Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция обмена кальция в тромбоцитах человека липопротеидами низкой плотности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция обмена кальция в тромбоцитах человека липопротеидами низкой плотности"

ВСЕСОЮЗНЫЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АМН СССР

На правах рукописи

БОЧКОВ Валерий Николаевич

РЕГУЛЯЦИЯ ОБМЕНА КАЛЬЦИЯ В ТРОМБОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА ЛИПОПРОТЕИДАМИ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

03.00.04 — Биохимия

Авторефер ат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

/

Москва 1991

Диссертационная работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР.

доктор биологических наук, профессор В. А. Ткачук.

Доктор медицинских наук В.Г. Пинелис, Кандидат биологических наук В.В. Тертов.

Ведущее учреждение — Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР, г. Москва.

Защита состоится « » июня 1991 года в « .лл » часов на заседании специализированного совета во Всесоюзном кардиологическом научном центре АМН СССР по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а.

Автореферат разослан « » . . 1991 г.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

/

. И. Венгерова

;

стаций

ХАРАКТЕР РАБОТЫ

Актуальность, темы. Концентрация ионов Сл2+ в цитоплазме тромбоцитов (tCa2*^ ) является фактором, определяющим функциональную активность этих клеток. Активация тромбоцитов является существенным звеном ряда физиологических и патологических процессов, таких как тромбообразование и атерогенез [Siess, 1989; Sussraan,, 19В5]. В связи с этим очевидна необходимость изучения факторов, регулирующих [Са2+] i в тромбоцитах.

В настоящее время относительно хорошо изучены механизмы гормон-индуцированного повышения iCa2+Ji в тромбоцитах. Важную роль в этом процессе играет вход ионов Са2 + в цитоплазму из внешней среды. Предполагается, что этот транспорт осуществляется по так называемым рецепторуправляемым каналам [Hallam, Rink, 1985]. Механизмы сопряжения этих каналов с активирующими их рецепторами не изучены. Не известно, в частности, участвуют ли в этом сопряжении GTP-связывающие белки.

В последнее время интенсивно изучается влияние компонентов плазмы на способность тромбоцитов к антивации. Было обнаружено, что липопротеиды низкой плотности обладают проагрегантной активностью [Bruckdorfer et al., 1984]. Повышение уровня этих липопротеидов может приводить к гмперреактивносги тромбоцитов [Aviram, Brook, 1987]. Механизмы активирующего воздействия ЛНП на тромбоциты исследованы недостаточно. Было высказано предположение, что под действием ЛНП в тромбоцитах повышается (Са2+Ь [Knorr et al., 1989). Однако не исследована ни специфичность действия ЛНП, ни роль рецепторов ЛНП, ни

механизмы индукции или регуляции этого процесса.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение

механизмов регуляции 1Са2""1 А в тромбоцитах человека

гормональными и негормональными активаторами вТР-связывающих

белков, а также липопротеидами низкой плотности.

В работе были поставлены следующие задачи:

1.Изучить влияние активаторов СТР-связывающих белков на функцию рецепторуправляемых кальциевых каналов тромбоцитов.

2.Исследовать влияние ЛНП на системы обмена кальция и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека.

Научная новизна работы. Впервые показано, что рецепторуправляемые кальциевые каналы тромбоцитов активируются под действием фторида натрия, что указывает на участие етР-связывающего белка в активации этих каналов. Впервые детально исследованы механизмы ЛНП-индуцированного повышения 1Са2*I4 в тромбоцитах человека. Получены свидетельства в пользу того, что под действием ЛНП происходит активация Са2* -каналов тромбоцитов. Охарактеризовано индуцированное ЛНП

фосфорилирование белков тромбоцитов. Описано ингибирование Са2* -мобилизующего эффекта ЛНП активаторами протеинкиназы С и сАМР-зависимых протеинкиназ. Впервые показано, что эффекты ЛНП на системы обмена кальция и фосфоинозитидов, а также на фосфорилирование белков потенциируются адреналином. Впервые получены данные об участии рецептора ЛНП в действии этих липопротеидов на 1Са2*]1 в тромбоцитах.

