные протеазы, секретируемые тучными клетками [Kaartinen et al., 1994], металлопротеиназы, секретируемые макрофагами и гладкомышечными клетками [Galis et al., 1994], плазмин [Grainger et al., 1994], тромбин [Smith et al., 1996] и лизосомальные протеазы [Lojda et al., 1984; Sukhova et al., 1998]. Химаза тучных клеток крысы может гидролизовать белковую часть ЛНП [Kokkonen et al., 1986; 1989], лизосомальные протеазы макрофагов разрушают апо-В-100 при кислых значениях рН [Leake et al., 1990]. Плазмин, калликреин, тромбин [Piha et al., 1995] и другие металопротеиназы также способны модифицировать апобелок ЛНП.

Во внеклеточном матриксе интимы присутствуют фосфолипаза А2 [Menschikowski et al., 1995; Hurt-Camejo et al., 1997; Romano et al., 1998] и сфингомиелиназа [Schissel et al., 1996; Marathe et al., 1999]. Фосфолипаза A2 гидролизует фосфатидилхолин ЛНП [Sartipy et al., 1996]. Сфингомиелиназа при кислых значениях рН гидролизует молекулы сфингомиелина, особенно после гидролиза ЛНП в нейтральной среде фосфолипазой А2 [Schissel et al., 1998].

В интиме была обнаружена рН-зависимая холестеринэстераза [Shamir et al., 1996; Li et al., 1998], которая способна гидролизовать лизофосфолипиды в окисленных ЛНП, а также в присутствии холата, эфиры холестерина. Наконец, макрофаги и пенистые клетки в стенке сосуда синтезируют лизосомальную кислую липазу [Davis et al., 1985]. Активен ли этот фермент во внеклеточном пространстве - неизвестно.

В интиме аорты есть ферменты, способные к окислению липопротеидов: 15-липоксигеназа [Yla-Herttuala et al., 1990], миелопероксидаза [Daugherty et al., 1994], гемоксигеназа-l [Wang et al., 1998]. Также в интиме находятся NO-синтаза [Luoma et al., 1998] и НАДФН-оксидаза [Azumi et al., 1999], которые продуцируют весьма реакционные соединения, способные окислять ЛНП. Области атеросклеротического поражения содержат также церулоплазмин [Swain et al., 1995] и ионы металлов переменной валентности [Swainet al., 1995; Smith et al., 1992; Evans et al., 1995; Lamb et al., 1995.], которые способны усугублять окисление ЛНП.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мельниченко, Александра Александровна

выводы

1. Нативные ЛНП в период инкубации при 37°С в С02-инкубаторе не образуют агрегатов, в то время как цмЛНП в аналогичных условиях ассоциируют в более крупные частицы. Удаление агрегатов цмЛНП путем фильтрации препятствует накоплению липидов в гладкомышечных клетках или макрофагах. Способность клеток накапливать холестерин зависит от степени агрегации цмЛНП и возрастает с увеличением среднего размера частиц цмЛНП.

2. Установлено, что относительная скорость захвата и внутриклеточной деградации агрегатов цмЛНП гладкомышечными клетками непораженной интимы аорты человека или макрофагами возрастает по сравнению с захватом и деградацией не агрегированных ЛНП. Однако скорость захвата достоверно превосходит скорость деградации, что приводит к накоплению холестерина в клетках. Полученные данные позволяют заключить, что захват агрегатов цмЛНП клетками происходит путем неспецифического фагоцитоза.

3. Использование спиновых и флуоресцентных зондов и меток, дающих усредненные характеристики частиц ЛНП, не позволило выявить достоверных различий в физико-химических свойствах нативных ЛНП и цмЛНП.

4. Связывание моноклональных антител к апо-В-100 с поверхностью частиц липопротеидов показало существование локальных различий в расположении отдельных фрагментов апо-В-100 на поверхности цмЛНП в сравнении с нативными ЛНП.

5. Циркулирующие модифицированные ЛНП менее устойчивы к ассоциации по сравнению с нативными ЛНП в условиях нарушения их сольватной оболочки путем снижения ионной силы среды или инкубации с полиэтиленгликолем, причем процесс ассоциации является необратимым.

