Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови при гиперлипидемии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Владимир Игоревич, Санкт-Петербург

6/: ## -3 -сг

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

Иванов Владимир Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ПРИ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ

03.00.04 - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.С.Гуревич

Санкт-Петербург 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................10

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНА ........................................................................................34

2.1. Определение функциональной активности тромбоцитов..............................................................................................................................................................................34

2.1.1. Определение индуцированной агрегации тромбоцитов в цельной крови........................................................................................................................34

9 1 9 МагЬополлотпмиог4!/!-!!/! ллрто.п м^полпваииа "ЗД

Г I I т^ЯЧ^^ ...........................

2.1.3. Метод измерения спонтанной агрегации кровяных

пластинок............................................................................ 36

О О Пппаплпаи(*д пмпмпцл^ ^п&^тб-ч'э ¡г^ло1/

Ч_П грЬДО'!СПИС „' О О! !С!Ч ! рС| ........................................................ОI

2.3. Определение содержания фибриногена в крови..........................38

2.4. Измерение гематологических показателей..............................................39

2.5. Порядок проведения исследования....................................................................39

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................... 43

3.1. Влияние способа отбора пооб на паоаметоы индуниоо-

I I I Г • »Л- г *

ванной агрегации тромбоцитов.......................................... 45

3.2. Агрегация тромбоцитов в зависимости от промежутка времени после венепункции.............................................. 51

3.3. Сравнительный анализ параметров АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов в цельной

крови и богатой тромбоцитами плазме........................... 53

3.3.1. Спонтанная и индуцированная агрегация тромбоцитов при нарушениях липидного обмена........................... 57

- ó -

3.3.2. Взаимосвязь уровня фибриногена и агрегационной

активности тромбоцитов....................................................................................................60

3.4. Влияние блокаторов мембранного гликопротеидного IIb/illa рецепторного комплекса на агрегацию и адгезию тромбоцитов в цельной крови....................................................................67

3ÍX 1\Л|Д»«ЛЯ(5АТЛП ЛППАПАПЛПКЛ 1 Д М р Л /I II А УЧЛО SJ í 1 Л MI ¿Ч!-*™} S 1! Л!/

.о. ivmi\(juMci иД и!чрсДса ichi'ií-í ИпДу цИ^ОсзаппиИ сп ¡jes ацИм

тромбоцитов..............................................................................................................................................76

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................................81

Г!| 1ПАП1 I Г\4

DDIDW^DI......................................................................................................................................................................................»S

ПРД irri/1ÜPri/MP PPk"r>MF!-i ПЛ I IMI/I Q^

! Г ■ ц -\i \ Г Г ? I 1= .'L^ I VW1VI !. ! i^f Л UJ^T ГГ!<...................................................MW

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ.,,.................„.........„........................................................95

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Одной из основных проблем научной и практической медицины до настоящего времени остается атеросклероз и этиологически связанная с ним ишеми-ческая болезнь сердца (ИБС). Участие тромбоцитов человека в механизмах возникновения и развития указанных заболеваний обеспечивается, как правило, реализацией событий, приводящих к повышению их функционального статуса [50, 134, 156]. Патологическая активация кровяных пластинок является сегодня общепризнанным фактором риска заболеваний сердечно-сосудистого профиля [69,137].

Согласно современным представлениям, основу аппарата регуляции функциональной активности тромбоцитов составляют разнообразные рецепторные комплексы их плазматической мембраны в совокупности с системами вторичных посредников. Известны три основных пути активации кровяных пластинок: активация за счёт усиления распада фосфатидилинозитолов, активация вследствие понижения внутриклеточного содержания циклического аденозин-монофосфата (цАМФ) и активация при "включении" каскада арахидоновой кислоты. Во всех трёх случаях происходит увеличение концентрации цитозольно-го кальция, вследствие его высвобождения из пулов внутриклеточного хране-

!_плез nfiri.

Наиболее информативным тестом для оценки степени активации тромбоцитов является исследование их способности к фибриногензависимой агрегации под воздействием специфических биохимических индукторов: аденозиндифос-фата (АДФ), коллагена и др. При этом различные агонисты, взаимодействуя со своими специфическими рецепторами на плазматической мембране кровяных пластинок, могут вызывать активацию тромбоцитов за счёт любого из ука-

■50UUUIV 0!_|! I Ю р\ГГр,1Л OUI II ILIIA UUIIXIU I |J I Cri.