Практическое значение работы. Результаты данного исследования могут быть использованы в разработке методов фармакологической защиты клеток организма от повреждающего действия высоких

концентраций ЛНП в крови. В частности, потенциирование этого действия адреналином и блокирование действия ЛНП веществами, повышающими сАМР, указывает на перспективность применения в качестве защитных средств альфа-адренергических антагонистов, природных активаторов аденилатциклазы и ингибиторов фосфодиэстеразы сАМР.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, были доложены на симпозиуме "Возбудимые мембраны" (Киев, 1987) и Международном Конгрессе по патофизиологии (Москва, 1991). Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть работ, три работы находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования, результаты и обсуждение), выводов и списка литературы, включающего источника.

Работа изложена на -/</^страницах, содержит 25 рисунков и 5 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выделение липопротеидов. Липопротеиды-выделяли из плазмы крови ультрацентрифугированием согласно методу [Havel et al., 19551. Модификацию ЛНП проводили по методу [Weisgraber et al., 1978]. Использованные в работе липопротеиды ' были любезно предоставлены Т.А. Войно-Ясенецкой и D-Л. Борисовой. Выделение тромбоцитов. Кровь здоровых ' доноров собирали в пробирку ~ кислым цитрат-декстрозным антикоагулянтом. Полученную центрифугированием плаьму, обогащенную тромбоцитами, повторно центрифугировали и осадок тромбоцитов ресуспендировали

в модифицированном растворе Тироде, рН. 6,55, содержащем альбумин и апиразу.

Измерение уровня цитоплазматического кальция. Тромбоциты, суспендированные в модифицированном растворе Тироде, рН 6,55, инкубировали 1 час при 30°С с ацетоксиметиловыми эфирами quin2, fura-2 или indo-1, после чего тромбоциты центрифугировали и ресуспендировали в модифицированном растворе Тироде, рН 7,4, содержащем альбумин и апиразу. Измерение флуоресценции индикаторов и расчет ССа2 + li проводили по методу {Tsien et al., 1982].

Измерение содержания фосфатов инозита. Тромбоциты, суспендированные в модифицированном растворе Тироде, рН 7,4, содержащем EGTA, инкубировали 4 часа при37°С со 100 мкКи/мл мио-[ Н]инозита. Далее клетки осаждали и ресуспендировали в модифицированном растворе Тироде, рН 7,4, содержащем 10 мЫ LiCl. После добавления стимуляторов клетки инкубировали 5 мин при 37°С-. Инкубацию останавливали горячим (90°С) раствором, содержащим 1% SDS и 30 мМ EDTA. Анализ фсэсфатов инозита проводили на колонках Dowex-1 по методу [Berridge et al., 1984]. Измерение захвата тромбоцитами 45Са2*. 1 мл суспензии тромбоцитов, нагруженных quin2, уравновешивали 2 мин в модифицированном растворе Тироде, содержащем 0,1 мМ СаС12 и 0,15 мкКи [45Са1СаС12 . .Захват радиоактивного кальция стимулировали добавлением ЛНП или других агентов. Спустя 1 мин захват 45Са2+ останавливали добавлением 4 ил холодного буфера, не содержащего кальция, с добавкой 5 мМ EDTA, с последующей фильтрацией через стеклофильтры Whatman GF/C. Фильтры дважды промывали по 20 мл того же буфера, высушивали и просчитывали в

жидкостном сциитилляционном спектрометре.