6. Липопротеиды, поверхность которых обеднена углеводами в результате ферментативного дегликозилирования (удаление как сиаловой кислоты или маннозы, так и целых гликозидных остатков), теряют устойчивость к ассоциации и агрегируют. Между размером агрегатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в интимальных клетках существует прямая зависимость.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мельниченко, Александра Александровна, Москва

1. Аничков Н.Н. Частная патологическая анатомия. Выпуск II. Сердце и сосуды. Второе издание. Москва-Ленинград, Медгиз, 1947.

2. Гриффит О., Джост П. Метод спиновых меток. Теория и применение. Ред. Л. Берлинер. М.: Мир, 1979. С. 489-569.

3. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. Москва: Наука, 1989.

4. Зонтаг Г., Штренге К. Коагуляция и устойчивость дисперстных систем. Л., Химия, 1973. 451с.

5. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. Изд-во «Питер», Санкт-Петербург. 1995.

6. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976.

7. Курек Н.К., Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е., Тур И.Н., Афанасиади Л.Ш. 4-5-(фенилоксазолил-2)-1-пентадецил.пиридиний флуоресцентный зонд для определения площади поверхности мембран и липопротеинов. Биологические мембраны, 1989, 6, 725-732.

8. Панасенко О.М., Борин М.Л., Азизова О.А., Арнольд К. Определение поверхностного заряда липопротеидов и его изменения при перекисном окислении липидов. Биофизика, 1985, 30, 822-827.

9. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Биол. Мембраны, 1988,5, 1186-1191.

10. Смит Я., Бутлер К. Метод спиновых меток. Теория и применение Ред. Л. Берлинер. М.: Мир, 1979. С. 444-488.

11. Тертов В.В. Множественно-модифицированные липопротеиды низкой плотности, циркулирующие в крови человека Ангиология и сосудистая хирургия, 1999, 5, 218-236.

12. Томпсон Г. Р. Руководство по гиперлипидемии. Изд-во Gorenjski Tisk, Югославия. 1992.

13. Янушевская Е.В., Валентинова Н.В., Медведева Н.В., Морозкин А.Д., Власик Т.Н. Иммунохимическая гетерогенность липопротеинов низкой плотности человека. Ангиология и сосудистая хирургия, 1999, 5 (приложение), 241-251.

14. Aggerbeck L.P., Kezdy F.J. and Scanu A.M. Enzymatic probes of lipoprotein structure. Hydrolysis of human serum low density lipoprotein-2 by phospholipase A2. J. Biol. Chem, 1976, 251, 3823-3830.

15. Alaupovic P. Apoliproproteins and lipoproteins.Atherosclerosis, 1971, 13(2), 141-6.

16. Arnold K., Arnhold J., Zschornig O., Wiegel D., Krumbiegel M. Characterization of chemical modifications of surface properties of low density lipoproteins. Biomed. Biochim. Acta, 1989, 48, 735-742.

17. Arnold K., Herrmann A., Gawrisch K., Pratsch L. In: Molecular Mechanisms of Membrane Fusion. New York. 1987, 118-137.

18. Arnold K., Zschornig O. Aggregation of human plasma low density lipoproteins by means of poly(ethylene glycol).Biomed. Biochim. Acta, 1988,47, 949-954.

19. Avogaro P., Bon G.B. and Cazzolato G. Presence of a modified low density lipoprotein in humans. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 1988, 8, 79.

20. Avogaro P., Cazzolato G. and Bittolo-Bon G. Some questions concerning a small, more electronegative LDL circulating in human plasma. Atherosclerosis, 1991,91(1-2), 163-71.

21. Azumi H.N., Takeshita I.S., Rikitake Y., Kawashima S., Hayashi Y., Itoh H. and Yokoyama M. Expression of NADH/NADPH oxidase p22phox in human coronary arteries. Circulation, 1999, 100, 1494-1498.

22. Barenghi L., Bradamante S., Giudici G.A. and Vergani C. NMR analysis of low-density lipoprotein oxidatively-modified in vitro. Free Radic. Res. Commun., 1990, 8, 175-183.