Следовательно, изучение тромбоцитарных функций s условиях гипврлипи-демии, при высоком риске развития атеросклероза и его коронарных осложнений, является одним из важных моментов для раскрытия интимных биохимических механизмов патогенеза указанных заболеваний. Кроме того, по данным ряда авторов [23, 142] изменения в функциональном статусе тромбоцитов предшествуют обострениям ИБС, что открывает возможность использо-

Г. Л 1 i I Л П ГЧ'ЗЛ'Ч А 4 /"Jm /I I l/ä I S Л Л I 1 ^ S I ï/^l A n i 1ЛЛТ1 A ГЧ A I IAU n I^^M lAAfn Л П РЧА П1Д1/

вапки i ia|_«aivicT(juD v^ynt4i_^Wncu iDnuvi агч i /юпи^ i vi i и юи i угпОгч о лачсиюс ирс^щал-

торов патологических состояний и показателей эффективности корригирующего лечения.

Определение функционального статуса тромбоцитов представляет собой достаточно сложную задачу: с одной стороны, нужно в максимальной степени

сохранить интактное состояние пластинок до начала исследования, а с другой - создать стандартные оптимальные условия, необходимые для обеспечения

ПЛП11А1Я -'Л /"Ч .""» i А > 11Л1Л ЗЛ\/ ПЛЫ П Г", ,-'v\ i'VTIil&ÎV/nijlrtAn'ÎLIlin ï 0—% S

i ÜJJ inun pcaj тоацуин 1Л1Л Цу>у гичцгт riüOj ic о i vuviyj ип^иоаппл ni vlu U.

Традиционный метод изучения индуцированной агрегации кровяных пластинок в богатой тромбоцитами плазме (БТП) по Born G.V.R. [88,89] обладает рядом существенных недостатков, главный из которых - невозможность проведения исследований в цельной крови. Последнее обстоятельство не позволяет осуществлять оценку расстройств функций кровяных пластинок в едином комплексе, включающем факторы других клеток крови, плазменные факторы, а также изменения свойств сосудистой стенки. Кроме того, метод не пригоден для обследования пациентов с выраженной гиперлипидемией, часто встречающейся в кардиологической практике.

i аким образом, исследование i ромиоцитарных ц^ункции в цельной крови и механизмов их регуляции при патологиях сердечно-сосудистой системы имеет не только научное, но и большое прикладное значение.

Работа проводилась в рамках плановой НИР Санкт-Петербургского НИИ кардиологии № 006: «Разработка и внедрение современных методов диагно-

стики и лечения различных клинических форм ИБС- на стационарном этапе».

Цели и задачи исследования

В связи с вышеизложенным, основной целью настоящей работы явилось сравнительное исследование АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов человека в образцах цельной крови и богатой тромбоцитами плазмы в условиях гиперлипидемии.

Дня достижения этой цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Разработать чувствительный стандартизованный метод анализа агрега-ционной активности тромбоцитов под воздействием различных агонистов в

обоазиах цельной коови:

i......i - --i -- i - - '

2) Провести анализ интенсивности агрегации тромбоцитов в цельной крови и БТП в зависимости от типа и концентрации биохимического индуктора;

3) Исследовать характеристики функциональной активности кровяных пластинок у здоровых доноров и больных с нарушениями липидного обмена в цельной крови и БТП. Сопоставить их с уровнем общего холестерина (ХС), холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП), холестерина липопро-теидов высокой плотности (ХС ЛПВП), а также с возрастными особенностями пациентов и наличием в анамнезе инфаркта миокарда (ИМ);

4) Выявить взаимосвязь параметров АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов in vitro с концентрацией фибриногена в плазме крови и уровнем спонтанной агрегации in vivo;

5) Изучить влияние блокаторов мембранного гликопротеидного I lb/Ilia ре-цепторного комплекса (ГП !!Ь/!!!а) на агрегацию и адгезию тромбоцитов в цельной крови. Оценить эффективность их действия по сравнению с ингибиторами циклооксигеназы.

Научная новизна работы В настоящем исследовании впервые с помощью разработанного метода экспериментально обоснована эффективность исследования функциональной активности тромбоцитов в цельной крови при нарушениях липидного обмена.