Изучение • фосфорилирования белков методами одно- и двумерного электрофореза. Тромбоциты, суспендированные в модифицированном растворе Тироде, рН 6,55, не содержащем фосфата, инкубировали 2 часа при 37°с с 0,5 мКи/мл [32Р1н3Р04 . После этого клетки осавдали и ресуспендировали в модифицированном растворе Тироде. После добавления стимуляторов клетки инкубировали 1 мин при 37°С. Инкубацию останавливали буфером для нанесения образца. Далее образцы анализировали с помощью одно- или двумерного электрофореза согласно методам Лэммли [Laemmly, 1970] и О'Фаррелла [O'Farrell, 1975], соответственно. Автораднограммы, полученные с высушенных гелей, анализировали на сканирующем денситометре.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Активация Са2*-каналов тромбоцитов фторидом натрия.Известно, что тромбин, ADP и некоторые другие вещества, связывающиеся с рецепторами плазматической Мембраны тромбоцитов, активируют так называемые рецепторуправляемые са2+ -каналы [Hallam, Rink, 19851. Механизмы сопряжения этих каналов с активирующими их рецепторами не известны. Для проверки того, не участвуют ли в этом сопряжении GTP-связывающие белки (подобно тому, как описано для некоторых других ионных каналов), мы использовали ноны F" •, способные, как известно, активировать G-белки, имитируя действие G.t (Sternneis, Gilman, 1982]. Ранее было показано,' что эти ионы способны в и'нтактных тромбоцитах активировать G-белки, сопряженные с аденилатциклазой и фосфолипазой С [Kienast et al., 1907], что свидетельствует об их способности проникать в клетки в количествах, достаточных

для активации й-белков.

Мы обнаружили, что обработка тромбоцитов фторидом натрия активирует систему входа внешнего Са2* (рис.1). НаР стимулировал также вход ионов Ва2 + , что характерно для рецепторуправляемых Са2* -каналов [Ау(1оп1п еЬ а1., 1967].

Известно, что гормон-стимулированное повышение {Са2*^ , в отличие от действия Са2*-ионофоров, ингибиторов метаболизма и других веществ, неспецифически повышающих уровень са2* в цитоплазме, блокируется веществами, активирующими протеинкиназу С и сАМР-зависимые протеинкиназы. Мы обнаружили, что эффект НаЕ также блокировался форболовым эфиром и простагландином Е1 , повышающим уровень сАМР в тромбоцитах (рис.2).

1 шш

ДИГИТОНИН'

М ДИГИТОНИН

t и

¿ХрНМ+Сй&Ъ oj^+BaClg

* ♦ I ♦ .

NaF СаС12 ' NaF Badg

Рис.1. Кинетика NaF-индуцированного изменения интенсивности флуоресценции тромбоцитов, нагруженных quin2. В обозначенные моменты к суспензии тромбоцитов в бескальциевой среде добавляли NaF (10 мМ), СаС12 (2 мМ) или ВаС12 (2 мИ).

[Слг\, нУ 500 —

200—

100—

БО —

и^го саа2

Ие^ОНаРСв!

/ч*

а я

1 иш

£00 —

100-

80 —

ФШ. НаГС»а2 ♦ ♦ ♦

пг е1 марсас!

Рис.2, Влияние форболового эфира и продтагландинае на кинетику ИаГ-индуцированного повышения гСа ]. . иа^ (.10 мм) и СаС1, (2 мМ) добавляли в суспензию тромбоцитов, предварительно инкуоИроваиных с форболмиристатацетатом (10 нм;, простагландиноми, (1 мкЫ) или с тем же объемом растворителя, в котором вносились указанные вещества (диметилсульфоксид;.

На основании приведенных данных можно предполагать, что под действием НаР активируются са2+-каналы плазматической мембраны тромбоцитов'. Наиболее вероятный механизм действия ИаГ - активация вТР-связывающего белка, участвующего в сопряжении этих каналов с рецепторами. : :

Повышение (Са

2 +

_ - в тромбоцитах человека под действием

ЛНП. Специфичность этого эффекта. Ми обнаружили, что ЛИП

Ч-

2 +

г*

вызывают • повышение 1Са'т1. в тромбоцитах, нагруженных Са' зондом и суспендированных в физиологическом буфере. Кинетика этого повышения очень напоминала действие' индукторов агрегации

наблюдавшиеся при

(рис.З). Максимальные значения 1Са2+ действии этих веществ, приведены в табл.1.

Действие ЛНП на гса2*ь в тромбоцитах достигало насыщения при концентрациях ЛНП 50-100 мкг белка/мл. Полумаксимальная действующая концентрация (ЕС^) ЛНП составляла 16+9 мкг белка/мл (п=4) (рис.4). Это'значение близко к известной из

литературы Kd связывания ЛНП с рецепторами-тромбоцитов .(10-30 мкг белка ЛНП/мл) (Curtiss, Plow, 19841, что позволяет предположить, что этот рецептор участвует в мобилизации са2* , вызванной ЛНП.