23. Bates S.R., Wissler R.W. Effect of hyperlipemic serum on cholesterol accumulation in monkey aortic medial cells. Biochim Biophys Acta, 1976, 450(1), 78-88.

24. Baumstark M.W., Kreutz W., Berg A., Frey I. and Keul J. Structure of human low-density lipoprotein subfractions, determined by X-ray small-angle scattering. Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1037, 48-57.

25. Bilheimer DW, Eisenberg S, Levy RI. The metabolism of very low density lipoprotein proteins. I. Preliminary in vitro and in vivo observations. Biochim Biphys Acta, 1972, 260, 212.

26. Brown M.S. and Goldstein J.L. Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis. Annu. Rev. Biochem., 1983, 52, 223-261.

27. Busch H., Hasilik A., Domschke W. Elevated level of b-hexosaminidase and a-mannosidase in human immunodeficiency virus-infected patients. J Infect Dis., 1995, 17, 683-686.

28. Camejo G., Hurt E., Wiklund O., Rosengren В., Lopez F., and Bondjers G. Modifications of low-density lipoprotein induced by arterial proteoglycans and chondroitin-6-sulfate Biochim Biophys Acta., 1991, 1096(3), 253-61.

29. Cazzolato G., Avogaro P. and Bittolo-Bon G. Characterization of a more electronegatively charged LDL subfraction by ion exchange HPLC. Free Radic Biol Med., 1991, 11(3), 247-53.

30. Chao F.F., Blanchette-Mackie E.J., Tertov V.V., Skarlatos S.I., Chen Y.J., and Kruth H.S. Hydrolysis of cholesteryl ester in low density lipoprotein converts this lipoprotein to a liposome. J. Biol. Chem., Mar 1992, 267, 4992 4998.

31. Chen R.F., Scott C., Trepman E. Fluorescence properties of o-phthaldialdehyde derivatives of amino acids. Biochim. et Biophys. Acta., 1979,576, 440-455.

32. Chen R.M., Fisher-Dzoga K. Effect of hyperlipemic serum lipoproteins on the lipid accumulation and cholesterol flux of rbbit aorticmedial cells. Atherosclerosis, 1977, 28, 339-353.

33. Cookson F.B. The origin of foam cells in atherosclerosis.Br J Exp Pathol, Feb 1971,52(1), 62-9.

34. Cross A.S., Wrigh D.G. Mobilization of sialidase from intracellular stores to the surface of human neutrophils and its role in stimulated adhesion responses of these cells. J Clin Invest. 1991, 88, 2067-2076.

35. Cynshi O., Takashima Y., Suzuki Т., Kawabe Y., Ohba Y. and Kodama T. Characterization of aggregated low density lipoproteins induced by copper-catalyzed oxidation. J. Atheroscler. Thromb., 1994, 1, 87-97.

36. Daugherty A., Dunn J.L., Rateri D.L. and Heinecke J.W. Myeloperoxidase, a catalyst for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. J. Clin. Invest., 1994, 94, 437-444.

37. Davis H.R., Glagov S. and Zarins C.K. Role of acid lipase in cholesteryl ester accumulation during atherogenesis. Correlation of enzyme activitywith acid lipase-containing macrophages in rabbit and human lesions. Atherosclerosis, 1985, 55, 205-215.

38. Deckelbaum R.J. Apoprotein В Structure andR eceptor Recognition of Triglyceride-rich Low Density Lipoprotein (LDL) Is Modified in Small LDL but Not in Triglyceride-rich LDL of Normal Size J. Biol. Chem, 1994, 269,511-519.

39. Dobretsov G.E., Kurek N.K., Machov V.N., Syrejshchikova T.I., Yakimenko M.N. Determination of fluorescent probes localization in membranes by nonradiative energy transfer. Journal of Biochem. and Biophys. Methods, 1989, 19, 259-274.

40. Dobretsov G.E., Spirin M.M., Chekrygin O.V., Karmansky I.M., Dmitriev V.M. and Vladimirov Yu.A. A fluorescence study of apolipoprotein localization in relation to lipids in serum low density lipoproteins. Biochim Biophys Acta, 1982, 710(2), 172-80.