Установлено существенное различие в соотношении амплитуд агрегаций, вызванных АДФ и коллагеном, в цельной крови и БТП. При этом в цельной

^ПЛП!* I щп П ЛИЛ Г*1 ЛЛ^ЛПЛЛ МЛА ПЛП1 I Л I |"ГЛПЛ, Я П I 1ЛЛТ1 Л ГПАГ^ 1 11Д1Д ТПЛИ Я^Л

гчриоУ! оотШ 1сп0 Доо I иБсрпОс I |0оо1шсггтс: ИН I сп^Иопи^ I у» аГрб| ацИИ I (ллуЮО-

цитов у пациентов, перенёсших в прошлом ИМ, а также у лиц возрастной группы 49-65 лет.

При умеренной гиперхолестеринемии обнаружена достоверная зависимость между агрегационной активностью кровяных пластинок и концентрацией фибриногена в крови. Переход от цельной крови к БТП вызывает инверсию связи.

В цельной крови выявлен эффект различной степени воздействия РОВ-со-держащих пептидов (ОРСОР, ОРОООКУ) на агрегационную и адгезионную функции тромбоцитов. Выраженность ингибирующего действия пептидов по сравнению с ацетилсалициловой кислотой определена как 20:1.

Научно-практическое значение полученных результатов Для исследовательских лабораторий и практического здравоохранения разработан высокоинформативный количественный метод экспресс-тестирования агрегационной и адгезионной способности тромбоцитов в цельной крови. Он позволяет корректно исследовать функциональную активность кровяных пластинок при сохранении естественной гетерогенности тромбоцитарного пула, в присутствии всех клеток, специфически модулирующих функции тромбоцитов. Снимаются все ограничения на проведение анализа у пациентов с выраженной гиперлипидемией.

Разработан и доведен до промышленного производства первый отечественный импедансный агрегометр А И-300, включённый экспертным советом по

направлению "Атеросклероз" в число приоритетных работ по государственной научно-технической программе "Борьба с наиболее распространёнными болезнями". Агрегометр внедрён в научную и клиническую практику ряда ведущих медицинских учреждений: НИИ кардиологии МЗ РСФСР (г.Санкт-Петер-бург), Военно-медицинской академии (г.Санкт-Петербург). НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАН (г.Санкт-Петербург), Российской медицинской

сичаДоуими iiuv-j lOivinui О ОиуаЗиоапиЯ .ч^апм-i leicrjjt/ypi ), v_/aiviapoKui u Mc-

дицинского института, Омского медицинского института, Сан кт- П етербу р гс ко го государственного медицинского университета.

Метод пригоден для массового скрининга населения, адекватной оценки осуществляемой антитромбоцитарной терапии, а также для изучения действия новых сЬаомакологических поепаоатов,

| 1................. ......I......i........

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови позволяет получать хорошо воспроизводимые объективные данные, без существенных искажений результатов, свойственных рутинному методу анализа в БТП. Снимаются все ограничения на проведение измерений при гиперлипи-демии и тромбоцитопении;

2. При гиперлипидемии имеются достоверные различия в агрегационной

ЛП(^лКуЛЛТ|Л ТГ>А||лЯл| 1МТЛП U nnUHQUnOHiLlll f^l Л <11/1 Л R Л IЛ ИДЛИ Л В Л 1JIU Г1W |/"Г ("\ О И Л О I |ОП1__

lu^uunuu I П I I UD |\ I ipriiviCn/ICivitjiivl v/vi<j/vrnviirnCwi\riivi rirl/цу i\ I LypU«IVI D io

ной крови и БТП;

3. Блокада мембранного гликопротеидного комплекса Hb/liia тромбоцитов RGD-содержащими пептидами вызывает в цельной крови торможение агрегационной функции пластинок, превышающее на 35-45 % соответствующее снижение их адгезионной активности;

4. Определение функционального статуса тромбоцитов в цельной крови повышает адекватность информации о нарушенной активности кровяных пласти-

нок при патологиях сердечно-сосудистой системы по сравнению с наблюдениями в богатой тромбоцитами плазме.

Д ППГ\Яо I 1\ла РЛО^ОТ!-!

I ч |риииц(/1л paüv I LJi

Результаты работы докладывались на; конференции "Эссенциальные" фос-фолипиды. Липостабил" (Москва, 1992), Всероссийской конференции кардиологов (Санкт-Петербург, 1993), VI симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), V Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995), симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения академика Аничкова H.H. (Санкт-Петербург, 1995), ХП international Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Houston, 1995), конференции "Профилактика и лечение сердечно-сосудистых заболеванийм (Санкт-Петербург, 1997).