Таблица 1. Сравнение эффектов форболмиристатацетата (ФМА.Ю-8 М), форсколина(ю-б м) и липопротеидов высокой плотности (ЛВП, 100 мкг/мл) на повышения tea в тромбоцитах, вызванные ЛНП (50 мкг/мл), фактором активации тромбоцитов (ФАТ, 10 Ы) и иономицином (ю м).

Внутриклеточная концентрация Са2+

Преннкубация Контроль ЛНП ФАТ Нонотцнн

Среда 135+ 30 343+ 24 1190+ 240 1420+ 303

ФМА 123+ 17 138+ 18 27S+ 43 1370+ 485

Форсколин . 118+27 140+ 21 191+ 71 1290+ 410

лвп3 130+ 22 193+23 1280+ 205 1305+ 350

[Ca2+]j, uU 1200-1

600

300 -

100 J

t

ФАТ

Л

i i шш

ЛНП

Рис.3. Сравнение эффектов ЛНП и фактора активации тромбоцитов (ФАТ) на ira2*! з тромбоцитах, нагруженных fura-2. К суспензии тромбоцитов в pâcTBope Тироде, содержащем 1 мМ СаС12, добавляли ЛНП (100 мкг/мл) или ФАТ 11 нМ).

Концентрация ЛНП, ыкг/шх

Рис.4. Концентрационная зависимость ШП-индуцированного повышения 1Са ]. в тромбоцитах и потенциирование этого эффекта адреналином. Адреналин добавляли в конечной концентрации 1 мкМ

Белок anó-В, входящий в состав ЛНП, принимает участие в связывании этих частиц сих специфическим рецептором. Для выяснения роли этого белка и рецептора ЛНП в изучаемом нами процессе мы заблокировали связывание ano-В с рецепторами путем 1) обработки антителами против апо-В, .2) химической модификации апо-В, приводящей к потере способности этого белка связываться с рецепторами и 3) обработки тромбоцитов ЛВП3, способными, по данным литературы, блокировать связывание ЛНП с тромбоцитами. Как следует из данных, приведенных на рис. 5, антитела против

апо-В Дозозависимо блокировали повышение-ica2^. , вызываемое

ЛНП. Метилирование ЛНП приводило к почти полному снижению их Са2+-мобилизующей активности (рис.6). Мы обнаружили также, что

в присутствии ЛВПд эффекты ЛНП достоверно рнияались (рис.7).

2+

Прирост [Са X от контроля 100.0 т—

козьи ЦО

о.оои

0.00 3.00 6.00 9.00 12.00

Антитела, шсг/Ш икг ЛНП

15.00

Рис.5. Блокирование ЛНП-индуцированного повышения сса2+). в тромбоцитах антителами против апоВ. 1

2+

Прирост [Са 120.0 100.0 -ео.оо 60.00 -40.0020.01 0.001

Рис.6. Влияние метилирования ЛНП на их способность повышать К)а ].. Тромбоциты обрабатывали нативными или метилированными ЛНП (ЗЙ мкг белка Л!1П/мл) в присутствии 1мкМ адреналина.

tí о

l-

ff 5 & ,

i шш

yj".---

I t 11

лнп ЛВПд ЛНП

Рис.7. Влияние липопротеидо^ белка/мл) на мобилизацию Са (30 мкг белка/мл).

высокой плотности (ЛВПд, 100 мкг в тромбоцитах, индуцированную ЛНП

Приведенные в этом разделе данные свидетельствуют, что для повышения iCa2f]j под действием ЛНП необходимо связывание этих липопротеидов со специфическими рецепторами, узнающими ano-В. Кроме того, эти результаты позволяют предположить, что изучаемые нами эффекты ЛНП специфичны и не являются действием неких примесей, например гормонов, входящих в состав ЛНП.

Данные, приведенные на рис.3, указывают на способность ЛНП вызывать быстрое обратимое повышение [Ca2+ii в тромбоцитах человека. Кинетика этого повышения • напоминает эффекты индукторов агрегации. Нам предстояло изучить, является ли это подобие чисто внешним или в его основе лежат общие механизмы регуляции ica2 +1. .