41. Dobrian A., Mora R., Simionescu M. and Simionescu N.In vitro formation of oxidatively-modified and reassembled human low-density lipoproteins: antioxidant effect of albumin. Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1169, 12-24.

42. Eichenberger K., Bohni P., Winterhalter K.H., Kawato S. and Richter C. Microsomal lipid peroxidation causes an increase in the order of the membrane lipid domain. FEBS Lett., 1982, 142, 59-62.

43. Enerbach L. Detection of histamine in mast cells by o-phtalalaldehyde reaction after liquid fixation. J. Histochem. Cytochem, 1969, 17, 757-759.

44. Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H. and Jurgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic. Biol. Med., 1992, 13, 341-390.

45. Evans .P, Smith J.C., Mitchinson M.J. and Halliwell B. Metal ion release from mechanically-disrupted human arterial wall. Implications for the development of atherosclerosis. Free Radic. Res. 1995, 23, 465-469.

46. Fenske D.B., Chana R.S., Parmar Y.I., Treleaven W.D. and Cushley R.J. Structure and motion of phospholipids in human plasma lipoproteins. A 3 IP NMR study. Biochemistry, 1990, 29, 3973-3981.

47. Filipovic I. Effect of inhibiting N-glycosylation on the stability and binding activity of the low density lipoprotein receptor. J. Biol. Chem., 1989, 264, 8815 8820.

48. Fogelman A.M., Shechter I., Seager J., Hokom M., Child J.S. and Edwards P.A. Malondialdehyde Alteration of Low Density Lipoproteins Leads to Cholesteryl Ester Accumulation in Human Monocyte-Macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, 77, 2214 2218.

49. Fowler S.M., Scio M.A., Haley N.J. Characterization of lipid-laden aortic cells from cholestrol rabbits. IV. Investigation of macrophage-like proteins of aortic cell populations. Lab Invest., 1979, 41, 372-378.

50. Gaffney B.J. Fatty Acid Chain Flexibility in the Membranes of Normal and Transformed Fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1975, 72, 664-668.

51. Goldstein J.L. and Brown M.S. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis. Annu Rev Biochem, 1977, 46, 897-930.

52. Goldstein J.L., Ho Y.K., Basu S.K., and Brown M.S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 333-337.

53. Gorshkova I.N., Menschikowski M. and Jaross W. Alterations in the physicochemical characteristics of low and high density lipoproteins after lipolysis with phospholipase A2. A spinlabel study. Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1300, 103-113.

54. Gotto A.M. Plasma Lipoproteins. New Comprehensive Biochem., 14. Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1987.

55. Grainger D.J., Kemp P.R., Liu A.C., Lawn R.M. and Metcalfe J.C. Activation of transforming growth factor-beta is inhibited in transgenic apolipoprotein(a) mice. Nature, 1994, 370, 460-462.

56. Haberland M.E., Fogelman A.M. The role of altered lipoproteins in the pathogenesis of atherosclerosis. Amer. Heart J. 1987, 259, 11305-11311.

57. Haberland M.E., Fong D., Chen L. Maalondialdehyde-altered protein in atheroma of Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Science, 1988, 241, 215-218.

58. Hakala J.K., Oorni K., Ala-Korpela M. and Kovanen P.T. Lipolytic modification of LDL by phospholipase A2 induces particle aggregation in the absence and fusion in the presence of heparin. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 1999, 19, 1276-1283.

59. Hanson V.A., Schettinger U.R., Loungani R.R., Nadijcka M.A. Plasma sialidase activity in acute myocardial infarction. Am Heart J., 1987, 114, 59-63.

60. Haust M.D. Light and electron microscopyof human atherosclerosis lesions. Adv Exp Med Biol., 1978, 10, 33-59.

61. Hazell L.J., van den Berg J.J. and Stocker R.Oxidation of low-density lipoprotein by hypochlorite causes aggregation that is mediated by modification of lysine residues rather than lipid oxidation.Biochem J., 1994, 302 (Pt 1), 297-304.