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания методов исследования (глава 2), результатов исследований (глава 3), обсуждения полученных данных (глава 4), выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками и 16 таблицами. Прилагаемый список литературы включает 178 источников.

-10-Глава 1

Обзор литературы

Сердечно-сосудистые заболевания до настоящего времени являются наиболее частой причиной преждевременной смертности и инвалидности населения с тенденцией к дальнейшему росту указанных показателей [5].

Исследования, выполненные в последние годы, свидетельствуют о важной роли тромбоцитарно-сосудистого звена системы гемостаза в механизмах становления и развития атеросклероза и ИБС [21, 51, 144, 149]. При этом основная их часть приходится на изучение взаимодействия клеток крови, среди которых ключевое значение придается кровяным пластинкам, со структурами ар-твризлын о й стенки. Изменения противотромбогенных свойств эндотелия сосудов, с одной стороны могут потенциировать атеросклеротический процесс, с другой - быть важным звеном патогенеза внутрисосудистой активации тромбоцитов и тромбогенеза [18, 137, 144].

Функциональный статус кровяных пластинок является суммарным показателем происходящих изменений тромбоцитарно-сосудистого звена гемостаза [18]. В сосудистом русле при отсутствии патологически активирующих влияний интактное состояние тромбоцитов (дискоцитов) препятствует неоправданному развитию внутрисосудистого тромбоза. При этом между продукцией и высвобождением эндотелием антиагрегантных соединений (простациклина ПГ12, эндотепиального расслабляющего фактора БОР [90] и других) и синтезом тромбоксана А.2 (ТхАо) тромбоцитами существует физиологический гомеоста-тический баланс [54].

Пусковым моментом участия кровяных пластинок в процессах атерогенеза можно считать их адгезию к субэндотелиальному слою сосудистой стенки, будь то в силу повреждения эндотелия или уменьшения его антиагрегантных свойств. Этот начальный этап формирования атероеклеротичеекой бляшки [18] запускает сложный процесс, включающий реакцию высвобождения АДФ и

синтез ТхА2, которые в тесном взаимодействии вызывают агрегацию и адгезию новых популяций кровяных пластинок и выделение новых порций секрета, сокращение в данном участке просвета артерии и образование тромба. Здесь гипотеза «ответа на повреждение» Ross R., Harker L. [161] переплетается с тромбогенной теорией, выдвинутой Rokitansky еще в середине прошлого столетия, и согласно которой образование тромбов является первопричиной в

Я"Р1Я1< ПЛЛЛТ1 1ЛЛ 1/ЛГЛ ППЛ! 1ЛЛЛА

aoDfi i viví ari cjjuoftj icpui упсьшГи ириЦсО^а,

Активация тромбоцитов сопровождается высвобождением из их гранулярного аппарата факторов роста, индуцирующих пролиферацию гладкомышеч-ных клеток (ГМК), что рассматривается в качестве одного из ключевых звеньев в развитии атеросклероза [19, 42, 43, 44]. В опытах in vivo показано [160], что тромбоцитарный фактор роста ÍPDGF) взаимодествует со специфическими рецепторами на поверхности ГМК. Присоединение тромбоцитарного фактора ро-

СТО I f SAt^S 10ПТЛПЧ MLJIJM I а A \ A fnr l/n/M/^in В-ЧЛГЗ^! IIJM QlfnLAt irtLA! I IMV л^лтлппоимй

la гч рЬЦС111 иру ипициирус! гчсюгчоД ресичциуц br\j игОЧагиЩИХ (ja^iljci uichHc фи^-

фатидилинозитдифосфата, активацию протеинкиназы С и увеличение концентрации внутриклеточного кальция. Кульминационным этапом являются активация синтеза ДНК и митоз. Подвергшиеся пролиферации ГМК изменяют свои свойства и из обычного контрактильного типа превращаются в синтезирующий тип клеток, способный образовывать коллаген, эластин, гликозаминогликаны, т.е. соединительнотканный матрикс будущей атероскперотической бляшки [101].

Следует отметить, что активация метаболизма арахидоновой кислоты в кровяных пластинках, наблюдаемая при атеросклерозе, способна повысить опасность высвобождения в значительных количествах фактора роста и развития атеросклеротического повреждения сосудов [18 ].

По данным [146] тран