Источники__ЛНП-индуцированного повышения ica2*it• Известно, т >

гормоны повышают ГСа2*]. в тромбоцитах за .счет выброса этих

ионов из ретикулума и входа из внешней среды. Мы обнаружили,

что в беснальциевой среде эффект ЛНП сэдгаен (рис.8), что

позволяет предположить, что в среде, содержащей Са2 + , ЛНП

вызывают вход Са2+ из внешней среды в цитоплазму. Для проверки

этой гипотезы мы провели обработку тромбоцитов ЛНП в среде,

содержащей 45Са2+ . Рис.9 свидетельствует о том, что ЛНП

г* »

стимулировали накопление радиоактивного Са в клетках, по-видимому, за счет его входа в цитоплазму. Известно, что Са2+-каналы в тромбоцитах не являются строго селективными и способны также пропускать ионы Ва2+ . имп2+ . Рис.8 указывает на способность ЛНП запускать вход этих ионов в цитоплазму. При этомВа2+ усиливает флуоресценцию quin2, а Мп2+- тушит. На основании приведенных данных можно сделать вывод об активации под действием ЛНП Са2 + -каналов плазматической мембраны тромбоцитов, по-видимому, похожих или даже идентичных описанным ранее рецепторуправляемым каналам [Hallam, Rink, 1985].

F ' . •

£ | || II II

СаС12 ЛНП БОТА. ЛНП - ВаС12ЛШ 1£пС12ЛНП

Рис 8. Характеристика Са2+ -ответов, индуцированных ЛНП. К тромбоцитам, нагруженным аи1п2 и суспендированным в бескальциевой среде, добавляли СаСЦ , ЕСТАВаСК или МпС1, (все в концентрации 1 иМ), после чего добавляли ЛНП 1100 мкг белка/мл).

Захват 45Са2+(расп./шш х 100 ел.) 6000;

5000.-4000^ 3000.2 ООО: 1000.0.00

контроль адреналин

ЛНП

ЛНП . + '

адреналин

Рис.9. Влияние ЛНП (100 мкг белка/мл) и адреналина (1 мкК) на включение |:>Са в тромбоциты.

Регуляция ЛНП-индуцированного повышения ГСа2*!^ Из литературы известно, что действие всех гормонов-индукторов агрегации на гса2*1. в тромбоцитах блокируется веществами, активирующими протеинкиназу С и сАМР-зависимые протеинкиназы и потенциируется адреналином, действующим через альфа£-рецепторы. В отличие от этого, эффекты са2+ -ионофоров и других веществ, вызывающих неспецифическое повышение гса2*!^ нечувствительны к указанным веществам. В настоящей работе' мы попытались определить, каким образом регулируются эффекты ЛНП.

Для активации эндогенной протеинкиназы С в тромбоцитах мы использовали форболовый эфир. Рис.10 и табл.2 иллюстрируют способность этого вещества блокировать са^+-мобилизующий эффект ЛНП. Сходным действием обладали простагландин е, (ПГ е( ) и

форскслин, повидащие уровень сАЫР в клетках и, таким образом, активирующие сАМ?-зависимые протеинкииазы (рис. 10, табл.2). Ни форболовил эфир, ни ПГ е1 не влияли на повышение вызванное иономицкном (табл.2).

Из литературы известно, что эффекты индукторов агрегации на (Са'*]. потенциирувтся адреналином, действующим через аль.т.а^-рецепторы. Ндмй было обнаружено сходное влияние этого катехолаыина на эффект ЛНП. Данные, представленные на рис.4 и в табл.2, свидетельствуют о способности адреналина усиливать -мобилизующий эффект ЛНП. Действие адреналина блокировалось йохимбиком, что указывает на участие в потенциирующем эффекте альфа£-рецепторов (табл.2).