62. Hirani S., Winchester B. The multiple forms of a-D-mannosidase in human plasma. Biochem J., 1979, 179, 583-592.

63. Hoff H.F. and O'Neil J. Lesion-derived low density lipoprotein and oxidized low density lipoprotein share a lability for aggregation, leading to enhanced macrophage degradation. Arterioscler. Thromb., 1991, 11, 12091222.

64. Hoff H.F., Whitaker Т.Е. and O'Neil J. Oxidation of low density lipoprotein leads to particle aggregation and altered macrophage recognition. J. Biol. Chem., 1992, 267, 602-609.

65. Holopainen J.M., Subramanian M., Kinnunen K.J. Sphingomyelinase induces lipid microdomain formation in a fluid phosphatidylcholine/sphingomyelin membrane. Biochemistry, 1998, 37, 17562-17570.

66. Howard G.C., Pizzo S.V. Lipoprotein(a) and its role in atherothrombotic disease. Lab. Invest., 1993, 69, 373-386.

67. Huang H-W., Goldberg E.M., and Zidovetzki R. Ceramide induces structural defects into phosphatidylcholine bilayers and activates phospholipase A2. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 220, 834-838.

68. Hurt-Camejo E., Camejo G., Peilot H., Oorni K. and Kovanen P. Phospholipase A2 in Vascular Disease Circ. Res., 2001, 89, 298 304.

69. Kawabe Y., Cynshi O., Takashima Y., Suzuki Т., Ohba Y. and Kodama T. Oxidation-induced aggregation of rabbit low-density lipoprotein by azo initiator. Arch Biochem Biophys., 1994, 310(2), 489-96.

70. Khoo J.C., Miller E., McLoughlin P. and Steinberg B. Prevention of low density lipoprotein aggregation by high density lipoprotein or apolipoprotein A-I. J. Lipid Res., 1990, 31, 645.

71. Kleinman Y., Krul E.S., Burnes M., Aronson W., Pfleger B. and Schonfeld G. Lipolysis of LDL with phospholipase A2 alters the expression of selected apoB-100 epitopes and the interaction of LDL with cells. J. Lipid Res., 1988, 29, 729-743.

72. Klimov A.N. Atherosclerosis Rev., 1988, 17, 75-86.

73. Kodama Т., Freeman M., Rohrer L., Zabrecky J., Matsudaira P. and Krieger M. Type I macrophage scavenger receptor contains alpha-helical and collagen-like coiled coils. Nature, 1990, 343, 531-535.

74. Kokkonen J.O. and Kovanen P.T. Proteolytic enzymes of mast cell granules degrade low density lipoproteins and promote their granule-mediated uptake by macrophages in vitro. J. Biol. Chem., 1989, 264, 10749-10755.

75. Kokkonen J.O., Vartiainen M. and Kovanen P.T. Low density lipoprotein degradation by secretory granules of rat mast cells. Sequential degradation of apolipoprotein В by granule chymase and carboxypeptidase A. J. Biol. Chem., 1986, 261, 16067-16072.

76. Krieger M., Acton S., Ashkenas J., Pearson A., Penman M., and Resnick D. Molecular flypaper, host defense, and atherosclerosis.Structure, binding properties, and functions of macrophage scavenger receptors. J. Biol. Chem., 1993,268, 4569-4572.

77. Krieger M. The other side of scavenger receptors: pattern recognition for host defense. Curr. Opin. Lipidol., 1997, 8, 275-280.

78. Kroon P.A. Fluorescence study of the motional states of core and surface lipids in native and reconstituted low density lipoproteins. Biochemistry, 1994,33,4879-4884.

79. La Belle M., Krauss R.M. Differences in carbohydrate content of low density lipoproteins associated with low density lipoprotein subclass patterns. J Lipid Res., 1990,31, 1577-1588.

80. Lamb D.J., Mitchinson M.J. and Leake D.S.Transition metal ions within human atherosclerotic lesions can catalyse the oxidation of low density lipoprotein by macrophages. FEBS Lett., 1995, 37, 12-16.