- 8

Таблица 2. Сравнение эффектов иохимбина (2 х 1(Г5М), ФМА(1° М), ПГЕ. (5 х,10"'М) и форсколина (ю м ) на ЛНП-индуцированное повышение а:а ). и его потенциирование адреналином (10-ьм)

Преинкубацкя Концентрация внутриклеточного Са Контроль Адреналин' ЛНП ЛНП+Адреналин

Среда ■131+ 26 126 + 48 307 + 48 747 + 105

Иохшбин 118+17 137 + 29 288 + 40 316 + 53

ФМА 127+18 139 + 19 122 + 39 134 + 23

ПГЕ ^ 122+11 • 119 + 23 137 + 33 127 + 30

Форсколин ." 133 +23 122 + 37 130 + 41 137 + 27 .

ЛНП-иКдуцированная активация фосфолипазы С. Одним из первых биохимических событий, развивающихся в тромбоцитах при действии индукторов агрегации, является активация

фосфоинозктидспецифичной фосфолипазы С. Мы обнаружили, что ЛНП вызывают сходный эффект, о чем свидетельствует увеличение содержания фосфатов инозита в тромбоцитах, обработанных этими липопротеидами (рис.11). Так же как и в случае гормонов, эффект

ЛИП потенциировался адреналином.

1 шш

ФМАЛНП ПГ Е^ ЛНП

активатора протеинкиназы С,

форболмиристатацетата (10 нМ) и активатора аденилатциклазы тромбоцитов, простагландина е, (1 мкМ) на повышение [са 1 ■ , индуцированное ЛНП (30 мнг белка/мл). 1

Влияние ЛНП на фосфорилирование белков тромбоцитов. Действие индукторов агрегации на тромбоциты сопровождается . повышением 1Са"+I^ и активацией фосфолипазы С. При этом активируются Са2*-зависимые протеинкиназы и протеинкиназа С. Основным субстратом Са -зависимого фосфоршшрования в тромбоцитах является легкая цепь миозина (мол. масса 20 кДа), фосфорилируемая специфичной Са2* -активируемой протеинкиназой. Основной субстрат протеинкиназы С в тромбоцитах - цитоплазматический белок с массой 47 кДа. С помощью двумерного электрофореза мы обнаружили, что ЛНП стимулируют фосфорилирование двух белков, по мол. массам и изоточкам близких к 20- и 47-кДа белкам. Так же как при действии гормонов, фосфорилирование 47-кДа белка, индуцированное ЛНП, было обратимым и потенциировалось

О)

£ I

Б

<и

я

I ©

7

6 н

5

4 -1

\

ШШ

Рис.10.

Влияние

адреналином (рис.12).

ю о

2000

А

1000

Рис.11. Активация фосфоинозитидного обмена в тромбоцитах человека под действием ЛНП (50 ыкг/мл) и адреналина (I мкМ).

1600

I £ ■

1000

500

адреналин + ЛНП

адреналин

О"- I—I—I

О 16 30 60

120

240

Время (с)

Рис.12. Кинетика ЛНП-индуцированного Фосфорилирования 47-кДа белка тромбоцитов. Суспензию зф.неченых тромбоцитов обрабатывали ЛНП (200 мкг белка/мл), адреналином (1 мкМ) или их

Возможные механизмы действия ЛНП на 1Са2*11 в тромбоцитах человека. Повышение [Са2+]. в тромбоцитах, наблюдаемое нами в присутствии ЛНП, теоретически могло развиваться по рецепторопосредованному механизму (подобно индукторам агрегации), за счет ионофорного действия ЛНП или же вследствие обогащения мембран тромбоцитов холестерином, который, встраиваясь в клетку, способен изменять активность ряда ион-транспортирующих систем.'

Согласно нашим данным, повышение 1Са2+)1 ¡в тромбоцитах под действием ЛНП развивается в течение первой минуты после добавления липопротеида. В отличие от этого, как известно из Литературы, встраивание холестерина ЛНП в тромбоциты требует инкубации в аналогичных условиях в течение десятков минут. Следовательно, изучаемый в этрй работе Са2+ -мобилизующий

эффект ЛНП не может развиваться за счет повышения уровня холестерина в тромбоцитах.