81. Leake D.S., Rankin S.M. and Collard J. Macrophage proteases can modify low density lipoproteins to increase their uptake by macrophages. FEBS Lett., 1990, 269, 209-212.

82. Li F. and Hui D.Y. Synthesis and secretion of the pancreatic-type carboxyl ester lipase by human endothelial cells. Biochem. J., 1998, 329, 675-679.

83. Lin R.C., Dai J., Lumeng L. and Zhang M.Y. Serum low density lipoprotein of alcoholic patients is chemically modified in vivo and inducesapolipoprotein E synthesis by macrophages. J. Clin. Invest., May 1995, 95(5), 1979-86.

84. Lindgren F.T. Preparative ultracentrifugal laboratory procedures and suggestions of lipoprotein analysis. In: Analysis of lipids and lipoproteins. Ed. E.G. Perkins, Champaign: American Oil Chemical Society, 204-224.

85. Liu H., Scraba D.G. and Ryan R.O. Prevention of phospholipase-C induced aggregation of low density lipoprotein by amphipathic apolipoproteins. FEBS Lett., 1993, 316, 27-33.

86. Lojda Z., Ruzickova M., Havrankova E. and Synkova V. Lysosomal proteases in the normal and atherosclerotic arterial wall. Histochem. J., 1984, 16, 399—405.

87. Lombardo A., Bairati C., Goi G., Roggi C., Maccarini L., Bollini D., Burlina A. Plasma lysosomal glycohydrolases in a general population. Clin ChimActa., 1996, 247,39-4.

88. Lopes-Virella M.F., Klein R.L., Lyons T.J., Stevenson H.C. and Witztum J.L. Glycosylation of low-density lipoprotein enhances cholesteryl ester synthesis in human monocyte-derived macrophages. Diabetes, 1988, 37, 550.

89. Lottin H., Motta C. and Simard G. Differential effects of glycero- and sphingo-phospholipolysis on human high-density lipoprotein fluidity. Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1301, 127-132.

90. Lougheed M., Steinbrecher U.P. Mechanism of uptake of copper-oxidized low density lipoprotein in macrophages is dependent on its extent of oxidation J. Biol. Chem., 1996, 271, 11798-11805.

91. Lowiy O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein mesurement with the Folin reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193, 265-275.

92. Lund-Katz S. and Phillips M.C. Packing of cholesterol molecules in human low-density lipoprotein. Biochemistry, 1986, 25, 1562-1568.

93. Lund-Katz S., Laboda H.M., McLean L.R. and Phillips M.C. Influence of molecular packing and phospholipid type on rates of cholesterol exchange. Biochemistry, 1988, 27, 3416-3423.

94. Mahley R.W., Innerarity T.L., Weisgraber K.H., Oh S.Y. Altered metabolism (in vivo and in vitro) of plasma lipoproteins after selective modification of lysine residues of apoproteins. J Clin Invest., 1979, 64, 743-750.

95. Major I. and Aviram M. Macrophage released proteoglycans are involved in cell-mediated aggregation of LDL. Atherosclerosis, Jan 1999, 142(1), 57-66.

96. Marsche G., Zimmermann R., Horiuchi S., Tandon N.N., Sattler W. and Malle E. Class В Scavenger Receptors CD36 and SR-BI Are Receptors for Hypochlorite-modified Low Density Lipoprotein J. Biol. Chem., 2003, 278, 47562-47570.

97. Mateu L., Avila E.M., Camejo G., Leon V. and Liscano N. The structural stability of low-density lipoprotein. A kinetic X-ray scattering study of its interaction with arterial proteoglycans. Biochim. Biophys. Acta., 1984, 795, 525-534.

98. Mattjus P. and Slotte J.P. Does cholesterol discriminate between sphingomyelin and phosphatidylcholine in mixed monolayers containing both phospholipids? Chem. Phys. Lipids., 1996, 81, 69-80.

99. Menschikowski M., Kasper M., Lattke P., Schiering A., Schiefer S., Stockinger H. and Jaross W. Secretory group II phospholipase A2 in human atherosclerotic plaques. Atherosclerosis, 1995, 118, 173-181.

100. Ohki S., Arnold K. Surface dielectric constant, surface hydrophobicity and membrane fusion. J. Membr. Biol., 1990, 114, 195-203.

101. Orekhov A.N., Tertov V.V. and Mukhin D.N. Desialylated low density lipoprotein—naturally occurring modified lipoprotein with atherogenic potency. Atherosclerosis, 1991, 86(2-3), 153-61.

102. Paananen K. and Kovanen P.T. Proteolysis and fusion of low density lipoprotein particles independently strengthen their binding to exocytosed mast cell granules. J. Biol. Chem., 1994, 269, 2023-2031.

103. Panasenko O.M., Vol'nova T.V., Azizova O.A. and Vladimirov Y.A. Free radical modification of lipoproteins and cholesterol accumulation in cells upon atherosclerosis. Free Radic. Biol. Med. 1991, 10, 137-148.

104. Pentikainen M.O., Lehtonen E.M.P. and Kovanen P.T. Aggregation and fusion of modified low density lipoprotein. J. Lipid Res., 1996, 37, 26382649.

105. Piha M., Lindstedt L. and Kovanen P.T. Fusion of proteolyzed low-density lipoprotein in the fluid phase: a novel mechanism generating atherogenic lipoprotein particles. Biochemistry, 1995,34, 10120-10129.

106. Pineto G.J., White R.R. Phagocytosis of latex beads by a human gingival epithelial-like cell line in tissue culture. J. Dent. Res., 1977, 56, 1119.

107. Prence E.M., Natowicz M.R. Diagnosis of a-mannosidosis by measuring a-mannosidase in plasma. Clin Chem., 1992, 38, 501-503.

108. Quinn M.T., Parthasarathy S., and Steinberg D. Endothelial cell-derived chemotactic activity for mouse peritoneal macrophages and the effects of modified forms of low density lipoprotein. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82,5949-5953.

109. Rodriguez-Iturbe В., Katiyar V.N., Coello J. Neuraminidase activity and free sialic acid levels inthe serum of patients with acute poststreptococcal glomerulonephritis. N Engl J Med., 1981, 304, 1506-1510.

110. Roggentin P., Schauer R., Heyer L.L., Vimr E.R. Micro review: The sialidase superfamily and its spread by horisontal gene transfer. Mol Microbiol., 1993,9,915-921.

111. Romano M., Romano E., Bjorkerud D. and Hurt-Camejo E. Ultrastructural localization of secretory type II phospholipase A2 in atherosclerotic and nonatherosclerotic regions of human arteries. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 1998, 18,519-525.

112. Ross R., Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science, 1976, 193, 1094-1100.

113. Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993, 362(6423), 801-9.

114. Sartipy P., Johansen В., Camejo G., Rosengren В., Bondjers G. and Hurt-Camejo E. Binding of human phospholipase A2 type II to proteoglycans. Differential effect of glycosaminoglycans on enzyme activity. J. Biol. Chem. 1996,271,26307-26314.

115. Shannon J.S., Lappin T.R., Elder G.E., Roberts G.M., McGeown M.G., Bridges J.M. Increase plasma glycosidase and protease acitivity in uraemia: possible role in the aetiology of the anaemia of chronic renal failure. Clin Chim Acta., 1985, 153, 203-207.

116. Shen M.M., Krauss R.M., Lindgren F.T. and Forte T.M. Heterogeneity of serum low density lipoproteins in normal human subjects. J. Lipid Res., 1981,22, 236.

117. Smith C., Mitchinson M.J., Aruoma O.I. and Halliwell B. Stimulation of lipid peroxidation and hydroxyl-radical generation by the contents of human atherosclerotic lesions. Biochem. J., 1992, 286, 901-905.

118. Smith E., Crosbie L. and Carey S. Prothrombin-related antigens in human aortic intima. Semin. Thromb. Hemost., 1996, 22, 347-350.

119. Smith E.B. The relationship between plasma and tissue lipids in human atherosclerosis. Adv Lipid Res., 1974, 12, 1-49.