Суммарные данные по эффектам иидукторов агрегации, ЛНП и Са^'-ионофоров на системы обмена Са2+ и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека приведены в табл.3. Очевидно высокое сходство в действии Са2+-агонистов к ЛНП. Следует отметить также, что часть гормональных эффектов имитируется Са + -ионофорами. Причиной этого, по-видимому, является активирующее действие ионов Са2+, входящих в клетку в присутствии ионофоров, на фосфолипазу С и протеиншшазу С.

ТаблицаЗ. Сравнение эффектоз липопротеидов низкой плотности, индукторов агрегации и са-ионофоров на системы вторичных посредников в тромбоцитах человека.

Индукторы агрегации

ЛНП са2+-ионофоры

Мобилизация внутриклеточных депо Са"

Активация

входа 2 + внешнего Са

Стимуляция фосфолипазы С

Оосфорилирование белков 47 кДа 20 кДа

Блокирующие эффекты 4МА ПГ е1

Потенциирующий эффект адреналина

Несмотря на подобие эффектов, вызываемых индукторами агрегации ' и ионофорами, регуляция действия этих веществ, как следует из табл.3, существенно отличается. В отличие от веществ, действие которых опосредуется'мембранными рецепторами, эффекты ионофоров не блокируются активаторами протеинкиназы С и сАМР-зависимых протеинкиназ и не. потенциируются адреналином, Согласно данным табл.3, регуляция действия ЛНП аналогична , регуляции гормональных эффектов и отличается от регуляции действия ионофоров. Эти данные свидетельствуют против гипотезы о возможном ионофорном действии каких-либо компонентов ЛНП.

На основании вышесказанного можно сделать вывод о сходстве в действии ЛНП и индукторов агрегации и охарактеризовать это действие как "гормоноподобное".

+

+

+

+

+

+

Представленные в настоящей работе данные позволяют сделать вывод о способности ЛНП активировать обмен Са2+ и фосфоинозитидов в тромбоцитах человека. Считается, что такие эффекты опосредуют действие веществ, вызывающих активацию тромбоцитов. Почему же в плазме, где концентрация- ЛНП может превышать 1 мг белка/мл, не развивается агрегация тромбоцитов? Прежде всего, следует отметить, что ЛНП - довольно слабый агонист. ЭфЛекты, вызываемые насыщающими концентрациями ЛНП, гораздо слабее, чем те, что наблюдаются под .действием таких индукторов агрегации как ФАТ (табл.1), АОР, вазопрессин, тромбин и др. Кроме того, существует предположение, что в плазме крови содержатся вещества, противодействующие активирующим эффектам ЛНП. Согласно данным, представленным в табл.1, Са2*-мобилизующие эффекты ЛНП, но не гормонов или ионофоров, снижаются в присутствии ЛВПд. Эти данные позволяют предположить, что активирующее действие ЛНП на тромбоциты определяется не абсолютным значением концентрации этих

липопротеидов, а их соотношением с другими компонентами плазмы, оказывающими блокирующий эффект, такими как ЛВП.

Предполагается, что тромбоциты могут участвовать в образовании и развитии атероматозной бляшки. Атеросклероз, как . известно, чаще развивается у лиц с повышенным уровнем ЛНП в крови. Возможно, что активирующее воздействие ЛНП на тромбоциты, а также потенциирование этого эффекта адреналином, может служить одним из патогенетических механизмов, соединяющих два фактора риска (высокий уровень ЛНП и катехоламинов в плазме крови) и тем самым повышающих вероятность заболевания атеросклерозом.

выводы

1. Активация вТР-связывающих белков тромбоцитов человека ионами фтора индуцирует вход Са2+ и Ва2+в клетки, а форболовый эфир и простагландин Е1 полностью блокируют этот, эффект фторида. Следовательно, рецепторуправляемые Са2+ -каналы тромбоцитов человека могут быть сопряжены с в-белками, а активаторы протеинкиназы С и сАМР-зависимой протеинкиназы подавляют эффекты Са2+ -мобилизующих гормонов скорее всего не на уровне рецептора, а на уровне передачи сигнала от С-белков на системы входа или мобилизации ионов Са2+.

2. Липопротеиды низкой плотности в концентрациях, сравнимых с физиологическими, вызывают повышение уровня свободного цитоплазматичесцого кальция в изолированных тромбоцитах человека. Концентрационная зависимость этого эффекта близка к параметрам специфичного связывания ЛЯП с тромбоцитами, а эффект ЛИП осуществляется, по-видимому,, не только за счет выброса ионов кальция из внутриклеточных депо, но и путем активации рецепторуправляемых кальциевых каналов плазматической мембраны.

3. Активирующее действие ЛНП на обмен кальция . тромбоцитах, -как н действие индукторов агрегации, блокируется веществами,' активирующими протеишшназу С и сАМР-зависимые протеинкиназы, а также сопровождается фосфорилированием 20- и 4?-кДа белков, типичных субстратов киназы легких цепей миозина •. и протеинкиназы С. ■ .

4. В тромбоцитах человека липопротеиды . низкой плотности активируют фосфоинозитидный обмен." Действие ЛНП на уровень кальция, обмен фосфоинозитидов и фосфорилирование белкоЕ потенциируется адреналином, что может служить механизма, развития патологического процесса при совместном действии дву; факторов риска - стресса и высокого уровня ЛНП.

20

5. Липопротеиды высокой плотности блокируют действие . ЛНП на вход Са/+ тромбоциты, но не влияют на подобные эффекты индукторов агрегации. Эффекты ЛНП на обмен Са2+ в тромбоцитах блокируются антителами против апо-В. Метилирование ЛНП. также приводит к снижению их Са2+-мобилизующей активности. Все эти данные указывают на специфичность действия ЛНП на тромбоциты, свидетельствуют об участии рецепторов ЛНП в обмене Са2+ и позволяют охарактеризовать действие этих липопротеидов на тромбоциты как "гормоноподобное". ;

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. В.Н. Бочков, И.А. Феоктистов, П.В. Авдонин, В.А. Ткачук. Форболовый эфир блокирует сопряжение СТР-связывающего белка с рецепторуправляемыми кальциевыми каналами. // Биохимия, 1989, Т. 54, вып.9, стр. 1533-1542.

2. В.Н. Бочков, И.Б. Чеглаков, Д.Э. Лигум, И.Ю. Гаврилоз, П.В. Авдонин. Повышение уровня ионов кальция в цитоплазме

клеток HeLa, загруженных indo 1, под влиянием гистамина. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1990, N1, стр. 40-42.3. Степанов А.Е., Рунова О.Б., Крылова В.Н., Бочков В.Н., Швец В.И. Синтез 1,4,5-трифосфата sn-мио-инозита. // Биоорг. химия, 1989, Т. 15, N 6, стр. §50-851.

4. Бочков В.Н., Феоктистов И.А., Авдонин П.В. ГТФ-связывающий белок участвует в регуляции рецепторуправляемых кальциевых каналов. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки", г.Суздаль, 1989.

5. ' V.A. Tkachuk, P.V. Avdonin, I.В. Cheglakov, V.N. Bochkov. Receptor-Operated Channels in Human Platelets. // J. Protein Chem., 1989, V.8, N3, P. 427-428.

6." V.N. Bochkov, T.A.•Rozhkova, Yu.G. Matchin, A.A. Lyakishev, N. A. Bochkova, Yu.L. Borisova, V.V. Kukharchuk, V.A. Tfcachuk. LDL- and agonist-induced Ca2+-mobilization in platelets of healthy subjects and in patients with familial hyperlipoproteinemia type II. //Thrombosis Res., 1991 (in press).

7. T.A. Voino-Yasenetskaya, V.H. Bochkov, V.A. Tkachuk U.S. Ryan. Regulation by bradykinin of phosphoinositide metabolism in the endothelial cells of the pulmonary artery. // Bioraed. Sci., 1990, V.l, P. 160-164,

8. V.A. Tkachuk, V.N. Bochkov, T.A Voyno-Yasenetskaya. P.V. Avcionin. A. Bobik. Low density lipoprotein activated calcium mobilisation by human platelets: characterization and regulation. // J. Biol. Chem., 1991 (in press).

9. V.N. Bochkov, T.A. Voyno-Yasenetskaya, V.A. Tkachuk. Epinephrine potentiates activation of human platelets by low density lipoproteins. // Biochem. Biophys. Acta, 1991 (in press).