120. Steinberg D., Parthasarathy S., Carew Т.Е., Khoo J.C., and Witztum J.L. ф Beyond cholesterol: modifications of low-density lipoprotein that increaseits atherogenicity. N Engl J Med., 1989, 320, 915-924.

121. Suits A.G., Chait A., Aviram M. and Heinecke J.W. Phagocytosis of aggregated lipoprotein by macrophages: low density lipoprotein receptor-dependent foam-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 2713-2717.

122. Sukhova G.K., Shi G.P., Simon D.I., Chapman H.A. and Libby P. Expression of the elastolytic cathepsins S and К in human atheroma and regulation of their production in smooth muscle cells. J. Clin. Invest., 1998, 102, 576-583.

123. Suzuki Т., Kitajima K., Inoue S., Inoue Y. Occurrence and biological roles of «proximal glycanases» in animal cells. Glycobiology, 1994, 4, 777-789.

124. Swain J. and Gutteridge J.M. Prooxidant iron and copper, with ferroxidase and xanthine oxidase activities in human atherosclerotic material. FEBS Lett. 1995,368,513-515.

125. Taniguchi Т., Ishikawa Y., Tsunemitsu M., Fukuzaki H. The structures of asparagine-linked sugar chains of human apolipoprotein B-100. Arch Bichem Biophys., 1989, 273, 197-205.

126. Tertov V.V., Sobenin I.A., Gabbasov Z.A., Popov E.G., Orekhov A.N. Lipoprotein aggregation as an essential condition of intracellular lipid caused by modified low density lipoproteins. Biochem Biophys Res Commun., 1989, 163,489.

127. Tertov V.V., Kaplun V.V., Orekhov A.N. In vivo oxidized low density lipoprotein: degree of lipoprotein oxidation does not correlate with its atherogenic properties. Mol Cell Biochem., 1998, 183, 141-146.

128. Vanderyse L., Devreese A.M., Baert J., Vanloo В., Lins L., Ruysschaert J.M. and Rosseneu M. Structural and functional properties of apolipoprotein В in chemically modified low density lipoproteins. Atherosclerosis., 1992, 97, 187-199.

129. Vauhkonen M., Viitala J., Parkkinen J., Rauvala H. High-mannose structures of apolipoprotein-B from low density lipoproteins of human plasma. Eur J Biochem., 1985, 15, 43-50.

130. Vedie В., Myara I., Pech M.A., Maziere J.C., Maziere C., Caprani A., Moatti N. Fractionation of charge-modified low density lipoproteins by fast protein liquid chromatography. J. Lipid Res., 1991, 32, 1359.

131. Venerando В., Fiorilli A., Croci G.L., Tettamanti G. Presence in human erythrocyte membraines of a novel form of sialidase acting optimall at neutral pH. Blood, 1997, 90, 2047-2056.

132. Wang L.J., Lee T.S., Lee F.Y., Pai R.C. and Chau L.Y. Expression of heme oxygenase-1 in atherosclerotic lesions. Am. J. Pathol., 1998, 152, 711-720.

133. Warren L. The Thiobarbituric Acid Assay of Sialic Acids J. Biol. Chem., 1959, 234,1971 1975.

134. Willcox P., Renwick G.C. Effect of neuraminidase on the chromatographic behavior of eleven acid hydrolases from human liver and plasma. Eur J Biochem., 1977, 73, 579-590.

135. Wissler R.W., Vesselinovitch D., Getz G.S. Abnormalities of arthererial wall and its metabolism in atherogenesis. Prog Cardiovasc Dis., 1976, 18, 341-352.

136. Xu X.X. and Tabas I. Sphingomyelinase enhances low density lipoprotein uptake and ability to induce cholesteryl ester accumulation in macrophages. J. Biol. Chem., 1991, 266, 24849 24858.

137. Yagi К. Assay for blood plasma or serum. Methods Enzymol., 1984, 105, 328-31.

138. Yla-Herttuala S., Palinski W., Butler S.W. Rabbit and human atherosclerotic lesions contain IgG that recognizes epitopes of oxidized LDL. Arterioscl. Thrombosis, 1994, 14, 32-40.

Информация о работе

Мельниченко, Александра Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы